Способ получения 7-гидроксиройлеанона, обладающего антимикробным действием
Владельцы патента RU 2554501:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" (RU)
Изобретение относится к способу получения 7-гидроксиройлеанона, обладающего антимикробным действием. Указанный способ включает экстракцию измельченных корней шалфея лекарственного 96% этиловым спиртом с последующим упариванием экстракта, обработкой водой, отгонкой спирта и обработкой гидрофобным растворителем или экстракцию указанного сырья хлороформом с последующей обработкой экстракта водой и упариванием; затем целевой продукт извлекают из органической фазы переведением в растворимые в воде феноляты, обрабатывая водным раствором гидроксида натрия; промывают щелочной раствор хлороформом; подкисляют соляной или серной кислотой; полученный осадок отфильтровывают; сушат и измельчают. Изобретение характеризуется улучшенной технологичностью процесса и обеспечивает получение из корней шалфея лекарственного индивидуального вещества с более высокой антимикробной активностью, чем ранее выделенные производные ройлеанона. 2 табл., 6 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения противомикробного средства: 7-гидроксиройлеанона.
В литературе описаны способы выделения ройлеанонов, отличающихся от 7-гидроксиройлеанона и его ацетоксипроизводного строением и расположением заместителей, из различного сырья:
- экстракция диэтиловым эфиром (Coleus fredericii, листья) с последующей колоночной хроматографией [1];
- экстракция диэтиловым эфиром (Coleus coerulescens, трава) с последующим фракционированием в системе растворителей диэтиловый эфир-ацетон 1:1 и петролейный эфир (30-60°) - метанол 1:9 и колоночной хроматографией на силикагеле [2];
- экстракция диэтиловым эфиром (Plectranthus barbathus, листья, Plectranthus sanguinens, листья), упариванием растворителя и хроматографированием на сефадексе LH-20 [3];
- экстракцией последовательно гексаном и диэтиловым эфиром (Plectranthus edulis, листья), упариванием растворителя и хроматографированием на сефадексе LH-20 [4];
- 7-ацетоксиройлеанон получают из корней Inula roylana экстракцией метанолом, сгущением экстракта, из которого выделяется осадок целевого продукта [5].
Во всех приведенных примерах преследуется цель выделения, идентификации или установления строения веществ, где полнота извлечения не главная задача, поэтому экстрагенты и процессы не являются оптимальными для промышленной технологии.
Известен способ получения суммы ройлеанонов [6], обладающих антимикробной активностью из корней шалфея лекарственного, включающий экстракцию сырья хлороформом, фильтрацию, упаривание хлороформного экстракта с последующим хроматографическим разделением в тонком слое сорбента и элюированием зоны адсорбции ройлеанонов.
Указанный способ хорошо решает аналитическую задачу - определение суммы ройлеанонов, но неприемлем в технологии, особенно крупномасштабной, вследствие наличия тонкослойной хроматографии, большого количества элюента и трудоемкости процесса.
Целью изобретения является разработка способа получения в качестве препарата индивидуального соединения с преобладающей антимикробной активностью, 7-гидроксиройлеанона, разработка способа очистки целевого продукта от примесей липидного характера с уменьшением временных затрат и хорошей воспроизводимостью. Антимикробная активность 7-ацетоксиройлеанона в отношении стафилококка золотистого составляет 62,5 мкг/мл, 7-гидроксиройлеанона - 15.6 мкг/мл. (Табл. 2).
Поставленная цель достигается тем, что в качестве экстрагента используется 96% этиловый спирт. После отгонки растворителя до ~2% исходного объема кубовый остаток разбавляют водой, полностью отгоняют спирт и обрабатывают хлороформом с последующей экстракцией целевого продукта из хлороформа водным раствором щелочи, промывают щелочной раствор хлороформом, осаждают соляной или серной кислотой, отделяют осадок, промывают водой, сушат. Экстракцией целевого продукта щелочью в виде фенолята, растворимого в воде, решаются сразу две задачи - гидролиз менее активного 7-ацетоксиройлеанона и отделение от 7-гидроксиройлеанона липидов, остающихся в хлороформной фазе. Промывание щелочного раствора целевого продукта хлороформом удаляет липиды, попадающие в водно-щелочную фазу при недостаточном расслоении органической и водно-щелочной фаз. Экстракцию сырья можно проводить непосредственно хлорсодержащим углеводородом (хлороформом) с последующим проведением процесса указанным способом. Использование на головной стадии в качестве экстрагента этилового спирта с последующим его упариванием и растворением экстрактивных веществ в хлороформе диктуется соображениями экологической безопасности.
Соответствие заявляемого способа критерию «новизна» заключается в том, что:
- отделение ройлеанонов от примеси липидов проводится путем обработки хлороформного экстракта водной щелочью, в которую ройлеаноны переходят в виде фенолятов,
- при этом 7-ацетоксиройлеанон гидролизуется до 7-гидроксиройлеанона, а липиды остаются в хлороформе,
- конечный продукт осаждается из щелочи кислотой, что является более технологичным, чем хроматографирование на сорбенте. Сравнительные данные физико-химических характеристик и биологической активности 7-гидроксиройлеанона - препарата и 7-гидроксиройлеанона - стандартного образца показывают, что предлагаемый способ обеспечивает получение целевого продукта необходимого качественно-количественного состава и биологических свойств.
Сущность способа заключается в экстракции измельченных корней шалфея лекарственного 96% этиловым спиртом, упаривании спирта, добавлении воды. Далее водную фазу обрабатывают хлороформом, хлороформный раствор промывают водой, обрабатывают раствором гидроксида натрия. Из щелочных извлечений удаляют вакуумом следы хлороформа, фильтруют и подкисляют раствором соляной или серной кислоты. Осадок целевого продукта отфильтровывают, промывают водой и сушат (Табл. 1).
Технический результат предложения заключается в расширении использования растительного сырья, корней шалфея лекарственного, до настоящего времени представляющих отходы при выращивании шалфея для получения эфирного масла из надземной части, в преобразовании суммы ройлеанонов: 7-ацетоксиройлеанона и 7-гидроксиройлеанона в индивидуальное вещество - 7-гидроксиройлеанон с наибольшей антимикробной активностью, улучшении технологичности процесса за счет замены длительного процесса хроматографии на сорбенте осаждением кислотой из щелочного раствора.
Пример 1.
200,0 г измельченного корня шалфея помещают в стеклянную колбу, заливают 1 л этилового спирта (1:5) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 16 ч при перемешивании. Первый экстракт сливают, заливают сырье спиртом в объеме слитого экстракта и экстрагируют как в первом случае. Третью экстракцию проводят аналогично в течение 16 ч. Объединенные спиртовые экстракты (около 2,3 л) упаривают до примерно 2% исходного объема (в случае непрерывного процесса третье извлечение подается на свежее сырье новой загрузки), разбавляют водой в 3-4 раза и полностью отгоняют спирт. Кубовый остаток (150-200 мл) трижды обрабатывают хлороформом 200, 100, 100 мл. Хлороформный раствор 4 раза экстрагируют 1% водным раствором гидроксида натрия. Соотношение водно-щелочной и органической фаз 0,4:1, 0,3:1, 0,3:1, 0,2:1. Объединенные щелочные извлечения промывают хлороформом (~50 мл), обрабатывают вакуумом, фильтруют через вату и подкисляют 5% раствором соляной кислоты до рН 3. Осадок отделяют фильтрованием, промывают водой до нейтральной реакции промывных вод, высушивают, растирают.
Выход 0,58 г (0,3% от массы сырья).
Содержание 7-гидроксиройлеанона 53,7%.
Пример 2.
200 г измельченных корней шалфея помещают в стеклянную колбу, заливают 1 л 95% этилового спирта (1:5) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 4 ч при перемешивании. Первый экстракт сливают, заливают сырье спиртом в объеме слитого экстракта и экстрагируют в течение 3 ч при тех же условиях, как в первой экстракции. Третью экстракцию проводят аналогично второй (3 часа, комнатная температура, перемешивание). Объединенные спиртовые экстракты (~2,3 л) упаривают до ~2% исходного объема (в случае непрерывного процесса третий экстракт подается на свежее сырье) с последующим проведением процесса указанным в примере 1 способом.
Получают 0,66 г препарата (0,33% от массы сырья).
Содержание 7-гидроксиройлеанона 55,9%.
Пример 3.
200 г измельченных корней шалфея помещают в стеклянную колбу, заливают 800 мл хлороформа (1:4) и проводят трехкратную экстракцию при комнатной температуре при перемешивании в течение 16 ч. Объединенные хлороформные извлечения промывают водой (~80 мл), упаривают до 340 мл и четырежды экстрагируют 2% водным раствором гидроксида натрия по 150 мл. Объединенные щелочные извлечения промывают хлороформом (~50 мл), обрабатывают вакуумом для удаления следов хлороформа и подкисляют 5% раствором соляной кислоты до рН 2-3. Выпавший золотисто-желтый осадок отфильтровывают, промывают водой до нейтральной реакции, высушивают и измельчают.
Получают 0,53 г препарата (0,3% от массы сырья).
Содержание 7-гидроксиройлеанона составляет 54,7%.
Пример 4.
1 кг измельченного сырья помещают в экстрактор из нержавеющей стали, вертикальный цилиндрический с коническим днищем, с нижним выпуском (d=200 мм, h=360 мм), заливают 5 л 95% этилового спирта (1:5) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 16 ч с перемешиванием. Первый экстракт сливают, заливают сырье в объеме слитого экстракта и экстрагируют как в первом случае. Третью экстракцию проводят в аналогичном режиме. Объединенные спиртовые извлечения упаривают до 200 мл, добавляют 150 мл воды, упаривают до полного удаления спирта, доводят объем водной фазы до 650 мл, экстрагируют хлороформом 350, 250, 250 мл. Объединенные хлороформные извлечения промывают водой (~150 мл) и экстрагируют 4 раза 1% раствором гидроксида натрия 300, 220, 220, 150 мл. Объединенные щелочные извлечения обрабатывают вакуумом для удаления следов хлороформа, фильтруют через вату, разбавляют водой в два раза, подкисляют 5% серной кислотой до рН 2. Желтый осадок отфильтровывают, промывают водой до нейтральной реакции, высушивают, измельчают.
Получают 3,49 г препарата (0,35% от массы сырья).
Содержание 7-гидроксиройлеанона составляет 48,5%.
Пример 5.
50,0 г измельченных корней шалфея помещают в стеклянную колбу, заливают 250 мл этилового спирта (1:5) и проводят экстракцию при комнатной температуре и при перемешивании в течение 4 часов. Получают 200 мл экстракта. Вторую экстракцию проводят в течение 3 часов, объем экстрагента 200 мл. Объем экстракта 195 мл. Третью экстракцию проводят аналогично второй в течение 2 часов. Объем экстрагента 195 мл, экстракта 200 мл. Объединенные экстракты упаривают до ~30 мл, разбавляют 120 мл воды и упаривают до полного удаления спирта. Затем водную фазу последовательно экстрагируют хлористым метиленом 7×40 мл до отрицательной реакции последнего извлечения на ройлеаноны (фиолетовое окрашивание пятна на фильтровальной бумаге или в тонком слое силикагеля от воздействия паров аммиака). Объединенные хлористометиленовые извлечения (240 мл) обрабатывают щелочью 40 мл, 3×30 мл. Объединенные щелочные извлечения обрабатывают вакуумом и подкисляют 5% соляной кислотой. Выпавший желто-золотистый осадок отфильтровывают, промывают до нейтральной реакции, сушат. Получают 0,043 г препарата (0,086% от массы сырья). Содержание 7-гидроксиройлеанона 31,76%.
Пример 6.
50,0 г измельченных корней шалфея трехкратно экстрагируют, как в примере 5 4, 3 и 2 часа. Соотношение объема экстрагента и массы сырья 5:1. Объем экстрагента на 1-ю экстракцию 250 мл, на каждую последующую равен объему слитого экстракта, т.е. 200 и 195 мл. Далее объединенный экстракт упаренный до полного удаления спирта обрабатывают дихлорэтаном 6×40 мл. Объединенные дихлорэтановые извлечения в объеме 232 мл фильтруют через ватку и обрабатывают 1% водным раствором NaOH 50 мл, 42 мл и 2×30 мл. Объединенные щелочные извлечения (151 мл) фильтруют, обрабатывают вакуумом и подкисляют 5% соляной кислотой. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают до нейтральной реакции, сушат, измельчают.
Получают 0,036 г препарата (0,072% от массы сырья). Содержание 7-гидроксиройлеанона 38,63%.
Сравнение технологии с прототипом представлено в табл. 1.
Использование предлагаемого способа в сравнении с известным обеспечивает следующие преимущества:
- использование на головной стадии производства практически нетоксичного экстрагента - этанола;
- отсутствие процессов нагревания токсичных и пожароопасных растворителей;
- превращение менее активного 7-ацетоксиройлеанона в более активный 7-гидроксиройлеанон (62,5 мкг/мл и 15,5 мкг/мл соответственно);
- проведение гидролиза 7-ацетоксиройлеанона и отделение липофильных примесей в одной операции: ройлеанон в виде фенолята переходит в водную фазу, а липофильные примеси остаются в хлороформе;
- осаждение целевого продукта из водного раствора гидроксида натрия кислотой более технологичная и хорошо воспроизводимая операция по сравнению с хроматографированием на сорбенте.
Антимикробную активность индивидуальных веществ и суммы 7-гидроксиройлеанона и сопутствующих веществ липидной природы изучали в опытах in vitro, с использованием метода двукратных серийных разведений веществ в жидких питательных средах: мясопептонном бульоне - для изучения бактериостатической активности и среде Сабуро - для изучения фунгистатической активности (7).
При определении антимикробного спектра изучаемых образцов использовали 6 патогенных тест-микроорганизмов: грамположительные бактерии золотистого стафилококка, грамотрицательные бактерии кишечной палочки, вульгарного протея и синегнойные бактерии, а также мицелиальные грибы рода MICROSPORUM и дрожжеподобные грибы рода CANDIDA.
В результате изучения установлено (табл. 2), что индивидуальный 7-гидроксиройлеанон обладает высокой бактериостатической активностью в отношении золотистого стафилококка в концентрации 15,6 мкг/мл, что примерно в 4 раза выше активности индивидуального 7-ацетоксиройлеанона. Из проведенных исследований видно, что варьирование % содержания ройлеанонов (36÷57%) в образцах не влияет на величину бактериостатической активности, которая в отношении золотистого стафилококка составляет 31,2 мкг/мл (табл. 2), при этом во всех образцах наблюдается частичная задержка роста бактерий до концентрации 15,6-7,8 мкг/мл.
Источники информации
1. Zhen-Yan Zhu, Н. Nayeshiro, R. Prewo, P. Rüedi, C.H. Eugster. Helvetica Chim Acta, v. 71, p. 577 (1988).
2. K. Grob, P. Rüedi, C.H. Eugster. Helvetica Chim Acta, v. 61, Fasc. 2, p. 871 (1978).
3. P. Rüedi. Helvetica Chim Acta, v. 69, p. 972 (1986).
4. J.M. Künde, P. Rüedi, C.H. Eugster. Helvetica Chim Acta, v. 70, p. 1911 (1987).
5. O.E. Edwards, G. Feniak, M. Los. Canadian J. of Chemistry, v. 40, р. 1540 (1962).
6. Б.А. Кривут, Л.П. Толстых, Н.А. Федюнина. Метод количественного определения производных ройлеанона (окси- и ацетоксиройлеанонов) в корнях шалфея лекарственного. Хим.-фарм. ж., 1980, №12, стр. 66-68.
7. Отчет группы химиотерапии отдела медицины ВИЛАР за 2012 г.
Способ получения 7-гидроксиройлеанона, обладающего антимикробным действием, включающий экстракцию измельченных корней шалфея лекарственного 96% этиловым спиртом с последующим упариванием экстракта, обработкой водой, отгонкой спирта и обработкой гидрофобным растворителем или экстракцию указанного сырья хлороформом с последующей обработкой экстракта водой и упариванием; затем целевой продукт извлекают из органической фазы переведением в растворимые в воде феноляты, обрабатывая водным раствором гидроксида натрия; промывают щелочной раствор хлороформом; подкисляют соляной или серной кислотой; полученный осадок отфильтровывают; сушат и измельчают.
