Способ изготовления образцов биологических тканей в комплексе с имплантированными элементами для исследования световой микроскопией

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для изготовления гистологических образцов биологических тканей с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций для изучения с помощью световой микроскопии. Способ заключается в том, что биологический образец последовательно обрабатывают раствором фиксаторов, отмывают, обезвоживают, пропитывают раствором прозрачной смолы для холодной заливки в течение 6-24 часов, погружают в чистую смолу на 12-24 часа и окрашивают красителями на глубину 1-2 мкм. При этом микроскопию последующих слоев выполняют после шлифовки, полировки и повторного окрашивания поверхности образца. Изобретение позволяет проводить послойное исследование образцов без повреждения клеточных компонентов и изменения архитектуры ткани в зоне контакта с инородным телом. 1 ил., 1 пр.

 

Настоящее изобретение относится к медицине и биологии, а именно к технике изготовления гистологических образцов биологических тканей, с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций для изучения с помощью световой микроскопии.

На сегодняшний день важной клинической проблемой остается изучение взаимодействия между тканями организма человека и металлическими или синтетическими имплантатами, такими, например, как эндоваскулярные стенты и протезы кровеносных сосудов. Исследование различных видов стентов и протезов, материалов, используемых для их изготовления, лекарственных покрытий и других способов модификации поверхности требует детального гистологического анализа тканей на границе с имплантатом.

Наиболее известный метод подготовки биологических тканей, содержащих металлический компонент, для исследования с помощью световой микроскопии заключается в фиксации материала в формальдегиде/параформальдегиде с последующим удалением металлической конструкции из биологической ткани (Giessen W.J., Serruys P.W., Beusekom H.M. Coronary stenting with a new, radiopaque, balloon-expandable endoprosthesis in pigs. Circulation. 1991; 83:1788-1798). После фиксации материал обезвоживают, заключают в парафин, изготавливают гистологические срезы и окрашивают их. Недостатком данного способа является повреждение биологических тканей в результате механического удаления металлических или полимерных фрагментов имплантата, приводящего к нарушению архитектуры ткани и невозможности оценить клеточные реакции на поверхности материала.

Наиболее близким к заявляемому способу является метод, основанный на фиксации биологического материала в формальдегиде с дальнейшим заключением в смолы на основе метакрилатов и акрила (Major A., Guidoin R., Soulez G. Implant degradation and poor healing after endovascular repair of abdominal aortic aneurysms: an analysis of explanted stent-grafts. J Endovasc Ther. 2006; 13: 457-467). Из образца, заключенного в смолу, с помощью алмазного ножа или высокоточного отрезного станка готовят тонкие срезы толщиной 10-20 мкм, которые тщательно полируют и окрашивают гистологическими красителями.

Основными недостатками данного способа является трудоемкость, сложность получения тонких срезов образцов и необходимость в специальном оборудовании для их изготовления.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность послойного исследования гистологических образцов биологических тканей, с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций без повреждения клеточных компонентов и изменения архитектуры ткани в зоне контакта с инородным телом.

Технический результат достигается за счет того, что биологический материал, содержащий металлические и/или полимерные конструкции, обрабатывают раствором фиксаторов, последовательно обезвоживают и погружают в прозрачную смолу для холодной заливки; после получения твердого образца выполняют полировку и окрашивание поверхности исследуемого биологического материала, а исследование образца осуществляют на глубину 1-2 мкм, при этом микроскопию последующих слоев выполняют после шлифовки и повторного окрашивания поверхности образца.

В соответствии с предлагаемым способом образец биологической ткани в комплексе с металлической и/или полимерной конструкцией фиксируют в любом из известных химических фиксаторов: альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид), хромовая кислота, спирты (этанол, метанол), ацетон, соли ртути (сулема), кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная). После фиксации образцы отмывают в течение 0,5-1 часа в фосфатно-солевом буфере и далее проводят их обезвоживание с помощью этилового спирта. Для чего гистологические образцы помещают последовательно в растворы этилового спирта с возрастающей концентрацией от 30% до 100% на время 1-24 часов в каждой порции. Кроме этанола для обезвоживания может быть применен безводный ацетон, изопропанол, диоксан, глицерин. После обезвоживания материал помещают на 1-3 часа в растворитель (ацетон, окись пропилена, 1,2-эпоксипропан).

После обезвоживания материал погружают в прозрачную смолу для холодной заливки, в качестве которой может быть использована эпоксидная, акриловая или полиэфирная смолы. Перед тем как поместить образец в смолу осуществляют его пропитывание раствором, содержащим смолу и растворитель в соотношении 1:1 на 6-24 часов. После чего образец пропитывают чистой смолой в течение 12-24 часов и далее проводят ее полимеризацию.

Полученный твердый образец, заключенный в смолу, шлифуют и полируют до поверхности биологического материла, которую необходимо исследовать. Окраску препарата выполняют щелочными растворами метиленового синего, толуидинового синего, азура II и другими. При этом происходит окрашивание только поверхностного слоя на глубину 1-2 мкм.

Для дифференциальной окраски спиртовыми красителями, например гематоксилин и эозин, предварительно осуществляют травление верхнего слоя препарата насыщенным раствором гидроксида натрия в этиловом спирте. После чего выполняют отмывку от щелочи и окрашивают образец по стандартному протоколу.

Полученный окрашенный препарат исследуют с помощью световой микроскопии в проходящем и в отраженном свете с использованием люминесценции и без нее. При необходимости дальнейшего изучения более глубоких слоев материала образец шлифуют до нужной глубины, после чего выполняют полировку и повторное окрашивание поверхностного слоя образца.

Технический результат предлагаемого изобретения поясняет изображение, где на фиг. 1 - представлен гистологический образец биологической ткани, извлеченный из легочной артерии, содержащий металлические стойки эндоваскулярного стента при окрашивании метиленовым синим с увеличением световой микроскопии × 200. На изображении отмечены: 1 - материал стента; 2 - грануляционная соединительная ткань, содержащая отдельные макрофаги, фибробласты и гигантские многоядерные клетки инородных тел; 3 - зрелые волокна соединительной ткани, образующие фиброзную капсулу.

Пример 1.

Эндоваскулярный стент с участками нативной ткани был извлечен из легочной артерии при проведении реоперации. Материал фиксировали в забуференном формалине в течение двух суток, после чего отмывали дважды по 30 минут в фосфатно-солевом буфере. Для обезвоживания материала осуществляли его проводку в растворах этилового спирта следующим образом:

1. 30% этиловый спирт - 2 раза по 30 минут.

2. 50% этиловый спирт - 2 раза по 30 минут.

3. 70% этиловый спирт - 2 раза по 40 минут.

4. 80% этиловый спирт - 2 раза по 60 минут.

5. 95% этиловый спирт - 60 минут, затем еще 120 минут.

6. 100% этиловый спирт - 2 раза по 60 минут.

После обезвоживания образец помещали в 100% ацетон - 2 раза по 60 минут, и далее еще на 120 минут. Затем образец выдерживали в смеси ацетона и смолы в соотношении 1:1 в течение 12 часов, а после этого в чистой смоле под вакуумом для полного пропитывания - 6 часов. Пропитанные кусочки материала помещали в специальные формы, заливали смолой и выдерживали 12 часов при комнатной температуре, далее проводили полимеризацию смолы при температуре 60°C до полного застывания.

Дальнейшую обработку осуществляли на шлифовально-полировальном станке с использованием шлифовальных дисков в следующем порядке: 1200, 1000 и 800. Для полировки последовательно использовали сукно различной упругости в комбинации с суспензиями, содержащими монокристаллические алмазы:

1. Шерстяное сукно с 9 мкм алмазной суспензией.

2. Шелковое сукно с 6 мкм алмазной суспензией.

3. Бархатное сукно с лубрикантом.

Для проведения окраски готовили краситель: 0,5% раствор метиленового синего в 0,5% водном растворе тетрабората натрия. Отполированный образец помещали в краситель на 7 минут при 60°C, после чего отмывали водой, высушивали и изучали светом на микроскопе в проходящем и отраженном свете с люминесценцией.

При микроскопическом исследовании было обнаружено образование фиброзной капсулы вокруг металлических стоек стента. В окружающих тканях наблюдали умеренную воспалительную инфильтрацию мононуклеарными клетками, а также фибробласты и отдельные гигантские многоядерные клетки инородных тел. Кроме того, были выявлены небольшие участки неоинтимы и организованного тромба.

Таким образом, предлагаемый метод подготовки биологического материала позволяет изучать морфологию и клеточный состав тканей, контактирующих с металлическими и полимерными конструкциям, без механического нарушения целостности комплекса ткань-имплантат.

Способ изготовления образцов биологических тканей в комплексе с имплантированными элементами для исследования световой микроскопией, включающий последовательную фиксацию, отмывание и обезвоживание биологического образца с последующим пропитыванием его раствором прозрачной смолы для холодной заливки в течение 6-24 часов и погружением в чистую смолу на 12-24 часа, а также окрашивание красителями, отличающийся тем, что окрашивание образца осуществляют на глубину 1-2 мкм, а исследование материала выполняют послойно без подготовки срезов, для чего проводят шлифовку поверхности на нужную глубину, полировку и повторное окрашивание образца.