Способ производства раствора сахара и устройство для его производства

Изобретение относится к способу получения жидкого сахара и к устройству для осуществления способа. Способ предусматривает стадию (1) добавления целлюлазы, выделенной из нитчатого гриба, принадлежащего роду Trichoderma, к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза, (2)стадию добавления свежей выделенной из нитчатого гриба целлюлазы к гидролизату со стадии (1) для осуществления вторичного гидролиза и стадию (3), на которой гидролизат со стадии (2) подвергают разделению твердого вещества и жидкости, получая жидкий сахар, из которого получают регенерированный фермент, при этом регенерированный фермент, получаемый на стадии (3), используют на стадии (1) следующего и дальнейших процессов получения жидкого сахара, причём способ предусматривает повторение стадий (1)-(3) два или более раза. Устройство для осуществления способа получения жидкого сахара содержит в качестве составляющих резервуар для гидролиза, с которым соединены труба для подачи регенерированного фермента и труба для подачи свежего фермента, устройство для разделения твёрдого вещества и жидкости гидролизата, резервуар для жидкого сахара, имеющий трубу подачи воды, устройство с ультрафильтрационной мембраной. Изобретение направлено на достижение более высокого эффекта уменьшения количества фермента в способе получения жидкого сахара из целлюлозы. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 11 ил., 6 табл., 5 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу получения жидкого сахара из целлюлозы и к устройству для осуществления такого способа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Способы проведения ферментации химических продуктов с использованием сахаров в качестве сырья применяли для получения различных промышленных материалов. В настоящее время в качестве сахаров, используемых в качестве сырья для ферментации, в промышленности используют такие сахара, которые получают из пищевых материалов, таких как сахарный тростник и сахарная свекла. Однако с точки зрения того факта, что ожидается повышение цен на пищевые материалы из-за увеличения населения мира, или с этической точки зрения на основании того факта, что сахара для промышленных материалов могут конкурировать с сахарами для питания, в будущем необходима разработка способа эффективного получения жидкого сахара из возобновляемого непищевого источника, то есть из содержащей целлюлозу биомассы, или способа применения получаемого жидкого сахара в качестве сырья для ферментации, чтобы эффективно превратить жидкий сахар в промышленный материал.

Примеры раскрытых способов получения жидкого сахара из содержащей целлюлозу биомассы включают способы получения жидких сахаров в результате кислотного гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы с использованием концентрированной серной кислоты (патентные документы 1 и 2) и способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают гидролизной обработке, используя разбавленную серную кислоту, и затем подвергают ферментативной обработке целлюлазой или подобным ферментом, чтобы получить жидкий сахар (непатентный документ 1). Кроме того, примеры раскрытых способов без применения кислоты включают способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу гидролизуют, используя воду в субкритическом состоянии примерно при 250°C-500°C, получая жидкий сахар (патентный документ 3), способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают обработке водой в субкритическом состоянии и затем обрабатывают ферментативно, получая жидкий сахар (патентный документ 4), и способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают гидролизной обработке горячей водой под давлением при 240°C-280°C и затем обрабатывают ферментативно, получая жидкий сахар (патентный документ 5).

В последние годы широко исследованы способы гидролиза биомассы, в которых используют меньше энергии и которые дают меньшую нагрузку на окружающую среду, но обеспечивают получение сахара с высоким выходом. Однако такие способы, в которых применяют ферменты, имеют недостаток, который заключается в высокой стоимости ферментов.

Для решения указанных технических проблем предложены способы регенерации и повторного применения ферментов, используемых при гидролизе. Примеры таких раскрытых способов включают способ, в котором осуществляют непрерывное разделение твердого вещества и жидкости с помощью центробежного фильтра и полученный жидкий сахар фильтруют через ультрафильтрационную мембрану, чтобы извлечь ферменты (патентный документ 6), способ, в котором поверхностно-активное вещество подают на стадии ферментативного осахаривания, чтобы уменьшить адсорбцию фермента и таким образом повысить эффективность регенерации (патентный документ 7), способ, в котором остаток, получаемый в результате ферментативного осахаривания, подвергают электрической обработке, чтобы извлечь ферментный компонент (патентный документ 8), и способ, в котором остаток, получаемый в результате ферментативного осахаривания снова загружают в другую партию биомассы и таким образом повторно используют ферменты (патентный документ 9).

ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

[Патентные документы]

Патентный документ 1: переведенная на японский язык выложенная заявка на выдачу патента PCT No. 11-506934

Патентный документ 2: JP 2005-229821 A

Патентный документ 3: JP 2003-212888 A

Патентный документ 4: JP 2001-95597 A

Патентный документ 5: JP 3041380 B

Патентный документ 6: JP 2006-87319 A

Патентный документ 7: JP 63-87994 A

Патентный документ 8: JP 2008-206484 A

Патентный документ 9: JP 55-144885 A

Непатентные документы

Непатентный документ 1: A. Aden et al. "Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover" NREL Technical Report (2002).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Были разработаны способы ферментативного гидролиза целлюлозы, которые описаны выше, но эффекты таких способов были недостаточны с точки зрения уменьшения количества используемого фермента. Поэтому настоящее изобретение нацелено на развитие способа, в котором достигается эффект уменьшения количества фермента более высокий, чем в случае обычных способов.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ

Настоящее изобретение имеет структуру, состоящую из пунктов [1]-[11], указанных ниже.

[1] Способ получения жидкого сахара в результате повторения способа получения жидкого сахара, включающего в себя стадии (1)-(3), указанные ниже:

(1) стадию добавления выделенной из нитчатого гриба целлюлазы к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза;

(2) стадию добавления свежей выделенной из нитчатого гриба целлюлазы к гидролизату со стадии (1) для осуществления вторичного гидролиза; и

(3) стадию, на которой гидролизат со стадии (2) подвергают разделению твердого вещества и жидкости с получением жидкого сахара, из которого получают регенерированный фермент;

при этом регенерированный фермент, получаемый на стадии (3), используют на стадии (1) следующего и дальнейших процессов получения жидкого сахара.

[2] Способ получения жидкого сахара по п. [1], в котором в качестве выделенной из нитчатого гриба целлюлазы на стадии (1) способа получения жидкого сахара используют ферментный компонент, регенерированный из гидролизата целлюлозы, образуемого под действием выделенной из нитчатого гриба целлюлазы.

[3] Способ получения жидкого сахара по п. [1] или [2], в котором выделенная из нитчатого гриба целлюлаза на стадии (1) или (2) содержит компонент, выделенный из культуральной жидкости микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma.

[4] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[3], в котором регенерированный фермент содержит ксиланазу и/или ксилозидазу.

[5] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[4], в котором регенерированный фермент содержит не растворимую в воде целлюлазу, выделенную из нитчатого гриба.

[6] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[5], в котором целлюлоза является подвергаемым обработке продуктом, полученным в результате подвергания содержащей целлюлозу биомассы щелочной обработке, гидротермальной обработке или обработке разбавленной серной кислотой.

[7] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[6], в котором количества фермента, добавляемого при первичном гидролизе и вторичном гидролизе, удовлетворяют следующему соотношению: количество регенерированного фермента, добавляемого на стадии (1) > количества свежего фермента, добавляемого на стадии (2).

[8] Способ получения жидкого сахара по любому из п.п. [1]-[7], в котором регенерацию выделенной из нитчатого гриба целлюлазы на стадии (3) осуществляют фильтрованием жидкого сахара через ультрафильтрационную мембрану и извлечением целлюлазы со стороны подачи.

[9] Устройство для осуществления способа получения жидкого сахара, при этом способ включает в себя стадию гидролиза целлюлозы, и устройство содержит в качестве составляющих: резервуар для гидролиза, с которым соединены труба для подачи регенерированного фермента, и труба для подачи свежего фермента; устройство для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата; резервуар для жидкого сахара, имеющий трубу подачи воды для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для разделения фермента и жидкого сахара.

[10] Устройство для осуществления способа получения жидкого сахара, при этом способ включает в себя стадию гидролиза целлюлозы и устройство содержит в качестве составляющих: устройство смешивания целлюлозы/регенерированного фермента для смешивания регенерированного фермента и целлюлозы для осуществления первичного гидролиза; резервуар для гидролиза, с которым соединены труба для подачи смеси целлюлозы/регенерированного фермента и труба для подачи свежего фермента; устройство для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата; резервуар для жидкого сахара, имеющий трубу подачи воды для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для разделения фермента и жидкого сахара.

[11] Устройство, содержащее в качестве составляющего (составляющих) в дополнение к составляющим устройства, перечисленным в п. [9] или [10], устройство (устройства) с обратноосмотической мембраной и/или нанофильтрационной мембраной для концентрирования жидкого сахара.

ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В способе гидролиза, в котором целлюлазу регенерируют и используют повторно, количество фермента, используемого для гидролиза, может быть значительно уменьшено, и эффективность получения сахара из содержащей целлюлозу биомассы может быть значительно повышена посредством добавления регенерированного фермента перед добавлением свежего фермента для осуществления первичного гидролиза и затем добавления свежего фермента для осуществления вторичного гидролиза.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 является схематичной диаграммой, показывающей методику осуществления способа гидролиза согласно настоящему изобретению.

Фиг. 2 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 3 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 4 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 5 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 6 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 7 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 8 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 9 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 10 является схематичной диаграммой, показывающей устройство, применяемой в настоящем изобретении.

Фиг. 11 является диаграммой, показывающей результат SDS-ПААГ не растворимого в воде целлюлазного компонента, выделенного из Trichoderma.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Большие количества целлюлозы содержатся в травянистой биомассе, такой как багасса, просо прутьевидное, пеннисетум красный, Erianthus, кукурузная солома, рисовая солома и пшеничная солома; и древесной биомассе, такой как деревья и отходы строительных материалов. Такие содержащие целлюлозу биомассы предпочтительно могут быть использованы в качестве сырья в настоящем изобретении.

Содержащая целлюлозу биомасса содержит кроме целлюлозы и гемицеллюлозы (далее называемых «целлюлозой» в качестве общего термина для целлюлозы и гемицеллюлозы), лигнин и тому подобное, которые являются ароматическими макромолекулами. Поэтому в случаях, когда целлюлозу, полученную из биомассы, используют в качестве сырья для жидкого сахара в способе согласно настоящему изобретению для получения жидкого сахара, эффективность ферментативного гидролиза может быть повышена в результате предварительной обработки. Примеры способа предварительной обработки содержащей целлюлозу биомассы включают обработку кислотой, обработку серной кислотой, обработку разбавленной серной кислотой, щелочную обработку, обработку каустической содой, гидротермальную обработку, обработку водой в субкритическом состоянии, обработку тонким измельчением и обработку паром. В настоящем изобретении способом предварительной обработки предпочтительно является щелочная обработка, гидротермальная обработка или обработка разбавленной серной кислотой.

Примеры щелочной обработки включают способы использования щелочи, такой как гидроксид натрия, гидроксид кальция или аммиак, и особенно предпочтительно может быть использован аммиак. Такая обработка аммиаком может быть осуществлена способами, описанными в JP 2008-161125 A и JP 2008-535664 A. Например, аммиак добавляют к биомассе в концентрации в диапазоне от 0,1 до 15% масс., и обработку осуществляют при 4-200°C, предпочтительно 90-150°C. Добавляемый аммиак может быть либо в состоянии жидкости, либо в газовом состоянии. Кроме того, добавляемый аммиак может быть в форме либо чистого аммиака, либо водного раствора аммиака. Количество обработок не ограничено, и может быть осуществлена одна или большее количество обработок. В частности, в тех случаях, когда обработку осуществляют два или большее количество раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующих обработок. Обработанный продукт, получаемый при обработке аммиаком, необходимо подвергать нейтрализации аммиак или необходимо удалять аммиак, чтобы далее осуществить реакцию ферментативного гидролиза. Нейтрализацию аммиака можно осуществить либо после удаления твердых веществ из гидролизата в результате разделения твердого вещества и жидкости, либо в состоянии, когда содержатся твердые вещества. Кислый реагент, используемый для нейтрализации, не ограничен. Аммиак можно удалить, выдерживая обработанный аммиаком продукт при пониженном давлении, чтобы обеспечить возможность для испарения аммиака и его перехода в состояние газа. Удаленный аммиак может быть регенерирован и использован повторно.

В случае гидротермальной обработки добавляют воду так, чтобы концентрация содержащей целлюлозу биомассы составляла от 0,1 до 50% масс., и полученную смесь обрабатывают при температуре от 100 до 400°C в течение периода времени от 1 секунды до 60 минут. При обработке в таких температурных условиях происходит гидролиз целлюлозы. Количество обработок не ограничено, и обработку можно осуществлять один или несколько раз. В частности, в случае, когда обработку осуществляют два или более раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующих обработок.

В случае обработки разбавленной серной кислотой концентрация серной кислоты предпочтительно составляет от 0,1 до 15% масс., более предпочтительно от 0,5 до 5% масс. Температура реакции может быть установлена в диапазоне от 100 до 300°C, и предпочтительно может быть установлена в диапазоне от 120 до 250°C. Время реакции может быть установлено в диапазоне от 1 секунды до 60 минут. Количество обработок не ограничено, и обработку можно осуществлять один или несколько раз. В частности, в случае, когда обработку осуществляют два или более раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующих обработок. Так как гидролизат, получаемый при обработке разбавленной серной кислотой, содержит кислоту, то необходима нейтрализация, чтобы далее осуществить реакцию гидролиза с использованием целлюлазы или чтобы использовать гидролизат в качестве сырья для ферментации.

Настоящее изобретение отличается тем, что целлюлозу гидролизуют выделенной из нитчатого гриба целлюлазой. Гидролиз целлюлозы означает, что целлюлозу превращают в низкомолекулярные фрагменты под действием целлюлазы, получая моносахариды и/или олигосахариды. Условия реакции для гидролиза не ограничены, при условии что реакцию осуществляют в условиях, предпочтительных для целлюлазы, и в общем, температура реакции предпочтительно находится в диапазоне от 15°C до 100°C, более предпочтительно от 40°C до 60°C, еще более предпочтительно 50°C. pH для гидролиза предпочтительно находится в диапазоне от 3 до 9, более предпочтительно от 4 до 5,5, еще более предпочтительно 5. pH можно корректировать добавлением кислоты или щелочи так, чтобы достичь требуемого значения pH. Кроме того, в зависимости от ситуации может быть добавлен буфер. При гидролизе предпочтительно перемешивание смеси, способствующее осуществлению контакта целлюлозы с ферментом и для получения однородной концентрации сахара в гидролизате. Предпочтительно добавление воды так, чтобы концентрация твердых веществ целлюлозы была в диапазоне от 1 до 25% масс., и более предпочтительно концентрация твердых веществ находится в диапазоне от 8 до 20% масс.

Примеры выделенной из нитчатого гриба целлюлазы включают целлюлазы, выделенные из Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Clostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor, Talaromyces, Phanerochaete, грибов белой гнили и грибов бурой гнили. Из них предпочтительно используют выделенные из нитчатых грибов целлюлазы, выделенную из Trichoderma целлюлазу, которая обладает высокой разрушающей целлюлозу активностью.

Выделенная из Trichoderma целлюлаза представляет собой композицию ферментов, содержащую целлюлазу, выделенную из микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, в качестве основного компонента. Микроорганизм, относящийся к роду Trichoderma, не ограничен и предпочтительным микроорганизмом является Trichoderma reesei. Конкретные примеры Trichoderma reesei включают Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei Rut C-30, Trichoderma reesei ATCC68589, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80 и Trichoderma viride QM9123 (Trichoderma viride QM9123). Целлюлаза также может быть выделена из мутантного штамма, происходящего от микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, и такой мутантный штамм получают мутагенезом, используя мутаген, УФ-излучение или тому подобное, для повышения продуктивности в отношении целлюлазы.

Выделенная из нитчатого гриба целлюлаза, используемая в настоящем изобретении, представляет собой композицию ферментов, содержащую множество ферментных компонентов, таких как целлобиогидролаза, эндоглюканаза, экзоглюканаза, β-глюкозидаза, ксиланаза и ксилозидаза, и такая ферментная композиция обладает активностью, вызывающей гидролиз и осахаривание целлюлозы. В случаях, когда выделенную из нитчатого гриба целлюлазу используют для разрушения целлюлозы, согласованное действие или комплементарное действие множества ферментных компонентов обеспечивает эффективный гидролиз целлюлозы.

Термин «целлобиогидролаза» является общим термином для целлюлаз, которые гидролизуют целлюлозу, действуя на концевые части. Группа ферментов, относящихся к целлобиогидролазе, описана под номером EC: EC 3.2.1.91.

Термин «эндоглюканаза» является общим термином для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы, начиная с их центральных частей. Группа ферментов, относящихся к эндоглюканазе, описана под номерами EC: EC 3.2.1.4, EC 3.2.1.6, EC 3.2.1.39 и EC 3.2.1.73.

Термин «экзоглюканаза» является общим термином для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы с концов. Группа ферментов, относящихся к экзоглюканазе, описана под номерами EC: EC 3.2.1.74 и EC 3.2.1.58.

Термин «β-глюкозидаза» является общим термином для целлюлаз, которые действуют на целлоолигосахариды или целлобиозу. Группа ферментов, относящихся к β-глюкозидазе, описана под номером EC: EC 3.2.1.21.

Термин «ксиланаза» является общим термином для целлюлаз, которые действуют на гемицеллюлозу или особенно на ксилан. Группа ферментов, относящихся к ксиланазе, описана под номером: EC 3.2.1.8.

Термин «ксилозидаза» является общим термином для целлюлаз, которые действуют на ксилоолигосахариды. Группа ферментов, относящихся к ксилозидазе, описана под номером EC: EC 3.2.1.37.

В качестве выдеденной из Trichoderma целлюлазы предпочтительно используют целлюлазу, содержащую компонент(ты), выделенный из культуральной жидкости микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma. Примеры компонента(ов), выделенного из культуральной жидкости Trichoderma, включают все другие компоненты, отличные от целлюлазы, находящейся в культуральной жидкости, полученной при культивирования микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, в среде, приготовленной так, что микроорганизм продуцирует целлюлазу. То есть, примеры компонента(ов) включают другие ферментные компоненты, отличные от целлюлазы, клетки микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, и компоненты среды для культивирования. Конкретные примеры компонентов среды, используемых для культивирования, включают моносахариды, такие как глюкоза и ксилоза; индукторы продуцирования целлюлазы, такие как жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт и целлюлоза; минералы; и витаминные компоненты. Клетки микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, могут содержаться в виде компонента, выделенного из культуральной жидкости микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma. Ведь включение клеток микроорганизма, относящегося к роду Trichoderma, в качестве компонента выделенной из Trichoderma целлюлазы согласно настоящему изобретению может повышать активность регенерированного фермента.

Массовые доли ферментных компонентов в выделенной из Trichoderma целлюлазе не ограничены, и культуральная жидкость, полученная от Trichoderma reesei, содержит, например, 50-95% масс. целлобиогидролазы, а также содержит другие компоненты эндоглюканазу, β-глюкозидазу, экзо-1,4-β-D-глюкозамидазу, ксиланазу, ксилозидазу, эндо-1,4-маннозидазу, 1,2-α-маннозидазу, α-глюкуронидазу, хиназаназу, хитиназу, 1,4-α-глюкозидазу, α-галактозидазу, β-галактозидазу, арабинофуранозидазу, ксиланэстеразу, сволленин, гидрофобин и/или тому подобные. Микроорганизмы, относящиеся к Trichoderma продуцируют высокоактивные целлюлазные компоненты, выделяемые в культуральную жидкость, хотя β-глюкозидазная активность в культуральной жидкости низкая, так как β-глюкозидаза сохраняется в клетках или на поверхности клеток. Поэтому кроме компонентов, присущих выделенной из Trichoderma целлюлазе, может быть добавлена β-глюкозидаза из другого вида или того же самого вида. В качестве β-глюкозидазы из другого вида предпочтительно можно использовать β-глюкозидазу, выделенную из Aspergillus. Примеры β-глюкозидазы, выделенной из Aspergillus, включают новозим 188, который коммерчески доступнее из Novozyme. Способ добавления β-глюкозидазы из другого вида или из того же самого вида может представлять собой способ, посредством которого ген вводят в микроорганизм, относящийся к Trichoderma, чтобы осуществить генетическую рекомбинацию микроорганизма, так чтобы он продуцировал и выделял в культуральную жидкость β-глюкозидазу, и затем клонируют микроорганизм, относящийся к Trichoderma, с последующим выделением культуральной жидкости.

В настоящем изобретении гидролиз целлюлозы с использованием выделенной из нитчатого гриба целлюлазы осуществляют в ходе двух отдельных стадий, то есть в ходе первичного гидролиза и вторичного гидролиза. Стадии описаны ниже в указанном порядке.

Первичный гидролиз в настоящем изобретении означает, что выделенную из нитчатого гриба целлюлазу добавляют к целлюлозе, которая не была подвергнута ферментативной обработке, чтобы осуществить гидролиз. Ферментом, используемым для первичного гидролиза, может быть либо далее описанный свежий фермент, либо регенерированный фермент, и регенерированный фермент используют предпочтительно, так как использование регенерированного фермента может повысить эффективность продукции сахара. Механизмы, посредством которых эффективность продукции сахара повышается при использовании регенерированного фермента в первичном гидролизе, представляют собой следующие механизмы. В регенерированном ферменте содержаться ферментные компоненты, структуры которых были частично денатурированы вследствие теплового воздействия во время гидролиза, и такие ферментные компоненты особенно сильно адсорбируются на участках адсорбции, существующих на поверхности целлюлозы. В результате ферментные компоненты неспецифично адсорбируются на адсорбирующих частях поверхности целлюлозы, например, лигнина. Поэтому неспецифичная адсорбция свежего ферментного компонента, который подают позже, может быть подавлена. В общем, удельная активность (ферментативная активность на массу белка) в разрушении целлюлазой выше у регенерированного фермента, чем у свежего фермента. То есть, в результате подавления неспецифичной адсорбции свежего ферментного компонента, который обладает более высокой удельной активностью, выход продукции сахара и эффективность регенерации фермента может быть повышена. Другая причина состоит в том, что поскольку количество раз извлечения регенерированного фермента согласно настоящему изобретению увеличивается, можно получить более высокую разрушающую ксилан активность. Разрушающая ксилан активность, имеющаяся у регенерированного фермента, может быть измерена с использованием в качестве разрушаемого субстрата реагента ксилана, такого как ксилан древесины березы. Примеры выделенных из нитчатого гриба целлюлазных компонентов, вовлеченных в разрушающую ксилан активность, включают ксиланазу и ксилозидазу. Примеры генов ксиланазы включают xyn1(GH11), xyn2(GH11), xyn3(GH10), xyn4(GH5), xyn5b(GH5) и xyn11(GH11). Примеры генов ксилозидазы включают bx11/bx13a(GH3), bx1l3b(GH3) и bx13c(GH3). Каждый из указанных выше генов кодирует ксиланазу или ксилозидазу и содержится в виде выделенного из нитчатого гриба целлюлазного компонента. Примеры разрушающих ксилан ферментов, активности которых в регенерированном ферменте могут быть повышены, включают ксиланазу 3 (молекулярная масса 38 кД; xyn3), эндо-β-1,4-ксиланаза (молекулярная масса 25 кД; xyn1) и β-ксилозидаза (молекулярная масса 88 кД; bx11/bx13a). При добавлении для первичного гидролиза регенерированного фермента, разрушающая ксилан активность которого была повышена, как описано выше, преимущественно гидролизуются компоненты ксилана, окружающие целлюлозу, и поэтому продуктивность сахара при первичном и вторичном гидролизе может быть повышена.

Время реакции при первичном гидролизе предпочтительно находится в диапазоне от 15 минут до 6 часов. В случаях, когда время реакции составляет менее 15 минут, степень повышения эффективности продукции сахара может быть низкой, тогда как в случаях, когда время реакции составляет не менее 6 часов, эффективность продукции сахара на единицу времени может быть низкой. Концентрация целлюлозы, температура реакции и pH не ограничены и могут быть такими, как в случае указанных выше условий гидролиза.

Фермент для первичного гидролиза предпочтительно добавляют в массовой доле от 1/1000 до 1/50 по отношению к массу предварительно обработанной целлюлозы. Масса предварительно обработанной целлюлозы может быть вычислена посредством измерения массы твердого вещества, содержащегося в предварительной обработанной целлюлозе. Массу твердых веществ можно вычислить, подвергая предварительно обработанный продукт разделению твердого вещества и жидкости с использованием центрифугирования, мембранного разделения или тому подобного и промывке полученного вещества водой, чтобы отделить и удалить водорастворимые компоненты, с последующей сушкой содержащих воду твердых веществ вплоть до момента, когда масса достигает постоянной величины, и измерения массы твердых веществ. Количество добавляемого фермента можно вычислить, измеряя концентрацию белка в растворе, содержащем свежий фермент, и умножая концентрацию белка на количество добавляемого раствора свежего фермента.

В первичном гидролизате, полученном в результате первичного гидролиза, накапливаются моносахаридные компоненты, получаемые при гидролизе. Разрушающая ксилан активность имеет тенденцию к высоким значениям, особенно в случаях, когда используют регенерированный фермент для первичного гидролиза. То есть, в первичном гидролизате, полученном с использованием регенерированного фермента в ходе первичного гидролиза, образуется большое количество ксилозы. Первичный гидролизат, получаемый в результате первичного гидролиза согласно настоящему изобретению, может быть подвергнут описанному далее вторичному гидролизу как таковой или после осуществления такой операции, как разделения твердого вещества и жидкости, чтобы повысить концентрацию не разрушенных твердых веществ. Кроме того, в случаях, когда осуществляют разделение твердого вещества и жидкости после первичного гидролиза, компонент, получаемый при разделении в виде раствора, может быть использован в качестве жидкого сахара.

Вторичный гидролиз в настоящем изобретении означает, что свежий фермент дополнительно добавляют к гидролизату, получаемому в результате описанного выше первичного гидролиза, чтобы осуществить гидролиз. Для первичного гидролизата не требуется осуществления разделения твердого вещества и жидкости. Кроме того, в случае необходимости можно добавить воду, но добавление воды не является обязательным.

В настоящем изобретении подают и используют для вторичного гидролиза свежий фермент. Это осуществляют в силу следующих причин: 1) так как достаточная эффективность разрушения целлюлозы не может быть получена с использованием количества фермента, подаваемого при первичном гидролизе (свежий фермент или регенерированный фермент), свежий фермент необходимо подавать дополнительно, чтобы получить достаточную эффективность разрушения целлюлозы; и 2) эффективность получения сахара и эффективность регенерации фермента может быть повышена посредством подачи свежего фермента на двух отдельных стадиях, то есть, при первичном гидролизе и вторичном гидролизе. Кроме того, особенно в случаях, когда осуществляют только первичный гидролиз, используя регенерированный фермент, выход сахара во втором и последующих процессах снижается, что не является предпочтительным. Поэтому, при подаче свежего фермента в дополнение к регенерированному ферменту для вторичного гидролиза выход сахара может быть эквивалентен выходу в первом процессе или предыдущем процессе. То есть, в настоящем способе получения жидкого сахара можно повторять получение сахара в концентрации не меньше предварительно определяемого значения.

Добавление свежего фермента для вторичного гидролиза можно осуществлять дробно множество раз (дробная подача). Например, после первичного гидролиза половина свежего фермента, добавляемого для вторичного гидролиза, может быть подана для осуществления гидролиза в течение нескольких часов, с последующей подачей остальной половины свежего фермента. В настоящем изобретении даже в случаях, когда свежий фермент подают дробно несколько раз при вторичном гидролизе, такие операции также включены во вторичный гидролиз.

Время реакции вторичного гидролиза предпочтительно более длительное, чем время реакции первичного гидролиза. Более конкретно, время реакции вторичного гидролиза предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 200 часов, более предпочтительно в диапазоне от 6 до 72 часов, еще более предпочтительно в диапазоне от 12 до 24 часов. Хотя время реакции необходимо контролировать в зависимости от количества используемого фермента, температуры реакции, представляющей интерес концентрации сахара и тому подобного, время реакции более 200 часов может вызывать тепловую инактивацию целлюлазы, которая не является предпочтительной с точки зрения регенерации и повторного использования целлюлазы. С другой стороны, в случаях, когда время реакции составляет менее 1 часа, концентрация сахара в получаемом гидролизате может быть недостаточной.

Фермент для вторичного гидролиза предпочтительно добавляют при соотношении масс от 1/1000 до 1/50 по отношению к массе предварительной обработанной целлюлозы. Масса предварительно обработанной целлюлозы может быть рассчитана на основании массы сухого остатка предварительно обработанной целлюлозы перед первичным гидролизом.

Количества добавляемого фермента в ходе первичного гидролиза и вторичного гидролиза предпочтительно удовлетворяет следующему соотношению: количество фермента, добавляемого для первичного гидролиза > количества фермента, добавляемого для вторичного гидролиза. Добавленное количество в данном случае вычисляют, умножая концентрацию белка свежего фермента или регенерированного фермента на количество подаваемого раствора фермента. Что касается измерения концентрации белка, то концентрацию белка регенерированного фермента и свежего фермента можно рассчитать описанным выше известным способом. Концентрация белка в данном случае просто означает концентрацию белка, независимо от того является ли белок полученным из целлюлазы компонентом или другим компонентом. В настоящем изобретении, когда добавленное количество удовлетворяет указанному соотношению, может быть достигнута более высокая продукция сахара, и эффективность регенерации фермента также может быть повышена.

Настоящее изобретение предусматривает стадию, на которой вторичный гидролизат подвергают разделению твердого вещества и жидкости с получением жидкого сахара, из которого выделенную из нитчатого гриба целлюлазу затем извлекают; и стадию повторного использования в первичном гидролизе регенерированной выделенной из нитчатого гриба целлюлазы. Стадии описаны ниже в указанном порядке.

Разделение твердого вещества и жидкости вторичного гидролизата осуществляют с целью разделения жидкого сахара и гидролизного остатка, получаемого при вторичном гидролизе. «Жидкий сахар» означает раствор сахара, получаемый в результате описанного выше гидролиза целлюлозы. Сахара обычно классифицируют на основе степени полимеризации моносахаридов, и делят на моносахариды, такие как глюкоза и ксилоза; олигосахариды, получаемые в результате сопровождаемой дегидратацией конденсации от 2 до 9 моносахаридов; и полисахариды, образуемые в результате сопровождаемой дегидратацией конденсации не менее чем 10 моносахаридов. Жидкий сахар, получаемый с применением настоящего изобретения, содержит глюкозу и ксилозу в качестве основных компонентов и, хотя и в небольших количествах, олигосахариды, такие как целлобиоза; и моносахариды, такие как арабиноза и манноза. Более конкретно, способ анализа моносахаридов, олигосахаридов и полисахаридов, растворенных в воде, может представлять собой ВЭЖХ, с помощью которой может быть осуществлено определение количества на основе сравнения со стандартным образцом. Способ разделения твердого вещества и жидкости не ограничен, и примеры способа разделения твердого вещества и жидкости включают центрифугирование с использованием шнекового декантера или тому подобного, фильтрование с использованием фильтр-пресса или тому подобного, и мембранное разделение с использованием мембраны для микрофильтрации или тому подобного.

Во вторичном гидролизате выделенная из нитчатого гриба целлюлаза существует в растворенном в жидком сахаре состоянии или адсорбирована на твердом остатке в виде неразрушенного материала. Такая выделенная из нитчатого гриба целлюлаза может быть регенерирована посредством разделения твердого вещества и жидкости и извлечения со стороны жидкого сахара. Предпочтительные примеры регенерации выделенной из нитчатого гриба целлюлазы из жидкого сахара включают способ, в котором жидкий сахар фильтруют через ультрафильтрационную мембрану и целлюлазу извлекают со стороны подачи. Примеры ультрафильтрационной мембраны, которую можно использовать, включают мембраны, изготовленные из таких материалов, как полиэфирсульфон (PES), поливинилиденфторид (PVDF) и регенерированная целлюлоза, предпочтительно используют ультрафильтрационную мембрану, изготовленную из синтетического полимерного материала, такого как PES или PVDF. Предел отсечения молекулярной массы ультрафильтрационной мембраны не ограничен, при условии, что используемая целлюлаза может быть эффективно регенерирована, и ультрафильтрационная мембрана предпочтительно имеет предел отсечения молекулярной массы в диапазоне от 1000 до 50000. Количество регенерированного фермента варьирует в зависимости от количества свежего фермент, добавляемого для вторичного гидролиза, и поэтому не ограничено.

В некоторых случаях в ходе осуществления повторения регенерации и повторного использования в настоящем изобретении и, особенно, в процессе отделения регенерируемого фермента с использованием ультрафильтрационной мембраны, не растворимый в воде выделенный из нитчатого гриба целлюлазный компонент может быть получен в виде регенерированного ферментного компонента. Такой не растворимый в воде выделенный из нитчатого гриба целлюлазный компонент представляет собой ферментный компонент, полученный в ходе процесса гидролиза или в ходе извлечения фермента с использованием ультрафильтрационной мембраны или тому подобного. Такой не растворимый в воде выделенный из нитчатого гриба целлюлазный компонент предпочтительно используют как таковой без извлечения посредством разделения твердого вещества и жидкости, фильтрации или тому подобного в качестве регенерированного ферментного компонента. Не растворимый в воде выделенный из нитчатого гриба целлюлазный компонент состоит, главным образом, из целлобиогидролазы. Нерастворимость в воде означает, что компонент существует в жидком регенерируемом ферменте в виде осадка, хлопьев или микрочастиц, которые могут быть отделены посредством помещения регенерируемого фермента в пробирку и центрифугирования пробирки с получением не растворимого в воде выделенного из нитчатого гриба целлюлазного компонента в виде осадков. Не растворимый в воде выделенный из нитчатого гриба целлюлазный компонент, извлеченный в виде осадков, может быть идентифицирован по его окраске, которая может быть белой, бледно-желтой, коричневой или тому подобной. При отделении не растворимого в воде выделенного из нитчатого гриба целлюлазного компонента и ресуспендировании его в воде, часть компонента может быть растворена. Однако для полного растворения компонента необходимо добавление мочевины или поверхностно-активного вещества (додецилсульфата натрия, твина 80, тритона X или тому подобного). При повторном использовании регенерированного фермента, содержащего такой не растворимый в воде выделенный из нитчатого гриба целлюлазный компонент, для первичного гидролиза может быть достигнута еще более высокая продукция сахара.

Выделенную из нитчатого гриба целлюлазу, регенерированную из вторичного гидролизата (далее называемую регенерированным ферментом) повторно используют в первичном гидролизе. Преимущества использования регенерированного фермента в первичном гидролизе описаны выше. Количество раз повторного использования регенерированного фермента не ограничено.

В настоящем изобретении количество фермента, добавляемого при повторном использовании фермента, регенерированного из вторичного гидролизата, для первичного гидролиза предпочтительно больше, чем количество свежего фермента, добавляемого для вторичного гидролиза. Количество добавленного фермента измеряют по количеству белка, как описано выше. В общем, целлюлазная активность регенерированного фермента (ферментная активность на определенное количество белка) ниже, чем целлюлазная активность свежего фермент, но в настоящем изобретении в случаях, когда удовлетворяется соотношение: количество добавленного регенерированного фермента, повторно используемого для первичного гидролиза > количества добавленного свежего фермента при вторичном гидролизе; эффективность продукции сахара, отнесенной к количеству свежего фермента возрастает.

Жидкий сахар, получаемый согласно настоящему изобретению, содержит моносахариды, такие как глюкоза, ксилоза, арабиноза и манноза, полученные из целлюлозы и гемицеллюлозы (ксилан и арабинан). Соотношения в составе моносахаридов не ограничены и основными моносахаридными компонентами являются глюкоза и ксилоза. Жидкий сахар согласно настоящему изобретению также может содержать олигосахариды, такие как целлобиоза и тому подобные, хотя их количества могут быть очень небольшими по сравнению с количеством моносахаридов. Концентрация моносахаридов, содержащихся в жидком сахаре, не ограничена и предпочтительно составляет от 0,1 до 20% масс., более предпочтительно от 5 до 20% масс.. В случаях, когда концентрация в жидком сахаре находится в диапазоне от 5 до 20% масс., жидкий сахар можно использовать в качестве сырья для ферментации микроорганизмами без концентрирования.

Жидкий сахар согласно настоящему изобретению можно концентрировать с использованием нанофильтрационной мембраны и/или обратноосмотической мембраны. Примеры материала нанофильтрационной мембраны или обратноосмотической мембраны, который можно использовать в настоящем изобретении, включают полимерные материалы, такие как полимеры на основе ацетата целлюлозы, полиамиды, сложные полиэфиры, полиимиды, виниловые полимеры и полисульфоны. Мембрана не ограничена мембраной, состоящей только из одного из материалов, и может представлять собой мембрану, содержащую несколько мембранных материалов.

В качестве нанофильтрационной мембраны, используемой в настоящем изобретении, предпочтительным является мембранный элемент рулонного типа. Конкретные примеры предпочтительного нанофильтрационного мембранного элемента включают нанофильтрационный мембранный элемент из ацетата целлюлозы GE Sepa производства GE Osmonics; нанофильтрационные мембранные элементы NF99 и NF99HF производства Alfa-Laval, которые имеют полиамидные функциональные слои; нанофильтрационные мембранные элементы NF-45, NF-90, NF-200, NF-270 и NF-400 производства FilmTec Corporation, которые имеют поперечно сшитые функциональные слои из пиперазинполиамида; и нанофильтрационные мембранные элементы SU-210, SU-220, SU-600 и SU-610 производства Toray Industries, Inc., ссодержащие нанофильтрационную мембрану UTC60, изготовленную тем же производителем, которая содержит поперечно сшитый пиперазинполиамид в качестве основного компонента. Нанофильтрационным мембранным элементом более предпочтительно является NF99 или NF99HF; NF-45, NF-90, NF-200 или NF-400; или SU-210, SU-220, SU-600 или SU-610. Еще более предпочтительно нанофильтрационным мембранным элементом является SU-210, SU-220, SU-600 или SU-610.

В качестве обратноосмотической мембраны, используемой в настоящем изобретении мембранный элемент рулонного типа является предпочтительным, как и в случае нанофильтрационной мембраны. Конкретные примеры предпочтительного обратноосмотического мембранного элемента включают полиамидные обратноосмотические мембранные модули производства TORAY INDUSTRIES, INC. SU-710, SU-720, SU-720F, SU-710L, SU-720L, SU-720LF, SU-720R, SU-710P и SU-720P, которые являются модулями низкого давления, а также SU-810, SU-820, SU-820L и SU-820FA, содержащие UTC70 в качестве обратноосмотической мембраны, которые являются модулями высокого давления; состоящие из ацетата целлюлозы обратноосмотические мембраны, изготовленные тем же производителем, SC-L100R, SC-L200R, SC-1100, SC-1200, SC-2100, SC-2200, SC-3100, SC-3200, SC-8100 и SC-8200; NTR-759HR, NTR-729HF, NTR-70SWC, ES10-D, ES20-D, ES20-U, ES15-D, ES15-U и LF10-D производства Nitto Denko Corporation; RO98pHt, RO99, HR98PP и CE4040C-30D производства Alfa-Laval; GE Sepa, производства GE; и BW30-4040, TW30-4040, XLE-4040, LP-4040, LE-4040, SW30-4040 и SW30HRLE-4040 производства FilmTec Corporation.

Устройство для осуществления способа согласно настоящему изобретению для получения жидкого сахара в результате ферментативного гидролиза целлюлозы описано ниже более конкретно со ссылкой на прилагаемые чертежи.

В качестве аппаратного механизма для осуществления способа получения жидкого сахара устройство согласно настоящему изобретению имеет в своем составе: 1) резервуар для гидролиза, с которым соединены труба для подачи регенерированного фермента, и труба для подачи свежего фермента; 2) устройство для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата; 3) резервуар для жидкого сахара, имеющий трубу подачи воды для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе; и 4) устройство с ультрафильтрационной мембраной для разделения фермента и жидкого сахара, которые функционально соединены друг с другом. То есть, в способе согласно настоящему изобретению для получения жидкого сахара осуществляют первичный гидролиз, используя регенерированный фермент. Для осуществления такого гидролиза предлагается 1) резервуар для гидролиза, с которым соединены труба для подачи регенерированного фермента и труба для подачи свежей карбогидразы. Кроме того, для отделения регенерированного фермента, находящегося в гидролизате предлагаются 2) устройство для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата; и 4) устройство с ультрафильтрационной мембраной для разделения фермента и жидкого сахара. Кроме того, для извлечения регенерированного жидкого фермента и промывки ультрафильтрационной мембраны одновременно предлагается 3) резервуар для жидкого сахара, имеющий трубу подачи воды для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе. Конкретные примеры устройства описаны ниже со ссылкой на фиг. 2-фиг. 10.

На фиг. 2 показан пример устройства для осуществления способа согласно настоящему изобретению. А именно, устройство на фиг. 2 содержит в качестве составных частей:

резервуар для гидролиза 1, имеющий: трубу подачи регенерированного фермента 4, которая может независимо подавать регенерированный фермент в резервуар для гидролиза и может при необходимости дополнительно регулировать подачу; и трубу подачи свежего фермента 6, которая может независимо подавать свежий фермент в резервуар для гидролиза и при необходимости может дополнительно регулировать подачу; которые независимо соединены с резервуаром для гидролиза 1;

устройство для фильтр-прессования 9 для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата;

резервуар для жидкого сахара 12, имеющий трубу для подачи воды 11 для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе 15; и

устройство, имеющее ультрафильтрационную мембрану, 14 для разделения фермента и жидкого сахара.

Кроме того, для резервуара, в котором проходит гидролиз, 1 предлагается термостат 2 для поддержания температуры в ходе гидролиза; перемешивающая лопасть 3 для смешивания лигноцеллюлозы посредством перемешивания; и канал для ввода целлюлозы 7. Труба для подачи регенерированного фермента 4 и труба для подачи свежего фермента 6 соединены с резервуаром, содержащим регенерированный фермент 5, и резервуаром, содержащим свежий фермент 8, соответственно, через клапаны. Предпочтительно клапаны по отдельности регулируются электронно-запорными клапанами.

Резервуар для гидролиза 1 соединен с устройством для фильтр-прессования 9, в котором гидролизат отделяют за счет использования клапана и воздушного насоса или тому подобного, обеспечивающих перенос гидролизата в устройство для фильтр-прессования 9. С устройством для фильтр-прессования 9 соединен компрессор 10, обеспечивающий давление для фильтрации.

Жидкий сахар, полученный фильтр-прессованием, задерживается в резервуаре для жидкого сахара 12. Резервуар для жидкого сахара 12 соединен с устройством, имеющим мембрану для ультрафильтрации 14, через циркуляционный насос 13. Регенерируемый фермент, который прошел с мембранной стороны (стороны подачи) ультрафильтрационной мембраны, возвращается в резервуар для жидкого сахара 12 через циркуляционную трубу 15. Раствор сахара после удаления фермента собирается с другой стороны (со стороны проходящего через фильтр вещества) в качестве фильтрата. Регенерированный фермент, собранный в резервуаре для жидкого сахара 12, отправляют в резервуар, удерживающий регенерированный фермент, 5 через трубу для регенерированного фермента 16 и насос. Воду подают в резервуар для жидкого сахара 12 через трубу для подачи воды 11, и вода циркулирует через устройство, имеющее ультрафильтрационную мембрану, 14 и циркуляционную трубу 15 с циркуляционным насосом 13. Благодаря этому регенерированный ферментный компонент, удерживаемый на поверхности ультрафильтрационной мембраны и в циркуляционной трубе 15 может быть дополнительно извлечен в виде раствора, что делает процесс эффективным. Кроме того, не растворимый в воде выделенный из нитчатого гриба целлюлазный компонент, налипший на поверхность ультрафильтрационной мембраны и тому подобного, также может быть извлечен. Кроме того, такая циркуляция воды делает возможной промывку поверхности ультрафильтрационной мембраны, которой снабжено устройство с мембраной для ультрафильтрации 14, и полезно для уменьшения загрязнения мембраны. При такой операции вода, находящаяся в резервуаре для жидкого сахара 12, отправляется в резервуар, удерживающий регенерированный фермент, 5 через трубу для регенерированного фермента 16. Следовательно, вода, подаваемая через трубу для подачи воды 11, используется для гидролиза лигноцеллюлозы в резервуаре для гидролиза 1.

На фиг. 3 оказан другой пример устройства для осуществления способа согласно настоящему изобретению. А именно, устройство, показанное на фиг. 3 содержит в качестве составляющих компонентов:

устройство смешивания целлюлозы/регенерированного фермента 18 для смешивания регенерированного фермента с целлюлозой для осуществления первичного гидролиза;

резервуар для гидролиза 1, имеющий трубу для подачи смесицеллюлозы/регенерированного фермента 17 и трубу для подачи свежего фермента 6, которые независимо соединены с резервуаром для гидролиза 1;

устройство для фильтр-прессования 9 для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата;

резервуар для жидкого сахара, 12, имеющий трубу для подачи воды 11 для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе 15; и

устройство, имеющее ультрафильтрационную мембрану, 14 для разделения фермента и жидкого сахара.

Такое устройство отличается от устройства, показанного на фиг. 2, наличием устройства для смешивания целлюлозы/регенерированного фермента 18 и впускной трубой 17, предназначенным для такого устройства. Устройство для смешивания целлюлозы/регенерированного фермента 18 представляет собой устройство для смешивания целлюлозы с регенерированным ферментом, и регенерированный фермент смешивают с целлюлозой, используя внутренний шнек. В устройстве для смешивания целлюлозы/регенерированного фермента 18 осуществляют стадию первичного гидролиза (1). Устройство для смешивания целлюлозы/регенерированного фермента 18 может поддерживаться при температуре, подходящей для первичного гидролиза. Затем регенерированный фермент может быть предварительно инкубирован с последующим смешиванием с целлюлозой в устройстве для смешивания целлюлозы/регенерированного фермента 18 для осуществления первичного гидролиза. Благодаря предварительному смешиванию регенерированного фермента с целлюлозой в устройстве для смешивания целлюлозы/регенерированного фермента 18, затраты на энергию, необходимую для перемешивания смеси в резервуаре для гидролиза 1 могут быть снижены. Кроме того, благодаря предварительному смешиванию регенерированного фермента с целлюлозой в устройстве для смешивания целлюлозы/регенерированного фермента 18, продолжительность времени, необходимого для равномерного диспергирования целлюлозы в резервуаре для гидролиза 1, может быть уменьшена, что приводит к уменьшению продолжительности периода времени, необходимого для гидролиза. Первичный гидролизат, полученный в устройстве для смешивания целлюлозы/регенерированного фермента 18, подают в устройство для гидролиза 1 через трубу для подачи смеси целлюлозы/регенерированного фермента 17. Затем свежий фермент, содержащий выделенную из нитчатого гриба целлюлазу со стадии (2) добавляют из трубы для подачи свежего фермента 6 для осуществления вторичного гидролиза. Последующее разделение твердого вещества и жидкости и процесс извлечения фермента являются такими же как в случае устройства, показанного на фиг. 2.

На фиг. 4 показан другой пример устройства для осуществления способа согласно настоящему изобретению. Устройство, показанное на фиг. 4 соответствует случаю, когда устройство для разделения твердого вещества и жидкости 19, содержащее фильтр-пресс, используют для описанного выше устройства, показанного на фиг. 2. Резервуар для удержания регенерированного фермента 5, резервуар для удержания свежего фермента 8 и перемешивающая лопасть 3, описанные на фиг. 2, не показаны на фиг. 4, так как они могут быть предусмотрены при необходимости. Твердые вещества, отделяемые с помощью устройства для разделения твердого вещества и жидкости 19, удаляют через трубу для вывода твердых веществ 20. Устройство для разделения твердого вещества и жидкости 19 может представлять собой фильтр-пресс, который показан на фиг. 2 и фиг. 3 выше, и примеры других устройств для разделения твердого вещества и жидкости включают центрифугу непрерывного действия, шнековый декантер, центрифугу де Лаваля, шнековый пресс, ленточный фильтр и барабанный фильтр. Что касается основных характеристик устройства, то резервуар для гидролиза имеет трубу для подачи регенерированного фермента 4 и трубу для подачи свежего фермента 6, которые независимо соединены с ним и, следовательно, позволяют независимо контролировать добавление регенерированного фермента и добавление свежего фермента, и резервуар для жидкого сахара 12, имеет трубу для подачи воды 11, соединенную с ним, так что вода, подаваемая из трубы для подачи воды 11, может циркулировать в устройство, имеющее ультрафильтрационную мембрану 14, и также может подаваться через трубу для регенерированного фермента 16 в резервуар для гидролиза 1. Такие характеристики являются такими же, как характеристики устройства, показанного на фиг. 2 и фиг. 3.

На фиг. 5 показан другой пример устройства для осуществления способа согласно настоящему изобретению. Устройство, показанное на фиг. 5 в основном такое же, как описанное выше устройство, показанное на фиг. 4, но со стороны непроникающей через мембрану жидкости устройство с ультрафильтрационной мембраной 14 соединено с резервуаром, удерживающим регенерированный фермент 5. В таком устройство, в частности, используют в качестве ультрафильтрационной мембраны, спиральные элементы, которые соединены линейно или в разветвленной форме. В таком устройстве подобно устройствам, показанным на фиг. 2-4, труба для подачи воды 11 соединена с резервуаром для жидкого сахара 12. Вода, подаваемая через трубу для подачи воды 11, может циркулировать в имеющее ультрафильтрационную мембрану устройство 14 благодаря переключению трубопровода с использованием трехходового клапана 21, и затем переключение с использованием трехходового клапана 21 обеспечивает возможность подачи воды резервуар, удерживающий регенерированный фермент, 5. Далее труба для регенерированного фермента 16 соединена с резервуаром, удерживающим регенерированный фермент, 5 и через эту трубу воду можно подавать в резервуар для гидролиза 1. Подобно устройствам, показанным на фиг. 2-4, труба для подачи регенерированного фермента 4 и труба для подачи свежего фермента 6 независимо соединены с резервуаром для гидролиза, обеспечивая независимую регуляцию добавления регенерированного фермента и добавления свежего фермента.

На фиг. 6 показан другой пример устройства для осуществления способа согласно настоящему изобретению. В устройстве, показанном на фиг. 6, устройство с микрофильтрационной мембраной 22 помещают ниже по потоку от устройства для разделения твердого вещества и жидкости 19. В случае, когда твердые вещества не случае, когда твердые вещества не могут быть в достаточной степени удалены в устройстве для разделения твердого вещества и жидкости 19, дальнейшая обработка с использованием устройства с микрофильтрационной мембраной 22 позволяет получать жидкость, которая почти полностью освобождена от твердых веществ. Тем самым может быть уменьшено засорение устройства, содержащего ультрафильтрационную мембрану, 14 на следующей стадии.

Фиг. 7 представляет собой подробный чертеж устройства с микрофильтрационной мембраной 22, показанного на фиг. 6, и показывает конструкцию устройства для осуществления фильтрования в тангенциальном потоке. В данном устройстве фильтрат, отделяемый в устройстве для разделения твердого вещества и жидкости 19, задерживается в резервуаре 23 для фильтрата, получаемого при разделении твердого вещества и жидкости, и фильтрование в тангенциальном потоке осуществляют на микрофильтрационной мембране 25, соединенной через насос 24. Микрофильтрационная мембрана 25 может быть в форме либо плоской мембраны, либо мембраны с полыми волокнами. Мембрана с полыми волокнами может быть либо мембранной внутреннего давления, либо мембраной внешнего давления.

Фиг. 8 представляет собой подробный чертеж устройства с микрофильтрационной мембраной 22, показанного на фиг. 6, и показывает конструкцию устройства для осуществления тупиковой фильтрации в устройстве с микрофильтрационной мембраной 22. Фильтрат, отделяемый в устройстве для разделения твердого вещества и жидкости 19, задерживается в резервуаре 23 для удержания фильтрата, получаемого при разделении твердого вещества и жидкости, и фильтруется через микрофильтрационную мембрану 25. В случаях тупиковой фильтрации может присутствовать устройство подачи сжатого воздуха 26 для осуществления пузырьковой промывки поверхности мембраны, и может быть помещен насос для реверсивной промывки 27 для осуществления реверсивной промывки. Реверсивную промывку можно осуществлять либо с использованием фильтрата, возвращенного в резервуар для жидкого сахара 12, либо с использованием жидкости для общей промывки мембраны или жидкого средства. Микрофильтрационная мембрана 25 может быть в форме либо плоской мембраны, либо мембраны с полыми волокнами. Мембрана с полыми волокнами может быть либо мембранной внутреннего давления, либо мембраной внешнего давления.

На фиг. 9 показан другой пример устройства для осуществления способа согласно настоящему изобретению. Устройство согласно настоящему изобретению для получения жидкого сахара может дополнительно иметь обратноосмотическую мембрану и/или нанофильтрационную мембрану для концентрирования жидкого сахара. На фиг. 9 показано устройство, соответствующее устройству, показанному на фиг. 4, с которым далее соединена нанофильтрационная мембрана или обратноосмотическая мембрана 30. Со стороны фильтрата устройство 14, имеющее ультрафильтрационную мембрану, далее соединено с резервуаром для концентрирования жидкого сахара 28, и фильтрование осуществляют с использованием обратноосмотической мембраны и/или нанофильтрационной мембраны 30 посредством насоса высокого давления 29. Жидкий сахар блокируется обратноосмотической мембраной и/или нанофильтрационной мембраной и таким образом концентрируется в резервуаре для концентрирования жидкого сахара 28. С другой стороны избыточная вода может быть удалена в виде фильтрата. Устройство с обратноосмотической мембраной и/или нанофильтрационной мембраной 30 может быть помещено таким образом, чтобы оно было соединено со стороны фильтрата с устройством, имеющим ультрафильтрационную мембрану, 14 в любом из устройств, показанных на фиг. 2-6.

На фиг. 10 показан другой пример устройства для осуществления способа согласно настоящему изобретению. Труба для подачи регенерированного фермента 4 и труба для подачи свежего фермента 6 предпочтительно независимо соединены с резервуаром для гидролиза 1, но труба 4 и труба 6 могут быть соединены друг с другом трехходовым клапаном 31 или тому подобным с получением одной трубы (трубы для подачи свежего фермента или регенерированного фермента), соединенной с резервуаром для гидролиза 1, при условии, что при этом можно регулировать подачу каждого из ферментных компонентов.

Вода, подаваемая из трубы для подачи воды 11 может быть теплой воды. Температура теплой воды предпочтительно не выше 60°C, принимая во внимание предотвращение инактивации фермента. Благодаря подаче теплой воды из трубы для подачи воды и обеспечению циркуляции теплой воды в устройстве 14, имеющем ультрафильтрационную мембрану, может быть получен высокий эффект промывки ультрафильтрационной мембраны. Для более высокого эффекта промывки температура теплой воды предпочтительно составляет от 30°C до 60°C.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение описано ниже более конкретно с помощью примеров. Однако настоящее изобретение не ограничено такими примерами.

(Справочный пример 1) Получение целлюлазы (композиция фермента целлюлазы, выделенной из Trichoderma.)

Ферментную композицию, получаемую из культуральной жидкости Trichoderma, готовили следующим способом.

[Предварительное культивирование]

Готовили смесь 5% жидкого кукурузного экстракта (масс./об.), 2% глюкозы (масс./об.), 0,37% тартрата аммония (масс./об.),0,14% (масс./об.) сульфата аммония, 0,2% (масс./об.) дигидрофосфата калия, 0,03% (масс./об.) дигидрата хлорида кальция, 0,03% (масс./об.) гептагидрата сульфата магния, 0,02% (масс./об.) хлорида цинка, 0,01% (масс./об.) гексагидрата хлорида железа (III), 0,004% (масс./об.) пентагидрата сульфата меди (II), 0,0008% (масс./об.) тетрагидрата хлорида марганца, 0,0006% (масс./об.) борной кислоты и 0,0026% (масс./об.) тетрагидрата гептамолибдата гексааммония в дистиллированной воде, и 100 мл полученной смеси помещали в колбу Эрленмейера с перегородками объемом 500 мл, затем стерилизовали автоклавированием при 121°C в течение 15 минут. После того, как смеси давали возможность остыть к ней добавляли РЕ-М и твин 80, каждый из которых стерилизовали автоклавированием при 121°C в течение 15 минут отдельно от смеси, до 0,01% (масс./об.) каждого. В такую среду для предварительного культивирования инокулировали Trichoderma reesei АТСС68589 по 1×10⁵ клеток/мл и клетки культивировали при 28°C в течение 72 часов со встряхиванием при 180 об/мин, чтобы осуществить предварительное культивирование (качалка: BIO-SHAKER BR-40LF производства TAITEC CORPORATION).

[Основная культура]

Готовили смесь 5% жидкого кукурузного экстракта (масс./об.), 2% глюкозы (масс./об.), 10% (масс./об.) целлюлозы (Avicel), 0,37% тартрата аммония (масс./об.), 0,14 (масс./об.) сульфата аммония, 0,2% (масс./об.) дигидрофосфата калия, 0,03% (масс./об.) дигидрата хлорида кальция, 0,03% (масс./об.) гептагидрата сульфата магния, 0,02% (масс./об.) хлорида цинка, 0,01% (масс./об.) гексагидрата хлорида железа (III), 0,004% (масс./об.) пентагидрата сульфата меди (II), 0,0008% (масс./об.) тетрагидрата хлорида марганца, 0,0006% (масс./об.) борной кислоты и 0,0026% (масс./об.) тетрагидрата гептамолибдата гексааммония в дистиллированной воде, и 2,5 л полученной смеси помещали в сосуд объемом 5 л с мешалкой (производства ABLE, DPC-2A), затем стерилизовали автоклавированием при 121°C в течение 15 минут. После того, как смеси давали возможность остыть, к ней добавляли PE-M и твин 80, каждый из которых стерилизовали автоклавированием при 121°C в течение 15 минут отдельно от смеси, до 0,1% каждого. В полученную смесь инокулировали 250 мл предварительной культуры Trichoderma reesei ATCC68589, предварительно полученной с использованием жидкой среды способом, описанным выше. Клетки культивировали при 28°C в течение 87 часов при 300 об/мин с скорости аэрации 1 vvm. После центрифугирования надосадок подвергают фильтрованию через мембрану (Stericup-GV, производства Millipore, материал: PVDF). К культуральной жидкости, приготовленной в описанных выше условиях, добавляли β-глюкозидазу (Novozyme 188) с массовой долей белка 1/100 и полученную смесь использовали в качестве выделенной из Trichoderma целлюлазы в примерах, описанных ниже.

(Справочный пример 2) Получение предварительно обработанной целлюлазы

[Получение предварительно обработанной целлюлозы 1]

Авицел (производства Merck), который является коммерчески доступным, использовали в качестве предварительно обработанной целлюлозы 1 в примерах, описанных ниже, без какой-либо обработки.

[Получение предварительно обработанной целлюлозы 2]

В качестве содержащей целлюлозу биомассы использовали рисовую солому. Содержащую целлюлозу биомассу вымачивали в 1% водном растворе серной кислоты и подвергали обработке, используя автоклав (производства Nitto Koatsu Co., Ltd.), при 150°C в течение 30 минут. Затем осуществляли разделение твердого вещества и жидкости, чтобы отделить обработанную серной кислотой целлюлозу от водного раствора серной кислоты (далее называемого «жидкостью после обработки разбавленной серной кислотой»). Затем обработанную серной кислотой целлюлозу смешивали с жидкостью после обработки разбавленной серной кислотой с перемешиванием так, чтобы концентрация твердого содержимого составляла 10% масс., и pH доводили примерно до 5, используя гидроксид натрия. Полученную смесь использовали в описанных ниже примерах в качестве предварительно обработанной целлюлозы 2.

[Получение предварительно обработанной целлюлозы 3]

В качестве целлюлозы использовали рисовую солому. Содержащую целлюлозу биомассу загружали в компактный реактор (производства Taiatsu Techno Corporation, TVS-N2 30 мл), и охлаждали жидким азотом. В указанный реактор пропускали газообразный аммиак и образец полностью замачивали в жидком аммиаке. Крышку реактора закрывали и реактор оставляли стоять при комнатной температуре примерно на 15 минут. Затем реактор выдерживали на масляной бане при 150°C в течение 1 часа. Затем реактор извлекали из водяной бани и газообразный аммиак выпускали в вытяжном шкафу с последующим вакуумированием внутри реактора до 10 Па с помощью вакуумного насоса, таким образом осуществляя сушку целлюлозы. Полученный продукт использовали в описанных ниже примерах в качестве предварительно обработанной целлюлозы 3.

[Получение предварительно обработанной целлюлозы 4]

В качестве содержащей целлюлозу биомассы использовали рисовую солому. Содержащую целлюлозу биомассу вымачивали в воде и подвергали обработке, используя автоклав (производства Nitto Koatsu Co., Ltd.), при 180°C в течение 20 минут с перемешиванием. Обработку осуществляли при давлении 10 МПа. После обработки осуществляли разделение твердого вещества и жидкости центрифугированием (3000 g), чтобы отделить обработанный компонент биомассы от компонента, представленного раствором (далее называемого «жидкостью после гидротермальной обработки»). Продукт использовали в описанных ниже примерах в качестве предварительно обработанной целлюлозы 4.

(Справочный пример 3) Измерение концентрации сахара

Концентрации глюкозы и ксилозы, содержащихся в водном растворе сахара, измеряли в условиях ВЭЖХ, описанных ниже, на основе сравнения со стандартными образцами.

Колонка: Luna NH₂ (производства Phenomenex, Inc.)

Подвижная фаза: MilliQ: ацетонитрил = 25:75 (расход 0,6 мл/минуту)

Реакционный раствор: нет

Способ регистрации: RI (дифференциальный показатель преломления)

Температура: 30°C

(Справочный пример 4) Измерение ферментативной активности выделенной из Trichoderma целлюлазы

Ферментативную активность выделенной из Trichoderma целлюлазы измеряли следующим способом.

1) Активность в разрушении кристаллической целлюлозы

К жидкому ферменту (полученному в ранее определенных условиях) добавляли авицел (производства Merck

) в концентрации 1 г/л и добавляли натрий-ацетатный буфер (рН 5,0) 100 мМ, затем полученной смеси давали возможность взаимодействовать при 50°C в течение 24 часов. Указанный реакционный раствор готовили в пробирке объемом 1 мл и реакции давали возможность протекать при перемешивании вращением в описанных выше условиях. Затем пробирку подвергали центрифугированию и измеряли концентрацию глюкозы в надосадочном компоненте. Измерение концентрации глюкозы осуществляли согласно способу, описанному в справочном примере 3. Концентрацию полученной глюкозы (г/л) использовали как таковую в качестве значения активности в разрушении авицела.

2) Активность в разрушении целлобиозы

К жидкому ферменту добавляли целлобиозу (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в концентрации 500 мг/л и добавляли натрий-ацетатный буфер (pH 5,0) 100 мМ, затем полученной смеси давали возможность взаимодействовать при 50°C в течение 0,5 часа. Указанный реакционный раствор готовили в пробирке объемом 1 мл и реакции давали возможность протекать при перемешивании вращением в описанных выше условиях. Затем пробирку подвергали центрифугированию и измеряли концентрацию глюкозы в надосадочном компоненте. Измерение концентрации глюкозы осуществляли согласно способу, описанному в справочном примере 3. Концентрацию полученной глюкозы (г/л) использовали как таковую в качестве значения активности в разрушении целлобиозы.

3) Активность в разрушении ксилана

К жидкому ферменту добавляли ксилан (ксилан из березовой древесины, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в концентрации 10 г/л и добавляли натрий-ацетатный буфер (pH 5,0) 100 мМ, затем полученной смеси давали возможность взаимодействовать при 50°C в течение 4 часов. Указанный реакционный раствор готовили в пробирке объемом 1 мл и реакции давали возможность протекать при перемешивании вращением в описанных выше условиях. Затем пробирку подвергали центрифугированию и измеряли концентрацию ксилозы в надосадочном компоненте. Измерение концентрации ксилозы осуществляли согласно способу, описанному в справочном примере 3. Концентрацию полученной ксилозы (г/л) использовали как таковую в качестве значения активности в разрушении ксилозы.

(Сравнительный пример 1)

В качестве сравнительного примера жидкий сахар получали из целлюлозы, как описано ниже, без осуществления первичного гидролиза или вторичного гидролиза.

[Стадия 1: Гидролиз]

К каждой из предварительно обработанных целлюлоз 1-4 (1 г каждой) добавляли 0,2 мл (количество белка 10 мг) свежего фермента, описанного в справочном примере 1 (концентрация белка 50 мг/мл) и дополнительно добавляли раствор фермента, регенерированного способом, который описан далее в разделе «Стадия 2». Затем добавляли дистиллированную воду так, чтобы масса полученного раствора была 10 г. Композицию переносили в реактор с боковым отводом (φ30 NS14/23, производства Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), затем осуществляли гидролиз при 50°C в течение 19 часов с инкубацией и перемешиванием (компактная механическая мешалка CPS-1000 производства Tokyo Rikakikai Co., Ltd., конверсионный адаптер, загрузочное отверстие с трехходовым запорным краном, инкубатор MG-2200).

[Стадия 2: Разделение твердого вещества и жидкости и извлечение фермента (регенерированного фермента) из жидкого сахара]

Гидролизат на стадии 1 подвергали разделению твердого вещества и жидкости центрифугированием (4500 g, 10 минут) и разделяли на жидкий сахар и остаток. Концентрации глюкозы и ксилозы в жидком сахаре измеряли способом, описанным в справочном примере 3, и вычисляли количество полученных сахаров.

Жидкий сахар затем подвергали фильтрованию через мембрану (Steriflip-GP, производства Millipore, материал: PES). Полученный надосадок наносили на ультрафильтрационную мембрану, имеющую предел отсечения по молекулярной массе 10000 (VIVASPIN 20, производства Sartorius stedim biotech, материал: PES) и центрифугировали при 4500 g вплоть до уменьшения мембранной фракции до 1 мл. К мембранной фракции добавляли 10 мл дистиллированной воды и полученную смесь снова центрифугировали при 4500 g вплоть до уменьшения мембранной фракции до 1 мл. Затем фермент извлекали из мембранной фракции, получая регенерированный фермент. Регенерированный фермент повторно использовали для гидролиза на стадии 1, которая описана выше.

В данном сравнительном примере стадию 1 и стадию 2 осуществляли, используя периодическое повторение, регенерируя и повторно используя целлюлазу. Цикл, состоящий из стадии 1 и стадии 2, повторяли всего 6 раз, чтобы осуществить регенерацию и повторное использование. Нулевую реакцию, в которой не проводили регенерацию и повторное использование, осуществляли следующим способом.

[Стадия 0: Нулевой гидролиз]

К каждой предварительно обработанной целлюлозе 1-4 (1 г каждой) добавляли 0,3 мл (количество белка 15 мг) свежего фермента (концентрация белка 50 мг/мл) (регенерированный фермент не добавляли, так как это был нулевой гидролиз). Затем добавляли дистиллированную воду так, чтобы масса полученного раствора составляла 10 г. Композицию переносили в реактор с боковым отводом (φ30 NS14/23, производства Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), затем осуществляли гидролиз при 50°C в течение 19 часов с инкубацией и перемешиванием (компактная механическая мешалка CPS-1000 производства Tokyo Rikakikai Co., Ltd., конверсионный адаптер, загрузочное отверстие с трехходовым запорным краном, инкубатор MG-2200). Посредством разделения полученного гидролизата способом, описанным выше в разделе «Стадия 2», получали регенерированный фермент. На этом этапе измеряли концентрации глюкозы и ксилозы в жидком сахаре.

В таблице 1 суммированы концентрации глюкозы (Glc, г/л) и концентрации ксилозы (Xyl, г/л) в жидком сахаре, полученном в реакциях, в которых стадии 0 и 2 осуществляли один раз и стадии 1 и 2 осуществляли всего 6 раз. По мере увеличения количества раз регенерации и повторного использования количество глюкозы (Glc) и ксилозы (Xyl) снижалось. Кроме того, было обнаружено, что эффективность получения сахара постепенно снижается по мере увеличения количества раз повторного использования (N).

[Таблица 1]
	0-й гидролиз	1-й гидролиз	2-й гидролиз	3-й гидролиз	4-й гидролиз	5-й гидролиз	6-й гидролиз
Предварительно обработанная целлюлоза 1	Glc	42	39	37	35	31	30	27
Xyl	1	0,8	0,7	0,6	0,4	0,4	0,3
Предварительно обработанная целлюлоза 2	Glc	32	30	28	27	25	23	20
Xyl	7	4	3	2	0,9	0,6	0,3
Предварительно обработанная целлюлоза 3	Glc	40	35	31	28	25	24	22
Xyl	12	10	9	7	6	4	4
Предварительно обработанная целлюлоза 4	Glc	25	23	22	20	18	18	15
Xyl	4	2	2	1	0,4	0,2	0,1

(Пример 1)

В качестве примера целлюлозу подвергали первичному гидролизу и вторичному гидролизу, как описано ниже, чтобы получить жидкий сахар.

[Стадия 1: Первичный гидролиз]

К каждой предварительно обработанной целлюлозе 1-4 (1 г каждой) добавляли дистиллированную воду и добавляли регенерированный фермент, который регенерировали способом, описанным далее в разделе «Стадия 3», затем дополнительно добавляли дистиллированную воду так, чтобы общая масса составляла 10 г. Композицию переносили в реактор с боковым отводом (φ30 NS14/23, производства Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), затем осуществляли гидролиз при 50°C в течение 1 часа с инкубацией и перемешиванием (компактная механическая мешалка CPS-1000 производства Tokyo Rikakikai Co., Ltd., конверсионный адаптер, загрузочное отверстие с трехходовым запорным краном, инкубатор MG-2200).

[Стадия 2: Вторичный гидролиз]

К первичному гидролизату со стадии 1 добавляли 0,2 мл (количество белка 10 мг) свежего фермента, описанного в справочном примере 1 (концентрация белка 50 мг/мл) и реакции давали возможность протекать при 50°C в течение 18 часов.

[Стадия 3: Разделение твердого вещества и жидкости и извлечение фермента (регенерированного фермента) из жидкого сахара]

Вторичный гидролизат на стадии 3 подвергали разделению твердого вещества и жидкости центрифугированием (4500 g, 10 минут), и разделяли на жидкий сахар и остаток. Концентрации глюкозы и ксилозы в жидком сахаре измеряли способом, описанным в справочном примере 3, и вычисляли в виде сахаров, получаемых N-ый раз. Жидкий сахар затем подвергали фильтрованию через мембрану (Steriflip-GP, производства Millipore, материал: PES) и полученный надосадок наносили на ультрафильтрационную мембрану, имеющую предел отсечения по молекулярной массе 10000 (VIVASPIN 20, производства Sartorius stedim biotech, материал: PES) и центрифугировали при 4500 g вплоть до уменьшения мембранной фракции до 1 мл. К мембранной фракции добавляли 10 мл дистиллированной воды и полученную смесь снова центрифугировали при 4500 g вплоть до уменьшения мембранной фракции до 1 мл. Затем фермент извлекали из мембранной фракции, получая регенерированный фермент. Регенерированный фермент повторно использовали для гидролиза на стадии 1, которая описана выше.

В данном примере стадию 1 и стадию 2 осуществляли, используя периодическое повторение, регенерируя и повторно используя целлюлазу. Цикл, состоящий из стадий 1-3, повторяли всего 6 раз, чтобы осуществить регенерацию и повторное использование. Нулевую реакцию, в которой не проводили регенерацию и повторное использование, осуществляли следующим способом.

[Стадия 0: Нулевой гидролиз]

К каждой предварительно обработанной целлюлозе 1-4 (1 г каждой) добавляли 0,3 мл (количество белка 15 мг) свежего фермента (концентрация белка 50 мг/мл) (регенерированный фермент не добавляли, так как это был нулевой гидролиз). Затем добавляли дистиллированную воду так, чтобы масса полученного раствора составляла 10 г. Композицию переносили в реактор с боковым отводом (φ30 NS14/23, производства Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), затем осуществляли гидролиз при 50°C в течение 19 часов с инкубацией и перемешиванием (компактная механическая мешалка CPS-1000 производства Tokyo Rikakikai Co., Ltd., конверсионный адаптер, загрузочное отверстие с трехходовым запорным краном, инкубатор MG-2200). Посредством разделения полученного гидролизата способом, описанным выше в разделе «Стадия 3», получали регенерированный фермент. На этом этапе измеряли концентрации глюкозы и ксилозы в жидком сахаре.

В таблице 2 суммированы концентрации глюкозы (Glc, г/л) и концентрации ксилозы (Xyl, г/л) в жидком сахаре, полученном в реакциях, в которых стадии 0 и 3 осуществляли один раз и стадии 1-3 осуществляли всего 6 раз. По мере увеличения количества раз регенерации и повторного использования количество глюкозы (Glc) и ксилозы (Xyl) снижалось. Кроме того, было подтверждено, что количество получаемого сахара постепенно увеличивалось в отличие от случаев, описанных в ссылочном примере 1 (таблица 1).

[Таблица 2]
	0-й гидролиз	1-й гидролиз	2-й гидролиз	3-й гидролиз	4-й гидролиз	5-й гидролиз	6-й гидролиз
Концентрация сахара (г/л) в предварительно обработанной целлюлозе 1	Glc	42	42	43	45	47	48	49
Xyl	1	1	1	1	1,1	1,1	1,2
Концентрация сахара (г/л) в предварительно обработанной целлюлозе 2	Glc	32	32	33	33	34	36	39
Xyl	7	6	6	7	8	9	10
Концентрация сахара (г/л) в предварительно обработанной целлюлозе 3	Glc	32	30	33	34	35	38	40
Xyl	7	6	6	7	8	10	11
Концентрация сахара (г/л) в предварительно обработанной целлюлозе 4	Glc	25	24	24	25	25	26	26
Xyl	4	3	3	3	3	5	5

В данном примере первичный гидролиз с использованием регенерированного фермента осуществляли в течение 1 часа, и вторичный гидролиз после добавления свежего фермента осуществляли в течение 18 часов, при этом реакцию гидролиза осуществляли в течение 19 часов как в сравнительном примере 1. Кроме того, количество добавляемого свежего фермента было таким же, как в сравнительном примере 1. Поэтому в данном примере показано, что при осуществлении периодического повторения стадий: 1) добавления регенерированного фермента к предварительно обработанной целлюлозе, чтобы осуществить первичный гидролиз; 2) добавления свежего фермента к гидролизату, чтобы осуществить вторичный гидролиз; и 3) подвергания гидролизата разделению твердого вещества и жидкости для получения регенерированного фермента из полученного жидкого сахара; концентрация сахара, полученного при использовании регенерации и повторного использования, то есть эффективность получения сахара может быть выше, чем в сравнительном примере.

(Пример 2) Измерение количества добавленного регенерированного фермента в первичном гидролизе

Концентрацию белка регенерированного фермента, добавляемого для первичного гидролиза в примере 1, анализировали с помощью набора для измерения BCA (набор реагентов для анализа белка BCA производства PIERCE), используя бычий альбумин (2 мг/мл) в качестве стандартного образца, измеряя оптическую плотность при 562 нм для осуществления колориметрии. В таблице 3 суммированы данные, касающиеся регенерации/повторного использования фермента в случае предварительно обработанной целлюлозы 2, о взаимосвязи между количеством регенерированного фермента, получаемого при N-ой регенерации, и количеством добавляемого свежего фермента. Учитывая данные о количестве получаемой глюкозы, суммированные в таблице 2 в примере 1, настоящим примером можно подтвердить, что количество получаемой глюкозы может быть дополнительно увеличено, если взаимосвязь: количество добавляемого фермента при первичном гидролизе > количества добавляемого фермента при вторичном гидролизе; и, кроме того, взаимосвязь: количество регенерированного фермента, повторно используемого для первичного гидролиза, > количества свежего фермента, добавляемого для вторичного гидролиза; удовлетворяются, как в случаях 4-ой и последующей регенерации/повторного использования.

[Таблица 3]
	0-й гидролиз	1-й гидролиз	2-й гидролиз	3-й гидролиз	4-й гидролиз	5-й гидролиз	6-й гидролиз
Количество белка в регенерированном ферменте (мг)	-	7	8,4	9,3	11	12	14
Количество белка в свежем ферменте (мг)	15	10	10	10	10	10	10
Концентрация глюкозы в предварительно обработанной целлюлозе 2 (г/л)	32	32	33	33	34	36	39

(Пример 3) Ферментативная активность регенерированного фермента

Активность регенерированного фермента измеряли в случаях предварительно обработанной целлюлозы 3 (сравнительный пример 1: случай, когда регенерированный фермент подавали одновременно со свежим ферментом; пример 1: случай, когда регенерированный фермент добавляли для осуществления первичного гидролиза, после которого подавали свежий фермент). Ферментативную активность измеряли согласно справочному примеру 3 для 3 типов разрушающей активности, то есть 1) активность, разрушающую кристаллическую целлюлозу, 2) активность, разрушающую целлобиозу, и 3) активность, разрушающую ксилан. Каждую разрушающую активность выражали в виде относительного значения (%) ферментативной активности регенерированного фермента, принимая ферментативную активность свежего фермента (10 мг) за 100(%). Активности регенерированных ферментов после 2-ой регенерации и 4-ой регенерации показаны в таблице 4 (пример 1) и таблице 5 (сравнительный пример 1).

[Таблица 4]
	Свежий фермент (10 мг)	Регенерированный фермент
2-й гидролиз	4-й гидролиз
Активность в разрушении кристаллической целлюлозы	100	84	110
Активность в разрушении целлобиозы	100	94	114
Активность в разрушении ксилана	100	154	250

[Таблица 5]
	Свежий фермент (10 мг)	Регенерированный фермент
2-й гидролиз	4-й гидролиз
Активность в разрушении кристаллической целлюлозы	100	74	80
Активность в разрушении целлобиозы	100	80	84
Активность в разрушении ксилана	100	114	106

Было обнаружено, что по мере того, как количество раз первичного гидролиза увеличивается, все активности: разрушающая кристаллическую целлюлозу, разрушающая целлобиозу активность и разрушающая ксилан активность, имеют тенденции увеличиваться, и такая тенденция особенно заметна в случае разрушающей ксилан активности. Поскольку выделенные из Trichoderma ксиланаза и ксилозидаза особенно вовлечены в разрушающую ксилан активность, предполагается, что эффективность регенерации таких ферментов возрастала с увеличением количества раз проведения первичного гидролиза.

(Пример 4) Агрегированный выделенный из Trichoderma целлюлазный компонент, который содержится в регенерированном ферменте

Обнаружено, что при 4-ой и последующей регенерации не растворимый в воде компонент образуется в регенерированном ферментном компоненте, который извлекают в виде не проникающего через ультрафильтрационную мембрану жидкости. Такой не растворимый в воде выделенный из Trichoderma целлюлазный компонент анализировали следующим способом.

Используя предварительно обработанную целлюлозу 3, первичный гидролиз и вторичный гидролиз осуществляли способом, описанным в примере 1, и анализировали регенерированный ферментный компонент, полученный при 4-ой регенерации. Регенерированный фермент (100 мкл) помещали в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 5 минут. Затем надосадок удаляли, получая осадок на дне пробирки. Осадок промывали, добавляя чистую воду 100 мкл, и в пробирку добавляли буфер для приготовления образца (EZ Apply, АТТО Corporation) с последующим осуществления анализа в SDS-ПААГ (e-PAGEL; концентрация геля 15%; АТТО Corporation). Окрашивание осуществляли с использованием Кумасси бриллиантового синего (BioSafecoomassie Stain, Bio-Rad Laboratories). Для измерения молекулярной массы использовали маркер молекулярной массы (PrecisionPlus Protein Standard, Kaleidoscope, Bio-Rad Laboratories).

Полученный результат анализа в SDS-ПААГ показан на фиг.11. Так как компонент имел молекулярную массу примерно 50-60 кД, было выявлено, что в качестве основного компонента содержалась выделенная из Trichoderma целлобиогидролаза (фиг.11).

(Пример 5) Влияние не растворимого в воде выделенного из Trichoderma. целлюлазного компонента в качестве компонента регенерированного фермента

Фермент извлекали из мембранной фракции на стадии 3 примера 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3), получая регенерированный фермент, который затем центрифугировали при 15000 об/мин в течение 5 минут. В качестве регенерированного фермента повторно использовали только полученный надосадок, и наблюдаемый в результате выход сахара сравнивали с результатами, полученными в примере 1. То есть, в примере 5 описано повторное использование регенерированного фермента, из которого был удален не растворимый в воде выделенный из Trichoderma целлюлазный компонент.

[Таблица 6]
	0-й гидролиз	1-й гидролиз	2-й гидролиз	3-й гидролиз	4-й гидролиз	5-й гидролиз	6-й гидролиз
Предварительно обработанная целлюлоза 3 (Пример 1)	Glc	32	30	33	34	35	38	40
Xyl	7	6	6	7	8	10	11
Предварительно обработанная целлюлоза 3	Glc	32	32	32	31	31	30	30
Xyl	7	6	6	7	6	6	6

То есть, было выявлено, что в случаях, когда не растворимый в воде выделенный из Trichoderma целлюлазный компонент, находящийся в качестве регенерированного фермента, не удален, может быть получена более высокая производительность сахара при следующем повторном использовании фермента.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

С применением настоящего изобретения жидкий сахар может быть эффективно получен из целлюлозы, и получаемая целлюлоза может быть использована в качестве содержащего сахар материала для различных продуктов ферментации.

ОПИСАНИЕ СИМВОЛОВ

1 Резервуар для гидролиза

2 Термостат

3 Лопасть для перемешивания

4 Труба для подачи регенерированного фермента

5 Резервуар, удерживающий регенерированный фермент

6 Труба для подачи свежего фермента

7 Канал для ввода целлюлозы

8 Резервуар, удерживающий свежий фермент

9 Устройство для фильтр-прессования

10 Компрессор

11 Труба для подачи воды

12 Резервуар для жидкого сахара

13 Циркуляционный насос

14 Устройство, имеющее ультрафильтрационную мембрану

15 Циркуляционная труба

16 Труба для регенерированного фермента

17 Труба для подачи смеси целлюлозы/регенерированного фермента

18 Устройство для смешивания целлюлозы/регенерированного фермента

19 Устройство для разделения твердого вещества и жидкости

20 Выпускная труба для твердых веществ

21 Трехходовой клапан

22 Устройство с микрофильтрационной мембраной

23 Резервуар для фильтрата после разделения твердого вещества и жидкости

24 Насос

25 Микрофильтрационная мембрана

26 Устройство для подачи сжатого воздуха

27 Насос для реверсивной промывки

28 Резервуар для концентрирования жидкого сахара

29 Насос высокого давления

30 Устройство с обратноосмотической мембраной и/или нанофильтрационной мембраной

31 Трехходовой клапан

1. Способ получения жидкого сахара в результате повторения способа получения жидкого сахара, включающего в себя стадии (1)-(3), два или более раза, указанные ниже:
(1) стадию добавления целлюлазы выделенной из нитчатого гриба, принадлежащего роду Trichoderma, к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза;
(2) стадию добавления свежей выделенной из нитчатого гриба целлюлазы к гидролизату со стадии (1) для осуществления вторичного гидролиза; и
(3) стадию, на которой гидролизат со стадии (2) подвергают разделению твердого вещества и жидкости, получая жидкий сахар, из которого получают регенерированный фермент;
при этом указанный регенерированный фермент, получаемый на стадии (3), используют для стадии (1) следующего и последующих процессов получения жидкого сахара, где время реакции первичного гидролиза на стадии (1) находится в пределах от 15 минут до 6 часов и где время реакции вторичного гидролиза находится в пределах от 1 до 200 часов.

2. Способ получения жидкого сахара по п. 1, в котором указанный регенерированный фермент содержит ксиланазу и/или ксилозидазу.

3. Способ получения жидкого сахара по п. 1, в котором указанный регенерированный фермент содержит не растворимую в воде выделенную из нитчатого гриба целлюлазу.

4. Способ получения жидкого сахара по п. 1, в котором указанная целлюлоза представляет собой обработанный продукт, полученный в результате подвергания содержащей целлюлозу биомассы щелочной обработке, гидротермальной обработке или обработке разбавленной серной кислотой.

5. Способ получения жидкого сахара по п. 1, в котором количества ферментов, добавляемых при первичном гидролизе и указанном вторичном гидролизе, удовлетворяют следующему соотношению: количество указанного регенерированного фермента, добавляемого на стадии (1), > количества указанного свежего фермента, добавляемого на стадии (2).

6. Способ получения жидкого сахара по п. 1, в котором регенерацию указанной выделенной из нитчатого гриба целлюлазы на стадии (3) осуществляют фильтрованием указанного жидкого сахара через ультрафильтрационную мембрану и извлечением указанной целлюлазы со стороны подачи.

7. Устройство для осуществления способа получения жидкого сахара по пп. 1-6, где устройство содержит в качестве составляющих: резервуар для гидролиза, с которым соединены труба для подачи регенерированного фермента и труба для подачи свежего фермента; устройство для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата; резервуар для жидкого сахара, имеющий трубу подачи воды для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для разделения фермента и жидкого сахара.

8. Устройство для осуществления способа получения жидкого сахара по пп. 1-6, где устройство содержит в качестве составляющих: устройство смешивания целлюлозы/регенерированного фермента для смешивания регенерированного фермента и целлюлозы для осуществления первичного гидролиза; резервуар для гидролиза, с которым соединены труба для подачи смеси целлюлозы/регенерированного фермента и труба для подачи свежего фермента; устройство для разделения твердого вещества и жидкости гидролизата; резервуар для жидкого сахара, имеющий трубу подачи воды для промывки ультрафильтрационной мембраны и/или для удаления регенерированного фермента, оставшегося в циркуляционной трубе; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для разделения фермента и жидкого сахара.

9. Устройство для получения жидкого сахара согласно способу по п. 1, где устройство представляет собой устройство по п. 7 или 8, дополнительно содержащее устройство (устройства) с обратноосмотической мембраной и/или нанофильтрационной мембраной для концентрирования указанного жидкого сахара.