Антитела к рецепту глюкагона и их использование
Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Представлено выделенное антитело (Ab7), специфически связывающееся с рецептором глюкагона человека, содержащее тяжелую цепь и легкую цепи, вариабельные области которых содержат аминокислотные последовательности, представленные в описании как SEQ ID NO:12 и 28, соответственно. Описана фармацевтическая композиция для лечения диабета II типа, содержащая эффективное количество указанного антитела и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Кроме того, раскрыты: выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело, и рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, ингибирующих рецептор глюкагона человека. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям и способам, относящимся к антителам к рецептору глюкагона и производным этих антител. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям и их производным, подходящим для таких способов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению, диагностическому использованию и терапевтическому использованию моноклональных и поликлональных антител и их фрагментов, которые специфически связываются с рецептором глюкагона.
Уровень техники
Гипергликемия натощак у пациентов, страдающих плохо контролируемым сахарным диабетом II типа, тесно связана с повышенным темпом продукции глюкозы, который, в свою очередь, может быть приписан повышенному темпу глюконеогенеза. Множество исследований показало, что повышенный уровень глюкагона частично ответствен за повышенную продукцию глюкозы в печени у пациентов с диабетом II типа.
Глюкагон представляет собой гормон, состоящий из 29 аминокислот, α-клеток поджелудочной железы, который играет важную роль в антагонистической регуляции действия инсулина. При голодании секреция глюкагона повышается в ответ на низкий уровень глюкозы в циркулирующей крови. Повышенная секреция глюкагона стимулирует продукцию глюкозы за счет запуска глюконеогенеза в печени и гликогенолиза. Кроме того, глюкагон уменьшает синтез гликогена в печени. Клинически глюкагон вводят пациентам, у которых присутствует риск существенной гипогликемии. И наоборот, ингибирование глюкагонового пути может предоставить стратегию лечения диабета II типа.
Биологические эффекты глюкагона опосредованы его связыванием со специфическим рецептором на поверхности клетки - рецептором глюкагона - и последующей активацией сигнального пути. Рецептор глюкагона принадлежит семейству B G-белок связанных рецепторов (GPCR). Он преимущественно экспрессируется в печени и почках, что отражает его первичную роль как регулятора выброса глюкозы и глюконеогенеза в этих тканях. Активация рецептора глюкагона в печени стимулирует активность аденилатциклазы и обмен фосфоинозитола, приводящие к повышенной экспрессии нескольких ключевых ферментов глюконеогенеза.
Что касается ключевой роли глюкагона в контроле гипергликемии, то стратегия ингибирования пути, активируемого глюкагоном, может обеспечить терапевтические средства для лечения диабета II типа.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема
Задачей настоящего изобретения является получение антител к рецептору глюкагона.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в получении рекомбинантных векторов, клеток-хозяев, выделенных клеточных линий и гибридом для продукции таких антител.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в получении фармацевтических композиций, содержащих антитела.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в создании способов лечения диабета II типа и связанных с ним заболеваний с использованием этих антител.
Решение проблемы
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным антителам или их антигенсвязывающим участкам или их производным, которые специфически связываются с рецептором глюкагона.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, или его антигенсвязывающему участку, или его производному, содержащему:
(a) первый набор CDR, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, которые последовательно соединены, который содержит аминокислотные последовательности CDR тяжелой цепи, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, которые последовательно соединены, которые включают любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16;
(b) второй набор CDR, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, которые последовательно соединены, который содержит аминокислотные последовательности CDR легкой цепи, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, которые последовательно соединены, которые включают любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30; или,
(c) сочетание первого набора CDR по (a) и второго набора CDR по (b).
В предпочтительном варианте осуществления антитело содержит тяжелую цепь или легкую цепь, или обе цепи, в которых указанная тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из HC1 (SEQ ID NO:2); HC2 (SEQ ID NO:4); HC3 (SEQ ID NO:6); HC4 (SEQ ID NO:8); HC5 (SEQ ID NO:10); HC6 (SEQ ID NO:12); HC7 (SEQ ID NO:14); HC8 (SEQ ID NO:16); и их антигенсвязывающих фрагментов; а указанная легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из: LC1 (SEQ ID NO:18); LC2 (SEQ ID NO:20); LC3 (SEQ ID NO:22); LC4 (SEQ ID NO:24); LC5 (SEQ ID NO:26); LC6 (SEQ ID NO:28); LC7 (SEQ ID NO:30); и их антигенсвязывающие фрагменты.
В более предпочтительном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению выбрано из группы, состоящей из:
(a) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:18 (Ab1);
(b) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:20 (Ab2);
(c) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:22 (Ab3);
(d) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:24 (Ab4);
(e) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:26 (Ab5);
(f) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:26 (Ab6);
(g) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:28 (Ab7);
(h) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:30 (Ab8);
(i) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:26 (Ab9); и,
(j) антитела, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:22 (Ab 10).
Еще один аспект настоящего изобретения относится к выделенному антителу, или антигенсвязывающему участку, или их производным, которые конкурируют за связывание с рецептором глюкагона.
В одном из вариантов осуществления выделенный антигенсвязывающий агент связывается с рецептором глюкагона человека с Kd, близкой к таковому эталонного антитела, или ингибирует стимуляцию глюкагона рецептором с практически такой же IC50, как у эталонного антитела, или конкурирует за связывание с эталонным антителом.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к выделенному антителу, или антигенсвязывающему участку, или их производному, содержащему:
(a) первый набор CDR, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, которые последовательно соединены, который по меньшей мере на 85% идентичен аминокислотной последовательности CDR тяжелой цепи, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, которые последовательно соединены, которые включают любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16;
(b) второй набор CDR, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, которые последовательно соединены, который по меньшей мере на 85% идентичен аминокислотной последовательности CDR легкой цепи, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, которые последовательно соединены, которые включают любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30; или,
(c) сочетание первого набора CDR по (a) и второго набора CDR по (b),
где указанное антитело, антигенсвязывающий участок или их производное, конкурируют с глюкагоном за связывание с рецептором глюкагона.
Антитело может содержать тяжелую цепь, содержащую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, на 90%, более предпочтительно, на 95%, а наиболее предпочтительно, на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16. Кроме того, антитело может содержать легкую цепь, содержащую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, на 90%, более предпочтительно, на 95%, а наиболее предпочтительно, на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к выделенному антителу или антигенсвязывающему участку, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(а) последовательности тяжелой цепи CDR3, которая отличается не более чем тремя аминокислотными добавлениями, делециями и/или неконсервативными заменами в последовательности CDR3, выбранной из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16;
(b) последовательности легкой цепи CDR3, которая отличается не более чем тремя аминокислотными добавлениями, делециями и/или неконсервативными заменами в последовательности CDR3, выбранной из SEQ ID NO:18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30; или
(c) сочетания последовательности тяжелой цепи CDR3 по (a) и последовательности легкой цепи CDR3 по (b),
где указанное антитело или антигенсвязывающий участок связывается с рецептором глюкагона.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей антитело или его функциональный фрагмент, и фармацевтически приемлемый носитель. Композиции по настоящему изобретению содержат тяжелую и/или легкую цепь, их вариабельные домены или их антигенсвязывающие участки, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитело, цепь антитела или их вариабельный домен и смесь с одним или более фармацевтически приемлемым носителем или агентом, обеспечивающим слияние клеток. Композиции по настоящему изобретению могут также содержать другие компоненты, такие как терапевтический агент или диагностический агент.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельный домен легкой цепи антитела, вариабельный домен тяжелой цепи антитела или и то, и другое. Нуклеиновая кислота может содержать любую нуклеотидную последовательность из одной или более SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 и 29.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантному вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту эталонных последовательностей.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к клеткам-хозяевам, трансформированным вектором.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к выделенной клеточной линии, которая продуцирует антитело или его тяжелую цепь, или его легкую цепь, или его антигенсвязывающий участок.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к гибридоме, продуцирующей антитело, или его тяжелую цепь, или его легкую цепь, или его антигенсвязывающий участок.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу уменьшения глюкозы в крови, улучшения переносимости глюкозы или лечению, профилактики или ингибированию диабета II типа, дислипидемии или связанных заболеваний у больного, предусматривающему стадию введения индивиду антитела, его антигенсвязывающего участка, или его производного, или фармацевтической композиции. Антитела к рецептору глюкагона могут быть введены сами по себе или в сочетании с дополнительными антителами или другими лекарствами.
Преимущества настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям и способам, основанным на воздействии на активацию рецептора глюкагона, включающем, но не ограничивающемся связыванием с внеклеточным участком рецептора глюкагона. Антагонисты по настоящему изобретению, как описано в данном документе, предоставляют важные терапевтические и диагностические агенты для использования при воздействии на патологические состояния, связанные с сахарным диабетом и связанными заболеваниями. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам, композициям, наборам и изделиям, относящимся к модулированию сигнального пути рецептора глюкагона.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 является графическим представлением, показывающим способность выбранных антител связываться с рецептором глюкагона, который экспрессируется на поверхности клетки. Варьирующие количества антител были добавлены к клеткам CHO, экспрессирующим полноразмерный рецептор глюкагона человека. После отмывки антитела, оставшиеся на клетках, детектировали с помощью конъюгированного с HRP человеческим антителом, после чего добавляли субстрат активности HRP.
Фиг. 2 показывает график, иллюстрирующий ингибирование продукции цАМФ антителами к рецептору глюкагона при стимуляции глюкагоном. Стабильная клеточная линия, экспрессирующая полноразмерный рецептор глюкагона человека, инкубировалась с варьирующими количествами антител. Через 15 мин к клеткам добавляли 100 пМ глюкагона и измеряли уровень цАМФ с помощью набора cAMP HTRF (фирма CIS Bio). Показаны средние значения и стандартное отклонение в дубликатных образцах.
Фиг. 3-5 показывают предсказанные аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей антитела к рецептору глюкагона. Подчеркнутые последовательности представляют, слева направо, CDR1, CDR2 и CDR3.
Фиг. 6 показывает уровень глюкозы в крови у мышей с ожирением, вызванным высоким содержанием жира в пище, инъецированных выбранным антителом (Ab7) в дозе 1 мг/кг и 7 мг/кг. Глюкозу в крови измеряли в 0-й, 1-й, 2-й, 3-й и 10-й дни после одиночной инъекции либо антитела, либо буфера в качестве контроля. Значения представляют собой рассчитанные средние и стандартное отклонение на девяти-десяти мышах в каждой группе.
Фиг. 7 представляет графическое изображение уровней глюкозы плазмы натощак и базальные скорости продукции глюкозы в печени (HGP) у мышей с ожирением, вызванным высоким содержанием жира в пище. Базальную HGP определяли способом разбавления радиоизотопа (Choi C. S. et al, Proc Natl Acad Sci U-S-A, 2007, 104:16480-85). Уровни глюкозы в плазме натощак и базальные скорости HGP значительно снижены у мышей, инъецированных 7 мг/кг Ab7, по сравнению с группой, инъецированной носителем, тогда как базальный клиренс глюкозы у двух групп не различался. Данные выражены в средних значениях ± стандартная ошибка среднего (SEM) для 10 мышей в каждой группе.
Техническое выполнение изобретения
Определения
Термин «антитело», как он используется в данном документе, означает белок, состоящий из одного или более полипептидов, в основном кодируемый всеми или частью известных генов иммуноглобулинов. Известные гены иммуноглобулинов, например, у человека включают генетические локусы κ (каппа), λ (лямбда) и тяжелой цепи, которые вместе содержат неисчислимое количество вариабельных областей генов и константных областей генов. В данном документе термин «антитело» может означать «специфический антигенсвязывающий агент». Специалистам в данной области техники легко понять, что антитело может быть использовано как терапевтический или диагностический агент, и, таким образом, «антитело» может также быть обозначено как «терапевтический агент» или «диагностический агент.
Термин «выделенное антитело», как используется в данном документе, предназначен для обозначение антитела, которое, в основном, свободно от других антител, обладающих иной антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с рецептором глюкагона и которое свободно от антител, которые специфически связывают иные антигены, чем рецептор глюкагона). Выделенное антитело, которое специфически связывается с рецептором глюкагона, может, однако, иметь кросс-реактивность с другими антигенами, такими как рецептор глюкагона других видов животных. Далее, выделенное антитело может быть, в основном, свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ. Далее, выделенное антитело, например, выделенное антитело человека, может представлять собой химерное антитело, в котором, например, вариабельные области, домены CDR или изотипы, происходящие из различных источников в человеке, трансплантированы в исходное антитело человека.
Термин «нейтрализующее антитело» к рецептору глюкагона обозначает антитело, которое может ингибировать глюкагон-зависимую стимуляцию этого рецептора на около 10~120%, предпочтительно, по меньшей мере на 30, 50, 70, 80, 90, 100% или более, в зависимости от типа анализа. Способность антитела к рецептору глюкагона ингибировать глюкагоновую сигнализацию, предпочтительно, оценивается по меньшей мере по одному анализу, основанному на клетках, описанному в данном документе и/или известному в данной области техники. Одним из примеров является измерение продукции цАМФ при стимуляции глюкагоном, с использованием набора, такого как cAMP HTRF (фирма CisBio).
«Консервативные замены аминокислот», как используется в данном документе, представляют собой замены, которые заменяют аминокислотный остаток, таковыми, которые сообщают сходные или лучшие (для намеченной цели) функциональные и/или химические характеристики, как это известно специалистам в данной области техники. Часты консервативные замены аминокислот, при которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком со сходной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи известны в данной области техники. Например, лизин, аргинин, гистидин - с щелочной боковой цепью, аспарагиновая кислота и глютаминовая кислота - с кислотными боковыми цепями, глицин, аспарагины, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан - с незаряженными полярными боковыми цепями, аланин, валин, лейцин, треонин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин - с неполярными боковыми цепями, и тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин - с ароматическими боковыми цепями. Замены происходят между аминокислотами, в целом, со сходными физико-химическими свойствами, так что замена существенно не изменяет характеристик пептида, полипептида или белка, или их активности.
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями является функцией числа аминокислотных положений, совпадающих в последовательностях (т.е. число положений, в которых находятся одинаковые аминокислоты, деленное на общее число положений и умноженное на 100), учитывая число пробелов и длину каждого пробела, которые необходимы для оптимального выравнивания двух последовательностей. Антитела по настоящему изобретению также включают таковые, в которых сделаны модификации в каркасных остатках в VH и/или VL для улучшения одного или более свойств антитела. Обычно такие каркасные модификации делаются для уменьшения иммуногенности или улучшения стабильности антитела.
В дополнение к модификациям, сделанным в каркасной или CDR областях, антитела по настоящему изобретению могут быть выполнены так, чтобы включать модификации в Fc области, обычно, чтобы изменить одно или более функциональных свойств антитела, таких как время полураспада сыворотки, связывание комплемента, связывание Fc рецептора и/или антигензависимая цитотоксичность. Фрагменты антитела или производные агенты являются частью антител или антител в другом формате, содержащих участок, который связывается с антигеном и, если требуется, каркасный или остовный участок, которые позволяют антигенсвязывающему участку антигенсвязывающего белка связываться с антигеном. Например, изменения в каркасе или CDR, такие как замены аминокислоты, делеции или вставки могут быть выполнены для поддержания антигенсвязывающей способности. В качестве альтернативы антигенсвязывающий участок по настоящему изобретению может быть дериватизирован или связан с другой молекулой (например, другим пептидом, белком, полимерами или химическими веществами).
Антигенсвязывающий участок антитела может быть модифицирован в одноцепочечное антитело, диатело, триатело, тетратело, фрагмент Fab (моновалентный фрагмент с VL, CL, VH и CH1), фрагмент F(ab')2 (два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком), Fd (домены VH и CH1), scFv (VL и VH, соединенные линкером), доменное антитело, биспецифические антитела, миниантитело, скэб (фрагмент антитела, содержащий VH и VL, так же как или CL, либо CH1), антитело IgD, антитело IgE, антитело IgM, антитело IgG1, антитело IgG2, антитело Ig3, антитело IgG4 или какие-либо производные константного домена антитела и искусственные антитела, основанные на белковых каркасах, включающие в себя, но не ограничивающиеся [белками] типа фибронектина, авимеров или цитохрома B.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предоставляет выделенные рекомбинантные и/или синтетические антитела к рецептору глюкагона, так же как и композиции и молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно антитело к рецептору глюкагона. Настоящее изобретение относится к композициям и способам, основанным на воздействии на сигнализацию рецептора глюкагона путем связывания с внеклеточной частью рецептора глюкагона, но не ограничивающиеся ими. Антагонисты по настоящему изобретению, как описано в настоящем документе, предоставляют важные терапевтические и диагностические агенты для использования в воздействии на патологические состояния, связанные с сахарным диабетом и связанными заболеваниями. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам, композициям, наборам и изделиям, относящимся к модулированию сигнального пути рецептора глюкагона.
Один из аспектов настоящего изобретения относится к терапевтическому агенту против рецептора глюкагона, подходящему для терапевтического использования и способному влиять на поражения разной степени сигнального пути рецептора глюкагона. Например, настоящее изобретение относится к антителам человека к рецептору глюкагона и их производным и фрагментам, содержащим последовательность полинуклеотидов, которая кодирует весь полипептид или его часть, который связывается с рецептором глюкагона, такой как нуклеиновая кислота, кодирующая целиком или часть антитела к рецептору глюкагона, фрагмент антитела или производное антитела.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело человека, которое ингибирует связывание глюкагона человека с рецептором глюкагона. Например, антитело по настоящему изобретению ингибирует связывание глюкагона со значением IC50 в концентрации менее чем 1 мкМ, предпочтительно, менее чем 100 нМ, более предпочтительно, 10 нМ, а наиболее предпочтительно, 1 нМ. Еще в одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело, которое ингибирует сигнал цАМФ, зависимый от глюкагона.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным молекулам специфического антитела к рецептору глюкагона, которые содержат вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, которые гомологичны соответствующим аминокислотным последовательностям описанных антител, причем молекулы антитела ингибируют опосредованную глюкагоном сигнализацию через рецептор глюкагона. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97 или 99% идентична последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16. Далее, вариабельный домен легкой цепи может содержать последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97 или 99% идентична последовательности вариабельного домена легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30. Специфическими вариантами осуществления являются антагонисты, которые содержат вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей, которые по меньшей мере на 85%, предпочтительно, на 90%, более предпочтительно, на 95%, а наиболее предпочтительно, на 99% гомологичны описанным вариабельным областям тяжелой и/или легкой цепей, соответственно.
В еще одном варианте осуществления выделенный антигенсвязывающий белок содержит комбинацию вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи, выбранную из группы комбинаций, состоящей из тяжелой и легкой цепей в SEQ ID NO:. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным молекулам антитела, содержащим вариант последовательности вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи, описанный в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30, и их консервативные модификации. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает антитела, которые могут быть образованы какой-либо комбинацией последовательностей вариабельных доменов легкой цепи и тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30, и их эквивалентами, характеризующимися тем, что они имеют одно или более консервативных замен аминокислот в какой-либо одной или более из последовательностей CDR, конкретные варианты осуществления которых ингибируют глюкагон-зависимую активацию сигнального пути рецептора глюкагона.
Настоящее изобретение также предоставляет химерные молекулы, содержащие антагонист рецептора глюкагона, соединенный или слитый с другим гетерологичным полипептидом или полимером. Например, известны технологии получения антител различных подклассов или изотипов из антитела, представляющего интерес, т.е. изменение подкласса. Они включают гуманизированное антитело, химерное антитело, моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, такой как фрагменты F(ab')2, Fab, Fv, Fab', Fc и Fd, и могут быть инкорпорированы в единичный домен антитела, такой как одноцепочечные антитела, макситела, минитела, интратела, диатела, триатела, тетратела, vNAR и bisscFv (Hollinger, P. and Hudson, P. J., 2005, Nat Biotech, 23: 112636).
В дополнительных вариантах осуществления, антитела, их фрагменты и производные по настоящему изобретению могут быть слиты с другими полипептидами или химическими веществами. Партнером по слиянию может быть пептид, белок или производное антитела, которое имеет специфическую активность связывания с другими белками с образованием биспецифических или полиспецифических молекул или для улучшения физико-химических свойств молекул. Кроме того, антитела могут быть модифицированы гликозилированием, пегилированием, могут быть сшиты или конъюгированы с другими белками или химическими веществами. Аминокислоты, входящие в антитела, могут представлять собой неприродные аминокислоты.
Антитела к рецептору глюкагона могут нести или быть конъюгированы с токсином, радиоактивным изотопом, радионуклидом, липосомой, агентом, обеспечивающим направленную доставку, биосенсором, катионным хвостом или ферментом. Такие композиции антагонистов образуют дополнительный аспект настоящего изобретения.
В некоторых случаях может быть полезным иметь антитело-антагонист рецептора глюкагона, которое не влияет на связывание лиганда (такого как глюкагон) с рецептором. Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое не связывается с сайтом связывания глюкагона на рецепторе глюкагона. В еще одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению существенно не ингибирует связывание глюкагона с рецептором глюкагона. В еще одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению существенно не конкурирует с глюкагоном за связывание с рецептором глюкагона.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к использованию антитела-антагониста рецептора глюкагона по настоящему изобретению при изготовлении медикамента для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как диабет.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к вектору экспрессии по настоящему изобретению для изготовления медикамента для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как диабет.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к использованию клеток-хозяев по настоящему изобретению для изготовления медикамента для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как диабет.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к использованию изделий по настоящему изобретению в изготовлении медикамента для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как диабет.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело или его антигенсвязывающий участок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция также содержит по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент для лечения заболевания, при котором активация рецептора глюкагона губительна.
Антитела и антигенсвязывающие участки по настоящему изобретению могут быть инкорпорированы в фармацевтические композиции, подходящие для введения индивиду. Обычно, фармацевтическая композиция содержит антитело или антигенсвязывающий участок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Так, как это используется в данном документе, «фармацевтически приемлемый носитель» включает какой-либо или все растворители, дисперсионную среду, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и им подобные, которые физиологически совместимы. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают одно или более из воды, физиологического раствора, раствора фосфатного буфера, декстрозы, глицерина, этанола и им подобного, как и их комбинации. Во многих случаях предпочтительно включение в композицию изотонических агентов, например, сахаров, полиспиртов, таких как маннитол, сорбитол или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут также содержать малые количества дополнительных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают время хранения или эффективность антитела или антигенсвязывающего участка.
Композиции по настоящему изобретению могут существовать в разнообразных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые формы дозировок, такие как жидкие растворы (например, инъецируемые и инфузируемые растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции имеют форму инъекционных или инфузионных растворов, таких как композиции, сходные с таковыми, используемыми для пассивной иммунизации человека другими антителами.
Антитела и антигенсвязывающие участки по настоящему изобретению могут быть введены различными способами, известными в данной области техники, хотя для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения является подкожная инъекция, внутривенная инъекция или вливание. Как ясно специалистам в данной области путь и/или способ введения может меняться в зависимости от желаемых результатов.
Дополнительные активные соединения могут также быть инкорпорированы в композиции. В определенных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий участок по настоящему изобретению изготавливается в виде единой формы и/или вводится совместно с одним или более дополнительных терапевтических агентов, которые полезны для лечения заболевания, при котором активация рецептора глюкагона губительна. Например, антитело к рецептору глюкагона или антигенсвязывающий участок по настоящему изобретению могут быть изготовлены в единой форме и/или введены совместно с одним или более дополнительных антител, которые связываются с другими мишенями. Кроме того, одно или более антитело по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с двумя или более терапевтическими агентами. Такая комбинированная терапия может использовать преимущества более низких дозировок вводимых терапевтических агентов, устраняя, таким образом, возможную токсичность или осложнения, связанные с различными монотерапиями.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» антитела или антигенсвязывающего участка по настоящему изобретению. Термин «терапевтически эффективное количество» обозначает количество, эффективное в дозировках и в течение периодов времени, необходимое для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или антигенсвязывающего участка может варьировать в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивида, а также способности антитела или антигенсвязывающего участка вызывать желаемый ответ у индивида. Терапевтически эффективное количество - это также такое количество, при котором терапевтически полезные эффекты преобладают над какими-либо токсическими или губительными эффектами антитела или антигенсвязывающего участка. «Профилактически эффективное количество» обозначает количество, эффективное в дозировках и в течение периода времени, необходимое для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактические дозы используют до развития заболевания или на его ранних стадиях, профилактически эффективное количество меньше, чем терапевтически эффективное количество.
Иллюстративный не ограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективных количеств антитела или антигенсвязывающего участка по настоящему изобретению составляет 0,01-100 мг/кг, более предпочтительно, 0,1-30 мг/кг. Следует отметить, что величина дозировки может варьировать в зависимости от типа и тяжести состояния, которое должно быть облегчено. Также следует понимать, что для конкретных индивидов специфический режим дозировки может регулироваться во времени в соответствии с его индивидуальными потребностями и профессиональными решениями того, кто вводит композицию или руководит ее введением, и что диапазоны дозировки, изложенные в данном документе, являются лишь иллюстративными и не направлены на ограничение сферы или применения заявленной композиции.
Ниже в данном документе настоящее изобретение будет конкретно объяснено со ссылкой на нижеследующие примеры, которые представлены только для лучшего понимания настоящего изобретения, но не должны истолковываться как ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Пример 1: Скрининг антител, которые связываются с рецептором глюкагона
Получали клетки HEK293 и CHO, экспрессирующие полноразмерный рецептор глюкагона человека, соединенный на С-конце с GFP (зеленый флуоресцирующий белок). Стабильный клеточный пул сортировали с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS), и клетки с высоким уровнем флуоресценции отбирали для обогащения фракции клеток, с высоким уровнем экспрессии рецептора глюкагона.
Для получения белка, который кодирует 1-й внеклеточный домен рецептора глюкагона человека, вектор экспрессии млекопитающих, содержащий 1-й внеклеточный домен рецептора глюкагона человека, сливали с участком Fc IgG1 человека на C-конце (NTD-FC). Конструкт временно трансфицировали в клетки HEK293 и собирали кондиционированную среду. Слитый белок NTD-FC очищали с помощью аффинной очистки на шариках, покрытых агарозой с белком A (фирма Pierce).
NTD-FC и клетки, экспрессирующие рецептор глюкагона, использовали для сортировки с библиотекой фагов, проявляющих scFv антитела человека. scFv готовили из кДНК человека, полученной от здоровых людей и выявляемой на фаге M13 с помощью слияния с pIII. Для сортировки очищенный NTD-FC иммобилизовали на магнитных шариках с G-белком (фирма Invitrogen), а связанные фаги на первом этапе элюировали триэтиламином. Клетки HEK293 и клетки CHO, экспрессирующие рецептор глюкагона, слитый с GFP, использовали на последующих этапах сортировки. После трех этапов сортировки индивидуальные клоны фагов проверяли на их способность связывать NTD-FC, определяемую с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Позитивные фаги затем тестировали на связывание с помощью основанного на клетках ELISA в клетках CHO или HEK293, экспрессирующих рецептор глюкагона, слитый с GFP.
Пример 2: Конверсия антитела и тест активности
Отобранные клоны фага секвенировали и отдельные клоны конвертировали в IgG2 человека для получения полного антитела человека путем кратковременной экспрессии. Собирали кондиционированную среду, а антитела очищали с помощью шариков с агарозой с белком A (фирма Pierce). Различные количества антител затем готовили к основанному на клетках ELISA, чтобы протестировать их способность связывания с рецептором глюкагона человека.
Очищенные антитела затем тестировали на нейтрализующую активность по анализу цАМФ с помощью набора cAMP HTRF kit (фирма CisBio). Различные количества антител добавляли к клеткам, экспрессирующим рецептор глюкагона, и инкубировали в течение 15 минут перед тем, как к клеткам добавляли глюкагон. Стимуляцию рецептора глюкагона измеряли по количеству продуцируемого цАМФ. Потентность антитела определяли по проценту ингибирования продукции цАМФ при стимуляции 100 пМ глюкагона.
Пример 3: Тест эффективности антитела in vivo на модели ожирения, индуцированного диетой с высоким содержанием жира
Для тестирования эффективности антител in vivo, Ab7 кратковременно экспрессировали и очищали. После очистки белком A определяли количество антитела и подтверждали его активность анализом на цАМФ.
Для модели ожирения, вызванного диетой с высоким содержанием жира, самцы мышей C57BL/6 акклиматизировались и получали диету с высоким содержанием жира (60% жира в расчете на калорийность; фирма Research Diet) в течение 6 недель. В день введения антител у мышей брали кровь для измерения базального уровня глюкозы, после чего немедленно измеряли вес тела. Мыши были разделены на 3 группы (n = 9-10 на группу), имеющие сходное распределение по весу тела и глюкозе в крови. Затем мыши получали по одной интраперитонеальной (IP) инъекции носителя или антитела в дозе 7 мг/кг и 1 мг/кг. Последующие измерения глюкозы в крови проводили на 1, 2, 3 и 10-й дни после одиночной инъекции.
Пример 4: Молекулярный механизм эффекта антитела, исследованный способом разбавления радиоизотопа
Чтобы добиться дополнительного понимания механизма эффекта снижения антителами уровня глюкозы, инсулиновую чувствительность в печени и на периферии оценивали с помощью вливания глюкозы, меченной радиоизотопом (Choi C. S. et al, Proc Natl Acad Sci U-S-A, 2007, 104:16480-85). Самцы мышей C57BL/6 акклиматизировались и получали диету с высоким содержанием жира (60% жира в расчете на калорийность; фирма Research Diet) в течение 6 недель. За семь дней до исследования в яремную вену устанавливали постоянный катетер. Затем мыши получали разовую интраперитонеальную (IP) инъекцию носителя или антитела в дозе 7 мг/кг за 48 ч до экспериментов.
После голодания в течение ночи [3-3H]-глюкозу (фирма Perkin Elmer) вливали в течение 2 часов, чтобы оценить базальную скорость появления глюкозы (базальная продукция глюкозы в печени). Образцы крови (20 мкл) собирали в конце базального периода для измерения концентрации глюкозы в плазме после голодания и активности [3-3H]-глюкозы. Базальную скорость появления глюкозы в целом организме определяли как соотношение скорости вливания [3-3H]-глюкоза (распады в минуту [dpm]) к специфической активности глюкозы в плазме (dpm на мг) в конце базального периода.
Список последовательностей в произвольной форме
SEQ ID NO:1 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области HC1 тяжелой цепи;
SEQ TD NO:2 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области HC1 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:3 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области HC2 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:4 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области HC2 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:5 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области HC3 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:6 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области HC3 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:7 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области HC4 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:8 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области HC4 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:9 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области HC5 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:10 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области HC5 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:11 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области HC6 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:12 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области HC6 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:13 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области HC7 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:14 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области HC7 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:15 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области HC8 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:16 представляет аминокислотную последовательность вариабельной область HC8 тяжелой цепи;
SEQ ID NO:17 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области LC1 легкой цепи;
SEQ ID NO:18 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области LC1 легкой цепи;
SEQ ID NO:19 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области LC2 легкой цепи;
SEQ ID NO:20 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области LC2 легкой цепи;
SEQ ID NO:21 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области LC3 легкой цепи;
SEQ ID NO:22 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области LC3 легкой цепи;
SEQ ID NO:23 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области LC4 легкой цепи;
SEQ ID NO:24 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области LC4 легкой цепи;
SEQ ID NO:25 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области LC5 легкой цепи;
SEQ ID NO:26 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области LC5 легкой цепи;
SEQ ID NO:27 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области LC6 легкой цепи;
SEQ ID NO:28 представляет аминокислотную последовательность вариабельной область LC6 легкой цепи;
SEQ ID NO:29 представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области LC7 легкой цепи; и
SEQ ID NO:30 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области LC7 легкой цепи.
1. Выделенное антитело, специфически связывающееся с рецептором глюкагона человека, содержащее:
(а) тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12; и
(б) легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:28.
2. Выделенное антитело по п.1, которое представляет собой моноклональное антитело.
3. Выделенное антитело по п.1, где антитело выбрано из группы, состоящей из антитела человека, гуманизированного антитела, антигенсвязывающего фрагмента, одноцепочечного антитела, диатела ("diabody"), триатела, тетратела, фрагмента Fab, фрагмента F(аЬ')2, Fd, scFv, доменного антитела, биспецифических антител, минитела, скэба, антитела IgD, антитела IgE, антитела IgM, антитела IgG1, антитела IgG2, антитела Ig3, антитела IgG4, любых производных константного домена антитела и искусственных антител, основанных на белковом каркасе.
4. Фармацевтическая композиция для лечения диабета II типа, содержащая эффективное количество выделенного антитела по п.1, а также один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.
5. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по п.1, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:27 и вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:11 выделенного антитела по п.1.
6. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.5.
