Композиция разрушающейся полимерной мицеллы

Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой композицию полимерной мицеллы, пригодной для инкапсулирования и подходящего высвобождения лекарственных средств, содержащей блок-сополимеры, которые компонуются радиально и имеют гидрофобный сегмент, направленный внутрь, и гидрофильный сегмент, направленный наружу, при этом в качестве блок-сополимеров содержит блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, который содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи, образованный из гидрофобного производного аминокислоты, полученного в результате введения в боковую цепь аминокислоты стерольного остатка, и блок-сополимер, обладающий сродством к липопротеину за исключением ЛПВП, который содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи, образованный из гидрофобного производного аминокислоты, полученного в результате введения в боковую цепь аминокислоты гидрофобной группы, обладающей линейной или разветвленной структурой. Изобретение обеспечивает стабильное инкапсулирование имеющих большой размер лекарственных средств и их подходящее высвобождение. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 пр., 3 табл., 4 ил.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к композиции полимерной мицеллы и фармацевтической композиции, использующей композицию полимерной мицеллы.

Область техники

Известны использование блок-сополимеров, каждый из которых содержит гидрофильный сегмент полимерной цепи и гидрофобный сегмент полимерной цепи в качестве носителя для лекарственных средств, и способ инкапсулирования предварительно определенного лекарственного средства в полимерной мицелле, образованной из сополимеров (например, патентные документы 1 или 2). Также известны и композиция, включающая гомогенную полимерную мицеллу, инкапсулирующую плохо растворимое в воде лекарственное средство, и способ ее получения (патентный документ 3).

В патентных документах 1 или 2 описывается способ инкапсулирования лекарственного средства в мицелле, предварительно полученной из блок-сополимеров в водной среде, в результате добавления лекарственного средства в раствор мицелл и, необязательно, смешивания и перемешивания получающегося в результате продукта в условиях нагревания и ультразвуковой обработки. Кроме того, в патентном документе 3 описывается способ получения полимерной мицеллы, инкапсулирующей лекарственное средство, в результате растворения блок-сополимеров и лекарственных средств в смешиваемом с водой полярном растворителе, а после этого проведения для получающегося в результате продукта диализа по воде.

В соответствии с данным предшествующим уровнем техники необходимо понимать то, что использованию полимерной мицеллы в качестве носителя для лекарственных средств свойственны различные преимущества, включающие замедленное высвобождение лекарственного средства. Однако в случае обычной полимерной мицеллы лекарственное средство инкапсулируется в мицелле очень стабильно, что может воспрепятствовать подходящему высвобождению лекарственного средства.

Документы предшествующего уровня техники

Патентный документ

[Патентный документ 1] JP 06-107565 A

[Патентный документ 2] US 5449513 A

[Патентный документ 3] JP 11-335267 A

Краткое изложение изобретения

Проблемы, разрешаемые в изобретении

Основная цель настоящего изобретения заключается в предложении композиции полимерной мицеллы, способной стабильно инкапсулировать и подходящим образом высвобождать лекарственное средство, и фармацевтической композиции, использующей композицию полимерной мицеллы.

Средства разрешения проблем

Настоящее изобретение предлагает композицию полимерной мицеллы. Композиция полимерной мицеллы содержит блок-сополимеры, каждый из которых содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи и гидрофильный сегмент полимерной цепи. Множество блок-сополимеров компонуются радиально в состоянии, в котором гидрофобный сегмент полимерной цепи направлен внутрь, а гидрофильный сегмент полимерной цепи направлен наружу. Композиция полимерной мицеллы в качестве блок-сополимеров содержит блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, и блок-сополимер, обладающий сродством к липопротеину, исключающему ЛПВП. Блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи, образованный из полиаминокислоты, включающей повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты. Гидрофобное производное аминокислоты включает производное, полученное в результате введения в боковую цепь аминокислоты ароматической группы и/или стерольного остатка. Блок-сополимер, обладающий сродством к липопротеину, исключающему ЛПВП, содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи, образованный из полиаминокислоты, включающей повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты. Гидрофобное производное аминокислоты включает производное, полученное в результате введения в боковую цепь аминокислоты гидрофобной группы, обладающей линейной или разветвленной структурой. Отделение блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, индуцируется адгезией ЛПВП, которая приписывается такому сродству. Зазор в полимерной мицелле, полученный в результате отделения, вызывает промотирование высвобождения инкапсулируемого лекарственного средства, то есть одного типа, выбираемого из группы, состоящей из растворимых в воде физиологически активных полипептидов и белков, каждый из которых имеет молекулярную массу, равную 1500 и более. Блок-сополимер, обладающий сродством к липопротеину, исключающему ЛПВП, делает зазор меньше, подавляя промотирование высвобождения инкапсулируемого лекарственного средства, что делает возможным контроль скорости высвобождения лекарственного средства.

Настоящее изобретение в другом аспекте предлагает еще одну композицию полимерной мицеллы. Композиция полимерной мицеллы содержит блок-сополимеры, каждый из которых содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи и гидрофильный сегмент полимерной цепи. Множество блок-сополимеров компонуются радиально в состоянии, в котором гидрофобный сегмент полимерной цепи направлен внутрь, а гидрофильный сегмент полимерной цепи направлен наружу. Композиция полимерной мицеллы в качестве одного из блок-сополимеров содержит блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП. Блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи, образованный из полиаминокислоты, включающей повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты. Гидрофобное производное аминокислоты включает производное, полученное в результате введения в боковую цепь аминокислоты стерольного остатка. Блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, содержит гидрофильный сегмент полимерной цепи, образованный поли(этиленгликолем). Отделение блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, индуцируется адгезией ЛПВП, которая приписывается такому сродству. Зазор в полимерной мицелле, полученный в результате отделения, вызывает промотирование высвобождения инкапсулируемого лекарственного средства, то есть одного средства, выбираемого из группы, состоящей из растворимых в воде физиологически активных полипептидов и белков, каждый из которых имеет молекулярную массу, равную 1500 или более.

Настоящее изобретение в еще одном другом аспекте предлагает фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция содержит вышеупомянутую композицию полимерной мицеллы и лекарственное средство, инкапсулированное в композиции полимерной мицеллы, то есть одно средство, выбираемое из группы, состоящей из растворимых в воде физиологически активных полипептидов и белков, каждый из которых имеет молекулярную массу, равную 1500 или более.

Выгодные эффекты от изобретения

В соответствии с настоящим изобретением могут быть предложены композиция полимерной мицеллы, способная стабильно инкапсулировать и подходящим образом высвобождать лекарственное средство, и фармацевтическая композиция, использующая композицию полимерной мицеллы.

Краткое описание чертежей

[ФИГ.1] Фиг.1 представляет собой концептуальные диаграммы, иллюстрирующие взаимодействия между композицией полимерной мицеллы настоящего изобретения и липопротеинами.

[ФИГ.2] Фиг.2 представляет собой график, иллюстрирующий соотношения уровней содержания полимеров в соответствующих липопротеиновых фракциях.

[ФИГ.3] Фиг.3 представляет собой график, иллюстрирующий динамику концентрации G-CSF в плазме из примера 1.

[ФИГ.4] Фиг.4 представляет собой график, иллюстрирующий динамику концентрации G-CSF в плазме из примера 4.

Описание вариантов осуществления

А. Композиция полимерной мицеллы

Композиция полимерной мицеллы настоящего изобретения включает блок-сополимеры, каждый из которых содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи и гидрофильный сегмент полимерной цепи. Множество блок-сополимеров компонуются радиально в состоянии, в котором гидрофобный сегмент полимерной цепи направлен внутрь, а гидрофильный сегмент полимерной цепи направлен наружу. Композиция полимерной мицеллы включает блок-сополимер, обладающий сродством к липопротеину высокой плотности (ЛПВП), (далее в настоящем документе иногда называемый «блок-сополимером, обладающим сродством к ЛПВП») в качестве одного из блок-сополимеров. В соответствии с композицией полимерной мицеллы отделение блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, индуцируется адгезией к ЛПВП, которая приписывается такому сродству, и зазор, образованный в результате отделения, вызывает промотирование высвобождения инкапсулированного лекарственного средства. Адгезионные характеристики полимерной мицеллы по отношению к ЛПВП могут быть подтверждены в результате наблюдения присутствия блок-сополимеров во фракции ЛПВП в случае инкубирования композиции полимерной мицеллы в присутствии ЛПВП (например, в плазме), а после этого очистки фракции ЛПВП. «Гидрофобный сегмент полимерной цепи» и «гидрофильный сегмент полимерной цепи» могут характеризоваться любыми подходящими степенью гидрофобности и степенью гидрофильности, соответственно, если только в водной среде может быть образована мицелла, в которой в вышеупомянутом состоянии скомпоновано множество блок-сополимеров, каждый из которых содержит два данных сегмента.

Возможная причина того, почему промотируется высвобождение лекарственного средства из композиции полимерной мицеллы, описывается ниже. Как это проиллюстрировано на фиг.1(А), в крови ЛПВП 20, который характеризуется средним диаметром частиц, составляющим всего лишь приблизительно 10 нм, легко может проходить во внутреннее пространство (область гидрофобного сегмента полимерной цепи) полимерной мицеллы, включающей блок-сополимеры 10, обладающие сродством к ЛПВП, каждый из которых содержит гидрофильный сегмент полимерной цепи 11 и гидрофобный сегмент полимерной цепи 12. Каждый из блок-сополимеров 10, обладающих сродством к ЛПВП, с учетом сродства к ЛПВП взаимодействует с ЛПВП 20, который проходит в область гидрофобного сегмента полимерной цепи и предпочтительно отделяется от полимерной мицеллы вследствие адгезии к ЛПВП 20. В результате в структуре полимерной мицеллы образуются зазоры, что облегчает высвобождение инкапсулированного лекарственного средства 50. Кроме того, легко происходит дезинтеграция полимерной мицеллы, что промотирует высвобождение лекарственного средства 50. Между тем, как это проиллюстрировано на фиг.1(В), липопротеин низкой плотности (ЛПНП) 30, который характеризуется настолько большим (относительно) средним диаметром частиц, как приблизительно 26 нм, и липопротеин очень низкой плотности (ЛПОНП) 40, который характеризуется диаметром частиц, равным или большим диаметра ЛПНП, с трудом проходят во внутреннее пространство полимерной мицеллы. Таким образом, при учете также и наличия у обладающих сродством к ЛПВП блок-сополимеров 10 по самой их природе слабых взаимодействий с липопротеинами, исключающими ЛПВП, отделение блок-сополимеров от полимерной мицеллы, индуцируемое адгезией липопротеина, исключающего ЛПВП, едва ли должно происходить.

В качестве лекарственного средства, инкапсулируемого в композиции полимерной мицеллы, предпочтительным является одно средство, выбираемое из группы, состоящей из растворимых в воде физиологически активных полипептидов и белков, каждый из которых имеет молекулярную массу, равную 1500 или более. Лекарственное средство имеет относительно большой размер и, таким образом, едва ли будет просачиваться из небольших зазоров между блок-сополимерами в полимерной мицелле, относящейся к обычному типу. Таким образом, лекарственное средство не высвобождается в достаточной степени и в некоторых случаях исключается из кровообращения совместно с мицеллой. С другой стороны, композиция полимерной мицеллы, соответствующая настоящему изобретению, обнаруживает характеристики замедленного высвобождения лекарственного средства вследствие мицеллообразования, в то время как в сопоставлении с полимерной мицеллой, относящейся к обычному типу, она также является превосходной для использования при промотировании высвобождения такого лекарственного средства, имеющего относительно большой размер. Кроме того, как это описывается ниже, в композицию полимерной мицеллы, соответствующую настоящему изобретению, для контроля степени высвобождения лекарственного средства также может быть дополнительно включен блок-сополимер, обладающий сродством к липопротеину, исключающему ЛПВП, такому как ЛПНП или ЛПОНП (далее в настоящем документе иногда называемый «блок-сополимером, не обладающим сродством к ЛПВП»).

Гидрофобный сегмент полимерной цепи в блок-сополимере, обладающем сродством к ЛПВП, может быть образован из полиаминокислоты. Полиаминокислота включает повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты, полученного в результате введения в боковую цепь аминокислоты гидрофобной группы, обладающей циклической структурой. Гидрофобным производным аминокислоты, обладающим циклической структурой, предпочтительно является гидрофобное производное кислой аминокислоты, такой как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, и гидрофобная группа, обладающая циклической структурой, может быть введена в карбоксильную группу в боковой цепи кислой аминокислоты.

Гидрофобной группой, обладающей циклической структурой, может быть группа, обладающая моноциклической структурой, или группа, обладающая полициклической структурой, и, например, могут быть ароматическая группа, алициклическая группа или стерольный остаток. Гидрофобной группой предпочтительно являются С₄-С₁₆ алкильная группа, обладающая циклической структурой, С₆-С₂₀ арильная группа, С₇-С₂₀ аралкильная группа и стерольный остаток. Стерол обозначает природное, полусинтетическое или синтетическое соединение на основе циклопентанонового гидрофенантренового кольца (С₁₇Н₂₈) и его производных. Например, примером природного стерола являются холестерин, холестанол, дигидрохолестерин, холевая кислота, кампестерин и ситостерин. Полусинтетические или синтетические соединения могут представлять собой, например, синтетических предшественников природного стерола (по мере надобности при включении соединения, у которого часть или все из определенных функциональных групп, гидроксигрупп при наличии таковых защищены известной на современном уровне техники группой, защищающей гидроксигруппу, или соединения, у которого карбоксильная группа защищена группой, защищающей карбоксильную группу). Стерольное производное может иметь С₆-С₁₂ алкильную группу или атом галогена, такой как хлор, бром и фтор, введенные в циклопентаноновое гидрофенантреновое кольцо, до тех пор, пока на достижение цели настоящего изобретения не будет оказываться неблагоприятного воздействия. Циклопентаноновое гидрофенантреновое кольцо может быть насыщенным или частично ненасыщенным.

Гидрофобный сегмент полимерной цепи в блок-сополимере, обладающем сродством к ЛПВП, может содержать не только повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты, обладающего циклической структурой, но также и другие повторяющиеся звенья, до тех пор, пока будут обнаруживаться эффекты настоящего изобретения. Примеры других повторяющихся звеньев включают повторяющиеся звенья, произведенные из кислой аминокислоты, такой как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота, и, например, гидрофобного производного, полученного в результате введения в кислую аминокислоту С₄-С₁₆ незамещенной или замещенной линейной или разветвленной алкильной группы.

Для получения гидрофобного сегмента полимерной цепи в блок-сополимере, обладающем сродством к ЛПВП, уровень содержания повторяющихся звеньев, произведенных из гидрофобного производного аминокислоты, обладающего циклической структурой, предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 100% мол., более предпочтительно от 20 до 80% мол., в расчете на совокупное количество 100% мол. повторяющихся звеньев. Вышеупомянутый уровень содержания может более надежно обеспечить получение сродства к ЛПВП.

Примеры гидрофильного сегмента полимерной цепи в блок-сополимере, обладающем сродством к ЛПВП, включают поли(этиленгликоль), полисахарид, поли(винилпирролидон), поли(виниловый спирт), поли(акриловый амид), поли(акриловую кислоту), поли(метакриловый амид), поли(метакриловую кислоту), поли(сложный эфир метакриловой кислоты), поли(сложный эфир акриловой кислоты), полиаминокислоту, поли(яблочную кислоту) и их производные. Конкретные примеры полисахарида включают крахмал, декстран, фруктан и галактан.

В блок-сополимере, обладающем сродством к ЛПВП, гидрофильный сегмент полимерной цепи и гидрофобный сегмент полимерной цепи соединены друг с другом через известную соединительную группу. Примеры соединительной группы включают связь сложного эфира, связь амида, иминогруппу, связь углерод-углерод и связь простого эфира. Конец, противоположный концу со стороны гидрофильного сегмента полимерной цепи, у гидрофобного сегмента полимерной цепи и конец, противоположный концу со стороны гидрофобного сегмента полимерной цепи, у гидрофильного сегмента полимерной цепи могут быть подвергнуты любому подходящему химическому модифицированию, если только на образование полимерной мицеллы не будет оказано неблагоприятного воздействия.

Блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, может содержать гидрофильный сегмент полимерной цепи, образованный поли(этиленгликолем), и гидрофобный сегмент полимерной цепи, образованный полиаминокислотой, включающей повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты. Гидрофобное производное аминокислоты может быть производным, полученным в результате введения в боковую цепь аминокислоты стерольного остатка.

Блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, может быть описан каждой из следующих далее общих формул (I) и (II). Композиция полимерной мицеллы настоящего изобретения может включать два и более типа блок-сополимеров, обладающих сродством к ЛПВП.

[Химическая формула 1]

В каждой из вышеупомянутых формул каждый из R¹ и R³ независимо представляет собой атом водорода или низшую алкильную группу, замещенную или незамещенную необязательно защищенной функциональной группой;

R² представляет собой атом водорода, насыщенную или ненасыщенную С₁-С₂₉ алифатическую карбонильную группу или арилкарбонильную группу;

R⁴ представляет собой гидроксильную группу, насыщенную или ненасыщенную С₁-С₃₀ алифатическую оксигруппу или арил(низший алкил)оксигруппу;

каждый из R⁵ представляет собой -О- или -NH-;

каждый из R⁶ представляет собой атом водорода, С₄-С₁₆ алкильную группу, обладающую циклической структурой, незамещенной или замещенной аминогруппой или карбоксильной группой, С₆-С₂₀ арильную группу, С₇-С₂₀ аралкильную группу или стерильную группу;

каждый из R⁷ и R⁸ независимо представляет собой метиленовую группу или этиленовую группу;

n представляет собой целое число в диапазоне от 10 до 2500;

х представляет собой целое число в диапазоне от 10 до 300;

m представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 300 (при том условии, что в случае m, составляющего 1 и более, повторяющееся звено с числом повторений х и повторяющееся звено с числом повторений m будут связаны друг с другом любым подходящим образом, каждый из R⁶ независимо выбирается в соответствующих повторяющихся звеньях в одном блок-сополимере и присутствует при случайном распределении, и каждые 10% или более из совокупного количества R⁶ независимо выбирают из С₄-С₁₆ алкильной группы, обладающей циклической структурой, незамещенной или замещенной аминогруппой или карбоксильной группой, С₆-С₂₀ арильной группы, С₇-С₂₀ аралкильной группы и стерильной группы);

L¹ представляет собой соединительную группу, выбираемую из группы, состоящей из -NH-, -O-, -O-Z-NH-, -CO-, -CH₂-, -O-Z-S-Z- и -OCO-Z-NH- (где Z независимо представляет собой С₁-С₆ алкиленовую группу); и

L² представляет собой соединительную группу, выбираемую из -OCO-Z-CO- и -NHCO-Z-CO- (где Z представляет собой С₁-С₆ алкиленовую группу).

Примерами С₆-С₂₀ арильной группы и С₇-С₂₀ аралкильной группы являются предпочтительно фенильная группа, нафтильная группа, толильная группа, ксилильная группа, бензильная группа и фенэтильная группа, более предпочтительно бензильная группа. Кроме того, примером стерола, из которого производят стерильную группу, является предпочтительно холестерин, холестанол и дигидроксихолестерин, более предпочтительно холестерин.

n в каждой из вышеупомянутых формул представляет собой целое число в диапазоне предпочтительно от 10 до 1000, более предпочтительно от 20 до 600, в особенности предпочтительно от 50 до 500. Каждые из х и m в каждой из вышеупомянутых формул представляют собой целое число в диапазоне предпочтительно от 20 до 200, более предпочтительно от 30 до 100.

Примеры необязательно защищенной функциональной группы включают гидроксильную группу, ацеталь, кеталь, альдегид, остаток сахара, малеимидную группу, карбоксильную группу, аминогруппу, тиольную группу и активный сложный эфир. Гидрофильный сегмент полимерной цепи в том случае, когда каждые из R¹ и R³ представляют собой низшую алкильную группу, замещенную необязательно защищенной функциональной группой, может быть получен, например, в соответствии со способами, описанными в публикациях WO 96/33233 A1, WO 96/32434 A1 и WO 97/06202 A1. Низшая алкильная группа обозначает линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую, например, 7 или менее, предпочтительно 4 или менее, атомов углерода.

Блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, может быть получен, например, в результате сочетания по известному способу полимера, имеющего гидрофильную полимерную цепь, и полимера, имеющего полиаминокислотную цепь, каждый из которых не подвергали какой-либо обработке или по мере надобности очищали в целях достижения узкого молекулярно-массового распределения. Блок-сополимер, описывающийся общей формулой (I), также может быть получен, например, в результате проведения анионной живой полимеризации при использовании инициатора, способного придавать R¹ для получения полиэтиленгликолевой цепи, после этого введения аминогруппы со стороны растущего конца и полимеризации с аминового конца N-карбонового ангидрида (NCA) защищенной аминокислоты, такой как β-бензил-L-аспарагинат или γ-бензил-L-глутаминат.

Конкретный пример способа изготовления блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, описывается ниже. Добавляют (i) N-карбокси-β-бензил-L-аспарагиновый ангидрид (BLA-NCA) или (ii) N-карбокси-γ-бензил-L-глутаминовый ангидрид (BLG-NCA), которые подвергают реакции при использовании в качестве инициатора полиэтиленгликоля, который защищен с одного конца и имеет аминогруппу на другом конце, такого как в случае MeO-PEG-CH₂CH₂CH₂-NH₂, в обезвоженном органическом растворителе для достижения желательной степени полимеризации (количества аминокислотных звеньев), что тем самым приводит к получению (i) сополимера полиэтиленгликоль-бензиловый сложный эфир полиаспарагиновой кислоты или (ii) сополимера полиэтиленгликоль-бензиловый сложный эфир полиглутаминовой кислоты. В дополнение к этому, получающийся в результате блок-сополимер ацетилируют на конце ацетилхлоридом или уксусным ангидридом, после этого подвергают щелочному гидролизу для удаления бензильной группы и превращают в сополимер полиэтиленгликоль-полиаспарагиновая кислота или сополимер полиэтиленгликоль-полиглутаминовая кислота. После этого в органический растворитель добавляют бензиловый спирт для достижения желательной степени этерификации и реакцию проводят в присутствии конденсационного агента, такого как N-N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) и N-N'-диизопропилкарбодиимид (DIPCI), что приводит к получению блок-сополимера, частично содержащего бензиловый сложный эфир.

В случае проведения реакции при использовании вместо бензилового спирта холестерина может быть получен сополимер полиэтиленгликоль-холестериновый сложный эфир полиаспарагиновой кислоты и сополимер полиэтиленгликоль-холестериновый сложный эфир полиглутаминовой кислоты.

Другим конкретным примером способа изготовления блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, является способ, включающий введение гидрофобной боковой цепи через амидную связь. В способе изготовления сополимер полиэтиленгликоль-бензиловый сложный эфир полиаспарагиновой кислоты или сополимер полиэтиленгликоль-бензиловый сложный эфир полиглутаминовой кислоты ацетилируют на конце тем же самым образом, что и описанный выше. После этого бензильную группу удаляют в результате проведения щелочного гидролиза, а образованную карбоксильную группу подвергают реакции с гидрофобной боковой цепью, имеющей аминогруппу. В альтернативном варианте проводят реакцию для сополимера полиэтиленгликоль-бензиловый сложный эфир полиаспарагиновой кислоты или сополимера полиэтиленгликоль-бензиловый сложный эфир полиглутаминовой кислоты и соединения, включающего первичный амин, а после этого проводят аминолиз для превращения сложноэфирной связи в амидную связь. Это обеспечивает введение гидрофобной боковой цепи через амидную связь. В дополнение к этому, также могут быть получен сегмент поли(аминокислотного производного), включающий гидрофобную боковую цепь, имеющую гидрофобную группу, конец которой замещен аминогруппой, и гидрофобную боковую цепь, не имеющую замещения аминогруппой, в результате добавления первичного амина, такого как 1-октиламин, к сополимеру полиэтиленгликоль-бензиловый сложный эфир полиаспарагиновой кислоты в органическом растворителе для достижения желательной степени амидирования, проведения для смеси реакции в течение предварительно определенного периода времени, а после этого добавления большого избыточного количества 1,8-диаминооктана и тому подобного к непрореагировавшему бензиловому сложному эфиру.

Блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, благодаря своему сродству к ЛПВП характеризуется коэффициентом переноса в ЛПВП, который определяют так, как это описывается ниже, равным 30% или более. Блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, характеризуется коэффициентом переноса в ЛПВП, равным предпочтительно 40% или более, более предпочтительно 45% или более, в особенности предпочтительно 50% или более.

[Метод определения коэффициента переноса в ЛПВП]

Блок-сополимеры используют в качестве полимерных мицелл, инкапсулирующих лизоцим, и полимерные мицеллы инкубируют в плазме при 37°С в течение 24 часов. После этого соответствующие липопротеиновые фракции очищают и собирают. Измеряют концентрацию блок-сополимеров в каждой из собранных фракций в виде ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП и остаточных фракций. После этого, исходя из объема, рассчитывают уровень содержания (в массовом выражении) блок-сополимеров в каждой из фракций и концентрацию блок-сополимера в каждой из фракций. Получающееся в результате значение подставляют в следующее далее уравнение для определения коэффициента переноса в ЛПВП.

Коэффициент переноса в ЛПВП (%) = уровень содержания блок-сополимера во фракции ЛПВП/совокупное значение уровней содержания блок-сополимера в соответствующих фракциях × 100

При определении коэффициента переноса в ЛПВП блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, предпочтительно присутствует во фракции ЛПВП с наибольшим количеством среди других липопротеиновых фракций (за исключением фракции хиломикрона). То есть предпочтительно, чтобы уровень содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, во фракции ЛПВП был наибольшим среди уровней содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, в соответствующих фракциях, то есть фракциях в виде ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП и остаточных фракций.

Композиция полимерной мицеллы в качестве одного из блок-сополимеров, каждый из которых содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи и гидрофильный сегмент полимерной цепи, может дополнительно включать блок-сополимер, не обладающий сродством к ЛПВП. Блок-сополимер, не обладающий сродством к ЛПВП, трудно предпочтительно отделять от полимерной мицеллы. Это обусловливается трудностью прохождения липопротеинов, за исключением ЛПВП, во внутреннее пространство полимерной мицеллы. Таким образом, в случае получения композиции полимерной мицеллы смешанного типа из блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, и блок-сополимера, не обладающего сродством к ЛПВП, может быть подавлено образование зазора вследствие отделения блок-сополимеров, обладающих сродством к ЛПВП, и, наоборот, в некоторых случаях образование зазора может быть промотировано вследствие уменьшения гидрофобного взаимодействия между блок-сополимерами для получения композиции полимерной мицеллы. Как это описывалось выше, скорость высвобождения лекарственного средства из композиции полимерной мицеллы можно контролировать в результате регулирования уровней содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, и блок-сополимера, не обладающего сродством к ЛПВП. То есть в соответствии с настоящим изобретением может быть предложена полимерная мицелла, обладающая способностью разрушаться, которую обычно трудно придавать, и, кроме того, также может быть облегчен контроль скорости дезинтеграции полимерной мицеллы.

Гидрофобный сегмент полимерной цепи в блок-сополимере, не обладающем сродством к ЛПВП, может быть образован из полиаминокислоты, включающей повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты, полученного в результате введения в боковую цепь аминокислоты гидрофобной группы, обладающей линейной или разветвленной структурой. Гидрофобным производным аминокислоты является гидрофобное производное предпочтительно кислой аминокислоты, более предпочтительно аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты.

Примерами гидрофобной группы, обладающей линейной или разветвленной структурой, являются С₄-С₁₈ незамещенная или замещенная линейная или разветвленная алкильная группа, С₄-С₁₈ незамещенная или замещенная линейная или разветвленная алкенильная группа и С₄-С₁₈ незамещенная или замещенная линейная или разветвленная алкинильная группа, предпочтительно С₄-С₁₈ незамещенная или замещенная линейная или разветвленная алкильная группа.

Что касается гидрофильного сегмента полимерной цепи в блок-сополимере, не обладающем сродством к ЛПВП, то может быть выбран тот же самый гидрофильный полимер, что и в случае гидрофильного сегмента полимерной цепи в блок-сополимере, обладающем сродством к ЛПВП. Кроме того, концевое модифицирование каждых гидрофильного сегмента полимерной цепи и гидрофобного сегмента полимерной цепи в блок-сополимере, не обладающем сродством к ЛПВП, и соединение данных сегментов также представляют собой то же самое, что и было описано в параграфе, относящемся к блок-сополимеру, обладающему сродством к ЛПВП.

Блок-сополимер, не обладающий сродством к ЛПВП, может быть описан каждой из следующих далее общих формул (III) и (IV):

[Химическая формула 2]

В каждой из вышеупомянутых формул каждый из R⁹ и R¹¹ независимо представляет собой атом водорода или низшую алкильную группу, замещенную или незамещенную необязательно защищенной функциональной группой;

R¹⁰ представляет собой атом водорода, насыщенную или ненасыщенную С₁-С₂₉ алифатическую карбонильную группу или арилкарбонильную группу;

R¹² представляет собой гидроксильную группу, насыщенную или ненасыщенную С₁-С₃₀ алифатическую оксигруппу или арил(низший алкил)оксигруппу;

каждый из R¹³ представляет собой -О- или -NH-;

каждый из R¹⁴ представляет собой атом водорода, С₄-С₁₈ линейную или разветвленную алкильную группу, незамещенную или замещенную аминогруппой или карбоксильной группой;

каждый из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой метиленовую группу или этиленовую группу;

р представляет собой целое число в диапазоне от 10 до 2500;

q представляет собой целое число в диапазоне от 10 до 300;

r представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 300 (при том условии, что в случае r, составляющего 1 или более, повторяющееся звено с числом повторений q и повторяющееся звено с числом повторений r будут связаны друг с другом любым подходящим образом, каждый из R¹⁴ независимо выбирается в соответствующих повторяющихся звеньях в одном блок-сополимере и присутствует при случайном распределении, и каждые 40% и менее из совокупного количества R¹⁴ представляют собой атом водорода);

L³ представляет собой соединительную группу, выбираемую из группы, состоящей из -NH-, -O-, -O-Z-NH-, -CO-, -CH₂-, -O-Z-S-Z- и -OCO-Z-NH- (где Z независимо представляет собой С₁-С₆ алкиленовую группу); и

L⁴ представляет собой соединительную группу, выбираемую из -OCO-Z-CO- и -NHCO-Z-CO- (где Z представляет собой С₁-С₆ алкиленовую группу).

р в каждой из вышеупомянутых формул представляет собой целое число в диапазоне предпочтительно от 10 до 1000, более предпочтительно от 20 до 600, в особенности предпочтительно от 50 до 500. Каждые из q и r в каждой из вышеупомянутых формул представляют собой целое число в диапазоне предпочтительно от 20 до 200, более предпочтительно от 30 до 100.

Необязательно защищенная функциональная группа представляет собой то, что было описано в абзаце, относящемся к каждой из формул (I) и (II).

Коэффициент переноса в ЛПВП для блок-сополимера, не обладающего сродством к ЛПВП, может быть меньшим чем 30%, предпочтительно равным 25% или менее, более предпочтительно 20% или менее.

Соотношение между уровнями содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, и блок-сополимера, не обладающего сродством к ЛПВП, в композиции полимерной мицеллы настоящего изобретения (массовое соотношение блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП:блок-сополимер, не обладающий сродством к ЛПВП) может быть установлено в зависимости от предполагаемого варианта использования композиции полимерной мицеллы, коэффициента переноса в ЛПВП для каждого из блок-сополимеров и тому подобного. Соотношение между уровнями содержания (массовое соотношение блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП:блок-сополимер, не обладающий сродством к ЛПВП) может находиться, например, в диапазоне от 1:99 до 99:1, в диапазоне от 3:97 до 97:3, в диапазоне от 15:85 до 85:15 или в диапазоне от 40:60 до 60:40. Как это описывалось выше, массовая доля блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, в расчете на совокупную массу блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, и блок-сополимера, не обладающего сродством к ЛПВП, в композиции полимерной мицеллы может составлять, например, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 20% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 2% или менее или 1% или менее. Имеет место тенденция к индуцированию дезинтеграции полимерной мицеллы, что промотирует высвобождение лекарственного средства, при большой доле уровня содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП. Между тем имеет место тенденция к подавлению дезинтеграции полимерной мицеллы и сопутствующего высвобождения лекарственного средства при малой доле уровня содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП.

В. Фармацевтическая композиция

Одна фармацевтическая композиция настоящего изобретения включает композицию полимерной мицеллы, описанную в вышеупомянутом разделе А, и лекарственное средство, инкапсулированное в композиции полимерной мицеллы. Лекарственное средство в желательном варианте представляет собой один тип, выбираемый из группы, состоящей из растворимых в воде физиологически активных полипептидов и белков. В дополнение к этому, лекарственное средство имеет молекулярную массу, равную в желательном варианте 1500 и более, предпочтительно 2000 и более. Предпочтительные примеры физиологически активных полипептидов и белков включают интерфероны α, β и γ; эритропоэтин; G-CSF; гормон роста; интерлейкины; фактор некроза опухоли; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; макрофагальный колониестимулирующий фактор; фактор роста гепатоцитов; надсемейство TGF-β; EGF; FGF; IGF-I; и факторы свертывания крови, типичным представителем которых является фактор VII. Кроме того, до тех пор пока активность не ухудшится, в качестве лекарственных препаратов могут быть использованы и производные вышеупомянутых белков, говоря более конкретно, белки, демонстрирующие наличие замещений, присоединений или удалений в одной или нескольких аминокислотах.

Лекарственным средством может быть плохо растворимое в воде лекарственное средство, характеризующееся растворимостью в воде, равной 100 мкг/мл или менее. Примеры плохо растворимого в воде лекарственного средства включают: противоопухолевые препараты, такие как паклитаксел, топотекан, камптотецин, цисплатин, гидрохлорид даунорубицина, метотрексат, митомицин С, доцетаксел, сульфат винкристина и их производные; антибиотики на полиеновой основе, такие как амфотерицин В и нистатин; и липофильные лекарственные средства, такие как простагландины и их производные. Плохо растворимое в воде лекарственное средство имеет относительно малый размер, но вследствие своей высокой гидрофобности с трудом может высвобождаться из композиции полимерной мицеллы, относящейся к обычному типу. С другой стороны, в сопоставлении с композицией полимерной мицеллы, относящейся к обычному типу, фармацевтическая композиция настоящего изобретения также является превосходной для использования и при промотировании высвобождения такого плохо растворимого в воде лекарственного средства.

Количество инкапсулируемого лекарственного средства может быть установлено в зависимости от предполагаемого варианта использования фармацевтической композиции и тому подобного. Количество используемого лекарственного средства в общем случае находится в диапазоне от 0,01 до 50% масс., предпочтительно от 0,1 до 10% масс., в расчете на совокупное количество блок-сополимеров в композиции полимерной мицеллы.

На диаметр частицы полимерной мицеллы, инкапсулирующей лекарственное средство, каких-либо конкретных ограничений не накладывают до тех пор, пока он будет иметь величину, пригодную для введения в живой организм. Диаметр частиц предпочтительно составляет 10 мкм или менее, более предпочтительно 5 мкм или менее. В частности, в случае использования полимерной мицеллы при внутривенном введении диаметр частиц предпочтительно составит 500 нм или менее, более предпочтительно 300 нм или менее.

Фармацевтическая композиция, например, может быть получена так, как это описывается ниже. Сначала вышеупомянутые блок-сополимеры растворяют в органическом растворителе. По мере надобности органический растворитель может быть удален в результате проведения для получающегося в результате раствора воздушной сушки, например, по мере надобности сушки для получения пленки в атмосфере потока газообразного азота и дополнительной сушки при пониженном давлении. К блок-сополимерам, подвергнутым обработке таким образом, добавляли и примешивали раствор, содержащий инкапсулируемое лекарственное средство. После этого из получающегося в результате смешанного раствора образуется полимерная мицелла при одновременном инкапсулировании лекарственного средства.

Примеры органического растворителя включают: несмешиваемые с водой органические растворители, такие как дихлорметан, хлороформ, диэтиловый эфир, дибутиловый эфир, этилацетат и бутилацетат; смешиваемые с водой органические растворители, такие как метанол, этанол, пропиловый спирт, изопропиловый спирт, диметилсульфоксид, диметилформамид, диметилацетамид, ацетонитрил, ацетон и тетрагидрофуран; и растворители, смешанные из них.

Полимерная мицелла, инкапсулирующая лекарственное средство, может быть образована, например, в результате перемешивания смешанного раствора блок-сополимеров и лекарственного средства при одновременном воздействии на раствор энергией ультразвукового облучения. Ультразвуковое облучение может быть проведено, например, при использовании биодезинтегратора (изготовленного в компании NIHONSEIKI KAISHA LTD.).

С. Способ контроля скорости высвобождения лекарственного средства из фармацевтической композиции

Способ включает изменение доли уровня содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, в расчете на совокупное количество блок-сополимеров в композиции полимерной мицеллы в фармацевтической композиции, описанной в вышеупомянутом разделе В. Блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, способен обнаруживать эффект промотирования высвобождения лекарственного средства из полимерной мицеллы. Таким образом, для контроля скорости высвобождения лекарственного средства из полимерной мицеллы может быть изменена доля уровня содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП.

Например, долю уровня содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, в расчете на совокупное количество блок-сополимеров в композиции полимерной мицеллы (массовое соотношение уровень содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП/совокупное значение уровней содержания блок-сополимеров) устанавливают в диапазоне от более чем 0/100 до 100/100 или менее, предпочтительно от 1/100 до 100/100. Более конкретно, соотношение между уровнями содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, и блок-сополимера, не обладающего сродством к ЛПВП, в композиции полимерной мицеллы (массовое соотношение блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП:блок-сополимер, не обладающий сродством к ЛПВП) устанавливают, например, в диапазоне от 1:99 до 99:1, в диапазоне от 3:97 до 97:3, в диапазоне от 15:85 до 85:15 или в диапазоне от 40:60 до 60:40. Имеет место тенденция к возможности промотирования высвобождения лекарственного средства при большой доле уровня содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, в то время как при малой доле уровня содержания высвобождение лекарственного средства может быть подавлено.

Примеры

В следующем далее описании изобретения для целей упрощенного выражения, например в случае содержания в блок-сополимере гидрофильного сегмента полимерной цепи, образованного из цепи PEG, имеющей среднюю молекулярную массу 10000, и гидрофобного сегмента полимерной цепи, образованного из полиаминокислотной цепи, содержащей в среднем 40 аминокислотных остатков, и в случае демонстрации им степени введения в боковую цепь полиаминокислотной цепи бензильной группы, равной приблизительно 65%, будет использоваться выражение «блок-сополимер (10-40, 65% Bn)». Подобным образом, в случае наличия гидрофобных групп, вводимых в боковую цепь полиаминокислотной цепи, в виде октильной группы и холестерильной группы будут использоваться выражения «блок-сополимер (10-40, 65% С8)» и «блок-сополимер (10-40, 65% Chol)», соответственно. Степень введения гидрофобной группы, равная приблизительно 65%, включает диапазон от 62 до 68%.

Справочный пример 1

Получение полимерной мицеллы, инкапсулирующей лизоцим

В качестве блок-сополимеров использовали блок-сополимеры, описывающиеся в следующей далее общей формуле (V) и таблице 1. Каждый из блок-сополимеров отвешивали в пробирку и сюда же добавляли очищенную воду до достижения концентрации полимера 5 мг/мл. После этого растворы полимеров интенсивно перемешивали при 4°С в течение ночи. Растворы полимеров подвергали воздействию ультразвукового облучения (в водяной бане со льдом, низкий режим, интервал в 1 секунду, 10 минут) при использовании биодезинтегратора (установка High Power Unit, изготовленная NIHONSEIKI KAISHA LTD.), а после этого подвергали обработке при использовании мембранного фильтра на 0,22 мкм. Таким образом, получают растворы пустых мицелл, каждый из которых характеризуется концентрацией полимера 5 мг/мл. К каждому из растворов пустых мицелл (0,6 мл) добавляли раствор лизоцима при 1 мг/мл (0,15 мл) до достижения концентрации 5% масс./масс. в расчете на массу полимера, натрий-фосфатный буфер (рН 6) при 200 мМ и очищенную воду. Параметры получающихся в результате смесей регулировали при использовании HCl при 0,1н. для получения в конечном счете концентрации полимера 3 мг/мл, концентрации лизоцима 0,15 мг/мл и композиции с 20 мМ натрий-фосфатного буфера, а также рН 6. Растворы переворачивали и взбалтывали два или три раза, а после этого оставляли на ночь стоять в покое при 4°С. Мицеллы, каждые из которых инкапсулируют лизоцим, будучи полученными так, как это описывалось выше, нагревали до комнатной температуры и после этого их использовали.

[Химическая формула 3]

В вышеупомянутой формуле звено глутаминовой кислоты и звено ее гидрофобного производного связаны друг с другом любым подходящим образом и присутствуют при случайном распределении в одном блок-сополимере.

Таблица 1
Блок-сополимер	Молекулярная масса PEG	R17	t
PEG-pGlu (10-40, 60% Bn)	10000	Бензильная группа	24
PEG-pGlu (10-40, 30% Chol)	10000	Холестерильная группа	12
PEG-pGlu (10-40, 60% С8)	10000	Октильная группа	24
PEG-pGlu (10-40, 60% С12)	10000	Додецильная группа	24
PEG-pGlu (10-40, 60% С16)	10000	Гексадецильная группа	24

Справочный пример 2

Коэффициент переноса в ЛПВП

При определении коэффициента переноса в ЛПВП для каждого из блок-сополимеров использовали полимерные мицеллы, каждые из которых инкапсулируют лизоцим, будучи полученными в справочном примере 1. Конкретный экспериментальный метод описывается ниже. К 810 мкл плазмы крыс, хранившейся при -80°С после центрифугирования крови, собранной при использовании гепарина у каждой из мужских особей крыс Wistar возрастом 8 недель, добавляли 90 мкл каждых полимерных мицелл, каждые из которых инкапсулируют лизоцим, и смесь инкубировали при 37°С в течение 24 часов (конечная концентрация лизоцима: 15 мкг/мл, конечная концентрация полимера: 300 мкг/мл). После этого смесь подвергали ультрацентрифугированию в условиях в виде 45000 об/мин (приблизительно 100000 g), 15 минут и 4°С (Ротар: MLA-130, пробирка для центрифуги: толстостенная полиалломерная пробирка) при использовании системы «OptimaMAX» (торговое наименование) (изготовленной Beckman) в соответствии с протоколом Axis-Shield Density Gradient Media, загружаемым со страницы интернета http://www.axis-shield-density-gradient-media.com/CD2009/macromol/M07.pdf. Затем после ультрацентрифугирования из плазмы удаляли фракцию хиломикрона в виде самого верхнего слоя. После этого в расчете на 720 мкл плазмы добавляли и примешивали 180 мкл препарата «Optiprep (зарегистрированная торговая марка)» (торговое наименование) (изготовленного Axis-shield) в 1/4 объема плазмы и смесь подвергали ультрацентрифугированию в условиях в виде 85000 об/мин (приблизительно 350000 g), 3 часа и 16°С. Во время ультрацентрифугирования проводили балансовое регулирование при использовании буфера 0,85% масс./об. NaCl/10 мМ 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновая кислота (HEPES) (pH 7,4). После ультрацентрифугирования собирали фракции в виде ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП и остаточных (других) фракций и при использовании комплекта PEG-ELISA (изготовленного Life Diagnostics) измеряли концентрацию блок-сополимера в каждой из фракций. Исходя из получающейся в результате концентрации полимера и объема каждой из фракций, рассчитывали уровень содержания блок-сополимера в каждой из фракций и его долю (то есть, коэффициент переноса блок-сополимера в каждую фракцию). Фиг.2 демонстрирует результаты.

Как можно видеть на фиг.2, материалы как PEG-pGlu (10-40, 60% Bn), так и PEG-pGlu (10-40, 30% Chol) характеризовались коэффициентом переноса в ЛПВП, равным 50% или более, и демонстрировали высокое сродство к ЛПВП. С другой стороны, все материалы, выбираемые из PEG-pGlu (10-40, 60% С8), PEG-pGlu (10-40, 60% С12) и PEG-pGlu (10-40, 60% С16), характеризовались коэффициентом переноса в ЛПВП, меньшим чем 20%, и в сопоставлении с ЛПВП демонстрировали более высокое сродство к другим липопротеинам, таким как ЛПНП и ЛПОНП.

Пример 1

Испытание на внутривенное введение крысам полимерной мицеллы, инкапсулирующей G-CSF

(1) PEG-pGlu (10-40, 30% Chol)

В качестве блок-сополимера использовали материал PEG-pGlu (10-40, 30% Chol). Блок-сополимер отвешивали в пробирку. Сюда же добавляли буфер моногидрата 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES) (pH 5) при 20 мМ до достижения концентрации полимера 2 мг/мл и смесь интенсивно перемешивали в течение ночи при 4°С. Раствор полимера подвергали ультразвуковому облучению (в водяной бане со льдом, низкий режим, интервал в 1 секунду, 10 минут) при использовании биодезинтегратора (установка High Power Unit, изготовленная NIHONSEIKI KAISHA LTD.), а после этого подвергали обработке при использовании мембранного фильтра на 0,22 мкм. Таким образом, получали раствор пустых мицелл, характеризующийся концентрацией полимера 2 мг/мл. К получающемуся в результате раствору пустых мицелл (6 мл) добавляли раствор G-CSF при 300 мкг/мл (2 мл) до достижения концентрации 5% масс./масс. в расчете на массу полимера и смесь переворачивали и взбалтывали, а после этого оставляли на ночь стоять в покое при 4°С. После этого раствор очищали и концентрировали в результате ультрафильтрования при использовании системы «Amicon Ultra (зарегистрированная торговая марка)» (торговое наименование) (изготовленной Millipore Corporation, отсечение по молекулярной массе: 100000) и среду замещали водным раствором сахарозы при 10% масс./масс. Собранные полимерные мицеллы, инкапсулирующие G-CSF, хранили при -80°С и оттаивали при комнатной температуре перед использованием.

Полученный выше раствор полимерной мицеллы, инкапсулирующий G-CSF, вводили мужским особям крыс Wistar через хвостовую вену. Дозировка составляла 100 мкг/кг массы тела, а количество животных для образца составляло три. Кровь собирали при использовании обработанного гепарином шприца из яремной вены в условиях эфирной анестезии по истечении 5 минут, 1 часа, 6 часов, 1 дня, 2 дней и 3 дней после введения. Концентрацию G-CSF в плазме измеряли при использовании комплекта G-CSF-ELISA (изготовленного RayBiotech, Inc.).

(2) PEG-pGlu (10-40, 60% C8)

Полимерную мицеллу, инкапсулирующую G-CSF, получали тем же образом, что и в примере испытания при использовании материала PEG-pGlu (10-40, 30% Chol), за исключением использования в качестве блок-сополимера материала PEG-pGlu (10-40, 60% C8) и количества животных для образца, равного девяти. Рассматривали динамику концентрации G-CSF в плазме.

(3) Смешанная полимерная мицелла

Каждый из материалов PEG-pGlu (10-40, 30% Chol) и PEG-pGlu (10-40, 60% C8) отвешивали в равном количестве и оба полимера растворяли в дихлорметане и полностью гомогенизировали. После этого растворитель удаляли при использовании шейкерного концентратора до получения пленки. Затем в соответствии с обычным способом получали пустые мицеллы. После этого в соответствии с обычным способом в пустые мицеллы инкапсулировали G-CSF до достижения концентрации 5% масс./масс. в расчете на массу полимеров. Получающиеся в результате полимерные мицеллы, инкапсулирующие G-CSF, вводили крысам для рассмотрения динамики концентрации G-CSF в плазме.

(4) Непосредственное введение G-CSF

Динамику концентрации G-CSF в плазме рассматривали тем же образом, что и в примере испытания при использовании материала PEG-pGlu (10-40, 30% Chol), за исключением использования вместо раствора полимерной мицеллы, инкапсулирующей G-CSF, раствора G-CSF (100 мкг/мл) и количества животных для образца, равного пяти.

Фиг.3 иллюстрирует результаты для примера 1 (среднее значение ± среднеквадратическая ошибка). Фиг.3 также иллюстрирует теоретические значения для динамики концентрации в плазме в случае смешанной полимерной мицеллы (1:1), которые рассчитывают по результатам для динамики концентрации в плазме из примеров испытаний при использовании материалов PEG-pGlu (10-40, 30% Chol) и PEG-pGlu (10-40, 60% C8).

Как это проиллюстрировано на фиг.3, в случае непосредственного введения G-CSF G-CSF очень быстро подвергался распаду или метаболизму, и время удерживания в плазме было чрезвычайно коротким. С другой стороны, в случае введения G-CSF, инкапсулированного в полимерных мицеллах, время удерживания в плазме значительно продлевалось. В дополнение к этому, в сопоставлении с полимерной мицеллой, образованной из блок-сополимера, не обладающего сродством к ЛПВП, полимерная мицелла, образованная из блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, промотировала высвобождение G-CSF. Кроме того, в смешанной полимерной мицелле, включающей материалы PEG-pGlu (10-40, 30% Chol) и PEG-pGlu (10-40, 60% C8) при соотношении 1:1, наблюдавшиеся значения для концентрации G-CSF в плазме были значительно меньшими в сопоставлении с их теоретическими значениями. Это выявило создание смесью из множества блок-сополимеров, отличающихся друг от друга по сродству к липопротеину, удивительного действия по промотированию высвобождения лекарственного средства, неожиданного с точки зрения соотношения между количествами полимеров в смеси.

Пример 2

(1) Мицелла, относящаяся к типу С8

В качестве блок-сополимера использовали материал PEG-pGlu (10-40, 90% C8). Блок-сополимер отвешивали в пробирку. Сюда же добавляли буфер MES (pH 5) при 20 мМ, включающий 13,3% сахарозы, до достижения концентрации полимера 10 мг/мл и смесь интенсивно перемешивали в течение ночи при 4°С. Раствор полимера подвергали ультразвуковому облучению (в водяной бане со льдом, высокий режим, интервал в 1 секунду, 15 минут × 3) при использовании биодезинтегратора (NIHONSEIKI KAISHA LTD., High Power Unit), а после этого подвергали обработке при использовании мембранного фильтра на 0,22 мкм. К раствору добавляли вышеупомянутый буфер MES (pH 5) при 20 мМ, включающий сахарозу, и концентрацию полимера доводили до 2 мг/мл для получения раствора пустых мицелл. К получающемуся в результате раствору пустых мицелл (1,2 мл) добавляли раствор G-CSF при 300 мкг/мл (0,4 мл) до достижения концентрации 5% масс./масс. в расчете на массу полимера и смесь переворачивали и взбалтывали, после этого оставляли на ночь стоять в покое при 4°С и затем хранили при -80°С. Хранящуюся смесь оттаивали при комнатной температуре перед использованием.

(2) Мицелла, относящаяся к типу Bn

Полимерную мицеллу, инкапсулирующую G-CSF, получали тем же самым образом, как и в примере испытания в случае мицеллы, относящейся к типу С8, за исключением использования в качестве блок-сополимера материала PEG-pGlu (10-40, 100% Bn).

(3) Мицелла, относящаяся к смешанному типу

Каждый материал из PEG-pGlu (10-40, 90% C8) и PEG-pGlu (10-40, 100% Bn) отвешивали в пробирку и полностью растворяли, используя ацетон, до достижения концентрации полимера 10 мг/мл. Растворы перемешивали друг с другом до получения массовых соотношений между материалами PEG-pGlu (10-40, 90% C8) и PEG-pGlu (10-40, 100% Bn) 19:1, 4:1 и 1:1. После этого растворитель удаляли при использовании шейкерного концентратора для получения пленки. Затем в соответствии с обычным способом получали пустые мицеллы. После этого в соответствии с обычным способом в пустых мицеллах инкапсулировали G-CSF до достижения концентрации 5% масс./масс. в расчете на массу полимеров.

Данные растворы полимерных мицелл, каждые из которых инкапсулируют G-CSF, вводили мужским особям крыс Wistar (возрастом 6 недель) через хвостовую вену в условиях легкой эфирной анестезии. Дозировка составляла 100 мкг/кг массы тела, а количество животных для образца составляло три на каждый раствор. Кровь собирали при использовании обработанного гепарином шприца по истечении 24 часов после введения и добавляли EDTA-2Na до получения конечной концентрации 1 мг/мл. В данном состоянии измеряли количество нейтрофилов при использовании многоцелевого автоматического гематологического анализатора для ветеринарного использования (pocH-100iV Diff, изготовленного SYSMEX CORPORATION). Исходя из получающихся в результате измеренных значений, в соответствии со следующим далее уравнением рассчитывали коэффициенты высвобождения лекарственного средства (%) для мицеллы, относящейся к типу Bn, и мицелл, относящихся к различным смешанным типам. Таблица 2 демонстрирует рассчитанные коэффициенты высвобождения лекарственного средства из полимерных мицелл. Как можно себе представить, более значительный коэффициент должен обозначать более интенсивное действие по активному высвобождению лекарственного средства из полимерной мицеллы в сопоставлении с тем, что имеет место для мицеллы, относящейся к типу С8.

Коэффициент высвобождения лекарственного средства (%)=100×(А-В)/(А-С)

А: количество нейтрофилов у животных, которым вводили мицеллы, относящиеся к типу С8

В: количество нейтрофилов у животных, которым вводили каждые из мицелл, относящихся к различным смешанным типам

С: количество нейтрофилов у животных, не подвернутых обработке.

Таблица 2
	Коэффициент высвобождения лекарственного средства
Мицелла, относящаяся к типу Bn	30%
Мицелла, относящаяся к смешанному типу, (С8:Bn=1:1)	20%
Мицелла, относящаяся к смешанному типу, (С8:Bn=4:1)	15%
Мицелла, относящаяся к смешанному типу, (С8:Bn=19:1)	19%

Как это описывалось выше, скорость высвобождения лекарственного средства можно контролировать в результате использования мицеллы, относящейся к смешанному типу, также и в случае выбора в качестве блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, полимера, относящегося к бензильному типу.

Пример 3

(1) Мицелла, относящаяся к типу С8

Полимерную мицеллу, инкапсулирующую G-CSF, получали тем же образом, что и в примере испытания в случае мицеллы, относящейся к типу С8, из примера 2.

(2) Мицелла, относящаяся к типу Chol

Полимерную мицеллу, инкапсулирующую G-CSF, получали тем же образом, что и в примере испытания в случае материала PEG-pGlu (10-40, 30% Chol), за исключением использования в качестве блок-сополимера материала PEG-pGlu (10-40, 25% Chol).

(3) Мицелла, относящаяся к смешанному типу

G-CSF инкапсулировали в пустой мицелле тем же образом, что и в примере 2, за исключением того, что вместо материала PEG-pGlu (10-40, 100% Bn) использовали материал PEG-pGlu (10-40, 25% Chol); в качестве растворителя для растворения материала PEG-pGlu (10-40, 90% С8) использовали дихлорметан; и материалы PEG-pGlu (10-40, 90% С8) и PEG-pGlu (10-40, 25% Chol) перемешивали друг с другом при массовых соотношениях 19:1 и 4:1.

Количество нейтрофилов измеряли тем же образом, что и в примере 2, за исключением равенства количества животных для образца шести. Исходя из получающихся в результате измеренных значений тем же образом, что и в примере 2, рассчитывали коэффициенты высвобождения лекарственного средства (%) для мицеллы, относящейся к типу Chol, и мицелл, относящихся к различным смешанным типам. Таблица 3 демонстрирует рассчитанные коэффициенты высвобождения лекарственного средства для полимерных мицелл.

Таблица 3
	Коэффициент высвобождения лекарственного средства
Мицелла, относящаяся к типу Chol	55%
Мицелла, относящаяся к смешанному типу, (С8:Chol=4:1)	51%
Мицелла, относящаяся к смешанному типу, (С8:Chol=19:1)	26%

Как это описывалось выше, скорость высвобождения лекарственного средства можно контролировать при использовании мицеллы, относящейся к смешанному типу, также и в случае выбора в качестве блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, полимера, относящегося к холестериновому типу.

Пример 4

Испытание на внутривенное введение крысам полимерной мицеллы, инкапсулирующей G-CSF

(1) Мицелла, относящаяся к типу С8

Полимерную мицеллу, инкапсулирующую G-CSF, получали тем же образом, что и в примере испытания в случае мицеллы, относящейся к типу С8, из примера 2.

(2) Мицелла, относящаяся к типу Chol

Полимерную мицеллу, инкапсулирующую G-CSF, получали тем же образом, что и в примере испытания в случае мицеллы, относящейся к типу Chol, из примера 3.

(3) Смешанная полимерная мицелла

Полимерные мицеллы, каждую из которых инкапсулируют G-CSF, получали в результате перемешивания материалов PEG-pGlu (10-40, 90% С8) и PEG-pGlu (10-40, 25% Chol) при массовых соотношениях 19:1, 4:1 и 1:1 тем же образом, что и в примере испытания в случае смешанной полимерной мицеллы из примера 3.

Растворы полученных выше полимерных мицелл, каждую из которых инкапсулируют G-CSF, вводили мужским особям крыс Wistar через хвостовую вену. Дозировка составляла 100 мкг/кг массы тела, а количество животных для образца составляло три на каждый раствор. Кровь собирали при использовании обработанного гепарином шприца из яремной вены в условиях эфирной анестезии по истечении 5 минут, 1 часа, 6 часов, 1 дня, 2 дней и 3 дней после введения и концентрацию G-CSF в плазме измеряли при использовании комплекта G-CSF-ELISA (изготовленного RayBiotech, Inc.).

Фиг.4 иллюстрирует результаты для примера 4. Как можно видеть на фиг.4, также в данном примере можно контролировать время удерживания лекарственного средства в плазме, другими словами, скорость высвобождения лекарственного средства можно контролировать при использовании мицеллы, относящейся к смешанному типу. Необходимо отметить то, что также в данном примере наблюдаемые значения для концентрации G-CSF в плазме были значительно меньшими в сопоставлении с их теоретическими значениями у любых мицелл, относящихся к смешанным типам.

1. Композиция полимерной мицеллы, пригодная для инкапсулирования и подходящего высвобождения лекарственных средств, содержащая блок-сополимеры, каждый из которых имеет гидрофобный сегмент полимерной цепи и гидрофильный сегмент полимерной цепи, при этом множество блок-сополимеров компонуются радиально в состоянии, в котором гидрофобный сегмент полимерной цепи направлен внутрь, а гидрофильный сегмент полимерной цепи направлен наружу,
где
композиция полимерной мицеллы в качестве блок-сополимеров содержит блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, и блок-сополимер, обладающий сродством к липопротеину за исключением ЛПВП;
блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи, образованный из полиаминокислоты, включающей повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты, при этом гидрофобное производное аминокислоты включает производное, полученное в результате введения в боковую цепь аминокислоты стерольного остатка;
блок-сополимер, обладающий сродством к липопротеину за исключением ЛПВП, содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи, образованный из полиаминокислоты, включающей повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты, при этом гидрофобное производное аминокислоты включает производное, полученное в результате введения в боковую цепь аминокислоты гидрофобной группы, обладающей линейной или разветвленной структурой; и
отделение блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, индуцируется адгезией ЛПВП, связанной со сродством, и зазор, полученный в результате отделения, вызывает промотирование высвобождения, в качестве инкапсулируемого лекарственного средства, одного средства, выбираемого из группы, состоящей из растворимых в воде физиологически активных полипептидов и белков, каждый из которых имеет молекулярную массу, равную 1500 или более, и блок-сополимер, обладающий сродством к липопротеину за исключением ЛПВП, делает зазор меньше, подавляя промотирование высвобождения инкапсулируемого лекарственного средства, что делает возможным контроль скорости высвобождения лекарственного средства.

2. Композиция полимерной мицеллы по п. 1, где гидрофобное производное аминокислоты включает производное кислой аминокислоты, выбираемой из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

3. Композиция полимерной мицеллы по п. 1 или 2, где уровень содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, во фракции ЛПВП является большим, чем уровень его содержания в другой фракции липопротеина за исключением фракции хиломикрона, при этом уровень содержания определяют после инкапсулирования лизоцима и инкубирования в плазме при 37°C в течение 24 часов.

4. Композиция полимерной мицеллы по п. 1 или 2, где гидрофобная группа, обладающая линейной или разветвленной структурой, включает C₄-C₁₈ незамещенную или замещенную линейную или разветвленную алкильную группу, C₄-C₁₈ незамещенную или замещенную линейную или разветвленную алкенильную группу и С₄-С₁₈ незамещенную или замещенную линейную или разветвленную алкинильную группу.

5. Композиция полимерной мицеллы по п. 3, где гидрофобная группа, обладающая линейной или разветвленной структурой, включает C₄-C₁₈ незамещенную или замещенную линейную или разветвленную алкильную группу, С₄-С₁₈ незамещенную или замещенную линейную или разветвленную алкенильную группу и С₄-С₁₈ незамещенную или замещенную линейную или разветвленную алкинильную группу.

6. Композиция полимерной мицеллы по любому из пп. 1, 2 или 5, где гидрофобное производное аминокислоты в блок-сополимере, обладающем сродством к липопротеину, исключающему ЛПВП, включает производное кислой аминокислоты, выбираемой из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

7. Композиция полимерной мицеллы по п. 3, где гидрофобное производное аминокислоты в блок-сополимере, обладающем сродством к липопротеину, исключающему ЛПВП, включает производное кислой аминокислоты, выбираемой из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

8. Композиция полимерной мицеллы по п. 4, где гидрофобное производное аминокислоты в блок-сополимере, обладающем сродством к липопротеину, исключающему ЛПВП, включает производное кислой аминокислоты, выбираемой из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

9. Композиция полимерной мицеллы, пригодная для инкапсулирования и подходящего высвобождения лекарственных средств, содержащая блок-сополимеры, каждый из которых имеет гидрофобный сегмент полимерной цепи и гидрофильный сегмент полимерной цепи, при этом множество блок-сополимеров компонуются радиально в состоянии, в котором гидрофобный сегмент полимерной цепи направлен внутрь, а гидрофильный сегмент полимерной цепи направлен наружу,
где
композиция полимерной мицеллы в качестве блок-сополимеров содержит блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП;
блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, содержит гидрофобный сегмент полимерной цепи, образованный из полиаминокислоты, включающей повторяющиеся звенья, произведенные из гидрофобного производного аминокислоты, при этом гидрофобное производное аминокислоты включает производное, полученное в результате введения в боковую цепь аминокислоты стерольного остатка;
блок-сополимер, обладающий сродством к ЛПВП, содержит гидрофильный сегмент полимерной цепи, образованный поли(этиленгликолем); и
отделение блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, индуцируется адгезией ЛПВП, связанной со сродством, и зазор, полученный в результате отделения, вызывает промотирование высвобождения, в качестве инкапсулируемого лекарственного средства, одного средства, выбираемого из группы, состоящей из растворимых в воде физиологически активных полипептидов и белков, каждый из которых имеет молекулярную массу, равную 1500 или более.

10. Композиция полимерной мицеллы по п. 9, где гидрофобное производное аминокислоты включает производное кислой аминокислоты, выбираемой из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

11. Композиция полимерной мицеллы по п. 9 или 10, где уровень содержания блок-сополимера, обладающего сродством к ЛПВП, во фракции ЛПВП является большим, чем уровень его содержания в другой фракции липопротеина за исключением фракции хиломикрона, при этом уровень содержания определяют после инкапсулирования лизоцима и инкубирования в плазме при 37°C в течение 24 часов.

12. Фармацевтическая композиция, содержащая
композицию полимерной мицеллы по любому одному из пп. 1-11; и
лекарственное средство, инкапсулированное в композиции полимерной мицеллы, при этом лекарственное средство представляет собой один тип, выбираемый из группы, состоящей из растворимых в воде физиологически активных полипептидов и белков, каждый из которых имеет молекулярную массу, равную 1500 и более.