Синергические комбинации каротиноидов и полифенолов

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к терапевтической противовоспалительной композиции, которая содержит один или несколько полифенолов и два или более каротиноидов, которые выбирают из группы, состоящей из лютеина, ликопена и β-каротина, где полифенолы выбирают из группы, состоящей из карнозной кислоты, кверцетина, резвератрола и галловой кислоты, в определенном количестве; к способу ингибирования или снижения образования супероксид-ионов, NO, TNF-α и/или PGE₂ у субъекта-млекопитающего, которому вводят указанную выше композицию; к способу лечения патологических состояний, в которых супероксид-ионы, NO, TNF-α и/или PGE₂ выполняют функцию модулятора или медиатора указанного состояния у субъекта-млекопитающего, которому вводят указанную выше композицию; к применению комбинации одного или нескольких полифенолов и двух или более каротиноидов, которые выбирают из группы, состоящей из лютеина, ликопена и β-каротина, где полифенолы выбирают из группы, состоящей из карнозной кислоты, кверцетина, резвератрола и галловой кислоты, в определенном количестве. Вышеописанные изобретения характеризуются синергетическим взаимодействием полифенольных соединений с каротиноидами при ингибировании путей воспаления. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей синергические комбинации полифенолов и каротиноидов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей синергическую комбинацию указанных выше соединений, которые можно использовать inter alia для ингибирования образования различных медиаторов воспаления.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Воспалительный процесс, который образует важную часть неспецифической иммунной системы, характеризуется сложным набором химических и клеточных изменений, которые необходимы для защиты организма-хозяина перед лицом микробных агентов и других потенциально опасных факторов окружающей среды. Однако во многих случаях может происходить нецелесообразный запуск воспаления, и/или оно может сохраняться в той степени, которая становится опасной для организма-хозяина. В таких случаях может существовать необходимость ингибировать или предотвращать развитие одного или нескольких аспектов воспалительного процесса, в частности в оазисах неинфекционных воспалительных заболеваний.

Показано, что в развитие и контроль воспалительного процесса вовлечено очень большое число различных химических медиаторов. Недавние исследования во многих различных лабораториях связывают оксид азота (NO) в качестве важного модулятора различных острых и хронических воспалительных нарушений, включая различные типы артрита, желудочно-кишечных заболеваний, воспалительных состояний центральной нервной системы и определенные формы астмы. Таким образом, предполагают, что ингибирование образования NO может предоставить эффективный терапевтический механизм для лечения и/или контроля этих воспалительных нарушений. Кроме того, также показано, что ингибирование синтеза NO можно использовать при некоторых заболеваниях или состояниях, которые не обладают первичной воспалительной природой. Таким образом, например, обнаружено, что ингибирование синтеза NO снижает захват глюкозы в тканях конечностей у индивидуумов с диабетом 2-го типа во время физических нагрузок.

Образование NO in vivo опосредовано ферментами семейства синтазы оксида азота (NOS), включая индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS), которую активируют многие различные иммунологические стимулы, включая липополисахарид (ЛПС), γ-интерферон и интерлейкин 1 (IL-1).

Ингибирование NOS можно осуществить как in vitro, так и in vivo путем использования L-N^G-монометиларгининцитрата (L-NMMA). Кроме того, также показано, что некоторые другие соединения, включая множество натуральных продуктов, ингибируют образование NO. Последняя группа включает соединения, такие как лютеин [Rafi M. M. et al. Mol Nutr Food Res. 2007 Mar; 51 (3): 333-40; Choi, J. S. Nutrition. 2006 Jun; 22 (6):668-71] и ликопен [Rafi, M. M. et al. J Food Sci. 2007 Jan; 72 (1):S069-74]. Однако доказано, что эффективность и активность многих ингибиторов NO из натуральных продуктов не особенно высока. Следовательно существует необходимость в усовершенствованных ингибирующих образование NO композициях природного происхождения.

Другим крайне важным медиатором воспаления является фактор некроза опухоли α (TNF-α), который представляет собой цитокин, образуемый множеством типов клеток, включая макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты. TNF-α занимает ключевое положение на ранней стадии воспалительного процесса и отвечает за стимуляцию образования других факторов, таких как ядерный фактор κB, который в свою очередь вызывает активацию широкого диапазона провоспалительных генов. Таким образом, принимая во внимание его ключевую роль, TNF-α, несомненно, является важной возможной терапевтической мишенью для противовоспалительных средств.

Третьим ключевым медиатором воспаления является простагландин E₂ (PGE₂), член семейства регулирующих молекул эйкозаноидов. Таким образом, PGE₂ образуется в значительных количествах в местах воспаления, где он выполняет функцию вазодилататора, а также (вместе с другими медиаторами, такими как гистамин и брадикинин) вызывает повышение проницаемости сосудов, тем самым внося вклад в большинство классических признаков воспаления.

Наконец, другим провоспалительным медиатором, который высвобождают воспалительные клетки, такие как макрофаги и нейтрофилы, является супероксид-ион. Несмотря на то, что супероксид-ионы очень эффективно убивают микробных возбудителей, в других (в частности, неинфекционных) воспалительных состояниях, эти ионы могут вызывать обширное повреждение тканей организма-хозяина. Следовательно, образование супероксид-ионов является потенциально эффективной терапевтической мишенью при рассмотрении новых средств контроля воспалительных состояний.

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить композицию, которую можно использовать для ингибирования образования одного или нескольких ключевых медиаторов воспаления, таких как супероксид-ионы, NO, TNF-α и/или PGE₂, в качестве средства лечения или контроля патологических состояний и процессов, в которые вовлечены указанные медиаторы.

Другая цель изобретения состоит в том, чтобы предоставить композицию, которая может ингибировать образование указанных выше медиаторов воспаления с более высокой эффективностью и/или активностью, чем соединения и композиция, о которых сообщалось в предшествующем уровне техники.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Недавно авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что полифенольные соединения могут синергически взаимодействовать с каротиноидами при ингибировании некоторых провоспалительных путей. В частности, недавно обнаружено, что полифенольное соединение карнозная кислота вызывает синергическое усиление ингибирующего действия определенных каротиноидов, таких как ликопен, лютеин и β-каротин, на образование медиаторов воспаления NO, TNF-α и PGE₂. Кроме того, несмотря на то, что это синергическое действие наблюдали в двойных комбинациях карнозной кислоты вместе с ликопеном, β-каротином или лютеином, синергизм значительно усиливается, когда карнозную кислоту комбинируют двумя указанными выше каротиноидами. Указанное выше синергическое противовоспалительное действие также наблюдают, когда каротиноиды представлены в сочетании с другими полифенолами, такими как кверцетин, резвератрол и галловая кислота.

Следовательно настоящее изобретение главным образом направлено на терапевтическую композицию, которая содержит один или несколько полифенолов и два или более каротиноидов, которые выбирают из группы, состоящей из лютеина, ликопена и β-каротина.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления полифенолы, использованные в композициях по настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из карнозной кислоты, кверцетина, резвератрола, галловой кислоты, цикориевой кислоты, гингерола и куркумина.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению содержат полифенольное соединение карнозную кислоту.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению содержат полифенольное соединение кверцетин.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению содержат полифенольное соединение резвератрол.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению содержат полифенольное соединение галловую кислоту.

В одном из вариантов осуществления указанная выше терапевтическая композиция содержит карнозную кислоту, ликопен и лютеин.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиция содержит карнозную кислоту, лютеин и β-каротин.

В еще одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления композиция содержит ликопен, β-каротин и карнозную кислоту.

В другом варианте осуществления композиция по существу состоит из ликопена, лютеина и карнозной кислоты.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления композиция по существу состоит из лютеина, β-каротина и карнозной кислоты.

В еще одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления композиция по существу состоит из ликопена, β-каротина и карнозной кислоты.

Следует отметить, что термин «по существу состоит из», как используют на всем протяжении этого описания и приложенной формулы изобретения, относится к ситуации, где композиция по настоящему изобретению может содержать, в дополнение к названным компонентам (т.е. карнозная кислота вместе с ликопеном и/или лютеином), другие соединения, вещества и средства, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики настоящего изобретения.

В других предпочтительных вариантах осуществления композиции по описанным выше предпочтительным вариантам осуществления могут дополнительно содержать один или несколько дополнительных каротиноидов. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления дополнительные каротиноиды выбирают из группы, состоящей из фитоена и фитофлуена.

Активные компоненты описанных выше композиций (т.е. полифенол(ы) и каротиноиды) могут представлять собой очищенные соединения, синтетические соединения или могут быть представлены в смеси с другими компонентами, например, в растительных экстрактах, таких как экстракт розмарина (в случае карнозной кислоты), экстракт календулы (в случае лютеина) или экстракт томата (такой как Lycomato, который коммерчески доступен в компании LycoRed, Be'er Sheva, Israel - в случае ликопена и других каротиноидов).

Следует понимать, что термин «лютеин», как используют в настоящем описании, включает все сложные эфиры лютеина в пределах его объема. Кроме того, в объем термина «лютеин» может входить смесь лютеина и зеаксантина, поскольку указанный последним каротиноид часто присутствует вместе с лютеином (иногда составляет 0,1%-15% и более часто 4%-6% от содержания лютеина).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования или снижения образования супероксид-ионов, NO, TNF-α и/или PGE₂ у субъекта-млекопитающего, который содержит введение указанному субъекту терапевтической композиции по любому варианту осуществления, описанному выше в настоящем документе.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу лечения патологических состояний, в которых супероксид-ионы, NO, TNF-α и/или PGE₂ выполняют функцию модулятора или медиатора указанного состояния у субъекта-млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, где указанный способ включает в себя введение указанному субъекту терапевтической композиции согласно любому варианту осуществления, описанному выше в настоящем документе. В одном из предпочтительных вариантов осуществления этого способа состояние, подлежащее лечению, выбирают из группы, состоящей из острых воспалительных состояний, хронических воспалительных состояний, ревматоидного артрита, синдрома расстройства дыхания взрослых (СРДВ), астмы, ринита, идиопатического фиброза легких, перитонита, сердечно-сосудистого воспаления, ишемии миокарда, нарушения реперфузии, атеросклероза, сепсиса, травмы, диабета 2-го типа, ретинопатии, псориаза, желудочно-кишечного воспаления, цирроза, перитонита и воспалительного заболевания кишечника и нейродегенеративных заболеваний, таких как, например, болезнь Альцгеймера (БА).

В особенно предпочтительных вариантах осуществления способов, описанных выше в настоящем документе, субъектом-млекопитающим является человеческий субъект.

Несмотря на то, что в описанных выше способах терапевтическую композицию можно вводить любым удобным средством, в одном из предпочтительных вариантов осуществления указанную композицию вводят в фармацевтической лекарственной форме. Однако в другом предпочтительном варианте осуществления терапевтическую композицию включают в продукт питания или напиток.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию комбинации одного или нескольких полифенолов и двух или более каротиноидов, которые выбирают из группы, состоящей из ликопена, β-каротина и лютеина, в производстве лекарственного средства для лечения состояний, чувствительных к ингибированию образования NO, TNF-α и/или PGE₂.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления этого аспекта по изобретению один или несколько полифенолов выбирают из группы, состоящей из карнозной кислоты, кверцетина, резвератрола, галловой кислоты, цикориевой кислоты, гингерола и куркумина.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления этого аспекта по изобретению полифенолом является карнозная кислота.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления этого аспекта по изобретению полифенолом является кверцетин.

В еще одном другом особенно предпочтительном варианте осуществления этого аспекта по изобретению полифенолом является резвератрол.

В еще одном другом особенно предпочтительном варианте осуществления этого аспекта по изобретению полифенолом является галловая кислота.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления состоянием, подлежащим лечению, является воспалительное состояние.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления описанного выше использования состояние, подлежащее лечению, выбирают из группы, состоящей из острых воспалительных состояний, хронических воспалительных состояний, ревматоидного артрита, синдрома расстройства дыхания взрослых (СРДВ), астмы, ринита, идиопатического фиброза легких, перитонита, сердечно-сосудистого воспаления, ишемии миокарда, нарушения реперфузии, атеросклероза, сепсиса, травмы, диабета 2-го типа, ретинопатии, псориаза, желудочно-кишечного воспаления, цирроза, перитонита и воспалительного заболевания кишечника и нейродегенеративных заболеваний, таких как, например, болезнь Альцгеймера (БА).

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления этого аспекта по изобретению, карнозную кислоту используют в сочетании как с ликопеном, так и с лютеином.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления этого аспекта по изобретению, карнозную кислоту используют в сочетании как с ликопеном, так и с β-каротином.

В еще одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления этого аспекта по изобретению карнозную кислоту используют в сочетании как с лютеином, так и с β-каротином.

Все указанные выше и другие характеристики и преимущества настоящего изобретения можно глубже понять на основе следующих иллюстративных неограничивающих примеров его предпочтительных вариантов осуществления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фиг. 1 графически представлено синергическое взаимодействие карнозной кислоты и ликопена при ингибировании образования NO перитонеальными макрофагами. На верхнем графике показаны результаты, полученные с использованием очищенного ликопена, тогда как на нижнем графике показаны результаты, полученные с использованием обогащенного ликопеном экстракта томата.

На фиг. 2a графически представлено синергическое взаимодействие между карнозной кислотой и очищенным ликопеном (верхний график) и между карнозной кислотой и обогащенным ликопеном экстрактом томата (нижний график) при ингибировании образования NO перитонеальными макрофагами.

На фиг. 2b графически представлено синергическое взаимодействие между ликопеном и различными комбинациями лютеина, карнозной кислоты и β-каротина при ингибировании образования NO перитонеальными макрофагами. На верхнем графике представлены результаты, полученные с использованием очищенного ликопена, тогда как на нижнем графике представлены результаты, полученные с использованием обогащенного ликопеном экстракта томата.

На фиг. 2c дополнительно показано синергическое взаимодействие между ликопеном и различными комбинациями лютеина, карнозной кислоты и β-каротина при ингибировании образования NO перитонеальными макрофагами. На верхнем графике представлены результаты, полученные с использованием очищенного ликопена, тогда как на нижнем графике представлены результаты, полученные с использованием обогащенного ликопеном экстракта томата.

На фиг. 3 графически представлено синергическое взаимодействие между ликопеном и различными комбинациями лютеина, карнозной кислоты и β-каротина при ингибировании образования TNF-α перитонеальными макрофагами. На верхнем графике представлены результаты, полученные с использованием очищенного ликопена, тогда как на нижнем графике представлены результаты, полученные с использованием обогащенного ликопеном экстракта томата.

На фиг. 4 графически представлено синергическое взаимодействие между ликопеном и различными комбинациями лютеина, карнозной кислоты и β-каротина при ингибировании образования PGE₂ перитонеальными макрофагами, в сравнении с несинергическим действием комбинаций без ликопена.

На фиг. 5a графически представлено синергическое взаимодействие между очищенным ликопеном и различными комбинациями различных смесей лютеина, карнозной кислоты и β-каротина при ингибировании образования PGE₂ перитонеальными макрофагами.

На фиг. 5b графически представлено синергическое взаимодействие между обогащенным ликопеном экстрактом томата и различными комбинациями различных смесей лютеина, карнозной кислоты и β-каротина при ингибировании образования PGE₂ перитонеальными макрофагами.

На фиг. 6 графически представлено синергическое взаимодействие между лютеином, β-каротином и карнозной кислотой при ингибировании стимулированного липополисахаридом образования NO перитонеальными макрофагами.

На фиг. 7 графически представлено синергическое взаимодействие между лютеином, β-каротином и карнозной кислотой при ингибировании стимулированного липополисахаридом образования TNF-α перитонеальными макрофагами.

На фиг. 8 графически представлено синергическое взаимодействие между ликопеном, лютеином и различными полифенолами при ингибировании стимулированного липополисахаридом образования NO перитонеальными макрофагами. На диаграмме A представлены результаты использования очищенного ликопена, тогда как на диаграмме B представлены результаты, полученные при использовании содержащего ликопен экстракта томата (Lyc-O-Mato).

На фиг. 9 графически представлено синергическое взаимодействие между ликопеном, лютеином, β-каротином и карнозной кислотой при ингибировании образования супероксида макрофагами. На диаграмме A представлены результаты использования очищенного ликопена, тогда как на диаграмме B представлены результаты, полученные с использованием содержащего ликопен экстракта томата (Lyc-O-Mato).

На фиг. 10 представлено синергическое взаимодействие между ликопеном или Lyc-O-Mato с лютеином и карнозной кислотой при ингибировании фосфорилирования p65-NFκB по серину 536 в клеточных ядерных лизатах, после предварительной инкубации с ЛПС в течение 10 минут. На верхней части фигуры представлены результаты иммуноблоттинга, из которых получали графические данные.

На фиг. 11 графически представлено синергическое взаимодействие между ликопеном или Lyc-O-Mato с лютеином и карнозной кислотой при ингибировании экспрессии белка индуцируемой липополисахаридом синтазы оксида азота (iNOS) и циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) в цельноклеточных лизатах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Как описано выше в настоящем документе, настоящее изобретение относится к композициям, которые содержат комбинации одного или нескольких полифенолов с одним или несколькими каротиноидами. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции содержат карнозную кислоту в качестве единственного полифенола и один или несколько каротиноидов, которые выбирают из группы, состоящей из ликопена (или очищенного или содержащегося в экстракте томата), лютеина и β-каротина. В других предпочтительных вариантах осуществления единственный полифенольный компонент выбирают из группы, состоящей из кверцетина, резвератрола и галловой кислоты.

Предпочтительные суточные количества каждого активного средства, присутствующего в композициях, которые вводят субъектам, нуждающимся в таком введении, имеют следующие значения:

Карнозная кислота	от 0,5 до 30 мг
Ликопен	от 0,5 до 30 мг
Лютеин	от 0,5 до 30 мг
β-каротин	от 0,5 до 30 мг

Более предпочтительно, суточное количество каждого указанного выше активного средства находится в диапазоне от 1 до 5 мг.

Количество каждого из различных активных компонентов можно выбрать так, чтобы массовые отношения между ними попадали в следующий широкий диапазон:

Ликопен:	Лютеин:	β-каротин:	Карнозная кислота:
0,1-5,0:	0,1-5,0:	0,1-5,0:	0,1-5,0

В одной предпочтительной группе композиций активные компоненты можно комбинировать в следующих диапазонах массовых отношений:

Ликопен:	Лютеин:	β-каротин:	Карнозная кислота:
0,1-1,0:	0,1-1,0:	0,1-1,0:	0,1-1,0

В одном из предпочтительных вариантов осуществления активные компоненты можно комбинировать при следующем отношении:

Ликопен:	Лютеин:	β-каротин:	Карнозная кислота:
1,0:	1,0:	1,0:	0,5

В другом предпочтительном варианте осуществления активные компоненты можно комбинировать при следующем отношении:

Ликопен:	Лютеин:	β-каротин:	Карнозная кислота:
1,0:	0,3:	0,3:	0,4

В еще одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления активные компоненты можно комбинировать при следующем отношении:

Ликопен:	Лютеин:	β-каротин:	Карнозная кислота:
1,0:	1,0:	1,0:	1,0

Следует отметить, что композиции, полученные в соответствии с предыдущими примерами предпочтительных массовых отношений не требуют обязательного присутствия всех четырех перечисленных компонентов. Точнее достаточно, чтобы композиция содержала карнозную кислоту (или другой полифенол) вместе с по меньшей мере двумя указанными каротиноидами, где относительное количество каждого из этих компонентов равно указанному с помощью фигур, приведенных непосредственно выше в настоящем документе.

В другой группе предпочтительных вариантов осуществления активные компоненты можно комбинировать в следующих диапазонах массовых отношений:

Ликопен:	Лютеин:	β-каротин:	Карнозная кислота:
0,1-1,0:	0,1-5,0:	0,1-1,0:	0,1-1,0

Более предпочтительно активные компоненты можно комбинировать в следующих диапазонах массовых отношений:

Ликопен:	Лютеин:	β-каротин:	Карнозная кислота:
0,1-1,0:	0,1-4,0:	0,1-1,0:	0,1-1,0

В конкретных предпочтительных вариантах осуществления активные компоненты можно комбинировать при следующих массовых отношениях:

Ликопен:	Лютеин:	Карнозная кислота:
0,1:	1,73:	0,13

Ликопен:	Лютеин:	Карнозная кислота:
0,1:	1,8:	0,26

β-каротин:	Лютеин:	Карнозная кислота:
0,29:	1,29:	0,1

β-каротин:	Лютеин:	Карнозная кислота:
0,39:	1,29:	0,1

β-каротин:	Лютеин:	Карнозная кислота:
0,32:	3,42:	0,1

β-каротин:	Лютеин:	Карнозная кислота:
0,16:	1,71:	0,1

β-каротин:	Лютеин:	Карнозная кислота:
0,29:	1,29:	0,1

β-каротин:	Лютеин:	Карнозная кислота:
0,39:	1,29:	0,1

Различные активные компоненты можно вводить в составы или для системного, или для местного использования. В случае системного введения полифенол(ы) и каротиноид(ы) можно включать в пероральные лекарственные формы, такие как таблетки, каплеты, капсулы, сиропы, эликсиры, жидкости и т.д.

В других предпочтительных вариантах осуществления композицию по настоящему изобретению можно вводить местно, например на кожу или слизистые оболочки (например, в виде кремов, лосьонов, мазей и т.д.). Дополнительные подробности относительно подходящих способов включения содержащих полифенолы и каротиноиды композиций по настоящему изобретению во многие различные лекарственные формы можно получить из любого стандартного справочника, известного специалистам, включая, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, Па, USA (1980).

В других предпочтительных вариантах осуществления композицию по настоящему изобретению получают в виде пищевой добавки, которая подходит для непосредственного включения в продукт питания или напиток.

Карнозную кислоту, которую используют для получения композиций по настоящему изобретению, можно получать коммерческим путем от нескольких различных поставщиков, включая Alexis Biochemicals, Lausen, Switzerland. Каротиноиды получали от нескольких различных поставщиков, включая LycoRed Ltd., Be'er Sheva, Israel.

Альтернативно, некоторые компоненты композиции, такие как ликопен, можно включать в указанную композицию в форме обогащенного ликопеном экстракта томата. Один такой экстракт томата коммерчески доступен (например, в форме капсул) из LycoRed Ltd., Beer Sheva, Israel, под торговым названием «Lyc-O-Mato®». Подходящие процессы для получения этого экстракта и схожих экстрактов описаны в US 5837311, описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Однако следует учитывать, что любые другие типы процедур получения можно использовать для получения содержащей каротиноид композиции из множества растительных источников. Кроме того, композиции также можно получать из одного или нескольких синтетических каротиноидов.

Следующие примеры приведены в иллюстративных целях и для того, чтобы более конкретно объяснить и описать настоящее изобретение. Однако настоящее изобретение не ограничено конкретными вариантами осуществления, описанными в этих примерах.

ПРИМЕР 1

Ингибирование образования NO, TNF-α и PGE ₂ в перитонеальных макрофагах различными комбинациями карнозной кислоты, лютеина, ликопена и β-каротина

Способы и материалы

Выделение и клеточная культура макрофагов. Перитонеальные макрофаги собирали из брюшных полостей самцов мышей ICR в возрасте 6-8 недель (Harlan, Israel), которым вводили интраперитонеальную инъекцию 1,5 мл тиогликолевой жидкой среды (4%) за 4 суток до сбора. Перитонеальные макрофаги отмывали три раза с PBS и, при необходимости, осуществляли гипотонический лизис эритроцитов, получали чистоту 90-95%. Макрофаги идентифицировали в анализе на клеточном сортере с возбуждением флуоресценции с использованием конъюгированных с ФИТЦ антител крысы против F4/80 мыши (MCA497F) (Serotec, Oxford, England) посредством проточной микрофлуорометрии на клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Для каждого образца анализировали 10000 отобранных по светорассеянию жизнеспособных клеток. Перитонеальные макрофаги и клеточную линию макрофагов мыши RAW264,7 культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS, 2 мМ L-глутамина; 100 Ед/мл пенициллина; 100 мкг/мл стрептомицина (Beit-Haemek, Israel) в 96-луночных плашках (1×10⁶ клеток/лунка) при 37°C в атмосфере с 5% CO₂. Клетки стимулировали липополисахаридом (0,1-1 мкг/мл) в присутствии или в отсутствие карнозной кислоты и/или одного или нескольких следующих каротиноидов: карнозная кислота, очищенные ликопен, обогащенный ликопеном экстракт томата (Lyc-O-Mato®; LycoRed Ltd., Be'er Sheva, Israel), лютеин и β-каротин.

Карнозную кислоту и различные каротиноиды растворяли в DMSO (до конечной концентрации 5 мМ). Смесь энергично перемешивали и инкубировали на водяной бане при 37°C (при встряхивании) в течение 10 мин, а затем обрабатывали звуком в ванне для обработки звуком три раза, каждый раз в течение 15 секунд. Используя этот основной раствор, желаемые концентрации получают добавлением соответствующих его объемов в теплую среду для культивирования.

Концентрацию ликопена в растворе определяли после экстракции следующим образом: 0,5 мл изопропанола + 1,5 гексана/дихлорметана (1:5 об./об.), содержащего 0,025% BHT, добавляли в 1 мл свежеприготовленного раствора ликопена с концентрацией 20 мкМ в предварительно нагретой среде. Раствор энергично перемешивали и разделяли фазы посредством центрифугирования на скорости 3000 об./мин в течение 10 мин.

Чтобы измерить содержание ликопена проводили спектральный анализ (пик поглощения 471 нм).

Соответствующие объемы DMSO (0,1-0,2%) добавляли в контроли и процент ингибирования в каждой пробирке вычисляли по отношению к его контролю.

Анализ образования NO. Уровни NO в супернатантах клеточных культур определяли посредством анализа уровней нитрита с использованием реактива Грисса и нитрита натрия в качестве стандарта, как описано в Green, L. C, Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., и Tannenfaaum, S. R. (1982) Anal Biochem. 126: 131-138.

Измерение PGE ₂ . Супернатанты покоящихся и стимулированных клеток собирали и незамедлительно сохраняли при -70°C. Уровни PGE₂ определяли, используя протокол радиоиммунного анализа с угля, покрытого декстраном, как ранее описано (Dror N, Tveria L, Meniv I, Ben-Shmuel S, Filipovich T, Fleisher-Berkovich S., Regul Pept. 2008 150: 21-5).

В кратком изложении, 100 мкл образца или стандарта PGE₂ (Sigma Israel, Rehovot, Israel) инкубировали в присутствии 500 мкл антисыворотки против PGE₂ (Sigma Israel, Rehovot, Israel) в течение 30 мин. Затем добавляли [³H]PGE₂ (Amersham Biosciences, NJ, USA) в течение 24 ч при температуре 4°C. Через 24 ч 200 мкл холодной суспензии угля, покрытого декстраном, добавляли в каждую пробирку и инкубировали в течение 10 мин на льду. Пробирки центрифугировали на скорости 3500 об/мин в течение 15 мин при температуре 4°C. В 500 мкл супернатантов, содержащих комплексы [³H]PGE₂ и антител против PGE₂, проводили подсчет (Packard Spectrometry 1900CA) и вычисляли количество PGE₂.

Анализ образования TNF-α. Концентрации TNF-α количественно определяли с использованием наборов ELISA (Biolegend Inc., San Diego, CA).

Статистический анализ. Данные представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Статистическую значимость для сравнений между группами определяли с использованием двустороннего парного критерия Стьюдента.

Результаты

Фиг. 1

Зависящее от дозы синергическое ингибирование образования NO комбинацией ликопена или Lycomato и карнозной кислоты.

С использованием карнозной кислоты или отдельных каротиноидов самих по себе получены следующие результаты: ликопен или Lycomato в диапазоне 1-5 мкМ вызывали низкий уровень ингибирования образования NO. Карнозная кислота (1 и 2 мкМ) вызывала 12% и 18% ингибирование образования NO, соответственно.

Добавление карнозной кислоты к ликопену или Lycomato вызывало синергическое ингибирование образования NO, которое зависело от дозы.

Более эффективна комбинация карнозной кислоты с Lycomato, чем с очищенным ликопеном.

Результаты, представленные на фиг. 1, представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего 10 независимых экспериментов, каждый из которых проводили дважды.

Фиг. 2a

Ингибирование образования NO комбинацией оптимальных низких концентраций двух компонентов: ликопена или Lycomato с карнозной кислотой, лютеином и β-каротином.

Комбинация 1 мкМ ликопена или Lycomato с 2 мкМ карнозной кислоты вызывала значимое синергическое ингибирование образования NO, которое было более эффективным в присутствии Lycomato в сравнении с ликопеном.

Комбинация 1 мкМ ликопена или Lycomato с 1 мкМ лютеина или с 2 мкМ β-каротина вызывала аддитивное или не обладающее значимостью синергическое ингибирование образования NO, соответственно.

Комбинация ликопена или Lycomato с карнозной кислотой (т.е. комбинация каротиноида с полифенолом) более эффективна, чем комбинация двух каротиноидов.

Фиг. 2b

Ингибирование образования NO комбинацией оптимальных низких концентрации ликопена или Lycomato с двумя другими компонентами.

Комбинация ликопена или Lycomato с карнозной кислотой и лютеином или с карнозной кислотой и β-каротином (концентрации такие же, как использовали для получения результатов, представленных на фиг. 2a) вызывала значимое и схожее синергическое ингибирование образования NO, тогда как комбинация, не содержащая карнозную кислоту, оказывала только аддитивное действие (обозначено пунктирным эллипсом).

Комбинация четырех компонентов (т.е. ликопена или Lycomato вместе с карнозной кислотой, лютеином и β-каротином) не превосходила комбинацию трех компонентов.

Фиг. 2c

Комбинация карнозной кислоты и каротиноидов, исключая ликопен или Lycomato.

Комбинация или лютеина, или β-каротина с карнозной кислотой вызывала значимое и схожее синергическое ингибирование образования NO (которое схоже с комбинацией ликопена и карнозной кислоты, но ниже, чем наблюдали при использовании комбинации Lycomato и карнозной кислоты). Комбинация лютеина и β-каротина оказывала аддитивное (или более слабое) действие. Эти результаты дополнительно подтверждают то, что как каротиноид(ы), так и полифенол(ы) необходимы для того, чтобы добиться оптимального синергического действия.

Результаты представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего 3 независимых экспериментов, каждый из которых проводили дважды.

Фиг. 3

Верхний график: Ингибирование образования TNF-α различными комбинациями оптимальных низких концентраций ликопена с карнозной кислотой, лютеином и β-каротином.

Образование TNF-α в том же наборе экспериментов, что и на фиг. 2, менее чувствительно, чем образование NO, поскольку ни одно из этих средств не вызывало какого-либо обнаружимого ингибирования образования TNF-α при использовании по отдельности (т.е. не в сочетании с другими средствами).

Комбинации ликопена с карнозной кислотой или с β-каротином вызывали низкий уровень синергического ингибирования образования TNF-α: 10% и 8% соответственно.

Сходно действию на образование NO, комбинации ликопена или с карнозной кислотой и лютеином или с карнозной кислотой и β-каротином вызывали значимое и схожее синергическое ингибирование образования TNF-α, которое превышало синергическое ингибирование, вызванное комбинацией, не содержащей карнозную кислоту.

Комбинация карнозной кислоты со всеми тремя каротиноидами не превосходила синергический результат, полученный с использованием указанной выше комбинации карнозной кислоты с двумя каротиноидами.

Нижний график: Ингибирование образования TNF-α различными комбинациями оптимальных низких концентраций Lycomato с карнозной кислотой, лютеином и β-каротином.

Образование TNF-α ингибировали (10%) в присутствии Lycomato (в отличие от отсутствия обнаружимого ингибирования в присутствии ликопена). Комбинации Lycomato с каждым другим каротиноидом вызывали синергическое ингибирование, которое было выше в присутствии карнозной кислоты.

Сходно с действием на образование NO, комбинации Lycomato с карнозной кислотой и лютеином или с карнозной кислотой и β-каротином вызывало значимое схожее синергическое ингибирование образования TNF-α, тогда как комбинации, не содержащие карнозную кислоту, оказывали меньшее синергическое действие.

Как и в случае очищенного ликопена, комбинация карнозной кислоты со всеми тремя каротиноидами не превосходила синергический результат, полученный при использовании указанной выше комбинации карнозной кислоты с двумя каротиноидами.

Результаты представляли собой средние значения ± стандартную ошибку среднего 3 независимых экспериментов, каждый из которых осуществляли дважды.

Следует отметить, что комбинации, которые содержали Lycomato, были более эффективны при ингибировании образования TNF-α, чем те, что содержали очищенный ликопен.

Фиг. 4

Ингибирование образования PGE ₂ различными комбинациями оптимальных низких концентраций ликопена с карнозной кислотой, лютеином и β-каротином.

Образование PGE₂ в том же наборе экспериментов, как представлено на фиг. 2, более чувствительно, чем образование NO, к карнозной кислоте или β-каротину при использовании по отдельности (ингибирование приблизительно 20% для каждого). Комбинации ликопена с лютеином, карнозной кислотой или β-каротином вызывали синергическое ингибирование образования PGE₂.

Низкий уровень синергического ингибирования можно обнаружить с использованием комбинации Lycomato только с лютеином и карнозной кислотой, тогда как комбинация с карнозной кислотой и β-каротином вызывала только аддитивное действие. Комбинация с лютеином и β-каротином вызывала аддитивное ингибирование образования PGE₂.

На фиг. 4 также вновь можно видеть, что комбинация четырех средств (карнозной кислоты плюс три каротиноида) не превосходила комбинацию карнозной кислоты с двумя каротиноидами.

Фиг. 5a

Ингибирование образования PGE ₂ различными комбинациями оптимальных низких концентраций ликопена с карнозной кислотой, лютеином и β-каротином.

Как уже показано на фиг. 4, на верхней диаграмме на фиг. 5a показано, что карнозная кислота или β-каротин (каждое использовали раздельно) вызывали высокий уровень ингибирования образования PGE₂ (ингибирование приблизительно 20% для каждого). Комбинации ликопена с лютеином, карнозной кислотой или β-каротином вызывали синергическое ингибирование образования PGE₂.

Низкий уровень синергического ингибирования можно определить в случае комбинации ликопена только с лютеином и карнозной кислотой, тогда как комбинация с карнозной кислотой и β-каротином вызывала только аддитивное действие. Комбинация, содержащая лютеин и β-каротин, вызывала аддитивное ингибирование образования PGE₂. Таким образом, изучали более низкие концентрации (как показано на нижней диаграмме на фиг. 5a, рассмотрено ниже).

Комбинация всех четырех активных средств (т.е. карнозной кислоты плюс три каротиноида) не превосходила комбинацию карнозной кислоты с двумя каротиноидами.

Синергическое ингибирование образования PGE ₂ различными комбинациями оптимальных более низких концентраций карнозной кислоты, лютеина и β-каротина (нижняя диаграмма).

Ни лютеин (0,5 мкМ), ни β-каротин (1 мкМ) по отдельности не оказывали действие на образование PGE₂, тогда как карнозная кислота (1 мкМ) вызывала 10% ингибирование. В этих условиях комбинации ликопена 1 мМ с более низкой концентрацией одного из двух других компонентов вызывали синергическое ингибирование.

Комбинация всех четырех активных средств не превосходила комбинацию трех активных средств.

Фиг. 5b

Ингибирование образования PGE ₂ различными комбинациями оптимальных низких концентраций Lycomato с карнозной кислотой, лютеином и β-каротином.

На верхней диаграмме показано, что действие Lycomato на ингибирование образования PGE₂ схоже с таковым чистого ликопена и схожие комбинации приводили к схожему действию, как показано для ликопена (верхняя диаграмма на фиг. 5a).

Синергическое ингибирование образования PGE ₂ различными комбинациями оптимальных более низких концентраций карнозной кислоты, лютеина и β-каротина (нижняя диаграмма).

Как на фиг. 5a ни лютеин (0,5 мкМ), ни β-каротин (1 мкМ) по отдельности не оказывали влияние на образование PGE₂, тогда как карнозная кислота (1 мкМ) вызывала 10% ингибирование. Комбинация с β-каротином была аддитивной, тогда как комбинации с лютеином или с карнозной кислотой были синергическими и более эффективными, чем полученные с использованием очищенного ликопена (фиг. 5a). Комбинация Lycomato с карнозной кислотой и лютеином или с карнозной кислотой и β-каротином вызывала значимое и схожее синергетическое ингибирование образования PGE₂. Комбинация лютеина и β-каротина (не содержащая карнозную кислоту) вызывала более низкий уровень синергического ингибирования. При этих концентрациях комбинация Lycomato с лютеином и карнозной кислотой вызывала синергическое действие, которое значительно превосходило полученное в результате использования комбинаций с очищенным ликопеном.

Комбинация всех четырех активных средств (т.е. карнозной кислоты плюс три каротиноида) не превосходила комбинацию карнозной кислоты с двумя каротиноидами.

Фиг. 6

Синергическое ингибирование образования NO комбинациями лютеина, β-каротина и карнозной кислоты.

На двух верхних диаграммах (A и B) представлено синергическое взаимодействие между тремя компонентами тестируемой композиции на образование NO, где конечная концентрация β-каротина составляла 0,5 мкМ. Аналогичным образом, композиции, содержащие более высокую концентрацию β-каротина (1,0 мкМ; диаграммы C и D), также вызывали ингибирование образования NO синергическим образом.

На каждой диаграмме, представленной на фиг. 6, горизонтальная линия на столбце, представляющем трехкомпонентную композицию, указывает уровень ингибирования NO, который следовало ожидать, если бы действие каждого указанного компонента было аддитивным. Наблюдаемый значительно повышенный уровень ингибирования (область столбца над горизонтальной линией, обозначенная «S») указывает на то, что три компонента композиции действовали синергически.

Фиг. 7

Синергическое ингибирование образования TNF-α комбинациями лютеина, β-каротина и карнозной кислоты.

На двух верхних диаграммах (A и B) представлено влияние синергического взаимодействия между тремя компонентами тестируемой композиции на образование TNF-α, где конечная концентрация β-каротина составляла 0,5 мкМ. Аналогичным образом, композиции, содержащие более высокую концентрацию β-каротина (1,0 мкМ; диаграммы C и D) также вызывали ингибирование образования TNF-α синергическим образом.

На каждой диаграмме, представленной на фиг. 7, горизонтальная линия на столбце, соответствующем трехкомпонентной композиции, указывает уровень ингибирования TNF-α, который следовало ожидать, если бы действие каждого указанного компонента было аддитивным. Наблюдаемый значительно повышенный уровень ингибирования (область столбца над горизонтальной линией, обозначенной «S») указывает на то, что три компонента композиции действовали синергически.

ПРИМЕР 2

Ингибирование индуцированного липополисахаридом образования NO в перитонеальных макрофагах различными комбинациями лютеина, ликопена и полифенола, который выбирают из группы, состоящей из карнозной кислоты, галловой кислоты, резвератрола и кверцетина

Способы и материалы

Выделение и клеточная культура макрофагов. Перитонеальные макрофаги собирали и культивировали, как описано в примере 1 выше в настоящем документе.

Получение тестируемых средств. Ликопен и лютеин растворяли в DMSO (объем DMSO в тестируемом растворе не превышал 0,04%). Смесь энергично перемешивали и встряхивали при температуре 37°C в течение 10 мин и обрабатывали звуком в ванне для обработки звуком 3 раза по 15 с. Из этого основного раствора желаемые концентрации получали добавлением соответствующих объемов в теплую среду для культивирования. Концентрацию в растворе вычисляли для 1 мл самой высокой конечной концентрации 0,5 мл изопропанола + 1,5 мл гексана/дихлорметана (1:5 об./об.), содержащего 0,025% BHT. Раствор энергично перемешивали и фазы разделяли посредством центрифугирования на скорости 3000 об/мин в течение 10 мин. Для определения уровня питательных веществ проводили спектральный анализ. Карнозную кислоту, резвератрол, галловую кислоту или кверцетин растворяли в этаноле (объем этанола в тестируемом растворе не превышал 0,0025%).

В контроли добавляли соответствующие объемы DMSO и/или этанола и вычисляли процент ингибирования каждой пробирки по отношению к ее контрольной пробирке.

Анализ образования NO. Уровни NO в супернатантах клеточных культур определяли посредством анализа уровней нитрита с использованием реактива Грисса и нитрита натрия, как описано выше в настоящем документе в примере 1.

Статистический анализ. Данные представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Статистическую значимость для сравнений между группами определяли с использованием двустороннего парного критерия Стьюдента.

Результаты

Фиг. 8

A. Синергическое ингибирование образования NO комбинациями низких концентраций ликопена, лютеина и каждого из различных полифенолов

Макрофаги инкубировали 1 мкМ ликопена, 1 мкМ лютеина и одним из 2 мкМ карнозной кислоты, 2 мкМ резвератрола, 2 мкМ галловой кислоты или 2 мкМ кверцетина и их комбинациями в течение 1 часа перед добавлением ЛПС на 16 ч при температуре 37°C. Измеряли образование NO и вычисляли процент ингибирования. В каждом эксперименте анализировали действие трех различных концентраций ЛПС, поскольку чувствительность клеток могла меняться в различных экспериментах.

Комбинации 1 мкМ ликопена, 1 мкМ лютеина и 2 мкМ одного из карнозной кислоты, резвератрола, галловой кислоты или кверцетина вызывали значимое синергическое ингибирование образования NO (обозначено буквой «S» на диаграмме, где горизонтальная линия, пересекающая каждый столбец, представляющий синергическую комбинацию, обозначает результаты, которые следовало ожидать, если бы взаимодействие было аддитивным, а не синергическим). Отсутствовали значимые различия между всеми этими различными комбинациями. Как показано на фигуре, действие каждого тестируемого каротиноида или полифенола при данной концентрации было очень слабым. Как показано горизонтальной линией на каждой диаграмме, синергическое действие было приблизительно в три раза сильнее, чем аддитивное действие.

B. Синергическое ингибирование образования NO комбинацией низких концентраций Lyc-O-Mato, лютеина и каждого из различных полифенолов.

Макрофаги обрабатывали как в п. A, но эксперименты проводили с использованием Lyc-O-Mato вместо ликопена.

Несмотря на то, что сам Lyc-O-Mato вызывал ингибирование образования NO, схожее с вызываемым ликопеном, комбинации с Lyc-O-Mato были более эффективными и приводили к более выраженному приблизительно четырехкратному синергизму по сравнению с аддитивным действием.

Результаты, приведенные на фиг. 8, приведены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего трех различных экспериментов, каждый из которых выполняли трижды.

ПРИМЕР 3

Ингибирование индуцированного липополисахаридом образования супероксида в макрофагах различными комбинациями ликопена или Lyc-O-Mato, лютеина, β-каротина и карнозной кислоты

Способы и материалы

Выделение макрофагов. Перитонеальные макрофаги выделяли и обрабатывали, как описано выше в настоящем документе в примере 1.

Образование супероксида. Образование супероксид-аниона (O₂ ^-) макрофагами измеряли в виде ингибируемого супероксиддисмутазой восстановления феррицитохрома способом с микротитровальным планшетом, как известно в существующем уровне техники. Аликвоту радиоактивно меченных макрофагов (5×10⁵ клеток/лунка), использованных в анализе прилипания, брали и суспендировали в 100 мкл инкубационной среды, содержащей феррицитохром c (150 мМ). Стимуляцию индуцировали с использованием PMA (50 нг/мл). Восстановление феррицитохрома c вызывало изменение спектральной поглощательной способности, которую измеряли при 550 нм через интервалы 2 мин в течение 30 мин на Thermomax Microplate Reader (Molecular Devices, Melno Park, Calif., USA). Максимальные интенсивности образования супероксида определяли и выражали в виде наномолей O₂ ^-/10⁶ клеток/10 мин с использованием коэффициента экстинкции E₅₅₀=21 мМ^-1см^-1.

Результаты

Фиг. 9

Верхняя диаграмма (A): Ингибирование образования супероксида различными комбинациями оптимальных низких концентраций очищенного ликопена с карнозной кислотой, лютеином или β-каротином.

Образование супероксида ингибировали в присутствии 2 мкМ β-каротина (10%).

Комбинации ликопена с карнозной кислотой или с β-каротином вызывали низкий уровень ингибирования образования супероксида, которое незначительно отличалось от действия β-каротина.

Схожее с действием на образование NO (см. пример 1 выше в настоящем документе), комбинации ликопена или с карнозной кислотой и лютеином или с карнозной кислотой и β-каротином, вызывали значимое и схожее синергическое ингибирование образования супероксида, которое превышало синергическое ингибирование, вызванное комбинацией, не содержащей карнозную кислоту.

Комбинация карнозной кислоты со всеми тремя каротиноидами не превосходила синергический результат, полученный с использованием указанной выше комбинации карнозной кислоты с двумя каротиноидами.

Нижняя диаграмма (B): Ингибирование образования супероксида различными комбинациями оптимальных низких концентраций Lyc-O-Mato с карнозной кислотой, лютеином или β-каротином.

Образование супероксида ингибировали (7%) в присутствии Lyc-O-Mato (в отличие от отсутствия обнаружимого ингибирования в присутствии ликопена). Комбинации Lyc-O-Mato с каждым из других каротиноидов вызывали низкий уровень ингибирования образования супероксида, которое незначительно отличалось от действия β-каротина или Lyc-O-Mato.

Схоже с действием на образование NO (см. пример 1 выше в настоящем документе), комбинации Lyc-O-Mato с карнозной кислотой и лютеином или с карнозной кислотой и β-каротином вызывали значимое и схожее синергическое ингибирование образования супероксида, тогда как комбинация, не содержащая карнозную кислоту, вызывала менее выраженное синергическое действие.

Как и в случае очищенного ликопена, комбинация карнозной кислоты со всеми тремя каротиноидами не превосходила синергический результат, полученный с использованием указанной выше комбинации карнозной кислоты с двумя каротиноидами.

Результаты представляли собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего 3 независимых экспериментов, каждый из которых осуществляли дважды.

ПРИМЕР 4

Ингибирование индуцированного липополисахаридом фосфорилирования p65-NFkB по серину 536 в клеточных ядерных лизатах и активации iNOS и ЦОГ-2 различными комбинациями ликопена или Lyc-O-Mato с лютеином и карнозной кислотой

Введение

Экспрессию воспалительных цитокинов, а также экспрессию белков-ферментов можно регулировать посредством активации транскрипционного фактора ядерного фактора κB (NFκB), который выполняет ключевую роль в некоторых аспектах патогенеза хронических воспалительных заболеваний. NFκB активируется вследствие фосфорилирования, убиквитинилирования и последующего протеолитического расщепления белка IκB через активацию киназы IκB (IKK). Высвобожденный NFκB перемещается в ядра и связывается с мотивами в промоторах провоспалительных генов, таких как индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS), и циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) TNF-α и IL-1β, что ведет к индукции экспрессии их мРНК. Показано, что большинство противовоспалительных лекарственных средств подавляют экспрессию этих генов посредством ингибирования пути активации NFκB. Таким образом, ингибитор NFκB можно использовать в качестве потенциального терапевтического лекарственного средства в клинических применениях для регулирования связанных с воспалением заболеваний человека.

p65 NFκB RelA можно фосфорилировать с помощью PKA по Ser-276 или с помощью чувствительного к окислению-восстановлению механизма по Ser-536. Показано, что реакционноспособные соединения кислорода (ROS) играют важную роль в активации NFκB и экспрессии воспалительных генов.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы изучить, могут ли низкие концентрации комбинаций ликопена/Lyc-O-Mato + лютеина + карнозной кислоты вызывать синергическое ингибирование активации NFκB.

Активацию NFκB анализировали по его двум фосфорилированным формам: PKA-зависимая Ser-276 и чувствительная к окислению-восстановлению Ser-536.

Способы

Выделение макрофагов. Перитонеальные макрофаги выделяли и обрабатывали, как описано выше в настоящем документе в примере 1.

Для определения активации NFκB клетки обрабатывали липополисахаридом в течение 10 мин.

Получение ядерного белкового экстракта. 2×10⁶ клеток суспендировали в 600 мкл ледяного буфера для лизиса NP-40 (0,1% NP-40, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 10 мкг/мл лейпептина, 10 мкг/мл апротонина и 1 мМ PMSF). Клетки энергично перемешивали в течение 15 с, держали на льду в течение 5 мин и центрифугировали на скорости 300 об в течение 10 мин при температуре 4°C. Затем полученные осадки (содержащие ядра фракции) немедленно растворяли в буфере для электрофореза образца. Целостность ядер подтверждали непосредственно световой микроскопией, которая также выявила, что редко наблюдались интактные клетки в содержащей ядра фракции (<2%).

Цельноклеточные лизаты получали, используя 1% Triton X-100, 50 мМ HEPES (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 10% глицерин, 25 мМ NaF, 10 мкМ ZnCl₂, 1 мМ PMSF и 100 мкМ лейпептин.

Иммуноблот-анализ. Белки лизата (35-50 мкг) разделяли электрофорезом на 7,5% полиакриламидных SDS гелях. Разрешенные белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозу, которую окрашивали Понсе красным для определения полос белков и затем блокировали в 5% молоке в TBS (10 мМ Tris, 135 мМ NaCl, pH 7,4). Определение иммуноблоттинга осуществляли, как описано выше (17), с использованием первичных антител p-P65, ЦОГ-2 и iNOS (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) для инкубации в течение ночи при температуре 4°C и вторичного антитела, противокроличьего или противомышиного конъюгированного с пероксидазой антитела козы (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom), в течение 1 часа при комнатной температуре и определяли, используя систему определения усиленной хемилюминесценции (ECL) (Amersham Biosciences).

Для определения иммуноблоттинга P-65 ядерные фракции 2×10⁶ клеток незамедлительно растворяли в буфере для электрофореза образца и обрабатывали для разделения в 8% SDS электрофорезе в полиакриламидном геле (SDS-PAGE).

Результаты

Как показано на фиг. 10, в представительном иммуноблот-анализе добавление комбинации 1 мкМ ликопена или 1 мкМ Lyc-O-Mato с 1 мкМ лютеина и 2 мкМ карнозной кислоты к перитонеальным макрофагам на 1 ч перед добавлением ЛПС на 10 мин вызывало значимое синергическое ингибирование (приблизительно 80%) фосфорилирования p65-NFκB по серину 536 в клеточных ядерных лизатах, тогда как каждое питательное вещество по отдельности не оказывало действия вовсе. Интенсивность каждой полосы фосфорилированного p-65-NFκB делили на интенсивность каждой полосы ламина после количественного определения посредством денситометрии и выражали в произвольных единицах. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего трех независимых экспериментов.

Как показано в иммуноблоте, фосфорилирование p65 NFκB по серину 276 отсутствовало.

Эти результаты демонстрируют, что тестируемая композиция каротиноида-полифенола вызывает значимое синергическое ингибирование активации NFκB, опосредованной фосфорилированием Ser-536, которое опосредовано чувствительным к окислению-восстановлению механизмом.

В аналогичных условиях добавление комбинаций питательных веществ (в концентрациях, подробно указанных выше) за 1 ч до добавления ЛПС на 24 ч вызывало значимое ингибирование экспрессии белков iNOS и ЦОГ-2 в цельноклеточных лизатах (фиг. 11). Каждое питательное вещество по отдельности не вызывало ингибирования индукции ни iNOS, ни ЦОГ-2.

Интенсивность каждой белковой полосы (iNOS или ЦОГ-2) делили на активность каждой полосы β-актина после количественного определения посредством денситометрии и выражали в произвольных единицах. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего трех независимых экспериментов.

Эти результаты демонстрируют синергическое ингибирование индукции обоих воспалительных ферментов на уровне приблизительно 80% и приблизительно 60% для iNOS и ЦОГ-2 соответственно и обеспечивают поддержку для ингибирования как образования NO, так и высвобождения PGE₂, о которых сообщалось выше в настоящем документе, а также молекулярное объяснение для этого.

Несмотря на то, что конкретные варианты осуществления изобретения описаны для иллюстративной цели, понятно, что специалисты могут осуществить изобретение на практике со многими модификациями, изменениями и адаптациями, не отступая от его сущности или не превышая объем формулы изобретения.

1. Терапевтическая противовоспалительная композиция, которая содержит один или несколько полифенолов и два или более каротиноидов, которые выбирают из группы, состоящей из лютеина, ликопена и β-каротина, где полифенолы выбирают из группы, состоящей из карнозной кислоты, кверцетина, резвератрола и галловой кислоты, и
где суточное количество каждого из активных агентов находится в диапазоне 1-5 мг.

2. Терапевтическая композиция по п. 1, где полифенолом является карнозная кислота.

3. Терапевтическая композиция по п. 1, где полифенолом является кверцетин.

4. Терапевтическая композиция по п. 1, где полифенолом является резвератрол.

5. Терапевтическая композиция по п. 1, где полифенолом является галловая кислота.

6. Терапевтическая композиция по п. 1, которая по существу состоит из ликопена, лютеина и карнозной кислоты.

7. Терапевтическая композиция по п. 1, которая по существу состоит из лютеина, β-каротина и карнозной кислоты.

8. Терапевтическая композиция по п. 1, которая по существу состоит из ликопена, β-каротина и карнозной кислоты.

9. Терапевтическая композиция по любому из пп. 6-8, где указанная композиция дополнительно содержит фитоен.

10. Терапевтическая композиция по любому из пп. 6-8, где указанная композиция дополнительно содержит фитофлуен.

11. Терапевтическая композиция по любому из пп. 6-8, где указанная композиция дополнительно содержит фитоен и фитофлуен.

12. Способ ингибирования или снижения образования супероксид-ионов, NO, TNF-α и/или PGE₂ у субъекта-млекопитающего, который содержит введение указанному субъекту терапевтической композиции по любому из пп. 1-11.

13. Способ лечения патологических состояний, в которых супероксид-ионы, NO, TNF-α и/или PGE₂ выполняют функцию модулятора или медиатора указанного состояния, у субъекта-млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, где указанный способ включает в себя введение указанному субъекту терапевтической композиции по любому из пп. 1-11.

14. Способ лечения по п. 13, где состоянием, подлежащим лечению, является воспалительное состояние.

15. Способ лечения по п. 13, где состояние, подлежащее лечению, выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, синдрома расстройства дыхания взрослых (СРДВ), астмы, ринита, идиопатического фиброза легких, перитонита, сердечно-сосудистого воспаления, ишемии миокарда, нарушения реперфузии, атеросклероза, сепсиса, травмы, диабета 2-го типа, ретинопатии, псориаза, желудочно-кишечного воспаления, цирроза, перитонита и воспалительного заболевания кишечника и нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера.

16. Способ по любому из пп. 12-15, где субъектом-млекопитающим является человеческий субъект.

17. Способ по любому из пп. 12-15, где терапевтическую композицию вводят в фармацевтической лекарственной форме.

18. Способ по любому из пп. 12-15, где терапевтическую композицию включают в продукт питания или напиток.

19. Применение комбинации одного или нескольких полифенолов и двух или более каротиноидов, которые выбирают из группы, состоящей из лютеина, ликопена и β-каротина, в производстве лекарственного средства для лечения состояний, чувствительных к ингибированию образования супероксид-ионов, NO, TNF-α и/или PGE₂, где полифенолы выбирают из группы, состоящей из карнозной кислоты, кверцетина, резвератрола и галловой кислоты, и где суточное количество каждого из активных агентов находится в диапазоне 1-5 мг.

20. Применение по п. 19, где полифенолом является карнозная кислота.

21. Применение по п. 19, где полифенолом является кверцетин.

22. Применение по п. 19, где полифенолом является резвератрол.

23. Применение по п. 19, где полифенолом является галловая кислота.

24. Применение по п. 19, где состоянием является воспалительное состояние.

25. Применение по п. 19, где состояние, подлежащее лечению, выбирают из группы, состоящей из ревматоидного артрита, синдрома расстройства дыхания взрослых (СРДВ), астмы, ринита, идиопатического фиброза легких, перитонита, сердечно-сосудистого воспаления, ишемии миокарда, нарушения реперфузии, атеросклероза, сепсиса, травмы, диабета 2-го типа, ретинопатии, псориаза, желудочно-кишечного воспаления, цирроза, перитонита и воспалительного заболевания кишечника и нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера.

26. Применение по п. 19, где карнозную кислоту используют в сочетании с ликопеном и лютеином.

27. Применение по п. 19, где карнозную кислоту используют в сочетании с ликопеном и β-каротином.

28. Применение по п. 19, где карнозную кислоту используют в сочетании с лютеином и β-каротином.