Способ получения бактериородопсина

Авторы патента:

Владельцы патента RU 2558237:

Зарудный Владимир Семенович (RU)
Муха Михаил Сергеевич (RU)
Тюрин Сергей Ананьевич (RU)
Погорелов Олег Вадимович (RU)
Гниденко Лев Викторович (RU)
Рассказов Владимир Владимирович (RU)

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Описан способ получения бактериородопсина. Способ включает в себя выращивание микробной массы в ферментере объемом 1200 л в течение 7 суток. Отделение и разрушение биомассы на модуле-сепараторе. Отделение осадка центрифугированием при 10000 g 15 мин. Полученный супернатант центрифугировали при 50000 g 55 мин, а супернатант отбрасывали. К полученному осадку приливали дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендировали в воде 3-4 раза. После чего наносили на хроматографическую колонку с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля. После элюции отбирали образцы с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5. Изобретение позволяет получать высокий выход бактериородопсина, в том числе за счет использования штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается получения белка, бактериородопсина, путем микробиологического синтеза.

Область возможного применения бактериородопсина поразительна по своему разнообразию. Она включает двухстороннюю голографическую память, ультрабыстрое оперативное запоминающее устройство, пространственную модуляцию света, нелинейные оптические фильтры, распознавательные системы, высококонтрастные дисплеи, оптические переключатели и пикосекундные детекторы. Бактериородопсин находит применение в производстве материалов, которые предохраняют ценные бумаги от подделок, а также в качестве антиоксиданта в медицине, фармацевтике, косметологии и сельском хозяйстве в качестве стимулятора роста растений [1-10].

Известен препарат для стимуляции роста и развития на основе бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025, содержащий бактериородопсин в количестве от 10^-9 до 10^-6 М. [1].

Известен препарат для стимуляции роста и развития растений на основе штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025, содержащий бактериородопсин, полученный путем выращивания штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 в течение 6 сут, после чего биомассу отделяют центрифугированием при 7000 g и инкубируют в дистиллированной воде, осадок отбрасывают, а полученный супернатант центрифугируют при 50000 g, супернатант отбрасывают, а к полученному осадку приливают дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендируют несколько раз до тех пор, пока в суспендируемом осадке не восстановится отношение оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀\D₅₇₀) менее 2,5, далее супернатант стандартизуют до концентрации бактериородопсина от 10^-9М до 10^-6М [2]. Данный способ является ближайшим аналогом заявленного изобретения.

Задача заявляемого изобретения - способ, позволяющий получить высокий выход бактериородопсина.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение выхода бактериородопсина.

Технический результат достигается за счет использования штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 и любого силикагеля. Изобретение иллюстрируется следующим примером.

ПРИМЕР. Способ получения бактериородопсина.

Штамм ВКПМ В-11850, а также используемый в качестве контроля штамм ВКПМ В-9025 (прототип) выращивали в ферментере объемом 1200 л (DeDietrich, Germany) в объеме среды культивирования 500 л. Для выращивания использовали среду следующего состава (мас. %): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, КСl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, СаСl₂ - 0,02, вода - остальное, рН среды -7,2-7,4. В ферментере поддерживали температурный режим 36,8-37,2°С. Аэрация во время ферментации - 30 л/мин. Исследуемые штаммы выращивали при освещении люминесцентными лампами дневного света (L 18 W/530, «Osram», PRC) 7 суток.

По окончании ферментации проводили отделение и разрушение биомассы на модуле-сепараторе Clara 20 (Альфа Лаваль Поток, Россия). Процесс на модуле-сепараторе проводили при скорости подачи ферментационной жидкости 240 литров/час и вращении барабана 9512 об/мин.

Осадок отделяли центрифугированием при 10000 g 15 мин и отбрасывали, а полученный супернатант центрифугировали при 50000 g 55 мин, супернатант отбрасывали, а к полученному осадку приливали дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендировали 3-4 раза, после чего наносили на хроматографическую колонку с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля [10]. После элюции отбирали образцы с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀\D₅₇₀) менее 2,5. В отобранных образцах определяли количество бактериородопсина при длине волны 570 нм. Концентрацию бактериородопсина определяли по следующей формуле:

С=D·M_r·V_p-pa·V_кюв/E_бр·V_пробы

Где:

D - оптическая плотность раствора при длине волны 570 нм;

М_r - молекулярная масса бактериородопсина (26700);

V_p-pa - общий объем раствора бактериородопсина;

V_кюв - объем раствора бактериородопсина в спектрофотометрической кювете;

Е_бр - коэффициент молярного поглощения бактериородопсина (63000 М^-1 см^-1);

V_пробы - объем пробы бактериородопсина в спектрофотометрической кювете.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1
Исследуемые штаммы	Количество бактериородопсина (мг/мл)
ВКПМ В-9025	30
ВКПМ В-11850	45

Из приведенных в таблице 1 результатов видно, что заявляемый способ получения бактериородопсина с использования штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 дает более высокий уровень бактериородопсина по сравнению со способом, основанным на применении штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025.

Источники информации

1. Патент РФ N 2307506.

2. Патент РФ N2416634.

3. Skladnev D., Tyurin S., Gricevich J. "Plant-growth-promoting effects of biomass lysate of selected agronomically important strain Halobacterium salinarum." Abst. XI International Congress PHYTOPHARM-2007 "Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin" Leiden, The Netherlands, 2007 - P. 18.

4. Тюрин C.A., Складнев Д.А., Ходонов А.А. "Ретиналь бактериородопсина как иммобилизованный фитогормон" Тезисы стендовых сообщений. III Российский симпозиум «Белки и пептиды». - Пущино. - 2007. - С. 94.

5. Tyurin S.A., Khodonov А.А., Skladnev D.A.«Unfolded bacteriorhodopsin become a phytohormone» Abstracts 3rd International Meeting "Molecular Simulation Studies in Material and Biological Sciences", September 10-12, JINR, Dubna, Russia, 2008 - P.36,37.

6. С.А.Тюрин, Ю.Г. Грицевич, Д.А. Складнев, А.А. Ходонов "Бактериородопсин как стимулятор роста и развития растений", Агрохимия - 2009. - №.6. - С. 32-39.

7. Коротков А.В., Прусакова Л.Д., Фесенко А.Н., Грицевич Ю.Г., Тюрин С.А. "Способ выращивания гречихи", Объединенный научный журнал - 2010. - №3. - С.66-69.

8. Alexander KOROTKOV, Alexey FESENKO, Sergey TYURIN, Yuliy GRITSEVICH, Lidiya PRUSAKOVA «Effect of Bacteriorhodopsin on the growth and development of buckwheat» Advances in buckwheat research. Proceedings of the 11th International Symposium on Buckwheat. Orel, Russia, 2010, P. 670-674.

9. А.В. Коротков, Л.Д. Прусакова, С.Л. Белопухов, А.Н. Фесенко, С.А. Тюрин, Ю.Г. Грицевич "Влияние люрастима и бактериородопсина на урожай и качество зерна гречихи", Известия ТСХА, 2011 год, выпуск 1, С. 118-123.

10. Остерман Л.А. «Хроматография белков и нуклеиновых кислот». Издательство «Наука», Москва, 1985 год, С. 58-62.

Способ получения бактериородопсина, включающий выращивание в ферментере объемом 1200 л в течение 7 суток штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850, отделение и разрушение биомассы на модуле-сепараторе, отделение осадка центрифугированием при 10000 g 15 мин, центрифугирование полученного супернатанта при 50000 g 55 мин, обработку полученного осадка дистиллированной водой в том же объеме 3-4 раза и хроматографирование на колонке с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля, элюцию и отбор образцов с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 - продуцент бактериородопсина.

Штамм бактерий halobacterium salinarum - продуцент бактериородопсина // 2558230

Получен штамм бактерий Halobacterium salinarum D96N ВКПМ В-11953 - продуцент бактериородопсина, значительно превосходящий по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) как ближайший аналог, так и другие, выбранные в качестве контролей штаммы в различных условиях культивирования.

Ферментационная среда и способ получения рекомбинантных белков // 2556120

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ферментационной среде и способу получения рекомбинатных белков с использованием данной среды. Ферментационная среда для получения рекомбинантных белков, выбранных из группы, включающей Г-КСФ, стрептокиназу и липазу, с использованием микроорганизмов, выбранных из группы, включающей: E.

Композиция и способ для контроля численности моллюсков // 2549697

Изобретения относятся к области биотехнологии. Предложены композиция и способ для контроля численности моллюсков классов Gastropoda и Bivalvia.

Соединение а-87774 или его соль, способ получения соединения и его соли и агрохимикат, содержащий соединение или его соль в качестве активного ингредиента // 2545403

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены соединения A-87774, представленные соединениями A-87774-1, A-87774-2, A-87774-3 или их солью, способ получения соединений A-87774, штамм Streptomyces sp.

Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, вовлеченный в биосинтез пирипиропена а, вектор и клетка-хозяин содержащие такой полинуклеотид и способ получения предшественника пирипиропена а (варианты) // 2540017

Представленные изобретения касаются выделенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, вовлеченный в биосинтез пирипиропена А, вектора и клетки-хозяина, включающих такой полипептид, и способов получения предшественников пирипиропена А, включающих культивирование клетки-хозяина.

Способ получения бруцеллезного l-антигена // 2533811

Изобретение касается способа получения бруцеллезного L-антигена. Представленный способ включает стадии.

Штамм bacillus lentus - продуцент бактериоциноподобной субстанции антимикробного действия и способ получения бактериоциноподобной субстанции // 2530552

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм Bacillus lentus «ГКПМ - Оболенск» B-7150 - продуцент бактериоциноподобной субстанции широкого спектра антимикробного действия, имеющей молекулярную массу по данным SDS-PAGE около 4 кДа.

Изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным // 2528859

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штамм Enterococcus faecium 8G-1 (NRRL В-50173), штамм Enterococcus faecium 8G-73 (NRRL B-50172) и штамм Bacillus pumilus 8G-134 (NRRL B-50174), обеспечивающие улучшение состояния здоровья жвачных животных.

Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк // 2528251

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются слитого белка для специфического ингибирования свертывания крови, экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей такой слитый белок, бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной такой ДНК, и способу получения слитого белка.

Способ получения бактериородопсина // 2563349

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в производстве физиологически активных соединений. Способ получения бактериородопсина предусматривает выращивание в ферментере в течение шести суток штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 с последующим отделением биомассы центрифугированием и разрушением ее при инкубации в дистиллированной воде в течение ночи при постоянном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием с получением супернатанта. Полученный супернатант центрифугируют и отбрасывают. К полученному осадку приливают дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендируют в воде 3-4 раза. После чего осадок наносят на хроматографическую колонку с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля. После элюции отбирают образцы с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D280\D570) менее 2,5. Изобретение позволяет повысить выход бактериородопсина. 1 табл., 1 пр.

Штамм бактерий escherichia coli - продуцент белка теплового шока 70 и способ получения препарата белка теплового шока человека // 2564120

Изобретения касаются штамма бактерий Escherichia coli-продуцента белка теплового шока (БТШ70) и способа получения такого белка. Охарактеризованный штамм депонирован 28.11.2012 во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Гос-НИИГенетика под №В-11388. Предложенный способ включает в себя культивирование рекомбинантного штамма-продуцента, выделение из бактериальной биомассы рекомбинантного белка, очистку его от примесей бактериальных белков с использованием в качестве штамма-продуцента штамма Escherichia coli BB 1553, трансформированного векторной плазмидой pMSHsp70. Выделение белка проводят неоднократным замораживанием-оттаиванием клеток и обработкой полученной суспензии последовательно раствором ДНК-зы и раствором хлорида магния с последующим центрифугированием белоксодержащего раствора и хроматографической очисткой супернатаната. Представленные изобретения позволяют получать белок БТШ70 с высоким выходом и высокой чистоты с последующей возможностью его использования для получения лекарственного препарата. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

Биоклей // 2574631

Изобретение относится к области клеящих веществ на основе культуральной жидкости микробиологического производства ксантана и может быть использовано в различных областях науки и техники, предпочтительно в деревообрабатывающей промышленности. Биоклей содержит жидкое стекло, хлорид калия, наполнитель, спирт этиловый ректификат и культуральную жидкость производства ксантана на субстрате из низкосортной древесины при общем содержании ксантана в культуральной жидкости не менее 4 мас.%. Технический результат, достигаемый при реализации разработанного состава клеящего вещества, состоит в повышении таких технологических характеристик клеевого слоя как сохранение стандартным раствором клея вязкотекучего состояния, сохранение состояния плотного эластичного студня, образованного стандартным ратвором клея, прочность склеивания древесины при сухом испытании. 5 з.п. ф-лы.

Способ получения биогенного сероводорода // 2577114

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения биогенного сероводорода. Способ включает добавление в питательную среду микроорганизмов и серы в качестве акцептора электронов. В качестве микроорганизмов используют сероредуцирующие анаэробные бактерии Desulfurella acetivorans, Desulfurella kamchatkensis, Desulfurella auxotro, а в качестве донора электронов используют уксусную кислоту. Подачу уксусной кислоты в биореактор осуществляют при достижении значения pH>5,0, где загрузка реагентов в биореактор в сутки составляет: серы - 2,5 г/л, донора электронов - уксусной кислоты - 0,23 г/л. Способ осуществляют при температуре от 50 до 55°C и при pH=4,0-7,0, а гидравлическое время удерживания жидкой среды составляет 30 дней, после чего осуществляют обновление 20% питательной среды. Отгонку сероводорода из биореактора осуществляют при достижении ОВП максимального значения (-350)-(-380) мВ до критического значения (-250 мВ) либо непрерывно за счет циркуляции оборотного газа 3 м3/1 м3 пульпы с подпиткой свежим азотом 0,003 м3/ч. Изобретение обеспечивает повышение качества проведения процесса. 1 ил., 2 табл.

Способ и технологическая линия производства низина // 2585521

Группа изобретений относится к области производства низина. Предложен способ и технологическая линия микробиологического производства низина. Способ включает проведение культивирования продуцента низина в ферментере с использованием штамма-продуцента низина Lactococcus (Streptococcus) lactis с последующей экстракцией низина. В качестве компонентов питательной среды используют рассол после сушки молочной сыворотки, молочную сыворотку, ополоски, получаемые после мойки технологического оборудования на молочных предприятиях, а также мегатерин. Культивирование проводят с использованием автоматического pH-статирования и термостатирования, экстракцию низина проводят подкислением с последующим выделением низина центрифугированием. Технологическая линия содержит ферментёр со сферическим днищем и крышкой. Ферментёр снабжен барботером, рубашкой, мешалкой и системой автоматического pH-статирования и термостатирования. Входы ферментёра совмещены с системами подачи питательной среды и засевного материала, а выход по культуральной жидкости сообщен через блоки экстракции, центрифугирования, ультрафильтрации и нанофильтрации с блоком сушки препарата низин. Изобретения обеспечивают одновременно с получением низина утилизацию ранее не использованных отходов молочного производства. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 ил.

Макромолекулярный комплекс бактериального происхождения и его применение для предотвращения или лечения ревматоидного артрита // 2599422

Предложен бактериальный макромолекулярный комплекс для профилактики или лечения воспалительного ревматизма и остеоартрита. Комплекс продуцирован штаммом бактерий Bifidobacterium longum CNCM I-3994. Комплекс состоит из цепей, объединяющих липопротеин и олигосахарид. При этом липопротеин имеет молекулярную массу в интервале от 30 кДа до 60 кДа, а олигосахарид - меньше чем 15 кДа и предпочтительно меньше чем 10 кДа. Липопротеиновая компонента, состоящая из всех липопротеинов каждой цепи, составляет от 75 до 99%, предпочтительно от 80 до 98%, более предпочтительно от 85 до 95% по массе от общей массы комплекса, и олигосахаридная компонента, состоящая из всех олигосахаридов, объединенных с каждой из цепей, составляет от 1 до 25%, предпочтительно от 2 до 20% и более предпочтительно от 5 до 15% от общей массы комплекса. Аминокислотная последовательность липопротеина является SEQ ID 2. Сахариды, образующие олигосахаридную компоненту комплекса, выбраны из галактозы (Gal), N-ацетилгалактозамина (Gal Nac), глюкозы (Glc), N-ацетилглюкозамина (Glc Nac), рамнозы (Rham) и маннозы (Man) и смесей вышеперечисленного. Средняя массовая доля Gal составляет 5-20 мкг/мг комплекса, Man 1-10 мкг/мг комплекса, Glc 10-50 мкг/мг комплекса, Gal Nac 2-10 мкг/мг комплекса, Glc Nac 1-5 мкг/мг комплекса, Rham 1-5 мкг/мг комплекса. Липиды, составляющие липопротеиновую компоненту комплекса, выбраны из группы, состоящей из насыщенных жирных кислот длиной C14:0, C16:0 и C18:0 и их смесей. Предложены также фармацевтическая, пищевая и нутрицевтическая композиции на основе указанного комплекса. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 табл., 9 пр.

Способ получения наночастиц элементного аморфного селена // 2615461

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения наночастиц элементного аморфного селена. Способ включает внесение селенита натрия в культуру фототрофных бактерий Rhodobacter capsulatus В10 из расчета 5 мМ/л, инкубирование культуры с селенитом, отделение селена от культуральной среды и бактерий. Полученный осадок селена разбавляют лизирующим составом, инкубируют и центрифугируют. Полученный осадок дополнительно центрифугируют в градиенте водного раствора сахарозы. Градиент сформирован из последовательных слоев 80%, 60% и 40% водных растворов сахарозы. Изобретение обеспечивает ускорение способа получения однородного по размеру (280±45нм) аморфного красного селена, при более полной мягкой очистки полученных частиц от клеток бактерий и клеточных фрагментов без нарушения аллотропной модификации селена. 1 ил., 1 табл.

Способ приготовления гетерогенного биокатализатора на основе бактериальных клеток, агрегированных с углеродными нанотрубками // 2634414

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ приготовления гетерогенного биокатализатора. Способ включает выращивание обладающих нитрил- и амидгидролизующей активностью клеток бактерий в жидкой минеральной среде до стационарной фазы, смешивание клеток бактерий путём осаждения с помощью центрифугирования, отмывание калий-фосфатным буфером, повторное центрифугирование, ресуспендирование в калий-фосфатном буфере и инкубирование с многослойными углеродными нанотрубками на шейкере. После инкубирования суспензию с несвязавшимися клетками бактерий отделяют путем фильтрования от агрегатов бактерий с многослойными углеродными нанотрубками. Изобретение обеспечивает сохранение ферментативной активности, легкость отделения биокатализатора от реакционной среды, содержащей продукт реакции, а также возможность повторного использования. 4 ил., 1 табл., 5 пр.