Способ получения состава ферментационного бульона

Изобретение относится к способу получения состава ферментационного бульона. Способ предусматривает инкубацию смеси, содержащей один или несколько ферментационных бульонов, первый компонент органической кислоты, второй компонент органической кислоты, при pH от 3,5 до 5, температуре от 20°C до 50°C в течение 8-36 ч. Первый компонент органической кислоты выбран из по меньшей мере одной из следующих кислот: уксусной кислоты, соли уксусной кислоты, муравьиной кислоты, соли муравьиной кислоты, пропионовой кислоты, соли пропионовой кислоты, или смеси двух или более из указанных кислот в количестве от 0,1% до 15% масс. инкубируемой смеси. Второй компонент органической кислоты выбран из по меньшей мере одной из следующих кислот: бензойной кислоты, соли бензойной кислоты, циклогексанкарбоновой кислоты, соли циклогексанкарбоновой кислоты, 4-метилвалериановой кислоты, соли 4-метилвалериановой кислоты, фенилуксусной кислоты, соли фенилуксусной кислоты, или смеси двух или более из указанных кислот в количестве от 0,025% до 5% масс. инкубируемой смеси. Изобретение обеспечивает снижение количества жизнеспособных клеток нитчатых грибов, составляющего по меньшей мере 4 log. 34 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 2 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительным заявкам США № 61/154235, поданной 20 февраля 2009 года, 61/185865, поданной 10 июня 2009 года, и 61/304219, поданной 12 февраля 2010 года, каждая из которых включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

1. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к композициям ферментационных бульонов и способам их изготовления и применения.

2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В различных процессах культивирования или ферментации микроорганизмов иногда необходимо в ходе процесса ферментации или в завершение процесса ферментации убить активные клетки в смеси. В частности, это справедливо, когда микроорганизмы, содержащие рекомбинантную ДНК, выращивают в качестве продуцирующих хозяев, и желательно предотвратить, чтобы какие-либо жизнеспособные рекомбинантные организмы высвобождались в окружающую среду. Даже если микроорганизмы не содержат рекомбинантную ДНК, часто желательно убить клетки перед переработкой для обеспечения того, чтобы жизнеспособные клетки не попадали в окружающую среду либо в продукте, либо в отходах процесса.

Многие общепринятые способы, требуемые для индукции гибели микроорганизмов, такие как нагревание, являются чрезмерно агрессивными и могут разрушить или изменить желаемый секретируемый продукт до того, как клетки погибают. В этом случае продукт необходимо выделять, не убивая клетки, что требует применения трудоемких и дорогостоящих процедур и оборудования. В патентах США № 5801034 и 5378621 описан способ индукции гибели микробных клеток единичной органической кислотой, имеющей от 1 до 5 атомов углерода. Однако согласно примерам этих патентов оптимальным является высокий уровень органической кислоты и низкое значение pH. Условия низких значений pH часто являются вредоносными для стабильности многих представляющих интерес ферментных продуктов в ферментационной среде, и высокий уровень органической кислоты часто является ингибиторным при последующих применениях, в которых желательно использовать ферментные продукты, таких как ферментация микроорганизма, который продуцирует органическое вещество на субстрате, продуцированном ферментативным катализом с ферментным продуктом. Кроме того, применение высокой концентрации химического агента для индукции гибели микробных клеток может значительно увеличить стоимость продукта, выделенного из ферментационной среды. Таким образом, остается потребность в разработке способов индукции гибели клеток в менее жестких условиях, и является желательной более низкая концентрация химических агентов.

3. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие промышленные белки, такие как ферменты, часто поставляют коммерчески в ферментационных бульонах, в которых они продуцированы. Как правило, белки экспрессируются и секретируются клетками (рекомбинантными или нерекомбинантными) в ферментационный бульон, содержащий ферментационную среду и клетки. Часто желательно инактивировать, например убить, клетки перед использованием белков в промышленных применениях, так чтобы реплицирующиеся клетки не попадали в окружающую среду. Настоящее описание направлено на необходимость инактивировать клетки таким образом, чтобы по существу не препятствовать активности белков, например ферментов.

В некоторых аспектах настоящее описание относится к способу получения ферментационного бульона, включающему инкубацию первой смеси, содержащей (a) один или несколько ферментационных бульонов, (b) первый компонент органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту из 1-5 атомов углерода (т.е. органическую кислоту всего с 1-5 атомами углерода в ее основной цепи и боковых цепях) и/или ее соль в количестве от 0,1% до 15% масс. первой смеси, и (c) второй компонент органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту с 6 или более атомами углерода (т.е. органическую кислоту всего с 6 или более атомами углерода в основной цепи или боковых цепях) и/или ее соль в количестве от 0,025% до 5% масс. первой смеси, в течение периода времени и в условиях, которые приводят к снижению количества жизнеспособных клеток, составляющего по меньшей мере 4 log, в указанных одном или нескольких ферментационных бульонах, тем самым получая композицию ферментационного бульона.

В конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты находится в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75% или 1% и в котором верхний предел независимо выбран из 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12% или 15% масс. первой смеси, например в количествах в диапазоне от 0,2% до 1%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 10%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. первой смеси и т.д.

В конкретных вариантах осуществления второй компонент органической кислоты находится в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75% или 1% и в котором верхний предел независимо выбран из 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3% или 5% масс. первой смеси, например в количествах в диапазоне от 0,04% до 3%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 1%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. первой смеси и т.д. Допустимо, чтобы эта органическая кислота представляла собой органическую кислоту из 6-10 атомов углерода, органическую кислоту из 6-9 атомов углерода или органическую кислоту из 6-8 атомов углерода. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления второй компонент органической кислоты содержит органическую кислоту из 6 атомов углерода и/или ее соль, органическую кислоту из 7 атомов углерода и/или ее соль, органическую кислоту из 8 атомов углерода и/или ее соль, органическую кислоту из 9 атомов углерода и/или ее соль или органическую кислоту из 10 атомов углерода и/или ее соль или состоит из них.

Допустимо, чтобы период времени инкубации находился в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 4 часов, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 14 часов, 16 часов, 18 часов или 20 часов и в котором верхний предел независимо выбран из 12 часов, 16 часов, 20 часов, 24 часов, 28 часов, 32 часов или 36 часов, например от 4 часов до 36 часов, например от 8 часов до 36 часов, от 20 часов до 28 часов, от 8 часов до 16 часов, от 10 часов до 20 часов, от 16 часов до 30 часов и т.д.

Условия инкубации включают температуру, для которой является допустимым диапазон, в котором нижний предел выбран из 20°C, 22°C, 25°C, 28°C, 30°C, 32°C, 34°C, 36°C, 38°C или 40°C и в котором верхний предел независимо выбран из 28°C, 33°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C или 55°C, например от 20°C до 50°C, от 25°C до 40°C, от 28°C до 33°C и т.д.

Условия инкубации включают pH, для которого допустимым является диапазон, в котором нижний предел выбран из 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4 или 4,2 и в котором верхний предел независимо выбран из 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,2 или 5,5, например pH от 3,5 до 5, от 4 до 4,7 или от 4,2 до 4,5. pH можно корректировать в начале инкубации и/или один или несколько раз в ходе инкубации, например, добавлением pH-корректирующего вещества. В конкретных вариантах осуществления pH-корректирующее вещество представляет собой фосфорную кислоту, серную кислоту или гидроксид натрия. Также в настоящем документе предусматривается, что в определенных вариантах осуществления первый и/или второй компонент органической кислоты может участвовать в коррекции pH в начале инкубации и/или в ходе периода инкубации, таким образом частично или полностью устраняя потребность в дополнительных pH-корректирующих средствах.

В некоторых аспектах способы по изобретению приводят к снижению числа жизнеспособных клеток в одном или нескольких ферментационных бульонах в смеси, составляющего по меньшей мере 5 log, 6 log, 7 log или 8 log (логарифмов).

В конкретных вариантах осуществления снижение уровня жизнеспособных клеток в указанной смеси по меньшей мере в 0,25 раза, по меньшей мере в 0,5 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз превышает снижение во второй смеси или альтернативной смеси, подвергаемой указанным условиям, которая содержит только один компонент органической кислоты в количестве, составляющем вплоть до общего весового процента первого и второго компонентов органической кислоты в первой смеси. В качестве примера, применение первого количества (например, 1% масс.) первого компонента органической кислоты и второго количества (0,5% масс.) второго компонента органической кислоты применительно к способам по изобретению приводит к большему снижению количества жизнеспособных клеток, чем применение третьего количества, которое составляет вплоть до суммы указанного первого и второго количеств (например, 1,5% масс.) первого компонента органической кислоты или второго компонента органической кислоты отдельно в одних и тех же или сходных условиях.

Способы по настоящему изобретению можно применять для инактивации клеток грибов, например клеток нитчатых грибов. В конкретных вариантах осуществления клетки нитчатых грибов происходят из родов Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium или Neurospora. Другие типы клеток, допустимые для способов, составов и композиций по настоящему изобретению, описаны в разделе 5.2.1, ниже.

В конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту, соль уксусной кислоты, муравьиную кислоту, соль муравьиной кислоты, пропионовую кислоту, соль пропионовой кислоты или смесь двух или более из вышесказанных или состоит из них. В одном из вариантов осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту и/или ее соль или состоит из них.

В конкретных вариантах осуществления второй компонент органической кислоты содержит бензойную кислоту, соль бензойной кислоты, циклогексанкарбоновую кислоту, соль циклогексанкарбоновой кислоты, 4-метилвалериановую кислоту, соль 4-метилвалериановой кислоты, фенилуксусную кислоту, соль фенилуксусной кислоты, или смесь двух или более из указанных выше или состоит из них. В одном из вариантов осуществления второй органический компонент содержит бензойную кислоту и/или ее соль, или состоит из них.

В определенных вариантах осуществления способов по настоящему изобретению первый компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль указанной органической кислоты из 1-5 атомов углерода и/или второй компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль указанной органической кислоты из 6 или более атомов углерода.

В некоторых конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту в концентрации 0,2%-0,4% масс. и второй компонент органической кислоты содержит бензоат натрия в концентрации 0,2%-0,4% масс., и/или период времени составляет 24 часа, и/или условия включают температуру 40°C, и/или условия включают pH от 4 до 4,6.

В способах по настоящему изобретению первая смесь также может содержать одно или несколько противомикробных средств, например, для ингибирования роста контаминирующих бактерий или грибов. В конкретных вариантах осуществления одно или несколько противомикробных средств находятся в количестве от 0,0005 до 0,05% масс. первой смеси, например в количестве от 0,001 до 0,025% масс. указанной смеси. В конкретном варианте осуществления противомикробное средство содержит экстракт хмеля, содержащий изо-альфа-кислоты, тетра-изо-альфа-кислоты и/или бета-кислоты. Также в настоящем документе предусматривается, что в определенных вариантах осуществления первый и/или второй компонент органической кислоты может играть противомикробную роль и, таким образом, частично или полностью устранять необходимость в других противомикробных средствах.

Способы по настоящему изобретению, кроме того, могут включать стадию получения первой смеси перед стадией инкубации, описанной выше, например, путем комбинирования одного или нескольких ферментационных бульонов по меньшей мере с одной органической кислотой из 1-5 атомов углерода и/или ее солью, по меньшей мере с одной органической кислотой из 6 или более атомов углерода и/или ее солью и необязательно с одним или несколькими другими реагентами, такими как pH-корректирующее средство и/или противомикробное средство.

В определенных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включают стадию культивирования клеток для получения одного или нескольких из ферментационных бульонов, используемых для настоящего изобретения. В качестве неограничивающего примера ферментационные бульоны можно получать согласно любому из способов культивирования клеток, описанных в разделе 5.2.2, ниже. Таким образом, композиции и составы по настоящему изобретению могут включать ферментационные бульоны, полученные способами, описанными в настоящем документе.

Без связи с какой-либо теорией авторы настоящего изобретения полагают, что применение двух компонентов органических кислот, описанных в настоящем документе, приводит к снижению общего компонента органической кислоты, требуемого для достижения инактивации клеток (например, путем снижения числа жизнеспособных клеток на коэффициент 4 log или более, как описано в настоящем документе) по сравнению с использованием одного компонента органической кислоты, и позволяет проведение реакции инкубации при более высоком pH, чем возможно в ином случае, тем самым минимизируя неблагоприятные эффекты на сворачивание и стабильность белков, например ферментов, в исходном ферментационном бульоне. Таким образом, в некоторых аспектах способы по настоящему изобретению проводят в условиях, которые приводят к композиции ферментационного бульона, в котором один или несколько ферментов сохраняют по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% их исходной ферментативной активности.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции ферментационного бульона, полученной или получаемой способами, описанными в настоящем документе.

Таким образом, в некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей (a) один или несколько ферментационных бульонов, содержащих клетки; (b) первый компонент органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту из 1-5 атомов углерода и/или ее соль в количестве от 0,2% до 1,5% масс. указанной композиции, (c) второй компонент органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту из 6 или более атомов углерода и/или ее соль в количестве от 0,04% до 0,6% масс. указанной композиции.

В конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты находится в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75% или 1% и в котором верхний предел независимо выбран из 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12% или 15% масс. композиции, например в количествах в диапазоне от 0,2% до 1%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 10%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. композиции и т.д.

В конкретных вариантах осуществления второй компонент органической кислоты находится в диапазоне, в котором нижний предел выбран из 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,5%, 0,75% или 1% и в котором верхний предел независимо выбран из 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3% или 5% масс. композиции, например в количествах в диапазоне от 0,04% до 3%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 1%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. композиции и т.д.

Следует понимать, что компоненты органических кислот в составах и композициях по изобретению, как правило, по меньшей мере частично находятся в диссоциированной форме и, когда такие компоненты находятся в диссоциированной форме, массовый процент компонента относится не к массе диссоциированных ионов (например, катионов), а к массе сухого материала (например, кислоты или соли), используемого для получения композиции или состава. Степень, с которой такие компоненты диссоциируют, зависит от их соответствующих величин pKa. Предпочтительно, чтобы состав или композицию изготавливали в условиях pH и при температуре, при которых по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70% компонента органической кислоты являются диссоциированными.

В некоторых аспектах композиция по изобретению имеет значение pH, которое находится в допустимом диапазоне, в котором нижний предел выбран из 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4 или 4,2 и в котором верхний предел независимо выбран из 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,2 или 5,5, например pH от 3,5 до 5, от 4 до 4,7 или от 4,2 до 4,5.

В некоторых аспектах клетки в композиции по изобретению являются преимущественно или полостью нежизнеспособными клетками. Например, в определенных вариантах осуществления, если в композиции присутствуют жизнеспособные клетки, тогда соотношение нежизнеспособных клеток и жизнеспособных клеток в указанной композиции составляет по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 1000:1, по меньшей мере 10000:1, по меньшей мере 100000:1 или по меньшей мере 1000000:1.

В некоторых аспектах клетки включают клетки грибов, например клетки нитчатых грибов. В конкретных вариантах осуществления клетки нитчатых грибов происходят из родов Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium или Neurospora.

В определенных вариантах осуществления композиций по изобретению первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту, соль уксусной кислоты, муравьиную кислоту, соль муравьиной кислоты, пропионовую кислоту, соль пропионовой кислоты или смесь двух или более из указанных выше или состоит из них. В конкретном варианте осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту и/или ее соль или состоит из них.

В определенных вариантах осуществления композиции по изобретению второй компонент органической кислоты содержит бензойную кислоту, соль бензойной кислоты, циклогексанкарбоновую кислоту, соль циклогексанкарбоновой кислоты, 4-метилвалериановую кислоту, соль 4-метилвалериановой кислоты, фенилуксусную кислоту, соль фенилуксусной кислоты или смесь двух или более из указанных выше или состоит из них. В конкретном варианте осуществления второй компонент органической кислоты содержит бензойную кислоту и/или ее соль или состоит из них.

В определенных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль органической кислоты из 1-5 атомов углерода и/или второй компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль органической кислоты из 6 или более атомов углерода.

Дополнительные детали и варианты осуществления органических кислот, допустимых в способах и композициях по настоящему изобретению, описаны в разделе 5.2.4 ниже.

В конкретных вариантах осуществления первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту в концентрации 0,2%-0,4% масс. и/или второй компонент органической кислоты содержит бензоат натрия в концентрации 0,2%-0,4% масс.

Композиции по изобретению могут содержать одно или несколько противомикробных средств. В конкретных вариантах осуществления одно или несколько противомикробных средств представлены в количестве от 0,0005 до 0,05% масс. композиции, например в количестве от 0,001 до 0,025% масс. указанной композиции. В конкретном варианте осуществления противомикробное средство содержит экстракт хмеля, содержащий изо-альфа-кислоты, тетра-изо-альфа-кислоты и/или бета-кислоты.

Ферментационные бульоны, используемые в способах, составах и композициях по изобретению, как правило, содержат один или несколько белков, секретируемых клетками. По меньшей мере один из указанных одного или нескольких белков может экспрессироваться рекомбинантно и/или представляет собой фермент, например экзоглюканазу, эндоглюканазу, гемицеллюлазу или β-глюкозидазу. В определенных вариантах осуществления ферментационные бульоны содержат множество ферментов, экспрессируемых рекомбинантно и секретируемых клетками, например два или более из экзоглюканазы, эндоглюканазы, гемицеллюлазы или β-глюкозидазы. Другие ферменты, присутствие которых является допустимым в композициях по настоящему изобретению, описаны в разделе 5.2.3 ниже. В некоторых аспектах белки составляют от 3 до 30% масс. состава или композиции по изобретению. В конкретных вариантах осуществления белки составляют 5-15% масс., от 7 до 10% масс., от 6 до 12% масс., от 5 до 20% масс., от 10 до 25% масс., от 10 до 20% масс., от 8 до 15% масс. или от 6 до 10% масс. состава или композиции по изобретению.

В определенных конкретных вариантах осуществления композиция по изобретению имеет один, два или все три из следующих видов активности:

(a) активность эндоглюканазы, находящаяся в диапазоне от нижнего предела, выбранного из 2000, 2100, 2200, 2350, 2500 или 2650 CMC Ед/г до верхнего предела, который независимо выбран из 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3500, 3750 или 4000 CMC Ед/г, например в диапазоне от 2200 CMC Ед/г до 2800 CMC Ед/г, от 2200 CMC Ед/г до 3200 CMC Ед/г, от 2500 до 3500 CMC Ед/г и т.д.;

(b) активность β-глюкозидазы, находящаяся в диапазоне от нижнего предела, который выбран из 300, 375, 450, 475, 500, 525, 550, 600, 650 или 700 pNPG Ед/г, до верхнего предела, который независимо выбран из 475, 525, 575, 635, 700, 775, 800, 850, 900 или 950 pNPG Ед/г, например в диапазоне от 525 pNPG Ед/г до 775 pNPG Ед/г, от 300 pNPG Ед/г до 800 pNPG Ед/г, от 350 pNPG Ед/г до 850 pNPG Ед/г и т.д.; и

(с) активность ксиланазы, находящаяся в диапазоне от нижнего предела, который выбран из 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750 или 3000 ABX Ед/г, до верхнего предела, который независимо выбран из 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000 или 7000 ABX Ед/г, например в диапазоне от 2000 ABX Ед/г до 5000 ABX Ед/г, от 1500 ABX Ед/г до 4500 ABX Ед/г, от 3500 ABX Ед/г до 5500 ABX Ед/г и т.д.

В другом аспекте изобретение относится к способу гидролиза целлюлозного материала, включающему контактирование целлюлозного материала с указанными выше композициями ферментационных бульонов. В некоторых вариантах осуществления целлюлозный материал представляет собой материал растительной биомассы, такой как лигноцеллюлозный материал, который необязательно предварительно обработан для усиления ферментативного гидролиза. Таким образом, в некоторых аспектах составы и композиции по изобретению, кроме того, содержат негидролизованный целлюлозный материал, частично гидролизованный целлюлозный материал или по существу полностью гидролизованный (например, >90% гидролизованный или >95% гидролизованный) целлюлозный материал. В конкретных вариантах осуществления частично гидролизованный целлюлозный материал (i) представляет собой целлюлозный материал, гидролизованный на вплоть до 40%, вплоть до 50%, вплоть до 60%, вплоть до 70%, вплоть до 80% или вплоть до 90%; (ii) представляет собой целлюлозный материал, гидролизованный по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 70%; или (iii) является гидролизованным до диапазона, попадающего между парой значений, независимо выбранных из (i) и (ii), например, гидролизованным на 30%-80% или 40%-90%. Следует отметить, что диапазоны масс компонентов (например, органических кислот) составов и композиций, описанных в настоящем документе, как правило, не включают целлюлозные материалы или продукты гидролиза целлюлозных материалов.

Дальнейшие детали и варианты осуществления составов и композиций по настоящему изобретению описаны в разделе 5.3 ниже.

В некоторых аспектах изобретение относится к способам получения органических веществ путем ферментации микроорганизма, который продуцирует органическое вещество в составе или композиции по изобретению. В одном из вариантов осуществления микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм и органическое вещество представляет собой этанол. Композицию по изобретению можно использовать в реакции одновременного осахаривания и ферментации ("SSF") или в реакции раздельного гидролиза и ферментации ("SHF").

Без связи с какой-либо теорией композиции по изобретению преимущественно содержат меньшее количество ингибиторов ферментации микроорганизмов, чем композиция (обозначаемая в настоящем документе как "альтернативная композиция"), которая сходна или идентична композиции по изобретению, но содержит только один компонент органической кислоты в количестве, инактивирующем или вызывающем гибель клетки в ферментационном бульоне(ах), в альтернативной композиции. Таким образом, в определенных вариантах осуществления выход органического вещества, продуцируемого ферментирующим микроорганизмом в присутствии композиции по изобретению по меньшей мере в 0,25 раза, по меньшей мере в 0,5 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз превышает выход органического вещества в присутствии такой альтернативной композиции. В качестве примера, когда для ферментирующего микроорганизма используют композицию по изобретению, содержащую ферменты, первое количество (например, 1% масс.) первого компонента органической кислоты и второе количество (0,5% масс.) второго компонента органической кислоты, выход органического вещества, продуцируемого ферментирующим микроорганизмом, превышает выход, когда используют композицию, содержащую те же ферменты и третье количество, которое составляет вплоть до суммы указанных первого и второго количеств (например, 1,5% масс.) первого компонента органической кислоты или второго компонента органической кислоты отдельно в тех же или сходных условиях.

Таким образом, в определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению используют в реакции SSF. Способы включают воздействие на реакционную смесь SSF, содержащую состав или композицию по изобретению, ферментирующий микроорганизм и целлюлозный субстрат, условий SSF. Необязательно, способы включают стадию получения реакционной смеси SSF, например путем комбинирования композиции по изобретению, этанологена и, необязательно, целлюлозного субстрата. В конкретном варианте осуществления условия SSF включают отсутствие дополнительного источника азота. В другом конкретном варианте осуществления условия способствуют как гидролизу целлюлозы в глюкозу и/или гемицеллюлозный сахар (например, ксилозу, арабинозу и/или маннозу), так и превращению глюкозы и/или гемицеллюлозы в органическое вещество (например, этанол). Также настоящее изобретение охватывает реакционные смеси SSF, содержащие композицию по изобретению, ферментирующий микроорганизм и, необязательно, целлюлозный материал, также как и продукты реакции SSF, в которых целлюлозный материал по меньшей мере частично гидролизован и ферментирован.

В других вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению используют в реакции SHF. Способы включают воздействие на реакционную смесь SHF, содержащую композицию по изобретению и целлюлозный субстрат, условий SHF. Необязательно, способы включают стадию получения реакционной смеси SHF, например путем комбинирования композиции по изобретению и целлюлозного субстрата. В конкретном варианте условия способствуют гидролизу целлюлозы в глюкозу и/или гемицеллюлозный сахар (например, ксилозу, арабинозу и/или маннозу). Также настоящее изобретение охватывает реакционные смеси SHF, содержащие композицию по изобретению и целлюлозный материал, также как и продукты реакции SHF, в которых целлюлозный материал по меньшей мере частично гидролизован.

Дополнительные детали и варианты осуществления способов гидролиза целлюлозного материала и способов продукции органических веществ описаны в разделах 5.4 и 5.5 ниже.

В другом аспекте изобретение относится к наборам, содержащим упаковку и композицию, реакционную смесь SSF, продукт реакции SSF, реакционную смесь SHF или продукт реакции SHF согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления набор, кроме того, содержит инструкции по применению в способе продукции органического вещества с помощью ферментирующего микроорганизма, например инструкции по применению в способе продукции этанола с помощью этанологенного микроорганизма, и целлюлозного субстрата, гидролизованного с помощью цельного бульона или композиции с убитыми клетками в наборе. Дополнительные детали и варианты осуществления наборов по настоящему изобретению описаны в разделе 5.6 ниже.

Следующие конкретные варианты осуществления способов, составов и композиций по настоящему изобретению представлены в разделе 5.7 ниже.

4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 показаны эффекты температуры и концентрации химических веществ в составе на индукцию гибели клеток T. reesei.

На фиг.2 показан эффект концентрации бензоата натрия на индукцию гибели клеток T. reesei при 40°C и pH 4.

На фиг.3 показан эффект условий индукции гибели клеток на гибель клеток грибов.

На фиг.4 показаны химические структуры и величины pKa для органических кислот с 6 или более атомами углерода.

На фиг.5 показаны эффекты различных органических кислот с 6 или более атомами углерода на индукцию гибели клеток T. reesei при 40°C и pH 4.

На фиг.6 показана продукция молочной кислоты из L. rhanmosus на промытом гидролизате APB, как описано в примере 2.

На фиг.7 представлена продукция этанола из дрожжей Thermosacc на промытом гидролизате APB, как описано в примере 2.

На фиг.8 представлено накопление глюкозы в процессе ферментации дрожжей Thermosacc на промытом гидролизате APB, как описано в примере 2.

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

5.1 Определения

Как используют в настоящем документе, термин "клетка-хозяин" относится к клетке или клеточной линии, в которые можно трансфицировать рекомбинантный вектор, экспрессирующий полипептид, для продукции полипептида. Клетки-хозяева включают потомков отдельной клетки-хозяина, и потомки необязательно являются полностью идентичными (по морфологии или полному набору геномной ДНК) исходной родительской клетке вследствие природной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные или трансформированные in vivo экспрессирующим вектором. "Клетка-хозяин" относится как к клеткам, так и к протопластам, полученным из клеток штамма нитчатых грибов, в частности штамма Trichoderma sp.

Термин "рекомбинантный", когда его используют в отношении клетки, нуклеиновой кислоты, белка или вектора, указывает на то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка или что клетка происходит из клетки, модифицированной таким путем. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не встречаются в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые в ином случае аномально экспрессируются, недостаточно экспрессируются или не экспрессируются совсем.

"Нитчатые грибы" относятся ко всем нитчатым формам подотделов Eumycotina и Oomycota (см., Alexopoulos, C.J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York). Эти грибы характеризуются вегетативным мицелием с клеточной стенкой, состоящей из хитина, бета-глюкана и других сложных полисахаридов. Нитчатые грибы по настоящему изобретению морфологически, физиологически и генетически отличаются от дрожжей. Вегетативный рост нитчатых грибов происходит путем удлинения гифа, а катаболизм углерода является облигатно-аэробным.

Как используют в настоящем документе, термин "Trichoderma" или "Trichoderma sp." относится к любому роду грибов, ранее или в настоящее время классифицируемому как Trichoderma.

Термин "культивирование" относится к выращиванию популяции микробных клеток в допустимых для роста условиях в жидкой или твердой среде.

Как используют в настоящем документе, термины "целлюлозный субстрат" или "целлюлозный материал", используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к материалу, содержащему целлюлозу и/или гемицеллюлозу. Целлюлозный субстрат может представлять собой лигноцеллюлозный материал, который содержит целлюлозу, гемицеллюлозу и бета-глюканы, которые являются сшитыми друг с другом и с лигнином. Такие целлюлозные субстраты также могут содержать другие материалы, такие как пектины, белки, крахмал и липиды, однако, как правило, они содержат целлюлозу, гемицеллюлозу и бета-глюканы в качестве основных компонентов.

"Ферментирующий микроорганизм" относится к любому микроорганизму, допустимому для применения в желаемом процессе ферментации в целях продукции органических веществ.

Термин "ферментационный бульон", как используют в настоящем документе, относится к препарату, продуцируемому посредством ферментации клеток, который не подвергают выделению и/или очистке или подвергают минимальному выделению и/или очистке. Например, ферментационные бульоны получают, когда микробные культуры выращивают до насыщения, инкубируют в условиях ограничения углерода для обеспечения синтеза белка (например, экспрессии клетками-хозяевами ферментов) и секреции его в клеточную культуральную среду. Ферментационный бульон может содержать нефракционированные или фракционированные части ферментационных материалов, образующихся в конце ферментации. Как правило, ферментационный бульон является нефракционированным и содержит использованную культуральную среду и клеточный дебрис, присутствующий после удаления микробных клеток (например, клеток нитчатых грибов), например, центрифугированием. В некоторых вариантах осуществления ферментационный бульон содержит использованную клеточную культуральную среду, внеклеточные ферменты и жизнеспособные и/или нежизнеспособные микробные клетки.

"Этанологенный" относится к способности микроорганизма продуцировать этанол из углевода в качестве основного продукта ферментации. В некоторых вариантах осуществления этанологенные микроорганизмы также можно использовать для продукции других органических веществ.

"Единица карбоксиметилцеллюлозы", или "CMC Ед", относится к единице активности эндоглюканазы, которая высвобождает 1 мкмоль восстанавливающего сахара (экспрессируемого в качестве эквивалентов глюкозы) за одну минуту при 50°С и pH 4,8.

"pVP-глюкозидная единица", или "pMPG Ед", относится к единице активности бета-глюкозидазы, которая высвобождает 1 мкмоль нитрофенола из пара-нитрофенил-B-D-глюкопиранозида при 50°С и pH 4,8.

"Единица ABX", или "ABX Ед", относится к единице активности ксиланазы, которая высвобождает 1 мкмоль эквивалентов восстанавливающего сахара ксилозы из раствора 1% ксилана из древесины березы в 50 мМ Na-цитратном буфере, pH 5,3, при 50°С, при анализе с использованием способа с динитросалициловой кислотой (DNS) (Miller, 1959, Anal Chem., 31: 426-428).

5.2 Способы индукции гибели клеток

Изобретение относится к способам индукции гибели клеток в культуральной среде с получением, тем самым, цельного бульона с убитыми клетками. В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование клеток с комбинацией из первой органической кислоты, имеющей от 1 до 5 атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% масс., и второй органической кислоты, имеющей 6 или более атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,04% до приблизительно 0,3% масс. В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование клеток с комбинацией из первой органической кислоты, имеющей от 1 до 5 атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс., и второй органической кислоты, имеющей 6 или более атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс. В других вариантах осуществления способ включает контактирование клеток с органической кислотой, имеющей 6 или более атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,25% до приблизительно 0,5% масс. Способ проводят в течение допустимого периода времени и при допустимых pH и температуре для достижения индукции по существу полной (т.е. снижение количества жизнеспособных клеток по меньшей мере приблизительно на 4, 5 или 6 log после обработки) или полной (т.е. отсутствие жизнеспособных клеток после обработки) гибели клеток. Как правило, pH составляет от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5, от приблизительно 4 до приблизительно 4,4 или от приблизительно 3,9 до приблизительно 4,2, температура составляет от приблизительно 30°C до приблизительно 40°C, и способ проводят при этих pH и температуре в течение от приблизительно 8 до приблизительно 24 часов. В одном из вариантов осуществления способ проводят при pH приблизительно 4 и температуре приблизительно 40°C в течение приблизительно 24 часов. В некоторых вариантах осуществления гибель клеток вызывают без лизиса. В некоторых вариантах осуществления осуществляют лизис некоторых или всех клеток.

5.2.1 Микробные клетки

Клетки, как правило, представляют собой микробные клетки, например клетки бактерий или грибов, и, как правило, они продуцируют по меньшей мере одну представляющую интерес молекулу, такую как фермент или органическое соединение. В некоторых вариантах осуществления клетки продуцируют по меньшей мере один фермент, который экспрессируется рекомбинантно. В некоторых вариантах осуществления представляющая интерес молекула секретируется во внеклеточную культуральную среду. В некоторых вариантах осуществления представляющая интерес молекула продуцируется внутриклеточно и не секретируется внеклеточно в культуральную среду. Когда молекула продуцируется внутриклеточно и не секретируется внеклеточно, для высвобождения молекулы в жидкую среду может потребоваться лизис убитых клеток.

В некоторых вариантах осуществления микробные клетки представляют собой клетки нитчатых грибов, включая встречающиеся в природе нитчатые грибы, нитчатые грибы с природными или индуцированными мутациями и нитчатые грибы, которые являются генетически модифицированными.

В некоторых вариантах осуществления клетки грибов представляют собой клетки видов Aspergillus, Acremonium, Aureobasidium, Beauveria, Bjerkandera, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Coriolus, Corynascus, Cryptococcus, Cyathus, Eridothia, Endothia, Filobasidium, Fusarium, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Myceliophthora, Myrothecium, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paeilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Podospora, Paecilomyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophylum, Sporotrychum, Stagonospora, Talaromyces, Toypoladium, Trichoderma, Thermomyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichophyton и Trametes или происходящих из них видов. В некоторых вариантах осуществления клетки грибов представляют собой Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus или Aspergillus oryzae. В некоторых вариантах осуществления клетки грибов представляют собой Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides или Fusarium venenatum. В некоторых вариантах осуществления клетки грибов представляют собой Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Cerporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Scytalidium thermophilum, Thielavia terrestris, Trametes pleurotus, Trametes villosa, Trametes versicolor, Chaetomium paecilomyces, Endothia mucor, Penicillium purpurogenum, Penicillium funiculosum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiate или Pleurotus eryngii. В некоторых вариантах осуществления клетки грибов представляют собой Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

5.2.2 Культивирование микробных клеток

Микробные клетки можно культивировать любым способом культивирования, известным в данной области, приводящим к экспрессии. Как правило, используют условия, допустимые для продукции одной или нескольких представляющих интерес молекул (например, одного или нескольких ферментов и/или органических соединений), например условия, допустимые для экспрессии ферментов, способных гидролизовать целлюлозный субстрат. Ферментация микробной культуры может включать культивирование во вращающемся флаконе, мелкомасштабную или крупномасштабную ферментацию, такую как непрерывная ферментация, периодическая ферментация, периодическая ферментация с подпиткой или ферментация в твердом состоянии в лабораторных или в промышленных ферментерах, проводимые в допустимой среде и в условиях, позволяющих экспрессию целлюлазы. Культивирование проводят в допустимой питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с использованием способов, известных в данной области. Допустимые культуральные среды, диапазоны температур и другие условия, допустимые для роста и продукции представляющих интерес молекул, например биомолекул, таких как ферменты или другие белки, или органических соединений, известны в данной области.

Ферментацию, например ферментацию клеток нитчатых грибов, часто проводят таким образом, что содержащий углерод субстрат может контролироваться как ограничивающий фактор, тем самым обеспечивая высокое превращение содержащего углерод субстрата в клетках и избегая контаминации клеток значительными количествами непревращенного субстрата. Последнее не является проблемой в случае растворимых в воде субстратов, поскольку любые остаточные следовые количества легко отмываются. Однако это может быть проблемой в случае нерастворимых в воде субстратов и может требовать дополнительных стадий обработки продукта, таких как подходящие стадии промывания.

Ферментацию можно проводить путем выращивания микробных клеток, например клеток нитчатых грибов, до стационарной фазы и поддержания клеток в условиях ограниченного содержания углерода в течение периода времени, достаточного для экспрессии одной или нескольких представляющих интерес молекул.

5.2.3 Ферменты, экспрессируемые микробными клетками

Микробные клетки, используемые в способах по изобретению, могут быть нерекомбинантными и/или рекомбинантными, например нерекомбинантными и/или рекомбинантными нитчатыми грибами. В некоторых вариантах осуществления микробные клетки содержат один или несколько генов, которые могут быть гомологичными или гетерологичными для микробных клеток.

В некоторых вариантах осуществления микробные клетки, например клетки нитчатых грибов, содержат один или несколько генов, которые могут быть гомологичными или гетерологичными для клеток, где один или несколько генов кодируют ферменты, которые могут осуществлять деградацию целлюлозного субстрата. Гены, кодирующие ферменты, деградирующие целлюлозный материал, известны специалистам в данной области. Допустимые неограничивающие примеры генов, которые кодируют ферменты, осуществляющие деградацию целлюлозных субстратов, включают эндоглюканазы, целлобиогидролазы, глюкогидролазы, бета-глюкозидазы, ксилоглюканазы, ксиланазы, ксилозидазы, альфа-арабинофуранозидазы, альфа-глюкуронидазы, ацетилксиланэстеразы, маннаназы, манноидазы, альфа-галактозидазы, маннанацетилэстеразы, галактаназы, арабинаназы, пектатлиазы, пектинлиазы, пектатлиазы, полигалактуроназы, пектинацетилэстеразы, пектинметилэстеразы, альфа-арабинофуранозидазы, бета-галактозидазы, галактаназы, арабинаназы, альфа-арабинофуранозидазы, рамногалактуроназы, рамногалактуронанлиазы и рамногалактуронанацетилэстеразы, ксилогалактуронозидазы, ксилогалактуроназы, рамногалактуронанлиазы, лигнинпероксидазы, марганецзависимые пероксидазы и лакказы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микробные клетки, например рекомбинантные клетки нитчатых грибов, сверхэкспрессируют фермент(ы), увеличивающий деградацию целлюлозного субстрата. Альтернативно микробные клетки могут представлять собой смесь нерекомбинантных клеток и рекомбинантных клеток, сверхэкспрессирующих фермент(ы), повышающий деградацию целлюлозного субстрата. В некоторых вариантах осуществления изобретения микробные клетки, например клетки нитчатых грибов, сверхэкспрессируют β-глюкозидазу. Альтернативно микробные клетки могут представлять собой смесь нерекомбинантных клеток и рекомбинантных клеток, сверхэкспрессирующих β-глюкозидазу.

Термин "бета-глюкозидаза" определяют в настоящем документе как бета-D-глюкозидглюкогидролаза, классифицируемая как EC 3.2.1.21, и/или ферменты семейств GH, включая, но не ограничиваясь ими, ферменты семейств GH 1, 3, 7, 9 или 48, которые катализируют гидролиз целлобиозы с высвобождением бета-D-глюкозы. Сверхэкспрессированная бета-глюкозидаза может быть из того же вида, что и клетка-хозяин, или из другого вида. Следует отметить, что для экспрессии в клетках грибов сверхэкспрессируемая бета-глюкозидаза не обязательно должна быть бета-глюкозидазой грибов.

В некоторых вариантах осуществления бета-глюкозидазу можно продуцировать путем экспрессии гена, кодирующего бета-глюкозидазу. Например, бета-глюкозидаза может секретироваться во внеклеточное пространство, например, грамположительными организмами (такими как Bacillus и Actinomycetes), или эукариотическими хозяевами (например, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces и Pichia). Также следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления бета-глюкозидаза может сверхэкспрессироваться в рекомбинантном микроорганизме относительно естественных уровней. В некоторых вариантах осуществления, если для экспрессии бета-глюкозидазы используют клетку-хозяина, клетка может быть генетически модифицирована для снижения экспрессии одного или нескольких белков, которые являются эндогенными для клетки. В одном из вариантов осуществления в клетке могут быть удалены или инактивированы один или несколько нативных генов, в частности генов, которые кодируют секретируемые белки. Например, могут быть удалены или инактивированы один или несколько генов, кодирующих протеазы (например, ген, кодирующий аспартилпротеазу; см. Berka et al., Gene 1990 86:153-162 и USP 6509171), или генов, кодирующих целлюлазу. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин Trichoderma sp., например клетка-хозяин T. reesei, содержит инактивирующие делеции в генах cbh1, cbh2 и egl1 и egl2, как описано в заявке PCT № WO05/001036. Нуклеиновая кислота, кодирующая бета-глюкозидазу, может присутствовать в геноме ядра клетки-хозяина Trichoderma sp., или она может присутствовать в плазмиде, которая реплицируется в клетке-хозяине Trichoderma.

Примеры бета-глюкозидаз, которые можно использовать, включают бета-глюкозидазу из Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus kawachi (Iwashita et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 5546-5553), Aspergillus oryzae (WO2002/095014), Cellulomonas biazotea (Wong et al., 1998, Gene 207: 79-86), Saccharomycopsis fibuligera (Machida et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 54: 3147-3155), Schizosaccharomyces pombe (Wood et al., 2002, Nature 415: 871-880), бета-глюкозидазу 1 Trichoderma reesei (патент США № 6022725), бета-глюкозидазу 3 Trichoderma reesei (патент США № 6982159), бета-глюкозидазу 4 Trichoderma reesei (патент США № 7045332), бета-глюкозидазу 5 Trichoderma reesei (патент США № 7005289), бета-глюкозидазу 6 Trichoderma reesei (USPN 20060258554) и бета-глюкозидазу 7 Trichoderma reesei (USPN 20040102619).

В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес фермент(ы), секретируемый внеклеточно микробными клетками, является растворимым во внеклеточной культуральной среде и/или в бульоне с убитыми клетками. В некоторых вариантах осуществления представляющие интерес фермент(ы), секретируемый внеклеточно микробными клетками, является нерастворимым во внеклеточной культуральной среде и/или в бульоне с убитыми клетками. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная культуральная среда и/или бульон с убитыми клетками содержат смесь растворимых и нерастворимых представляющих интерес ферментов.

5.2.4 Органические кислоты

Способы по изобретению включают контактирование клеток в культуральной среде с органической кислотой(ами) или ее солью(ями) в количестве и в условиях, как описано в настоящем документе, обеспечивающих инактивацию клеток, например в количестве, обеспечивающем снижение количества жизнеспособных клеток, составляющее по меньшей мере 4 log, 5 log, 6 log, 7 log или 8 log.

В некоторых вариантах осуществления способы включают контактирование клеток с первой органической кислотой (или ее солью), содержащей от 1 до 5 атомов углерода, в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 15%, от 0,2% до приблизительно 1% или от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс., и второй органической кислотой (или ее солью), содержащей 6 или более атомов углерода в концентрации приблизительно от 0,025% до 5% масс., от 0,04% до приблизительно 0,3% масс. или от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс. В различных вариантах осуществления первую органическую кислоту используют в любой концентрации из приблизительно 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 или 1% масс. в комбинации со второй органической кислотой в любой концентрации из приблизительно 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25 или 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 или 0,5% масс. В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота представляет собой уксусную кислоту в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс., или приблизительно 0,28% масс., и вторая органическая кислота представляет собой бензойную кислоту в концентрации от приблизительно 0,04% до приблизительно 0,06%, или приблизительно 0,044% масс. В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота представляет собой уксусную кислоту в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5%, или приблизительно 0,28% масс., и вторая органическая кислота представляет собой бензойную кислоту в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5%, или приблизительно 0,22% масс.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование клеток с органической кислотой (или ее солью), содержащей 6 или более атомов углерода, в количестве от приблизительно 0,25% до приблизительно 0,5% масс. В различных вариантах осуществления органическую кислоту, содержащую 6 или более атомов углерода, используют в любой концентрации от приблизительно 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 или 0,5% масс. В одном из вариантов осуществления органическая кислота, содержащая 6 или более атомов углерода, представляет собой бензойную кислоту в концентрации приблизительно 0,5% масс.

В некоторых вариантах осуществления органическая кислота, содержащая от 1 до 5 атомов углерода, представляет собой уксусную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту (или ее соль) или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления органическая кислота, содержащая от 1 до 5 атомов углерода, представляет собой уксусную кислоту.

В некоторых вариантах осуществления органическая кислота, содержащая 6 или более атомов углерода, представляет собой бензойную кислоту, циклогексанкарбоновую кислоту, 4-метилвалериановую кислоту, адипиновую кислоту, 3-метилглутаровую кислоту, фенилуксусную кислоту (или их соли) или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления органическая кислота, содержащая 6 или более атомов углерода, представляет собой бензойную кислоту (или ее соль, такую как бензоат натрия). В некоторых вариантах осуществления органическая кислота, содержащая 6 или более атомов углерода, содержит от 6 до 8 (т.е. 6, 7 или 8) атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления органическая кислота, содержащая 6 или более атомов углерода, содержит 1 или 2 функциональные группы карбоновых кислот. В некоторых вариантах осуществления органическая кислота, содержащая 6 или более атомов углерода, представляет собой ароматическую органическую кислоту. В некоторых вариантах осуществления органическая кислота, содержащая 6 или более атомов углерода, содержит 7 или 8 атомов углерода и 1 фенильную группу.

5.3 Композиции

Изобретение относится к композициям, получаемым способами индукции гибели клеток, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой цельный бульон с убитыми клетками, содержащий органическую кислоту(ы), как описано в настоящем документе, убитые клетки и/или клеточный дебрис и культуральную среду. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит органическую кислоту(ы), как описано в настоящем документе, и необязательно дополнительно содержит убитые клетки и/или клеточный дебрис. В одном из вариантов осуществления убитые клетки и/или клеточный дебрис удаляют из цельного бульона с убитыми клетками, как описано в настоящем документе, c получением композиции, которая не содержит этих компонентов. Цельный бульон или композиция с убитыми клетками по изобретению, как правило, содержат по меньшей мере одну представляющую интерес молекулу (например, биомолекулу, такую как белок, например фермент, и/или органическое вещество), продуцированную микробными клетками, которые использовали для получения цельного бульона или композиции с убитыми клетками.

Необязательно в цельный бульон или композицию с убитыми клетками можно добавлять консерванты и/или противомикробные (например, бактериостатические) средства, включая, но не ограничиваясь ими, сорбит, хлорид натрия, сорбат калия и другие средства, известные в данной области.

В некоторых вариантах осуществления цельный бульон или композиция с убитыми клетками могут быть дополнены одним или несколькими ферментными активными веществами, которые не экспрессируются эндогенно микробными клетками или экспрессируются ими на относительно низком уровне. Например, можно добавлять один или несколько ферментов для повышения деградации целлюлозного субстрата, например в ферментируемые сахара, такие как глюкоза или гемицеллюлозный сахар (например, ксилоза, арабиноза, манноза). Дополнительный фермент(ы) можно добавлять в качестве добавки в цельный бульон или композицию с убитыми клетками, и фермент(ы) может быть компонентом отдельного ферментационного бульона, или он может быть очищенным, или минимально выделенным и/или очищенным. Допустимые неограничивающие примеры дополнительных ферментов включают целлобиогидролазы, эндоглюканазу, бета-глюкозидазу, эндо-бета-1,3(4)-глюканазу, глюкогидролазу, ксилоглюканазу, ксиланазу, ксилозидазу, арабинофуранозидазу, альфа-глюкуронидазу, ацетилксиланэстеразу, маннаназу, маннозидазу, альфа-галактозидазу, маннанацетилэстеразу, галактаназу, арабинаназу, пектатлиазу, пектиназа-лиазу, пектатлиазу, полигалактуроназу, пектинацетилэстеразу, пектинметилэстеразу, бета-галактозидазу, галактаназу, арабинаназу, альфа-арабинофуранозидазу, рамногалактуроназу, эстеразы феруловой кислоты, рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронанацетилэстеразу, ксилогалактуронозидазу, ксилогалактуроназу, рамногалактуронанлиазу, лигнинпероксидазу, марганецзависимые пероксидазы, гибридные пероксидазы с комбинированными свойствами лигнинпероксидаз и марганецзависимых пероксидаз, глюкоамилазу, амилазу, протеазу и лакказу.

В некоторых вариантах осуществления цельный бульон или композиция с убитыми клетками включают целлюлолитические ферменты, включая, но не ограничиваясь ими, (i) эндоглюканазы (EG) или 1,4-d-глюкан-4-глюканогидролазы (EC 3.2.1.4), (ii) экзоглюканазы, включая 1,4-d-глюканглюканогидролазы (также известные как целлодекстриназы) (EC 3.2.1.74) и 1,4-d-глюканцеллобиогидролазы (экзоцеллобиогидролазы, CBH) (EC 3.2.1.91), и (iii) бета-глюкозидазу (BG) или бета-глюкозидглюкогидролазы (EC 3.2.1.21).

В некоторых вариантах осуществления цельный бульон или композиция с убитыми клетками содержит один или несколько ферментов, выбранных из экзоглюканазы, эндоглюканазы, гемицеллюлазы и бета-глюкозидазы. В одном из вариантов осуществления цельный бульон или композиция с убитыми клетками содержит от приблизительно 1000 до приблизительно 2000, от приблизительно 1500 до приблизительно 2500, от приблизительно 2200 до приблизительно 2800, или приблизительно 2500 СМС Ед/г активности эндоглюканазы и от приблизительно 450 до приблизительно 775, от приблизительно 525 до приблизительно 775, от приблизительно 400 до приблизительно 800 или приблизительно 650 pNPG Ед/г активности бета-глюкозидазы. Активность в отношении карбоксиметилцеллюлозы (CMC) и активность в отношении пара-нитрофенил-B-D-глюкопиранозида (pNPG) можно определять с использованием способов, известных в данной области (см. например, Ghose Т.K., "Measurement of Cellulase Activities", Pure & Appl. Chem. 59, pp. 257-268, 1987); Chen H., Hayn M., Esterbauer H. "Purification and characterization of two extracellular b-glucosidases from Trichoderma reesei", Biochimica et Biophysica Acta, 1992, 1121, 54-60).

В некоторых вариантах осуществления цельный бульон или композиция с убитыми клетками содержит уксусную кислоту в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% или приблизительно 0,28% масс. и бензойную кислоту в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5%, или приблизительно 0,22% масс., при pH от приблизительно 3,9 до приблизительно 4,3, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5, от приблизительно 4 до приблизительно 5, от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5, от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,2, или приблизительно 4.

В некоторых вариантах осуществления цельный бульон или композиция с убитыми клетками содержит нефракционированую часть ферментационных материалов, образующихся в конце ферментации. Как правило, цельный бульон или композиция с убитыми клетками содержит использованную культуральную среду и клеточный дебрис, присутствующий после выращивания микробных клеток (например, клеток нитчатых грибов) до насыщения, инкубации в условиях с ограниченным содержанием углерода для обеспечении синтеза белка (например, экспрессии целлюлазного и/или глюкозидазного фермента(ов)). В некоторых вариантах осуществления цельный бульон или композиция с убитыми клетками содержит использованную клеточную культуральную среду, внеклеточные ферменты и убитые клетки нитчатых грибов. В некоторых вариантах осуществления микробные клетки, присутствующие в цельном бульоне или композиции с убитыми клетками, можно подвергать увеличению проницаемости или лизису с использованием способов, известных в данной области.

Также изобретение относится к реакционно-способной композиции, которая содержит смесь целлюлозного материала, цельного бульона или композиции с убитыми клетками, как описано в настоящем документе, и ферментирующий микроорганизм в культуральной среде. В некоторых вариантах осуществления реакционно-способная композиция по существу не содержит дополнительного источника азота. В некоторых вариантах осуществления ферментирующий микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм. В некоторых вариантах осуществления продукция органического вещества в реакционно-способной композиции возрастает по меньшей мере приблизительно на 50% по сравнению с реакционно-способной композицией, которая содержит приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты. В одном из вариантов осуществления ферментирующий микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм, органическое вещество представляет собой этанол и продукция этанола в реакционно-способной композиции возрастает по меньшей мере приблизительно в 10 раз по сравнению с реакционно-способной композицией, которая содержит приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты.

Цельный бульон или композиция с убитыми клетками, как описано в настоящем документе, как правило, представляет собой жидкость, однако может содержать нерастворимые компоненты, такие как убитые клетки, клеточный дебрис, компоненты культуральной среды и/или нерастворимый фермент(ы). В некоторых вариантах осуществления нерастворимые компоненты можно удалять с получением прозрачной жидкой композиции.

5.4 Способы гидролиза целлюлозного материала

Изобретение относится к способам гидролиза целлюлозного материала. Способ включает контактирование целлюлозного материала с цельным бульоном или композицией с убитыми клетками, полученными способом индукции гибели клеток, как описано в настоящем документе, в количестве, достаточном для обеспечения ферментативного гидролиза целлюлозного материала одним или несколькими ферментом(ами) в цельном бульоне или композиции с убитыми клетками.

Допустимые неограничивающие примеры целлюлозных субстратов включают, но не ограничиваются ими, биомассу, травяной материал, сельскохозяйственные отходы, отходы лесничества, муниципальные твердые отходы, макулатуру, и пульпу, и бумажные отходы. Распространенные формы целлюлозного субстрата для применения в настоящем изобретении включают, но не ограничиваются ими, деревья, кустарники и травы, пшеницу, пшеничную солому, выжимки сахарного тростника, кукурузу, кукурузную шелуху, кукурузное зерно, включая волокно из зерен, продукты и субпродукты измельчения зерен, таких как кукуруза (включая влажное измельчение и сухое измельчение), а также муниципальные твердые отходы, макулатуру и садовые отходы. Целлюлозный субстрат можно получать из "первичной биомассы" (такой как деревья, кустарники, травы, плоды, цветы, зеленые культуры, твердая и мягкая древесина), "непервичной биомассы" (такой как сельскохозяйственные субпродукты, коммерческие органические отходы, строительные и городские отходы, муниципальные твердые отходы и садовые отходы) или "смешанной биомассы", которая представляет собой смесь первичной и непервичной биомассы.

В некоторых вариантах осуществления целлюлозный субстрат включает древесину, древесную пульпу, отходы бумажного производства, стоки отходов бумажной массы, прессованную древесину, кукурузную солому, кукурузное волокно, рис, отходы переработки бумаги и пульпы, древесные или травяные растения, плодовую пульпу, растительную пульпу, пористые прессованные отходы, барду, травы, рисовую шелуху, выжимку сахарного тростника, хлопок, джут, пеньку, лен, бамбук, сизаль, абаку, солому, сердцевину кукурузных початков, сушеную барду, листья, пшеничную солому, волокна кокоса, водоросли, просо и их смеси.

Целлюлозный субстрат можно использовать как есть или его можно подвергать предварительной обработке с использованием общепринятых способов, известных в данной области. Такая предварительная обработка включает химическую, физическую и биологическую предварительную обработку. Например, способы физической предварительной обработки могут включать, но не ограничиваться ими, различные типы измельчения, дробления, паровой обработки/парового взрыва, облучения и гидротермолиза. Способы химической предварительной обработки могут включать, но не ограничиваться ими, обработку разбавленной кислотой, щелочью, органическим растворителем, аммиаком, диоксидом серы, диоксидом углерода и pH-контролируемым гидротермолизом. Способы биологической предварительной обработки могут включать, но не ограничиваться ими, применение солюбилизирующих лигнин микроорганизмов.

5.5 Способы продукции органических веществ в микроорганизмах

Изобретение относится к способам продукции органических веществ в микроорганизмах, например ферментирующих микроорганизмах. Способы включают получение гидролизованного целлюлозного материала с помощью цельного бульона или композиции с убитыми клетками, как описано выше, и выращивание ферментирующего микроорганизма в присутствии гидролизованного целлюлозного материала в условиях, допустимых для ферментации микроорганизма с получением одного или нескольких представляющих интерес органических веществ(а). В некоторых вариантах осуществления ферментирующий микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм и способ используют для продукции этанола. В некоторых вариантах осуществления используют предварительно обработанный целлюлозный материал.

Гидролиз целлюлозного материала и ферментацию ферментирующего микроорганизма для продукции органического вещества можно проводить одновременно или последовательно.

В некоторых вариантах осуществления применение цельного бульона или композиции с убитыми клетками, описанных в настоящем документе, увеличивает продукцию органического вещества по меньшей мере приблизительно на 50% по сравнению со способом, в котором целлюлозный материал, на котором выращивают ферментирующий микроорганизм, гидролизуют с помощью композиции, которая содержит приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты. В некоторых вариантах осуществления продукция органического вещества (например, этанола или другой органической молекулы) увеличивается по меньшей мере приблизительно в 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению со способом, в котором целлюлозный материал, на котором выращивают ферментирующий микроорганизм, гидролизуют с помощью композиции, которая содержит приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты.

Допустимые ферментирующие микроорганизмы способны ферментировать или конвертировать сахара, такие как глюкоза, ксилоза, галактоза, арабиноза, манноза или олигосахариды, в желаемый продукт или продукты ферментации. Допустимые неограничивающие примеры ферментирующих микроорганизмов включают микроорганизмы-грибы, такие как дрожжи, и бактерии.

В некоторых вариантах осуществления ферментирующий микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм, такой как встречающийся в природе этанологенный организм, этанологенный организм с природными или индуцированными мутациями или генетически модифицированный этанологенный организм.

В некоторых вариантах осуществления этанологенный микроорганизм представляет собой клетку дрожжей, такую как Saccharomyces cerevisiae, S. uvarum, Kluyveromyces fagilis, Candida pseudotropicalis и Pachysolen tannophilus, которая может эффективно ферментировать глюкозу в этанол. Допустимые штаммы включают, но не ограничиваются ими, S. cerevisiae D_5A (ATCC200062), S. cerevisiae Y567 (ATCC24858), АСА 174 (ATCC 60868), MY91 (ATCC 201301), MY138 (ATCC 201302), C5 (ATCC 201298), ET7 (ATCC 201299), LA6 (ATCC 201300), OSB21 (ATCC 201303), F23 (S. globosus ATCC 90920), АСА 174 (ATCC 60868), A54 (ATCC 90921), NRCC 202036 (ATCC 46534), ATCC 24858, ATCC 24858, G 3706 (ATCC 42594), NRRL, Y-265 (ATCC 60593), Sa28 (ATCC 26603) и ATCC 24845-ATCC 24860. Другие не являющиеся cerevisiae штаммы дрожжей, допустимые для применения в настоящем изобретении, включают Pichia pastoris (tozony ID 4922), S. pastorianus SA 23 (S. carlsbergensis ATCC 26602), S. pastorianus (S. carlsbergensis ATCC 2345), Candida acidothermophilum (Issatchenkia orientalis, ATCC 20381). В некоторых вариантах осуществления этанологенный микроорганизм представляет собой рекомбинантный штамм дрожжей. Допустимые рекомбинантные дрожжи могут содержать гены, кодирующие ксилозоредуктазу, ксилитдегидрогеназу и/или ксилулокиназу (см., например, USPN 5789210).

В некоторых вариантах осуществления этанологенный микроорганизм представляет собой бактериальную клетку, например грамотрицательную факультативно анаэробную бактериальную клетку, такую как бактериальная клетка семейства Enterobacteriaceae. В некоторых вариантах осуществления этанологенный микроорганизм представляет собой микроорганизм из рода Escherichia или Klebsiella и, например, E. coli В, E. coli DH5α, E. coli KO4 (ATCC 55123), E. coli KO11 (ATCC 55124), E. coli KO12 (ATCC 55125), E. coli LY01, K. oxytoca M5A1 или K. oxytoca P2 (ATCC 55307). В некоторых вариантах осуществления этанологенный микроорганизм представляет собой микроорганизм вида Zymomonas или происходит из Zymomonas mobilis (ATCC31821). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный штамм Zymomonas может содержать гены, кодирующие, например, ксилозоизомеразу, ксилулокиназу, трансальдолазу и транскетолазу.

В то время как гидролиз целлюлозного материала до глюкозы и других малых сахаридов является важной стадией, одновременное осахаривание и ферментация (SSF) основано на живой культуре этанологенного микроорганизма для превращения этих сахаров в этанол.

Ферментирующие микроорганизмы, как правило, добавляют к гидролизату и ферментации позволяют протекать в течение 12-96 часов, например 30-80 часов. Температура, как правило, составляет 26-40°C, например приблизительно 32°C, и pH, как правило, составляет 3-6.

После ферментации представляющее интерес органическое вещество выделяют любым способом, известным в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, дистилляцию, экстракцию, хроматографию, электрофоретические способы и дифференциальную растворимость. Например, при ферментации этанола спирт можно выделять и очищать общепринятыми способами дистилляции. Этанол, полученный способом по изобретению, можно использовать в качестве топливного этанола, пищевого этанола или промышленного этанола.

Без связи с теорией в отношении изобретения, полагают, что непрозрачный цельный бульон с убитыми клетками обеспечивает остаточные питательные вещества для этанологенного микроорганизма. Это может привести к более быстрой ферментации этанола и повысить выход этанола. Возможность устранить необходимость в предоставлении питательного бульона или снизить количество дополнительных питательных веществ для этанологенного микроорганизма в дополнение к осахариваемой целлюлозе приводит к снижению стоимости исходных материалов для процесса ферментации этанола.

В некоторых вариантах осуществления использование цельного бульона или композиции с убитыми клетками, как описано в настоящем документе, в способе продукции органического вещества в ферментирующем микроорганизме может снизить количество и/или тип дополнительного источника азота для ферментирующего микроорганизма. В некоторых вариантах осуществления способы и композиции по настоящему изобретению могут снизить количество дрожжевого экстракта, пептона и/или мочевины, требуемых для роста ферментирующего микроорганизма.

В некоторых вариантах осуществления в способе продукции органического вещества в ферментирующем микроорганизме, как описано в настоящем документе, отсутствует или по существу ответствует дополнительный азот и/или источник питательных веществ для ферментирующего микроорганизма. В некоторых вариантах осуществления в способах и композициях отсутствуют или по существу отсутствуют дрожжевой экстракт, пептон и/или мочевина. Специалисту в данной области понятно, что в способах и композициях по изобретению может отсутствовать или по существу отсутствовать дополнительный источник азота, однако могут присутствовать следовые количества азота и/или источника питательных веществ в качестве примесей, или они могут быть добавлены в таком количестве, которые по существу не увеличивают питательную ценность цельного ферментационного бульона для ферментирующего микроорганизма.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу продукции органического вещества путем одновременного осахаривания и ферментации. Способ включает объединение, в отсутствие дополнительных источников азота, целлюлозного материала (например, предварительно обработанного целлюлозного материала), цельного бульона или композиции с убитыми клетками, как описано в настоящем документе, которые содержат один или несколько фермент(ов), способных гидролизовать целлюлозный материал (например, экзоглюканазу, эндоглюканазу, гемицеллюлазу и/или бета-глюкозидазу) и ферментирующий микроорганизм. Целлюлозный материал, цельный бульон или композицию с убитыми клетками и ферментирующий микроорганизм инкубируют в условиях, способствующих как гидролизу целлюлозы до глюкозы и/или гемицеллюлозного сахара (например, ксилозы, арабинозы и/или маннозы), так и превращению глюкозы и/или гемицеллюлозного сахара в органическое вещество. В некоторых вариантах осуществления продукция органического вещества возрастает по меньшей мере приблизительно на 50% по сравнению со способом, в котором используют цельный бульон или композицию с убитыми клетками, которые содержат приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты. В одном из вариантов осуществления ферментирующий микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм, органическое вещество представляет собой этанол, и продукция этанола возрастает по меньшей мере приблизительно в 10 раз по сравнению со способом, в котором используют цельный бульон или композицию с убитыми клетками, которые содержат приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты. В одном из вариантов осуществления используют цельный бульон с убитыми клетками, который содержит от приблизительно 1000 до приблизительно 2000, от приблизительно 1500 до приблизительно 2500, от приблизительно 2200 до приблизительно 2800, или приблизительно 2500 CMC Ед/г активности эндоглюканазы и от приблизительно 450 до приблизительно 775, от приблизительно 525 до приблизительно 775, от приблизительно 400 до приблизительно 800, или приблизительно 650 pNPG Ед/г активности бета-глюкозидазы, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5%, или приблизительно 0,28% уксусной кислоты по массе, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5%, или приблизительно 0,22% бензойной кислоты по массе (или приблизительно 0,26% бензоата натрия), при pH от приблизительно 3,9 до приблизительно 4,3, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5, от приблизительно 4 до приблизительно 5, от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5, от приблизительно 4,8 до приблизительно 4,2, или приблизительно 4.

5.6 Наборы

Изобретение также относится к наборам. Наборы по изобретению содержат цельный бульон или композицию с убитыми клетками, содержащие комбинацию органических кислот, как описано в настоящем документе. Предусмотрена допустимая упаковка. Как используют в настоящем документе, "упаковка" относится к твердой матрице, материалу или контейнеру, обычно используемым в системе и способным содержать фиксированные количества компонентов набора, как описано в настоящем документе.

Также набор может содержать инструкции по применению цельного бульона или композиции с убитыми клетками. Например, могут быть предоставлены инструкции по применению цельного бульона или композиции с убитыми клетками в способе гидролиза целлюлозного субстрата или инструкции по применению в способе продукции органического вещества в ферментирующем микроорганизме, как описано в настоящем документе. Инструкции могут быть предоставлены в напечатанной форме или в форме электронного носителя, такого как гибкий диск, CD или DVD, или в форме адреса на web-сайте, где могут быть получены такие инструкции.

5.7 Конкретные варианты осуществления

В одном аспекте изобретение относится к способу индукции гибели клеток в ферментационной культуре. Способ включает контактирование ферментационной культуры, которая содержит клетки в культуральной среде, с первой органической кислотой, содержащей от 1 до 5 атомов углерода, или ее солью и второй органической кислотой, содержащей 6 или более атомов углерода, или ее солью. В одном из вариантов осуществления концентрация первой органической кислоты составляет от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% масс. и концентрация второй органической кислоты составляет от приблизительно 0,04% до приблизительно 0,3% масс. В одном из вариантов осуществления концентрация первой органической кислоты составляет от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс. и концентрация второй органической кислоты составляет от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс. Способ проводят в течение периода времени и при температуре и pH, достаточных для обеспечения индукции по существу полной гибели клеток, тем самым получая цельный бульон с убитыми клетками. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет от приблизительно 8 до приблизительно 24 часов, температура составляет от приблизительно 30°C до приблизительно 40°C и pH составляет от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5, от приблизительно 3,9 до приблизительно 4,2 или от приблизительно 4 до приблизительно 4,4. В одном из вариантов осуществления период времени составляет приблизительно 24 часа, температура составляет приблизительно 40°C и pH составляет приблизительно 4. Индукция по существу полной гибели клеток, как правило, вовлекает снижение количества жизнеспособных клеток, составляющее по меньшей мере приблизительно 4 log, 5 log, 6 log, 7 log или 8 log.

В некоторых вариантах осуществления способа индукции гибели клеток клетки представляют собой микробные клетки (т.е. клетки грибов или бактерий). В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки грибов, например клетки нитчатых грибов. В некоторых вариантах осуществления клетки нитчатых грибов выбраны из Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium и Neurospora.

В некоторых вариантах осуществления способа индукции гибели клеток первая органическая кислота выбрана из уксусной кислоты, муравьиной кислоты или пропионовой кислоты. В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота представляет собой уксусную кислоту. В некоторых вариантах осуществления вторая органическая кислота выбрана из бензойной кислоты, циклогексанкарбоновой кислоты, 4-метилвалериановой кислоты и фенилуксусной кислоты. В одном из вариантов осуществления вторая органическая кислота представляет собой бензойную кислоту. В некоторых вариантах осуществления используют соль органической кислоты, например бензоат натрия. В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота представляет собой уксусную кислоту в концентрации приблизительно 0,28% масс. и вторая органическая кислота представляет собой бензойную кислоту в концентрации приблизительно 0,044% масс. (или бензоат натрия в концентрации приблизительно 0,052% масс.). В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота представляет собой уксусную кислоту в концентрации приблизительно 0,28% масс. и вторая органическая кислота представляет собой бензойную кислоту в концентрации приблизительно 0,22% масс. (или бензоат натрия в концентрации приблизительно 0,26% масс.).

В некоторых вариантах осуществления способа индукции гибели клеток клетки секретируют по меньшей мере один представляющий интерес фермент внеклеточно в культуральную среду. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес фермент экспрессируется рекомбинантно. В некоторых вариантах осуществления клетки секретируют по меньшей мере один представляющий интерес фермент, выбранный из экзоглюканазы, эндоглюканазы, гемицеллюлазы и бета-глюкозидазы.

В другом аспекте изобретение относится к цельному бульону с убитыми клетками, полученному любыми способами индукции гибели клеток, описанными в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления цельный бульон с убитыми клетками содержит один или несколько ферментов, секретированных клетками во внеклеточную культуральную среду перед индукцией гибели клеток. В некоторых вариантах осуществления цельный бульон с убитыми клетками содержит по меньшей мере один фермент, выбранный из экзоглюканазы, эндоглюканазы, гемицеллюлазы и бета-глюкозидазы, во внеклеточной культуральной среде. В некоторых вариантах осуществления цельный бульон с убитыми клетками содержит от приблизительно 1000 до приблизительно 2000, от приблизительно 1500 до приблизительно 2500, от приблизительно 2200 до приблизительно 2800, или приблизительно 2500 CMC Ед/г активности эндоглюканазы и от приблизительно 450 до приблизительно 775, от приблизительно 525 до приблизительно 775, от приблизительно 400 до приблизительно 800, или приблизительно 650 pNPG Ед/г активности бета-глюкозидазы. В одном из вариантов осуществления композиция содержит от приблизительно 2200 до приблизительно 2800 CMC Ед/г активности эндоглюканазы и от приблизительно 450 до приблизительно 775 pNPG Ед/г активности бета-глюкозидазы при pH от приблизительно 3,9 до приблизительно 4,3.

В некоторых вариантах осуществления продукция органического вещества ферментирующим микроорганизмом возрастает по меньшей мере приблизительно на 50% в присутствии цельного бульона с убитыми клетками по сравнению со способом, в котором используют цельный бульон с убитыми клетками, который содержит приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты. В одном из вариантов осуществления ферментирующий микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм. В одном из вариантов осуществления продукция этанола ферментирующим этанологенным организмом возрастает по меньшей мере приблизительно в 10 раз по сравнению со способом, в котором используют цельный бульон с убитыми клетками, который содержит приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей первую органическую кислоту, содержащую от 1 до 5 атомов углерода, или ее соль, и вторую органическую кислоту, содержащую 6 или более атомов углерода, или ее соль, и представляющий интерес фермент. В некоторых вариантах осуществления композиция также содержит убитые клетки и культуральную среду, где клетки выращивали в культуральной среде и продуцировали представляющий интерес фермент, перед контактированием их с первой и второй органическими кислотами. В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота присутствует в композиции в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% масс. и вторая органическая кислота присутствует в концентрации от приблизительно 0,04% до приблизительно 0,3% масс. В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота присутствует в композиции в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс. и вторая органическая кислота присутствует в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% масс. В некоторых вариантах осуществления первая органическая кислота выбрана из уксусной кислоты, муравьиной кислоты или пропионовой кислоты. В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота представляет собой уксусную кислоту. В некоторых вариантах осуществления вторая органическая кислота выбрана из бензойной кислоты, циклогексанкарбоновой кислоты, 4-метилвалериановой кислоты и фенилуксусной кислоты. В одном из вариантов осуществления вторая органическая кислота представляет собой бензойную кислоту. В некоторых вариантах осуществления используют соль органической кислоты, например бензоат натрия. В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота представляет собой уксусную кислоту в концентрации приблизительно 0,28% масс. и вторая органическая кислота представляет собой бензойную кислоту в концентрации приблизительно 0,044% масс. (или бензоат натрия в концентрации приблизительно 0,052% масс.). В одном из вариантов осуществления первая органическая кислота представляет собой уксусную кислоту в концентрации приблизительно 0,28% масс. и вторая органическая кислота представляет собой бензойную кислоту в концентрации приблизительно 0,22% масс. (или бензоат натрия в концентрации приблизительно 0,26% масс.). В некоторых вариантах осуществления композиция содержит один или несколько ферментов, выбранных из экзоглюканазы, эндоглюканазы, гемицеллюлазы и бета-глюкозидазы. В одном из вариантов осуществления композиция содержит от приблизительно 1000 до приблизительно 2000, от приблизительно 1500 до приблизительно 2500, от приблизительно 2200 до приблизительно 2800, или приблизительно 2500 CMC Ед/г активности эндоглюканазы и от приблизительно 450 до приблизительно 775, от приблизительно 525 до приблизительно 775, от приблизительно 400 до приблизительно 800, или приблизительно 650 pNPG Ед/г активности бета-глюкозидазы. В некоторых вариантах осуществления pH составляет от приблизительно 3,9 до приблизительно 4,3, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5, от приблизительно 4 до приблизительно 5, от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5, от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,2, или приблизительно 4. В одном из вариантов осуществления композиция содержит от приблизительно 2200 до приблизительно 2800 CMC Ед/г активности эндоглюканазы и от приблизительно 450 до приблизительно 775 pNPG Ед/г активности бета-глюкозидазы при pH от приблизительно 3,9 до приблизительно 4,3.

В другом аспекте изобретение относится к способу гидролиза целлюлозного материала, включая контактирование целлюлозного материала с цельным бульоном с убитыми клетками, полученным способом индукции гибели клеток, как описано в настоящем документе, или композиции, содержащей первую органическую кислоту, содержащую от 1 до 5 атомов углерода, или ее соль, вторую органическую кислоту, содержащую 6 или более атомов углерода, или ее соль, и по меньшей мере один представляющий интерес фермент, как описано в настоящем документе, в количестве, эффективном для обеспечения ферментативного гидролиза целлюлозного материала с помощью одного или нескольких ферментов в цельном бульоне или композиции с убитыми клетками. В некоторых вариантах осуществления используют композицию, которая, кроме того, включает культуральную среду и убитые клетки, где клетки выращивали в культуральной среде и они продуцировали представляющий интерес фермент, перед контактированием их с первой и второй органическими кислотами. В некоторых вариантах осуществления целлюлозный материал представляет собой материал растительной биомассы. В одном из вариантов осуществления целлюлозный материал представляет собой лигноцеллюлозный материал. В некоторых вариантах осуществления целлюлозный материал предварительно обрабатывают для усиления ферментативного гидролиза. Также изобретение относится к гидролизованному целлюлозному материалу, продуцированному гидролизом с помощью цельного бульона с убитыми клетками, продуцированного способом индукции гибели клеток, как описано в настоящем документе, или к композиции, содержащей первую органическую кислоту, содержащую от 1 до 5 атомов углерода, или ее соль, вторую органическую кислоту, содержащую 6 или более атомов углерода, или ее соль, по меньшей мере один представляющий интерес фермент и, необязательно, ферментационную культуральную среду и убитые клетки, как описано в настоящем документе.

В другом аспекте изобретение относится к способу продукции органического вещества. Этот способ включает ферментацию микроорганизма, который продуцирует органическое вещество, в культуральной среде в присутствии гидролизованного целлюлозного материала, путем гидролиза цельным бульоном с убитыми клетками, полученным способом индукции гибели клеток, как описано в настоящем документе, или композиции, содержащей первую органическую кислоту, содержащую от 1 до 5 атомов углерода, или ее соль, вторую органическую кислоту, содержащую 6 или более атомов углерода, или ее соль, по меньшей мере один представляющий интерес фермент и, необязательно, ферментационную культуральную среду и убитые клетки, как описано в настоящем документе, в условиях, допустимых для продукции микроорганизмом органического вещества. В одном из вариантов осуществления микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм и органическое вещество представляет собой этанол. В одном из вариантов осуществления концентрация органического вещества в культуральной среде увеличивается по меньшей мере приблизительно на 50% по сравнению со способом, в котором целлюлозный материал гидролизуют с помощью цельного бульона или композиции с убитыми клетками, которые содержат компоненты, сходные, по существу идентичные или идентичные с компонентами цельного бульона или композиции с убитыми клетками, использованными в способе, за исключением того, что цельный бульон или композиция с убитыми клетками содержит приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты. В одном из вариантов осуществления продукция этанола ферментирующим этанологенным организмом увеличивается по меньшей мере приблизительно в 10 раз по сравнению со способом, в котором используют цельный бульон или композицию с убитыми клетками, которые содержат приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты.

В некоторых вариантах осуществления ферментативный гидролиз целлюлозного материала и ферментация микроорганизма происходят одновременно. В других вариантах осуществления ферментативный гидролиз целлюлозного материала происходит перед ферментацией микроорганизма.

В другом аспекте изобретение относится к способу продукции органического вещества путем одновременного осахаривания и ферментации. Способ включает (a) комбинирование, в отсутствие дополнительного источника азота, целлюлозного субстрата, цельного бульона с убитыми клетками, полученного способом индукции гибели клеток, как описано в настоящем документе, или композиции, содержащей первую органическую кислоту, содержащую от 1 до 5 атомов углерода, или ее соль, вторую органическую кислоту, содержащую 6 или более атомов углерода, или ее соль, по меньшей мере один представляющий интерес фермент и, необязательно, ферментационную культуральную среду и убитые клетки, как описано в настоящем документе, и ферментацию микроорганизма; и инкубацию целлюлозного субстрата цельного ферментационного бульона или композиции с убитыми клетками, и ферментирующего микроорганизма в культуральной среде в условиях, способствующих как гидролизу целлюлозы до глюкозы и/или гемицеллюлозного сахара (например, ксилозы, арабинозы и/или маннозы), так и превращению глюкозы и/или гемицеллюлозы в органическое вещество, где концентрация органического вещества в культуральной среде увеличивается по меньшей мере приблизительно на 50% по сравнению со способом, в котором целлюлозный материал гидролизуют с помощью цельного бульона или композиции с убитыми клетками, которые содержат компоненты, сходные, по существу идентичные или идентичные с компонентами цельного бульона или композиции с убитыми клетками, используемыми в способе, за исключением того, что цельный бульон или композиция с убитыми клетками содержит приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты. В одном из вариантов осуществления ферментирующий микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм и органическое вещество представляет собой этанол. В одном из вариантов осуществления продукция этанола ферментирующим этанологенным организмом увеличивается по меньшей мере приблизительно в 10 раз по сравнению со способом, в котором используют цельный бульон или композицию с убитыми клетками, которые содержат приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты.

В другом аспекте изобретение относится к реакционно-способной композиции для продукции органического вещества. Реакционно-способная композиция содержит смесь целлюлозного субстрата, цельный бульон с убитыми клетками, полученный способом индукции гибели клеток, как описано в настоящем документе, или композицию, содержащую первую органическую кислоту, содержащую от 1 до 5 атомов углерода, или ее соль, вторую органическую кислоту, содержащую 6 или более атомов углерода, или ее соль, по меньшей мере представляющий интерес фермент и, необязательно, ферментационную культуральную среду и убитые клетки, как описано в настоящем документе, и ферментирующий микроорганизм в культуральной среде. Реакционно-способная композиция по существу не содержит дополнительного источника азота, и концентрация органического вещества в культуральной среде увеличена по меньшей мере приблизительно на 50% по сравнению со способом, в котором целлюлозный материал гидролизуют с помощью цельного бульона или композиции с убитыми клетками, которые содержат компоненты, сходные, по существу идентичные или идентичные с компонентами цельного бульона или композиции с убитыми клетками, используемыми в способе, за исключением того, что цельный бульон или композиция с убитыми клетками содержит приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты. В одном из вариантов осуществления ферментирующий микроорганизм представляет собой этанологенный микроорганизм и органическое вещество представляет собой этанол. В одном из вариантов осуществления продукция этанола ферментирующим этанологенным организмом увеличивается по меньшей мере приблизительно в 10 раз по сравнению с композицией, которая содержит цельный бульон или композицию с убитыми клетками с приблизительно 1,4% масс. уксусной кислоты и приблизительно 0,22% масс. бензойной кислоты.

В другом аспекте изобретение относится к наборам, содержащим цельный бульон с убитыми клетками, продуцированный способом индукции гибели клеток, как описано в настоящем документе, или композицию, содержащую первую органическую кислоту, содержащую от 1 до 5 атомов углерода, или ее соль, вторую органическую кислоту, содержащую 6 или более атомов углерода, или ее соль, по меньшей мере один представляющий интерес фермент, и необязательно ферментационную культуральную среду и убитые клетки, как описано в настоящем документе, в упаковке. В некоторых вариантах осуществления набор, кроме того, содержит инструкции по применению в способе продукции органического вещества ферментирующим микроорганизмом, например инструкции по применению в способе продукции этанола с помощью этанологенного микроорганизма и целлюлозного субстрата, гидролизованного с помощью цельного бульона или композиции с убитыми клетками, в наборе.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения, изобретения.

6. ПРИМЕРЫ

Пример 1

Условия индукции гибели клеток

Определение количества клеток грибов

Аликвоту среды после ферментации Trichoderma reesei в течение 150 часов подвергали серийному разведению с помощью стерильной воды с коэффициентом разведения 10³. Затем образец разведения объемом 100 мкл высевали распределением на картофельный агар с декстрозой (PDA), приобретенный у Difco^TM (REF#213200), и инкубировали при 25°C. Затем в инкубированном планшете с PDA проводили подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) после инкубации в течение 3 суток. КОЕ характеризуется как отдельный индивидуальный кластер растущих клеток, присутствующий на агаре, и число этих КОЕ, присутствующих на агаре, умноженное на степень разведения при посеве, представляет собой число КОЕ, присутствующих в исходном образце.

Отдельные суспензии спор Aspergillus niger и Penicillium funiculosum высевали распределением на PDA, приобретенный у Difco^TM (REF#213200), и инкубировали при 25°С в течение 3 суток. Затем отдельные секции PDA, содержащие колонии A. niger и P. funiculosum, удаляли в асептических условиях и помещали в отдельные вращающиеся флаконы, содержащие среду с глюкозой и дрожжевым экстрактом (YEG), состоящую из 5 г/л дрожжевого экстракта и 20 г/л глюкозы. Затем вращающиеся флаконы инкубировали на вращающем устройстве при 200 об/мин и 33°C в течение 3 суток. Образцы выращенных культур удаляли и серийно разбавляли стерильной водой с коэффициентом разведения 10⁴. Затем образец разведения объемом 100 мкл высевали распределением на PDA и инкубировали при 25°C. Затем в инкубированных планшетах с PDA посчитывали КОЕ.

Индукция гибели клеток T. reesei с помощью уксусной кислоты и бензоата натрия при различных температурах

Ферментационный бульон Trichoderma reesei разделяли на 5 аликвот и включали в композицию, как описано в таблице 1 ниже. Затем pH полученного бульона доводили до 4,0 с использованием 10% (масс./масс.) серной кислоты. Затем каждую композицию далее разделяли на 3 аликвоты, причем одну аликвоту инкубировали при 10°C, другую аликвоту инкубировали при 25°C и третью аликвоту инкубировали при 40°C. После инкубации в течение 24 часов pH всех аликвот доводили до 4,8 с использованием 10% (масс./масс.) гидроксида натрия. Затем каждую аликвоту подвергали серийному разведению с помощью стерильной воды, высевали распределением на PDA и инкубировали при 25°C. Затем в инкубированных планшетах с PDA подсчитывали КОЕ.

Таблица 1
Описание композиции ферментационного бульона T. reesei
# аликвоты	Композиция
1	11,2 г/л уксусной кислоты, 2,06 г/л бензоата натрия
2	8,4 г/л уксусной кислоты, 1,55 г/л бензоата натрия
3	5,6 г/л уксусной кислоты, 1,03 г/л бензоата натрия
4	2,8 г/л уксусной кислоты, 0,52 г/л бензоата натрия
5	20 г/л уксусной кислоты

Полной гибели клеток достигали при температуре 40°C для всех композиций. Гибели клеток T. reesei можно было достигнуть при более низких температурах, однако она требовала более высоких концентраций органических кислот. На фиг.1 представлен график, иллюстрирующий эффекты температуры и концентрации химических веществ в композиции на гибель клеток T. reesei.

Эффект бензоата натрия

Бензоат натрия добавляли к отдельным аликвотам T. reesei до конечной концентрации 2,5 г/л бензоата натрия или 5 г/л бензоата натрия. Затем аликвоты доводили до pH 4 и инкубировали в течение 24 часов при 40°C. После инкубации в течение 24 часов pH всех аликвот доводили до 4,8 с использованием 10% (масс./масс.) гидроксида натрия. Затем каждую аликвоту подвергали серийному разведению стерильной водой, высевали распределением на PDA и инкубировали при 25°C. Затем в инкубированных планшетах с PDA посчитывали КОЕ. Результаты представлены на фиг. 2.

T. reesei, включенные в композицию с 2,5 г/л бензоата натрия, pH 4, претерпевали снижение количества жизнеспособных клеток, составляющее 5 log, после инкубации в течение 24 часов при 40°C, в то время как T. reesei в композиции с 5 г/л бензоата натрия, pH 4, претерпевали снижение, составляющее 7 log, причем после инкубации в течение 24 часов при 40°С присутствовало менее 10 КОЕ.

Применение условий индукции гибели клеток к культурам A. niger и P. funiculosum

Уксусную кислоту и бензоат натрия добавляли к отдельным аликвотам выращиваемых культур T. reesei, A. niger и P. funiculosum до конечных концентраций 2,8 г/л и 2,6 г/л соответственно. Затем аликвоты доводили до pH 4 и инкубировали в течение 24 часов при 40°C. После инкубации в течение 24 часов pH всех аликвот доводили до 4,8 с использованием 10% (масс./масс.) гидроксида натрия. Затем каждую аликвоту подвергали серийному разведению стерильной водой, высевали распределением на PDA и инкубировали при 25°C. Затем в инкубированных планшетах с PDA посчитывали КОЕ. Результаты представлены на фиг.3.

После воздействия в течение 24 часов условий индукции гибели клеток не было жизнеспособных клеток T. reesei, A. niger и P. funiculosum.

Индукция гибели клеток органическими кислотами, имеющими шесть или более атомов углерода

Отдельную не включенную в композицию аликвоту ферментационного бульона T. reesei далее разделяли на 10 аликвот и включали в композицию с органическими кислотами, имеющими 6 или более атомов углерода, как описано в таблице 2 ниже. Химические структуры и pKa органических кислот представлены на фиг.4.

Таблица 2
Композиция ферментационного бульона T. reesei с органическими кислотами, имеющими шесть или более атомов углерода
# аликвоты Т. reesei	Состав композиции
1	5 г/л циклогексанкарбоновой кислоты
2	15 г/л циклогексанкарбоновой кислоты
3	5 г/л L-аскорбиновой кислоты
4	15 г/л L-аскорбиновой кислоты
5	5 г/л адипиновой кислоты (pH 5)
6	15 г/л адипиновой кислоты (pH 5)
7	5 г/л 4-метилвалериановой кислоты
8	15 г/л 4-метилвалериановой кислоты
9	5 г/л 3-метилглутаровой кислоты
10	15 г/л 3-метилглутаровой кислоты
11	5 г/л фенилуксусной кислоты

Затем pH изготовленных культур доводили до 4,0 с использованием 10% (масс./масс.) серной кислоты. Затем изготовленные культуры инкубировали при 40°С. После инкубации в течение 2 и 4 часов pH изготовленных культур измеряли и доводили до 4,0 с помощью 10% (масс./масс.) серной кислоты и их возвращали к инкубации при 40°С. После инкубации в течение 24 часов изготовленные культуры извлекали и затем 100 мкл изготовленной культуры высевали распределением при разведениях 10⁰, 10¹, 10² и 10³ на PDA и инкубировали при 25°С. Затем в инкубированных планшетах с PDA подсчитывали КОЕ. Результаты представлены на фигуре 5.

Пример 2

Эффект цельного бульона с убитыми клетками на продукцию органических веществ в микроорганизмах

Цельный бульон с убитыми клетками получали из ферментационной культуры клеток T. reesei, которые секретируют ферменты экзоглюканазу, эндоглюканазу, гемицеллюлазу и бета-глюкозидазу во внеклеточную среду. Ферментационную культуру обрабатывали 0,28% масс. уксусной кислотой и 0,052% масс. бензоатом натрия при pH 4 и 40°С в течение 24 часов, как описано в примере 1 ("бульон A"), или 1,4% масс. уксусной кислотой, 0,26% масс. бензоатом натрия и 0,5% масс. сорбатом калия при pH 4 и 10°C в течение 24 часов ("бульон B"). Исследовали эффекты этих двух бульонов на ферментацию микроорганизма для продукции органического вещества. Бульоны использовали для гидролиза целлюлозного субстрата в целях получения гидролизата глюкана для применения в качестве источника углерода для выращивания микроорганизма. Оценивали продукцию органических веществ микроорганизмами, выращенными на гидролизате глюкана.

Получение гидролизата

Предварительную выжимку получали от National Renewable Energy Laboratory (NREL). Выжимка была предварительно обработана разбавленной серной кислотой и возрастающей температурой в NREL (Schell et al. (2004) Bioresource Technology 91, 179-188). Затем предварительно обработанную кислотой выжимку промывали деионизированной водой до тех пор, пока значение pH не становилось более 4,2, после чего остаточную воду удаляли фильтрацией в вакууме. Затем промытую предварительно обработанную кислотой выжимку (wAPB) автоклавировали в течение 20 минут при 121°C для удаления каких-либо контаминирующих микробов из субстрата wAPB. Затем из автоклавированного wAPB получали 13% (масс./масс.) гидролизат глюкана с использованием дозы бульона A или бульона В c 80 мг белка на грамм субстратного глюкана. Каждый гидролизат получали в условиях осахаривания, состоящих в 5 сутках инкубации при 50°C во вращающем устройстве, установленном на 200 об/мин. Затем концентрацию глюкозы в каждом гидролизате анализировали, следуя процедуре, описанной ниже в разделе анализа ВЭЖХ. После осахаривания wAPB каждый гидролизат разделяли на 3 флакона и разбавляли стерильным фильтрованным 50 мМ натрий-цитратном буфере (pH 4,8) с получением 1% (масс./масс.), 7% (масс./масс.) и 13% (масс./масс.) смесей гидролизатов глюкана.

Получение культуры Lactobacillus rhamnosus

Лиофилизированные Lactobacillus rhamnosus (ATCC7469) получали от American Type Culture Collection (ATCC) и регидратировали стерильной водой. Затем регидратированные L. rhamnosus высевали распределением на агар Lactobacilli MRS, приобретенный у Difco^TM (REF#288210), и инкубировали в течение 2 суток при 37°C для получения колоний L. rhamnosus. Затем колонии L. rhamnosus добавляли в асептических условиях во вращающийся флакон, содержащий бульон Lactobacilli MRS, приобретенный у Difco^TM (REF#288130). Затем вращающийся флакон с L. rhamnosus инкубировали во вращающем устройстве, установленном на 33°C и 150 об/мин, в течение 1 суток с получением выращенной культуры.

Ферментация гидролизата L. rhamnosus

Выращенную культуру L. rhamnosus инокулировали в концентрации 3% (об./масс.) в отдельные флаконы для гидролизата с wAPB с 7% (масс./масс.) глюканом, полученным с бульонами A и B. Флаконы, инокулированные L. rhamnosus, ферментировали в анаэробных условиях во вращающем устройстве, установленном на 37°C и 150 об/мин, в течение 5 суток. Взятие образцов ферментационных смесей проводили через 1, 2, 3 и 5 суток после инокуляции и анализировали в отношении концентраций молочной кислоты и глюкозы в соответствии с процедурой, описанной ниже в разделе "Анализ ВЭЖХ". Результаты представлены на фиг.6.

Одновременное осахаривание и ферментация (SSF) дрожжей Thermosacc

Промытую предварительно обработанную кислотой выжимку, 50 мМ натрий-цитратный буфер (pH 4,8), и бульон A или В добавляли в отдельные флаконы в концентрации 80 мг белка на грамм субстратного глюкана. Затем каждый флакон инокулировали 1% (об./масс.) регидратированных дрожжей Thermosacc, а затем инокулировали 1% (об./масс.) питательных веществ дрожжей, состоящих из 10% (масс./масс.) дрожжевого экстракта, 10% (масс./масс.) пептона и 1% (масс./масс.) глюкозы. Затем каждый флакон инкубировали во вращающем устройстве, установленном на 38°C и 150 об/мин. Взятие образцов ферментационных смесей проводили после инкубации в течение 2, 3, 4 и 5 суток и анализировали в отношении концентраций этанола и глюкозы в соответствии с процедурой, описанной ниже в разделе "Анализ ВЭЖХ". Результаты представлены на фиг.7 и 8.

Анализ ВЭЖХ

Все образцы для анализа ВЭЖХ разбавляли 10х в 5 мМ серной кислоте и фильтровали через 0,2-мкм фильтр перед инжекцией в ВЭЖХ. Анализ ВЭЖХ проводили использованием ионообменной колонки BioRad Aminex HPX-87H (300 мм × 7,8 мм).

Результаты

В гидролизате, полученном с бульонами A и В, продуцировалось свыше 130 г/л глюкозы с процентной конверсией глюкозы 90,4% и 92,6% соответственно. Молочная кислота не выявлялась ни в одном из гидролизатов.

Концентрация молочной кислоты, продуцированной из L. rhamnosus, возрастает при более низкой нагрузке глюканом wAPB, указывая на сильный ингибиторный эффект субстрата. При нагрузке 13% глюканом гидролизатов wAPB, полученных с бульонами A и В, уровень продуцированной молочной кислоты значимо не отличался между ними. Продукция молочной кислоты из L. rhamnosus при нагрузке 7% глюканом wAPB, полученным из бульона A, в 1,5 раза превышала продукцию молочной кислоты из гидролизата, полученного с бульоном В. На фиг.6 представлен график, сравнивающий продукцию молочной кислоты из L. rhamnosus на гидролизате wAPB, продуцированном из бульонов A и B.

Продукция этанола из дрожжей Thermosacc на 13% глюкане гидролизата wAPB, полученного из бульона A, была в 12,5 раз больше, чем в случае гидролизата, продуцированного из бульона В (фиг.7). На фиг.7 представлен график, сравнивающий продукцию этанола из дрожжей Thermosacc на гидролизате wAPB с 13% глюканом, полученном из бульонов A и B. После ферментации дрожжей Thermosacc в течение 5 суток остаточное накопление глюкозы из гидролизата, полученного в бульоне В, в 4 раза превышало накопление глюкозы в случае гидролизата, полученного в бульоне A. На фиг.8 представлен график, сравнивающий накопление глюкозы в процессе ферментации дрожжей Thermosacc на гидролизате, продуцированном в бульонах A и B.

Хотя описанное выше изобретение подробно описано с помощью иллюстрации и примеров для ясности понимания, специалистам в данной области понятно, что можно проводить определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема изобретения. Таким образом, описание не следует истолковывать как ограничивающее объем изобретения.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем документе, включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме для всех целей и в той же степени, как если бы было конкретно и отдельно указано, что каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка включены в качестве ссылок.

1. Способ получения состава ферментационного бульона, включающий инкубацию смеси, содержащей
(a) один или несколько ферментационных бульонов,
(b) первый компонент органической кислоты, включающий или состоящий из по меньшей мере одной из: уксусной кислоты, соли уксусной кислоты, муравьиной кислоты, соли муравьиной кислоты, пропионовой кислоты, соли пропионовой кислоты, или смеси двух или более из указанных выше в количестве от 0,1% до 15% масс. указанной смеси, и
(c) второй компонент органической кислоты, включающий или состоящий из по меньшей мере одной из: бензойной кислоты, соли бензойной кислоты, циклогексанкарбоновой кислоты, соли циклогексанкарбоновой кислоты, 4-метилвалериановой кислоты, соли 4-метилвалериановой кислоты, фенилуксусной кислоты, соли фенилуксусной кислоты, или смеси двух или более из указанных выше, в количестве от 0,025% до 5% масс. указанной смеси,
в течение периода времени и в условиях, которые приводят к снижению количества жизнеспособных клеток, составляющему по меньшей мере 4 log, в указанных одном или нескольких ферментационных бульонах, тем самым получая состав ферментационного бульона,
где указанные условия включают pH от 3,5 до 5 и температуру от 20°C до 50°C, где указанный период времени составляет от 8 часов до 36 часов и клетки представляют собой клетки нитчатых грибов.

2. Способ по п. 1, где указанный первый компонент органической кислоты присутствует в количестве от 0,2% до 1%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 10%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. указанной первой смеси.

3. Способ по п. 1, где указанный второй компонент органической кислоты присутствует в количестве от 0,04% до 3%, от 0,2% до 0,5%, от 0,1% до 1%, от 0,25% до 5% или от 0,3% до 3% масс. указанной первой смеси.

4. Способ по п. 1, где указанный период времени составляет от 20 часов до 28 часов.

5. Способ по п. 1, где указанные условия включают температуру от 25°C до 40°C.

6. Способ по п. 5, где указанные условия включают температуру от 28°C до 33°C.

7. Способ по п. 1, где указанные условия включают pH от 4 до 4,7.

8. Способ по п. 7, где указанные условия включают pH от 4,2 до 4,5.

9. Способ по п. 1, где указанную инкубацию проводят в течение периода времени и в условиях, которые приводят к снижению количества жизнеспособных клеток в указанном одном или нескольких ферментационных бульонах, составляющему по меньшей мере 5 log, 6 log, 7 log или 8 log.

10. Способ по п. 1, где указанное снижение жизнеспособных клеток по меньшей мере в 0,5 раз, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз превышает снижение во второй смеси, подвергнутой указанным условиям, где указанная вторая смесь содержит только один из указанного первого компонента органической кислоты и указанного второго компонента органической кислоты, в количестве вплоть до суммы массовых процентов первого и второго компонентов органической кислоты в указанной первой смеси.

11. Способ по п. 1, где клетки нитчатых грибов представляют собой клетки рода Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Chrysosporium или Neurospora.

12. Способ по п. 1, где первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту и/или ее соль или состоит из них.

13. Способ по п. 1, где второй компонент органической кислоты содержит бензойную кислоту и/или ее соль или состоит из них.

14. Способ по п. 1, где указанный первый компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль указанной кислоты и/или где указанный второй компонент органической кислоты содержит натриевую, калиевую, кальциевую или магниевую соль указанной кислоты.

15. Способ по п. 1, где указанный первый компонент органической кислоты содержит уксусную кислоту в концентрации 0,2%-0,4% масс. и второй компонент органической кислоты содержит бензоат натрия в концентрации 0,2%-0,4% масс.

16. Способ по п. 15, где указанный период времени составляет 24 часа, указанные условия включают температуру 40°C и указанное значение pH составляет от 4 до 4,6.

17. Способ по п. 1, где по меньшей мере один из указанных одного или нескольких ферментационных бульонов содержит один или несколько белков, секретируемых указанными клетками.

18. Способ по п. 17, где указанный по меньшей мере один из указанных одного или нескольких белков экспрессируется рекомбинантно указанными клетками.

19. Способ по п. 17, где по меньшей мере один из указанных одного или нескольких белков представляет собой фермент.

20. Способ по п. 19, где указанный фермент представляет собой экзоглюканазу, эндоглюканазу, гемицеллюлазу или β-глюкозидазу.

21. Способ по п. 17, где по меньшей мере один из указанных одного или нескольких ферментационных бульонов содержит множество ферментов, экспрессируемых рекомбинантно и секретируемых клетками.

22. Способ по п. 21, где указанное множество ферментов представляет собой каждый из экзоглюканазы, эндоглюканазы, гемицеллюлазы или β-глюкозидазы.

23. Способ по п. 1, где указанные условия приводят к составу ферментационного бульона, имеющему по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% ферментативной активности указанного одного или нескольких ферментационных бульонов.

24. Способ по п. 1, где белки составляют 5-15% масс. от указанной первой смеси.

25. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию добавления pH-корректирующего средства в указанную первую смесь в ходе указанного периода инкубации.

26. Способ по п. 25, где указанное pH-корректирующее средство представляет собой фосфорную кислоту.

27. Способ по п. 25, где указанное pH-корректирующее средство представляет собой серную кислоту.

28. Способ по п. 25, где указанное pH-корректирующее средство представляет собой гидроксид натрия.

29. Способ по п. 1, где указанная первая смесь дополнительно содержит одно или несколько противомикробных средств.

30. Способ по п. 29, где указанные одно или несколько противомикробных средств присутствуют в количестве от 0,0005 до 0,05% масс. указанной первой смеси.

31. Способ по п. 30, где указанные одно или несколько противомикробных средств присутствуют в количестве от 0,001 до 0,025% масс. указанной первой смеси.

32. Способ по п. 29, где противомикробное средство содержит экстракт хмеля, содержащий изо-альфа-кислоты, тетра-изо-альфа-кислоты и/или бета-кислоты.

33. Способ по п. 1, дополнительно включающий получение указанной первой смеси перед указанной стадией инкубации.

34. Способ по п. 33, где указанную первую смесь получают с помощью процесса, включающего комбинирование одного или нескольких ферментационных бульонов по меньшей мере с одной органической кислотой, включающей или состоящей из: уксусной кислоты, соли уксусной кислоты, муравьиной кислоты, соли муравьиной кислоты, пропионовой кислоты, соли пропионовой кислоты, или смеси двух или более из указанных выше, по меньшей мере одной органической кислотой, включающей или состоящей из: бензойной кислоты, соли бензойной кислоты, циклогексанкарбоновой кислоты, соли циклогексанкарбоновой кислоты, 4-метилвалериановой кислоты, соли 4-метилвалериановой кислоты, фенилуксусной кислоты, соли фенилуксусной кислоты, или смеси двух или более из указанных выше, и, необязательно, одним или несколькими дополнительными реагентами.

35. Способ по п. 34, где указанные один или несколько дополнительных реагентов содержат pH-корректирующее средство и/или противомикробное средство.