Способ лечения системных иерсиниозных бактериальных инфекций в эксперименте

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и может быть использовано для лечения системных иерсиниозных бактериальных инфекций псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза в эксперименте. Для этого проводят инфицирование лабораторных животных соответствующей культурой патогенных иерсиний псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза для инициации экспериментальной патологии с последующим внутримышечным введением лечебного препарата Скай-форс в терапевтически эффективной дозе под контролем содержания патогенных бактерий и индигенной микрофлоры в течение срока, достаточного для устранения заболевания. При этом в качестве лечебного средства внутримышечно в первые 24 ч после инфицирования каждому лабораторному животному, а именно белой конвенциональной мыши, 1 раз в сутки вводят препарат Скай-форс 25 мг на 1 кг массы в течение 5 дней в приготовленном для применения виде как средство монотерапии. Изобретение обеспечивает невосприимчивость органов и тканей к возбудителю путем создания в них бактерицидных концентраций препарата Скай-форс, а также поддержание колонизационной резистентности кишечника по отношению к возбудителю. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, инфектологии и медицинской микробиологии и может быть использовано для моделирования системных инфекций бактериальной природы у лабораторных животных при отборе средств предотвращения развития в чувствительном организме летальной инфекции, вызванной патогенными бактериями.

Открытие А. Флемингом первого антибиотика в 1929 г. положило начало новой эры в биологии и медицине - эры антибиотиков [Васильев Н.Т., Пименов Е.В., Калининский В.Б., Бакулин М.К. Вклад военных медиков в разработку технологий промышленного производства первых отечественных антибиотиков // Антибиотики и химиотерапия. - 1996. - №4. - С. 3-6; Прозоровский В.Б. Рождение Пенициллина // Российские аптеки. - 2003. - №11. - С. 60-62].

Антибиотики, а затем и химиотерапевтические препараты, стали основными средствами борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы, в том числе опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Механизм действия антибиотиков состоит главным образом в их способности угнетать рост и разрушать клетки бактерий, грибов и опухолей [Шевелева М.А., Раменская Г.В. Современные представления о применении различных групп пробиотических средств при антибиотикотерапии // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т. 54, №3-4. - С. 61-68]. Однако опубликованный анализ изменения номенклатуры антибиотиков и химиотерапевтических препаратов свидетельствует о прогрессирующем снижении числа препаратов, зарегистрированных в Российской Федерации, начиная с 2002 г. [Бондарева Т.А., Калининский В.Б., Борисевич И.В., Бондарев В.П., Фоменков О.О. Современное состояние и перспективы решения проблемы повышения эффективности экстренной профилактики и лечения системных бактериальных инфекций // Молекул. медицина. - 2009. - №5. - С. 24-25]. Это не может не сказаться на общем состоянии проблемы экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекционных заболеваний. Многие из утративших регистрацию препаратов в свое время были включены в инструкции и руководства по экстренной профилактике и лечению чумы и иерсиниозов, сапа, мелиоидоза, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, холеры. В целом, общие перспективы развития мирового, а значит и отечественного рынков антибиотиков и химиотерапевтических препаратов оцениваются как неблагоприятные.

Основными причинами указанной негативной тенденции являются, с одной стороны, утрата интереса крупных фармацевтических компаний к разработке новых антибиотиков, а с другой, сложность проведения клинических испытаний, необходимых для регистрации новых противомикробных препаратов. Важно и другое: в современных условиях практические врачи с целью предотвращения распространения антибиотико-резистентных штаммов бактерий используют новые высокоэффективные антибактериальные препараты лишь в крайнем случае. Вследствие этого коммерческие перспективы нового препарата выглядят непривлекательными для производителя, которого интересует только прибыль от широкого применения в практическом здравоохранении нового антибактериального средства.

Неблагоприятные тенденции развития рынков антибиотиков и химиотерапевтических препаратов сопровождаются рядом побочных эффектов от их применения. Бессистемное и бесконтрольное использование антибактериальных препаратов негативно сказывается на человеческом организме, что проявляется токсическими реакциями, поражением паренхимы печени и почек, поражением периферической нервной системы и органов кроветворения, аллергизирующими реакциями, иммунодепрессивным состоянием, антибиотико-ассоциированным дисбактериозом [Абдуллин И.М., Баширова Д.К., Кузнецова А.В., Визель А.А. Антибиотики в клинической практике / Под ред. А.А. Визеля. Казань, 1997. - 304 с.; Бельмер С.В. Дисбактериоз кишечника как осложнение антибактериальной терапии // Детские инфекции. - 2007. - Т. 6, №2. - С. 44-48].

Перечисленные проблемы мирового производства и применения антибактериальных средств, а также связанные с этим побочные эффекты на организм человека, явились основанием для руководства США объявить в 2011 г. о намерении покончить с эрой антибиотиков [Универсальный наноантибиотик. Хроника // Изобретательство. - 2012. - Т. XII, №7. - С. 10]. Указанный прорыв в медицине должен произойти при серьезной поддержке Пентагона и специалистов оборонного научного агентства DARPA (агентства передовых оборонных исследовательских проектов), которые взялись за осуществление уникального проекта по созданию быстро адаптируемой нанотерапии (Rapidly Adaptable Nanotherapeutics). В основе проекта - разработка биотехнологии быстрого синтеза терапевтических наночастиц, которые можно использовать для лечения любых инфекционных болезней, включая борьбу со смертоносными образцами генно-инженерного биологического оружия. Это будет новый класс противомикробных и противовирусных препаратов, содержащих в качестве «носителя» наночастицы и малые интерферирующие рНК (миРНК). Такая конструкция, введенная в организм, способна отыскивать клетки, где развивается инфекция и купировать инфекционный процесс. Указанная генетическая конструкция в сочетании с наночастицами в качестве носителя, получившая название «наноантибиотик», положительно зарекомендовала себя при лечении экспериментальной лихорадки Эбола у обезьян.

Известно несколько интерферирующих РНК, заявленных для использования в медицине, в частности для подавления антигенного процесса [Заявка 2010122 640/10, 03.06.2010, С 12 №15/11, A61K 48/00, А61Р 43/00 «Малая интерферирующая рибонуклеиновая кислота (миРНК) для перорального введения»]; для лечения легочных и респираторных заболеваний, ишемически-реперфузионных повреждений, глазного ишемического синдрома, повреждений спинного мозга, возрастной макулаторной дистрофии, мукозита слизистой оболочки рта, хронического обструктивного заболевания легких при пересадке органов и тканей [Патент РФ 2487716, A61K 31/7088, С12 №15/11 «Новые структуры малых интерферирующих РНК (SIRNA)», опубл. 20.07.2013]; для продолжительной циркуляции в крови носителя и короткой интерферирующей РНК и повышения эффективности лечебного действия [Патент РФ 2476204, A61K 9/127, A61K 47/18, A61K 47/24, A61K 47/34, A61K 31/7088, опубл. 27.02.2013]; для лечения и/или профилактики пролиферативных заболеваний, рака и бактериальных инфекций [Заявка 2007141588/15, 12.04.2006, A61K 47/48 «Наночастица и на ее основе инфузионный раствор и фармацевтическая композиция»].

Известно комплексное лекарственное средство для лечения бактериальных инфекций (коклюша, псевдотуберкулеза, иерсиниоза, пневмоний различной этиологии, в том числе атипичных), характеризующееся тем, что содержит антитела к гамма-интерферону человека и к CD₄-рецептору и активированную потенцированную форму антител к гистамину [Патент РФ 2502521, A61P 31/32, A61K 39/00 «Комплексное лекарственное средство для лечения бактериальных инфекций и способ лечения бактериальных инфекций», опубл. 27.12.2013].

Учитывая всеобщую настороженность в отношении возбудителей системных (опасных и особо опасных) инфекций, которые могут быть использованы в биотеррористических целях, существующие негативные тенденции на мировом и отечественном рынках антибиотиков и химиотерапевтических препаратов, разработка и внедрение в практическое здравоохранение новых средств экстренной профилактики и лечения системных бактериальных инфекций, обладающих высокой эффективностью, является актуальной проблемой. Для ее решения много внимания уделяется моделированию бактериальных инфекций на лабораторных животных, в ходе которого оценивается эффективность разрабатываемых средств как при профилактическом, так и лечебном курсах [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.Ю. Хабриева. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.].

Наиболее близким к изобретению является техническое решение, известное из описания изобретения [Горшков Г.И., Тарасов М.Б., Хмельков Я.Т., Кравченко Э.А., Яковлева Е.Г., Тарасова Л.Б. «Способ лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней телят и поросят». Патент РФ 2427366, A61K 31/00, А61Р 31/04, опубл. 27.08.2011]. Однако известный способ, предусматривающий энтеральное введение с кормом препарата Пентациклин [Сноз Г.В., Горшков Г.И., Яковлева Е.Г., Кравченко Э.А., Тарасов М.Б., Хмельков Я.Т. «Испытание пентациклина при заболеваниях телят // Ветеринария. - 2010. - №10. - С. 44-47] больным кишечной инфекцией телятам и поросятам, не может быть использован при остро протекающих системных (генерализованных) бактериальных инфекциях, когда требуется создать в тканях и крови чувствительного организма в кратчайшие сроки бактерицидные концентрации вводимого антибактериального препарата. Для этого требуется парентеральный способ введения и иной антибактериальный препарат.

Техническим результатом изобретения является обоснование такого способа введения в инфицированный организм нового лечебного средства, которые бы позволяли применять их в эксперименте у лабораторных животных, уже зараженных патогенным микроорганизмом из числа опасных и особо опасных возбудителей, обеспечивая при этом полное излечение без сопутствующих негативных последствий.

Этот технический результат достигается тем, что в заявляемом способе лечения псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза, возбудители которых близкородственны возбудителю чумы (т.е. относятся к роду Yersinia), путем инициирования у лабораторных животных экспериментальной, соответствующей возбудителю, патологии с последующим внутримышечным введением лечебного препарата в терапевтически активной дозе под контролем содержания патогенной микрофлоры, в течение срока, обеспечивающего купирование заболевания, в качестве лечебного средства внутримышечно в первые 24 ч после энтерального инфицирования (естественного для псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза) каждому лабораторному животному 1 раз в сутки вводят препарат Скай-форс как средство монотерапии, обеспечивающее гибель возбудителя в организме животного, при этом каждому лабораторному животному препарат Скай-форс вводят в дозе 25 мг на 1 кг массы в течение 5 дней. Об эффективности препарата Скай-форс судят по отсутствию гибели и общему состоянию подопытных лабораторных животных, энтерально инфицированных возбудителями псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза.

Формирование у лабораторных животных экспериментальной системной кишечной патологии осуществляют путем энтерального введения им или возбудителя псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза в количестве 10 LD₅₀.

Кроме того, технический результат достигается тем, что в заявляемом способе лечения псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза (типичных системных кишечных инфекций) в эксперименте используют новый лечебный препарат Скай-форс - синергидно действующее наноструктурное комплексное средство, обладающее широким спектром антибактериального действия в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий [Временное наставление по применению препарата Скай-форс в птицеводстве. Утверждено начальником управления ветеринарии, заместителем начальника департамента АПК Правительства Белгородской области, главным государственным ветеринарным инспектором Белгородской области О.В. Бабенко 05.12.2011 г.]. В рекомендованной дозе препарат Скай-форс нетоксичен, побочного действия не оказывает; противопоказаний к применению не установлено.

Способ лечения системного генерализованного псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза в эксперименте осуществляют следующим образом:

1. Готовят две группы подопытных лабораторных животных - опытную и контрольную; перорально вводят каждому лабораторному животному в обеих группах культуру возбудителя псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза в дозе 10 LD₅₀, обеспечивающей гарантированное воспроизведение генерализованной смертельной кишечной инфекции.

2. Диагностируют заболевание с использованием бактериологического метода, позволяющего обнаруживать в фекалиях инфицированного лабораторного животного бактерии псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза, и определения клинически значимых симптомов болезни.

3. Вводят внутримышечно животным опытной группы водный раствор препарата Скай-форс в рекомендованной дозировке и продолжительности введения до достижения лечебного эффекта - полного излечения лабораторных животных и нормализации кишечных функций и стабилизации кишечной микрофлоры, определяемой бактериологическим методом.

4. Определяют наличие и количество бактерий возбудителя кишечной инфекции в содержимом кишечника и внутренних органах у погибших лабораторных животных контрольной группы, а также общее количество кишечной микробиоты и отдельных ее представителей для установления степени дисбиотических изменений в кишечнике.

5. При сравнении количества выживших инфицированных лабораторных животных в опытной группе с количеством погибших/выживших инфицированных лабораторных животных в контрольной группе выносят суждение о лечебной эффективности препарата Скай-форс.

6. Вынесение суждения о профилактической или лечебной эффективности внутримышечного введения препарата Скай-форс инфицированным лабораторным животным опытной группы производят на основании улучшения самочувствия и выздоровления, а также определения общего количества микроорганизмов кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей в 1 г фекалий, свидетельствующего об отсутствии дисбиотических изменений в составе кишечной микрофлоры.

7. В качестве профилактического и лечебного средства для купирования системных иерсиниозных инфекций используют препарат Скай-форс (производитель ООО «НПФ «НаноВетПром»).

Лечение системных иерсиниозных бактериальных инфекций у лабораторных животных проводили как в режиме профилактики, когда препарат Скай-форс вводили белым мышам через 2 ч после их инфицирования, так и в режиме собственно лечения - спустя 24 ч после инфицирования лабораторных животных. В режиме профилактики каждому инфицированному животному вводили внутримышечно по 0,5 мг растворенного в 0,1 мл дистиллированной воды, а в режиме лечения - внутримышечно по 1 мг препарата, растворенного в 0,1 мл дистиллированной воды. При обоих терапевтических курсах продолжительность введения препарата Скай-форс составила 5 суток. Увеличение дозы препарата Скай-форс, вводимого лабораторным животным в режиме лечения, связано с необходимостью быстрейшего подавления роста размножившихся за 24 ч бактерий и предотвращения развития эндотоксического шока у животных.

В экспериментах на белых конвенциональных мышах был использован препарат с 1% действующего вещества: соответствующую навеску порошка в расчете на одно животное растворяли в 0,1 мл дистиллированной воды, после чего вводили лабораторному животному внутримышечно.

Описание средства для осуществления способа лечения системных иерсиниозных бактериальных инфекций.

Препарат Скай-форс - это наноструктурное комплексное средство. Препарат Скай-форс производится из фармакопейного сырья с применением авторских технологий. Представляет собой водорастворимый мелкодисперсный порошок песочно-кремового цвета с вкраплениями. Выпускается в герметичных полиэтиленовых упаковках по 100 г, 500 г и 1 кг в соответствии с ГОСТ 24104-88. Применяется с целью профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных. В рекомендованных дозах (25 мг на 1 кг живой массы) нетоксичен, побочного действия не оказывает, совместим с приемом пробиотиков, противопоказаний к применению не установлено.

Препарат Скай-форс был синтезирован как препарат первого выбора для практического применения в инфектологии, когда еще не установлен и не идентифицирован возбудитель инфекционного заболевания, но уже есть явные признаки генерализации инфекционного процесса. К препарату Скай-форс в принципе не может быть индуцирована устойчивость у микроорганизмов в связи с совершенно иным механизмом бактерицидного действия, чем у известных антибиотиков: один из компонентов препарата ингибирует процесс распознавания бактериальной клеткой «свой-чужой», второй компонент предотвращает доставку питательных веществ внутрь бактериальной клетки и инициирует дезинтеграцию клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, а третий компонент обеспечивает целевую доставку всего комплекса в очаг поражения и его депонирование.

Препарат идеально подходит в качестве препарата первого выбора для купирования генерализации системных бактериальных инфекций, таких как чума, возбудитель которой близкородственен возбудителям псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза и которые могут служить прототипами чумного микроба.

Хорошая растворимость препарата Скай-форс в воде, апирогенность, нетоксичность и безвредность водного раствора обуславливают возможность парентерального введения препарата в организм подопытного животного.

Моделирование системного заболевания у конвенциональных белых мышей осуществляют следующим образом.

1. Выбирают возбудитель системного инфекционного заболевании, в качестве которого могут быть выбраны:

возбудитель Yersinia pseudotuberculosis (близкородственный чумному микробу Yersinia pestis), вызывающий генерализованное системное заболевание псевдотуберкулез, летальность при котором достигает 50-70%;

возбудитель Yersinia enterocolitica (относится как и возбудитель чумы к роду Yersinia) - вызывающий генерализованное системное заболевание -кишечный иерсиниоз с выраженным полиморфизмом клинических проявлений, поражением желудочно-кишечного тракта, склонностью к хронизации.

2. Оценивают патогенность возбудителя системного инфекционного заболевания при энтеральном введении подопытным лабораторным животным - естественном для возбудителей Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. На основании результатов инфицирования конвенциональных белых мышей рассчитывают показатель патогенности (вирулентность) возбудителя в виде значения среднесмертельной дозы LD₅₀ [Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Медгиз, 1962 - 280 с.]. Значение среднесмертельной дозы возбудителя Y. pseudotuberculosis при энтеральном введении конвенциональным белым мышам составляет 8,2·10⁴ КОЕ, а возбудителя кишечного иерсиниоза - 7,6·10⁷ КОЕ.

Пример 1

Выращивают культуру псевдотуберкулезного микроба (Y.pseudotuberculosis) с учетом его психрофильности при температуре (5±1)°С в течение 4 суток, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия, исходя из расчета концентрации микробных клеток 10 LD₅₀ в вводимом объеме суспензии (0,2 мл) для энтерального заражения подопытных лабораторных животных. Указанная концентрация бактерий в суспензии, соответствующая 10 среднесмертельным дозам возбудителя, гарантированно обеспечивает моделирование манифестной формы заболевания с генерализацией инфекционного процесса и созданием в организме подопытных лабораторных животных летальных популяций возбудителя.

Берут 20 прошедших акклиматизацию конвенциональных белых мышей массой 18-20 г и рассаживают по 10 особей в 2 кювета с крышками (опытная и контрольная группы). От каждого лабораторного животного в начале исследования отбирают фекальные массы для подсчета общего количества микроорганизмов кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей (КОЕ·г^-1) с учетом выросших колоний на селективных плотных питательных средах при температуре 37°C в течение 48 ч.

Лабораторным животным обеих групп энтерально вводят суспензию бактерий возбудителя псевдотуберкулеза в объеме 0,2 мл, содержащем 10 LD₅₀ бактерий. Через 24 ч инфицированным лабораторным животным опытной группы внутримышечно вводят в объеме 0,1 мл водный раствор препарата Скай-форс из расчета 1 мг препарата на одно лабораторное животное. Лабораторным животным контрольной группы препарат Скай-форс не вводят. Наблюдение за лабораторными животными осуществляют в течение 14 дней, отмечая исход инфицирования. В табл. 1 приведен результат инфицирования конвенциональных белых мышей возбудителем псевдотуберкулеза .

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют, что в результате инфицирования возбудителем псевдотуберкулеза все лабораторные животные контрольной группы, в которой лечение не проводили, погибли в срок от 5 до 13 суток от начала инфицирования. От всех погибших лабораторных животных из внутренних органов выделена культура псевдотуберкулезного микроба: в 1 г фекалий количество бактерий составляет 1,6·10⁶-9,5·10⁷ КОЕ·г^-1. При этом отмечается снижение общего количества микробиоты в 3,6·10⁵ раз, бифидобактерий - в 5,1·10⁵ раз, лактобактерий - в 3,0·10⁶ раз, эшерихий - в 3,5·10³ раз. Полученные результаты свидетельствуют о развитии у инфицированных лабораторных животных контрольной группы системной генерализованной инфекции - псевдотуберкулеза и выраженных дисбиотических изменений в составе кишечной микрофлоры.

Из данных табл. 1 также следует, что все инфицированные лабораторные животные опытной группы, которым внутримышечно вводили препарат Скай-форс, выздоровели. Отсутствие гибели животных, отсутствие дисбиотических изменений в составе кишечной микрофлоры, отсутствие в кишечном содержимом возбудителя псевдотуберкулеза свидетельствуют о высокой эффективности препарата Скай-форс при лечении системной бактериальной инфекции - псевдотуберкулеза.

Пример 2

Выращивают культуру возбудителя кишечного иерсиниоза (Y.enterocolitica) в течение 48 ч при температуре (27±1)°C, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия, исходя из расчета концентрации микробных клеток 10 LD₅₀ в вводимом объеме суспензии (0,2 мл) для энтерального заражения подопытных лабораторных животных.

Указанная концентрация бактерий в суспензии, соответствующая 10 среднесмертельным дозам возбудителя, гарантированно обеспечивает моделирование манифестной формы заболевания с генерализацией инфекционного процесса и созданием в организме подопытных лабораторных животных летальных популяций возбудителя.

Берут 20 прошедших акклиматизацию конвенциональных белых мышей массой 18-20 г и рассаживают по 10 особей в 2 кювета с крышками (опытная и контрольная группы). От каждого животного в начале исследования отбирают фекальные массы для подсчета общего количества микроорганизмов кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей (КОЕ·г^-1) с учетом выросших колоний на селективных плотных питательных средах при температуре 37°C в течение 48 ч.

Лабораторным животным обеих групп энтерально вводят суспензию бактерий возбудителя кишечного иерсиниоза в объеме 0,2 мл, содержащем 10 LD₅₀ бактерий. Через 24 ч инфицированным животным опытной группы внутримышечно вводят в объеме 0,1 мл водный раствор препарата Скай-форс из расчета 1 мг препарата на одно лабораторное животное. Лабораторным животным контрольной группы препарат Скай-форс не вводят. Наблюдение за животными осуществляют в течение 18 дней, отмечая исход инфицирования. В табл. 2 приведен результат инфицирования конвенциональных белых мышей возбудителем кишечного иерсиниоза .

Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют, что в результате инфицирования возбудителем кишечного иерсиниоза все лабораторные животные контрольной группы, в которой лечение не проводили, погибли в срок от 5 до 15 суток от начала инфицирования. От всех погибших лабораторных животных из внутренних органов выделена культура бактерий кишечного иерсиниоза: в 1 г фекалий количество бактерий составило 5,1·10⁵-6,5·10⁵ КОЕ·г^-1. При этом отмечается снижение общего количества микробиоты в 3,4·10⁵ раз, бифидобактерий - в 3,2·10⁵ раз, лактобактерий - в 3,3·10⁶ раз, эшерихий - в 10³ раз. Полученные результаты свидетельствуют о развитии у инфицированных лабораторных животных контрольной группы системной генерализованной инфекции - кишечного иерсиниоза и выраженных дисбиотических изменений в составе кишечной микрофлоры.

Из представленных в табл. 2 данных также следует, что все инфицированные лабораторные животные опытной группы, которым внутримышечно вводили препарат Скай-форс, выздоровели. Отсутствие гибели животных, отсутствие дисбиотических изменений в составе кишечной микрофлоры, отсутствие в кишечном содержимом бактерий кишечного иерсиниоза свидетельствуют о высокой эффективности препарата Скай-форс при лечении системной бактериальной инфекции - кишечного иерсиниоза.

Исследование органов и тканей подопытных лабораторных животных.

Для гистологических исследований отбирали кусочки органов и тканей, готовили тонкие срезы препаратов, окрашивали их гематоксилином Эрлиха и эозином, просматривали окрашенные срезы препаратов под световым микроскопом ЛОМО «Микмед-2». Для здоровых животных характерна следующая гистологическая картина: печень - дольчатая структура сохранена, кровенаполнение в норме, центральные вены не расширены, инфильтрация в портальных трактах отсутствует, дистрофических изменений гепатоцитов не выявлено; легкие - альвеолы не утолщены, кровенаполнение нормальное, инфильтация отсутствует; почки - клубочки без изменений, эпителий канальцев без признаков дистрофии.

При развитии патологического процесса наиболее выраженные изменения выявляются в кишечнике. Стенка кишки резко истончена, слизистая оболочка некротизирована, оставшиеся клетки железистого эпителия с выраженными дистрофическими изменениями, со стороны просвета кишки определяются некротические массы. Изменения в других внутренних органах являются следствием интоксикации организма микробными токсинами, а также продуктами распада тканей. В частности в легких просветы альвеол свободные, межальвеолярные перегородки утолщены, сосуды полнокровны, ткань легкого инфильтрирована клеточными элементами крови. Структура печени сохранена, сосуды полнокровны, в портальных трактах выявляется умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация, гепатоциты с выраженными дистрофическими изменениями, выявляются портопортальные некрозы. Для эпителия почечных канальцев характерна зернистая дистрофия, единичные клетки эпителия некротизированы и слущены просвет канальцев, в некоторых клубочках определяются эритроциты.

В опытных группах, где отмечено выздоровление лабораторных животных после лечения препаратом Скай-форс, гистологическая картина внутренних органов практически соответствует гистологическому описанию внутренних органов здоровых животных.

Поддержание колонизационной резистентности кишечника лабораторного животного по отношению к возбудителю.

От состояния колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника зависит начальный этап взаимодействия возбудителя с чувствительным организмом, то есть приживление или элиминация возбудителя, и в последующем исход заболевания. Препарат Скай-форс, введенный в организм, разрушает микробные клетки, в результате чего предотвращается адгезия возбудителя к эпителиоцитам и последующее его размножение. Таким образом, препарат Скай-форс препятствует размножению возбудителя, поддерживает колонизационную резистентность слизистой оболочки кишечника, обеспечивает нормальной микрофлоре кишечника микроэкологическое преимущество. Так, если в контрольной группе лабораторных животных, где лечение не проводили, общее количество нормальной микрофлоры снизилось с (6,0-6,4)·10⁹ КОЕ·г^-1 до (1,6-2,4)·10⁴ КОЕ·г^-1, то при введении лабораторным животным препарата Скай-форс изменений в состоянии нормальной микрофлоры не выявлено: в начале эксперимента общее ее количество составляло (6,1-6,5)·10⁹ КОЕ·г^-1, а в конце - (5,8-8,1)·10⁹ КОЕ·г^-1 (данные представлены в табл. 1 и 2). Сохранение микробиоты при введении препарата Скай-форс подтверждается также определением количества таких ведущих представителей микробиоты, как бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии (данные также представлены в табл 1 и 2).

Пример 3

Выращивают культуру вакцинного штамма чумного микроба (Y. pestis EV НИИЭГ), после чего готовят суспензию бактерий на изотоническом растворе хлорида натрия. Вносят в пробирку с бактериальной суспензией препарат Скай-форс до конечной концентрации 10 мкг·мл^-1. Производят отбор проб через 5, 8, 10 мин для определения количества жизнеспособных бактериальных клеток и проведения электронной микроскопии. Посев проб, отобранных после взаимодействия бактерий с препаратом Скай-форс, проводят на плотную питательную среду в чашках Петри и просматривают по окончании инкубирования в течение 48 ч при температуре 28°C. Результаты контроля бактерицидного действия препарата Скай-форс оценивают по наличию или отсутствию роста бактерий Y. pestis EV НИИЭГ на плотных питательных средах, а также по данным электронно-микроскопического исследования (рисунок).

Изучение бактерицидного действия препарата Скай-форс на микробную клетку показало, что через 5 мин контакта жизнеспособными остаются единичные бактерии. Через 8 мин контакта микробных клеток с препаратом Скай-форс жизнеспособных бактерий бактериологическим методом обнаружить не удается: как следует из микрофотографии на рисунке, контур клеток нарушен, видны расслоение клеточной стенки и разрывы в ней. К 10 минуте воздействия препарата Скай-форс на микробные клетки наблюдается их фрагментация, нарушение целостности клеточной оболочки и выход цитоплазмы за пределы клеточной оболочки. Указанные повреждения структуры клетки делают ее абсолютно нежизнеспособной.

Представленные результаты экспериментальных исследований со всей очевидностью свидетельствуют о больших потенциальных возможностях и уникальности свойств препарата Скай-форс, а также о перспективности его использования в качестве препарата первого выбора при лечении системных бактериальных инфекций, когда фактор времени является ключевым, а безотлагательно введенное парентерально лаборраторным животным лекарственное средство Скай-форс полностью купирует генерализацию инфекционного процесса.

1. Способ лечения системных иерсиниозных бактериальных инфекций псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза в эксперименте путем инфицирования лабораторных животных соответствующей культурой патогенных иерсиний псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза для инициации экспериментальной патологии с последующим внутримышечным введением лечебного препарата Скай-форс в терапевтически эффективной дозе под контролем содержания патогенных бактерий и индигенной микрофлоры в течение срока, достаточного для устранения заболевания, отличающийся тем, что в качестве лечебного средства внутримышечно в первые 24 ч после инфицирования каждому лабораторному животному, а именно белой конвенциональной мыши, 1 раз в сутки вводят препарат Скай-форс в приготовленном для применения виде как средство монотерапии, обеспечивающее невосприимчивость органов и тканей к возбудителю путем создания в них бактерицидных концентраций препарата Скай-форс, а также поддержание колонизационной резистентности кишечника по отношению к возбудителю, при этом каждому лабораторному животному препарат Скай-форс вводят 25 мг на 1 кг массы в течение 5 дней.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что о колонизационной резистентности слизистой кишечника судят по отсутствию дисбиотических изменений в составе кишечной микрофлоры путем подсчета общего количества микроорганизмов кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей (КОЕ·г^-1) на основании учета выросших колоний после посева суспензий фекалий лабораторных животных на селективные питательные среды и инкубации посевов при температуре 37°C в течение 48 ч.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инициация у лабораторных животных экспериментальной системной иерсиниозной бактериальной инфекции осуществляют путем энтерального введения им возбудителей псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза в дозе, равной 10 LD₅₀.