Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота

Авторы патента:

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

Владельцы патента RU 2564437:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных" (ФГБНУ ВНИИБТЖ) (RU)

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для оценки повышенной чувствительности крупного рогатого скота к лейкозной инфекции. Способ включает выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см³), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96 луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (БЦЖ) в оптимальном разведении в забуференном физиологическом растворе или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест), затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия, перемешивают, инкубируют 20 минут при температуре 37°С, центрифугируют при 500 g 10 минут. Затем отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта. Раствор центрифугируют 5 минут при 500 g, отделяют надосадочную жидкость. В клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора. Центрифугируют 5 минут при 500 g. Добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°С 20 минут, добавляют по 70 мкл 2 М раствора КОН, тщательно перемешивают. Результаты реакции фиксируют с помощью иммунохимического анализатора и выражают в условных единицах оптической плотности. После учета реакции определяют коэффициент стимуляции, при этом при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Результаты реакции определяют по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм. Коэффициент стимуляции (КС) определяется отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню. При КС ≤0,95 животное считают с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота. Заявленный способ позволяет быстро и достоверно проводить оценку чувствительности к инфекции ВЛКРС и дает возможность диагностировать развитие инфекционно-воспалительных процессов у больных лейкозом животных. 4 табл., 3 пр.

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторным методам исследований, и может быть использовано для выявления у крупного рогатого скота предрасположенности к лейкозу путем исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов.

Среди хронических инфекционных болезней сельскохозяйственных животных в последние годы удельный вес лейкоза крупного рогатого скота возрос до 60-63%.

Современная система борьбы с лейкозом базируется на выявлении и удалении из стада больных и инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Однако выявить инфицированных животных в инкубационной стадии не удается из-за уровня антител ниже пороговой чувствительности серологических реакций. Поэтому выявление повышенной чувствительности у крупного рогатого скота к инфекции ВЛКРС на основе методов оценки состояния иммунной системы является одним из важных элементов превентивных мер по управлению эпизоотическим процессом.

Среди интегральных показателей иммунобиологической защиты наиболее адекватным параметром является фагоцитарная активность нейтрофилов крови. Системой фагоцитоза фиксируются многочисленные изменения внутренней среды организма. Особенно показательны в этом отношении нейтрофилы. Обмениваясь в циркуляции каждые 4-5 часов, они как бы фотографируют сдвиги, происходящие в этот период, являясь зеркалом гомеостаза.

О функциональном состоянии ключевой клетки системы антимикробной резистентности организма, реагирующей на любые изменения гомеостаза, позволяет судить исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов. Одним из основных и наиболее объективных методов исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов является тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), который основан на способности гранулоцитов фагоцитировать бесцветный краситель тетразолиевого ряда - НСТ и затем восстанавливать его в нерастворимый формазан темно-синего цвета с помощью НАД Н- и НАДФ Н-оксидаз.

НСТ-тест ставят в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (с антигеном). Спонтанный НСТ-тест отражает степень функционального раздражения нейтрофилов in vivo, являясь своеобразным зеркалом гомеостаза. Индуцированный НСТ-тест характеризует потенциальную способность нейтрофилов ответить «респираторным взрывом» на адекватное раздражение. Отношение показателей индуцированного НСТ к спонтанному тесту рассматривают как биохимический критерий готовности нейтрофила к завершенному фагоцитозу (полному уничтожению объекта) и называют функциональным резервом (Я.А. Юцковская, Е.В. Маркелова и др. / Патент РФ №2216739, кл. G01N 33/52).

Известен способ определения функциональной активности нейтрофилов по реакции восстановления нитросинего тетразолия (патент РФ №2415423, кл. G01N 33/48), который основан на микроскопическом подсчете в камере Горяева нейтрофильных гранулоцитов, содержащих в цитоплазме диформазан. Недостатками данного способа являются отсутствие количественной регистрации кислородных радикалов, генерированных пулом нейтрофилов, и субъективность учета результатов реакции.

Перспективным в этом плане является исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов с помощью теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), основанного на оптическом измерении экстрагированного диформазана, позволяющего вести автоматизированный учет реакции и, соответственно, объективнее оценить функциональную активность клеток.

Наиболее близким техническим решением к заявленному является методика определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия [B.C. Власенко, М.А. Бажин, Т.С. Дудоладова и др. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе: методические рекомендации / ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии. - Омск, 2010]. Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота включает выделение нейтрофильных гранулоцитов центрифугированием на градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см³), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР) или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (ППД-туберкулина, БЦЖ) в оптимальном разведении в ЗФР или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест). Затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия и осторожно перемешивают содержимое лунок, после чего планшеты с ингредиентами инкубируют 20 минут при температуре 37°C. После инкубации планшет с пробами центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g. Отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора и центрифугируют 5 минут при 500 g. Для растворения образовавшегося диформазана добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°C 20 минут. Для визуализации реакции после инкубации в лунки добавляют по 70 мкл 2 М раствора KOH, тщательно перемешивают. Результаты реакции фиксируют на иммуно-химическом анализатора при длине волны 630 нм и выражают в условных единицах оптической плотности. После учета реакции определяют коэффициент стимуляции (К ст. НСТ) по формуле: отношение оптической плотности в стимулированных лунках к оптической плотности в контрольных лунках.

Этот метод позволяет объективно оценивать различные состояния иммунной системы, в том числе выявлять иммунную недостаточность, вызванную вирусом лейкоза, но только в комплексе с другими иммунологическими параметрами после обработки полученных данных с помощью дискретно-динамического анализа. Отдельно взятый метод не позволяет достаточно эффективно выявить животных с предрасположенностью к лейкозу.

Техническим результатом заявленного способа является повышение точности и достоверности при выявлении животных с повышенной чувствительностью к инфекции ВЛКРС.

Технический результат достигается тем, что способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота включает выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см³), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, в одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР) или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (БЦЖ) в оптимальном разведении в ЗФР или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест), затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия, перемешивают, инкубируют 20 минут при температуре 37°C, центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g, отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора, центрифугируют 5 минут при 500 g, добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°C 20 минут, добавляют по 70 мкл 2 М раствора KOH, тщательно перемешивают, результаты реакции фиксируют с помощью иммунохимического анализатора и выражают в условных единицах оптической плотности, после учета реакции определяют коэффициент стимуляции, при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, результаты реакции определяют по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм, коэффициент стимуляции (КС) определяется отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню, при КС≤0,95 животное считают с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота.

Отличительными признаками предложенного способа являются: при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола, а учет результатов реакции регистрируется по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм. Использование двухволнового метода измерения рекомендуется для уменьшения ошибок, вызванных присутствием в растворе посторонних окрашенных веществ или его мутностью [М.А. Годков, В.Ю. Зинкин / Патент РФ №2218567, кл. G01N 33/52 от 10.12.2003].

Левамизол - левовращающий оптический изомер тетрамизола, оказывающий влияние на механизмы иммунологической защиты организма. Основное его действие проявляется в усилении активности фагоцитов и Т-лимфоцитов в иммунологически дефектном организме, но не у здоровых [Последние достижения в клинической иммунологии / Под ред. Р.А. Томпсона. - М.: Медицина, 1983. - С.465-472].

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве отбирают кровь от 5 коров, которых по результатам диагностических исследований признают носителями ВЛКРС (РИД-позитивные). Проводят исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по предлагаемому способу для изучения влияния различных концентраций левамизола (0,01; 0,1; 0,5; 5 и 50 мкг/мл) на оптическую плотность раствора диформазана при определении уровня индуцированной вакциной БЦЖ активности. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние различных концентрации левамизола на оптическую плотность раствора диформазана при определении уровня индуцированной активности, у.е. оп. пл.
Символы статистики	левамизол, мкг/мл
0,01	0,1	0,5	5,0	50,0
М m±	221,0	271,0	296,60	293,60	246,0
12,23	14,15	16,17	13,83	14,8

Из таблицы 1 видно, что линейное увеличение плотности наблюдается при увеличении концентрации левамизола от 0,01 до 0,5 мкг/мл. Дальнейший подъем концентрации левамизола приводил к нелинейному изменению оптической плотности и даже ее уменьшению. Таким образом, для оценки восстановительно-окислительного метаболизма нейтрофилов у инфицированных ВЛКРС животных предпочтительно использовать левамизол в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Пример 2. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве исследуют 15 коров, которых по результатам диагностических исследований делят на 2 группы: 1-я группа - 5 здоровых (не реагирующих в РИД) коров и 2 группа - 10 животных вирусоносителей (РИД-положительные). Проводят исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известной методике и по предлагаемому способу с добавлением левамизола при определении уровня индуцированной активности.

С этой целью выделяют нейтрофильные гранулоциты из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/см³, затем в три параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл клеточной взвеси. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл, на пример физиологического раствора, (спонтанный НСТ-тест), в другую - 50 мкл предварительно растворенную, на пример, в физиологическом растворе (1000 мкг/мл) вакцину БЦЖ и 50 мкл левамизола в конечной концентрации, не превышающей 0,5 мкг/мл (индуцированный вариант по предлагаемому способу), а в третью - вакцину БЦЖ в физиологическом растворе (1000 мкг/мл) (индуцированный вариант по известному способу).

Затем в лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15%-ного раствора нитросинего тетразолия и осторожно перемешивают. После внесения всех ингредиентов планшет с пробами инкубируют 20 минут при 37°C. Затем для остановки реакции и осаждения клеток, содержащих диформазан, планшет центрифугируют при 500 g 10 минут (например, на центрифуге LU-418, приспособленной для центрифугирования планшетов). Для фиксации осажденных клеток и последующего отмывания фиксированных клеток сначала отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и центрифугируют раствор 5 минут при 500 g и затем добавляют 200 мкл физиологического раствора и вновь центрифугируют в том же режиме. Для растворения образовавшегося диформазана добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют в его присутствии при 60°C 20 минут. Для визуализации реакции после инкубации в лунки добавляют по 70 мкл 2 М раствора КОН и тщательным перемешиванием добиваются равномерного окрашивания раствора, результаты реакции регистрируют на иммунохимическом анализаторе по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм и выражают в условных единицах оптической плотности. Затем определяют коэффициент стимуляции как отношение индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню.

В таблице 2 представлены результаты постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известной методике (одно- и двухволновым методом) и по предлагаемому способу с добавлением левамизола при определении уровня индуцированной активности.

Из таблицы 2 видно, что у носителей ВЛКРС происходит усиление функциональной активности нейтрофилов в спонтанном и особенно в индуцированном варианте при постановке НСТ известным способом (259,12±9,59, 208,4±12,33 у.е. оп. пл.; Р<0,01).

Таблица 2
Результаты оценки функциональной активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием у РИД-отридательных и инфицированных ВЛКРС животных, проведенном по известному и предлагаемому способу, М±m
Группа животных	вариант постановки НСТ
	спонтанный	Индуцированный
	известный способ	предлагаемый способ
у.е. оп. пл.	у.е. оп. пл.	КС	у.е. оп. пл.	КС
РИД-отрицательные	207,6±32,66	208,4±12,33	1,11±0,12	209,2±20,9	1,28±0,22
986,8±39,5*	1024±45,51*	1,04±0,04*
Носители ВЛКРС	268,33±9,84	259,12±9,59	1,0±0,04	236,37±9,07	0,77±0,06
882,75±44,0*	1017±38,08*	1,16±0,05*
Достоверность, Р	>0,05	<0,01	>0,05	>0,05	<0,05
>0,05*	>0,05*	>0,05*
* результаты постановки НСТ известным способом с использованием одноволнового метода (630 нм)

Несколько иная картина наблюдается при постановке НСТ известным способом с использованием длины волны 630 нм. Отмечено недостоверное снижение показателей в спонтанном варианте (882,75±44,0, 986,8±39,5 у.е. оп. пл.; Р>0,05) при отсутствии выраженных изменений при стимуляции БЦЖ.

При постановке предлагаемым способом у инфицированных животных также установлено увеличение количества активированных нейтрофилов, однако не достигало достоверной разницы (236,37±9,07, 209,2±20,09 у.е. оп. пл.; Р>0,05).

Следует отметить, что важным показателем НСТ-теста явилось не столько его повышение в спонтанном и индуцированных вариантах, сколько соотношение между стимулированным и спонтанным, т.е. коэффициент стимуляции (КС). Так, у носителей ВЛКРС при постановке НСТ известным способом при использовании как одно-, так и двухволнового метода этот показатель изменялся незначительно, тогда как при постановке предлагаемым способом с высокой степенью достоверности уменьшался (0,77±0,07, 1,11±0,12; Р<0,05).

Таким образом, исходно низкий показатель стимулированной реакции по отношению к спонтанной у животных, инфицированных ВЛКРС, при постановке предлагаемым методом, свидетельствует о снижении резистентности организма и низкой микробицидной активности нейтрофилов и, как следствие, высокой чувствительности к инфекции ВЛКРС.

Пример 3. Проводят исследование крови у 20 коров из благополучного по лейкозу хозяйства и у 20 из неблагополучного по лейкозу хозяйства путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известному способу и по предлагаемому способу. Вычисляют коэффициент стимуляции, по результатам которого животных делят на 3 группы. В 1-ю группу включают коров с низкими значениями коэффициента (КС≤0,95); во 2-ю - с КС от 0,96 до 1,10 и 3-ю - с высокими (КС≥1,11).

Полученные данные были сопоставлены с результатами диагностических исследований на лейкоз (табл.3, 4). С этой целью ставили реакцию иммунодиффузии (РИД), основанную на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Животных, сыворотка крови которых дали положительный результат в РИД, признавали зараженными вирусом лейкоза и исследовали гематологическим методом, заключающимся в подсчете лейкоцитов в единице объема крови. При обнаружении повышенного их количества выводили лейкоцитарную формулу и оценивали статус животного по лейкозу согласно «лейкозному ключу» как здорового, подозрительного по заболеванию лейкозом или больного лейкозом [Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота / Департамент ветеринарии, Минсельхоз России. - 2000. - №13-7-2/2130].

При исследовании сыворотки крови в РИД от коров из благополучного хозяйства носителей ВЛКРС не было выявлено.

Таблица 3
Значения коэффициента стимуляции у животных из благополучного хозяйства (n=20)
Группа животных	РИД (-)	% от общего числа
известный способ
1-я группа (КС≤0,95)	10	50
2-я группа (от 0,96 до 1,10)	4	20
3-я группа (КС≥1,11)	6	30
предлагаемый способ
1-я группа (КС≤0,95)	2	10
2-я группа (от 0,96 до 1,10)	-
3-я группа (КС≥1,11)	18	90

Из таблицы 3 видно, что у 90% животных из благополучного по лейкозу хозяйства при постановке НСТ-теста предлагаемым способом отмечена высокая микробицидная активность нейтрофилов (КС составил 1,11 и выше), тогда как при проведении НСТ-теста известным способом было установлено только 30% таких коров.

В неблагополучном хозяйстве при постановке известным способом (табл. 4) снижение коэффициента стимуляции ниже отметки 0,95 было отмечено у 12 из 20 животных (60%). При этом 8 животных являлись носителями ВЛКРС, а остальные 4 были РИД-отрицательными. В то же время при постановке предлагаемым способом со сниженным коэффициентом выявлено на 15% коров больше (75%), из них подавляющая часть была инфицирована ВЛКРС (11 из 15 голов), и только 4 животных были РИД-отрицательными.

Следует отметить, что среди 3-х животных с высоким значением коэффициента при постановке НСТ предлагаемым способом только у одного были обнаружены специфические антитела к антигенам ВЛКРС, при этом КС был резко повышен и составил 10,13. Дополнительным исследованием это животное было признано больным в гематологической стадии. Резкое повышение НСТ-положительных нейтрофилов и, как следствие, коэффициента стимуляции у больного лейкозом связано с развитием инфекционно-воспалительного осложнения. Об этом также могут свидетельствовать данные научной литературы [Тест восстановления нитросинего тетразолия у здоровых людей и больных острым лейкозом / В.Е. Логинский, В.В. Короткий // Лаб. дело. - 1978. - №1. - С.3-5].

Таблица 4
Значения коэффициента стимуляции у животных из неблагополучного хозяйства (п=20)
Группа животных	РИД (-)	Носители ВЛКРС	Итого (%)
всего	в т.ч. гембольные
известный способ
1-я группа (КС≤0,95)	4	8	-	12(60%)
2-я группа (от 0,96 до 1,10)	1	2	-	3(15%)
3-я группа (КС≥1,11)	2	3	1	5(25%)
предлагаемый способ
1-я группа (КС≤0,95)	4	11	-	15(75%)
2-я группа (от 0,96 до 1,10)	-	1	-	1(5%)
3-я группа (КС≥1,11)	3	1	1	4(20%)

Менее точные результаты получены при проведении НСТ известным способом. Так, с высокой активностью нейтрофилов (КС≥1,11) было установлено 5 коров, из них носителями ВЛКРС являлись 3, в том числе гембольная (КС=16,7), как и в случае постановки реакции предлагаемым способом.

Таким образом, результаты оценки окислительно-восстановительного метаболизма нейтрофилов в НСТ-тесте у коров из благополучного и неблагополучного по лейкозу крупного рогатого скота позволяют прийти к выводу о том, что высокая чувствительность к инфекции ВЛКРС отмечается при значениях КС≤0,95. При этом предлагаемый способ позволяет более точно и достоверно проводить оценку чувствительности к инфекции ВЛКРС и дает возможность диагностировать развитие инфекционно-воспалительных процессов у больных лейкозом животных.

Способ оценки повышенной чувствительности крупного рогатого скота к лейкозной инфекции, включающий выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см³), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, в одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (БЦЖ) в оптимальном разведении в забуференном физиологическом растворе или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест), затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия, перемешивают, инкубируют 20 минут при температуре 37°С, центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g, отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора, центрифугируют 5 минут при 500 g, добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°С 20 минут, добавляют по 70 мкл 2 М раствора КОН, тщательно перемешивают, результаты реакции фиксируют с помощью иммунохимического анализатора и выражают в условных единицах оптической плотности, после учета реакции определяют коэффициент стимуляции, при этом при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, результаты реакции определяют по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм, коэффициент стимуляции (КС) определяется отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню, при КС ≤0,95 животное считают с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения адаптационной способности пациента с новообразованиями челюстно-лицевой области к съемным пластиночным конструкциям ортопедических протезов.

Вероятность повреждения здоровых тканей, адаптированная с учетом маркеров // 2564077

Группа изобретений относится к медицине, онкологии и касается формирования плана индивидуальной терапии пациента. Способ включает формирование исходного плана терапии с помощью вероятностной модели осложнения здоровой ткани (NTCP) и вероятностной модели подавления опухоли (TCP) целевой области.

Способ лечения больных риносинуситом // 2564006

Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано для лечения больных риносинуситом с болевым симптомом. Для этого в сыворотке крови больного до начала лечения определяют уровень субстанции Р.

Способ качественного определения адаптационной способности к съемным пластиночным конструкциям ортопедических протезов по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента с новообразованиями челюстно-лицевой области // 2563982

Способ ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы // 2563981

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы. Для этого проводят измерение и оценку внутриглазного давления, исследование полей зрения и слезной жидкости с последующим определением уровня провоспалительных и противоспалительных цитокинов с дополнительным определением их уровня в сыворотке крови.

Способ диагностики муковисцидоза // 2563835

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и описывает способ диагностики муковисцидоза. Способ характеризуется тем, что определяют концентрации Na, В и Pb в пробоподготовленных волосах детей раннего возраста методами атомной эмиссионной спектрометрии с индукционно связанной аргоновой плазмой и/или масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой, при этом у больных муковисцидозом относительно контрольной группы увеличивается содержание Na и В соответственно в 8,5; 3,3 раза и уменьшается содержание Pb в 1,3 раза.

Способ снижения токсического действия энрофлоксацина на клеточный иммунитет с применением гомеопатических препаратов in vitro // 2563810

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для снижения токсического эффекта энрофлоксацина на опсонофагоцитарную активность нейтрофилов с применением гомеопатических препаратов in vitro.

Способ иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологических тканей (варианты) // 2563679

Группа изобретений относится к области экспериментальной биологии и медицины для приготовления тотальных препаратов биологических тканей для оптической проекционной томографии, конфокальной, мультифотонной и светоплоскостной микроскопии и может быть использована для предклинических испытаний фармакологических препаратов и оценки физиологических воздействий на организм, а также для работы с материалом биопсий в диагностических и исследовательских целях.

Способ прогнозирования достижения полных морфологических регрессий у больных трипл-негативным раком молочной железы, получавших курсы химиотерпии по схеме сах // 2563180

Изобретение относится к области медицины и касается способов прогнозирования достижения ПМР у больных ТНР молочной железы. Проводят иммунногистохимическое исследование ткани опухоли.

Кинетический способ определения антиоксидантной активности биоматериала // 2563177

Изобретение относится к медицине, биологии, фармации и пищевой технологии применительно к исследованию гомолитических свойств липидов и их участия в свободнорадикальных реакциях окисления, а также - к осуществлению подбора антиоксидантов.

Способ изготовления образцов биологических тканей в комплексе с имплантированными элементами для исследования световой микроскопией // 2564895

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для изготовления гистологических образцов биологических тканей с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций для изучения с помощью световой микроскопии. Способ заключается в том, что биологический образец последовательно обрабатывают раствором фиксаторов, отмывают, обезвоживают, пропитывают раствором прозрачной смолы для холодной заливки в течение 6-24 часов, погружают в чистую смолу на 12-24 часа и окрашивают красителями на глубину 1-2 мкм. При этом микроскопию последующих слоев выполняют после шлифовки, полировки и повторного окрашивания поверхности образца. Изобретение позволяет проводить послойное исследование образцов без повреждения клеточных компонентов и изменения архитектуры ткани в зоне контакта с инородным телом. 1 ил., 1 пр.

Системы и способы измерений аналита с высокой точностью // 2564923

Изобретение относится к медицине и описывает способы для определения концентрации аналита в пробе, приборы и системы, используемые в связи с ними. В одном из вариантов осуществления изобретения способ включает обнаружение содержащей аналит пробы, введенной в электрохимический сенсор, содержащий два электрода в разнесенной конфигурации; реагирование аналита с вызыванием физического превращения аналита между двумя электродами; измерение выходов тока на дискретных интервалах для выведения времени заполнения сенсора пробой и емкости сенсора с пробой; определение первого значения концентрации аналита по выходам тока; расчет второго значения концентрации аналита по выходам тока и первому значению концентрации аналита; корректировку второго значения концентрации аналита на влияния температуры для обеспечения третьего значения концентрации аналита; корректировку третьего значения концентрации аналита как функции времени заполнения сенсора для обеспечения четвертого значения концентрации аналита; и корректировку четвертого значения концентрации аналита как функции емкости для обеспечения конечного значения концентрации аналита. Изобретение обеспечивает более точное определение концентрации аналита в пробе. 7 н. и 66 з.п. ф-лы, 21 ил., 6 пр., 4 табл.

Способ диагностики функциональной задержки полового развития у мальчиков-подростков // 2564925

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики функциональной задержки полового развития у мальчиков-подростков. Сущность способа состоит в том, что предварительно у ребенка определяют росто-весовой индекс (РВИ), если его значение менее 340 отн.ед., дополнительно атомно-абсорбционным методом определяют в суточной моче концентрации цинка, селена, свинца и вычисляют соотношения концентраций пар свинец/цинк, свинец/селен. Если индекс соотношения превышает не менее чем в 2 раза установленные нормативы, то диагностируют у данного мальчика-подростка задержку полового развития полимикроэлементозного генеза. У мальчиков с росто-весовым индексом более 400 отн.ед. определяют концентрацию хрома в моче и если его уровень не менее чем в 2 раза ниже установленного норматива, диагностируют задержку полового развития мономикроэлементозной этиологии. Использование заявленного способа позволяет повысить точность и достоверность диагностики функциональной задержки полового развития у мальчиков-подростков с ранним его выявлением. 2 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования органоспецифической аутоиммунизации при воспалительных заболеваниях глаз // 2564929

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования органоспецифической аутоиммунизации при воспалительных заболеваниях глаз. Во влаге передней камеры глаза определяют концентрацию трансформирующего ростового фактора бета1 (TGFβ1). При ее уровне менее 1000 пг/мл прогнозируют органоспецифическую аутоиммунизацию. Использование изобретения обеспечивает раннее выявление аутоиммунного компонента или процесса при воспалительных заболеваниях глаз с повышением точности диагностики и выбора адекватной тактики лечения. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования эффективности комбинированной терапии хронического гепатита с у детей // 2564933

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования эффективности комбинированной терапии ХГС у детей, включающий исследование абсолютного количества нейтрофилов крови, отличающийся тем, что до начала терапии определяют исходный уровень абсолютного количества нейтрофилов, при этом уровень 2000-3400/мкл считают положительным предиктором получения первичной вирусологической ремиссии, а уровень, превышающий 3500/мкл, расценивают как отрицательный предиктор получения ремиссии; в динамике через 12 и 24 недели от начала комбинированной терапии определяют уровень абсолютного количества нейтрофилов, и при уровне нейтрофилов ≤1400/мкл делают вывод о положительном прогнозе эффективности терапии, а при уровне абсолютного числа нейтрофилов ≥2500/мкл достижение первичной вирусологической ремиссии маловероятно. Использование изобретения позволяет прогнозировать эффективность комбинированной терапии ХГС пегилированным IFNα-2b и рибавирином у детей и дает возможность избежать длительного нерационального лечения, предотвратить развитие осложнений. 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования исхода инфаркта миокарда у больных сахарным диабетом 2 типа старше 45 лет на госпитальном этапе // 2565103

Изобретение относится к медицине, а именно кардиологии. Оценивают обширность поражения миокарда, нарушение сердечной проводимости, признаки хронической сердечной недостаточности, уровень гликемии, мочевины в крови и артериальное систолическое давление при поступлении, и рассчитывают вероятность благоприятного или неблагоприятного прогноза (Р) по формуле. При величине Р≥0,6 прогнозируют благоприятный исход инфаркта миокарда (ИМ), а при Р<0,4 - неблагоприятный исход. Способ позволяет с высокой вероятностью сделать прогноз исхода ИМ у больных сахарным диабетом 2 на госпитальном этапе, является более простым и доступным, так как включает 6 наиболее значимых показателей для пациентов с сахарным диабетом 2 типа. 3 табл., 3 пр.

Способ диагностики нарушений рубцового пищеварения у жвачных // 2565412

Изобретение относится к ветеринарии и предназначено для оценки степени нарушения рубцового пищеварения у жвачных животных. Определяют в содержимом рубца количество веществ, имеющих «средний» (500-5000 D) диапазон молекулярной массы. На клинически здоровое состояние животных указывает уровень содержания средних молекул (ССМ) в рубцовой жидкости, определяемый на волне 237 нм - менее 2,0 усл. ед., на волне 254 нм - менее 1,0 усл. ед., на волне 280 нм - менее 1,0 усл. ед. О наличии патологии рубцового пищеварения свидетельствует увеличение ССМ на волне 237 нм более 2,0 усл. ед., на 254 нм более 1,0 усл. ед. и на 280 нм более 1,0 усл. ед. Способ позволяет выявлять патологию на ранних этапах развития, а у больных - оценивать степень нарушения рубцового пищеварения и эффективность проводимого лечения. 4 табл., 2 пр.

Способ комплексной оценки прогноза течения и эффективности лечения гипертрофии глоточной миндалины и хронического аденоидита у детей по оксидант/антиоксидантной активности кожи // 2565838

Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано при выборе тактики лечения гипертрофии глоточной миндалины и хронического аденоидита. Проводят комплексное обследование больного ребенка: сбор жалоб, фибровидеоэндоскопию носа, носоглотки и гортани, тимпанометрию. Проводят потенциометрическое исследование антиоксидант/окислительной активности кожи (АОА/ОА) на внутренней стороне предплечья пациента. При значении АОА/ОА кожи 2,5-4,0*105 М-экв и больше и при наличии у пациента трех из следующих результатов: наличия улучшения от ранее проведенного консервативного лечения, длительности храпа и сопения во сне до трех месяцев, отсутствия синдрома обструктивного апноэ сна, снижении слуха до трех месяцев, отсутствии рецидивирующих острых средних отитов в последние три месяца в анамнезе, гипертрофии глоточной миндалины II-III степени, тимпанометрии - тип А, В, С, типе тимпанометрии В длительностью до 3 месяцев, пациенту проводят консервативный курс лечения. При значении АОА/ОА кожи менее 2,5-4,0*105 М-экв и при наличии у пациента трех из следующих результатов: неэффективность минимум двух курсов консервативного лечения, длительности храпа и сопения во сне более трех месяцев, наличии синдрома обструктивного апноэ сна, снижении слуха более трех месяцев в анамнезе, либо рецидивирующих острых средних отитах в последние три месяца в анамнезе, гипертрофии глоточной миндалины II-III степени, тимпанометрии - тип В, длительностью более 3 месяцев, пациенту проводят аденотомию. Способ позволяет провести диагностику неинвазивно, быстро, объективно, своевременно начать лечение за счет комплексного обследования пациентов, проведения потенциометрического исследования АОА/ОА кожи. 4 ил., 3 пр.

Способ оценки эффективности лечения острого герпетического стоматита у детей // 2566070

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу оценки эффективности лечения острого герпетического стоматита. Сущность способа состоит в том, что в ротовой жидкости ребенка спектрофотометрически определяют величину содержания меди и кальция и при соотношении величины содержания меди к величине содержания кальция свыше 45 лечение считают эффективным. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность лечения острого герпетического стоматита у детей по биохимическому анализу ротовой жидкости. 5 пр.

Способ подготовки биоматериала для пцр диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (вл крс) // 2566071

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ подготовки биоматериала для ПЦР диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС). Осуществляют взятие образцов крови животного. Для подготовки к ПЦР диагностике используют образцы биоматериала в виде клеточной культуры СС81, культивированной на среде Игла MEM в виде многоядерных клеточных образований - синтициев. В качестве отрицательного контроля используют лейкоциты от животного, отрицательного по ВЛ КРС, а также незараженную культуру. Достигается повышение точности выявления ВЛ КРС с помощью ПЦР за счет особенностей клеточной линии фибробластов легкого кошки СС81 формировать синцитий при наличии в образцах вируса. 2 ил., 1 пр.