Штамм bacillus sp. для биологической борьбы с saprolegnia sp. и его применения
Группа изобретений относится к области биотехнологии и микробиологии. Предложены штамм Bacillus sp. КССМ11143Р, обладающий противогрибковой активностью в отношении Saprolegnia sp., культуральная жидкость, полученная при культивировании штамма, пробиотическая композиция, кормовая добавка, противогрибковое средство и средство для улучшения качества воды, содержащие штамм Bacillus sp. КССМ11143Р или его культуральную жидкость. Также предложены способ культивирования рыбы или ракообразных, способ предотвращения сапролегниоза у животных и способ улучшения качества воды с использованием штамма Bacillus sp. КССМ11143Р или его культуральной жидкости. Штамм Bacillus sp. КССМ11143Р имеет высокий уровень продуктивности сидерофоров с проявлением высокой способности захвата железа, и таким образом ингибирует рост других патогенных бактерий и Saprolegnia sp., способствует увеличению скорости потребления пищи рыбой и скорости увеличения веса, а также снижению уровня экскреции, что приводит к улучшению качества воды. 9 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл., 15 пр.
Область техники
Изобретение относится: к пробиотикам для биологической борьбы с Saprolegnia sp. и, в частности, к свежевыделенному штамму Bacillus, который ингибирует рост патогенного гриба Saprolegnia sp.и продуцирует сидерофоры; культуральной жидкости, полученной при культивировании штамма, ее концентрату или сухому продукту из нее; пробиотической композиции, кормовой добавке, противомикробному средству, противогрибковому средству или средству для улучшения качества воды, включающим штамм, его культуральную жидкость, ее концентрат или сухой продукт из нее; способу культивирования рыб или ракообразных с применением штамма, его культуральной жидкости, ее концентрата или сухого продукта из нее; способу предотвращения сапролегниоза у животных путем добавления штамма, его культуральной жидкости, ее концентрата или сухого продукта из нее; и способу улучшения качества воды путем обработки штаммом, его культуральной жидкостью, ее концентратом или сухим продуктом из нее.
Уровень техники
В развитых регионах, таких как США, Европа и Япония, много внимания уделялось улучшению режима питания для предотвращения заболеваний у взрослых, так как население мира и уровень жизни людей растут. Соответственно, спрос на рыбные продукты продолжает увеличиваться, что приводит к быстрому росту продукции аквакультуры. Отрасль аквакультуры стала вносить важный вклад в экономику многих стран, а вспышка заболеваний среди культивируемой рыбы приводит к значительным экономическим потерям (Jose Luis Balcazar et al. Veter. Microbio. 114(2006):173-186; Laurent venrschuere et al. Microbio. Mot. BioLRev. Dec. 2000. 655-671).
Возникновение заболеваний на рыбных фермах вызвано инфицированной рыбой или патогенами, которые переносятся из морской окружающей среды вблизи аквакультурных ферм, а также вызвано поставкой зараженного рыбного корма или антисанитарными условиями на рыбных фермах. Инфекционные заболевания рыбы делятся на грибковые, бактериальные и вирусные инфекции. Среди них типичную грибковую инфекцию вызывает Saprolegnia sp. (Diagnosis of Fish Diseases and Treatment Measures, The Ministry of Maritime Affairs and Fisheries, 2001). Saprolegnia sp. повсеместно распространена в пресноводных экосистемах и является главным родом водных плесеней, ответственных за значимые грибковые инфекции пресноводной рыбы. Saprolegnia sp. внедряется в эпидермальные ткани рыбы, обычно начиная с головы или плавников, и может распространяться по всей поверхности туловища, что приводит к возникновению серьезных заболеваний на рыбных хозяйствах. Сообщалось, что Saprolegnia sp. вызывает первичные инфекции, но в большинстве случаев встречается как вторичный патоген после первичного повреждения кожного покрова рыбы, вызванного паразитами, такими как вирусы и бактерии (Производство водных грибов и рыбы в Египте, II-in vivo этап исследований).
Для предотвращения повреждений, вызванных Saprolegnia sp., использовались синтетические фунгициды (например, малахитовый зеленый и т.д.). Однако эти синтетические фунгициды с трудом поддаются биологическому разложению и имеют тенденцию к сохранению в окружающей среде, что вызывает ухудшение качества окружающей среды, а также вызывает умеренные или тяжелые неблагоприятные эффекты, а некоторые грибы развили устойчивость к этим химическим веществам. Таким образом, применение этих химических веществ стало ограниченным, и было произведено много работ для разработки альтернатив для них (Ebele М. et al. African Journal of Biotechnology Vol. 8 (24), 7130-7132, 2009). В одной из таких работ, патенте США №6160023, раскрыты применение бронопола в лечении различных заболеваний водных организмов, включая грибковые инфекции, протозойные инфекции и бактериальный бранхионекроз, и способ дезинфекции контейнеров для рыбы и/или оборудования с использованием бронопола. Подобным образом, в патенте Кореи №0782500 раскрыто терапевтическое средство от грибковой инфекции рыбы, содержащее экстракт аира тростникового (acorus calamus) в качестве активного ингредиента.
При этом с растущим спросом на безвредную для окружающей среды аквакультуру в настоящее время широкое признание получает применение пробиотиков в качестве усиливающего иммунитет средства. Применение пробитиков популяризировал в 1989 г. R. Fuller, и были составлены в виде кормовой добавки из живых микроорганизмов, которая благоприятно влияет на хозяина за счет улучшения его кишечного микробного баланса. Например, в качестве пробиотиков использовались бактерии, такие как Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium и Bacillus, дрожжи, такие как Saccharomyces, и грибы, такие как Aspergillus. Пробиотики классифицированы как GRAS (общепризнанные безопасными) и не содержат генов, токсичных для человека и животного, а также из них не образуются патогенные вещества. Пробиотики представляют собой микроорганизмы, которые, как доказано, являются эффективными для улучшения продуктивности сельскохозяйственных животных. Пробиотики характеризуются отсутствием патогенности, беспрепятственной пролиферацией in vitro, быстрым ростом в организме и устойчивостью к кислоте и желчи. В дополнение к этому, их активность не должна ингибироваться кормовыми ингредиентами, их эффекты должны сохраняться при комнатной температуре и для удобства они должны легко смешиваться с кормом.
Пробиотики являются эффективными в отношении конкуренции с патогенными бактериями, которые вызывают кишечные заболевания, в отношении предотвращения их прочной адгезии к кишечному эпителию и в отношении быстрого восстановления кишечной микрофлоры, измененной в результате лечения антибиотиками. Кроме того, пробиотики предотвращают инфекцию, вызываемую патогенными микроорганизмами, и ингибируют их пролиферацию, способствуют пролиферации кишечной микрофлоры за счет поддержания оптимальных условий, продуцируют молочную кислоту или уксусную кислоту, составляющие органические кислоты кишечника, и снижают pH в кишечнике для предотвращения пролиферации вредных патогенных бактерий. Таким образом, скармливание пробиотиков с вышеописанными множественными механизмами действия поддерживает кишечную микрофлору и повышает продуктивность сельскохозяйственных животных. В аквакультуре пробиотики также добавляют в рыбный корм или дополнительно в воду. Недавние исследования были проведены для повышения иммунитета к патогенам и улучшения качества воды с применением пробиотиков при культивировании рыб или креветок (Jiqiu Li et al. Aquaculture 291(2009) 3540). Примерами пробиотиков, используемых для биологической борьбы в аквакультуре, служат полезные бактерии, такие как Lactobacillus, Enterococcus и Bacillus. Bacillus представляет собой грамположительную, палочковидную, образующую эндоспоры бактерию и отличается морфологией среди штаммов, используемых в качестве пробиотиков. Штаммы, такие как Bacillus subtilis (В. subtilis), Bacillus cereus (В. cereus), Bacillus coagulans (B. coagulans), Bacillus clausii (B. clausii), Bacillus megaterium (B. megaterium) и Bacillus licheraformis (B. licheniformis), используются в качестве пробиотиков. Bacillus превосходит в термоустойчивости Lactobacillus, который не образует эндоспоры. Кроме того, Bacillus способен выживать при низком pH желудочного барьера, и таким образом большая часть поглощенных бактерий попадает в тонкий кишечник неповрежденными (Barbosa, Т.М. et al. Appl. Enviroa Microbiol. 71(2005)968-978; Spinosa, M.R. et al. Res. Microbiol. 151(2000):61-368). Сообщалось, что Bacillus используется в качестве биологически активных добавок к пище людей и в качестве активаторов роста животных, а также используется при культивировании рыб или креветок для активации роста и устойчивости к заболеваниям, улучшает качество воды и скорость роста креветок и снижает количество патогенных вибрионов (Dalmin, G. et al. Indian J. Exp. Biol 39(2001) 939-942; Wang, Y.B. etal. Fish. Sci. 71(2005) 1034-1039).
При этом сидерофор представляет собой своего рода антибиотик, продуцируемый микроорганизмами, включая патогенные бактерии, которые конкурируют с другими микроорганизмами за быстрый рост и распространение в конкретной окружающей среде. Сидерофоры связываются с ионами железа (Fe3+) и затем транспортируются в клетки через высокоаффинную систему транспорта железа, и ионы железа (Fe3+) поддерживают рост микроорганизмов. Микроорганизмы продуцируют сидерофоры из-за конкуренции за ионы железа (Fe3+), а высокий уровень продукции сидерофоров ингибирует рост других микроорганизмов. В этом отношении бактерии, продуцирующие сидерофоры, активно исследовались для использования в качестве потенциального средства биологической борьбы. В 1970 г. изучали конкуренцию специфических к железу сидерофоров, продуцируемых Pseudomonas sp., в качестве способа биологической борьбы для ингибирования роста патогенов растений (Sang-Min Woo and Sang-Dal Kim, Kor. J. Microbiol. Biotechnol. Vol. 36(4):326-335(2008)), поскольку сообщалось, что супрессивность почв в сельскохозяйственных областях обусловлена антагонистическим действием микроорганизмов в почве. До настоящего времени сообщалось, что сидерофор представляет собой водорастворимый метаболит с низким молекулярным весом 1 кДа или меньше и высокой аффинностью к ионам железа. В зависимости от функциональных групп, связывающих ион железа, сидерофоры делятся на катехоловые и гидроксаматные, и сидерофоры, и пробиотики продуцирующие таковые, активно исследовались. В одном из исследований в патенте США №6746672 раскрыт способ ингибирования роста Lactococcus lactis (L. lactis) с использованием сидерофоров, продуцируемых бифидобактериями. В патенте Кореи №037043 раскрыт новый антагонистический штамм Pseudomonas fluorescens LS20, продуцирующий сидерофор, способ ингибирования роста патогенной для растений ризобактерии Fusarium solani с использованием Pseudomonas fluorescens LS20 и способ лечения заболеваний, вызванных патогенными для растений грибами, с использованием сидерофоров. В патенте Кореи №0747700 раскрыты продуцирующий сидерофоры Bacillus subtilis и композиция для борьбы с Phytophtora capsici или Fusarium oxysporum, включающая продуцируемые им сидерофоры в качестве активного ингредиента
В большей части родственных патентов упоминалось о применении продуцирующих сидерофоры микроорганизмов для биологической борьбы с патогенными для растений бактериями и грибами и не было сообщения о пробиотике на основе Bacillus, применяемом для ингибирования патогенных для рыб бактерий.
Авторы настоящего изобретения выделили пробиотики из природного источника, в котором пробиотики обладают высокой противомикробной активностью против патогенных бактерий и превосходным уровнем продукции пищеварительных ферментов при культивировании рыб и креветок, и они изучили их морфологические, биохимические и генетические свойства. В результате они обнаружили, что пробиотики представляют собой Bacillus с высокой термоустойчивостью, и Bacillus имеет высокий уровень продукции сидерофоров и ингабирования роста водного гриба Saprolegnia sp.
Раскрытие настоящего изобретения
Техническая задача
Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что свежевыделенный Bacillus sp. ингибирует рост водного гриба Saprolegnia sp., и имеет высокий уровень продукции сидерофоров для конкуренции с патогенными бактериями за захват железа, и таким образом может применяться в качестве пробиотической композиции для культивирования рыб и ракообразных, тем самым осуществляя настоящее изобретение.
Решение технической задачи
Целью настоящего изобретения является обеспечение свежевыделенного штамма Bacillus, который ингибирует рост Saprolegnia sp. и продуцирует сидерофоры.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение культуральной жидкости, полученной при культивировании штамма, ее концентрата или сухого продукта из нее.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение пробиотической композиции, включающей штамм, его культуральную жидкость, ее концентрат или сухой продукт из нее.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение кормовой добавки, включающей штамм, его культуральную жидкость, ее концентрат или сухой продукт из нее.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа культивирования рыб или ракообразных с применением штамма, его культуральной жидкости, ее концентрата или сухого продукта из нее.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение противомикробного средства или противогрибкового средства, включающего штамм, его культуральную жидкость, ее концентрат или сухой продукт из нее.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа предотвращения сапролегниоза путем добавления штамма, его культуральной жидкости, ее концентрата или сухого продукта из нее.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение средства для улучшения качества воды, включающего штамм, его культуральную жидкость, ее концентрат или сухой продукт из нее.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа улучшения качества воды путем обработки штаммом, его культуральной жидкостью, ее концентратом или сухим продуктом из нее.
Полезные эффекты настоящего изобретения
Свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения оказывает сильное противогрибковое действие на водный гриб Saprolegnia sp., а также продуцирует сидерофоры.
Таким образом, его можно широко применять в различных продуктах, способствующих борьбе с грибковыми инфекциями, включающими инфекцию Saprolegnia sp. и бактериальные инфекции, таких как кормовые добавки для культивирования водных организмов, пробиотические композиции и средства для улучшения качества воды.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой фотографию, на которой показано, что Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения ингибировал рост водного гриба Saprolegnia sp.
Фиг. 2 представляет собой фотографию, на которой показана противомикробная активность Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения за счет образования сидерофоров, направленная на патогены рыбы Vibrio harveyi (VHl, VH2, VH3), Vibrio cholerae (VC), Vibrio vulnificus (W) и Aeromonas salmonicida (AS), в среде CAS.
Фиг. 3 представляет собой фотографию, на которой показано наличие гемолиза Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения; и
Фиг. 4 представляет собой фотографию, на которой показана утилизация азотистой кислоты Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения.
Наилучший способ осуществления настоящего изобретения
В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 (КССМ11143Р). Штамм способен продуцировать сидерофоры, а также ингибировать рост Saprolegnia sp.
Конкретно, полученные из морской воды образцы собирали на креветочных фермах вокруг острова Канхвадо и культивировали в плотной среде BHI, дополненной 3% хлоридом натрия. Затем колонии наблюдали на предмет образования групп и выделяли штаммы.
Из выделенных штаммов путем первичного скрининга отобрали штаммы, проявившие высокую противобактериальную активность по отношению к типичным патогенным бактериям, поражающим культивируемую рыбу, включающим Aeromonas salmonicida, Vibrio harveyi, Vibrio anguillarum, Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae и Vibrio haemolyticus.
Из отобранных путем первичного скрининга штаммов с высокой противобактериальной активностью путем вторичного скрининга отобрали штаммы с высокой активностью пищеварительных ферментов, таких как протеаза, целлюлаза, амилаза и липаза.
Из отобранных путем вторичного скрининга штаммов в конечном итоге отобрали Bacillus sp. CJP-14, оказывающий сильное ингибирующее действие на Saprolegnia sp., который представляет собой патогенный гриб пресноводной рыбы с высоким уровнем продукции сидерофоров для захвата ионов железа (Fe3+), тем самым оказывающий основанное на конкуренции антагонистическое действие на рост других патогенных бактерий.
Bacillus sp. CJP-14 имеет морфологию грамположительной палочковидной бактерии, и в результате анализа последовательности оснований 16s pДНК показано, что она имеет 99% гомологии с Bacillus sp.W30. Если этот результат сравнить с результатом, что по отношению к последовательности оснований 16s pДНК известного продуцирующего сидерофоры Bacillus subtilis АН18 показано, что она имеет 98% гомологии с таковой штамма CICC 10088 Bacillus subtilis (см. патент Кореи №0717700), то можно увидеть, что штамм настоящего изобретения представляет собой новый неизвестный ранее штамм. Помимо этого, штамм настоящего изобретения способен продуцировать сидерофор, а также целлюлазу, протеазу, амилазу и липазу, тогда как Bacillus subtilis АН 18 способен продуцировать целлюлазу и ауксин в дополнение к сидерофорам, это указывает на то, что штамм настоящего изобретения представляет собой новый неизвестный ранее штамм.
Соответственно, авторы настоящего изобретения депонировали свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 в Корейской федерации коллекций культур (Korean Federation of Culture Collection) (в Корейском центре культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms), 361-221, Yurim B/D 3F, Hongje-l-dong, Seodaemun-gu, Сеул) 14 декабря 2010 г. как "Bacillus sp. CJP-14" (KCCM11143P).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает культуральную жидкость, полученную при культивировании свежевыделенного штамма Bacillus sp., ее концентрат или сухой продукт из нее. Конкретно, под культуральной жидкостью настоящего изобретения понимают среду, в которой культивировали свежевыделенный штамм CJP-14 Bacillus sp., и предпочтительно культуральную среду, включающую штамм.
Как используется в данном документе, под культуральной средой понимают среду, включающую питательные вещества, которые требуются для культивирования клеток животных, клеток растений или бактерий, а под культуральной жидкостью понимают жидкую среду, в которую инокулируют штамм и где его культивируют. Культуральной жидкостью может быть среда, включающая штамм или культуральный фильтрат, который получают путем удаления штамма из культуральной жидкости, в которую инокулировали штамм и где его культивируют. Под концентратом культуральной жидкости понимают концентрат, полученный путем концентрирования культуральной жидкости, а сухой продукт из культуральной жидкости означает сухой продукт, полученный путем удаления воды из культуральной жидкости. Концентрат культуральной жидкости может быть получен с использованием любых подходящих способов концентрирования, таких как концентрирование выпариванием, концентрирование вымораживанием, концентрирование при помощи обратного осмоса и/или концентрирование в вакууме.
Способ сушки может включать сушку воздухом, естественную сушку, сушку распылением и сушку вымораживанием, но не ограничивается ими.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает пробиотическую композицию, содержащую в качестве активного ингредиента свежевыделенный Bacillus sp. или его культуральную жидкость, ее концентрат или сухой продукт из нее и фармацевтически приемлемый носитель.
Как используется в данном документе, выражение "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения организма и не нивелирует биологическую активность и свойства вводимого соединения. Для составления композиции в виде жидкого препарата можно использовать фармацевтически приемлемый носитель, который является стерильным и биосовместимым, такой как физиологический раствор, стерильная вода, стабилизированный буфером физиологический раствор, раствор альбумина для инфузий, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин и смесь одного или нескольких из них. В случае необходимости можно добавлять другие общепринятые добавки, такие как антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и тому подобное. Кроме того, можно дополнительно добавлять в композицию разбавители, диспергирующие вещества, поверхностно-активные вещества, связывающие вещества и смазывающие вещества для приготовления инъекционных составов, таких как водные растворы, суспензии и эмульсии, или пилюль, капсул, гранул или таблеток.
Свежевыделенный Bacillus sp., который включен в качестве активного ингредиента в пробиотики настоящего изобретения, обитает в желудочно-кишечном тракте культивируемой рыбы или ракообразных для ингибирования вредных бактерий и размножения патогенных бактерий. Помимо этого, полезные пищеварительные ферменты, продуцируемые штаммом, способствуют всасыванию и полезности питательных веществ для улучшения коэффициента конверсии корма.
Композиция настоящего изобретения включает от 5×104 КОЕ/мл до 5×1010 КОЕ/мл и предпочтительно от 1×106 КОЕ/мл до 1×109 КОЕ/мл Bacillus CJP-14.
Предпочтительно композицию настоящего изобретения можно получить в виде лекарственных форм для перорального применения, и примеры лекарственных форм для перорального применения могут включать таблетки, пастилки, леденцы, водные или маслянистые суспензии, порошок или гранулы, эмульсии, твердые или мягкие капсулы, сиропы или эликсиры. Для состава, такого как таблетки и капсулы, пригодным является связывающее вещество, такое как лактоза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, амилопектин, целлюлоза или желатин, наполнитель, такой как дикальцийфосфат, разрыхлитель, такой как кукурузный крахмал или крахмал батата, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, стеарат кальция, стеарилфумарат натрия или воск на основе полиэтиленгликоля. Для капсул, кроме того, можно использовать жидкий носитель, такой как липид, в дополнение к вышеупомянутым соединениям.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает кормовую добавку, включающую свежевыделенный штамм Bacillus sp. или его культуральную жидкость, ее концентрат или сухой продукт из нее.
Как правило, все виды Bacillus могут образовывать эндоспоры для того, чтобы быть очень устойчивыми к повышенной температуре. Таким образом, свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 можно получить в форме кормовой добавки и затем добавить в корм. В качестве альтернативы свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 можно непосредственно добавлять на протяжении получения корма. Bacillus sp. CJP-14 может находиться в корме настоящего изобретения в форме жидкости или сухого продукта, а предпочтительно в форме сухого порошка. Способ сушки может включать сушку воздухом, естественную сушку, сушку распылением и сушку вымораживанием, но не ограничивается ими. Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения в порошкообразной форме можно смешивать в соотношении от 0,05% до 10% по весу, а предпочтительно от 0,1% до 1% по весу на основании веса корма. В дополнение к этому, корм для культивирования водных организмов, кроме того, может включать общеизвестные добавки для улучшения сохранности в дополнение к Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения.
Корма, включающие Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения, могут включать корма растительного происхождения, такие как зерновые культуры, орехи, побочные продукты пищевой промышленности, водоросли, волокна, масло, крахмалы, муку и побочные продукты переработки зерна, и корма животного происхождения, такие как белки, неорганические вещества, жир, минералы, белки одноклеточных организмов, зоопланктон и рыбную муку, но не ограничиваются ими.
В настоящем изобретении пробиотическая композиция, содержащая Bacillus sp. CJP-14, включает добавки для предотвращения ухудшения качества, такие как связывающие вещества, эмульгаторы и консерванты, и добавки для увеличения полезности, такие как аминокислоты, витамины, ферменты, ароматизаторы, небелковый азот, силикаты, буферные средства, экстракты и олигосахариды, но не ограничивается ими. В дополнение к этому, пробиотическая композиция, содержащая Bacillus sp. CJP-14, кроме того, может включать готовые кормовые смеси, но не ограничивается ими.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ культивирования рыб или ракообразных, включающий этап, на котором обрабатывают рыбу или ракообразных аквакультурных хозяйств с применением свежевыделенного штамма Bacillus, его культуральной жидкости, ее концентрата или сухого продукта из нее.
Как описано выше, свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения имеет широкий спектр противомикробной активности, а также оказывает основанное на конкуренции антагонистическое действие для ингибирования роста других патогенных бактерий. Таким образом, штамм применяют для предотвращения заболеваний, вызываемых распространенными патогенными бактериями аквакультуры, таким образом безопасно культивируя рыб или ракообразных.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает противомикробное средство или противогрибковое средство, включающее свежевыделенный штамм Bacillus, его культуральную жидкость, ее концентрат или сухой продукт из нее.
Предполагается, что выражение "предотвращение", использованное в данном документе, охватывает все действия, направленные на ограничение или замедление развития заболевания посредством введения композиции.
Свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения обладает противомикробной активностью, направленной против вышеописанных 6 типов патогенных бактерий организмов аквакультуры, и продуцирует сидерофоры с проявлением высокой способности к захвату железа. Таким образом, свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения оказывает основанное на конкуренции антагонистическое действие для ингибирования роста других патогенных бактерий. В дополнение к этому, было подтверждено, что свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 способен ингибировать рост патогенного водного гриба Saprolegnia sp. Таким образом, свежевыделенный Bacillus sp. используется дня предотвращения заболеваний, вызываемых вышеописанными патогенными бактериями аквакультуры.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает средство для улучшения качества воды, включающее свежевыделенный Bacillus sp., его культуральную жидкость, ее концентрат или сухой продукт из нее.
Свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения можно применять для снижения содержания азотистой кислоты, присутствующей в среде аквакультурных хозяйств.
Для улучшения качества воды свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения можно отдельно получить в форме средства для улучшения качества воды или свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14, его культуральную жидкость ее концентрат или сухой продукт из нее можно непосредственно распылять. Bacillus sp. CJP-14 может быть в форме жидкости или сухого продукта в составе средства для улучшения качества воды настоящего изобретения, и предпочтительно в форме сухого порошка.
Для средства для улучшения качества воды можно использовать носитель, который является стерильным и биосовместимым, такой как физиологический раствор, стерильная вода, стабилизированный буфером физиологический раствор, раствор альбумина для инфузий, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин и смесь одного или нескольких из них. В случае необходимости можно добавлять другие общепринятые добавки, такие как антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и тому подобное. Кроме того, можно дополнительно добавлять в композицию растворители, диспергирующие средства, поверхностно-активные вещества, связывающие вещества и смазывающие вещества для приготовления инъекционных составов, таких как водные растворы, суспензии и эмульсии, или пилюль, капсул, гранул или таблеток.
Если использовать средство для улучшения качества воды, можно улучшить качество воды аквакультурной фермы. Конкретно, средство для улучшения качества воды можно добавлять на аквакультурной ферме до культивирования водных организмов или на протяжении культивирования водных организмов. Предпочтительно его добавляют на аквакультурной ферме до культивирования водных организмов и оставляют на заданный период. Вследствие этого свежевыделенный Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения в достаточном объеме продуцирует сидерофоры с проявлением высокой способности захвата железа, и таким образом ингибирует рост других патогенных бактерий и Saprolegnia sp. В дополнение к этому, средство для улучшения качества воды добавляют один или несколько раз на протяжении культивирования водных организмов с тем, чтобы предотвратить дополнительный рост Saprolegnia sp.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения качества воды, включающий этап, на котором воду обрабатывают свежевыделенным Bacillus sp., его культуральной жидкостью, ее концентратом или сухим продуктом из нее. Воду улучшенного качества можно использовать на аквакультурной ферме и можно также использовать в качестве питьевой воды для сельскохозяйственных животных или людей. В этом отношении воду, обработанную свежевыделенным Bacillus sp., его культуральной жидкостью, ее концентратом или сухим продуктом из нее, предпочтительно очищают перед использованием, а этап очистки воды осуществляют известным способом.
Способ осуществления настоящего изобретения
Ниже в данном документе настоящее изобретение будет описано более детально со ссылкой на примеры. Однако эти примеры служат исключительно иллюстративным целям; и подразумевается, что настоящее изобретение не ограничено этими примерами.
Пример 1. Выделение Bacillus sp. CJP-14
Пример 1-1. Получение образцов и выделение штамма
Принимая во внимание свойства пробиотиков, которые обладают высокой специфичностью по отношению к окружающей среде и хозяину, авторы настоящего изобретения собирали полученные из морской воды образцы на креветочных фермах, у которых показана низкая степень встречаемости внутренних заболеваний и высокая продуктивность. Собранные образцы подвергали серийному разведению и распределяли по поверхности агара BHI (Difco, США), дополненного 3% хлоридом натрия с последующим культивированием при 37°С в течение 24 часов. Формирование групп штаммов, выделенных из каждого образца, осуществляли путем наблюдения за колониями и отбирали штаммы. Отобранные колонии культивировали три раза в свежей среде для выделения. Выделенные штаммы хранили в среде, содержащей 20% глицерина при -70°С или ниже.
Пример 1-2. Отбор штаммов с высокой противомикробной и противогрибковой активностью
Для первичного отбора штаммов с противомикробной активностью против типичных патогенных бактерий аквакультуры осуществляли тестирование противомикробной активности против 6 типов бактерий, включающих Aeromonas salmonicida, Vibrio harveyi. Vibrio anguillarum, Edwardsiella tarda и Vibrio haemolyticus.
Противомикробную активность против патогенных бактерий оценивали путем анализа чистых зон. 3 мл 0,7% агара (вес/объем) и 150 мкл каждой перемешиваемой культуральной жидкости, полученной от 6 типов патогенных бактерий (ОП 600=2,0), смешивали и наносили на среду BHI для приготовления агара верхнего слоя. 10 мкл культуральной жидкости, полученной от отобранных штаммов, наносили на полученный арат верхнего слоя и культивировали в течение 18 часов при 30°С. Затем наблюдали наличие чистой зоны, окружающей нанесенные штаммы. Из 53 типов отобранных штаммов провели первичный скрининг 20 штаммов, проявляющих противомикробную активность против любого из 6 типов патогенных бактерий аквакультуры (таблица 1).
| Таблица 1 | ||||||||||||||||||
| Противомикробная активность штаммов, прошедших первичный скрининг | ||||||||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | |
| AS | + | - | + | - | - | + | - | - | + | - | + | + | + | + | - | - | - | - |
| SI | + | - | + | - | - | - | + | - | - | - | + | + | + | + | + | - | - | - |
| ET | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - | + | + | - | + | - | - | - | - |
| VH | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | + | - | - | - | - |
| VP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | + | - | - | - | - |
| VA | + | - | + | - | - | + | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - | - | - |
| 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | |
| AS | - | - | - | - | + | - | - | + | + | - | - | - | - | + | - | - | + | - |
| SI | - | - | - | - | + | - | - | + | + | - | - | - | - | - | - | + | + | - |
| ET | - | - | - | - | + | - | - | + | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| VH | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | - | - |
| VP | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | - | - |
| VA | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | ||
| AS | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | + | |
| SI | - | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | + | |
| ET | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| VH | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | |
| VP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | |
| VA | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| -: отсутствие активности, +: активность. |
AS: Aeromonas salmonicida;
SI: Streptococcus iniae;
ET: Edwardsiella tarda;
VH: Vibrio harveyi;
VP: Vibrio hemolyticus;
VA: Vibrio anguillarum.
Пример 1-3. Отбор штаммов с высокой ферментативной активностью
Пример 1-3-1. Сбор неочищенного экстракта ферментов
Для отбора штаммов с активностью сложных пищеварительных ферментов культивировали 20 типов штаммов с противомикробной активностью в среде BHI в течение 8, 24 и 48 часов, соответственно, и собирали их культуральную жидкость с последующим центрифугированием при 4°C и 13000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Конечный супернатант использовали в качестве неочищенного экстракта ферментов для анализа ферментативной активности, а среды, включающие каждый субстрат для следующих ферментов, использовали для определения уровня расщепления субстрата.
Пример 1-3-2. Протеазная активность
В качестве субстрата приготовили среду YM (Difco, США), дополненную 2% обезжиренным молоком (Sigma, США). 3 мкл собранного неочищенного экстракта фермента добавляли в каждую среду субстрата и затем проводили реакцию при 30°C в течение 2 часов. Ферментативную активность определяли по наличию чистой зоны, окружающей неочищенный экстракт ферментов, которая образуется за счет расщепления субстрата.
Пример 1-3-3. Целлюлазная активность
В качестве субстрата приготовили среду YM, дополненную 1% CMC (карбоксиметилцеллюлоза). 3 мкл собранного неочищенного экстракта фермента добавляли в каждую среду субстрата и затем проводили реакцию при 30°C в течение 2 часов с последующим окрашиванием 0,2% водным раствором конго красного в течение 30 минут и обесцвечиванием водным раствором 1 М NaCl. Ферментативную активность определяли по наличию чистой зоны, окружающей неочищенный экстракт ферментов, которая образуется за счет расщепления субстрата.
Пример 1-3-4. Амилазная активность
В качестве субстрата приготовили среду YM, дополненную 1% растворимым крахмалом. 3 мкл собранного неочищенного экстракта ферментов добавляли в каждую среду субстрата и затем проводили реакцию при 30°C в течение 2 часов с последующим окрашиванием водным раствором, содержащим 0,1% I2 и 2% KI. Ферментативную активность определяли по наличию чистой зоны, окружающей неочищенный экстракт ферментов, которая образуется за счет расщепления субстрата.
Пример 1-3-5. Липазная активность
В качестве субстрата приготовили среду YM, дополненную 1% трикаптилином. 3 мкл собранного неочищенного экстракта фермента добавляли в каждую среду субстрата и затем проводили реакцию при 30°C в течение 2 часов. Затем определяли ферментативную активность по наличию чистой зоны, окружающей неочищенный экстракт ферментов, которая образуется за счет расщепления субстрата.
Из 20 типов штаммов с противомикробной активностью отобрали 6 типов штаммов, продуцирующих 4 вида пищеварительных ферментов, включающих протеазу, целлюлазу, амилазу и липазу, как показано в следующей таблице 2.
| Таблица 2 | ||||||||
| Продуктивность в отношении пищеварительных ферментов штаммов, прошедших вторичный скрининг | ||||||||
| Фермент | Протеаза | Амилаза | Целлюлаза | Липаза | ||||
| Время культивирования | 8 часов | 24 часа | 8 часов | 24 часа | 8 часов | 24 часа | 8 часов | 24 часа |
| 11 | +++ | +++ | + | ++ | +++ | ++ | - | - |
| 12 | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | ++ | - | + |
| 14 | ++ | + | + | ++ | +++ | +++ | - | +++ |
| 23 | +++ | ++ | + | ++ | +++ | ++ | - | - |
| 26 | ++ | +++ | + | +++ | +++ | +++ | - | +++ |
| 52 | +++ | ++ | + | + | +++ | +++ | - | ++ |
| -: отсутствие активности, +: активность, ++: высокая активность, +++: очень высокая активность. |
Пример 2. Тестирование in vitro ингибирующего действия на патогенный гриб пресноводной рыбы
Ингибирующее действие на патогенный гриб Saprolegnia sp. у пресноводной рыбы изучали in vitro с использованием 4 кандидатных штаммов с высокой противомикробной и противогрибковой активностью и продуктивностью в отношении сложных ферментов.
Saprolegnia sp. культивировали путем стационарного культивирования на плотной питательной среде PDA (Difco, США) при 30°C в течение 72 часов. Saprolegnia sp., культивируемый на плотной питательной среде, разрезали на части размером 5 мм × 5 мм (ширина × длина), инокулировали в центр свежей плотной питательной среды PDA и культивировали в течение 24 часов. 20 мкл каждого из 4 кандидатных штаммов помещали на стерильные бумажные диски и затем инокулировали на плотную питательную среду, в которой культивировали Saprolegnia sp., с последующим культивированием при 30°C в течение 48 часов. Как показано в таблице 3, наблюдали наличие чистой зоны, окружающей 4 кандидатных штамма (фиг.1).
| Таблица 3 | |
| Ингибирующее действие на рост Saprolegnia sp. | |
| Кандидатный штамм | Наличие чистой зоны |
| CJP11 | ++ |
| CJP12 | + |
| CJP14 | +++ |
| CJP26 | +++ |
| -: отсутствие активности, +: активность, ++: высокая активность, +++: очень высокая активность. |
Для оценки ингибирующего действия на Saprolegnia sp. в жидкой среде 4 кандидатных штамма культивировали в среде BHI при 37°C, 200 оборотов в минуту в течение 8 часов.
Каждую культуральную жидкость подвергали серийному разведению с плотностью 10 КОЕ, 107 КОЕ, 106 КОЕ, 105 КОЕ и 104 КОЕ, добавляли в каждую лунку 24-луночных планшетов (Falcon, США) и в них добавляли Saprolegnia sp. с плотностью 102 до конечного объема 1 мл. Туда добавляли 0,5 мл жидкой среды PDB (Difco, США), дополненной 0,5 г/л пептоном и 20 г/л дрожжевым экстрактом, с последующим культивированием при 25°C в течение 48 часов. Ингибирование активности грибов оценивали по застыванию, и два кандидатных штамма ингибировали рост Saprolegnia sp., как показано в следующей таблице 4.
| Таблица 4 | |||||
| Ингибирующее действие двух кандидатных штаммов на рост Saprolegnia sp. | |||||
| Тестируемый штамм | 108 | 107 | 106 | 103 | 104 |
| CJP14 | +++ | +++ | ++ | - | - |
| CJP26 | +++ | + | + | - | - |
| +: Положительный; -: Отрицательный. |
Пример 3. Отбор штаммов с высоким уровнем продуктивности в отношении сидерофоров
Для изучения уровня продуктивности в отношении сидерофоров 4 кандидатных штаммов с высокой противомикробной и противогрибковой активностью и продуктивностью в отношении сложных ферментов осуществляли CAS-анализ. Среду CAS приготовили, как указано далее.
| Таблица 5 | |
| Состав среды CAS для оценки продуктивности в отношении сидерофоров | |
| Раствор Fe (1 мМ FeCl3·6H2O в 10 мМ HCl) | 1,5 |
| Раствор CAS (0,121 г CAS в 100 мл дистиллированной воды) | 7,5 |
| HDTMA (0,0219 г HDTMA в 50 мл дистиллированной воды) | 50 |
| Буфер на основе пиперазина с pH 6,5 (4,307 г пиперазина в 30 мл дистиллированной воды) | 30 |
| Дистиллированная вода | 100 (остальная часть) |
Каждый из 4 кандидатных штаммов инокулировали с концентрацией 0,1% в жидкую среду BHI и культивировали при 37°C и 200 оборотов в минуту в течение 18 часов. В дополнение к этому, каждый вид патогенных бактерий Vibrio harveyi. Vibrio cholerae. Vibrio vulnificus и Aeromonas salmonicida инокулировали с концентрацией 0,1% в среду LB, дополненную 2% хлоридом натрия, и культивировали при 30°C, 200 оборотов в минуту в течение 18 часов. Каждый культуральный супернатант фильтровали с использованием 0,45 мкм фильтра и профильтрованный культуральный супернатант использовали для выполнения эксперимента. В агаре CAS делали лунки диаметром 0,5 см, 50 мкл каждого профильтрованного культурального супернатанта инокулировали в лунку и проводили реакцию при 37°C в течение 8 часов. Как показано на фиг.2, наблюдали наличие чистой зоны оранжевого цвета, окружающей лунку, которая образуется после утилизации железа. В конечном итоге отобрали Bacillus sp. CJP-14 с наиболее высоким уровнем продуктивности в отношении сидерофоров среди 4 кандидатных штаммов и вышеописанных 4 типов патогенных бактерий (таблица 6).
| Таблица 6 | |||
| Оценка продуктивности в отношении сидерофоров | |||
| Кандидаты штамм | Продуктивность в отношении | Патогенные бактерии культивируемой рыбы | Продуктивность в отношении |
| сидерофоров | сидерофоров | ||
| CJP11 | ++ | Vibrio harveyi | ++ |
| CJP12 | + | Vibrio cholerae | ++ |
| CJP14 | +++ | Vibrio vulnificus | ++ |
| CJP26 | ++ | Aeromonas salmonicida | + |
| -: отсутствие активности, +: активность, ++: высокая активность, +++: очень высокая активность. |
Пример 4. Идентификация отобранных штаммов и их физиологическая и биохимическая характеристика
Пример 4-1. Идентификация штаммов
Из 4 кандидатных штаммов в конечном итоге отобрали, идентифицировали и проанализировали штамм CJP-14, оказывающий сильное ингибирующее действие на Saprolegnia sp. и имеющий высокий уровень продуктивности в отношении сидерофоров. Идентификацию штамма осуществляли физиологическими и биохимическими методами и методами молекулярной систематики. Было обнаружено, что штамм по морфологическому свойству является грамположительной палочковидной бактерией. Анализ последовательности 16s рДНК показал, что штамм имеет 99% гомологии с Bacillus sp., что указывает на новый микроорганизм. Последовательность оснований 16s рДНК выделенного штамма представлена SEQ ID NO.1. Анализ последовательности оснований осуществляли путем амплификации 16s рДНК с использованием готовой смеси для ПНР (Bioneer, Корея) и универсальных праймеров 27F и 492R с указанной ниже последовательностью оснований. Для анализа последовательности оснований амплифицированной ДНК осуществляли амплификацию гена в общем объеме реакционной смеси 20 мкл в общей сложности в течение 30 циклов, состоящих из этапов при 94°C в течение 1 минуты, при 56°C в течение 1 минуты и при 72°C в течение 1 минуты.
27F: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.2)
92R: 5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO.3)
Новый микроорганизм настоящего изобретения, который идентифицировали вышеописанным способом, депонировали в Корейской федерации коллекций культур (в Корейском центре культур микроорганизмов, 361-221, Yurim B/D 3F, Hongje-1-dong, Seodaemun-gu, Сеул) 14 декабря 2010 г. как "Bacillus sp. CJP-14" (KCCM11143P).
Пример 4-2. Физиологическая и биохимическая характеристика
Для анализа биохимических свойств штамма Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения анализировали паттерны ферментации сахаров штамма с использованием системы API 50 СНВ (Корейский центр культур микроорганизмов, Корея) (таблица 7).
| Таблица 7 | |||
| Результат для паттернов ферментации сахаров | |||
| Контроль | - | эскулин | + |
| глицерин | + | салицин | + |
| эритрит | - | целлобиоза | + |
| D-арабиноза | - | мальтоза | + |
| L-арабиноза | + | лактоза | + |
| эибоза | + | мелибиоза | - |
| D-ксилоза | + | сахароза | + |
| L-ксилоза | - | грегалоза | + |
| адонит | - | инулин | - |
| β-метилксилозид | - | мелицитоза | - |
| галактоза | - | D-рафиноза | + |
| D-глюкоза | + | амидон | + |
| D-фруктоза | + | гликоген | + |
| D-манноза | + | ксилит | - |
| L-сорбоза | - | B-генцибиоза | - |
| рамноза | - | D-тураноза | - |
| дульцит | - | D-ликсоза | - |
| инозит | + | D-тагатоза | - |
| маннит | + | D-фукоза | - |
| сорбит | + | L-фукоза | - |
| α-метил-D-маннозид | - | D-арабит | - |
| α-метилглюкозид | + | L-арабит | - |
| N-ацетилглюкозамин | - | глюконат | - |
| амигдалин | + | 2-кетоглюконат | - |
| арбутин | + | 5-кетоглюконат | - |
| +: Положительный; -: Отрицательный. |
Пример 5. Безопасность и утилизация
Пример 5-1. β-Гемолиз
β-Гемолиз представляет собой полный лизис эритроцитов, который вызван гидролизом фосфолипида бактериями, продуцирующими фосфолипазу.
Для изучения гемолиза Bacillus sp. CJP-14 приготовили пластинку с кровяным агаром, содержащую TSA (триптический соевый агар) (Difco, США) и 5% крови барана (Kisan Biotech, Корея). После посева штрихом Bacillus sp. CJP-14 на полученную пластинку с кровяным агаром, для изучения гемолиза проводили инкубацию при 37°C в течение 24 часов. Как показано на фиг.3, гемолиз не наблюдали.
Пример 5-2. Утилизация азотистой кислоты
Для изучения уровня утилизации азотистой кислоты штамма настоящего изобретения приготовили среду, содержащую азотистую кислоту, как показано в следующей таблице 8. 0,1% Bacillus sp. CJP-14 инокулировали в приготовленную среду и затем культивировали при 30°C, 200 оборотов в минуту в течение 6 часов, 12 часов и 24 часов. Образец культуральной жидкости собирали через каждый период времени культивирования. Собранные образцы культуральной жидкости центрифугировали при 4°C, 13000 оборотов в минуту в течение 5 минут с получением супернатанта и измеряли содержание азотистой кислоты в полученном супернатанте для количественного определения уровня потребления.
| Таблица 8 | |
| Состав среды для оценки утилизации азотистой кислоты | |
| нитрит (NaNO2) | 0,5 г/л |
| двухосновный фосфат натрия (Na2HPO4) | 13,5 г/л |
| двухосновный фосфат калия (K2HPO4) | 0,7 г/л |
| сульфат магния (MgSO47H2O) | 0,1 г/л |
| хлорид кальция (CaCl2) | 0,18 г/л |
| бикарбонат натрия (NaHCO3) | 0,5 г/л |
| хлорид трехвалентного железа (FeСl3·6H2O) | 0,014 г/л |
| глюкоза (глюкоза) | 0,5 г/л |
Первоначальная концентрация азотистой кислоты в среде составляла приблизительно 10 мг. По мере роста Bacillus sp. CJP-14 с утилизацией азотистой кислоты потребление азотистой кислоты составляло приблизительно 94% после культивирования в течение 30 часов (см. фиг.4).
Вышеописанные результаты демонстрируют, что Bacillus sp. CJP-14 проявляет ингибирующее действие на водный гриб Saprolegnia sp., продуктивность в отношении сидерофоров и противомикробную активность.
Пример 6. Эффективность воздействия на патогенный гриб Saprolegnia sp. пресноводной рыбы
Оценивали in vitro эффективность воздействия Bacillus sp. CJP-14, оказывающего ингибирующее действие на патогенный гриб Saprolegnia sp. пресноводной рыбы и имеющего высокий уровень продуктивности в отношении сидерофоров. Авторы настоящего изобретения инфицировали оплодотворенные икринки радужной форели Saprolegnia sp. в присутствии Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения, а затем изучали долю икринок на стадии глазка (%).
Конкретно, 500 оплодотворенных икринок радужной форели помещали в лабораторный стакан, содержащий стерилизованную пресную воду, и затем икринки погружали в раствор, включающий Saprolegnia sp. и каждый из составов, описанных в таблице 9, в течение 30 минут один раз в сутки в течение 3 суток, затем определяли долю икринок на стадии глазка (%), как указано далее (таблица 9). Хлорид натрия и формалин использовали в качестве контрольной группы
Доля икринок на стадии глазка (%) = (число икринок на стадии глазка / число использованных оплодотворенных икринок) ×100
| Таблица 9 | |||
| Эффективность воздействия на Saprolegnia sp. Группа обработки |
Концентрация | Число оплодотворенных икринок | Доля икринок на стадии глазка (%) |
| Bacillus sp. CJP14 | 1×109 КОЕ | 300 | 54,7 |
| 1×108 КОЕ | 300 | 53,2 | |
| 1×107 КОЕ | 300 | 40,5 | |
| Хлорид натрия | 10 ppm | 300 | 52,3 |
| Формалин (37% раствор формальдегида) | 120 ppm | 300 | 19,5 |
| Контрольная группа | - | 300 | 0,5 |
Как показано в таблице 9, доля икринок на стадии глазка контрольной группы составляла 0,5%, а доля таковых для хлорида натрия и формалина, используемых в настоящее время в качестве противогрибкового средства, составляли 52,3% и 19,5%, соответственно. Для обработки Bacillus sp. CJP-14 с концентрацией 1×108 КОЕ или выше была показана более высокая эффективность, чем для обработки хлоридом натрия и раствором формалина, это указывает на ингибирующее действие Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения на патогенный гриб Saprolegnia sp. пресноводной рыбы.
Пример 7. Эффективность пробиотиков
Для изучения того, оказывает ли на практике Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения пробиотическое действие при добавлении его в корм и кормлении рыбы этим кормом, Bacillus sp. CJP-14 настоящего изобретения смешивали с кормом, и мальков камбалы кормили комбикормом в течение 8 недель с тем, чтобы определить коэффициент увеличения веса, ежедневный коэффициент роста, коэффициент превращения корма, коэффициент эффективности белка и коэффициент выживаемости.
Конкретно, основной корм (контрольная группа) готовили так, чтобы он имел энергосодержание, равное 30% неочищенного белка, как показано в таблице 10. Bacillus sp. CJP-14 штамма настоящего изобретения добавляли в основной корм для приготовления комбикорма, содержащего 5% Bacillus sp. CJP-14, а количество целлюлозы снижали на добавляемое количество пробиотиков для равного энергосодержания.
| Таблица 10 | |
| Состав основного корма | |
| Сырьевые материалы | % |
| Мука из белой рыбы | 36,0 |
| Соевый шрот | 12,0 |
| Кукурузная глютеновая мука | 8,0 |
| Пшеничная мука | 30,4 |
| Жир печени кальмара | 5,0 |
| Соевая мука | 5,0 |
| CMC | 1,0 |
| Целлюлоза | 0,5 |
| Минеральная смесь | 1,0 |
| Витаминная смесь | 1,0 |
Мальки камбалы, использованные в эксперименте, имели первоначальный средний вес 25 г, и 25 рыб разделили с помощью рандомизации в круглом полипропиленовом контейнере емкостью 150 л. Профильтрованную через песчаный фильтр морскую воду использовали в качестве воды для культивирования и скорость потока регулировали до уровня 2-3 л/мин. Контейнер оборудовали аэратором для подачи кислорода и циркуляции воды для культивирования. Фотопериод поддерживали при условии 12L:12D с использованием флуоресцентной лампы. Температуру воды для культивирования поддерживали в пределах естественных температурных условий 21-29°C на протяжении всего периода проведения эксперимента. Рыб кормили до насыщения два раза в сутки. Скорость роста измеряли каждые три недели, и всех рыб подвергали голоданию в течение 24 часов до измерения (см. таблицу 11).
| Таблица 11 | ||
| Эффективность пробиотиков для камбалы | ||
| Контрольная группа | Экспериментальная группа | |
| Конечный средний вес (г) | 50,6±1,7a | 57,4±3,8b |
| Коэффициент увеличения веса (%) | 103,03±5,6a | 130,05±9,3b |
| Ежедневный коэффициент роста (%) | 1,42±0,06a | 1,67±0,08b |
| Коэффициент выживаемости (%) | 77,3±15,1a | 97,3±2,3b |
| Коэффициент превращения корма | 15,9±0,15a | 1,16±0,05b |
| Коэффициент эффективности белка | 1,10±0,1a | 1,40±0,0b |
Как показано в таблице 11, с добавлением Bacillus sp. CJP 14 скорость роста увеличилась приблизительно на 13% по сравнению с контрольной группой, а также увеличился коэффициент превращения корма и коэффициент эффективности белка по сравнению с контрольной группой. Коэффициент выживаемости также увеличился приблизительно на 25% по сравнению с контрольной группой.
Эти результаты демонстрируют, что Bacillus sp. CJP 14 имеет высокий уровень продуктивности в отношении сложных ферментов, что способствует увеличению скорости потребления пищи рыбой и скорости увеличения веса, а также снижению уровня экскреции, что приводит к улучшению качества воды.
1. Штамм Bacillus sp. КССМ11143Р, обладающий противогрибковой активностью в отношении Saprolegnia sp.
2. Культуральная жидкость Bacillus sp. КССМ11143Р по п. 1, обладающая противогрибковой активностью в отношении Saprolegnia sp.
3. Культуральная жидкость по п. 2, находящаяся в форме концентрата или сухого продукта.
4. Пробиотическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента штамм по п. 1 или культуральную жидкость по п. 2.
5. Кормовая добавка, используемая для аквакультуры рыб или ракообразных, содержащая в качестве активного ингредиента штамм по п. 1 или культуральную жидкость по п. 2.
6. Способ культивирования рыб или ракообразных, включающий этап обработки фермы для разведения рыб или ракообразных штаммом по п. 1 или культуральной жидкостью по п. 2.
7. Противогрибковое средство против водного гриба Saprolegnia sp., содержащее штамм по п. 1 или культуральную жидкость по п. 2.
8. Способ предотвращения заболеваний, вызванных водным грибом Saprolegnia sp., у животных, включающий этап добавления штамма по п. 1 или культуральной жидкости по п. 2.
9. Средство для улучшения качества воды, содержащее штамм по п. 1 или культуральную жидкость по п. 2.
10. Способ улучшения качества воды, включающий этап обработки воды штаммом по п. 1 или культуральной жидкостью по п. 2.
