Способ приготовления реагента для получения меченного технецием-99м доксорубицина

Изобретение относится к способу приготовления реагента для получения меченного технецием-99м доксорубицина. Способ включает приготовление солянокислого раствора олова (II) хлорида дигидрата, его смешивание с порошком доксорубицина гидрохлорида с добавлением 1 мл буферного раствора pH 4,01, замораживание полученной смеси при температуре жидкого азота, лиофильную сушку при температуре -50°C в вакууме - 0,0015 Торр, в течение не менее 20,5 часов, с последующим досушиванием в течение не менее 5,5 часов при температуре +16±2°C. Заявленное изобретение позволяет стабилизировать pH реагента для получения меченного технецием-99м доксорубицина. 1 ил.

 

Изобретение относится к области фармацевтической химии, в частности, к способам получения реагентов для приготовления радиофармпрепаратов (РФП), применяемых для диагностики в онкологии.

Введение изотопной метки технеция-99 м (^99mТс) в структуру противоопухолевого антибиотика доксорубицина гидрохлорида (ДОКС) явилось новым подходом к проблеме визуализации злокачественных новообразований (ЗНО) и прогноза эффективности противоопухолевой терапии. Обосновывается это тем, что антибиотик антрациклинового ряда доксорубицин подавляет синтез ДНК и РНК в раковых клетках и имеет высокое противоопухолевое и противолейкозное действие, обусловленное изменением клеточных функций. Эти свойства обеспечивают высокую специфичность РФП на их основе к очагам ЗНО.

Противоопухолевая химиотерапия доксорубицином прочно вошла в практику лечения большинства онкологических заболеваний и проведение предварительных исследований с меченным ^99mТс доксорубицином помогло бы определить чувствительность ЗНО к данному препарату и проведение эффективной противоопухолевой терапии.

Первые исследования показали, что меченный Тс доксорубицин избирательно накапливается в опухолевой ткани.

В настоящее время известно несколько лабораторных методик приготовления доксорубицина, меченного технецием-99 м.

Так, например, известен способ приготовления [Liang Shan, PhD, 99mTc-Labeled doxorubicin // Created: December 3, 2012; Last Update: January 2, 2013, PubMed. Chemical name: 99mTc-Labeled doxorubicin] путем смешивания во флаконе водного раствора доксорубицина с переменными концентрациями (20, 50, 100, 200, 400 и 1000 мкг) хлорида олова. Затем к смеси добавляли раствор пертехнетата натрия, ^99mТс (40,0 МБк) и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Радиохимическая чистота (РХЧ) полученного препарата составляла 95%.

В методике [Faheem A. Rizvi, Tanveer Н. Bokhari, S. Roohi, A. Mushtaq. Direct labeling of doxorubicin with technetium-99m: its optimization, characterization and quality control // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry - 2012. - V 293. - p. 303-307] доксорубицин меченый ^99mTc был подготовлен смешиванием во флаконе, 200 мкг доксорубицина, 12 мкг олова хлорида дигидрата и 370 МБк раствора натрия пертехнетата, ^99mТс, pH в диапазоне 6-7 доводили с помощью 0,5 М NaOH. Полученную смесь инкубировали 15 минут при комнатной температуре и в темноте, т.к. лиганд светочувствительный. РХЧ препарата была равной 92% и оставалась стабильной в течение 5 часов.

По способу, предложенному в работе [Andras Polyak, Elena Alina Palade, Lajos Balogh et al. In vitro and biodistribution examinations of Tc-99m-labelled doxorubicin-loaded nanoparticles //. Nuclear Medicine Review. - 2011. - V. 14. - No.2. - p. 55-62], меченый ^99mTc доксорубицин был приготовлен путем предварительного смешивания во флаконе 200 мкг хлорида олова с 2 мл Doxo-HSA-Коллоид. Инкубировали при комнатной температуре 2 ч. После в полученный раствор вводили 1 мл (500 МБк) элюата натрия пертехнетата и проводили инкубацию в тех же условиях еще в течение часа. РХЧ - 95%.

Наиболее близким к заявляемому является способ, приведенный в работе [Pardeep Kumar, Baljinder Singh, Shalini Chopra, et al. Indigenous development of a single vial kit preparation of ^99mTc-doxorubicin and its preclinical evaluation // Journal of Nuclear Medicine - 2013. - V.54. - No. 2. - p. 1126], в соответствии с которым меченный ^99mTc доксорубицин был подготовлен путем предварительного смешивания во флаконе 1,0 мл раствора ДОКС с концентрацией 2 мг/мл, 0,05 мл раствора хлорида олова, содержащего 2 мг SnCl₂·2H₂O в 1 мл уксусной кислоты. pH доводили до 5,5 с помощью 0,1 N NaOH. Составляющие реагента лиофилизировали в течение 24 ч. В полученный реагент вводили 4 мл элюата технеция-99 м (0,5-1,1 ГБк) и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Препарат имеет РХЧ более 95%.

Главным недостатком способа, как и всех приведенных методик введения изотопной метки ^99mТс в структуру доксорубицина, является то, что все они недостаточно удобны для прямого получения радиофармпрепарата в условиях клиник, поскольку субстанция доксорубицина нестабильна при изменении кислотности, к тому же применение уксусной кислоты для приготовления раствора олова требует проведения дополнительных анализов при определении качества радиофармпрепарата.

Таким образом, до настоящего времени остается нерешенной задача приготовления реагента в виде стандартного набора для ⁹⁹Мо/^99mТс-генератора, при взаимодействии которого с элюатом ^99mТс из генератора, будет получаться РФП «Доксорубицин, ^99mТс» с заданными свойствами и требуемыми показателями качества.

Технический результат заключается в повышении стабильности реагента для получения радиофармпрепарата "Доксорубицин, ^99mТс".

Указанный технический результат достигается тем, что в способе приготовления реагента для получения меченного технецием-99 м доксорубицина, включающем приготовление раствора олова (II) хлорида дигидрата, его смешивание с порошком доксорубицина гидрохлорида и лиофильную сушку смеси, согласно изобретению, раствор олова (II) хлорида дигидрата готовят путем разведения в соляной кислоте, а в смесь добавляют 1 мл буферного раствора pH 4,01, замораживают при температуре жидкого азота и затем подвергают лиофильной сушке при температуре Т=-50°C в вакууме - 0,0015 Торр в течение не менее 20,5 часов, с последующим досушиванием в течение не менее 5,5 часов при температуре +16±2°C.

На фиг.1 изображена сцинтиграмма тела мыши через 1 ч после внутривенного введения радиофармпрепарата на основе меченного технецием-99м доксорубицина, который был получен из реагента, приготовленного по предлагаемому способу.

Осуществление способа рассмотрим на примере конкретного выполнения. В мерную пробирку вносят навеску олова (II) хлорида дигидрата (SnCl₂·2H₂O) массой 0,07 г, осторожно приливают 0,2 мл 1М соляной кислоты (НСl). По окончании растворения доводят объем кипяченой дистиллированной водой до 10 мл. Полученный раствор имеет концентрацию олова 7 мг/мл. Использовали только свежеприготовленный раствор. Преимущество данной методики приготовления раствора олова состоит в том, что в водных растворах соляная кислота диссоциирует практически полностью на водородные и хлорид ионы. В дальнейшем при проведении анализа качества полученного РФП это избавляет от сложного анализа по определению концентрации уксусной кислоты в составе РФП.

Во флакон вместимостью 10 мл вносят 3-4 мг порошка доксорубицина гидрохлорида, 0,25-0,30 мг приготовленного раствора олова и 1 мл буферного раствора pH 4,01, например фталатного.

Содержимое флакона замораживают, погружая его в контейнер с жидким азотом. После этого флакон помещают в камеру сублиматора и подвергают лиофильной сушке в течение не менее 26 часов. На первом этапе лиофилизацию проводят при заданных параметрах лиофилизатора: Т=-50°C в вакууме - 0,0015 Торр в течение не менее 20,5 часов. На втором этапе флакон перемещают в верхнюю лиофильую камеру и проводят досушивание в течение не менее 5,5 ч при +16±2°C.

Предварительная глубокая и быстрая заморозка важна для получения качественного продукта, т.к. размеры кристаллов льда получаются меньше и они быстрее испаряются на следующем этапе.

В ходе лиофилизации лед удаляется из замороженного образца в процессе возгонки. Процесс осуществляется за счет работы коллектора и вакуумного насоса. Для обеспечения этого процесса в рабочей камере создается высокий вакуум (0,0015 Торр). Температура коллектора, в котором конденсируется пары воды и растворителя, должна быть минимум на 15-20°C ниже, чем температура плавления образца.

Такие параметры процесса, как температура сушки, величина вакуума, температура конденсации, взаимозависимы и изменения одного из них неизбежно ведет за собой изменение других параметров.

Процесс досушивания при температуре ниже 16±2°C протекает более длительное время, при температуре выше +20°C происходит агломерация частиц.

В работе использовали лиофильную сушилку FreeZone (Labconco).

Из приготовленного реагента получили радиофармпрепарат, путем внесения во флакон с реагентом 5 мл раствора натрия пертехнетата, ^99mТс с активностью 110-1480 МБк/мл с последующим инкубированием в течение 20 мин до полного растворения. Радиохимическая чистота полученного радиофармпрепарата составила 98,2% на момент приготовления и 96,7% через 8 часов после приготовления. Испытания, проведенные на экспериментальных животных, показали, что после внутривенного введения радиофармпрепарат активно накапливается в перевитых злокачественных новообразованиях мышей более чем в 2 раза по сравнению с контралатеральной стороной (фиг. 1), что соответствует должному и свидетельствует о сохранении качества радиофармпрепарата.

Описанный выше способ по сравнению с известными ранее имеет преимущество, заключающееся в стабилизации pH радиофармпрепарата на основе меченного технецием-99м доксорубицина.

Способ приготовления реагента для получения меченного технецием-99м доксорубицина, включающий приготовление раствора олова (II) хлорида дигидрата, его смешивание с порошком доксорубицина гидрохлорида и лиофильную сушку смеси, отличающийся тем, что раствор олова (II) хлорида дигидрата готовят путем разведения в соляной кислоте, а в смесь добавляют 1 мл буферного раствора pH 4,01, замораживают при температуре жидкого азота и затем подвергают лиофильной сушке при температуре Т=-50°C в вакууме - 0,0015 Торр в течение не менее 20,5 часов, с последующим досушиванием в течение не менее 5,5 часов при температуре +16±2°C.