Способ выделения микровезикул эритроцитов
Владельцы патента RU 2558776:
Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВПО НГСХА) (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу выделения микровезикул эритроцитов. Способ выделения микровезикул эритроцитов, включающих забор крови, промывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, далее к полученному супернатанту добавляют хлористый лантан, перемешивают, центрифугируют, и получают осадок микровезикул. Вышеописанный способ позволяет ускорить процесс получения микровезикул эритроцитов. 2 пр.
Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине и может использоваться в опытах in vitro для получения и изучения микровезикул эритроцитов с помощью биохимических и морфологических методов исследования.
Известен способ выделения микровезикул эритроцитов из надосадочной жидкости (супернатант), который включает забор крови, промывание эритроцитов, инкубацию отмытых клеток в присутствии кальция и ионофора А 23187, центрифугирование при 1000 g в течение 10 минут для получения супернатанта, ультрацентрифугирование супернатанта при 100000 g в течение 60 минут, получение осадка, содержащего микровезикулы (Allan D., Thomas P., Limbrick A.R. Biochem.J. - 1980.- Vol. 188. - P.881-887).
В качестве прототипа взят способ выделения микровезикул эритроцитов, включающий забор крови, промывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, к супернатанту добавляют хлористый цинк до конечной концентрации 5-10 мМ, перемешивают, оставляют на 60 минут при комнатной температуре и получают осадок, содержащей микровезикулы (Шереметьев Ю.А., Левин Г.Я., Поповичева А.Н., Егорихина М.Н. Способ выделения микровезикул эритроцитов. Патент 2464563 РФ, 2012).
Однако в этом способе используются очень высокие концентрации хлористого цинка (5-10 мМ). Существенным недостатком является длительность выделения микровезикул (60 мин).
Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.
Технический результат - ускорение процесса получения микровезикул эритроцитов.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем забор крови, промывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, к супернатанту добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 300-500 мкМ, перемешивают, центрифугируют при 1000 g в течение 5 минут и получают осадок с микровезикулами.
Способ осуществляется следующим образом. Кровь от здоровых людей забирают в вакуумные пробирки, содержащие цитрат натрия. Эритроциты трижды промывают физиологическим раствором и инкубируют в инкубационной среде. Затем эритроциты центрифугируют при 1000 g в течение 10 минут для получения супернатанта. К супернатанту добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 300-500 мкМ, перемешивают и центрифугируют при 1000 g в течение 5 минут и получают осадок с микровезикулами.
Пример 1. Отмытые эритроциты инкубируют в безглюкозной среде при 37°C в течение 24 часов. К супернатанту добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 300-500 мкМ, перемешивают и центрифугируют при 1000 g в течение 5 минут и получают осадок с микровезикулами.
Пример 2. Отмытые эритроциты инкубируют в среде, содержащей кальций и ионофор А 23187, в течение 30 минут. К супернатанту добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 300-500 мкМ, интенсивно перемешивают и центрифугируют при 1000 g в течение 5 минут и получают осадок с микровезикулами.
Способ выделения микровезикул эритроцитов, включающий забор крови, промывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, отличающийся тем, что к супернатанту добавляют хлористый лантан до конечной концентрации 300-500 мкМ, перемешивают, центрифугируют при 1000 g в течение 5 минут и получают осадок, содержащий микровезикулы.
