4'-азидонуклеозиды, активные в отношении hcv

Настоящее изобретение относится к соединениям для лечения вирусного гепатита формулы:

где R¹, R² и R³ независимо выбраны из водорода и С_1-6алкилкарбонила; при условии, что по меньшей мере один из R¹, R² и R³ отличается от водорода, и при условии, что соединение согласно формуле I не является сложным (2R,3R,4S,5R)-4-ацетокси-5-ацетоксиметил-5-азидо-2-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2Н-пиримидин-1-ил)-тетрагидро-фуран-3-иловым эфиром уксусной кислоты, а также их фармацевтически приемлемым солям и фармацевтическим композициям на их основе. Предложены новые эффективные средства для лечения инфекции вируса гепатита С. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 пр., 8 ил.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены ацилированные нуклеозиды, которые представляют собой пролекарства ингибитора РНК-зависимой вирусной РНК-полимеразы вируса гепатита С (HCV). При пероральном введении данные соединения легко поглощаются из ЖК (желудочно-кишечный) тракта и эффективно превращаются обратно в родительский нуклеозид в крови. Эти пролекарства представляют собой ингибиторы РНК-зависимой репликации вирусной РНК и являются полезными в качестве ингибиторов полимеразы NS5B HCV, в качестве ингибиторов репликации HCV и для лечения инфекции гепатитом С у млекопитающих. В частности, изобретение касается применения ацилированных пиримидиновых нуклеозидных соединений, которые обеспечивают улучшенное поглощение лекарственного средства при пероральном введении нуклеозида.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Вирус гепатита С является ведущей причиной хронического заболевания печени во всем мире. (Boyer, N. et al., J. Hepatol. 2000 32:98-112). Пациенты, инфицированные HCV, подвергаются риску развития цирроза печени и последующей гепатоклеточной карциномы, и, следовательно, HCV является главным показанием для трансплантации печени.

HCV классифицировали как члена вирусного семейства Flaviviridae, которое включает роды флавивирусов, пестивирусов и хапацеивирусов, который включает вирусы гепатита С (Rice, С.М., Flaviviridae: The viruses and their replication. In: Fields Virology, Editors: B.N.Fields, D.М.Knipe and P.М.Howley, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa., Chapter 30, 931-959, 1996). HCV представляет собой оболочечный вирус, содержащий геном в виде одноцепочечной РНК положительной полярности, имеющей размер приблизительно 9,4 т.п.н. Вирусный геном состоит из высококонсервативной нетранслируемой 5'-области (UTR), длинной открытой рамки считывания, кодирующей полибелковый предшественник из приблизительно 3011 аминокислот, и короткой 3' UTR.

Генетический анализ HCV идентифицировал шесть главных генотипов, которые дивергируют по последовательности ДНК более чем на 30%. Различали более чем 30 подтипов. В США приблизительно 70% инфицированных индивидуумов имеют инфекцию Типа 1а и 1b. Тип 1b является самым превалирующим подтипом в Азии. (X. Forns and J. Bukh, Clinics in Liver Disease 1999 3:693-716; J. Bukh et al., Semin. Liv. Dis. 1995 15:41-63). К сожалению, инфекции типа 1 являются более устойчивыми к терапии, чем генотипы типа 2 или 3 (N.N. Zein, Clin. Microbiol. Rev.. 2000 13:223-235).

Вирусные структурные белки включают коровый белок нуклеокапсида (С) и два гликопротеина оболочки, Е1 и Е2. HCV также кодирует две протеазы, цинк-зависимую металлопротеиназу, кодируемую областью NS2-NS3, и сериновую протеазу, кодируемую областью NS3. Данные протеазы требуются для расщепления конкретных областей полибелка-предшественника на зрелые пептиды. Карбоксильная половина неструктурного белка 5, NS5B, содержит РНК-зависимую РНК-полимеразу. Функция остальных неструктурных белков, NS4A и NS4B, и функция NS5A (аминоконцевой половины неструктурного белка 5) остается неизвестной. Считается, что большинство неструктурных белков, кодируемых РНК-геномом HCV, участвует в репликации РНК.

В настоящее время для лечения инфекции HCV доступно ограниченное число одобренных терапий. Были сделаны обзоры новых и существующих терапевтических подходов для лечения инфекции HCV и ингибирования активности полимеразы NS5B HCV: R.G. Gish, Sem. Liver. Dis., 1999 19:5; Di Besceglie, A.M. and Bacon, B.R., Scientific American, October: 1999 80-85; G. Lake-Bakaar, Current and Future Therapy for Chronic Hepatitis С Virus Liver Disease, Curr. Drug Targ. Infect Dis. 2003 3(3):247-253; P. Hoffmann et al., Recent patent on experimental therapy for hepatitis С virus infection (1999-2002), Exp. Opin. Ther. Patents 2003 13(11): 1707-1723; M.P. Walker et al., Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C, Exp. Opin. Investing. Drugs 2003 12(8): 1269-1280; S.-L. Tan et al., Hepatitis С Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Rev. Drug Discov. 2002 1:867-881; J.Z. Wu and Z. Hong, Targeting NS5B RNA-Dependent RNA Polymerase for Anti-HCV Chemotherapy, Curr. Drug Targ. - Infect. Dis. 2003 3(3):207-219.

В настоящее время имеется ограниченное число одобренных терапий, доступных в настоящее время, для лечения инфекции HVC. Были сделаны обзоры новых и существующих терапевтических подходов для лечения HCV и ингибирования полимеразы NS5B HCV: R.G. Gish, Sem. Liver. Dis., 1999 19:5; Di Besceglie, A.M. and Bacon, B.R., Scientific American, October: 1999 80-85; G. Lake-Bakaar, Current and Future Therapy for Chronic Hepatitis С Virus Liver Disease, Curr. Drug Targ. Infect Dis. 2003 3(3):247-253; P. Hoffmann et al., Recent patents on experimental therapy for hepatitis С virus infection (1999-2002), Exp. Opin. Ther. Patents 2003 13(11): 1707-1723; F.F. Poordad et al. Developments in Hepatitis С therapy during 2000-2002, Exp. Opin. Emerging Drugs 2003 8(1):9-25; M.P. Walker et al., Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C, Exp. Opin. Investig. Drugs 2003 12(8); 1269-1280; S.-L Tan et al., Hepatitis С Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Rev. Drug Discov. 2002 1:867-881; R. De Francesco ef al. Approaching a new era for hepatitis С virus therapy: inhibitors of the NS3-4A serine protease and the NS5B RNA-dependent RNA polymerase, Antiviral Res. 2003 58:1-16; Q.M. Wang ef al. Hepatitis С virus encoded proteins: targets for antiviral therapy, Drugs of the Future 2000 25(9):933-8-944; J.A. Wu and Z. Hong, Targeting NS5B-Dependent RNA Polymerase forAnti-HCV Chemotherapy Cur. Drug Targ. - lnf. Dis.2003 3:207-219. В обзорах процитированы соединения, в настоящее время находящиеся на разных стадиях процесса разработки. Комбинированная терапия двумя или тремя агентами, направленными на одинаковые или разные мишени, стала стандартной терапией для предотвращения или замедления развития устойчивых штаммов вируса, и соединения, раскрытые в приведенных выше обзорах, могли бы использоваться в комбинированной терапии с соединениями по настоящему изобретению, и данные обзоры тем самым являются включенными посредством ссылки во всей их полноте.

Рибавирин (1а; амид 1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-дигидрокси-5-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2-ил)-1 Н-[1,2,4]триазол-3-карбоновой кислоты; VIRAZOLE^®) представляет собой синтетический, не индуцирующий интерферон, противовирусный нуклеозидный аналог широкого спектра. Рибавирин имеет активность in vitro против нескольких ДНК- и РНК-вирусов, включая Flaviviridae (Gary L. Davis, Gastroenterology 2000 118:S104-S114). В монотерапии рибавирин снижает уровни сывороточной аминотрансферазы до нормальных у 40% пациентов, но он не снижает сывороточные уровни РНК HCV. Рибавирин также демонстрирует значительную токсичность, и известно, что он индуцирует анемию. Рибавирин является ингибитором инозинмонофосфатдегидрогеназы. Рибовирин не одобрен в монотерапии против HCV, но данное соединение одобрено в комбинированной терапии с интерфероном α-2а и интерфероном α-2b. Вирамидин 1b представляет собой пролекарство, превращающееся в 1а в гепатоцитах.

Интерфероны (IFN) были доступны для лечения хронического гепатита в течение почти десятилетия. IFN представляют собой гликопротеины, продуцируемые иммунными клетками в ответ на вирусную инфекцию. Распознают два отличных типа интерферона: тип 1 включает несколько интерферонов альфа и один интерферон β, тип 2 включает интерферон γ. Интерферон типа 1 продуцируется, главным образом, инфицированными клетками и защищает соседние клетки от инфекции de novo. IFN ингибируют вирусную репликацию многих вирусов, включая HCV, и, при использовании в качестве единственного лечения инфекции гепатитом С, IFN подавляет сывороточную РНК HCV до недетектируемых уровней. Дополнительно IFN нормализует уровни сывороточной аминотрансферазы. К сожалению, эффекты IFN являются временными. Прекращение терапии приводит к 70%-ной частоте рецидивов, и только 10-15% демонстрируют стойкий вирусологический ответ с нормальными уровнями сывороточной аланинтрансферазы. (L.-B. Davis, выше).

Одним ограничением ранней терапии IFN был быстрый клиренс белка из крови. Химическая дериватизация IFN полиэтиленгликолем (ПЭГ) приводила к (получению) белков со значительно улучшенными фармакокинетическими свойствами. PEGASYS® представляет собой конъюгат интерферона α-2а и 40 кДа разветвленного монометокси ПЭГ, и PEG-INTRON® представляет собой конъюгат интерферона α-2b и 12 кДа монометокси ПЭГ. (В.A. Luxon et al., Clin. Therap.2002 24(9): 1363-1383; A. Kozlowski and J.M. Harris, J. Control. Release, 2001 72:217-224).

Интерферон α-2а и интерферон α-2b в настоящее время одобрены в качестве монотерапии для лечения HCV. ROFERON-A^® (Roche) представляет собой рекомбинантную форму интерферона α-2а. PEGASYS^® (Roche) представляет собой ПЭГилированную (т.е. модифицированную полиэтиленгликолем) форму интерферона α-2а. INTRON-A^® (Schering Corporation) представляет собой рекомбинантную форму интерферона α-2b, и PEG-INTRON^® (Schering Corporation) представляет собой ПЭГилированную форму интерферона α-2b.

Другие формы интерферона α, а также интерферона β, γ, τ и ω в настоящее время находятся в клинической разработке для лечения HCV. Например, в разработке находятся INFERGEN^® (интерферон альфакон-1) от InterMune, OMNIFERON^® (природный интерферон) от Viragen, ALBUFERON^® от Human Genome Sciences, REBIF^® (интерферон β-1а) от Ares-Serono, Omega Interferon от BioMedicine, Oral Interferon Alpha от Amarillo Biosciences, и интерферон γ, интерферон τ и интерферон γ-1b от InterMune.

Комбинированная терапия HCV рибавирином и интерфероном-α в настоящее время представляет собой оптимальную терапию. Объединение рибавирина и ПЭГ-IFN (ниже) приводит к стойкому вирусному ответу у 54-56% пациентов. SVR (стойкий вирусный ответ) достигает 80% для HCV типа 2 и 3 (Walker, выше). К сожалению, комбинация также продуцирует побочные эффекты, которые ставят клинические проблемы. Депрессия, гриппоподобные симптомы и кожные реакции ассоциированы с подкожным INF-α, и гемолитическая анемия ассоциирована с длительным лечением рибавирином.

Другие макромолекулярные соединения для лечения инфекции вирусом гепатита С, в настоящее время находящиеся в доклинической или клинической разработке, включают: lnterleukin-10 от Schering-Plough, 1P-S01 от Intemeuron, Merimebodib (VX-497) от Vertex, HEPTAZYME^® от RPI, IDN-6556 от Idun Pharma, XTL-002 от XTL, HCV/MFS9 от Chiron, CIVACIR^® (иммуноглобулин против гепатита С) от NABI, ZADAXIN^® (тимозин α-1) от SciClone, тимозин плюс ПЭГилированный интерферон от SciClone, CEPLENE^®; терапевтическую вакцину, направленную на Е2 от Innogenetics, терапевтическую вакцину от Intercell, терапевтическую вакцину от Epimmune/Genencor, терапевтическую вакцину от Merix, терапевтическую вакцину Chron-VacC от Tripep.

Другие макромолекулярные подходы включают рибозимы, направленные на РНК HCV. Рибозимы представляют собой короткие встречающиеся в природе молекулы с эндонуклеазной активностью, которые катализируют специфичное в отношении последовательности расщепление РНК. Альтернативным подходом является применение антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются с РНК и стимулируют расщепление, опосредованное РНКазойН.

Теперь был идентифицирован целый ряд потенциальных молекулярных мишеней для разработки лекарственных средств - терапевтических агентов против HCV, включающий, но не ограничивающийся автопротеазой NS2-NS3, протеазой N3, хеликазой N3 и полимеразой NS5B. РНК-зависимая РНК-полимераза абсолютно необходима для репликации одноцепочечного, смыслового РНК-генома, и данный фермент вызывал значительный интерес среди медицинских химиков.

Нуклеозидные ингибиторы могут действовать либо в качестве терминатора цепи, либо в качестве конкурентного ингибитора, который препятствует связыванию нуклеотида с полимеразой. Для функционирования в качестве терминатора цепи, нуклеозидный аналог должен поглощаться клеткой и превращаться in vivo в его трифосфатную форму для конкуренции в качестве субстрата в сайте связывания нуклеотида полимеразы. Это превращение до трифосфата обычно опосредуется клеточными киназами, которые накладывают дополнительные структурные ограничения на любой нуклеозид. Нуклеозидполимеразы также являются существенным компонентом при нормальном делении клетки и для ограничения потенциальных токсичных побочных эффектов, нуклеозидные ингибиторы должны селективно ингибировать вирусные полимеразы без нарушения существенного клеточного роста и репарации посредством ингибирования полимераз хозяина. Таким образом, требование фосфорилирования эндогенными киназами и селективности по отношению к эндогенным полимеразам накладывает строгие требования на структуру потенциальных нуклеозидных терапевтических средств.

НУКЛЕОЗИДНЫЕ ПРОЛЕКАРСТВА

В то время как нуклеозиды часто являются мощными противовирусными и химиотерапевтическими агентами, их практическая польза часто ограничивается двумя факторами. Во-первых, плохие фармакокинетические свойства часто ограничивают поглощение нуклеозида из кишечника; и, во-вторых, субоптимальные физические свойства ограничивают возможности приготовления в виде препарата, которые могли бы применяться для улучшения доставки активного ингредиента.

Альберт (Albert) ввел термин «пролекарство» для описания соединения, которое не имеет подлинной биологической активности, но которое способно к метаболическому превращению до активного лекарственного вещества (A. Albert, Selective Toxicity, Chapman and Hall, London, 1951). Недавно были сделаны обзоры пролекарств (Р.Ettmayer etal., J. Med Chem. 2004 47(10):2393-2404; К. Beaumont et al., Curr. Drug Metab. 2003 4:461-485; H. Bundgaard, Design of Prodrugs: Bioreversible derivatives for various functional groups and chemical entities in Design of Prodrugs, H. Bundgaard (ed) Elsevier Science Publishers, Amersterdam 1985; G. M. Pauletti et al. Adv. Drug Deliv. Rev.1997 27:235-256; R.J. Jones and N. Bischofberger, Antiviral Res. 1995 27; 1-15 and С.R. Wagner et al., Med. Res. Rev. 2000 20:417-45). В то время как метаболическое превращение может катализироваться специфичными ферментами, часто гидролазами, активное соединение также может регенерировать посредством неспецифичных химических процессов.

Термин «фармацевтически приемлемые пролекарства» относится к соединению, которое метаболизируется, например гидролизуется или окисляется, у хозяина с образованием соединения по настоящему изобретению. При биопревращении должно предотвращаться образование фрагментов с токсикологическими склонностями. Типичные примеры пролекарств включают соединения, которые имеют биологически лабильные защитные группы, связанные с функциональной группировкой активного соединения. При конструировании пронуклеотидов использовали алкилирование, ацилирование или другие липофильные модификации гидроксильной группы(групп) на группировке сахара. Данные пронуклеотиды могут гидролизоваться или деалкилироваться in vivo с генерацией активного соединения.

Факторами, ограничивающими пероральную биодоступность, часто являются поглощение из желудочно-кишечного тракта и экскреция первого прохода стенки кишки и печени. Оптимизация трансклеточного поглощения через ЖК тракт требует D_(7,4) большего, чем ноль. Оптимизация коэффициента распределения, однако, не гарантирует успех. Пролекарство возможно должно избегать активных выводящих транспортеров в энтероците. Внутриклеточный метаболизм в энтероците может приводить к пассивному транспорту или активному транспорту метаболита выводящими насосами обратно в просвет кишки. Пролекарство также должно сопротивляться нежелательным биопревращениям в крови до достижения клеток-мишеней или рецепторов.

Часто требуются высокие уровни противовирусных лекарственных средств в системе кровообращения для поддержания достаточно высоких уровней API (активный фармацевтический ингредиент) в крови для того, чтобы минимизировать риск генерации устойчивых популяций. Например, в недавних испытаниях использовали дозы сложного (2R,3R,4R,5R)-5-(4-амино-2-оксо-2Н-пиримидин-1-ил)-4-фтор-2-изобутирилоксиметил-4-метил-тетрагидро-фуран-3-илового эфира изомасляной кислоты (II: R7128) вплоть до 1500 мг BID (два раза в сутки) и QID (четыре раза в сутки). (S. Le Pogam ef al., "No Evidence of R7128 Drug Resistance After Up To 4 Weeks Treatment of GT1,2 and 3 Hepatitis С Virus Infected Individuals", 44th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver (EASL), Copenhagen, Denmark, Apr 22-Apr 26, 2009). Это часто приводит к высоким суточным дозам, для которых требуется большой размер пилюли или капсулы, или более частое введение лекарственной формы. Когда требуются высокие дозы активного фармацевтического ингредиента, возможность добавления разбавителей или эксципиентов для улучшения биодоступности часто ограничивается. Таким образом, разработка новых ингибиторов полимеразы HCV требует идентификации соединений, которые являются биодоступными, превращаются в соответствующий трифосфат и являются мощными ингибиторами полимеразы HCV.

Обязательное требование для фосфорилирования in vivo недавно привело к интересу к нуклеозидмонофосфатным пролекарствам, содержащим маскированную фосфатную группировку, которая является чувствительной к внутриклеточной ферментативной активации, приводящей к (образованию) нуклеозидмонофосфата. Поскольку при образовании нуклеозидтрифосфатов стадией, лимитирующей скорость, является первая стадия, приводящая к монофосфату, последующее добавление второго и третьего фосфатов легко идет на основе монофосфата (смотрите, например, Р. Perrone et al., J. Med. Chem., 2007, 50(8):1840; S.J. Heckerand M.D. Erion, J. Med Chem. 2008 51(8):2328).

Химическая модификация активного соединения с образованием потенциального пролекарства дает совершенно новую молекулярную субстанцию, которая может демонстрировать нежелательные физические, химические и биологические свойства, отсутствующие у родительского соединения. Нормативные требования для идентификации метаболитов могут создавать проблемы, если многочисленные пути приводят к множеству метаболитов. Таким образом, идентификация пролекарств остается неопределенной и бросающей вызов задачей. Кроме того, оценка фармакокинетических свойств потенциальных пролекарств является бросающим вызов и затратным предприятием. Фармакокинетические результаты от животных моделей может быть сложно экстраполировать на людей.

Целью настоящего изобретения является предложение новых соединений, способов и композиций для лечения хозяина, инфицированного вирусом гепатита С.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время отсутствует предупредительное лечение или обычно эффективная терапия для лечения инфекций вирусом гепатита С (HCV). Одобренные в настоящее время терапии, которые только существуют против HCV, имеют ограниченную эффективность и связаны с серьезными побочными эффектами. Следовательно, важной является разработка и развитие новых более эффективных терапий с меньшей токсичностью.

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы I, где:

R¹ и R² (1) в каждом случае независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C_1-6алкилкарбонила, С_1-6алкоксикарбонила и С_1-6аминоалкилкарбонила или

(2) взятые в совокупности и R¹, и R² группировки вместе представляют собой С(=O);

R³ представляет собой водород, С_1-6алкилкарбонил, С_1-6алкоксикарбонил или C_1-6аминоалкилкарбонил;

и их фармацевтически приемлемой соли при условии, что по меньшей мере один из R¹, R² и R³ отличается от водорода.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения заболевания - вирусной инфекции вирусом гепатита С (HCV) путем введения терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I пациенту, нуждающемуся в этом. Соединение можно вводить одно или вводить совместно с другими противовирусными соединениями или иммуномодуляторами.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ ингибирования репликации HCV в клетке путем введения соединения согласно формуле I в эффективном количестве для ингибирования HCV.

Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно формуле I и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1а иллюстрирует профиль фосфорилирования 4'-AU (4'-азидо-урацил) в клетках с репликоном HCV.

Фиг.16 иллюстрирует профиль фосфорилирования 4'-AU в человеческих гепатоцитах.

Фиг.2а иллюстрирует профиль фосфорилирования 4'-AU в РВМС (одноядерные клетки периферической крови). Фиг.26 и Фиг.2в иллюстрируют профиль фосфорилирования 4'-азидо-цитидина (4'-АС) в РВМС после 1 ч инкубации и 120 ч инкубации соответственно.

Фиг.3а и 3б обеспечивают сравнение профиля фосфорилирования 4'-AU в первичных человеческих гепатоцитах, клетках костного мозга и РВМС. Сходные профили были получены у 3 доноров.

Фиг.4 иллюстрирует эффективность 4'-AU по сравнению с 4'-АС в человеческих гепатоцитах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Триацильные производные 4'-азидо-цитидина (4'-АС) исследовали в качестве ингибиторов полимеразы NS5B HCV (К. Klumpp et al; J. б/о. Chem., 2008 283(4):2167-2176). К сожалению, несмотря на то, что 4'-АС представляет собой мощный ингибитор вирусной репликации, клинические исследования были остановлены развитием неприемлемых побочных эффектов. Родственный пиримидиновый нуклеозид, 4'-азидо-уридин (4'-AU) не был активным в анализе репликона, который широко используется для оценки потенциальных ингибиторов полимеразы (V. Lohmann et al., J. Virol. 2003 77:3007-3019, K.J. Blight et al., Science 2000 290(5498): 1870-1871). При химическом получении трифосфата и оценке в анализе полимеразы HCV он ингибировал фермент с K_i 0,038±8 мкМ по сравнению с K_i 0,040±25 мкМ для 4'-азидо-цитидинтрифосфата (D. Smith et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007 17:2570). Следовательно, предполагалось, что отсутствие активности в анализе репликона указывает на то, что 4'-AU не фосфорилировался in vivo. Это объяснение было поддержано демонстрацией того, что, в то время как 4'-АС фосфорилировался РВМС (одноядерные клетки периферической крови), 4'-AU не превращался в соответствующий фосфорилированный нуклеозид (ФИГ.1).

Теперь неожиданно обнаружили, что фосфорилирование 4'-AU действительно эффективно осуществляется в первичных человеческих гепатоцитах (ФИГ.2). Поскольку специфичное в отношении клетки фосфорилирование происходит в ткани-мишени для репликации HCV, имеется потенциал для терапии селективно фосфорилированным нуклеозидом, который дополнительно свидетельствует о том, что ограниченное фосфорилирование в других клетках возможно будет приводить к меньшим возможностям для неблагоприятной токсичности.

Элемент в единственном числе здесь используется в отношении одного или более чем одного такого элемента, например «соединение» относится к одному или более чем одному соединению или по меньшей мере к одному соединению. Термины в единственном числе или предваряемые фразами «один или более чем один» и «по меньшей мере один», как таковые, могут здесь использоваться взаимозаменяемо.

Фраза «как определено здесь выше» относится к самому широкому определению для каждой группы, как приведено в кратком изложении сущности изобретения или в самом широком пункте формулы изобретения. Во всех других воплощениях, приведенных ниже, заместители, которые могут присутствовать в каждом воплощении и которые прямо не определены, сохраняют самое широкое определение, приведенное в кратком изложении сущности изобретения.

Термины «включают(ет)» и «включающий» в том виде, как они используются в данном описании изобретения, либо в переходной фразе, либо в основной части пункта формулы изобретения, следует интерпретировать как имеющие значение, допускающее поправки. То есть, данные термины следует интерпретировать синонимично фразам "имеющий по меньшей мере" или "включающий по меньшей мере". При использовании в контексте способа термин «включающий» означает то, что способ включает по меньшей мере перечисленные стадии, но может включать дополнительные стадии. При использовании в контексте соединения или композиции термин «включающий» означает то, что соединение или композиция включает по меньшей мере перечисленные характеристики или компоненты, но также может включать дополнительные характеристики или компоненты.

Термин «независимо» используется здесь для указания того, что переменная применяется в любом случае безотносительно к присутствию или отсутствию переменной, имеющей такое же или другое определение, в пределах того же самого соединения. Таким образом, в соединении, в котором R" появляется дважды и определяется как «независимо углерод или азот», оба R" могут представлять собой углерод, оба R" могут представлять собой азот, или один R" может представлять собой углерод, а другой - азот.

Когда любая переменная (например, R¹, R^4a, Аr, X¹ или Het) встречается больше, чем один раз в любой группировке или формуле, отображающей и описывающей соединения, применяемые или заявленные в настоящем изобретении, ее определение при каждом появлении является независимым от ее определения при каждом другом появлении. Также комбинации заместителей и/или переменных являются разрешенными, только если такие соединения приводят к стабильным соединениям.

Каждый из символов ^«*^» в конце связи или ^«----», нарисованный через связь, относится к точке присоединения функциональной группы или другой химической группировки к остальной молекуле, частью которой она является. Таким образом, например:

MeC(=O)OR⁴ где или .

Связь, нарисованная в системе кольца (в отличие от связи, соединенной с определенной вершиной), указывает на то, что связь может быть присоединена к любому подходящему атому кольца.

Термин «возможный» или «возможно» в том виде, как он здесь используется, означает то, что событие или обстоятельство, описанное далее, может, но не обязательно происходит, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит. Например, «возможно замещенный» означает то, что возможно замещенная группировка может включать водород или заместитель.

Термин «примерно» используется здесь для обозначения приблизительно, в районе, грубо или около. При использовании термина «примерно» в сочетании с числовым интервалом он модифицирует данный интервал, расширяя границы выше и ниже изложенных числовых значений. В общем, термин «примерно» используется здесь для модификации числового значения выше и ниже заявленного значения на отклонение 20%.

Перечисление числового интервала для переменной в том виде, как оно здесь используется, предназначено для выражения того, что изобретение можно воплощать на практике с переменной, равной любому из значений в пределах данного интервала. Таким образом, для переменной, которая является дискретной по своей природе, переменная может быть равной любому целочисленному значению из числового интервала, включая конечные точки интервала. Аналогично, для переменной, которая является непрерывной по своей природе, переменная может быть равна любому реальному значению из числового интервала, включая конечные точки интервала. В качестве примера, переменная, которая описана, как имеющая значения от 0 и 2, может составлять 0, 1 или 2 для переменных, которые являются дискретными по своей природе, и может составлять 0,0; 0,1; 0,01; 0,001 или любое другое реальное значение для переменных, которые являются непрерывными по своей природе.

Соединения формулы I демонстрируют таутомерию. Таутомерные соединения могут существовать в виде двух или более чем двух соединений, способных к взаимному превращению. Прототропные таутомеры образуются в результате миграции ковалентно связанного атома водорода между двумя атомами. Таутомеры обычно существуют в равновесии, и попытки выделить индивидуальные таутомеры обычно дают смесь, химические и физические свойства которой согласуются со смесью соединений. Положение равновесия зависит от химических свойств в пределах молекулы. Например, у многих алифатических альдегидов и кетонов, таких как ацетальдегид, преобладает кето форма, тогда как у фенолов преобладает енольная форма. Обычные прототропные таутомеры включают кето/енольные , амид/имидная кислота и амидиновые таутомеры. Последние два являются особенно обычными в гетероарильных и гетероциклических кольцах, и настоящее изобретение охватывает все таутомерные формы соединений.

В первом воплощении настоящего изобретения предложено соединение согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше.

Во втором воплощении настоящего изобретения предложено соединение согласно формуле I, где R¹, R² и R³ представляют собой С_1-6алкилкарбонил.

В третьем воплощении настоящего изобретения предложено соединение согласно формуле I, где R¹ и R² представляют собой С_1-6алкилкарбонил, и R³ представляет собой водород.

В четвертом воплощении настоящего изобретения предложено соединение согласно формуле I, где R¹ и R² представляют собой водород, и R³ представляет собой C_1-6алкилкарбонил или С_1-6аминоалкилкарбонил.

В пятом воплощении настоящего изобретения предложено соединение, выбранное из соединений 1-1 -1-6 ТАБЛИЦЫ I.

В шестом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции HCV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как определено здесь выше. Во всех других воплощениях, приведенных ниже, заместители, которые могут присутствовать в каждом воплощении, и которые явно не определены, сохраняют самое широкое определение, приведенное в кратком изложении сущности изобретения.

В седьмом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции HCV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ представляют собой С_1-6алкилкарбонил.

В восьмом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции HCV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I, где R¹ и R² представляют собой С_1-6алкилкарбонил, и R³ представляет собой водород.

В девятом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции HCV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I, где R¹ и R² представляют собой водород, и R³ представляет собой C_1-6алкилкарбонил или C_1-6аминоалкилкарбонил.

В десятом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции HCV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, и совместное введение по меньшей мере одного модулятора иммунной системы и/или по меньшей мере одного противовирусного агента, который ингибирует репликацию HCV.

В одиннадцатом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции HCV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, и совместное введение по меньшей мере одного модулятора иммунной системы, выбранного из группы, состоящей из интерферона, интерлейкина, фактора некроза опухолей и колониестимулирующего фактора.

В двенадцатом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции HCV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, и совместное введение по меньшей мере одного модулятора иммунной системы, где модулятор иммунной системы представляет собой интерферон или химически дериватизированный интерферон.

В тринадцатом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции HCV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, и совместное введение по меньшей мере одного противовирусного агента, который ингибирует репликацию HCV.

В четырнадцатом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции HCV, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, и совместное введение по меньшей мере одного противовирусного агента, выбранного из группы, состоящей из ингибитора протеазы HCV, другого нуклеозидного ингибитора полимеразы HCV, ненуклеозидного ингибитора полимеразы HCV, ингибитора хеликазы HCV, ингибитора праймазы HCV и ингибитора слияния HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как определено здесь выше, для лечения инфекции HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения формулы I, где R¹, R² и R³ являются такими, как определено здесь выше, для изготовления лекарственного средства для лечения инфекции HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ представляют собой C_1-6алкилкарбонил, для лечения инфекции HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения формулы I, где R¹, R² и R³ представляют собой C_1-6алкилкарбонил, для изготовления лекарственного средства для лечения инфекции HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения согласно формуле I, где R¹ и R² представляют собой C_1-6алкилкарбонил, и R³ представляет собой водород, для лечения инфекции HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения формулы I, где R¹ и R² представляют собой С_1-6алкилкарбонил, и R³ представляет собой водород, для изготовления лекарственного средства для лечения инфекции HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения согласно формуле I, где R¹ и R² представляют собой водород, и R³ представляет собой C_1-6алкилкарбонил или С_1-6аминоалкилкарбонил, для лечения инфекции HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения формулы I, где R¹ и R² представляют собой водород, и R³ представляет собой С_1-6алкилкарбонил или С_1-6аминоалкилкарбонил, для изготовления лекарственного средства для лечения инфекции HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, в комбинации с по меньшем мере одним модулятором иммунной системы и/или по меньшей мере одним противовирусным агентом, который ингибирует репликацию HCV, для лечения инфекции HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, для лечения инфекции HCV в комбинации с по меньшем мере одним модулятором иммунной системы, выбранным из группы, состоящей из интерферона, интерлейкина, фактора некроза опухоли и колониестимулирующего фактора.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, для лечения инфекции HCV в комбинации с по меньшем мере одним модулятором иммунной системы, где модулятор иммунной системы представляет собой интерферон или химически дериватизированный интерферон.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, для лечения инфекции HCV в комбинации с по меньшем мере одним антивирусным агентом, который ингибирует репликацию HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, для лечения инфекции HCV в комбинации с по меньшем мере одним антивирусным агентом, выбранным из группы, состоящей из ингибитора протеазы HCV, другого нуклеозидного ингибитора полимеразы HCV, ненуклеозидного ингибитора полимеразы HCV, ингибитора хеликазы HCV, ингибитора праймазы HCV и ингибитора слияния HCV.

В другом воплощении настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как описано здесь выше, смешанного с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

Термин «алкилкарбонил» в том виде, как он здесь используется, обозначает группу формулы C(=O)R, где R представляет собой алкил, как здесь определено. Термин С_1-6ацил [или «алканоил»] относится к группе -C(=O)R, которая содержит от 1 до 6 атомов углерода. С₁цильная [или «алканоильная»] группа представляет собой формильную группу, где R=Н, и С₆ацильная группа относится к гексаноилу, когда алкильная цепь является неразветвленной. Термин «арилкарбонил» или «ароил» в том виде, как он здесь используется, означает группу формулы C(=O)R, где R представляет собой арильную группу; термин «бензоил» в том виде, как он здесь используется, представляет собой «арилкарбонильную» или «ароильную» группу, где R представляет собой фенил.

Термины «алкоксикарбонил» и «арилоксикарбонил» в том виде, как они здесь используются, обозначают группу формулы C(=O)OR, где R представляет собой алкил или арил соответственно, и алкил и арил являются такими, как здесь определено.

Термин «аминоалкилкарбонил» в том виде, как он здесь используется, относится к алкилкарбонильной группировке, как здесь определено, где один водород заменен аминогруппой. Термин «С_1-6аминоалкилкарбонил» определяет C_1-6алкилкарбонильную группу. Примеры аминоалкилкарбонильных группировок включают, но не ограничиваются глицильной [СОСH₂NН₂], аланильной [СОСН(NН₂)Ме], валинильной [СОСН(NН₂)СНМе₂], лейцинильной [COCH(NH₂)CH₂CHMe₂], изолейцинильной [COCH(NH₂)CHMeEt] и норлейцинильной [СОСН(NН₂)(СН₂)₃Ме] и тому подобными. Это определение не ограничивается встречающимися в природе аминокислотами.

Обычно используемые сокращения включают: ацетил (Ас), водный (водн.), 4АС (4-азидоцитидин), 4AU (4-азидоуридин), 4AU-MP (4-азидоуридина монофосфат), 4AU-DP (4-азидоуридина дифосфат), 4AU-TP (4-азидоуридина трифосфат), атмосферы (атм.), mpem-бутоксикарбонил (Воc), ди-трет-бутилпирокарбонат или ангидрид Вое (ВОС₂O), бензил (Вn), бутил (Вu), регистрационный номер Chemical Abstracts (CASRN), бензилоксикарбонил (CBZ или Z), карбонилдиимидазол (CDI), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1,2-дихлорэтан (DCE), дихлорметан (DCM), диэтилазодикарбоксилат (DEAD), ди-изо-пропилазодикарбоксилат (DIAD), ди-изо-бутилалюминия гидрид (DIBAL или DIBAL-Н), ди-изо-пропилэтиламин (DIPEA), N,N-диметилацетамид (DMA), 4-N,N-диметиламинопиридин (DMAP), N,N-диметилформамид (DMF), диметилсульфоксид (DMSO), этил (Et), этанол (ЕtOН), 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (EDCl), этилацетат (ЕtOАс), сложный этиловый эфир 2-этокси-2Н-хинолин-1-карбоновой кислоты (EEDQ), диэтиловый эфир (Et₂O), уксусная кислота (НОАс), 1-N-гидроксибензотриазол (HOBt), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), изо-пропанол (IPA), метанол (МеОН), температура плавления (Тпл.), MeSO_2- (мезил или Ms), метил (Me), ацетонитрил (MeCN), мета-хлорпербензойная кислота (МСРВА), масс-спектр (МС), метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ), N-метилморфолин (NMM), N-метилпирролидон (NMP), фенил (Ph), пропил (Рr), изо-пропил (i-Pr), фунты на квадратный дюйм (psi), пиридин (pyr), комнатная температура (Т комн.), насыщ. (насыщенный), трет-бутилдиметилсилил или t-BuMe₂Si (TBDMS), триэтиламин (TEA или Et₃N), трифлат или СF₃SO_2- (Tf), трифторуксусная кислота (TFA), O-бензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат (TBTU), тонкослойная хроматография (ТСХ), тетрагидрофуран (THF), тетраметилэтилендиамин (TMEDA), триметилсилил или Me₃Si (TMS), пара-толуолсульфоновой кислоты моногидрат (TsOH или pTsOH), 4-Ме-С₆Н₄SO_2- или тозил (Ts), N-уретан-N-карбоксиангидрид (UNCA). Традиционная номенклатура, включающая префиксы нормальный (н-), изо (изо-), вторичный (втор-), третичный (трет-) и нео-, которые имеют их традиционное значение при использовании с алкильной группировкой. (J. Rigaudy and D.P. Klesney, Nomenclature in Organic Chemistry, IUPAC 1979 Pergamon Press, Oxford.).

СОЕДИНЕНИЯ И ПРЕПАРАТЫ

В следующей таблице приведены примеры репрезентативных соединений, охватываемых настоящим изобретением и находящихся в пределах объема изобретения. Данные примеры и получения, которые следуют, приведены для того, чтобы дать возможность специалистам в данной области более четко понять и воплотить на практике настоящее изобретение. Они не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения, но просто как иллюстративные и представляющие его.

В общем, номенклатура, используемая в данной заявке, основана на AUTONOM™ v.4.0, компьютеризированной системе института Бельштейна для генерации систематической номенклатуры IUPAC (Международный союз теоретической и прикладной химии). Если существует расхождение между изображенной структурой и названием, которое дано этой структуре, следует придавать больший вес изображенной структуре. Кроме того, если стереохимия структуры или части структуры не указана, например, жирными или пунктирными линиями, структуру или часть структуры следует интерпретировать как охватывающую все ее стереоизомеры.

Таблица 1
№ соед.		Способ	MC (M+H)+	Т пл.
	R1	R2	Способ	MC	Т пл.
1-1	H	EtC(=O)	С	398	118-120
1-2	i-PrC(=O)	i-PrC(=O)	A	496
1-3	EtC(=O)	EtC(=O)	A		111-113
1-4	MeC(=O)	MeC(=O)	A		158
1-5	n-BuC(=O)	n-BuC(=O)	A		64
1-6	EtC(=O)	H	В	340 [M-H]	148-150
1-7	C7H15C(=O)	H	В	412

Соединения по настоящему изобретению можно получать множеством способов, изображенных в иллюстративных схемах синтетических реакций, показанных и описанных ниже. Исходные вещества и реактивы, используемые при получении данных соединений, обычно либо доступны от коммерческих поставщиков, таких как Aldrich Chemical Co., либо получаются способами, известными специалистам в данной области, следуя методикам, изложенным в ссылках, таких как Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis; Wiley & Sons: New York, Volumes 1-21; R.C. LaRock, Comprehensive Organic Transformations, 2^nd edition Wiley-VCH, New York 1999; Comprehensive Organic Synthesis, B. Trost and I. Fleming (Eds.) vol.1-9 Pergamon, Oxford, 1991; Comprehensive Heterocyclic Chemistry, A.R. Katritzky and C.W. Rees (Eds) Pergamon, Oxford 1984, vol.1-9; Comprehensive Heterocyclic Chemistry II, A.R. Katritzky and C.W. Rees (Eds) Pergamon, Oxford 1996, vol.1-11; и Organic Reactions, Wiley & Sons: New York, 1991, Volumes 1-40. Следующие схемы синтетических реакций являются лишь иллюстративными для некоторых способов, посредством которых можно синтезировать соединения по настоящему изобретению, и можно сделать разные модификации данных схем синтетических реакций, и они будут предложены специалисту в данной области со ссылкой на раскрытие, содержащееся в данной заявке.

Исходные вещества и промежуточные соединения схем синтетических реакций, при необходимости, можно выделять и очищать, используя традиционные методики, включающие, но не ограничивающиеся, фильтрацией, перегонкой, кристаллизацией, хроматографией и тому подобным. Такие вещества можно охарактеризовать с использованием традиционных способов, включая физические константы и спектральные данные.

Если не определено противоположное, описанные здесь реакции предпочтительно проводят в инертной атмосфере при атмосферном давлении, в интервале температур реакции от примерно -78°С до примерно 150°С, более предпочтительно от примерно 0°С до примерно 125°С и наиболее предпочтительно и удобно - примерно при комнатной (или окружающей среды) температуре, например, примерно 20°С.

Некоторые соединения на следующих схемах изображены с обобщенными заместителями; однако, специалист в данной области немедленно поймет, что природа R групп может варьировать с получением разных соединений, рассматриваемых в данном изобретении. Кроме того, условия реакций являются примерными, и альтернативные условия хорошо известны. Имеется в виду, что последовательности реакций в следующих примерах не ограничивают объем изобретения, как изложено в формуле изобретения.

Соединения по настоящему изобретению можно получать ацилированием 4-азидо-урацила (CASRN 139442-01-6) или его защищенного производного, например, 2',3'-ацетонида (CASRN 690271-27-3). Обработка 4'AU активированным производным карбоновой кислоты, таким как хлорангидрид или ангидрид кислоты, дает триацильные производные. Обработка соответствующего ацетонида дает 5'-ацильное производное, с которого затем снимается защита.

Термин «защитная группа» в том виде, как он здесь используется, относится к химической группе, которая (а) эффективно объединяется с реакционноспособной группой в молекуле; (б) предотвращает участие реакционноспособной группы в нежелательной химической реакции и (в) может быть легко удалена после того, как больше не требуется защита реакционноспособной группы. Защитные группы используются в синтезе для того, чтобы временно маскировать характерные химические свойства функциональной группы, поскольку она мешает другой реакции. Реактивы и протоколы для введения и удаления защитных групп хорошо известны и рассматривались в многочисленных публикациях (например Т.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd edition, John Wiley & Sons, New York, 1999 и Harrison and Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 John Wiley and Sons, 1971-1996). Специалист в области химии поймет, что иногда протоколы должны быть оптимизированы для конкретной молекулы, и такая оптимизация находится полностью в пределах способностей специалиста в данных областях.

2',3'-Диацил-4'-АU производные получали ферментативным способом. 5'-Ацил-4'-АU производные получали ацетилированием 2',3'-ацетонида 4'-AU (пример 3) или селективным ацилированием 4'-AU, катализируемым ферментом.

ДОЗИРОВКА И ВВЕДЕНИЕ

Соединения по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде препарата в широком спектре лекарственных форм и носителей для перорального введения. Пероральное введение может осуществляться в форме таблеток, покрытых таблеток, драже, твердых и мягких желатиновых капсул, растворов, эмульсий, сиропов или суспензий. Соединения по настоящему изобретению являются эффективными при введении другими путями введения, включая непрерывное (внутривенное капельное введение), местное, парентеральное, внутримышечное, внутривенное, подкожное, чрескожное (которое может включать (применение) агента, усиливающего проникновение), буккальное, назальное, ингаляцию или введение суппозитория, наряду с другими путями введения. Предпочтительным способом введения обычно является пероральное с использованием удобной суточной схемы дозировки, которую можно корректировать согласно степени недуга и ответу пациента на активный ингредиент.

Соединение или соединения по настоящему изобретению, а также их фармацевтически полезные соли, совместно с одним или более чем одним традиционным эксципиентом, носителем или разбавителем, можно выпускать в форме фармацевтических композиций и лекарственных форм. Фармацевтические композиции и стандартные лекарственные формы могут состоять из традиционных ингредиентов в традиционных пропорциях, с или без дополнительных активных соединений или начал, и стандартные лекарственные формы могут содержать любое подходящее эффективное количество активного ингредиента, соразмерное с намеченным суточным интервалом дозы, подлежащей применению. Фармацевтические композиции могут применяться в твердом виде, таком как таблетки или заполненные капсулы, полутвердые вещества, порошки, препараты замедленного высвобождения, или (в виде) жидкостей, таких как растворы, суспензии, эмульсии, эликсиры или заполненные капсулы для перорального применения; или в форме суппозиториев для ректального или вагинального введения; или в форме стерильных инъецируемых растворов для парентерального применения. Типичный препарат будет содержать от примерно 5% до примерно 95% активного соединения или соединений (масс./масс.). Подразумевается, что термин «препарат» или «лекарственная форма» включает и твердые, и жидкие препараты активного соединения, и специалист в данной области поймет, что активный ингредиент может существовать в разных препаратах, в зависимости от органа или ткани-мишени и от желательной дозы и фармакокинетических параметров.

Термин «эксципиент» в том виде, как он здесь используется, относится к соединению, которое является полезным при получении фармацевтической композиции, обычно безопасным, нетоксичным и ни биологически, ни иным способом нежелательным, и включает эксципиенты, которые являются приемлемыми для ветеринарного применения, а также для фармацевтического применения у человека. Соединения по данному изобретения можно вводить одни, но обычно они будут вводиться в смеси с одним или более чем одним подходящим фармацевтическим эксципиентом, разбавителем или носителем, выбранным, принимая во внимание намеченный путь введения и стандартную фармацевтическую практику.

«Фармацевтически приемлемый» означает то, что является полезным в приготовлении фармацвтической композиции, что обычно является безопасным, нетоксичным и ни биологически, ни иным способом нежелательным, и включает то, что является приемлемым для фармацевтического применения у человека.

«Фармацевтически приемлемая солевая» форма активного ингредиента также может исходно придавать активному ингредиенту желательные фармакокинетические свойства, которые отсутствовали у несолевой формы, и может даже положительно влиять на фармакодинамику активного ингредиента относительно его терапевтической активности в организме. Фраза «фармацевтически приемлемая соль» соединения означает соль, которая является фармацевтически приемлемой и которая обладает желательной фармакологической активностью родительского соединения. Такие соли включают: (1) соли присоединения кислоты, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и тому подобное; или образованные с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропионовая кислота, гексановая кислота, циклопентанпропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2-этан-дисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4-хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоновая кислота, глюкогептоновая кислота, 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота, третичная бутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтоевая кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота и тому подобное; или (2) соли, образующиеся когда кислотный протон, присутствующий в родительском соединении либо ^заменяется ионом металла, например, ионом щелочного металла, ионом щелочноземельного металла или ионом алюминия; или координируется с органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, трометамин, N-метилглукамин и тому подобным.

Препараты в твердой форме включают порошки, таблетки, пилюли, капсулы, крахмальные облатки, суппозитории и диспергируемые гранулы. Твердый носитель может быть одним или более чем одним веществом, которое также может действовать в качестве разбавителя, корригента, солюбилизатора, смазки, суспендирующего агента, связующего вещества, консерванта, агента-разрыхлителя таблетки или инкапсулирующего вещества. В порошках носитель обычно представляет собой мелко измельченное твердое вещество, которое является смесью с мелко измельченным активным компонентом. В таблетках активный компонент обычно смешивают с носителем, имеющим необходимую связывающую способность, в подходящих пропорциях и прессуют до желательной формы и размера. Подходящие носители включают, но не ограничиваются, карбонатом магния, стеаратом магния, тальком, сахаром, лактозой, пектином, декстрином, крахмалом, желатином, трагакантом, метилцеллюлозой, натрий карбоксиметилцеллюлозой, низкоплавким воском, маслом какао и тому подобным. Препараты в твердой форме, помимо активного компонента, могут содержать красители, корригенты, стабилизаторы, буферы, искусственные и природные подсластители, диспергирующие агенты, загустители, солюбилизирующие агенты и тому подобное.

Жидкие препараты также подходят для перорального введения (и) включают жидкие препараты, включающие эмульсии, сиропы, эликсиры, водные растворы, водные суспензии. Они включают препараты в твердой форме, которые предназначены для превращения в препараты в жидкой форме незадолго до применения. Эмульсии можно готовить в растворах, например, в растворах водного пропиленгликоля, или они могут содержать эмульгирующие агенты, такие как лецитин, сорбитана моноолеат или аравийскую камедь. Водные растворы можно готовить растворением активного компонента в воде и добавлением подходящих красителей, корригентов, стабилизаторов и загустителей. Водные суспензии можно готовить диспергированием мелко измельченного активного компонента в воде с вязким веществом, таким как природные или синтетические камеди, смолы, метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и другие хорошо известные суспендирующие агенты.

Соединения по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде препарата для парентерального введения (например, путем инъекции, например, болюсной инъекции или непрерывной инфузии) и могут быть представлены в стандартных лекарственных формах - в ампулах, предварительно заполненных шприцах, контейнерах для инфузии малого объема или в многодозовых контейнерах с добавлением консерванта. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных наполнителях, например, растворы в водном полиэтиленгликоле. Примеры масляных или неводных носителей, разбавителей, растворителей или наполнителей включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла (например, оливковое масло) и инъецируемые органические сложные эфиры (например, этилолеат), и они могут содержать агенты для приготовления препарата, такие как консерванты, увлажнители, эмульгирующие или суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В качестве альтернативы, активный ингредиент может находиться в форме порошка, полученного асептическим выделением стерильного твердого вещества или лиофилизацией из раствора, для разведения перед применением подходящим наполнителем, например, стерильной апирогенной водой.

Соединения по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде препарата для местного введения в эпидермис в виде мазей, кремов или лосьонов, или в виде чрескожного пластыря. Мази и кремы, например, могут быть приготовлены в виде препаратов с водной или масляной основой с добавлением подходящих загустителей и/или гелеобразующих агентов. Лосьоны могут быть приготовлены в виде препаратов с водной или масляной основой и, в общем, также будут содержать один или более чем один эмульгатор, стабилизатор, диспергирующий агент, суспендирующий агент, загуститель или краситель. Препараты, подходящие для местного введения в рот, включают ромбовидные лепешки, содержащие активные агенты в ароматизированной основе, обычно сахарозе и аравийской камеди или трагакантовой камеди; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь; и полоскания для полости рта, содержащие активный ингредиент в подходящем жидком носителе.

Соединения по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде препарата для введения в виде суппозиториев. Низкоплавкий воск, такой как смесь глицеридов жирных кислот или масла какао, сперва плавят, и активный компонент гомогенно диспергируют, например, перемешиванием. Расплавленную гомогенную смесь затем вливают в формы удобного размера, дают охладиться и затвердеть.

Соединения по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде препарата для вагинального введения. В данной области известны как подходящие пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или спреи, содержащие, помимо активного ингредиента, такие носители. Соединения по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде препарата для введения в нос. Растворы или суспензии наносят непосредственно в полость носа традиционными способами, например, капельницей, пипеткой или (в виде) спрея. Препараты можно предоставлять в одно- или многодозовой форме. В последнем случае капельницы или пипетки, это может достигаться введением пациентом подходящего заданного объема раствора или суспензии. В случае спрея, это может достигаться, например, посредством дозирующего атомизирующего насоса для распыления.

Соединения по настоящему изобретению можно готовить в виде препарата для аэрозольного введения, в частности, в респираторный тракт и включая введение в нос. Соединение обычно будет иметь маленький размер частиц, например, порядка пяти (5) микрометров или менее. Такой размер частиц может быть получен способами, известными в данной области, например, микронизацией. Активный ингредиент предоставляется в упаковке под давлением с подходящим пропеллентом, таким как хлорфторуглерод (CFC), например, дихлордифторметан, трихлорфторметан или дихлортетрафторэтан, или диоксид углерода, или другой подходящий газ. Аэрозоль также с удобством может содержать поверхностно-активное вещество, такое как лецитин. Доза лекарственного средства может контролироваться дозирующим клапаном. В качестве альтернативы, активные ингредиенты могут быть предоставлены в форме сухого порошка, например, порошковой смеси соединения в подходящей порошковой основе, такой как лактоза, крахмал, производные крахмала, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза и поливинилпирролидон (PVP). Порошковый носитель будет образовать гель в полости носа. Порошковая композиция может быть представлена в стандартной лекарственной форме, например, в капсулах или картриджах из, например, желатина, или в блистерных упаковках, порошок из которых можно вводить посредством ингалятора.

При необходимости препараты могут быть получены с энтеросолюбильными покрытиями, адаптированными для замедленного введения активного ингредиента или введения с контролируемым высвобождением. Например, соединения по настоящему изобретению можно готовить в виде препаратов в устройствах для чрескожной или подкожной доставки лекарственного средства. Данные системы доставки являются полезными, когда необходимым является замедленное высвобождение соединения, и когда решающим является соблюдение пациентом схемы лечения. Соединения в системах чрескожной доставки часто присоединены к твердой подложке, которую можно приклеить на кожу. Интересующее соединение также может быть объединено с усилителем проникновения, например, Azone (1-додецилаза-циклогептан-2-он). Системы доставки с замедленным высвобождением вставляют подкожно в подкожный слой посредством хирургии или инъекции. Подкожные имплантаты инкапсулируют соединение в липидорастворимой мембране, например, в силиконовой резине, или в биодеградирующем полимере, например полимолочной кислоте.

Подходящие препараты, наряду с фармацевтическими носителями, разбавителями и эксципиентами, описаны в Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E.W. Martin, Mack Publishing Company, 19 th edition, Easton, Pennsylvania. Квалифицированный ученый в области приготовления препаратов может модифицировать препараты в пределах доктрины спецификации для предоставления многочисленных препаратов для конкретного пути введения, не делая композиции по настоящему изобретению нестабильными или не подвергая риску их терапевтическую активность.

Модификация настоящих соединений для того, чтобы сделать их более растворимыми в воде или другом носителе, например, может легко осуществляться минорными модификациями (препарат в виде соли, этерификация и пр.), которые целиком находятся в пределах обычной квалификации в данной области. Также целиком в пределах обычной квалификации в данной области является модификация пути введения и схемы дозировки конкретного соединения для того, чтобы управлять фармакокинетикой настоящих соединений для максимально полезного эффекта у пациентов.

Термин «терапевтически эффективное количество» в том виде, как он здесь используется, означает количество, требующееся для уменьшения симптомов заболевания у индивидуума. Доза будет корректироваться до индивидуальных требований в каждом конкретном случае. Эта дозировка может варьировать в широких пределах, в зависимости от многочисленных факторов, таких как тяжесть заболевания, подлежащего лечению, возраст и общее состояние здоровья пациента, другие лекарственные средства, которыми лечат пациента, путь и форма введения, и предпочтения и опыт участвующего врача. Для перорального введения в монотерапии и/или в комбинированной терапии должна быть подходящей суточная дозировка от примерно 0,01 до примерно 1000 мг/кг массы тела в сутки. Предпочтительная суточная дозировка составляет от примерно 0,1 до примерно 500 мг/кг массы тела, более предпочтительно от 0,1 до примерно 100 мг/кг массы тела и наиболее предпочтительно от 1,0 до примерно 10 мг/кг массы тела в сутки. Таким образом, для введения человеку, весящему 70 кг, интервал дозировки был бы от примерно 7 мг до 0,7 г в сутки. Суточную дозировку можно вводить в виде одиночной дозировки или в раздельных дозировках, типично от 1 до 5 дозировок в сутки. В общем, лечение начинают с меньших дозировок, которые меньше, чем оптимальная доза соединения. Затем дозировка увеличивается маленькими приращениями, пока не достигается оптимальный эффект для индивидуального пациента. Обычный специалист в лечении описанных здесь заболеваний, без чрезмерного экспериментирования и полагаясь на личные знания, опыт и раскрытия данной заявки, сможет установить терапевтически эффективное количество соединений по настоящему изобретению для данного заболевания и пациента.

В воплощениях изобретения активное соединение или соль можно вводить в комбинации с другим противовирусным агентом, таким как рибавирин, нуклеозидный ингибитор полимеразы HCV, другой ненуклеозидный ингибитор полимеразы HCV или ингибитор протеазы HCV. При введении активного соединения или его производного, или соли в комбинации с другим противовирусным агентом, активность может увеличиваться по сравнению с родительским соединением. Когда лечение представляет собой комбинированную терапию, такое введение может быть сопутствующим или последовательным относительно введения нуклеозидных производных. Таким образом, термин «сопутствующее введение» в том виде, как он здесь используется, включает введение агентов в то же самое или в разное время. Введение двух или более чем двух агентов в то же самое время может достигаться посредством одного препарата, содержащего два или более чем два активных ингредиента, или по существу одновременным введением двух или более чем двух лекарственных форм с одним активным агентом.

Будет понятно, что приведенные здесь ссылки на лечение распространяются на профилактику, а также на лечение существующих условий. Кроме того, термин «лечение» инфекции HCV в том виде, как он здесь используется, также включает лечение или профилактику заболевания или состояния, ассоциированного с или опосредованного инфекцией HCV, или его клинических симптомов.

Термин «терапевтически эффективное количество» в том виде, как он здесь используется, означает количество, требующееся для ослабления симптомов заболевания, у индивидуума. Доза будет корректироваться в каждом конкретном случае относительно индивидуальных требований. Данная дозировка может варьировать в широких пределах, в зависимости от многочисленных факторов, таких как тяжесть заболевания, подлежащего лечению, возраст и общее состояние здоровья пациента, другие лекарственные средства, которыми лечат пациента, путь и форма введения, и предпочтения и опыт участвующего врача. Для перорального введения в монотерапии и/или в комбинированной терапии должна быть подходящей суточная дозировка от примерно 0,01 до примерно 1000 мг/кг массы тела в сутки. Предпочтительная суточная дозировка составляет от примерно 0,1 до примерно 500 мг/кг массы тела, более предпочтительно от 0,1 до примерно 100 мг/кг массы тела и наиболее предпочтительно от 1,0 до примерно 10 мг/кг массы тела в сутки. Таким образом, для введения человеку, весящему 70 кг, интервал дозировки был бы от примерно 7 мг до 0,7 г в сутки. Суточную дозировку можно вводить в виде одиночной дозировки или в раздельных дозировках, типично от 1 до 5 дозировок в сутки. В общем, лечение начинают с меньших дозировок, которые меньше, чем оптимальная доза соединения. Затем дозировка увеличивается маленькими приращениями, пока не достигается оптимальный эффект для индивидуального пациента. Обычный специалист в лечении описанных здесь заболеваний, без чрезмерного экспериментирования и полагаясь на личные знания, опыт и раскрытия данной заявки, сможет установить терапевтически эффективное количество соединений по настоящему изобретению для данного заболевания и пациента.

Терапевтически эффективное количество соединения по настоящему изобретению и возможно одного или более чем одного дополнительного противовирусного агента представляет собой эффективное количество для снижения вирусной нагрузки или достижения длительного ответа вируса на терапию. Полезные индикаторы длительного ответа, помимо вирусной нагрузки, включают, но не ограничиваются фиброзом печени, повышением сывороточных уровней трансаминазы и некровоспалительной активности в печени. Одним обычным примером маркера, который подразумевается как примерный и неограничивающий, является сывороточная аланинтрансаминаза (ALT), которую измеряют стандартными клиническими анализами. В некоторых воплощениях изобретения эффективной схемой лечения является схема, которая снижает уровни ALT до меньше, чем примерно 45 IU(международная единица)/мл сыворотки.

Модификация настоящих соединений для того, чтобы сделать их более растворимыми в воде или другом носителе, например, может легко осуществляться минорными модификациями (препарат в виде соли, этерификация и пр.), которые целиком находятся в пределах обычной квалификации в данной области. Также целиком в пределах обычной квалификации в данной области находится модификация пути введения и схемы дозировки конкретного соединения для того, чтобы управлять фармакокинетикой настоящих соединений для максимально полезного эффекта у пациентов.

Следующие примеры иллюстрируют получение и биологическую оценку соединений в пределах объема изобретения. Данные примеры и получения, которые следуют, приведены для того, чтобы дать возможность специалистам в данной области более четко понять и воплотить на практике настоящее изобретение. Они не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения, но просто как иллюстративные и представляющие его.

Пример 1

Способ А: получение 2',3',5'-триацилнуклеозидных производных

Сложный 3,4-диацетокси-5-(4-амино-2-оксо-2Н-пиримидин-1-ил)-тетрагидро-фуран-2-илметиловый эфир уксусной кислоты (22)

К перемешиваемому раствору, содержащему 4'-азидоуридин, (0,330 г, 1,15 ммоль), пиридин (2 мл) и уксусный ангидрид (2 мл), добавляли DMAP (0,010 г, 0,08 ммоль). Через 12 ч реакционную смесь упаривали досуха при пониженном давлении. Остаток растворяли в дихлорметане и промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия, сушили над сульфатом магния и упаривали досуха с получением 0,42 г (88%) 2',3',5'-триацетокси-4'-азидоуридина (22: Р=СН₃, 1-4).

Сложный этиловый эфир (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2Н-пиримидин-1-ил)-4-этоксикарбонилокси-2-этоксикарбонилоксиметил-тетрагидро-фуран-3-ил-карбоновой кислоты (22 R=OEt) можно получать аналогично, за исключением того, что уксусный ангидрид заменяется зтилхлорформиатом.

Пример 2

Способ Б: получение 5'-ацилнуклеозидных производных

Сложный (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2Н-пиримидин-1-ил)-3,4-дигидрокси-тетрагидро-фуран-2-илметиловый эфир пропионовой кислоты (1-6)

250 мл круглодонную колбу, оснащенную магнитным стержнем для перемешивания, загружали 20 (5,94 г), винилпропионатом (15 мл) и THF (150 мл). Добавляли липазу В Candida antarctica (0,74 г, Sigma-Aldrich, рекомбинантная из Aspergillus oryzae, 5865 и(единица)/г), иммобилизированную на Immobead 150, и реакционную смесь нагревали до 60°С в атмосфере аргона. Через 2 суток добавляли дополнительное количество винилпропионата (6 мл) и фермента (1,11 г), наряду с 10 г 3 А сит. Через еще одни сутки реакционную смесь фильтровали для удаления иммобилизированного фермента и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали SiO₂ хроматографией, элюируя градиентом ЕtOАс/гексан (от 50% до 100% ЕtOАс). После удаления растворителя и сушки в сильном вакууме получали белую пену (4 г). Данное вещество (3,25 г) суспендировали в 3/1 гексаны/IPA и перемешивали 2 ч при Т комн. Образующееся кристаллическое вещество собирали фильтрованием и сушили в вакуумной печи при 75°С с получением 3,18 г 1-6: Т пл. 148-150°С.

Специалист в данной области поймет, что другая общая методика получения 5'-ацильных производных включает ацилирование 4'-С-азидо-2',3'-O-(1-метилэтилиден)-уридина (CASRN 690271-27-3) хлорангидридами и ангидридами кислот и последующее удаление изопропилиденовой защитной группы при мягких кислотных условиях, таких как HCI в водных спиртах. (J.A. Martin et al., WO2004/046159, опубликованная 3 июня 2004 года, которая тем самым включена посредством ссылки во всей ее полноте).

Пример 3

Сложный (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2Н-пиримидин-1-ил)-3,4-дигидрокси-тетрагидро-фуран-2-илметиловый эфир пропионовой кислоты (1-6) - альтернативная методика

3-Горлую круглодонную колбу, оснащенную барботером, мешалкой, термометром и охлаждающей ванной со льдом, загружали 24 (10 г, 30,7 ммоль, Экв.: 1,00, CASRN 139442-01-6), DMAP (376 мг, 3,07 ммоль, Экв.: 0,1), DIPEA (7,95 г, 10,7 мл, 61,5 ммоль, Экв.: 2,0), ацетонитрилом (47,2 г, 60,0 мл, Экв.: -). Суспензию перемешивали 0,5 ч, добавляли пропионилхлорид (3,05 г, 2,86 мл, 32,3 ммоль, Экв.: 1,05) при 0-10°С в течение 10 мин. Реакционная смесь становилась гомогенной и была нагрета до Т комн. Реакционную смесь распределяли между H₂O (30 мл) и ЕtOАс (50 мл), и органическую фазу промывали 2 н. HCl (2×30 мл), насыщ. водн. NaHCO₃ (20 мл), рассолом (10 мл), сушили, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением 15,2 г масла. Полученный таким образом продукт (5,37 г) растворяли в растворе IPA (25 мл), 6 н. водн. HCl (12 мл) и гидроксиламина гидрохлорида (0,8 г). Реакционную смесь перемешивали при Т комн. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч, распределяли между Н₂O (30 мл), DCM (50 мл). Органический слой последовательно промывали насыщ. водн. NаНСО₃ (30 мл), водой (10 мл), сушили, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток растирали с гептаном (30 мл) с получением 1,27 г 1-6 в виде пены.

Пример 4

Способ В: получение 2',3'-диацильных нуклеозидных производных

Сложный (2R,3R,4S,5R)-5-азидо-2-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2Н-пиримидин-1-ил)-5-гидроксиметил-4-пропионилокси-тетрагидро-фуран-3-иловый эфир пропионовой кислоты (1-1)

(2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2Н-пиримидин-1-ил)-3,4-бис-пропионилокси-тетрагидро-фуран-2-ил-метилпропионат (28) получают, как описано в примере 1, за исключением того, что уксусный ангидрид заменяют пропионилхлоридом или пропионовым ангидридом.

К раствору 28 (4,42 г), растворенного в горячем (около 40°С) МТВЕ (20 мл) добавляли фосфатный буфер (27 мл, рН=6,5) и рассол (0,5 мл). Добавляли раствор липолазы (5 мл), и реакционную смесь перемешивали при 30-35°С в течение примерно 3 ч. Обнаружили, что скорость гидролиза является довольно низкой. Добавляли дополнительное количество раствора фермента (6 мл), и реакционную смесь перемешивали при 30-35°С в течение 3 суток с достижением примерно 95%-ного превращения. Реакционную смесь экстрагировали ЕtOАс (30 мл). Во время экстракции образовалась эмульсия, которую растворяли, добавлением метанола (примерно 10 мл). Органический экстракт промывали рассолом и водой и затем упаривали досуха до 5,7 г масла (89%-ный выход неочищенного продукта, примерно 94% дипропионата при определении ВЭЖХ с нормированием по площади). Вязкое масло дополнительно сушили в вакуумной печи примерно при 50°С с получением пены. Неочищенный продукт дополнительно очищали SiO₂ хроматографией, элюируя градиентом MeOH/DCM с получением 1-1 в виде восковидного твердого вещества, которое кристаллизовалось при стоянии.

Пример 5

Сложный (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2Н-пиримидин-1-ил)-3,4-дигидрокси-тетрагидро-фуран-2-илметиловый эфир (R)-2-амино-3-метил-масляной кислоты

Стадия 1. К перемешиваемому раствору, содержащему 24 (1,00 г, 3,07 ммоль), Вос-(L)-валин (6,14 ммоль) и EDCl (6,14 ммоль) в DMF (20 мл) добавляют DMAP (3,07 ммоль). Образующийся раствор перемешивают в атмосфере азота и при Т комн. Через 12 ч реакционную смесь упаривают досуха при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают SiO₂ хроматографией, элюируя градиентом ЕtOАс/гексан с получением 24 (R=CH(NHBoc)CHMe₂).

Стадия 2. Воc и ацетонидные защитные группы могут быть удалены в растворе TFA и DCM или НСl и диоксана или метанола.

Пример 6

Фармакокинетика в плазме

Для определения плазматических уровней 4-амино-1-((2R,3R,4S,5R)-5-азидо-3,4-дигидрокси-5-гидроксиметил-тетрагидро-фуран-2-ил)-1Н-пиримидин-2-она (II) после введения одной пероральной дозы 5 мг/кг пролекарства II использовали фармакокинетические методики. Препарат представляет собой раствор/суспензию, содержащую 0,0176 ммоль пролекарства в 5 мл подходящего носителя.

Трем самцам яванского макака (6-9 кг) устанавливали не натощак катетер в подкожную вену ноги или плечевой катетер для облегчения отбора крови. Все время на протяжении исследования будет разрешен свободный доступ к пище и воде. В сутки исследования у каждой обезьяны отбирали пробу крови (2-3 мл) до дозы. Обезьянам дозировали 1 мл/кг раствор дозы посредством перорального искусственного питания. В каждый из следующих моментов времени (0,25; 0,5; 1; 3; 5; 7; 10; 24; 32 и 48 часов) после дозировки в литиевые пробирки, покрытые гепарином, будут отобраны приблизительно 0,5 мл крови. Кровь центрифугировали с получением плазмы, которую замораживали до анализа.

Концентрацию Ia (R¹-R⁴=Н) в каждом образце плазмы определяли посредством анализа ЖХ-МС. Стандартные кривые получали в контрольной плазме обезьян. AUC представляет собой площадь под графиком концентрации относительно всего времени, которая описывает концентрацию лекарственного средства в большом круге кровообращения как функцию времени (L.Z. Benet, D.L. Kroetz and L.В. Sheiner Pharmacokinetics in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, J.G. Hardman & L.E. Limbird Eds., 9^th Edition, McGraw Hill, New York, p 17-23). C_max представляет собой пиковую концентрацию, которая обнаруживается.

№ соед.	Доза2 мг/кг	4'-AU
Cmax (мкг/мл)	AUC (ч*мкг/мл)
4'-AU1	10	3,1	43

1-1	*	9,2	101
1-3	*	5,0	75
4'-AU	300	22,0	328
1-1	*	85,7	1420
1-3	*	55,5	1020
1.4-азидоуридин
* Доза 1-1 и 1-3 представляет собой молярный эквивалент дозы 4'AU

Пример 7

Активность РНК-полимеразы NS5B HCV

Нуклеозидмонофосфаты можно получать согласно общей методике, описанной М. Yoshikawa et al., Tetrahedron Lett. 1967 50:5065-5068. Также был сделан обзор способов получения нуклеозидтрифосфатов (К. Burgess and Dan Cook, Chem. Rev.2000 100:2047).

Ферментативную активность полимеразы HCV (NS5B570n-Con1) измеряли как включение радиоактивно меченых нукпеотидмонофосфатов в нерастворимые кислотами РНК-продукты. Невключенный радиоактивно меченый субстрат удаляли фильтрованием, и на промытую и высушенную фильтровальную пластинку, содержащую радиоактивно меченый РНК-продукт, добавляли сцинтиллятор. Количество РНК-продукта, генерированного NS5B570n-Con1 в конце реакции, было прямо пропорциональным количеству света, испускаемого сцинтиллятором.

Полимераза HCV, используемая в анализе ферментативной активности, представляет собой 21-аминокислотную С-концевую делецию полноразмерной полимеразы HCV, полученной из штамма Соn1 HCV, генотип 1b (номер доступа GenBank AJ242654) (NS5B570n-Con1). NS5B570n-Con1 субклонировали ниже по течению от промотора Т7 плазмидной экспрессионной конструкции рЕТ17b и трансформировали в штамм BL21(DE3) pLysS E. соli для экспрессии белка. Одиночную колонию использовали в качестве исходного инокулята 10л культуры в среде LB, дополненной 100 мкг/мл ампициллина при 37°С. Экспрессию белка индуцировали добавлением 0,25 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG), когда оптическая плотность культуры при 600 нМ составляла 0,8. Индукцию экспрессии белка проводили при 30°С в течение 16 ч, после которой клетки собирали центрифугированием. NS5B570n-Con1 очищали до гомогенности с использованием протокола очистки с тремя колонками, включающего последовательную колоночную хроматографию на смолах Ni-NTA, SP-Sepharose HP и Superdex 75.

Ферментативные реакции в присутствии РНК-матрицы cIRES (смотрите раздел 0004) содержали 20 нМ РНК cIRES, 20 нМ фермент NS5B570n-Con1, 0,5 мкКи (микрокюри) тритированного UTP (Perkin Elmer, каталожный № TRK-412; удельная активность: 30-60 Ки/ммоль), по 1 мкМ каждого из АТР, СТР и GTP, 40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 40 мМ NaCI, 4 мМ DTT (дитиотрейтол), 4 мМ MgCl₂, 5 мкл соединения, последовательно разведенного в DMSO, и воду, не содержащую нуклеазы, для доведения конечного объема реакции до 50 мкл. Ферментативные реакции в присутствии матрицы поли А РНК (смотрите раздел 0004) содержали 20 нМ предварительно смешанного поли А:олиго(rU)16 (смотрите раздел 0004), 20 нМ фермента NS5B570n-Con1, 1 мкКи тритированного UTP (Perkin Elmer, каталожный № TRK-412; удельная активность: 30-60 Ки/ммоль), 40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 40 мМ NaCl, 4 мМ DTT (дитиотрейтол), 4 мМ MgCl₂, 5 мкл соединения, последовательно разведенного в DMSO, и воду, не содержащую нуклеазы, для доведения конечного объема реакции до 50 мкл. Реакционные смеси создавали в 96-луночных фильтровальных планшетах (кат. № MADVNOB, Millipore Co.) и инкубировали в течение 2 ч при 30°С. Реакции останавливали добавлением 10% (об./об.) в конечном объеме трихлоруксусной кислоты и инкубировали в течение 40 мин при 4°С. Реакционные смеси фильтровали, промывали 8 реакционными объемами 10% (об./об.) трихлоруксусной кислоты, 4 реакционными объемами 70% (об./об.) этанола, сушили на воздухе и в каждую реакционную лунку добавляли 25 мкл сцинтиллятора (Microscint 20, Perkin-Elmer).

Для анализа описанных здесь соединений использовали две РНК-матрицы. РНК-матрица cIRES имела длину 377 нуклеотидов и состояла из частичной комплементарной последовательности (36 нуклеотидов) корового белка, с последующим 341 нуклеотидом комплементарной последовательности участка внутренней посадки рибосомы. Матрица - поли А РНК (GE Amersham, каталожный номер 27-4110) представляла собой гомополимерную РНК, подвергнутую предварительному отжигу с праймером олиго(rU)16 в молярном соотношении 3 к 1 (праймер-матрица).

Количество света, испускаемого от сцинтиллятора, превращали в импульсы в минуту (СРМ) на планшет-ридере Topcount® (Perkin-Elmer, интервал энергии: низкий, режим эффективности: нормальный, время счета: 1 мин, вычитание фона: нет, снижение помех: выключено).

Данные анализировали в Excel® (Microsoft®) и ActivityBase® (idbs®). Для определения фонового сигнала, который вычитали из ферментативных реакций, использовали реакционную смесь в отсутствие фермента. Реакции позитивного контроля проводили в отсутствие соединения, активность которых с поправкой на фон была принята за 100% полимеразной активности. Все данные выражали как процентную долю от позитивного контроля. Концентрацию соединения, при которой скорость синтеза РНК, катализируемого ферментом, снижалась на 50% (IC₅₀), рассчитывали посредством аппроксимации уравнения (i)

$$Y=\%Min+\frac{\left(\%Max-\%Min\right)}{\left[1+\frac{X}{\left(I{C}_{50}\right)S}\right]}\left(i\right)$$

к данным, где "Y" соответствует относительной активности фермента (в %), "%Min" представляет собой остаточную относительную активность при насыщающей концентрации соединения, "%Мах" представляет собой относительную максимальную ферментативную активность, "X" соответствует концентрации соединения, и "S" представляет собой коэффициент Хилла (или наклон).

Экспериментальное значение для IC₅₀ 4'-AU трифосфата равно 0,46±0,088 мкМ, которое является аналогичным (значению для) 4'-АС-трифосфата, которое равно 29±0,13 мкМ.

Пример 8

Образование 4АU-триФосФата в человеческих гепатоцитах, одноядерных клетках периферической крови (РВМС) и клетках костного мозга (ВМС). Анализ поглощения и фосфорилирования нуклеозидного аналога 4AU в первичных человеческих гепатоцитах проводили так же, как было опубликовано ранее (Ма, Н. et al. J. Вiоl. Chem. 2007, 282:29812-29820). Свежие человеческие гепатоциты высаживали на чашки и инкубировали с 4AU, меченным ³H в течение разных промежутков времени. Во время сбора клеток среду культуры клеток аспирировали, и клетки один раз промывали холодным фосфатно-солевым буферным раствором. Клетки соскабливали в 1 мл предварительно охлажденного 60%-го (об./об.) метанола, содержащего 10 мМ EDTA, и экстрагировали в метаноле в течение 24 ч при -20°С. Экстрагированные образцы затем центрифугировали при 10000 × g в течение 15 мин для удаления обломков клеток. Супернатант переносили в новые пробирки и упаривали в токе разреженного воздуха при комнатной температуре. Высушенные осадки клеточных экстрактов растворяли в Н₂О. Перед анализом ВЭЖХ в образцы клеточных экстрактов вводили немеченые контрольные стандарты 4AU и моно-, ди- и трифосфатных производных 4AU.

Поглощение и фосфорилирование 4AU в человеческих одноядерных клетках периферической крови (РВМС) и клетках костного мозга (ВМС) проводили инкубированием клеточных суспензий РВМС или ВМС в концентрациях 2-4×10⁵ клеток/мл или 5-6 10⁵ кпеток/мл соответственно с ³H-RO1080713 в течение разных периодов времени. Среды культуры клеток, содержащие ³H-RO1080713, пополняли каждые 24 ч. Образцы в двойной повторности, эквивалентные 2×10⁶ жизнеспособных клеток на момент времени, отбирали в конце экспериментов, осаждали центрифугированием в течение 5 мин и промывали один раз холодным PBS (фосфатно-солевой буферный раствор). Конечные клеточные осадки быстро замораживали на сухом льду и хранили при -80°С до экстракции. Экстракцию клеточных осадков проводили так же, как и экстракцию первичных гепатоцитов.

Фосфорилированные производные 4AU разделяли ионообменной ВЭЖХ с (использованием) колонки Whatman Partisil 10 SAX (4,6×250 мм), связанной с радиометрическим детектором ((3-RAM, IN/US Systems, Inc.). Градиент подвижной фазы линейно изменялся от 99% буфера А (Н₂О) и 1% буфера Б (0,5 М КН₂РO₄+0,8 М KCl) до 100% буфера Б от 4 до 16 минуты. 100%-ный буфер Б прогоняли от 16 минуты до 26 минуты и производили замену обратно на 100% А за 1 минуту. Буфер А прогоняли до 32 минут. Скорость тока на протяжении всего 32-минутного прогона была постоянной - 1 мл/мин. Использовали соотношение 5:1 Ultima-Flo™ АР (PerkinElmer) к элюенту колонки.

Производные RO 1080713 в образцах идентифицировали сравнением времен удерживания радиоактивных метаболитов в радиохроматограмме со временами удерживания нерадиоактивных контрольных стандартов, введенных в образцы.

Фиг.3 графически иллюстрирует эффективное фосфорилирование 4'-AU, которое приблизительно в 10 раз больше, чем (фосфорилирование) 4'-АС.

Пример 9

Фармацевтические композиции рассматриваемых Соединений для введения посредством нескольких путей были получены, как описано в данном Примере.

Композиция для перорального введения (А)

Ингредиент	% масс./масс.
Активный ингредиент	20,0%

Лактоза	79,5%
Стеарат магния	0,5%

Ингредиенты смешивают и распределяют в капсулы, содержащие примерно 100 мг каждого из них; одна капсула была бы приблизительно равна полной суточной дозировке.

Композиция для перорального введения (Б)

Ингредиент	% масс./масс.
Активный ингредиент	20,0%
Стеарат магния	0,5%
Натрия кроскармеллоза	2,0%
Лактоза	76,5%
PVP (поливинилпирролидон)	1,0%

Ингредиенты объединяют и гранулируют с использованием растворителя, такого как метанол. Препарат затем сушат и формуют в таблетки (содержащие примерно 20 мг активного соединения) подходящей таблетировочной машиной.

Композиция для перорального введения (В)

Ингредиент	% масс./масс.
Активное соединение	1,0 г
Фумаровая кислота	0,5 г
Хлорид натрия	2,0 г
Метилпарабен	0,15 г
Пропилпарабен	0,05 г
Гранулированный сахар	25,5 г
Сорбит (70%-ный раствор)	12,85 г
Вигум К (Vanderbilt Co.)	1,0 г
Корригент	0,035 мл
Красители	0,5 мг
Дистиллированная вода	сколько нужно до 100 мл

Ингредиенты смешивают с образованием суспензии для перорального введения.

Парентеральный препарат(Г)

Ингредиент	% масс./масс.
Активный ингредиент	0,25 г

Хлорид натрия	сколько нужно для получения изотоничного раствора
Вода для инъекции до	100 мл

Активный ингредиент растворяют в части воды для инъекции. Затем добавляют достаточное количество хлорида натрия с перемешиванием для того, чтобы сделать раствор изотоничным. Раствор доводят до (требующейся) массы остатком воды для инъекции, фильтруют через 0,2 мкм мембранный фильтр и упаковывают в стерильных условиях.

Для реализации изобретения в его разных формах можно использовать характеристики, раскрытые в приведенном выше описании или в следующей формуле изобретения, выраженные в их конкретных формах или в терминах средства для осуществления раскрытой функции или способа, или процесса для достижения раскрытого результата, сообразно обстоятельствам, раздельно или в любой комбинации таких характеристик.

Приведенное выше изобретение было описано с некоторыми подробностями в качестве иллюстрации и примера для целей ясности и понимания. Для специалиста в данной области будет очевидно, что в пределах объема приложенной формулы изобретения можно практиковать изменения и модификации. Следовательно, следует понимать, что приведенное выше описание предназначено для того, чтобы быть иллюстративным, а не ограничивающим. Объем изобретения, следовательно, должен определяться не ссылкой на приведенное выше описание, но, вместо этого, должен определяться ссылкой на следующую приложенную формулу изобретения, наряду с полным объемом эквивалентов, которым такая формула дает право.

Патенты, опубликованные заявки и научная литература, на которые здесь дается ссылка, устанавливают знание специалистов в данной области и являются тем самым включенными посредством ссылки во всей их полноте в той же самой степени, как если бы каждая была конкретно и индивидуально указана как включенная посредством ссылки. Любой конфликт между любой процитированной здесь ссылкой и конкретными идеями данного описания изобретения должен быть разрешен в пользу последнего. Подобным образом, любой конфликт между понятным в данной области определением слова или фразы и определением слова или фразы, как конкретно приведено в данном описании изобретения, должен быть разрешен в пользу последнего.

1. Соединение согласно формуле I

где
R¹ и R² в каждом случае независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, С_1-6алкилкарбонила;
R³ представляет собой водород, С_1-6алкилкарбонил, или
его фармацевтически приемлемая соль при условии, что по меньшей мере один из R¹, R² и R³ отличается от водорода, и при условии, что соединение согласно формуле I не является сложным (2R,3R,4S,5R)-4-ацетокси-5-ацетоксиметил-5-азидо-2-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2Н-пиримидин-1-ил)-тетрагидро-фуран-3-иловым эфиром уксусной кислоты.

2. Соединение по п. 1, где R¹, R² и R³ представляют собой С_1-6алкилкарбонил.

3. Соединение по п. 1, где R¹ и R² представляют собой С_1-6алкилкарбонил, и R³ представляет собой водород.

4. Соединение по п. 1, где R¹ и R² представляют собой водород, и R³ представляет собой С_1-6алкилкарбонил.

5. Соединение по п. 1, выбранное из группы, состоящей из:
сложного (2R,3R,4S,5R)-5-азидо-2-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2H-пиримидин-1-ил)-5-гидроксиметил-4-пропионилокси-тетрагидро-фуран-3-илового эфира пропионовой кислоты;
сложного (2R,3R,4S,5R)-5-азидо-2-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2H-пиримидин-1-ил)-4-изобутирилокси-5-изобутирилоксиметил-тетрагидро-фуран-3-илового эфира изомасляной кислоты;
сложного (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2H-пиримидин-1-ил)-3,4-бис-пропионилокси-тетрагидро-фуран-2-илметилового эфира пропионовой кислоты;
сложного (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2H-пиримидин-1-ил)-3,4-бис-пентаноилокси-тетрагидро-фуран-2-илметилового эфира пентановой кислоты; и
сложного (2R,3S,4R,5R)-2-азидо-5-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2H-пиримидин-1-ил)-3,4-дигидрокси-тетрагидро-фуран-2-илметилового эфира пропионовой кислоты.

6. Способ для лечения инфекции вирусом гепатита С (HCV), включающий лечение пациента, нуждающегося в этом, терапевтически эффективным количеством соединения по п. 1.

7. Способ по п. 6, где R¹, R² и R³ представляют собой С_1-6алкилкарбонил.

8. Способ по п. 6, где R¹ и R² представляют собой С_1-6алкилкарбонил, и R³ представляет собой водород.

9. Способ по п. 6, где R¹ и R² представляют собой водород, и R³ представляет собой C_1-6-алкилкарбонил.

10. Применение соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как определено в п. 1, для лечения инфекции HCV.

11. Применение соединения согласно формуле I, где R¹, R² и R³ являются такими, как определено в п. 1, для изготовления лекарственного средства для лечения инфекции HCV.

12. Фармацевтическая композиция для лечения инфекции HCV, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п. 1, смешанного с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.