Инъекционная лекарственная форма олигопептидного препарата для лечения рассеянного склероза и способ ее получения
Владельцы патента RU 2561582:
Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации (RU)
Открытое Акционерное Общество "Фармсинтез" (RU)
Группа изобретений относится к области фармацевтики и касается инъекционной лекарственной формы олигопептидов для лечения рассеянного склероза. Инъекционная лекарственная форма содержит олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, заключенные в липосомы, состоящие из смеси маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина, 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина, а также лактозу в качестве криопротектора и альфа-токоферол в качестве антиокислителя, а также способ ее приготовления. Группа изобретений обеспечивает усиление лечебного эффекта. 2 н.п. ф-лы, 2 пр., 1 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к инъекционному лекарственному средству для лечения рассеянного склероза (PC), а именно фармацевтической композиции, содержащего смесь трех олигопептидов в эквимолярном соотношении,
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
заключенному в липосомы, состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8) и содержащему в качестве стабилизатора и криопротектора лактозу, а в качестве антиокислителя - α-токоферол, и способу ее получения.
Известны лекарственные средства для лечения рассеянного склероза на основе олигопептидов и смесей олигопептидов. Эти олигопептиды представляют собой по химической структуре (аминокислотной последовательности) фрагменты основного белка миелина человека (ОБМ). Такие олигопептиды обозначаются соответственно порядковому номеру первой и последней аминокислоты, считая от С конца полной аминокислотной цепочки ОБМ. Например, ОБМ 18-32, то есть ASTMDHARHGFLPR или, например, ОБМ 75-98, то есть AGAPWHPPLAIVTPAT.
Известно, что часть пролиферирующих T-клеток у больных рассеянным склерозом направлена против ОБМ (Allegretta et al. Science, 718-721, 1990), и что T-клетки человека могут узнавать множественные эпитопы на молекуле (Richer! et al., J. Neuroimmun 23, 55-66, 1989). ОБМ, по-видимому, также способна к активации некоторых T-клеток без вовлечения антиген-презентирующих клеток [Eur J Immunol. 17, 1635-1640, 1987]. Возможно, что небольшие олигопептиды-фрагменты ОБМ могут распознаваться Т-клетками без внутриклеточного процессинга просто за счет их способности связывать антигены основного комплекса гистосовместимости класса II на поверхности антиген-презентирующих клеток.
Известны и хорошо изучены эпитопы (участки) ОБМ, ответственные за «узнавание» теми или иными специфическими T-клетками, выделенными из крови больных PC и обеспечивающими иммунологическую «атаку» на ОБМ, а также В-клетками, вырабатывающие аутоантитела, направленные против ОБМ.
Моделью рассеянного склероза человека у животных служит экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), представляющий собой демиелинизирующий процесс, опосредованный T-клетками заболевания. Течение ЭАЭ может быть приостановлено путем введения мышам синтетических пептидов, содержащих участки, гомологичные иммунодоминантным эпитопам ОБМ (Gaur, A. et al., Science, 258, 1491-1494, 1992). Введение высоких доз ОБМ снижало количество аутореактивных T-клеток и аннулировало клинические и патологические симптомы ЕАЕ у мышей (Gritchfield, J. M. et al., Science, 263, 1139-1143, 1994). Оральное введение ОБМ модулировало течение ЕАЕ за счет индукции периферической толерантности (Chen, W. et al., Science, 265, 1237-1240, 1394).
В связи с обнаружением таких эпитопов предпринимались и предпринимаются попытки с помощью коротких синтетических пептидов (олигопептидов), имеющих последовательность, гомологичную одному или нескольким эпитопам (фрагментам). Также описаны короткие пептиды, которые могут блокировать или связывать так называемые каталитические антитела, обнаруживаемые у больных рассеянным склерозом и вызывающие разрушение ОБМ. Так, показано, что введение животным с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (известной моделью рассеянного склероза человека) водных растворов коротких пептидов (олигопептидов)
(1) GGDRGAPKRGSGKDSHH
(2) GFGYGGRASDYKSAHK
(3) QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
приводит к уменьшению симптомов заболевания [Belogurov AA et al., Suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis in DA rats by novel peptide drug, structural part of human myelin basic protein 46-62. Autoimmunity, 2009 May; 42(4): 362-4].
Подобный эффект как это предполагается авторами вышеуказанной статьи обусловлен специфическим («антиген-антитело») связыванием и, соответственно, инактивацией каталитических антител, ответственных за развитие и поддержание процесса демиелинизации при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите у мышей.
Однако, как неожиданно было обнаружено авторами настоящего изобретения, лечебный эффект этих олигопептидов опосредуется через непосредственный контакт с антигенпрезентирующими клетками, и такое взаимодействие приводит к возникновению иммунологической толерантности, при этом продукция антител против ОБМ, в том числе каталитических, уменьшается.
Соответственно, для усиления лечебного эффекта этих олигопептидов авторы настоящего изобретения предлагают адъювантизацию вышеуказанных олигопептидов с использованием метода интеграции этих олигопептидов в липосомы определенного состава с добавлением других вспомогательных веществ.
Как известно, для усиления эффекта индукции толерантности к тем или иным антигенам применяются так называемые «адъюванты» - различные неорганические и органические вещества, вводимые совместно или в одной лекарственной форме с самим антигеном (см., например, Adjuvants for Allergen Immunotherapy: Experimental Results and Clinical Perspectives James N Francis; Stephen R Durham, Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2004; 4(6)). К таким адъювантам относятся, в частности, например, 3-о-дезацил-4'-монофосфорил липид А и алюминия гидроксид.
Известно, что в случае использования липосомальных вакцин иммунный ответ усиливается вследствие того, что антигены, ассоциированные с липосомами, попадают непосредственно в антигенпредставляющие клетки [Gluck R. (1995) In Vaccine Design: The Submit and Adjuvant Approch (Powell M.F., Newman M.J., eds)., Plenum Press. P.325-345], в случае олигопептидов - фрагментов ОМБ, однако, предсказать заранее, не приведет ли подобная адъювантизация к обратному эффекту, то есть к усилению производства каталитических антител сенсибилизированными В-клетками и соответственно к отрицательному клиническому эффекту, невозможно.
Например, предпринимались попытки усилить лечебное действие олигопептида-фрагмента ОБМ (а именно ОБМ 113-122) при ЭАЭ путем предварительной липофилизации олигопептида и внедрения в липосомы перед введением. Однако такая «липосомальная» адъювантизация не приводила к усилению эффекта при подкожном введении [Avrilionis К. and Boggs J.M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by the encephalitogenic peptide, in solution or bound to liposomes, J Neuroimmunol. 1991 Dec; 35(1-3): 201-10].
В последние десятилетия для адъювантизации тех или иных вакцин используется метод включения самого антигена в состав липосом специально подобранного состава (Заявка США 20070082043).
Описан способ направленного подавления определенного клона Т-клеток, ответственного за развитие ЭАЭ у животных и несущего интерферон - индуцибельный маркер CXCR3 с помощью ДНК-плазмиды, помещенной в липосомы [Chen W et al. In vivo administration of plasmid DNA encoding recombinant immunotoxin DT390-IP-10 attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 2007 Feb; 28(1): 30-40. Epub 2007 Jan 30].
Для усиления взаимодействия инкапсулированного антигена с антигенпрезентирующими клетками иммунной системы в состав липосом вводятся моно- и поли-маннозилированые липидные аналоги, [Garcon, N.; Gregoriadis, G.; Taylor, M. and Summerfield, J. Mannose-mediated targeted immunoadjuvant action of liposomes, Immunology. 1988 August; 64(4): 743-745], [Liposomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers, Series: Methods in Molecular Biology, Volume: 605, 2009, pp.177-188), в частности, например, Man4DOG3K8 [Espuelas, S. et al., Synthesis of an amphiphilic tetraantennary mannosyi conjugate and incorporation into liposome carriers, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 13, Issue 15, 4 August 2003, pages 2557-2560].
Однако такой подход требует тщательного подбора компонентов липосом и их размеров при обеспечении достаточной нагрузки липосом антигеном (то есть процента включенного в липосомы белка или пептида), а также количества маннозилированого компонента в составе липосом.
Вообще, сама по себе «адъювантизация» не предполагает a priory повышения эффективности лечебного действия и не является очевидной для этого в отношении того или иного антигена.
Так, предпринимались попытки усилить лечебное действие олигопептида-фрагмента ОБМ (а именно ОБМ 113-122) при ЭАЭ путем предварительной липофилизации олигопептида и внедрения в липосомы перед введением. Однако такая «липосомальная» адъюванитизация не приводила к усилению эффекта при подкожном введении [Avrilionis K. and Boggs J.M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by the encephalitogenic peptide, in solution or bound to liposomes, J Neuroimmunol. 1991 Dec; 35(1-3): 201-10].
Кроме того, недостатком водных растворов (или растворов в физиологически совместимых буферах, таких как фосфатный буфер) препаратов на основе пептидов является их быстрая деградация при введении в организм вследствие воздействия пептидаз.
Как известно, большинство фармацевтических препаратов, содержащих липососомы, представляют лиофильно-высушенные порошки, которые перед применением «восстанавливают» до суспензии липосом путем прибавления водного солевого забуференного раствора, и затем полученную липосомальную суспензию вводят тем или иным путем в организм. Для повышения стабильности лиофильно-высушенных порошков липосомальных препаратов, а также в качестве криопротектора при лиофилизации липосомальных препаратов в их состав вводится стабилизаторы, такие как сахара, а для снижения степени окисления липидов вводятся антиоксиданты, например, альфа-токоферол. Однако введение лактозы или иных сахаров в состав липосомальных препаратов может привести к уменьшению включения водорастворимых белков в липосомальную часть препарата, что закономерно снизит его лечебную эффективность.
Целью настоящего изобретения является создание инъекционной лекарственной формы на основе указанных пептидов с целью повышения эффективности их действия, а также увеличения стабильности препарата при хранении, а также стабильности препарата после его реконституции в полярном растворителе.
Поставленная задача достигается тем, что в качестве средства для лечения рассеянного склероза предлагается инъекционная лекарственная форма олигопептидов
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
которая содержит:
олигопептиды
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
включенные в липосомы размером от 100 до 200 нм, состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8);
лактозу;
α-токоферол при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| GGDRGAPKRGSGKDSHH | (0,1+0,07) |
| GFGYGGRASDYKSAHK | (0,1+0,07) |
| QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR | (0,1+0,07) |
| Липосомальная оболочка: | |
| 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолин | (20,0+5,0) |
| Маннозиалированый | |
| дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (Man4DOG3K8) | (0,003+0,002) |
| Антиокислитель: | |
| α-Токоферол (Eur. Ph.) | (0,003+0,002) |
| Криопротектор-стабилизатор: | |
| лактоза | (80,0+5,0) |
В процессе работы над настоящим изобретением авторами был неожиданно обнаружен феномен синергического действие вышеуказанных олигопептидов в отношении подавления симптомов экспериментального энцефаломиелита. Было неожиданно установлено, что при совместном применении лечебный эффект этих олигопептидов потенцируется. То есть их лечебный эффект при совместном применении выше, чем сумма эффектов, производимых ими по отдельности. Последнее, возможно, обусловлено тем, что один олигопептид содержит лишь ограниченное количество эпитопов ОБМ.
В настоящем изобретении, указанные активные и вспомогательные компоненты (криоконсерванты и антиокислители), в составе предложенного лекарственного средства, в указанном соотношении обеспечивают наилучшее включение олигопептидов в состав липосом, стабильность препарата при хранении, высокую лечебную эффективность.
Далее согласно изобретению предлагается способ приготовления инъекционной лекарственной формой олигопептидов
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
которая содержит:
олигопептиды
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
включенные в липосомы размером от 100 до 200 нм, состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8);
лактозу;
α-токоферол при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| GGDRGAPKRGSGKDSHH | (0,1+0,07) |
| GFGYGGRASDYKSAHK | (0,1+0,07) |
| QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR | (0,1+0,07) |
| Липосомальная оболочка: | |
| 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолин | (20,0+5,0) |
| Маннозиалированый | |
| дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (Man4DOG3K8) | (0,003+0,002) |
| Антиокислитель: | |
| α-Токоферол (Eur. Ph.) | (0,003+0,002) |
| Криопротектор-стабилизатор: | |
| лактоза | (80,0+5,0) |
при котором механическую смесь олигопептидов
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
растворяют в воде, затем смешивают с водной суспензией моноламеллярных липосом, размером 50-80 нм, предварительно полученных путем регидратации липидной пленки с последующей дезинтеграции получившихся мультиламеллярных липосом, полученную смесь олигопептидов и липосом стерильно фильтруют, разливают по флаконам, лиофильно высушивают, заполняют азотом, укупоривают резиновыми пробками и обкатывают колпачками.
Далее согласно изобретению предлагается способ лечения рассеянного склероза, отличающийся тем, что пациенту вводят в эффективном количестве инъекционную лекарственную форму олигопептидов
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
которая содержит:
олигопептиды
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
включенные в липосомы размером от 100 до 200 нм, состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8);
лактозу;
α-токоферол при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| GGDRGAPKRGSGKDSHH | (0,1+0,07) |
| GFGYGGRASDYKSAHK | (0,1+0,07) |
| QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR | (0,1+0,07) |
| Липосомальная оболочка: | |
| 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолин | (20,0+5,0) |
| Маннозиалированый | |
| дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (Man4DOG3K8) | (0,003+0,002) |
| Антиокислитель: | |
| α-Токоферол (Eur. Ph.) | (0,003+0,002) |
| Криопротектор-стабилизатор: | |
| лактоза | (80,0+5,0) |
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Синтез олигопептидов
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
осуществляли на автоматическом пептидном синтезаторе с использованием стандартной FMOC-стратегии. Строение олигопептидов было подтверждено с помощью MALDI-масс-спектрометрии.
Размер липосом в заявляемой инъекционной лекарственной форме определяли при помощи фотокорреляционного спектрометра Zetasizer Nano S. Для этого 100 мг порошка заявляемой лекарственной формы ресуспендировали в 1 мл воды для инъекций. Аликвоту 50 мкл вносили в кювету вместимостью 1 мл, содержащую 950 мкл воды, перемешивали, помещали в прибор и проводили измерения согласно инструкции производителя к прибору.
Фосфолипиды были закуплены в компании Sigma-Aldrich.
Пример 1. Приготовление заявляемой инъекционной лекарственной формы, содержащей олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, включенные в липосомы.
Приготовление раствора липидов в хлороформе. В круглодонную колбу ротационного испарителя РИ-1.1 объемом 10,0 л с помощью мерного цилиндра наливают 3,3 л хлороформа, добавляют 0,319 г липида Man4K3DOG, 31,95 г 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфохолина и 0,319 г α-токоферола. На управляющем терминале ротационного испарителя устанавливают температуру бани 37°С, скорость перемешивания 50 об/мин и перемешивают в течение 15 мин до полного растворения.
Упаривание раствора липидов. Температуру бани ротационного испарителя устанавливают 40°С, задают скорость вращения 200 об/мин (Кт ТП.6.2-2) и начинают упаривать раствор липидов в хлороформе, полученный на предыдущей стадии, под вакуумом. Раствор упаривают до образования липидной пленки, о полноте отгонки растворителя судят по прекращению каплеотделения и помутнению липидной пленки. Конденсат хлороформа собирают в сборник конденсата. Колбу с липидной пленкой передают на следующую стадию.
Регидратация липидной пленки. Температуру бани ротационного испарителя устанавливают 37°С, задают скорость вращения 200 об/мин. Осторожно приоткрывая вентиль на заборной линии подачи жидкости в колбу ротационного испарителя, содержащую липидную пленку, при помощи вакуума, добавляют первые 10% (305 мл) воды со средней скоростью, не превышающей примерно 10 мл/мин. Следующую порцию воды очищенной 20% (610 мл) добавляют таким образом, чтобы средняя скорость подачи воды не превышала примерно 20 мл/мин. Третью порцию воды 915 мл добавляют со скоростью примерно 30 мл/мин. Последнюю порцию воды 1220 мл добавляют со скоростью примерно 40 мл/мин.
По окончании добавления воды реакционную массу перемешивают в колбе ротационного испарителя в токе азота в течение 15-20 мин, затем передают ее на следующую стадию
Дезинтеграция липосом. Дезинтеграцию липосом ведут в гомогенизаторе APV-2000 для получения гомогенных малоразмерных липосом под давлением. Устанавливают давление ударного воздействия 150 МПа, минимальная единовременная загрузка суспензии липосом 100 мл. Рабочий цикл ведется при комнатной температуре в токе азота в течение 2 мин. Суспензию липосом загружают в приемник дезинтегратора Сб-4, осуществляют рабочий цикл, раствор малоразмерных липосом собирают в сборнике дезинтегратора. Таким образом, осуществляют 10 циклов дезинтеграции всего объема суспензии липосом, полученной после регидратации. В процессе 10 цикла дезинтеграции загружают 128,0 г лактозы. По окончании процесса дезинтеграции полученный раствор перемешивают для усреднения и отбирают пробу для определения размера липосом. При удовлетворительном результате контроля размера частиц 50-80 нм раствор передают на следующую стадию. При отрицательном результате контроля (размер частиц более 80 нм) раствор липосом подвергают повторной дезинтеграции.
Приготовление смеси целевых олигопептидов и липосом: в смесительный модуль Mobius Single-use Mixing Systems объемом 10,0 л устанавливают разовую полиэтиленовую емкость. К азотному порту разовой полиэтиленовой емкости смесительного модуля присоединяют шланг подачи стерильного азота, остальные загрузочные и разгрузочные порты при этом перекрыты. Разовым кратковременным открытием вентиля на линии подачи азота расправляют полиэтиленовую емкость. После этого открывают порт подачи жидких реагентов и с помощью мерного цилиндра загружают 24 мл воды очищенной, на терминале управления задают параметры перемешивания и включают магнитную мешалку. Открыв порт подачи сухих реагентов, при перемешивании, добавляют 0,479 г комбинации олигопептидов в равном мольном соотношении (0,136 мг - олигопептида GGDRGAPKRGSGKDSHH, 0,135 мг - олигопептида GFGYGGRASDYKSAHK, 0,208 мг - олигопептида QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR). Перемешивают в течение 10 минут до полного растворения. По окончании растворения, через порт подачи жидких реагентов добавляют суспензию липосом, полученную на стадии «Дезинтеграция липосом», перемешивают под азотной подушкой в течение 30 мин, при этом загрузочные порты закрыты. Готовую смесь олигопептидов и липосом передают на следующую стадию.
Стерилизующее фильтрование. По окончании перемешивания при помощи силиконового шланга соединяют разгрузочный порт смесительного модуля с системой стерилизующих фильтров диаметром пор 0,45/0,22 мкм, которая соединена с разовой приемной емкостью стерильной смеси при помощи шланга с обжимным концом. Питающий конец силиконового шланга находится в зоне класса чистоты С. Шланг через уплотнительную муфту входит в изолятор, стерилизующая система, обжимной шланг и приемная емкость находится в изоляторе.
Открывают разгрузочный порт смесительного модуля и вентиль на подачи стерильного азота. Передавливают смесь олигопептидов и липосом через собранную стерилизующую систему в приемную емкость, во время фильтрации смеси контролируют давление на линии подачи стерильного азота по показаниям манометра, корректируя с помощью редуктора значение давления от 0,07 до 0,15 МПа (от 0,7 до 1,5 бар). Прекращают подачу азота в смесительный модуль и перекрывают обжимной шланг к приемной емкости стерильной смеси.
При помощи силиконовых шлангов соединяют приемную емкость стерилизованной смеси с депирогенизирующим фильтром 0,22 мкм и разовой приемной емкостью депирогенизированного раствора, установленной на магнитной мешалке. Включают магнитную мешалку. К емкости стерилизованной смеси присоединяют линию подачи стерильного азота и открытием вентиля подачи азота передавливают смесь через депирогенизирующий фильтр в приемную емкость.
Силиконовый шланг, соединяющий депирогенизирующий фильтр с финишной приемной емкостью, перекрывают зажимом с образованием блокирующего полукольца. Аналогичным полукольцом блокируют силиконовый шланг, соединяющий разгрузочный порт смесительного модуля с системой стерилизующих фильтров. Отсоединяют силиконовые шланги с входного фитинга стерилизующего фильтра и выходного фитинга депирогенизирующего фильтра. Снимают соединения азотной линии с приемной емкости стерилизованной смеси. Отсоединенную разовую стерилизующую систему сбрасывают в контейнер для отходов, предусмотренный в изоляторе.
Стерилизованную и депирогенизированную смесь олигопептидов и липосом перемешивают в течение 15 мин. По окончании перемешивания отбирают пробу для определения концентрации смеси. Готовую стерилизованную и депирогенизированную смесь олигопептидов и липосом передают на следующую стадию.
Стерильный розлив и лиофильная сушка. Стерильные флаконы для инъекций объемом 10 мл, в количестве 1000 шт. заносят в передаточный шлюз изолятора, снимают первичную упаковку, закрывают крышку шлюза и обрабатывают флаконы УФ-излучением в течение 15 минут. Тем временем из лиофильной сушилки Epsilon 2-1 OD, находящейся в изоляторе, достают поддоны и устанавливают на стол изолятора. По окончании обработки флаконов УФ-излучением открывают внутреннюю крышку шлюза, ведущую в изолятор, вскрывают первичную упаковку и устанавливают флаконы в поддоны лиофильной сушилки Epsilon 2-10D, использованную упаковку сбрасывают в контейнер для отходов, предусмотренный в изоляторе. Таким же образом заносятся стерильные крышки и колпачки флаконов в изолятор.
Стерилизованная и депирогенизированная смесь олигопептидов и липосом из приемной емкости при помощи диспенсера eLINE Pro дозируется во флаконы примерно по 2,5 мл с учетом концентрации смеси, таким образом, чтобы концентрация действующего вещества в конечном лиофилизате составляла 0,45 мг в одном флаконе. По окончании дозирования смеси на каждый флакон легким нажатием устанавливается крышка, таким образом, чтобы оставалось отверстие для испарения жидкости. Не плотно укупоренные флаконы на поддонах устанавливаются в лиофильную сушилку Epsilon 2-10D.
Производится процесс лиофильного высушивания: задается температура полок -(45±2)°С и время замораживания 3-4 часа. После достижения материалом указанной температуры производится выдержка в течение 5-6 часов. Конденсатор сушилки охлаждается до -(80±5)°С и включается вакуумный насос. Остаточное давление в сушилке задают 0,01 mbar (1 Па), время выхода на режим сублимации составляет 55-65 мин. Производится сушка препарата в течение 6 часов при указанных параметрах. По истечении указанного времени начинается постепенный нагрев полок и материала со скоростью (5-6)°С в час, задается остаточное давление 0,005 mbar. При достижении температуры (8-10)°С нагрев прекращается и выдерживается материал в этих условиях в течение 3 часов. Об окончании процесса высушивания свидетельствует постоянная температура материала, равная температуре полок, постоянный уровень вакуума (0,005 mbar), срабатывает датчик понижения давления паров. По окончании сушки отключается вакуумный насос, камера сушилки заполняется сухим стерильным азотом и в автоматическом режиме происходит заключительное укупоривание флаконов.
Получают 1000 флаконов лиофилизированного продукта, каждый флакон содержит 125,98±6,0 мг лиофилизата.
Также применялись различные варианты приготовления лекарственной формы, в том числе оптимальное количество лактозы, что определялось по количеству включенного пептидного компонента после регидратации.
Пример 2. Лечебная эффективность заявляемой инъекционной лекарственной формы, содержащей олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR в отношении развития и течения экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс линии DA.
Для индукции ЭАЭ крысам линии DA, массой 220-250 г (возраст 12-14 месяцев), подкожно в переднюю лапку вводили 10 мкг энцефалогенного фрагмента основного белка миелина (ARTTHYGSLPQKSQRSQ), («Anaspec»,CUJA), эмульсифицированного в полном адъюванте Фрейнда («Difco», США) (1:10, вес/объем). Крысы взвешивались каждый день и оценивались на наличие неврологических симптомов ЭАЭ. Оценка производилась в соответствии со следующей шкалой: (0) - отсутствие симптомов ЭАЭ; (1) - снижение тонуса хвоста; (2) - снижение рефлекса выпрямления; (3) - парезы; (4) - полный паралич; (5) - агония или смерть. Менее выраженные симптомы ЭАЭ оценивались в 0,5 балла. На 6 день после индукции ЭАЭ животные случайным образом распределялись в различные группы (по 12 животных в группе). Животным соответствующей группы, с 6 по 11 дни включительно (после индукции) вводили подкожно: либо заявляемую инъекционную лекарственную форму, приготовленную, как это описано в Примере 1, разведенную (эмульгированные в фосфатном солевом растворе, рН 7.4) (ФБР), либо плацебо (растворитель - забуференный фосфатный солевой раствор (ФБР) (рН 7.4)), либо раствор механической смеси олигопептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, взятых в эквимолярном соотношении в (ФБР) (рН 7.4). Все растворы готовили с использованием в качестве растворителя забуференного фосфатного солевого раствора (ФБР) (рН 7.4). Препараты вводились в объеме 0,1 мл/животное ежедневно один раз в день. Разовая доза препаратов составляла (в пересчете на пептидный компонент) 160 мкг на животное.
Результаты эксперимента представлены в Таблице 1:
| Таблица 1 | |||
| Влияние заявляемой инъекционной лекарственной формы, плацебо и глатирамера ацетата на течение ЭАЭ у крыс линии DA | |||
| Выраженность неврологических симптомов ЭАЭ в баллах (среднее) | |||
| День после индукции ЭАЭ | Заявляемая инъекционная лекарственная форма | Плацебо | смесь олигопептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; |
| GFGYGGRASDYKSAHK; | |||
| QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR | |||
| -1 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 1 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 2 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 3 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 4 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 5 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 6 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 7 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 8 | 0,75 | 0,50 | 0,50 |
| 9 | 0,90 | 1,50 | 1,37 |
| 10 | 1,36 | 2,33 | 2,07 |
| 11 | 1,47 | 2,42 | 2,12 |
| 12 | 1,52 | 2,34 | 1,95 |
| 13 | 1,54 | 1,92 | 1,73 |
| 14 | 1,18 | 2,17 | 2,05 |
| 15 | 0,40 | 1,92 | 1,34 |
| 16 | 0,28 | 1,58 | 1,00 |
| 17 | 0,14 | 1,93 | 0,27 |
| 18 | 0,18 | 1,83 | 0,31 |
| 19 | 0,16 | 1,75 | 0,25 |
| 20 | 0,00 | 1,67 | 0,17 |
Как следует из таблицы 1, заявленная инъекционная лекарственная форма обладает гораздо большей способностью уменьшать выраженность и скорость развития симптомов ЭАЭ у животных, чем механическая смесь олигопептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR.
1. Инъекционная лекарственная форма олигопептидов для лечения рассеянного склероза
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
отличающаяся тем, что содержит:
олигопептиды
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
включенные в липосомы размером от 80 до 50 нм и состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8);
лактозу;
α-токоферол при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| GGDRGAPKRGSGKDSHH | (0,1±0,07) |
| GFGYGGRASDYKSAHK | (0,1±0,07) |
| QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR | (0,1±0,07) |
| Липосомальная оболочка: | |
| 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолин | (20,0±5,0) |
| Man4DOG3K8 | (0,003±0,002) |
| Антиокислитель: | |
| α-Токоферол (Eur. Ph.) | (0,003±0,002) |
| Криопротектор-стабилизатор: | |
| лактоза (Eur. Ph.) | (80,0±5,0) |
2. Способ приготовления инъекционной лекарственной формы
олигопептидов
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
по п.1, отличающийся тем, что механическую смесь олигопептидов
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
растворяют в воде, затем смешивают с водной суспензией моноламеллярных липосом, размером 50-80 нм, предварительно полученных путем регидратации липидной пленки с последующей дезинтеграцией получившихся мультиламеллярных липосом и контролем размера частиц, и добавлением лактозы, полученную смесь олигопептидов и липосом стерильно фильтруют, разливают по флаконам, лиофильно высушивают, заполняют азотом, укупоривают резиновыми пробками и обкатывают колпачками.
