Мутант пенициллинацилазы из e.coli с улучшенными свойствами



Владельцы патента RU 2564578:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой мутант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из E.coli, содержащий замену остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента в позиции 484 (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина. Изобретение позволяет получить пенициллинацилазу с улучшенными каталитическими свойствами. 2 табл., 2 пр.

 

Пенициллинацилаза из разных источников используется в фармацевтической промышленности при получении полусинтетических β-лактамных антибиотиков [1]. Широкая субстратная специфичность и стереоселективность могут дать возможность применения пенициллинацилазы в тонком органическом синтезе для получения энантиомеров α-, β-, γ-аминокислот и их элементоорганических аналогов [2] для высокоэффективного стереоселективного ацилирования аминосоединений в водной среде и получения энантиомерно чистых соединений [WO 02/20820, WO 02/20821, 3]. Высокий биокаталитический потенциал пенициллинацилазы делает ее перспективным объектом биоинженерии для создания биокатализаторов с улучшенными свойствами. Одним из основных путей улучшения свойств пенициллинацилазы является получение ее мутантных форм путем замены одной или нескольких аминокислотных остатков в структуре фермента данного типа, приводящей к улучшению каталитических свойств фермента.

В научных публикациях описаны мутации по целому ряду аминокислотных остатков прокариотических пенициллинацилаз. Основные данные изложены в обзоре [4], а также в более поздних и не вошедших в данный обзор работах [5-18]. Задачи, которые пытаются решить исследователи, вводя мутации в структуру пенициллинацилазы, - это увеличение эффективности ферментативного синтеза β-лактамных антибиотиков [9, 12, 13], улучшение специфичности и стереоспецифичности пенициллинацилазы [12, 13], увеличение стабильности пенициллинацилазы [8, 14, 16], изучение механизма процессинга пенициллинацилазы [17, 18].

Несмотря на то, что в литературе описано довольно много различных вариантов мутаций пенициллинацилазы, лишь немногие из них позволили улучшить субстратную специфичность и каталитические свойства фермента.

Показательными являются мутантные варианты пенициллинацилазы из E.coli и K.citrophila по положению βF71, с измененной специфичностью по отношению к ацильной части субстратов, впервые способные катализировать гидролиз адипил- и глутарил-L-лейцина [19, 20]. Однако «оборотной стороной» такой мутации в пенициллинацилазе является драматическое снижение активности по отношению к природным субстратам пенициллину G и V по сравнению с ферментом дикого типа.

Варианты пенициллинацилазы из E.coli по положениям αR145 и αF146 в 2-4 раза эффективнее катализируют синтез пенициллина и ампициллина методом ацильного переноса по сравнению с диким типом [6, 21, 22]. Наибольший эффект характерен для мутантов aR145G/S/L.

Представляет интерес мутация bF24A, посредством которой можно добиться увеличения выхода в реакциях синтеза ампициллина, амоксициллина, цефалексина и цефадроксила за счет увеличения соотношения скоростей синтеза и гидролиза [22]. Однако этот эффект достигается на фоне существенного снижения каталитической активности фермента (не более 1,6% каталитической активности пенициллинацилазы из E.coli дикого типа).

Патентная литература по получению мутантов пенициллинацилазы из прокариот с целью улучшения ее каталитических свойств также охватывает широкий круг мутаций. В основном, улучшение свойств направлено на увеличение эффективности синтеза β-лактамных антибиотиков.

В патентах [WO 9605318 и US 6033823], принадлежащих одной группе авторов, заявлено изменение субстратной специфичности и активности пенициллинацилазы из прокариот мутацией аминокислотных остатков по значительному числу сайтов альфа-цепи (α139-152) и бета- цепи (β20-27, β31, β32, β49-52, β56, β57, β65-72, β154-157, β173-179, β239-241, β250-263, β379-387, β390, β455, β474-480), хотя патенты основаны лишь на нескольких примерах влияния мутаций по отдельным положениям αM143, αF147, βL56, βA67, βl177 в пенициллинацилазе из Alcaligenes faecalis на способность фермента катализировать гидролиз природных пенициллинов G и V, а также синтез ампициллина.

В патентах [WО 9820120, US 6403356] круг вариантов пенициллинацилазы из Е. coli существенно сужен и ограничен мутациями по сайтам αM142, αF146, βF24, βV56, βl177.

Приоритетные права данных патентов ограничиваются способом получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способом получения β-лактамных антибиотиков ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот. Наиболее значительный эффект дала мутация по сайту β24 при замене L-фенилаланина на L-аланин, позволившая увеличить выход в синтезе пенициллинов и цефалоспоринов при использовании сложных эфиров в качестве ацильного донора. Существенно, что данная улучшенная мутантная форма фермента позволяет использовать амиды в качестве ацильных доноров.

В патенте [US 2005124029] авторы заменяли в пенициллинацилазе из E.coli аминокислотный остаток αR145 на L, K, или C. Для мутанта αR145L выход антибиотика в синтезе цефалексина увеличился с 70 до 81% в слабощелочных условиях, однако при этом наблюдалась существенная (более 10 раз) потеря каталитической активности.

В патенте [WO 2010072765] заявлены мутации в положениях α3, α77, α90, α144, α192, β24, β109, β148, β313, β460, β488 пенициллинацилазы из E.coli, предпочтительно мутации αM90K, αN144S, αV192E, βF24L, βK109R, βV148L, βS313N, βF460L, βF488L, а также находящие соответствие в прокариотических ПА. Авторы патента делают акцент на многоточечных заменах, содержащих мутацию βF24L либо βF460L в сочетании с любыми из вышеперечисленных мутаций. Заявленные авторами варианты пенициллинацилазы обладают улучшенными свойствами в синтезе полусинтетических β-лактамных антибиотиков, в частности амоксициллина, ампициллина, цефалексина, цефадроксила и цефрадина, и позволяют повысить выход в синтезе амоксициллина до 90-95% относительно 6-аминопенициллановой кислоты.

В патенте [WO 2010054319] заявлены варианты пенициллинацилаз, содержащие изменения в аминокислотной последовательности в позициях 24, 28, 31, 56, 71, 74, 547, 697, 701. Полученные мутанты обладают повышенной стереоселективностью по отношению к α-положению ацильной группы метилового эфира α-гидрокси-фенилуксусной кислоты, улучшенным соотношением синтез/гидролиз в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина из сложных эфиров, а также повышенной термостабильностью и стабильностью в водно-органических средах по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа из K.Citrophila.

Технической задачей настоящего изобретения является создание пенициллинацилазы с улучшенными каталитическими свойствами, в частности с повышенной каталитической активностью, стереоселективностью, операционной стабильностью в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и эфиров, а также их применение для проведения биокаталитических превращений.

Техническим результатом изобретения является создание пенициллинацилазы с увеличенной каталитической эффективностью, стереоизбирательностью и операционной стабильностью в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и эфиров, а также их применение для проведения биокаталитических превращений, в том числе для получения функционализированных и энантиомерно чистых соединений, в частности с целью получения так называемых ядер бета-лактамных антибиотиков 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот, β-лактамных антибиотиков.

Указанный технический результат достигается путем внесения изменений в структуру пенициллинацилазы, а именно путем замены аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента, соответствующего позиции β484 пенициллинацилазы из E.coli.

Наиболее близкими аналогами настоящего изобретения являются патенты [WO 9820120, US 6403356, US 2005124029], описанными выше.

В научной и патентной литературе нет данных о получении пенициллинацилазы с улучшенными каталитическими свойствами путем замены аминокислотного остатка 484. Полученное улучшение каталитических свойств, заявленное в настоящем патенте, не вытекает с очевидностью из известной структуры пенициллинацилазы и ее функций.

Настоящее изобретение относится к области инженерной энзимологии и биотехнологии, а именно к получению и применению пенициллинацилазы из E.coli, полученной из предшественника фермента посредством замены аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента, соответствующего позиции 484, на другой аминокислотный остаток, в частности на аспарагин, любыми доступными методами генной инженерии, направленной эволюции или селекции.

Пенициллинацилаза по настоящему изобретению может применяться в качестве катализатора реакции конденсации ацильного донора и нуклеофила при получении амидов, пептидов, в частности бета-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи, или при получении энантиомерно чистых соединений.

Пенициллинацилаза по настоящему изобретению может применяться в качестве катализатора реакции гидролиза эфиров, амидов или пептидов, в частности бета-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи, при получении ценных продуктов, в частности энантиомерно чистых соединений, 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот.

В качестве ацильных доноров в ферментативных реакциях конденсации, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы карбоновые кислоты, их сложные эфиры и амиды, в частности амиды и эфиры аминокислот и их замещенных производных в α-положении и в ароматическом кольце предпочтительно амиды и эфиры R, S-фенилглицина.

В качестве нуклеофилов в ферментативных реакциях конденсации, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы амины, аминоспирты, аминокислоты, их эфиры, амиды и соответствующие элементоорганические аналоги, в частности 6-аминопенициллановая и 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислоты.

В качестве субстратов в ферментативных реакциях гидролиза, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы ацильные производные аминов, аминоспиртов, аминокислот, их эфиров и амидов, в частности природные антибиотики.

Пенициллинацилаза по изобретению может быть получена и использована в виде гомогенного препарата, раствора с содержанием других химических соединений или белков, мицелл, агрегатов, или в твердом состоянии в виде кристаллов, агрегатов или иммобилизированных в геле, на различных подложках и носителях препаратах, или применяется в виде культуры клеток.

Примеры улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы приведены ниже. Изменения в аминокислотную последовательность пенициллинацилазы из E.coli вводили путем конструирования мутантного гена методом сайт-специфического мутагенеза по методикам, описанным в литературе [6]. После процедур клонирования, культивирования, выделения и очистки были получены гомогенные препараты мутантов пенициллинацилазы.

Пример 1. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза цефалексина

Реакцию ферментативного синтеза цефалексина переносом ацильной группы на ядро антибиотика 7-аминодезацетоксицефалоспорановую кислоту проводили, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. При использовании варианта пенициллинацилазы βD484N наблюдается увеличение выхода продукта реакции от 1,5 до 1,9 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (см. табл. 1).

Таблица 1
Выход продукта реакции ферментативного синтеза цефалексина
[7-ADCA]/[D-PGA], mM Выход цефалексина, %
Дикий тип βD484N
200/200 40 60
200/400 39 73

Пример 2. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина

Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина переносом ацильной группы на глицин проводили в водной среде, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. Оказалось, что в случае варианта пенициллинацилазы βD484N выход продукта реакции увеличивается приблизительно в 4,7 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (табл. 2).

Таблица 2
Выход продукта в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина
Вариант пенициллинацилазы Выход D-фенилглицил-глицина, %
Дикий тип 17
βD484N 80

Описание экспериментальной части

Определение ферментативной активности

Активность вариантов пенициллинацилазы определяли спектрофотометрически по накоплению хромофора в процессе гидролиза 1 мМ раствора цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамидо)бензойной кислоты при 400 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 (Япония). Реакцию проводили при 25°C в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,5, 0,1 М KCl.

Определение концентрации активных центров. Абсолютную концентрацию активных центров каждой из мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием активных цетров фермента необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом по методике [23]. Остаточную ферментативную активность определяли спектрофотометрически по гидролизу цветного субстрата, как описано выше.

ВЭЖХ анализ

Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Perkin Elmer 200 Series (США); колонка Kromasil Eternity C18 (AkzoNobel, США), 250 x 4.6 мм, размер частиц 5 µм; подвижная фаза CH3CN/вода 30:70, 0,68 г/л KH2PO4, 0,1 г/л додецилсульфата натрия, pH 3,0; скорость потока 0,7 мл/мин; объем вкола 10 мкл; УФ детектирование при 210 нм.

Проведение реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина

Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 9,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200 мМ D-фенилглицина, 200 мМ глицина, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.

Проведение реакции ферментативного синтеза цефалексина

Реакцию ферментативного синтеза цефалексина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 8,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200-400 мМ D-фенилглицина и 200 мМ 7-дезацетокси-цефалоспорановой кислоты, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.

Литература

1. Bruggink, A., Roos, E.G., De Vroom, E. Penicillin acylase in the industrial production of (3-lactam antibiotics. Org. Process. Res. Dev. (1998) 2, 128-133.

2. Svedas, V.K., Savchenko, M.V., Beltser, A.I., Guranda, D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N.-Y. Acad. Sci. (1996) 799, 659-669.

3. Guranda, D.T., Khimiuk, A.I., van Langen, L.M., van Rantwijk, F., Sheldon, R.A., Svedas, V.K. An "easy-on, easy-off" protecting group for the enzymatic resolution of (±)-1-phenylethylamine in an aqueous medium. Tetrahedron: Asymm. (2004) 15(18), 2901-2906.

4. Rajendhran, J., Gunasekaran, P. Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G acylases. J. Biosci. Bioeng. (2004) 97, 1-13.

5.Gabor, E.M. and Janssen, D.B. in Protein Engineering, Design and Selection (2004) 17,571-579.

6. Jager, SAW., Shapovalova, I.V., Jekel, PA, Alkema, W.B.L, Svedas, V.K., Janssen, D.B. Saturation mutagenesis reveals the importance of residues a!phaR145 and alphaF146 of penicillin acylase in the synthesis of beta-lactam antibiotics. J. Biotechnol. (2008) 133, 18-26.

7. Wang, J., Zhang, Q., Huang, H., Yuan, Z., Ding, D., Yang, S., Jiang, W. Increasing synthetic performance of penicillin G acylase from Bacillus megaterium by site-directed mutagenesis. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 74, 1023-1030.

8. Polizzi, K.M., phaparro-Riggers, J.F., yazquez-Figueroa, E., Bommarius, A.S. Structure-guided consensus approach to create a more thermostable penicillin G acylase. Biotechnol. J. (2006) 1(5), 531-6.

9. Chandel, A.K., Rao, L.V, Narasu, M.L., Singh, O.V., The realm of penicillin G acylase in beta-lactam antibiotics. Enzyme Microb. Technol. (2008) 42, 199-207.

10. Prieto, I., Martin, J., Arche, R., Fernandez, P., Perez-Aranda, A., Barbero, J.L. Penicillin acylase mutants with altered site-directed activity from Kluyvera citrophila. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990) 33, 553-559.

11. Shi, Y.F., Soumillion, P., Ueda, M. Effects of catalytic site mutations on active expression of phage fused penicillin acylase. J. Biotechnol. (2010) 145, 139-142.

12. Carboni, С., Kierkels, H.G., Gardossi, L, Tamiola, K., Janssen, D.B., Quaedflieg, P.J. Preparation of D-amino acids by enzymatic kinetic resolution using a mutant of penicillin-G acylase from E.coli. Tetrahedron: Asymmetry (2006) 17, 245-251.

13. Alkema, W.B., Hensgens, C.M., Snijder, H.J., Keizer, E., Dijkstra, B.W., Janssen, D.B. Structural and kinetic studies on ligand binding in wild-type and active-site mutants of penicillin acylase. Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17, 473-480.

14. Abian, 0., Grazu, V., Hermoso, J., Gonzalez, R., Garcia, J.L., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J.M. Stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli: site-directed mutagenesis of the protein surface to increase multipoint covalent attachment. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70, 1249-1251.

15. Kasche, V., Galunsky, В., Ignatova, Z. Fragments of pro-peptide activate mature penicillin amidase ofAlcaligenesfaecalis. Eur. J. Biochem. (2003) 270, 4721-4728.

16. Wang, Т., Zhu, H., Ma, X., Ма, Y., Wei, D. Structure-based stabilization of an enzyme: the case of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. Protein Pept. Lett. (2006) 13, 177-183.

17. Choi, K.S., Kim, J.A., and Kang, H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J. Bacteriol. (1992) 174, 6270-6276.

18. Lee, H., Park, O.K., and Kang, H.S. Identification of a new activ site for autocatalytic processing of penicillin acylase precursor in Escherichia coli ATCC 11105. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 272, 199-204.

19. Forney, L.J., Wong, D.C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. (1989) 55(10), 2550.

20. Roa, A., Garcia, J.L, Salto, F., Cortes, E. Changing the substrate specificity of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila through selective pressure. Biochem. J. (1994), 303, P. 869.

21. Alkema, W.B., Hensgens, C.M., Kroezinga, E.H., de Vries, E., Floris, R., van der Laan, J.M., Dijkstra, B.W., Janssen, D.B. Characterization of the beta-lactam binding site of penicillin acylase of Escherichia coli by structural and site-directed mutagenesis studies. Protein Engineering (2000) 13(12), 857-863.

22. Alkema, W.B.L, Dijkhuis, A., de Vries, E., and Janssen, D.B. The role of hydrophobic activ-site residues in substrate specificity and acyi transfer activity of penicillin acylase. Eur. J. Biochem. (2002) 269, 2093-2100.

23. Швядас, В.К., Марголин, А.Л., Шерстюк, С.Ф., Березин, И.В. Инактивация пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонил фторида: кинетический анализ и титрование активных центров. Биоорган. химия (1977) 3, 546-553.

Мутант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из E.coli, содержащий замену остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента в позиции 484 (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к инженерной энзимологии, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к повышению эффективности биокаталитических превращений посредством применения мутантных форм ферментов с улучшенными каталитическими свойствами.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть применено при ферментативной реакции синтеза, а также для фиксации ферментов на носителе. .

Изобретение относится к области биохимии, в частности к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий дельта-9-элонгазной активностью, а также к очищенному полипептиду, обладающему дельта-9-элонгазной активностью, кодируемому вышеуказанной изолированной молекулой нуклеиновой кислоты.

Изобретение относится к области автоматизации биотехнологических процессов. Предложен способ управления процессом получения капсулированных ферментных препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ферментационной среде и способу получения рекомбинатных белков с использованием данной среды. Ферментационная среда для получения рекомбинантных белков, выбранных из группы, включающей Г-КСФ, стрептокиназу и липазу, с использованием микроорганизмов, выбранных из группы, включающей: E.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена нуклеиновая кислота, кодирующая белок, обладающий ацетил-СоА- карбоксилазной активностью, компенсирующей недостаток ацетил-СоА-карбоксилазной активности в дрожжах, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность: (a) кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (b) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, комплементарной SEQ ID NO:1; (c) SEQ ID NO:1; и (d) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок SEQ ID NO:2; где SEQ ID NO:1 и 2 раскрыты в описании.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической промышленности, и представляет собой способ получения комплексных мультиферментных препаратов с целлобиогидролазной, эндоглюканазной, β-глюкозидазной (целлобиазной) активностями путем культивирования рекомбинантных штаммов мицелиальных грибов рода Penicillium verruculosum, трансформированных линейной фьюжн-конструкцией, представляющей собой последовательно соединенные через линкер гомологичные и гетерологичный гены карбогидраз, таких как целлобиогидролаза I, эндоглюканаза и бета-глюкозидаза.

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к биосинтезу гидролазы пептидогликана, и представляет собой белок с активностью гидролазы пептидогликана, плазмиду, содержащую фрагмент, кодирующий гидролазу пептидогликана, бактерию-продуцент, способ микробиологического синтеза гидролазы пептидогликана, а также фармацевтическую композицию, содержащую полученную гидролазу пептидогликана, для терапии заболеваний, вызванных грамотрицательной микрофлорой.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются вектора, клетки-хозяина, содержащего вектор, генетически модифицированного микроорганизма Clostridium thermocellum, способа получения такого микроорганизма и способа преобразования лигноцеллюлозной биомассы в этанол.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой способ получения лизогликолипида, включающий обработку субстрата, содержащего гликолипид, по меньшей мере одним липолитическим ферментом для получения указанного лизогликолипида, где указанный липолитический фермент обладает гликолипазной активностью и где указанный липолитический фермент получают из рода Thermobifida, где липолитический фермент содержит любую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:5, 7 или 16 или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична им, или кодируется любой нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:6 или 17 или нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 70% идентична им.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к использованию бета-галактозидазы AsBgl_1390 из археи Acidilobus saccharovorans в качестве бета-глюкозидазы, бета-ксилозидазы и бета-маннозидазы.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ определения у спортсмена состояния утомления и состояния «перетренированности» по повышенной экспрессии гена триптофинил-тРНК-синтетазы (ТРСазы).
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способу улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы. Заявленный способ включает изменение структуры пенициллинацилазы из Escherichia coli путем замены аминокислотного остатка 145 альфа-цепи на лейцин или аминокислотного остатка 71 бета-цепи на лейцин или аргинин. Способ приводит к улучшению каталитической активности пенициллинацилазы в реакциях стереоселективного ацилирования первичных аминогрупп химических соединений и стереоселективного гидролиза N-ацильных производных первичных аминосоединений. 6 табл., 5 пр.

Изобретение относится к медицине и заключается в безводной композиции для обработки ран, композиция содержит гидрофильную дисперсную фазу, включающую ПЭГ 400 и коллагеназу; и гидрофобную непрерывную фазу, включающую гидрофобную основу; при этом гидрофильная дисперсная фаза диспергирована в гидрофобной непрерывной фазе; количество ПЭГ 400 составляет 13-27% масс. В вариантах осуществления изобретения используется также ПЭГ 600 или Полоксамер 124 в количестве 20-40% масс. Технический результат заключается в улучшении ферментативной активности композиции. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 9 пр., 13 табл., 10 ил.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа активации теломеразы, удлинения теломер и увеличения потенциала клеточного деления, включающего введение композиции, содержащей соединение, такое как циклоастрагенол, и, по меньшей мере, один пептид тимуса, выбранный из группы дипептида, трипептида, тетрапептида или пентапептида, и/или пептид эпифиза, выбранный из группы дипептида, трипептида, тетрапептида или пентапептида. Группа изобретений также касается композиции, предназначенной для активации теломеразы, удлинения теломер и увеличения потенциала клеточного деления; применения указанной композиции для производства средства, предназначенного для профилактики и/или лечения состояний, для которого является полезной активация теломеразы, удлинение теломер и увеличение потенциала клеточного деления. Группа изобретений обеспечивает активацию теломеразы, удлинение теломер и увеличение потенциала клеточного деления. 3 н. и 27 з.п. ф-лы, 9 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения усеченной формы тритикаина-альфа пшеницы, имеющей последовательность SEQ ID NO: 2 (shortTRIT-α), рекомбинантно экспрессирующейся в бактериальной системе, заключающийся в том, что проводят культивирование клеток E. coli JM109, трансформированных плазмидой pQE80L_shortTRIT-α, содержащей последовательность ДНК, кодирующей белок shortTRIT-α, в среде LB с добавлением ампициллина при 37°С в аэробных условиях в течение 12-14 ч, посевным материалом инокулируют питательную среду, растят культуру до достижения оптической плотности А600 0.6-0.8, индуцируют 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозидом и растят еще 2.5-3 часа; очистку целевого белка shortTRIT-α проводят методом аффинной металл-хелатной хроматографии: осажденную центрифугированием клеточную биомассу экспрессионной культуры ресуспендируют в буфере, содержащем 0.01 М Трис-HCl, рН 8.0 и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин при 4°С, полученный после центрифугирования лизата осадок промывают исходным буфером и растворяют в буфере А, состоящем из 6 М гуанидин-хлорида и 0.05 М Трис-HCl, рН 7.8, раствор осветляют центрифугированием и наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А, сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А и тем же буфером с содержанием 8 М мочевины и 0.005 М имидазола, белок элюируют буфером А с содержанием 8 М мочевины и 0.25 М имидазола, затем элюат добавляют в охлажденный буфер 0.05 М Трис-HCl, 0.5 М аргинин-хлорид, 2 М мочевина, рН 7.8 в соотношении 1:5 и перемешивают 1 ч при 4°С, раствор диализуют против 0.05 М Трис-HCl, рН 7.8 при 4°С, супернатант, полученный после центрифугирования диализата, концентрируют на ячейке Amicon с мембраной РМ-10 (Millipore), с последующим диализом против фосфатно-солевого буфера PBS, рН 7.4, при 4°С, определяют концентрацию белка shortTRIT-α, аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют. Изобретение позволяет получить чистый белковый препарат с активностью тритикаина-альфа пшеницы с высокой степенью эффективности. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ снижения количества CO2 в потоке газообразных веществ, а также аппарат для удаления CO2 из потока газообразных веществ. Способ включает контактирование газообразных веществ, содержащих CO2, с первым потоком водной поглощающей жидкости, содержащей карбонат ангидразу, поглощение CO2 указанной жидкостью и превращение его в более растворимый неорганический углерод. Осуществление разделения первого потока жидкости на второй и третий потоки жидкости, где второй поток содержит более высокую концентрацию карбонат ангидразы относительно третьего потока. Осуществление контактирования третьего потока жидкости с микроорганизмом, способным превращать растворенный в жидкости неорганический углерод в кислород и/или биомассу. Аппарат содержит первую и вторую системы циркуляции текучего вещества. Первая система содержит поглощающий блок с внутренним пространством, ниже по потоку от поглощающего блока - фильтровальный блок с фильтром. Вторая система содержит биореактор или водоем для культивирования микроорганизмов. Изобретения обеспечивают повышение эффективности захвата CO2, снижение удельной площади поверхности водоема, а также снижение потребляемой энергии при регенерации поглощающей жидкости. 2 н. и 25 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретения касаются способа приготовления экспрессионного вектора, кодирующего адаптированную рекомбиназу, которая способна к рекомбинации асимметричных последовательностей-мишеней в пределах длинного концевого повтора (LTR) провирусной ДНК множества штаммов ВИЧ-1, встроенных в геном клетки-хозяина, а также к полученному экспрессионному вектору, клетке, трансфецированной этим вектором, экспрессированной рекомбиназе и фармацевтической композиции, включающей экспрессионный вектор, клетку и/или рекомбиназу. Представленные изобретения могут быть использованы при лечении или профилактике инфекции ВИЧ-1 у субъекта. 6 н и 22 з.п.ф-лы, 5 ил., 2 пр.

Изобретение относится к медицине и представляет собой безводную композицию для обработки ран, включающую (a) гидрофильную дисперсную фазу, содержащую PEG 400 и термолизин, и (b) гидрофобную непрерывную фазу, содержащую гидрофобную основу. Гидрофильная дисперсная фаза диспергирована в гидрофобной непрерывной фазе. В вариантах осуществления композиция включает трипсин, папаин или пепсин. Технический результат – повышенная ферментативная активность. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 пр., 13 табл., 10 ил.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к применению штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori ВКПМ F-148 в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов. Настоящее изобретение позволяет конструировать продуцентов рекомбинантных целевых ферментов, в том числе продуцентов ксиланаз и маннаназ. 3 ил., 2 табл., 2 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2015-10-10 2015-10-10T00:55:30
Наверх