Способ экстракции днк из клеток крови

Авторы патента:

C12N15/10 - способы выделения, получения или очистки ДНК или РНК (химические способы получения ДНК или РНК C07H 21/00; получение неструктурных полинуклеотидов из микроорганизмов или с помощью ферментов C12P 19/34)

B82B1/00 - Наноструктуры

Владельцы патента RU 2555551:

Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ экстракции ДНК из клеток крови. Добавляют в образец магнитные частицы и ферромагнитные наносферы CoNiFe₂O₄50 нм. Лизируют биологический материал. Промывают ДНК и снимают ДНК с носителя. Преимуществом заявленного способа является повышение количества ДНК в полученном образце. 3 ил., 1 пр.

1. Область техники

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано для медицинской лабораторной ДНК-диагностики и лабораторных научных исследований при экстракции (извлечении) ДНК из биопрепаратов и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения очищенной ДНК. Изобретение представляет способ предотвращения образования трудноразрушаемого осадка магнитных частиц, сорбирующих ДНК, за счет добавления в образец ферромагнитных наносфер.

2. Уровень техники

Экстракция нуклеиновых кислот (ДНК и/или РНК) является важным этапом медицинской лабораторной ДНК-диагностики и лабораторных научных исследований. Одними из наиболее эффективных и технологичных являются методы очистки нуклеиновых кислот (НК) при помощи их сорбции на твердой фазе (чаще всего - на различных модификациях оксида кремния) или так называемые «сорбентные» методики.

В последние годы с появлением автоматизированных пиппетирующих станций для экстракции НК и ПЦР-комплексов сорбент стали делать магнитозависимым, а магнитные поля использовать для концентрирования частиц с НК в определенном месте пробирки или для диссоциации частиц (при промывании).

В частности, на рынке представлен широкий спектр коммерческих наборов реагентов для очистки НК при помощи их сорбции на магнитных частицах: Magnetic Beads Genomic DNA Extraction Kit (Blood) (Cat. # MB048, MB096), Geneaid Biotech Ltd. (http://www.geneaid/.com); GeneCatcher™ gDNA 3-10 ml Blood Kit (Invitrogen™) (Cat. # CS21110) (http://www.invitrogen.com/); PowerMag® Microbial DNA Isolation Kit, (Cat. # 27200-4), MO BIO Laboratories, Inc. (http://www.mobio.com/) и др.

Использование магнитных частиц ничем принципиальным не отличается от использования других типов сорбентов (латексы, полимерные сорбенты, стекло), но позволяет применять магнитное разделение вместо центрифугирования и фильтрации. В основе магнитных частиц используются получаемые частицы оксида железа, обладающие суперпарамагнитными свойствами.

Однако примеси белков, липидов и полисахаридов в образцах биологического материала зачастую прочно скрепляют собранные вместе магнитным полем частицы в труднодиспергируемый осадок.

Предложен способ предотвращения образования устойчивых агрегатов несущих НК магнитных частиц для повышения эффективности экстракции и очистки НК, в том числе при использовании автоматизированных пиппетирующих станций для экстракции НК- и ПЦР-комплексов.

3. Раскрытие изобретения

Предотвращение образования устойчивых агрегатов несущих ДНК магнитных частиц достигается за счет добавления в образец вместе с сорбирующими ДНК-частицами ферромагнитных наносфер размером 50-200 нм.

Все процедуры по экстракции ДНК проводят в соответствии с инструкцией производителя набора реагентов (например, GeneCatcher™ gDNA 3-10 ml Blood Kit (Invitrogen™) (Cat. # CS 21110) однако перед началом экстракции в образец биологического материала добавляют ферромагнитные наносферы размером 50-200 нм (например, CoNiFe2O4 50 nm, Cat. # MKN-Co0.5Ni0.5Fe2O4-050, MKImpex Corp.)до конечной концентрации 10¹⁰ частиц на 1 мл биологического образца.

Положительный результат - повышение эффективности экстракции ДНК - достигается за счет предотвращения образования устойчивых агрегатов несущих ДНК магнитных частиц путем разделения несущих ДНК магнитных частиц прослойками ферромагнитных наносфер. При этом способность магнитных частиц (в частности, изготовленных на основе оксида кремния) к сорбции ДНК не меняется.

4. Реализация изобретения

Рассмотрим реализацию изобретения на примере экстракции ДНК из клеток крови при помощи коммерческого набора реагентов GeneCatcher™ gDNA 3-10 ml Blood Kit (Invitrogen™) (Cat. # CS 21110).

Процедуры по экстракции НК и промывке выполняют как указано в инструкции к набору реагентов.

1. Взятие биологического материала

1.1 Взятие крови проводится в пластиковые пробирки с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/мл.

1.2. После добавления на шаге 1 (согласно инструкции) в 1,5 мл полипропиленовую пробирку раствора, содержащего 50 мкл крови+150 мкл лизирующего раствора, 5 мкл магнитных частиц, дополнительно добавляют 5 мкл ферромагнитных наносфер CoNiFe2O4 50 nm, (Cat. # MKN-Co0.5Ni0.5Fe2O4-050, MKImpex Corp.).

2. Выделение ДНК из биологического материала

2.1. Промаркировать необходимое количество пластиковых пробирок объемом 1,5 мл (8, 16, 24 или 32 с учетом пробирки для «К-») производства SSI США кат. №1260.

2.2. Внести на дно каждой пробирки 50 мкл или 100 мкл) цельной крови. Устанавливайте образцы в штативы слева направо, сверху вниз.

Внимание! Одновременно с выделением ДНК из биологического материала необходимо подготовить отрицательный контрольный образец «К-». Для этого в промаркированную соответствующим образом пробирку внесите 50 мкл или 100 мкл) физиологического раствора стерильного.

2.3. Установить пробирки с образцами в штативы для выделения. Закрепите крышки в держателях.

Установить штативы на магнитный гомогенизатор.

2.4. Запустить на ПК программу DTStreamRunner.

2.5. Закрыть крышки пробирок после выполнения программы. Надосадочная жидкость, содержащая выделенную ДНК, готова к внесению в реакционную смесь для ПЦР-амплификации.

Процедуру снятия ДНК с носителя выполняют, как указано в инструкции к набору реагентов.

Результат экстракции ДНК без применения ферромагнитных наносфер и с ферромагнитными наносферами показан на фиг. 1, 2 и 3.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Electrostatic Adsorption of Polystyrene Nanospheres onto the Surface of an Ultrathin Polymer Film Prepared by Using an Alternate Adsorption Technique. Takeshi Serizawa, Hiroko Takeshita, and Mitsuru Akashi. Langmuir, 1998, 14 (15), pp 4088-4094.

2. Макаров B.M., Калаева C.3., Шипилин A.M. и др. Переработка железосодержащих отходов с получением наночастиц для изготовления магнитной жидкости // Нанотехника. - №4 (12), 2004 - С. 66-69.

3. Scherer С.and Figueiredo Neto A. M.Ferrofluids: Properties and Applications // Brazilian Journal of Physics - V. 35, 2005 - P. 718-727.

4. Макеева Г.С. Электродинамический расчет ферромагнитного резонанса в магнитных композитных наноматериалах на основе решеток ферромагнитных наносфер / Г.С. Макеева, О.А. Голованов, М.В. Савченкова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Физико-математические науки. - 2009. - N 2 (10). C. 102-109.

Способ экстракции ДНК из клеток крови с использованием магнитных частиц, сорбирующих ДНК, включающий лизис клеток крови, промывку и снятие ДНК с носителя, отличающийся тем, что перед началом экстракции в образец вместе с магнитными частицами добавляют ферромагнитные наносферы CoNiFe₂O₄50 нм.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для детектирования количества копий бета-глюкуронидазы в трансгенных растениях, включающему проведение полимеразной цепной реакции с помощью праймеров и разрушаемой пробы.

Олигонуклеотидные праймеры и способ выявления днк mycobacterium avium методом полимеразной цепной реакции // 2554842

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются олигонуклеотидных праймеров и способа выявления ДНК Mycobacterium avium с их использованием. Охарактеризованные олигонуклеотидные праймеры комплементарны специфичной области mig-гена Mycobacterium avium и имеют следующий нуклеотидный состав: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Способ выявления ДНК Mycobacterium avium выключает выделение ДНК, проведение амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, перенос продукта амплификации на гель с последующим детектированием результатов анализа на трансиллюминаторе.

Способ идентификации гетеромультимерных модифицированных убиквитиновых белков со способностью связываться с лигандами // 2553333

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для идентификации гетеромультимерных убиквитинов со способностью связываться с лигандом-антигеном.

Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей // 2548816

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу выделения микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы. Способ включает последовательное центрифугирование, ультрафильтрацию и ультрацентрифугирование культуральной конденсированной среды.

Многоканальный наконечник для экстракции нуклеиновых кислот, белков и пептидов // 2547597

Группа изобретений относится к многоканальным устройствам, модифицированным нанослоями анилинсодержащих полимеров. Предложен многоканальный наконечник для выделения нуклеиновых кислот, белков, пептидов и способ изготовления многоканального элемента, входящего в состав многоканального наконечника.

Устройство автоматической очистки нуклеиновой кислоты и способ для защиты от аэрозоля // 2542408

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к автоматическому устройству и способу очистки и выделения целевой нуклеиновой кислоты из биологического образца, причем устройство обеспечивает возможность предотвратить загрязнение выделенной целевой нуклеиновой кислоты от аэрозоля и которое может быть применено ко всем видам оборудования выделения и очистки нуклеиновых кислот из множества биологических образцов, использующего магнитный стержень или мультипипеточный блок, движущийся в двух или трех осевых направлениях.

Независимый от сигнальной последовательности фаговый дисплей на белке pix // 2540010

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и генетической инженерии. Предложен геном фага, фагмида и нитчатый фаг для использования в фаговом дисплее, система фагового дисплея, набор и фаговая библиотека для определения продукта экзогенного гена.

Рекомбинантная плазмидная днк pet40cmap/mbl-t, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид cmap/mbl-t со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы cmap и маннан-связывающего лектина с-типа mbl-t, рекомбинантный штамм e.coli rosetta(de3)/pet40cmap/mbl-t - продуцент гибридного бифункционального полипептида cmap/mbl-t и способ его получения // 2538169

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой плазмиду pET40CmAP/MBL-T, определяющую синтез гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina (CmAP) и маннан-связывающего лектина С-типа дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus (MBL-T).

Способ прогнозирования длины тела человека на основании исследования днк в рамках русской популяции // 2531341

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа прогнозирования длины тела человека в рамках русской популяции. Представленный способ основан на исследовании ДНК, в котором с помощью метода ПЦР и при использовании определенных праймеров проводят исследование участков генов амелогенина (AML), используя локусы генов секреторного рецептора гормона роста (GSHR), ко-репрессороподобного лигандзависимого ядерного рецептора (LCORL) и связывающего белка циклин-зависимых киназ (CABLES1) в образцах ДНК мужского пола и генов хейджхок-взаимодействующего белка (HHIP) и ядерного белка с цинковыми пальцами (JAZF1) в образцах ДНК женского пола.

Дисплей на поверхности клеток полипептидных изоформ на основе прочитывания терминирующего кодона // 2528858

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. Предложен способ селекции эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей желаемый уровень интересующего полипептида, включающий трансфекцию клеток гетерологичной нуклеиновой кислотой, содержащей по меньшей мере одну кассету, содержащую по меньшей мере первый полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, стоп-кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида, второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно стоп-кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, культивирование клеток-хозяев для экспрессии интересующего полипептида так, чтобы по меньшей мере часть рассматриваемого полипептида экспрессировалась в виде слитого полипептида, содержащего иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, причем такой слитый полипептид экспонируется на поверхности указанной клетки-хозяине, селекцию клетки по наличию или количеству слитого полипептида, экспонируемого на клеточной поверхности.

Самоохлаждаемый автономный наноприбор и способ его формирования // 2555512

Изобретение относиться к способам формирования самоохлаждаемых автономных приборов и элементов электроники, которые могут эффективно работать без использования технологии жидкого азота, и другой криогенной техники.

Пигмент на основе порошка диоксида титана, модифицированного наночастицами // 2555484

Изобретение относится к пигментам для белых красок и покрытий, в том числе для терморегулирующих покрытий космических аппаратов, и может быть использовано в космической технике, в строительной индустрии и в широких отраслях промышленности для термостатирования устройств или технологических объектов.

Способ получения пористых хитозановых губок, содержащих фосфаты кальция, для заполнения костных дефектов // 2554811

Изобретение относится к медицине. Описан способ получения композиционного материала на основе хитозана, содержащего аспарагиновую или глутаминовую аминокислоты в количестве от 2 до 5% мас., а также фосфаты кальция с соотношением Ca/P от 1,0 до 1,67.

Полимерная композиция для медицинских хирургических инструментов // 2554792

Изобретение относится к области медицины, а именно к полимерной композиции для медицинских изделий, включающей поликарбонат со степенью полимеризации n=200-2000 в количестве 100 мас.ч., полимерную добавку, в качестве которой используется полисульфон со степенью полимеризации n=70-150, в количестве от 5 до 40 мас.ч., комплексный стабилизатор, в качестве которого используется стерически затрудненный фосфит, в количестве от 0,045 до 1,5 мас.ч., компатибилизатор, представляющий собой малеинизированный полипропилен, в количестве от 0,025 до 5,0 мас.ч., наноструктурирующую добавку, представляющую собой суперконцентрат углеродных нанотрубок с содержанием нанотрубок 20-40 мас.ч.

Способ получения нанокапсул сульфата хондроитина в конжаковой камеди // 2554763

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ инкапсуляции лекарственного препарата методом осаждения нерастворителем, отличающийся тем, что в качестве ядра нанокапсул используется сульфат хондроитина, в качестве оболочки - конжаковая камедь, которую осаждают из суспензии в бутиловом спирте путем добавления гексана в качестве нерастворителя при 25°С.

Способ получения нанокапсул албендазола // 2554739

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ инкапсуляции лекарственного препарата методом осаждения нерастворителем, отличающийся тем, что в качестве ядра нанокапсул используется албендазол, в качестве оболочки - альгинат натрия, который осаждают из суспензии в бутаноле путем добавления хлороформа в качестве нерастворителя при 25°С.

Способ получения нанокапсул сульфата хондроитина в каррагинане // 2554738

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ инкапсуляции лекарственного препарата методом осаждения нерастворителем, отличающийся тем, что в качестве ядра нанокапсул используется сульфат хондроитина, в качестве оболочки - каррагинан, который осаждают из суспензии в бутиловом спирте путем добавления гексана в качестве нерастворителя при 25°С.

Туннельный полевой транзистор на основе графена // 2554694

Изобретение относится к области наноэлектроники. В туннельном полевом транзисторе с изолированным затвором, содержащем электроды истока и стока, выполненные из монослойного графена и лежащие на изолирующей подложке в одной плоскости, а также затвор, выполненный из проводящего материала и расположенный над областями истока, туннельного перехода и стока, электроды истока и стока ориентированы друг к другу кристаллографически ровным краем типа зигзаг и разделены туннельно-прозрачным для носителей заряда вакуумным барьером.

Многопереходное фотоэлектрическое устройство // 2554290

Многопереходное фотоэлектрическое устройство содержит первый и второй электроды, фотоэлектрический стек в электрическом контакте с указанными первым и вторым электродами и содержащий множество фотоэлектрических переходов, при этом каждый указанный фотоэлектрический переход включает электроноакцепторный полупроводниковый слой и светопоглощающий полупроводниковый слой, имеющий, в основном, большую рабочую функцию, чем указанный электроноакцепторный полупроводниковый слой, при этом указанные фотоэлектрические переходы разделены: рекомбинационной областью, включающей слой прозрачного и токопроводящего дырочного слоя в омическом контакте с указанным светопоглощающим полупроводниковым слоем указанного первого фотоэлектрического перехода, и прозрачный токопроводящий электроноакцепторный слой в омическом контакте с указанным электроноакцепторным полупроводниковым слоем указанного второго фотоэлектрического перехода; указанная рекомбинационная областью формирует градиентную рабочую функцию указанного прозрачного и токопроводящего дырочного слоя в омическом контакте с указанным светопоглощающим полупроводниковым слоем указанного первого фотоэлектрического перехода к указанному прозрачному и токопроводящему электроноакцепторному слою в омическом контакте с указанным электроноакцепторным полупроводниковым слоем указанного второго фотоэлектрического перехода, и имеющая толщину в пределах одного порядка величины суммы дебаевой длины всех слоев указанной рекомбинационной области.

Способ лазерной термотерапии кожи и ее придатков, фармацевтическая композиция для него и их применение // 2554219

Группа изобретений относится к медицине, а именно к дерматологии и микологии, и может быть использована в лечении кожи и ее придатков. Фармацевтическая композиция наружного применения содержит наночастицы для лазерной термотерапии инфекционных поражений кожи и ее придатков.

Способ получения нанокапсул витаминов // 2555556

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ инкапсуляции препарата методом осаждения нерастворителем, в котором согласно изобретению в качестве ядер нанокапсул используются витамины, в качестве оболочки - натрий карбоксиметилцеллюлоза, которую осаждают из суспензии в изопропиловом спирте путем добавления хлороформа в качестве нерастворителя с последующей сушкой при комнатной температуре. Изобретение обеспечивает упрощение и ускорение процесса получения нанокапсул, уменьшение потерь при получении нанокапсул (увеличение выхода по массе). 7 пр.