Иммунобиологическое средство для лечения рака мочевого пузыря и способ его использования
Владельцы патента RU 2555327:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Группа изобретений относится к медицине и касается иммунобиологического средства для лечения рака мочевого пузыря на основе вакцины БЦЖ, включающего фрагмент пептидогликана, содержащий в своей структуре диаминопимелиновую кислоту. Группа изобретений также касается способа использования указанного иммунобиологического средства для лечения рака мочевого пузыря. Группа изобретений обеспечивает увеличенную противоопухолевую активность. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 пр., 5 ил., 4 табл.
Область техники
Изобретение относится к иммунологии, а именно к иммунобиологическим композициям, и может быть использовано как иммуностимулирующее средство для лечения рака мочевого пузыря, а также для профилактики рецидивов рака мочевого пузыря после оперативного лечения.
Предшествующий уровень техники
Рак мочевого пузыря (РМП) является одной из актуальных проблем современного здравоохранения. По данным ВОЗ, РМП составляет 3% всех выявляемых злокачественных заболеваний и 70% всех новообразований мочевой системы в мире. Основным методом лечения РМП является оперативный способ. Однако результаты самостоятельного хирургического лечения больных РМП часто остаются неудовлетворительными. После удаления опухоли у 60 - 70% больных наблюдаются рецидивы заболевания.
Поиск методов, позволяющих улучшить результаты оперативного лечения, является важной задачей современной онкоурологии.
Известен способ лечения поверхностного рака мочевого пузыря (Матвеев Б.П., Фигурин К.М. и Карякин О.Б. "Рак мочевого пузыря", Москва, 2001 г.), в котором авторы предлагают вводить противоопухолевые препараты в мочевой пузырь после оперативного удаления опухоли. Однако недостатком данного метода является высокая токсичность химиопрепаратов, которые действуют на всю стенку мочевого пузыря.
Известно решение (патент РФ № RU 2290096), при котором предлагается способ введения химиопрепаратов с помощью микроирригаторов, которые вшивают в подслизистый слой мочевого пузыря пациентов после оперативного вмешательства. Данный способ позволяет уменьшить общую токсичность химиопрепаратов за счет локального введения, однако имеет недостаток, связанный с высокой травматичностью метода, поскольку требует дополнительного оперативного вмешательства для удаления микроирригаторов.
Известно также решение по патенту US 5194257, где заявлено использование бацилл Кальмета-Герена (БЦЖ), которые вводятся в мочевой пузырь после оперативного удаления опухоли. Данное решение основывается на том, что БЦЖ является мощным неспецифическим иммуностимулятором, вызывающим комплекс локальных иммунных реакций, в котором задействованы Т- и В-лимфоциты, макрофаги, и целый ряд цитотоксичеких цитокинов, что обеспечивает ее противоопухолевую активность.
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип.
К недостаткам прототипа можно отнести следующее:
1) относительно низкая иммуностимулирующая активность, которая требует введения высоких доз БЦЖ и приводит к увеличению токсичности;
2) небольшая длительность эффекта, которая требует многократных инстилляция БЦЖ.
Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке эффективного препарата для лечения рака мочевого пузыря после оперативного удаления опухолей, которое было бы лишено указанных недостатков.
Раскрытие настоящего изобретения.
Задачей настоящего изобретения является создание иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ, обладающего высокой иммуностимулирующей активностью и пролонгированностью действия, с возможностью его использования в терапии рака мочевого пузыря, с обеспечением индукции широкого спектра иммунных реакций, формируемых за счет дополнительной стимуляции врожденной иммунной системы посредством активации NOD рецепторов 1.
Указанная выше задача настоящего изобретения решается за счет того, что, создано иммунобиологическое средство для лечения рака мочевого пузыря на основе вакцины БЦЖ, при этом оно дополнительно включает фрагмент пептидогликана, содержащий в своей структуре диаминопимелиновую кислоту, взятые в эффективном количестве. В качестве фрагментов пептидогликана используют фрагменты пептидогликана, полученные из клеточной стенки бактерий. В качестве фрагментов пептидогликана могут быть также использованы фрагменты пептидогликана, полученные путем химического синтеза. В одной дозе содержится:
БЦЖ - от 103 КОЕ/дозу до 1010 КОЕ/дозу,
низкомолекулярный фрагмент пептидогликана - от 10 пг/дозу до 10 мг/дозу.
Заявленное иммунобиологическое средство используют в эффективном количестве для терапии рака мочевого пузыря.
Противоопухолевое действие БЦЖ связано с ее иммуностимулирующими свойствами. Известно, что в состав данных бактерий входят структуры, являющиеся лигандами рецепторов врожденной иммунной системы (TLR4, TLR5 и др.). Взаимодействие компонентов БЦЖ с данными рецепторами приводит к активации различных транскрипционных факторов (например, транскрипционного фактора NF-kB), контролирующих экспрессию целого ряда провоспалительных молекул.
Так, было показано, что введение БЦЖ усиливает экспрессию адгезионных и костимуляторных молекул, включая внутриклеточные адгезионные молекулы ICAM-1, которые влияют на связывание Т-лимфоцитов и нейтрофилов с опухолевыми клетками. Также есть литературные данные, указывающие на то, что при введении данных бактерий, увеличивается экспрессия HLAII, CD80, CD1b молекул, происходит индукция экспрессии ряда цитокинов, таких как интерлейкин-8 (ИЛ-8), интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухолей альфа (TNFα), гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (GM-CSF).
Фрагмент пептидогликана, содержащий диаминопимелиновую кислоту, является агонистом NOD рецептора 1. Диаминопимелиновая кислота является минимальным фрагментом, который распознает данный рецептор. При этом изменение состава других аминокислот и моносахаридов, входящих в состав пептидогликана, позволяет модулировать активность данного соединения.
Согласно литературным данным лиганды NOD рецептора 1 способны усиливать апоптоз, опосредованный каспазой 9. Активация NOD1 рецептора приводит усилению ряда иммунных реакций, например, усилению фагоцитоза, активации зрелых Т-клеток, пролиферации и созревания В-клеток, процессинге и презентации антигена дендритными клетками, прямой активации В-клеток памяти и последующей продукции антител, в том числе IgG, и других (Palm N.W. Medzhitov R., Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 2009 Jan;227(1):221-33).
Полученное иммунобиологическое средство, содержащее вакцину БЦЖ и низкомолекулярные фрагменты пептидогликана, обеспечивает значительно больший уровень индукции иммунных реакций по сравнению с интенсивностью тех эффектов, которые инициируются при применении индивидуальных компонентов, входящих в его состав.
Минимальное количество исследований, которое необходимо, чтобы доказать эффективность иммунобиологического средства, разработанного авторами, включает сравнение способности индуцировать иммунные реакции, изучение противоопухолевой активности и токсичности.
Краткое описание фигур
На фиг.1 представлена схема работы репортерной конструкции, которая находится под контролем NF-kB-зависимого промотора.
На фиг.2 представлена гистограмма, показывающая изменение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках ТНР-1 при добавлении к ним иммунобиологических средств, содержащих различное количество БЦЖ и диаминопимелиновой кислоты.
Ось ординат - оптическая плотность OD415
Ось абсцисс - концентрация диаминопимелиновой кислоты (мг/дозу)
Ось аппликат - концентрация БЦЖ (КОЕ/дозу)
На фиг.3 представлена гистограмма, показывающая изменение концентрации цитокинов IL-1a, IL-6, МСР-1, CXCL-1, MIP-1a в клетках ТНР-1 при добавлении иммунобиологических средств на основе вакцины БЦЖ. Ось ординат - концентрация цитокинов, пг/мл
Ось абсцисс: 1-IL-1α, 2-IL-6, 3-МСР-1, 4-CXCL-1, 5-MIP-1α
На фиг.4 представлена схема эксперимента по проверке противоопухолевой активности иммунобиологического средства на основе БЦЖ. По оси абсцисс указано время с начала эксперимента (недели), А - введение N-метил-М-нитрозомочевины, Б - введение физиологического раствора, В - введение вакцины БЦЖ, Г - введение иммунобиологического средства на основе БЦЖ.
На фиг.5 представлена гистограмма, показывающая изменение коэффициента токсичности в клетках ТНР-1 при добавлении к ним иммунобиологических средств, содержащих различное количество БЦЖ и диаминопимелиновой кислоты.
Ось ординат - коэффициент токсичности, %.
Ось абсцисс - концентрация диаминопимелиновой кислоты (мг/дозу).
Ось аппликат - концентрация БЦЖ (КОЕ/дозу).
Примеры осуществления настоящего изобретения
Пример 1
Определение доз БЦЖ и фрагмента пептидогликана, содержащего диаминопимелиновую кислоту, в составе разрабатываемого иммунобиологического средства Исходя из литературных данных, основным механизмом противоопухолевой активности БЦЖ является стимуляция иммунных реакций. Целью данного эксперимента было определить дозы действующих веществ иммунобиологического средства на основе БЦЖ путем анализа их иммуностимулирующих свойств. На первом этапе инвазии, БЦЖ активирует различные рецепторы врожденной иммунной системы. Другой компонент иммунобиологического средства - фрагмент пептидогликана, содержащий в своей структуре диаминопимелиновую кислоту, также является агонистом рецепторов врожденной иммунной системы -NOD рецепторов 1. Активация соответствующих рецепторов БЦЖ и фрагментами пептидогликана приводит к усилению активности транскрипционных факторов (в том числе транскрипционного фактора NF-kB), которые регулируют экспрессию различных провоспалительных белков и, как следствие, развитие тех или иных иммунных реакций. Таким образом, оценка активности транскрипционного фактора NF-kB позволит косвенно оценить эффективность стимуляции иммунных реакций. Для определения активности NF-kB была выбрана модель на основе клеточной линии моноцитарной лейкемии человека ТНР-SEAP, содержащей ген щелочной фосфатазы под контролем NF-kB-зависимого промотера (см. фиг.1).
Клетки пассировались на 25 см2 культуральных флаконах в ростовой среде RPMI с 10% эмбриональной сывороткой. Для проведения анализа клетки были рассеяны на 96-луночный планшет в количестве 105 клеток на лунку. После рассева клеток планшет инкубировали при +37°C и 5% CO2 в течение 24 часов.
Далее был получен ряд иммунобиологических средств на основе вакцины БЦЖ (в следующих концентрациях: 0, 102 КОЕ/дозу, 103 КОЕ/дозу, 104 КОЕ/дозу, 105 КОЕ/дозу, 106 КОЕ/дозу, 107 КОЕ/дозу, 108 КОЕ/дозу, 109 КОЕ/дозу, 1010 КОЕ/дозу, 1011 КОЕ/дозу), и фрагмента пептидогликана: L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновой кислоты (в следующих концентрациях: 1 пг/дозу, 10 пг/дозу, 100 пг/дозу, 1 мкг/дозу, 10 мкг/дозу, 100 мкг/дозу, 1 мг/дозу, 10 мг/дозу, 100 мг/дозу). Под дозой понимается количество препарата, предназначенное для единовременного (за 1 инстилляцию) введения в мочевой пузырь. Объем препарата, рекомендованный для одной инстилляции в мочевой пузырь, составляет 50 мл (инструкции к препаратам «Иммурон-вак», «Уро-БЦЖ медак»). Поскольку препарат содержит живые бактериальные клетки, для разведения рекомендуется использовать любой изотонический растворитель надлежащего фармацевтического качества. В данном случае нами использовался физиологический раствор.
После разведения препаратов 10 мкл из каждого образца было добавлено в соответствующие лунки планшета.
Далее клетки инкубировали 18 часов. Затем из лунок планшета удаляли ростовую среду и добавляли по 100 мкл раствора п-нитрофенилфосфата (4 мг/мл). Далее определяли активность фермента щелочной фосфатазы путем измерения оптической плотности раствора, при длине волны 405 нм 3 раза с интервалом 10 минут. В данном случае изменение оптической плотности раствора пропорционально количеству фермента щелочной фосфатазы, а следовательно, пропорционально активности транскрипционного фактора NF-kB. Полученные результаты представлены в Таблице 1.
| Таблица 1 | ||||||||||||
| Концентрация БЦЖ (КОЕ/дозу) | ||||||||||||
| Концентрация L-аланина-γ-D-глутамил-мезо-диаминопимелиновой кислоты | 0 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 | 1010 | 1011 | |
| 0 пг/дозу | 0 | 0,18 | 0,2 | 0,25 | 0,34 | 0,55 | 0,62 | 0,95 | 1,01 | 1,05 | 1,40 | |
| 1 пг/дозу | 0,1 | 0,09 | 0,21 | 0,30 | 0,33 | 0,57 | 0,65 | 0,92 | 1,05 | 1,10 | 1,41 | |
| 10 пг/дозу | 0,05 | 0,08 | 0,47 | 0,50 | 0,70 | 1,08 | 0,90 | 1,00 | 1,21 | 1,35 | 1,58 | |
| 100 пг/дозу | 0,25 | 0,23 | 0,53 | 0,74 | 1,04 | 1,10 | 1,11 | 1,10 | 1,23 | 1,42 | 1,71 | |
| 1 нг/дозу | 0,27 | 0,27 | 0,55 | 0,80 | 1,11 | 1,41 | 1,40 | 1,41 | 1,41 | 1,58 | 1,61 | |
| 10 нг/дозу | 0,30 | 0,28 | 0,61 | 0,89 | 1,19 | 1.57 | 1,40 | 1,42 | 1,43 | 1,63 | 1,63 | |
| 100 нг/дозу | 0,41 | 0,49 | 0,78 | 0,91 | 1,26 | 1,59 | 1,56 | 1,63 | 1,62 | 1,71 | 1,78 | |
| 1 мкг/дозу | 0,46 | 0,51 | 0,83 | 1,11 | 1,32 | 1,60 | 1,75 | 1,75 | 1,81 | 1,84 | 1,90 | |
| 10 мкг/дозу | 0,49 | 0,58 | 0,92 | 1,17 | 1,51 | 1,72 | 1,78 | 1,79 | 1,87 | 1,87 | 1,99 | |
| 100 мкг/дозу | 0,57 | 0,61 | 1,02 | 1,23 | 1,76 | 1,80 | 1,89 | 1,84 | 1,90 | 1,98 | 2,03 | |
| 1 мг/дозу | 0,63 | 0,67 | 1,30 | 1,43 | 1,79 | 1,91 | 2,08 | 1,80 | 1,95 | 2,01 | 1,98 | |
| 10 мг/дозу | 0,81 | 0,75 | 1,54 | 1,78 | 1,93 | 2,05 | 2,11 | 2,15 | 2,00 | 2,12 | 1,85 | |
| 100 мг/дозу | 0,94 | 1 | 1,80 | 2,20 | 2,15 | 2,30 | 2,25 | 2,22 | 2,35 | 2,40 | 1,83 |
Для наглядности полученные данные представлены также в виде трехмерной гистограммы (см. фиг.2), где ось ординат - оптическая плотность OD415, ось абсцисс - концентрация L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновой кислоты (мг/дозу), ось аппликат - концентрация БЦЖ (КОЕ/дозу)
Использованная в эксперименте L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновая кислота была получена из клеточной стенки бактерий (E.coli) согласно стандартной методике (J.Heijenoort, L. Elbaz, P.MI&Je, A. Petit, Е. Bricas, J. Ghuysen, Structure of the meso-Diaminopimelic Acid Containing Peptidoglycans in Escherichia coli В and Bacillus megaterium KM, Biochemistry, 1969, №8 (1), 207-213): выделение γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновой кислоты проводили с помощью хроматографии с использованием двух соединенных последовательно колонок Sephadex G-50-G25, с последующей финальной очисткой методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке С18. Дополнительный эксперимент был также проведен с L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновая кислотой, полученной методом химического синтеза по стандартной методике (A. Roychowdhury, М. Wolfert, G.Boons Synthesis and Proinflammatory Properties of Muramyl Tripeptides Containing Lysine and Diaminopimelic Acid Moieties, ChemBioChem 2005, 6, 2088 - 2097). L-аланин -γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновая кислота была синтезирована с использованием стандартных методов пептидного синтеза из производных мезодиаминопимелиновой кислоты, глутамина и аланина.
Результаты экспериментов, поставленных с использованием фрагментов пептидогликана, полученных различными методами (химическим синтезом и выделением из клеточной стенки бактерий), не отличались.
Как видно из представленных данных, иммунобиологическое средство на основе БЦЖ и низкомолекулярных фрагментов пептидогликана эффективно активирует основной провоспалительный транскрипционный фактор NF-kB в диапазоне концентраций БЦЖ (103 КОЕ/дозу - 1011 КОЕ/дозу), L-аланил-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновой кислоты (10 пг/дозу - 100 мг/дозу). При этом происходит значительное повышение интенсивности (потенциирование) эффектов, так как активация транскрипционного фактора NF-kB при действии иммунобиологического средства гораздо выше, чем сумма уровней активации NFkB его отдельными компонентами.
Пример 2
Оценка длительности эффекта иммунобиологического средства на основе БЦЖ и фрагментов пептидогликана, содержащего в своей структуре диаминопимелиновую кислоту
Целью данного эксперимента было сравнить длительность эффекта разработанного иммунобиологического средства по сравнению с вакциной БЦЖ (по способности активировать транскрипционный фактор NFkB).
Для определения активности NF-kB была выбрана модель на основе клеточной линии моноцитарной лейкемии человека ТНР-SEAP, содержащей ген щелочной фосфатазы под контролем NF-kB-зависимого промотера (см. фиг.1).
Клетки пассировались на 25 см2 культуральных флаконах в ростовой среде RPMI с 10% эмбриональной сывороткой. Для проведения анализа клетки были рассеяны на 96-луночный планшет в количестве 105 клеток на лунку. После рассева клеток планшет инкубировали при +37°C и 5% CO2 в течение 24 часов.
Через сутки к клеткам были добавлены следующие образцы:
1) иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (105 КОЕ/дозу), фрагмента пептидогликана, содержащего в своей структуре диаминопимелиновую кислоту (в данном случае L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновая кислота, 100 нг/дозу),
2) БЦЖ(104 КОЕ/дозу),
3) фрагмент пептидогликана, содержащий диаминопимелиновую кислоту (L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновая кислота, 100 нг/дозу).
Активность транскрипционного фактора NF-kB определяли через 6, 12, 18, 24 часа.
Затем из лунок планшета удаляли ростовую среду и добавляли по 100 мкл раствора п-нитрофенилфосфата (4 мг/мл). Далее определяли активность фермента щелочной фосфатазы, путем измерения оптической плотности раствора, при длине волны 405 нм 3 раза с интервалом 10 минут.В данном случае изменение оптической плотности раствора пропорционально количеству фермента щелочной фосфатазы, а следовательно, пропорционально активности транскрипционного фактора NF-kB. Полученные результаты представлены в Таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| Время после добавления лигандов, ч | ||||
| 6 | 12 | 18 | 24 | |
| Иммунобиологическое средство на основе БЦЖ |
0,15 | 0,94 | 0,97 | 0,68 |
| БЦЖ | 0,8 | 0,23 | 0,11 | 0,05 |
| Фосфатный буфер | 0 | 0,05 | 0,01 | 0,03 |
Результаты экспериментов, поставленных с использованием фрагментов пептидогликана, полученных различными методами (химическим синтезом и выделением из клеточной стенки бактерий), не отличались.
Как видно из представленных данных, иммунобиологическое средство на основе БЦЖ и низкомолекулярных фрагментов пептидогликана обладает пролонгированным действием по сравнению с БЦЖ.
Пример 3
Оценка иммуностимулирующих свойств иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ и фрагмента пептидогликана, содержащего в своей структуре диаминопимелиновую кислоту
Целью данного эксперимента было сравнить иммуностимулирующие свойства разработанного иммунобиологического средства по сравнению с вакциной БЦЖ (по способности индуцировать выброс цитокинов).
Для этого была выбрана модель культуры клеток моноцитарной лейкемии человека ТНР-1. Из литературных данных известно, что моноциты - это одна из главных клеточных популяций, принимающих участие в противораковом иммунитете. Кроме того, клетки данной линии экспрессируют достаточно большой спектр цитокинов.
Для оценки уровня экспрессии цитокинов были выбраны тест-системы фирмы eBioscience (BMS810FF, BMS821FF) для мультиплексного анализа, которые позволяют измерять уровень экспрессии 17 цитокинов и хемокинов.
Для исследования были выбраны такие концентрации действующих веществ иммунобиологического средства: БЦЖ и фрагмента пептидогликана, которые лежат в центре исследованного в примере 1 диапазона концентраций.
Клетки пассировались на 25 см2 культуральных матрасах в ростовой среде RPMI с 10% эмбриональной сывороткой. Для проведения анализа клетки были рассеяны на 96-луночный планшет в количестве 105 клеток на лунку. После рассева клеток планшет инкубировали при +37°C и 5% CO2 в течение 24 часов. Через сутки к клеткам были добавлены следующие образцы:
1) иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (105 КОЕ/дозу), фрагмента пептидогликана, содержащего в своей структуре диаминопимелиновую кислоту (в данном случае L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновая кислота, 100 нг/дозу),
2) БЦЖ(104 КОЕ/дозу),
3) фрагмент пептидогликана, содержащий диаминопимелиновую кислоту (L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновая кислота, 100 нг/дозу).
В эксперименте использовали фрагменты пептидогликана, полученные путем химического синтеза (по приведенной в примере 1 методике).
Далее клетки инкубировали 18 часов. Затем определяли уровень экспрессии цитокинов с помощью коммерческого набора. Полученные результаты представлены на фиг.2, где ось ординат - концентрация цитокинов, пг/мл, ось абсцисс: 1-1L-1α, 2-IL-6, 3-МСР-1, 4-CXCL-1, 5-М1Р-1α,
Было показано, что разработанное иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ индуцирует экспрессию цитокинов: IL-1α, IL-6, МСР-1, CXCL-1, MIP-1α, которые играют важную роль в противоопухолевом иммунном ответе. При этом происходит потенциирование эффектов: поскольку уровень экспрессии цитокинов при действии иммунобиологического средства гораздо выше, чем сумма уровней активации цитокинов его отдельными компонентами.
Аналогичные результаты были получены в эксперименте с использованием фрагментов пептидогликана, полученных путем выделения из клеточной стенки бактерий (по приведенной в примере 1 методике).
Пример 4
Оценка противоопухолевой активности иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ и фрагментов пептидогликана, содержащего в своей структуре диаминопимелиновую кислоту
Целью данного примера является оценка противоопухолевой эффективности иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ на модели рака мочевого пузыря мышей, индуцируемого N-метил-N-нитрозомочевиной.
На фиг.4 представлена схема эксперимента. По оси абсцисс указано время с начала эксперимента (недели), А - введение N-метил-N-нитрозомочевины, Б - введение физиологического раствора, В - введение БЦЖ, Г - введение иммунобиологического средства на основе БЦЖ.
Для проведения эксперимента были использованы мыши линии BALB/c, самки, весом 18-20 г. Все животные были катетеризованы по стандартной методике (С.Hung, К. Dodson, S. Hultgren, A murine model of urinary tract infection, Nature protocols, 4, 1230-1243, 2009). Далее всем животным вводили N-метил-N-нитрозомочевину (0,2 мг/мышь) в объеме 50 мкл. Данную процедуру повторяли еженедельно, в течение 10 недель. Таким образом, общая доза N-метил-N-нитрозомочевины составила 2 мг/мышь. После окончания курса N-метил-N-нитрозомочевины все животные были разделены на три группы, которым вводили
1) иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (104 КОЕ/дозу), отличающееся тем, что оно включает фрагмент пептидогликана, содержащий в своей структуре диаминопимелиновую кислоту (в данном случае L-аланил-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновую кислоту, 100 нг/дозу),
2) БЦЖ (104 КОЕ/дозу),
3) фрагмент пептидогликана, содержащий диаминопимелиновую кислоту (L-аланил-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновую кислоту, 100 нг/дозу.)
Для исследования были выбраны такие концентрации действующих веществ иммунобиологического средства: БЦЖ и фрагмента пептидогликана, которые лежат в середине исследованного в примере 1 диапазона концентраций.
Препараты вводились в мочевой пузырь с помощью катетера в терапевтической дозе, 3 раза с интервалом в неделю. Через 12 недель после последней инстилляции животные были усыплены.
Далее был подготовлен гистологический препарат мочевого пузыря. Все органы были помещены в заливочные формы, наполненные средой для замораживания образцов (кат№05-9891, Bio-Optica), и заморожены в спирте, охлажденном жидким азотом. Далее с помощью криотома Shandon (UK) были подготовлены срезы толщиной 10 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологическое изучение срезов проводили при увеличениях микроскопа ×100 и ×400. Полученные результаты представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | |||
| Гистология | Вакцина БЦЖ | Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ, отличающееся тем, что оно включает фрагмент пептидогликана, содержащий в своей структуре диаминопимелиновую кислоту |
Физиологи ческий раствор |
| Количество участков | Количество участков | Количество участков | |
| Переходнокле точный рак |
43 | 34 | 60 |
| Предрак | 26 | 29 | 25 |
| Отсутствие патологии |
31 | 37 | 15 |
Анализ гистологических изменений, полученных образцов показал, что в группе, которая получала БЦЖ, переходноклеточный рак встречался в 43% случаев, тогда как в группе, которая получала иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ, отличающееся тем, что оно включает фрагмент пептидогликана, содержащий в своей структуре диаминопимелиновую кислоту, переходноклеточный рак наблюдался в 34% случаев. Предраковое состояние было диагностировано в 26% случаях после введения вакцины БЦЖ и в 29% случаях после введения иммунобиологического средства на основе БЦЖ.
В эксперименте использовали фрагменты пептидогликана, полученные путем химического синтеза (по приведенной в примере 1 методике).
Аналогичные результаты были получены в эксперименте с использованием фрагментов пептидогликана, полученных путем выделения из клеточной стенки бактерий (по приведенной в примере 1 методике).
Исходя из полученных результатов проделанной работы можно заключить, что иммунобиологическое средство на основе БЦЖ имеет ярковыраженную противоопухолевую активность и обладает большим терапевтическим эффектом, чем прототип - БЦЖ.
Пример 5
Оценка токсичности иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ и фрагментов пептидогликана, содержащего в своей структуре диаминопимелиновую кислоту
Целью данного исследования являлось определение безопасности и потенциальных токсических эффектов иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ.
На первом этапе была определена токсичность иммунобиологического средства in vitro. Для этого были использованы клетки моноцитарной лейкемии человека ТНР-1.
Клетки пассировались на 25 см2 культуральных флаконах в ростовой среде DMEM с 10% эмбриональной сывороткой. Для проведения анализа клетки были рассеяны на 96-луночный планшет в количестве 105 клеток на лунку. После рассева клеток планшет инкубировали при +37°C и 5% CO2 в течение 24 часов.
Далее к клеткам были добавлены иммунобиологические средства на основе БЦЖ с теми же концентрациями действующих веществ, что и в примере 1:
БЦЖ - 0 КОЕ/дозу, 102 КОЕ/дозу, 103 КОЕ/дозу, 104 КОЕ/дозу, 105 КОЕ/дозу, 106 КОЕ/дозу, 107 КОЕ/дозу, 108 КОЕ/дозу, 109 КОЕ/дозу, 1010 КОЕ/дозу, 1011 КОЕ/дозу
L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновая кислота - 0 пг/дозу, 1 пг/дозу, 10 пг/дозу, 100 пг/дозу, 1 мкг/дозу, 10 мкг/дозу, 100 мкг/дозу, 1 мг/дозу, 10 мг/дозу, 100 мг/дозу
Под дозой понимается количество препарата, предназначенное для единовременного (за 1 инстилляцию) введения в мочевой пузырь. Объем препарата, рекомендованный для одной инстилляции в мочевой пузырь, составляет 50 мл. Поскольку препарат содержит живые бактериальные клетки, для разведения рекомендуется использовать любой изотонический растворитель надлежащего фармацевтического качества. В данном случае был использован физиологический раствор.
Клетки инкубировали в течение 18 часов. Затем из лунок планшета удаляли ростовую среду и добавляли по 50 мкл охлажденного спирта для фиксации клеток. Далее к фиксированным клеткам добавляли 100 мкл 0,1% раствора метиленового голубого. Через 20 минут лунки промывали дистиллятом от несвязавшегося красителя, высушивали и затем экстрагировали метиленовый голубой 1% раствором SDS. Оптическую плотность измеряли при длине волны: 540 нм и 620 нм. Результат необходимо было представить в виде разницы значений (Z), измеренных при длине волны 620 и 540 нм. Определялся коэффициент токсичности образца Т:
где Z контроль - разница значений оптической плотности, измеренных при длине волны 620 и 540 нм, в отрицательном контроле,
Z эксперимент - разница значений оптической плотности, измеренных при длине волны 620 и 540 нм, в опытной лунке.
При этом Т=0 означает, что препарат не токсичен и не влияет на выживаемость данной клеточной культуры, а Т=100% означает, что препарат токсичен и в лунке планшета нет живых клеток.
Полученные результаты представлены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||||||||||
| Концентрация БЦЖ (КОЕ/дозу) | ||||||||||||
| Концентрация L-аланина-γ-D-глутамил-мезо-диаминопимелиновой кислоты | 0 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 | 1010 | 1011 | |
| 0 пг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | |
| 1 пг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 11 | |
| 10 пг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 14 | |
| 100 пг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 15 | |
| 1 нг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 17 | |
| 10 нг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 21 | |
| 100 нг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 29 | |
| 1 мкг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 30 | |
| 10 мкг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 36 | |
| 100 мкг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 38 | |
| 1 мг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2 | 4 | 41 | |
| 10 мг/дозу | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 1 | 4 | 6 | 9 | 43 | |
| 100 мг/дозу | 9 | 9 | 10 | 14 | 19 | 21 | 24 | 27 | 33 | 38 | 46 |
Для наглядности полученные данные представлены также в виде трехмерной гистограммы (см. фиг.5), где ось ординат - коэффициент токсичности, %, ось абсцисс - концентрация L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновой кислоты (мг/дозу), ось аппликат - концентрация БЦЖ (КОЕ/дозу)
В эксперименте использовали фрагменты пептидогликана, полученные путем химического синтеза (по приведенной в примере 1 методике).
Аналогичные результаты были получены в эксперименте с использованием фрагментов пептидогликана, полученных путем выделения из клеточной стенки бактерий (по приведенной в примере 1 методике).
Как видно из представленных результатов, наибольшей токсичностью обладали иммунобиологические средства, содержащие БЦЖ в концентрации 1011 КОЕ/дозу и γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновую кислоту (концентрация 100 мг/дозу). Остальные иммунобиологические средства, содержащие БЦЖ (103-1010 КОЕ/дозу) и L-аланин-γ-D-глутамилмезодиаминопимелиновую кислоту (10 пг/дозу -10 мг/дозу), либо не обладали токсичностью, либо обладали незначительной токсичностью. Следовательно, данные концентрации БЦЖ и фрагмента пептидогликана могут использоваться для создания иммунобиологического средства.
Использование совместно в композиции БЦЖ и фрагментов пептидогликана приводит к активации соответствующих рецепторов БЦЖ и фрагментами пептидогликана и к усилению активности транскрипционных факторов (в том числе транскрипционного фактора NF-kB), которые регулируют экспрессию различных провоспалительных белков и, как следствие, развитие тех или иных иммунных реакций.
В приведенных примерах было показано, что разработанное иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ индуцирует экспрессию цитокинов: IL-1α, IL-6, МСР-1, CXCL-1, MIP-1α, которые играют важную роль в противоопухолевом иммунном ответе. При этом происходит потенциирование эффектов: поскольку уровень экспрессии цитокинов при действии иммунобиологического средства гораздо выше, чем сумма уровней активации цитокинов его отдельными компонентами. Пролонгированный эффект достигается за счет потенциирования индукции иммунных реакций по сравнению с интенсивностью тех эффектов, которые инициируются при применении индивидуальных компонентов, входящих в его состав (пример 2).
Аналогичные результаты были получены в эксперименте с использованием фрагментов пептидогликана, полученных путем выделения из клеточной стенки бактерий (по приведенной в примере 1 методике).
Таким образом, подтверждается изобретательский уровень данного изобретения.
Промышленная применимость. Результаты, приведенные в примерах, подтверждают промышленную применимость заявленного изобретения и выполнение поставленной задачи, а именно создание иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ и фрагмента пептидогликана, содержащего в своей структуре диаминопимелиновую кислоту, обладающего высокой иммуностимулирующей активностью и пролонгированностью действия, с возможностью его использования в терапии рака мочевого пузыря, с обеспечением индукции широкого спектра иммунных реакций, формируемых за счет дополнительной стимуляции врожденной иммунной системы посредством активации NOD рецепторов 1.
1. Иммунобиологическое средство для лечения рака мочевого пузыря на основе вакцины БЦЖ, отличающееся тем, что оно дополнительно включает фрагмент пептидогликана, содержащий в своей структуре диаминопимелиновую кислоту, взятые в эффективном количестве.
2. Иммунобиологическое средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве фрагментов пептидогликана используют фрагменты пептидогликана, полученные из клеточной стенки бактерий.
3. Иммунобиологическое средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве фрагментов пептидогликана используют фрагменты пептидогликана, полученные путем химического синтеза.
4. Иммунобиологическое средство по п.1, отличающееся тем, что в одной дозе содержится:
БЦЖ - от 103 КОЕ/дозу до 1010 КОЕ/дозу,
низкомолекулярный фрагмент пептидогликана - от 10 пг/дозу до 10 мг/дозу.
5. Способ использования иммунобиологического средства по п.1 для лечения рака мочевого пузыря.
