Противомикробное средство
Владельцы патента RU 2556509:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" (RU)
Никитина Лилия Евгеньевна (RU)
Изобретение относится к области медицины и предназначено для лечения инфекционных процессов, вызванных чувствительными микроорганизмами. Соединение 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат, имеющее структурную формулу I:
применяют в качестве противомикробного средства. Использование соединения формулы I, обладающего противомикробным действием, обеспечивает лечение инфекционных процессов, вызванных чувствительными микроорганизмами. 5 табл.
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в медицинской практике в качестве средства, обладающего противомикробным действием для лечения инфекционных процессов, вызванных чувствительными микроорганизмами. Сущность изобретения - применение терпенсульфида формулы (I) 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноата, обладающего противо-микробной активностью.
Современный фармацевтический рынок предлагает широкий спектр противомикробных, антисептических, дезинфицирующих средств и препаратов как синтетического, так и природного происхождения.
Препараты растительного происхождения, как правило, представляют собой комбинацию биологически активных соединений и могут оказывать комплексное многонаправленное действие.
К настоящему времени накоплен значительный объем сведений о лечебных свойствах природных терпеноидов, синтезируемых различными растениями (Павлов И.Н. Снижение устойчивости хвойных лесов Сибири к корневым патогенам в результате современного увеличения температуры приземного слоя воздуха и почвы / И.Н. Павлов. О.А. Барабанова, С.С. Кулаков, В.В. Еремин и соавт. // Хвойные бореальной зоны. - 2011. - Т. 28. - Вып. 1-2. - С. 47-54). По числу отдельных представителей с установленной химической структурой терпеноиды превосходят все другие классы природных соединений. У этого класса природных веществ выявлен широкий спектр биологической активности (Старцева В.А. Синтез и биологическая активность монотерпеноидов ментанового ряда / В.А. Старцева, Л.Е. Никитина, Е.В. Сиразиева и соавт. // Химия в интересах устойчивого развития. - 2009. - Том 17. - Вып. 5. - С. 539-545; Хасанов В.В. Изучение состава и антиокислительной активности продуктов водно-паровой дистилляции пихты сибирской / В.В. Хасанов, Г.Л. Рыжова, Т.Т. Куряева, К.А. Дычко // Химия растительного сырья. - 2009. - №4. - С.83-88; Мозуль В.И. Исследование эфирного масла MyrtuscommunisL. / В.И. Мозуль, В.С. Доля, Л.И. Слобожан // Актуальные вопросы фармацевтической и медицинской науки на практике. - 2011. - Вып. XXIV. - №2. - С.30-32; Степаненко И.С. Изучение антимикробной активности некоторых природных терпеноидов / И.С. Степаненко, С.В. Сяткин, И.В. Акулина, В.Н. Каргаев, Л.Е. Никитина // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медико-биологических дисциплин». - Саранск, 2012. - С.147-150; Акулина И.В. Фармакологические свойства терпенсульфида ментанового ряда / И.В. Акулина, Р.С. Гараев, Л.Е. Никитина, Н.П. Артемова, И.С. Степаненко // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2012. - №2. - С.83). Эфирные масла и живица хвойных растений, благодаря высокому содержанию монотерпеноидов, являются важным источником получения биологически активных веществ (Хасанов В.В. Изучение состава и антиокислительной активности продуктов водно-паровой дистилляции пихты сибирской / В.В. Хасанов, Г.Л. Рыжова, Т.Т. Куряева, К.А. Дычко // Химия растительного сырья. - 2009. - №4. - С.83-88; Павлов И.Н. Снижение устойчивости хвойных лесов Сибири к корневым патогенам в результате современного увеличения температуры приземного слоя воздуха и почвы / И.Н. Павлов, О.А. Барабанова, С.С. Кулаков, В.В. Еремин и соавт. // Хвойные бореальной зоны. - 2011. - Т. 28. - Вып. 1-2. - С. 47-54; Мозуль В.И. Исследование эфирного масла MyrtuscommunisL. / В.И. Мозуль, В.С. Доля, Л.И. Слобожан // Актуальные вопросы фармацевтической и медицинской науки на практике. - 2011. - Вып. XXIV. - №2. - С.30-32).
В последние два десятилетия в результате повышенного внимания к природным терпеноидам список лекарственных веществ пополнился за счет появления лекарственных средств на их основе (пат. 2197994 РФ, МПК7 A61L 2/16. Дезинфекционное средство «Лесептик» / Слинина К.Н. [и др.]; заявитель и патентообладатель Науч.-исслед. вет. ин-т Нечерноземной зоны РФ, ООО Науч.-произв. фирма «Левес-НН», ГУП Центр. Науч.-исслед. и проектный ин-т лес-хим. пром. - №2000113057/13; заявл. 25.05.2000; опубл. 10.02.2003; пат. 2054945 РФ, МПК6 A61K 35/78. Средство «Абисил-1», обладающее противовоспалительной, антибактериальной и ранозаживляющей активностью / Пинигина Н.М. [и др.]; заявитель и патентообладатель Пинигина Н. М. - №95109894/14; заявл. 28.06.1995; опубл. 27.02.1996; Pharmacological activity of the essential oil of Bupleurum gibraltaricum: Anti-inflammatory activity and effects on isolated rat uteri / M.A. Ocete [et al.] // J. of Ethnopharmacology. - 1989. - Vol. 25, Iss. 3. - P. 305-313; Бальзамическое средство для местного применения, обладающее антимикробным, противовоспалительным и болеутоляющим действием / Гармашова А.П. [и др.]; заявитель и патентообладатель ТОО НПФ "Левес-А", Ин-т гигиены труда и профзаболеваний ВСНЦ СО РАМН. - №94025798/14; заявл. 12.07.1994; опубл. 27.08.1997; пат. 2054945 РФ, МПК6 A61K 35/78. Средство «Абисил-1», обладающее противовоспалительной, антибактериальной и ранозаживляющей активностью / Пинигина Н.М. [и др.]; заявитель и патентообладатель Пинигина Н.М. - №95109894/14; заявл. 28.06.1995; опубл. 27.02.1996).
Известно, что терпенсульфид - 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат - обладает фунгицидным и противовоспалительным действием (пат. 2431479 РФ, МПК С07С 321/24, С07С 319/08, A61L 2/16, А61К 35/78. 2-(1′-Гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат, обладающий фунгицидным и противовоспалительным действием / Никитина Л.Е. и др.; заявитель и патентообладатель Казанский государственный медицинский университет - №2010130104/15, заявл. 19.07.2010, опубл. 20.10.11).
Противомикробные свойства заявляемого соединения 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноата в литературе не описаны.
Цель изобретения - эффективное соединение, обладающее противомикробной активностью.
Поставленная цель достигается предлагаемым изобретением, а именно, 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноатом (формулы I).
Исследование противомикробной активности 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноата
Исследование терпенсульфида (I) 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноата, исходного (+)-1,2-оксида лимонена, а также его структурного аналога (+)-лимонена проведено в отношении 14 музейных тест-штаммов микроорганизмов и 610 опытных штаммов микроорганизмов, изолированных из материала, взятого от больных с неспецифическими и специфическими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящих путей, желудочно-кишечного тракта.
Характеристика исследуемых микроорганизмов. В качестве тест-микроорганизмов использовали музейные штаммы: Salmonella enteritidis 5765 АТСС, Shigella sonnei S-форма 20, Pseudomonas aeruginosa 27853 ATCC, Pseudomonas aeruginosa 453, Escherichia coli M17 штамм, Escherichia coli 25922 ATCC, Staphylococcus aureus 29213 ATCC, Staphylococcus aureus 906, Enterococcus faecalis 2919 ATCC, Citrobacter freundii 101/57, Proteus vulgaris 222, Klebsiella pneumoniae 9172, Bacillus cereus 96, Streptococcus pyogenes 1238 ATCC. Музейные штаммы, используемые в работе, получены из коллекции музея живых культур ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Staphylococcus aureus 29213 ATCC, Staphylococcus aureus 906 при росте на плотной питательной среде: условия для выращивания - среды №1, 2; t=36±1°C, 18-20 часов. Колонии гладкие, с ровными краями, с равномерно золотистой пигментацией. При росте на жидкой питательной среде: условия для выращивания - среда №3, pH 7,2-7,4, 18-20 часов. Возникает равномерное помутнение бульона без пленки и слизистого осадка на дне. При микроскопии: однородные по величине расположенные в виде гроздьев кокки с хорошо выраженной грамположительной окраской.
Escherichia coli АТСС25922, Escherichia coli M17 штамм при росте на плотной питательной среде: условия для выращивания - среды №1, 2; t=36±1°C, 18-20 часов. Колонии плосковыпуклые опалово-мутные 0,3-0,5 см в диаметре с ровными или слегка волнистыми краями, могут быть слизистые колонии. При росте на лактозосодержащих дифференциальных питательных средах - среды №4, 5; t=36±1°C, 18-20 часов - колонии с зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец). При росте на жидкой питательной среде: условия для выращивания - среда №3, pH 7,2-7,4, 18-20 часов. Возникает диффузное помутнение и образование осадка либо пленки. При микроскопии: грамотрицательная мелкая палочка со слегка закругленными концами и перитрихиально расположенными жгутиками.
Bacillus cereus 96 при росте на плотной питательной среде: условия для выращивания - среды №1, 2; t=36±1°C, 18-20 часов. Колонии с шероховатым краем, сформированным из переплетающихся волокон. При росте на жидкой питательной среде: условия для выращивания - среда №3, pH 7,8-8,0, 18-20 часов. Рост в виде морщинистой пленки, вся среда прозрачная без осадка. При микроскопии: тонкие с закругленными концами палочки, располагающиеся отдельно или короткими цепочками, с хорошо выраженной грамположительной окраской.
Pseudomonas aeruginosa 27853 ATCC, Pseudomonas aeruginosa 453, при росте на плотной питательной среде: условия для выращивания - среды №1, 2; pH 7,2-7,-4, t=36±1°C, 18-20 часов. Колонии широкие, расплывчатые, прозрачные, с неровным краем. При росте на жидкой питательной среде: условия для выращивания - среда №3, pH 7,2-7,4, 18-20 часов. Рост в виде равномерного помутнения, толстой пленки; среда может приобретать желтовато-зеленую окраску. При микроскопии: одиночные палочки либо короткие цепочки с хорошо выраженной грамотрицательной окраской.
Streptococcus pyogenes 1238 АТСС, кокки неправильной округлой формы, располагающиеся в виде цепочек или попарно, размеры 0,5-2,0 мкм. По биохимическим свойствам разделяются S. bovis, S. agalactia, S. mutans и др. При росте на плотной питательной среде: условия для выращивания среды 6, 7; №, t=36±1°C, 18-20 часов. Колонии мелкие блестящие.
Klebsiella pneumoniae 9172, условно-патогенные бактерии, прямые грамотрицательные палочки (0,3-1,0 и 0,6-6 мкм), располагающиеся одиночно, парами или короткими цепочками. При росте на питательных средах: условия роста для выращивания среды №1, 2; t=36±1°C, 18-20 часов. Колонии крупные, выпуклые, влажные, слизистые, нередко сливающиеся друг с другом.
Proteus vulgaris 222, условно-патогенные бактерии, прямые грамотрицательные палочки с закругленными концами (0,4-0,8 и 1,0-3,0 мкм). Условия роста для выращивания - среды №1, 2 и др.; t=36±1°C, 18-20 часов. Образует ползучие колонии с отростками. При росте на лактозосодержащих дифференциальных питательных средах №4, 5; t=36±1°C, 18-20 часов - прозрачные, слегка розоватые колонии, проявляют способность к роению и дают сливной рост.
В качестве опытных исследовались штаммы микроорганизмов (№610), изолированных из материала, взятого от больных Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Республики Мордовия «Республиканская инфекционная клинической больница» г. Саранска с заболеваниями органов дыхания, мочевыводящих путей и желудочно-кишечного тракта. Источником выделения патогенов служила моча, мокрота, слизь из зева, носа и носоглотки, фекалии, секционный материал.
| Таблица 1 | |||
| Характеристика исследуемых клинических штаммов микроорганизмов | |||
| № п/п | Штамм микроорганизма | Количество изученных штаммов | Изолированы из материала исследования |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 1 | Staphylococcus aureus | 92 | Слизь из зева, носа, носоглотки, моча, фекалии, секционный материал |
| 2 | Staphylococcus epidermidis | 36 | Слизь из зева, носа, носоглотки, моча, фекалии, секционный материал |
| 3 | Streptococcus pyogenes | 20 | Слизь из зева, носа, носоглотки, секционный материал |
| 4 | Streptococcus pneumoniae | 18 | Слизь из зева, носа, носоглотки, секционный материал |
| 5 | Streptococcus salivarius | 20 | Слизь из зева, носа, носоглотки, секционный материал |
| 6 | Streptococcus uberis | 21 | Слизь из зева, носа, носоглотки, секционный материал |
| 7 | Streptococcus mitis | 20 | Слизь из зева, носа, носоглотки, секционный материал |
| 8 | Streptococcus agalactia | 23 | Слизь из зева, носа, носоглотки, секционный материал |
| 9 | Streptococcus sanguinis | 24 | Слизь из зева, носа, носоглотки, секционный материал |
| 10 | Streptococcus mutans | 23 | Слизь из зева, носа, носоглотки, секционный материал |
| 11 | Escherichia coli | 64 | Слизь из зева, носа, носоглотки, моча, фекалии, секционный материал |
| 12 | Klebsiella pneumoniae | 32 | Слизь из зева, носа, носоглотки, моча, фекалии, секционный материал |
| 13 | Klebsiella oxytoca | 19 | Слизь из зева, носа, носоглотки, моча, фекалии, секционный материал |
| 14 | Enterococcus faecalis | 18 | Моча, фекалии, секционный материал |
| 15 | Enterococcus faecium | 18 | Моча, фекалии, секционный материал |
| 16 | Salmonella enteritidis | 24 | Фекалии |
| 17 | Shigella sonnei | 12 | Фекалии |
| 18 | Enterobacter cloaceae | 19 | Фекалии, секционный материал |
| 19 | Enterobacter aerogenes | 18 | Фекалии, секционный материал |
| 20 | Proteusvulgaris | 24 | Моча, фекалии, секционный материал |
| 21 | Proteus mirabilis | 18 | Моча, фекалии, секционный материал |
| 22 | Citrobacter freundii | 18 | Моча, фекалии, секционный материал |
| 23 | Pseudomonas aeruginosa | 49 | Слизь из зева, носа, носоглотки, моча, фекалии, секционный материал |
Характеристика питательных сред. Питательные среды для культивирования и определения противомикробной активности исследуемых соединений должны отвечать следующим требованиям:
- содержать в оптимальных концентрациях все элементы, необходимые микробной клетке для обеспечения процессов жизнедеятельности и размножения: макро- и микроэлементы, органические источники углерода, азота, неорганические соли, витамины и другие ростовые факторы;
- обладать определенной влажностью (не менее 20%), так как вода необходима для осуществления всех метаболических процессов, помимо этого, она служит источником водорода и кислорода для микробной клетки;
- должна быть изотоничной, то есть концентрация солей в среде должна соответствовать таковой в микробной клетке (для большинства микроорганизмов - 0,5%, для галофильных - 3%);
- концентрация ионов водорода (pH) в среде должна быть оптимальной и соответствовать данному виду микроба (в диапазоне 4,5-8,5);
- окислительно-востановительный потенциал среды (Eh) должен соответствовать потребностям микроорганизма (для анаэробов - 0,120-0,060 В, для аэробов - более 0,080 В);
- питательная среда должна быть стерильной.
Среда №1. Мясо-пептонный агар (МПА) ЗАО «НИЦФ»
| Состав | г/л |
| Пептон | 10,0 |
| Натрия хлорид | 5,0 |
| Вода мясная | 1000,0 мл |
| Агар-агар | 2,0-20,0 |
Конечное значение pH (при 25°C) 7,3±0,2
Используется для выращивания неприхотливых микроорганизмов, для приготовления специальных сред.
Среда №2. Питательный агар (М001) HiMedia Laboratories Pvt. Limited
| Состав | г/л |
| Пептон | 5,0 |
| Натрия хлорид | 5,0 |
| Экстракт говяжий | 1,5 |
| Экстракт дрожжевой | 1,5 |
| Агар-агар | 15,0 |
| Дистиллированная вода | 1000,0 мл |
Конечное значение pH (при 25°C) 7,4±0,2
Используется для выращивания неприхотливых микроорганизмов.
Среда №3. Мясо-пептонный бульон (МПБ) ЗАО «НИЦФ»
| Состав | г/л |
| Пептон | 10,0 |
| Натрия хлорид | 5,0 |
| Вода мясная | 1000,0 мл |
Конечное значение pH (при 25°C) 7,3±0,2
Используется для выращивания неприхотливых микроорганизмов, для приготовления специальных сред.
Среда №4. Среда Эндо (коммерческая) ФС 42-350498 ЗАО «НИЦФ»
| Состав | г/л |
| Панкреатический гидролизат кильки | 11,5 |
| Экстракт кормовых дрожжей | 0,86 |
| Лактоза | 12,9 |
| Фуксин основной | 0,22 |
| Сульфат натрия двузамещенный | 0,48 |
| Сульфит натрия | 0,83 |
| Хлорид натрия | 3,6 |
| Карбонат натрия | 0,01 |
| Агар-агар | 9,6 |
| Дистиллированная вода | 1000,0 мл |
Конечное значение pH (при 25°C) 7,3±0,2
Микроорганизмы, способные расщеплять лактозу (лактозопозитивные) образуют колонии ярко-розового или красно-малинового цвета, нередко с металлическим блеском. Лактозонегативные микробы дают рост в виде бесцветных или слабо розовых колоний.
Среда №5. Среда Эндо (M029R) Hi Media Laboratories Pvt. Limited
| Состав | г/л |
| Пептический перевар животной ткани | 10,0 |
| Лактоза | 10,0 |
| Калия гидрофосфат | 3,5 |
| Натрия сульфит | 2,5 |
| Фуксин основной | 0,5 |
| Агар-агар | 0,5 |
| Дистиллированная вода | 1000,0 мл |
Конечное значение pH (при 25°C) 7,5±0,2
Сульфит натрия и основной фуксин обладают подавляющим эффектом на грамположительные микроорганизмы. Лактоза разлагается микроорганизмами до альдегида и кислоты. Альдегид в свою очередь освобождает фуксин из фуксин-сульфитного комплекса, усиливая красное окрашивание колоний. У кишечных палочек эта реакция очень выражена и сопровождается кристаллизацией фуксина, что проявляется зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец) колоний.
Среда №6. Основа колумбийского кровяного агара (M144) Hi Media Laboratories Pvt. Limited
| Состав | г/л |
| Пептон (специальный) | 23,0 |
| Крахмал кукурузный | 1,0 |
| Натрия хлорид | 5,0 |
| Агар-агар | 10,0 |
| Дистиллированная вода | 1000,0 мл |
Конечное значение pH (при 25°) 7,3±0,2
Для приготовления кровяного агара асептично вносят стерильную дефибринированую кровь барана (до 5% об.). Тщательно перемешать.
Присутствие специального пептона обеспечивает быстрый и обильный рост прихотливых микроорганизмов. Кукурузный крахмал служит источником энергии и одновременно нейтрализует токсические метаболиты. Баранья кровь позволяет оценить способность микробов к гемолизу и обеспечивает их гемином (Х-фактором), который необходим для роста многих бактерий.
Среда №7. Сывороточный агар
В качестве основы используют 1,2-1,5% агар (pH 7,4), приготовленный на бульоне из рыбного гидролизата, бульоне из перевара Хоттингера (аминный азот в бульоне 150-180 мг/мл) или на сухом питательном агаре специального назначения. К 80 мл расплавленного и остуженного до температуры 50°C агара добавляют 20 мл инактивированной при температуре 56°C в течение 30 минут сыворотки.
Среда №8. Агар Мюллера-Хинтона (МХА) (М173) Hi Media Laboratories Pvt. Limited
| Состав | г/л |
| Вытяжка говядины | 300,0 |
| Кислотный гидролизат казеина | 17,0 |
| Крахмал | 1,5 |
| Агар-агар | 17,0 |
| Дистиллированная вода | 1000,0 мл |
Конечное значение pH (при 25°) 7,3±0,2
Для приготовления кровяного агара асептично вносят стерильную дефибринированую кровь барана (до 5% об.). Тщательно перемешать.
Поддерживает рост многих микроорганизмов. Крахмал служит «защитным коллоидом» против токсичных веществ, вырабатываемых в процессе роста.
Среда №9. Бульон Мюллера-Хинтона (МХБ) (М391) Hi Media Laboratories Pvt. Limited
| Состав | г/л |
| Вытяжка говядины | 300,0 |
| Кислотный гидролизат казеина | 17,0 |
| Крахмал | 1,5 |
| Дистиллированная вода | 1000,0 мл |
Конечное значение pH (при 25°) 7,4±0,2
Для приготовления кровяного бульона асептично вносят стерильную дефибринированую кровь барана (до 5% об.). Тщательно перемешать.
Поддерживает рост многих микроорганизмов. Крахмал служит «защитным коллоидом» против токсичных веществ, вырабатываемых в процессе роста.
Характеристика методов исследования. В ходе исследования чувствительности микроорганизмов к лимонену, 1,2-оксиду лимонена и терпенсульфиду (I), независимо от конкретного метода, проводилось последовательное выполнение нескольких этапов (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04) // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2004. - Том 6. - №4. - С.306-359):
- приготовление питательных сред;
- приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма);
- инокуляция;
- инкубация;
- учет и интерпретация результатов.
Диско-диффузионный метод включал также этап наложения дисков на плотную питательную среду.
Для оценки чувствительности использовали специально предназначенные для этой цели среды (среды №8, 9), разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке и по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям. Внутрилабораторный контроль качества среды проводили при использовании всех сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.
Вид питательной среды для оценки чувствительности определяли выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тестируемого микроорганизма.
Выбранную питательную среду для определения чувствительности готовили из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливали в стерильные пробирки или в чашки Петри. Агар разливали по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм - 20 мл). Чашки оставляли при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри использовали немедленно.
Концентрация суспензии исследуемого микроорганизма составляла 1,5×108 КОЕ/мл. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1,5×108 КОЕ/мл при визуальном контроле соответствовала стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду. Контроль оптической плотности суспензии осуществляли денситометрически. В работе использовали коммерческий стандарт мутности. Бактериальную суспензию готовили из агаровых культур.
Для приготовления инокулюма использовали чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирали несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносили незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту Мак-Фарланда. Инокулюм использовали в течение 15 мин после приготовления.
Метод серийных разведений в бульоне - макрометод (пробирочный)
Тестирование проводили в объеме 1 мл каждого разведения исследуемого соединения с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма примерно 5×105 КОЕ/мл.
МХБ для определения чувствительности разливали по 0,5 мл в каждую пробирку. Количество пробирок составило девять штук плюс одна для постановки «отрицательного» контроля, т.е. десять.
Рабочий раствор исследуемого соединения готовили из основного раствора с использованием жидкой питательной среды - МХБ. Затем рабочий раствор в количестве 0,5 мл при помощи микропипетки со стерильным наконечником вносили в первую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона. Тщательно перемешивали и новым стерильным наконечником переносили 0,5 мл раствора исследуемого соединения в бульоне во вторую пробирку, содержавшую первоначально 0,5 мл бульона. Эту процедуру повторяли, пока не был приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0,5 мл бульона удаляли.
Таким образом, получали ряд пробирок с растворами исследуемого соединения, концентрации которых отличались в соседних пробирках в 2 раза.
Для инокуляции использовали стандартную микробную взвесь, эквивалентную 0,5 по стандарту Мак-Фарланда, разведенную в 100 раз на МХБ, после чего концентрация микроорганизма в ней составляла примерно 106 КОЕ/мл. По 0,5 мл инокулюма вносили в каждую пробирку, содержащую по 0,5 мл соответствующего разведения исследуемого соединения, и в одну пробирку с 0,5 мл МХБ без антибиотика («отрицательный» контроль). Конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке составила примерно 5×105 КОЕ/мл. Инокулюм вносили в пробирки с разведениями исследуемого соединения не позднее 15-30 мин с момента приготовления.
Пробирки закрывали стерильными ватно-марлевыми пробками и все, кроме пробирки «отрицательный» контроль, инкубировали в обычной атмосфере при температуре 37°C в течение 16-20 или 20-24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма). Пробирку «отрицательный» контроль помещали в холодильник при 4°C, где хранили до учета результатов.
Для определения наличия роста микроорганизма пробирки с посевами просматривали в проходящем свете. Рост культуры в присутствии исследуемого соединения сравнивали с референтной пробиркой («отрицательный» контроль), содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) определяли по наименьшей концентрации исследуемого соединения, которая подавляет видимый рост микроорганизма. Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли путем высева из пробирок на плотные питательные среды с последующей инкубацией посевов в обычной атмосфере при температуре 37°C в течение 16-20 или 20-24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма).
Для удобства в анализе полученных данных оценка активности исследуемых соединений определялась в крестах по следующей схеме (Першин Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии / Г.Н. Першин // М.: Медицина, 1971. - 541 с.): «+++» - обильный рост; «++» - глубинный или поверхностный рост штаммов менее обилен; «+» - рост слабый - неактивный менее 50-30%; «+/-,0» - более 70% задержки или отсутствие роста культуры, соответствие «отрицательному контролю».
Диско-диффузионный метод (ДДМ)
Для определения чувствительности ДДМ использовали МХА (для стрептококков с добавлением бараньей крови), приготовленный в соответствии с инструкцией изготовителя. Толщина слоя агара в чашке составляла 4,0±0,5 мм, что достигалось при внесении в чашку Петри диаметром 90 мм строго 20 мл агара, диаметром 100 мм - 25 мл агара. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливали на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). После заполнения чашки оставляли при комнатной температуре для застывания. Использовали свежеприготовленные чашки, которые перед инокуляцией подсушивали инкубацией при 37°C с приоткрытой крышкой в течение 10-20 мин. Перед инокуляцией контролировали отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.
Для определения чувствительности ДДМ использовали стандартизированные диски НД-ПМП-1 из картона технического фильтровального ГОСТ 6722-75 (ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Л. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека).
Хранение дисков НД-ПМП-1 из картона технического фильтровального осуществляли в герметичной упаковке предприятия-изготовителя в сухом темном месте при температуре 2-8°C в течение всего срока годности набора. Небольшие партии дисков, используемые при повседневной работе, хранили при температуре до 25°C не более 15 дней плотно укупоренными так, чтобы гарантировать невозможность попадания во флакон влаги, кроме того, для дополнительной защиты от влаги во флаконах (картриджах) с дисками содержится специальный влагопоглотитель (силикагель).
Перед использованием флаконы с дисками выдерживали при комнатной температуре 18-25°C в течение 1 ч для предотвращения образования конденсата на внутренней стенке флакона. Вскрытый флакон с дисками хранили при температуре 2-8°C в течение всего срока годности набора, при условии сохранения цвета индикаторного силикагеля от светло-голубого до синего. Непосредственно перед применением диски пропитывали исследуемым соединением. В качестве контроля использовали диски, пропитанные: 1) дистиллированной водой; 2) диоксидином (производство «Биосинтез», раствор для местного применения, эндотрахеального и внутривенного введения, 10 мг/мл), антибактериальный препарат, производное хиноксалина.
Для определения чувствительности ДДМ использовали стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту Мак-Фарланда и содержащий примерно 1,5×108 КОЕ/мл. Инокулюм использовали в течение 15 мин после приготовления. Для инокуляции приготовленных чашек с агаром использовали стерильные ватные тампоны промышленного производства (палочка-тампон (пластик-хлопок) CITOSWAB стерильный в индивидуальной упаковке). Тампон погружали в стандартную суспензию микроорганизма, затем избыток инокулюма удаляли, отжав тампон о стенки пробирки. Инокуляцию проводили штриховыми движениями в трех направлениях, поворачивая чашку Петри на 60°.
Не позднее чем через 15 мин после инокуляции на поверхность питательной среды наносили диски, пропитанные исследуемыми соединениями и дистиллированной водой. Аппликацию дисков проводили с помощью стерильного пинцета. Расстояние от диска до края чашки и между дисками составляло 15-20 мм. Для равномерного контакта с поверхностью агара диски аккуратно прижимали пинцетом.
Непосредственно после аппликации дисков на поверхность питательной среды чашки Петри помещали в термостат кверху дном и инкубировали при температуре 37°C в течение 18-24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма).
После окончания инкубации чашки помещали кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 1 мм с помощью линейки лекало (Hi Antibiotic Zone Scale (PW 2097) (Hi Media Laboratories Pvt. Limited, India)).
Степень активности к исследуемым соединениям определялась в крестах по следующей схеме (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04) // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2004. - Том 6. - №4. - С.306-359): «+++» высокая активность - диаметр зоны задержки роста более 25 мм; «++» активное - диаметр зоны задержки роста 16-25 мм; «+» малоактивное - диаметр зоны задержки роста 10-15 мм; «+/-, 0» - неактивное - диаметр зоны задержки роста менее 10 мм и полное отсутствие.
Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики, достоверность результатов оценивали с помощью метода определения t-критерия Стъюдента. Достоверными считали результаты при Р≤0,05 (Фисенко В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. В.П. Фисенко, Б.В Арзамасцева, Э.А Бабаян и соавт. - Москва: «Ремедиум», 2000. - 398 с.; Ланг Т.А. Как описывать статистику в медицине / Т.А. Ланг, М. Сесик; пер. с англ. под ред. В.П. Леонова. - М.: Практическая медицина, 2011. - 480 с.). В работе использовали персональный компьютер и стандартный пакет прикладных программ Statistica 6.0.
Результаты исследования
Исследование противомикробной активности исследуемых соединений методом серийных разведений в бульоне
Проведено исследование противомикробной активности (+)-лимонена, (+)-1,2-оксида лимонена, терпенсульфида 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноата по отношению к эталонным штаммам Staphylococcus aureus 29213, Escherichia coli 25922, Pseudomonas aeruginosa 27853, Streptococcus pyogenes 1238.
В качестве препарата сравнения использовался противомикробный препарат диоксидин (производное ди-N-оксихиноксалина), широко применяемый в лечебной практике. Этот препарат обладает высокой химиотерапевтической активностью in vitvo на модельных инфекциях, близких по патогенезу к патологическим процессам у человека (гнойные менингиты, пиелонефриты, септикопиемии) и вызванных штаммами анаэробных бактерий, устойчивых (в том числе полирезистентных) к препаратам других классов, включая штаммы синегнойной палочки и метициллинустойчивых стафилококков. Диоксидин характеризуется широким антибактериальным спектром с бактерицидным действием, активен также в отношении грамположительных и грамотрицательных аэробных условно-патогенных бактерий. Показана активность диоксидина в отношении микобактерий туберкулеза (Падейская Е.Н. Антибактериальный препарат диоксидин: особенности биологического действия и значение в терапии различных форм гнойной инфекции / Е.Н. Падейская // Инфекции и антимикробная терапия. - 2011. - Т.3 - №5. - С.105-155).
Результаты противомикробной активности исследуемых веществ приведены в таблице 2.
| Таблица 2 | |||||||||||||
| Определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) исследуемых соединений методом серийных разведений в жидкой питательной среде | |||||||||||||
| Тест-1 культура | Staphylococcus aureus 29213 | Escherichia coli 25922 | Pseudomonas aeruginosa 27853 | Streptococcus pyogenes 1238 | |||||||||
| исследуемое вещество | лимонен | 1,2-оксид лимонена | терпен-сульфид | лимонен | 1,2-оксид лимонена | терпен-сульфид | лимонен | 1,2-оксид лимонена | терпен-сульфид | лимонен | 1,2-оксид лимонена | терпен-сульфид | |
| Концентрация веществ в питательной среде, мг/мл | 32,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 16,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | +/-1 | +/-1 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 8,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | +/-1 | +/- | ++ | ++ | 0 | +/-1 | 0 | 0 | |
| 4,0 | 0 | 0 | 0 | ++ | +/- | +++ | +++ | 0 | ++ | 0 | 0 | ||
| 2,0 | +/-1 | 0 | 0 | ++ | +++ | +/-1 | +++ | +++ | +/-1 | +++ | +/-1 | +/-1 | |
| 1,0 | ++ | +/-1 | +/- | +++ | +++ | ++ | +++ | +++ | ++ | +++ | ++ | ++ | |
| 0,5 | +++ | ++ | +/-1 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | |
| 0,25 | +++ | +++ | ++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | |
| 0,125 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | |
| «Отрицательный» контроль | +/- | +/- | +/- | +/- | |||||||||
| Примечание: -1 титр активности, «+++» - обильный рост; «++» - глубинный или поверхностный рост штаммов менее обилен; рост слабый - неактивный менее 50-30% (+); более 70% задержки или отсутствие роста культуры по сравнению с контролем (+/-, 0). |
Для препарата сравнения диоксидина МПК относительно штаммов Staphylococcus spp. составляет 125,0-1000,0 мкг/мл, Escherichia coli 8,0-250,0 мкг/мл, Pseudomonas spp. 125,0-1000,0 мкг/мл, Streptococcus spp. 64,0-1000,0 мкг/мл (Падейская Е.Н. Антибактериальный препарат диоксидин: особенности биологического действия и значение в терапии различных форм гнойной инфекции / Е.Н. Падейская // Инфекции и антимикробная терапия. - 2011. - Т.3 - №5. - С.105-155).
Из данных таблицы 2 видно, что (+)-лимонен оказывает бактериостатическое действие на S. aureus 29213 при концентрации 2,0 мг/мл, а при концентрации 4,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры. Бактериостатическое действие на E.coli 25922 (+)-лимонена проявляется при концентрации 4,0 мг/мл, а при концентрации 8,0 мг/мл он полностью ингибирует рост культуры. Бактериостатическое действие на P. aeruginosa 27853 исследуемый монотерпен оказывает в концентрации 16,0 мг/мл, а при концентрации 32,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры. (+)-лимонен оказывает бактериостатическое действие на S. pyogenes 1238 в концентрации 8,0 мг/мл, а при концентрации 16,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры.
(+)-1,2-оксид лимонена оказывает бактериостатическое действие на S. aureus 29213 при концентрации 1,0 мг/мл, а при концентрации 2,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры. Бактериостатическое действие на E.coli 25922 (+)-1,2 оксид лимонена проявляет при концентрации 8,0 мг/мл, а при концентрации 16,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры.
Бактериостатическое действие на P. aeruginosa 27853 исследуемое соединение оказывает в концентрации 16,0 мг/мл, а при концентрации 32,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры. (+)-1,2 оксид лимонена оказывает бактериостатическое действие на S. pyogenes 1238 в концентрации 2,0 мг/мл, а при концентрации 4,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры.
Терпенсульфид 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метил-этаноат оказывает бактериостатическое действие на S. aureus 29213 при концентрации 1,0 мг/мл, а при концентрации 2,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры. Бактериостатическое действие на E.coli 25922 терпенсульфида (I) проявляется при концентрации 2,0 мг/мл, а при концентрации 16,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры. Бактериостатическое действие на P. aeruginosa 27853 исследуемое соединение оказывает в концентрации 2,0 мг/мл, а при концентрации 4,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры. 2-(1′-Гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат оказывает бактериостатическое действие на S. pyogenes 1238 в концентрации 2,0 мг/мл, а при концентрации 4,0 мг/мл полностью ингибирует рост культуры.
Во всех пробирках с «отрицательным контролем» отмечалась задержка роста тест-культур. Проведено 5 последовательностей опыта.
Таким образом, МПК для (+)-лимонена составили относительно S. aureus 29213 - 2,0 мг/мл, E.coli 25922 - 4,0 мг/мл, P. aeruginosa 27853 - 16,0 мг/мл, S. pyogenes 1238 - 8,0 мг/мл.
МПК для (+)-1,2-оксида лимонена - S. aureus 29213 - 1,0 мг/мл, E.coli 25922 - 8,0 мг/мл, P. aeruginosa 27853 - 16,0 мг/мл, S. pyogenes 1238 - 2,0 мг/мл.
МПК для терпенсульфида - S. aureus 29213 - 0,5 мг/мл, E.coli 25922 - 2,0 мг/мл, P. aeruginosa 27853 - 2,0 мг/мл, S. pyogenes 1238 - 2,0 мг/мл.
| Таблица 3 | ||||
| Противомикробная активность препарата сравнения диоксидина и исследуемых веществ | ||||
| Исследуемый тест-штамм микроорганизма | диоксидин (мг/мл) | (+)-лимонен (мг/мл) | (+)-1,2 оксид лимонена (мг/мл) | терпенсульфид (I) (мг/мл) |
| Staphylococcus aureus 29213 | 0,125-1,0 | 2,0 | 1,0 | 0,5 |
| Streptococcus pyogenes 1238 | 0,064-1,0 | 8,0 | 2,0 | 2,0 |
| Escherichia coli 25922 | 0,008-0,250 | 4,0 | 8,0 | 2,0 |
| Pseudomonas aeruginosa 27853 | 0,125-1,0 | 16,0 | 16,0 | 2,0 |
Исследуемые соединения обладают антимикробной активностью. Сравнительный анализ результатов показал, что исследуемые соединения различны по противомикробной активности, наибольшую активность относительно тест-штаммов микроорганизмов проявил терпенсульфид 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат. Его МПК в 4 раза ниже, чем у (+)-лимонена, и в 2 раза ниже, чем у (+)-1,2 оксида лимонена, в отношении золотистого стафилококка; в 2 раза ниже, чем у (+)-лимонена, и в 4 раза ниже, чем у (+)-1,2 оксида лимонена, в отношении кишечной палочки; в 8 раз ниже, чем у (+)-лимонена, (+)-1,2 оксида лимонена, по отношению к P. aeruginosa и в 4 раза ниже, чем у (+)-лимонена, по отношению к пиогенному стрептококку.
Исследование противомикробной активности исследуемых соединений диско-диффузионным методом
В ходе исследования музейных штаммов микроорганизмов получены следующие результаты (табл.4). В контрольном эксперименте в 100% случаев наблюдался сплошной рост исследуемых микроорганизмов.
Препарат сравнения диоксидин проявил высокую активность относительно тест-штаммов Citrobacter freundii 101/57, Klebsiella pneumoniae 9172, Proteus vulgaris 222 и Bacillus cereus 96 (P<0,05). Также чувствительны к препарату сравнения оказались Staphylococcus aureus 906, Streptococcus pyogenes 1238, Salmonella enteritidis 5765 ATCC, Shigella sonnei S-форма 20, Pseudomonas aeruginosa 453 (P<0,05). На фоне применения диоксидина значимой задержки роста Escherichia coliM17, Enterococcus faecalis 2919 ATCC не наблюдалось.
(+)-Лимонен оказался активен относительно Streptococcus pyogenes 1238, Escherichia coli M17, Salmonella enteritidis 5765 ATCC, Citrobacter freundii 101/57, Proteus vulgaris 222 (P<0,05). Высокую чувствительность к данному соединению показали Klebsiella pneumoniae 9172 и Bacillus cereus 96 (Р<0,05). В отношении Staphylococcus aureus 906, Enterococcus faecalis 2919 ATCC, Shigella sonnei S-форма 20 и Pseudomonas aeruginosa 453 (+)-лимонен оказался малоактивен.
(+)-1,2 Оксид лимонена проявил активность относительно тест-штаммов Staphylococcus aureus 906, Enterococcus faecalis 2919 ATCC, Escherichia coli M17 штамм, Salmonella enteritidis 5765 ATCC, Shigella sonnei S-форма 20, Citrobacter freundii 101/57, Pseudomonas aeruginosa 453 (P<0,05). Высокая активность (+)-1,2 оксида лимонена наблюдалась в отношении Klebsiella pneumoniae 9172, Proteus vulgaris 222, Bacillus cereus 96 (P<0,05).
Чувствительными к терпенсульфиду 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноату оказались тест-штаммы Staphylococcus aureus 906, Streptococcus pyogenes 1238, Enterococcus faecalis 2919 ATCC, Salmonella enteritidis 5765 ATCC, Shigella sonnei S-форма 20, Citrobacter freundii 101/57, Klebsiella pneumoniae 9172, Proteus vulgaris 222, Pseudomonas aeruginosa 453 (P<0,05). Высокая чувствительность к полусинтетическому производному лимонена наблюдалась у Escherichia coli M17 штамм и Bacillus cereus 96 (Р<0,05).
Чувствительность опытных штаммов микроорганизмов к исследуемым соединениям была следующей (табл.5). Клинические штаммы S. aureus были статистически значимо чувствительны к (+)-лимонену (Р<0,05). Зоны задержки роста у 43% штаммов составляла от 16 до 25 мм, у 27% - выше 25 мм.
(+)-1,2 Оксид лимонена показал низкую активность относительно изучаемых штаммов S. aureus, у 75% из них зоны задержки роста не превышали 15 мм.
| Таблица 4 | |||||
| Исследование противомикробной активности исследуемых соединений относительно тест-штаммов микроорганизмов диско-диффузионным методом | |||||
| Тест-штамм / Степень активности | контроль | (+)-лимонен | (+)-1,2-оксид лимонена | терпенсульфид | диоксидин |
| Staphylococcus aureus 906 | 0 | + | ++* | ++* | ++* |
| Streptococcus pyogenes 1238 | 0 | ++* | + | ++* | ++* |
| Enterococcus faecalis 2919 ATCC | 0 | + | ++* | ++* | + |
| Escherichia coli M17 штамм | 0 | ++* | ++* | +++* | + |
| Salmonella enteritidis 5765 ATCC | 0 | ++* | ++* | ++* | ++* |
| Shigella sonnei S-форма 20 | 0 | + | ++* | ++* | ++* |
| Citrobacter freundii 101/57 | 0 | ++* | ++* | ++* | +++* |
| Klebsiella pneumoniae 9172 | 0 | +++* | +++* | ++* | +++* |
| Proteus vulgaris 222 | 0 | ++* | +++* | ++* | +++* |
| Pseudomonas aeruginosa 453 | 0 | + | ++* | ++* | ++* |
| Bacillus cereus 96 | 0 | +++* | +++* | +++* | +++* |
| Примечание: * - отличие от контроля статистически достоверно при Р<0,05; «+++» высокая активность - диаметр зоны задержки роста более 25 мм; «++» активное - диаметр зоны задержки роста 16-25 мм; «+» малоактивное - диаметр зоны задержки роста 10-15 мм; «+/-, 0» - неактивное - диаметр зоны задержки роста менее 10 мм и полное отсутствие. |
Терпенсульфид 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метил-этаноат оказался активен относительно 57% клинических штаммов S. aureus (Р<0,05). Но 43% исследуемых штаммов на фоне применения терпенсульфида дали задержку роста, не превышающую 15 мм.
Исследуемые штаммы S. epidermidis в 64% были чувствительны к (+)-лимонену (Р<0,05). У 55% зона задержки роста составляла от 16 до 25 мм, у 9% - выше 25 мм. 23% исследуемых штаммов оказались не чувствительны к исследуемому монотерпену.
(+)-1,2 Оксид лимонена оказал статистически значимый противомикробный эффект относительно клинических штаммов S. epidermidis (Р<0,05). Причем относительно 40% штаммов наблюдалась высокая активность, остальные 60% дали зоны задержки роста от 16 до 25 мм.
Статистически значимо чувствительны к 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноату оказались исследуемые клинические штаммы S. epidermidis (P<0,05). Относительно 37% микроорганизмов данного вида терпенсульфид оказался малоактивен.
Представители семейства Streptococcaceae оказались малочувствительны к исследуемым соединениям. Были исследованы клинические штаммы родов Streptococcus и Enterococcus.
(+)-Лимонен не оказал статистически значимого противомикробного эффекта относительно клинических штаммов S. pyogenes (70% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. pneumoniae (70% - зоны задержки роста не более 15 мм, 30% - нечувствительны); S. uberis (65% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. salivarius (55% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. mitis (75% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. agalactia (64% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. sanguinis (78% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. mutans (73% - зоны задержки роста не более 15 мм); Е. faecalis (73% - зоны задержки роста не более 15 мм); E. faecium (64% - зоны задержки роста не более 15 мм).
(+)-1,2 Оксид лимонена не оказал статистически значимого противомикробного эффекта относительно клинических штаммов S. pneumoniae (70% - зоны задержки роста не более 15 мм, 30% - нечувствительны); S. uberis (75% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. salivarius (75% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. mitis (80% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. sanguinis (60% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. mutans (100% - зоны задержки роста не более 15 мм); E. faecalis (60% - зоны задержки роста не более 15 мм); E. faecium (96% - зоны задержки роста не более 15 мм). Но относительно S. pyogenes (+)-1,2 оксид лимонена проявил статистически значимый противомикробный эффект (Р<0,05). 58% исследуемых штаммов оказались чувствительны к (+)-1,2 оксиду лимонена, 42% - высокочувствительны. 50% клинических штаммов S. agalactia на фоне применения (+)-1,2 оксида лимонена дали зоны задержки роста от 16 до 25 мм.
Исследуемые штаммы S. epidermidis в 64% были чувствительны к (+)-лимонену (Р<0,05). У 55% зона задержки роста составляла от 16 до 25 мм, у 9% - выше 25 мм. 23% исследуемых штаммов оказались не чувствительны к исследуемому монотерпену.
(+)-1,2 Оксид лимонена оказал статистически значимый противомикробный эффект относительно клинических штаммов S. epidermidis (Р<0,05). Причем относительно 40% штаммов наблюдалась высокая активность, остальные 60% дали зоны задержки роста от 16 до 25 мм.
Статистически значимо чувствительны к терпенсульфиду 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноату оказались исследуемые клинические штаммы S. epidermidis (Р<0,05). Относительно 37% микроорганизмов данного вида терпенсульфид оказался малоактивен.
Представители семейства Streptococcaceae оказались малочувствительны к исследуемым соединениям. Были исследованы клинические штаммы родов Streptococcus и Enterococcus.
(+)-Лимонен не оказал статистически значимого противомикробного эффекта относительно клинических штаммов S. pyogenes (70% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. pneumoniae (70% - зоны задержки роста не более15 мм, 30% - нечувствительны); S. uberis (65% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. salivarius (55% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. mitis (75% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. agalactia (64% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. sanguinis (78% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. mutans (73% - зоны задержки роста не более 15 мм); E. faecalis (73% - зоны задержки роста не более 15 мм); E. faecium (64% - зоны задержки роста не более 15 мм).
(+)-1,2 Оксид лимонена не оказал статистически значимого противомикробного эффекта относительно клинических штаммов S. pneumoniae (70% - зоны задержки роста не более 15 мм, 30% - нечувствительны); S. uberis (75% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. salivarius (75% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. mitis (80% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. sanguinis (60% - зоны задержки роста не более 15 мм); S. mutans (100% - зоны задержки роста не более 15 мм); E. faecalis (60% - зоны задержки роста не более 15 мм); E. faecium (96%) - зоны задержки роста не более 15 мм). Но относительно S. pyogenes (+)-1,2 оксид лимонена проявил статистически значимый противомикробный эффект (Р<0,05). 58% исследуемых штаммов оказались чувствительны к (+)-1,2 оксиду лимонена, 42% - высокочувствительны. 50% клинических штаммов S. agalactia на фоне применения (+)-1,2 оксида лимонена дали зоны задержки роста от 16 до 25 мм.
Терпенсульфид 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат проявил статистически достоверный противомикробный эффект относительно клинических штаммов S. pyogenes, S. pneumoniae, E. faecalis (Р<0,05). 65% штаммов S. pyogenes, 60% штаммов S. pneumoniae, 80% штаммов E. faecalis были чувствительны к исследуемому препарату. На фоне применения терпенсульфида (I) исследуемые штаммы S. uberis в 63% дали зоны задержки роста не более 15 мм, S. salivarius - 75%, S. mitis - 71%, S. agalactia - 100%, S. sanguinis - 65%, S. mutans - 75%, E. faecium - 100%.
Наиболее выраженную активность исследуемые соединения проявили относительно представителей семейства Enterobacteriaceae.
(+)-Лимонен проявил статистически значимый противомикробный эффект относительно клинических штаммов E.coli, S. enteritidis, S. sonnei, E. aerogenes, K. pneumoniae, K. oxytoca (P<0,05). Исследуемые штаммы E.coli в 49% оказались чувствительны к исследуемому монотерпену, в 31% - высокочувствительны. 89% штаммов S. enteritidis оказались чувствительны к исследуемому (+)-лимонену. Относительно клинических штаммов S. sonnei (+)-лимонен в 30% оказался активным, в 70% - высокоактивным. 100% исследуемых штаммов E. aerogenes на фоне применения (+)-лимонен дали задержку роста от 16 до 25 мм. Исследуемые штаммы K. pneumoniae в 57% оказались чувствительны к исследуемому монотерпену, в 29% - высокочувствительны. 33% исследуемых штаммов K. oxytoca на фоне применения (+)-лимонена дали задержку роста от 16 до 25 мм, 17% - выше 25 мм. В 100% (+)-лимонен оказался неактивен или малоактивен относительно исследуемых штаммов P. vulgaris, P. mirabilis, E. cloaceae. Клинические штаммы С. freundii в 74% на фоне применения (+)-лимонена дали задержку роста не более 15 мм.
(+)-1,2 Оксид лимонена проявил статистически значимый противомикробный эффект относительно клинических штаммов E.coli, S. enteritidis, S. sonnei, С. freundii, E. aerogenes, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. vulgaris, P. mirabilis (P<0,05). Исследуемые штаммы E.coli в 57% оказались чувствительны к исследуемому соединению, в 43% - высокочувствительны (Р<0,05). 44% штаммов S. enteritidis оказались чувствительны к исследуемому (+)-1,2 оксиду лимонена, 56% - высокочувствительны. Относительно клинических штаммов S. sonnei (+)-1,2 оксид лимонена в 25% оказался активным, в 75% - высокоактивным. Клинические штаммы С. freundii в 85% на фоне применения (+)-1,2 оксида лимонена дали задержку роста от 16 до 25 мм, в 15% - более 25 мм. 75% исследуемых штаммов E. aerogenes на фоне применения (+)-1,2 оксида лимонена дали задержку роста от 16 до 25 мм. Исследуемые штаммы K. pneumoniae в 34% оказались чувствительны к исследуемому соединению, в 55% - высокочувствительны. 26% исследуемых штаммов K. oxytoca на фоне применения (+)-1,2 оксида лимонена дали задержку роста от 16 до 25 мм, 74% - выше 25 мм. P. vulgaris и P. mirabilis оказались чувствительны к исследуемому препарату, и на фоне его применения зоны задержки роста исследуемых штаммов составили в 64 и 76% соответственно от 16 до 25 мм, в 22 и 14% соответственно - выше 25 мм. В 100% (+)-1,2 оксид лимонена оказался малоактивен относительно исследуемых штаммов E. cloaceae.
Терпенсульфид 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат проявил статистически значимый противомикробный эффект относительно клинических штаммов E.coli, S. enteritidis, S. sonnei, C. freundii, K. pneumoniae, K. oxytoca (P<0,05). Исследуемые штаммы E.coli в 67% оказались чувствительны к исследуемому 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноату. 90% штаммов S. enteritidis оказались чувствительны к исследуемому терпенсульфиду. Относительно клинических штаммов S. sonnei терпенсульфид 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат в 87% оказался активным. 100% исследуемых штаммов C. freundii на фоне применения терпенсульфида дали задержку роста от 16 до 25 мм. Исследуемые штаммы K. pneumoniae в 63% оказались чувствительны к исследуемому соединению. 53% исследуемых штаммов K. oxytoca на фоне применения терпенсульфида дали задержку роста от 16 до 25 мм. В 100% терпенсульфид 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат оказался малоактивен относительно исследуемых штаммов P. vulgaris, P. mirabilis, E. cloaceae, E. aerogenes.
Исследуемые соединения оказались малоактивны в отношении клинических штаммов P. aeruginosa.
Полученные данные свидетельствуют о наличии противомикробной активности (+)-лимонена, (+)-1,2 оксида лимонена и, в особенности, сульфида лимонена в отношении тест-штаммов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов.
Терпенсульфид 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноат проявил широкий спектр противомикробной активности.
Применение 2-(1′-гидрокси-4′-изопропенил-1′-метилциклогексил-2′-тио)-метилэтаноата
формулы I:
в качестве противомикробного средства.
