Способ получения высокоочищенной азиатикозидной композиции из centella asiatica и способ ее применения
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения азиатикозида. Способ получения азиатикозида по меньшей мере 99%-ной чистоты, включающий обработку измельченного материала Centella asiatica петролейным эфиром; экстрагирование обработанного измельченного материала алифатическим спиртом, одним или в комбинации с водой; перегонку и растворение экстракта или фильтрата в метилизобутилкетоне с получением раствора; пропускание раствора через слой смолы и элюирование спиртовым растворителем с получением элюата; концентрирование элюата в вакууме с получением порошка азиатикозида; растворение порошка в спирте (варианты). Способ лечения и предупреждения заболевания, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, геморроя, анальной трещины, свища, желудочного заболевания, карциномы желудка и устранения инфекции Helicobacter pylori или их любой комбинации, включающий введение субъекту дозы азиатикозида, возможно наряду с фармацевтически приемлемым эксципиентом(ами). Вышеописанный способ позволяет получить азиатикозид по меньшей мере 99%-ной чистотой. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 10 табл., 14 пр.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к экстракту азиатикозида из Centella asiatica и, более конкретно, к его применению для управления воспалительными заболеваниями кишечника, лечения инфекции Helicobacter pylori, предупреждения желудочных заболеваний и карциномы желудка.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Азиатикозид, экстрагированный из Centella asiatica, представляет собой имеющееся в продаже вещество аналитических эталонных стандартов, причем компании, такие как, например, компания Yick-Vic, приписывала азиатикозиду чистоту 92,8%, определенную ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), компания Tauto Biotech приписывала азиатикозиду чистоту примерно 97%, определенную ВЭЖХ, и компания Baoji herbest Biotech имела содержание азиатикозида более чем 98%. Однако данные продукты конкретно адаптированы для применения в качестве эталонного стандарта для исследовательских целей в исследовательских лабораториях и не являются экстрактом растения Centella asiatica. Данные азиатикозидные продукты не являются рентабельными для применения в качестве фармацевтической композиции.
В способах, адаптированных для получения азиатикозида из Centella asiatica, в предшествующем уровне техники заявлена чистота, варьирующая от 50% до 97%. Например, в публикации США №2008/0194499 сообщается о фармацевтических пентациклических терпеноидных гликозидах, которые включают композицию азиатикозида с содержанием азиатикозида, варьирующим от 15 до 50%. Также в публикации США №2006/0177516 раскрыта терпеновая смесь, имеющая композицию азиатикозида с содержанием азиатикозида около 40%. Кроме того, в патенте США №6417349 предложен экстракт Centella asiatica, имеющий соотношение от 4:6 до 6:4 и содержащий 97% или более азиатикозида в экстракте. Кроме того, в китайском патенте №CN 1520824 раскрыт способ экстракции и разделения для азиатикозида, который имеет чистоту 92,8%. Однако ни в одном из способов предшествующего уровня техники не пытались экстрагировать только высокочистый азиатикозид из Centella asiatica.
Традиционное применение Centella asiatica или азиатикозида включает стимулирование заживления ран, лечение кожных заболеваний, кожных расстройств и хронических воспалительных заболеваний. Например, в китайском патенте №CN 101129393 раскрыто применение жидкого азиатикозида при заживлении ран. Кроме того, в публикации США №2009/0060985 сообщается о применениях городского экстракта Centella asiatica в качестве лекарственного вещества для лечения кожных расстройств. В данной области наблюдается мало попыток, когда азиатикозид или Centella asiatica используются для нетрадиционных применений. Например, в публикации США №2008/0194499 сообщается о применении терпеноидных гликозидов, предпочтительно азиатикозида и мадекассосида, возможно наряду с эксципиентами, для управления депрессией. Также в публикации США №2006/0177516 предложена пищевая добавка, которая демонстрирует применения азиатикозида для лечения состояний анемии.
Однако применение азиатикозида или Centella asiatica для управления заболеваниями, относящимися к желудочно-кишечному тракту, такими как воспалительное заболевание кишечника и заболевания, вызванные Helicobacter pylori, является относительно неизвестным. В данной области наблюдается мало попыток, когда азиатикозид используется для лечения заболеваний печени. Например, в китайских патентах №CN1439376 и CN1520824 раскрыто применение азиатикозида для предупреждения и лечения фиброза печени. Кроме того, в публикации США №2004/0097463 раскрыто применение азиатикозида для лечения ракового заболевания, ассоциированного с печенью, толстой кишкой и поджелудочной железой. Кроме того, Cheng et al., 2004, ("The healing effects of Centella extract and asiaticoside on acetic acid induced gastric ulcers in rats", Life Sciences, vol. 74, pp.2237-2249) обсуждают заживляющие эффекты водного экстракта Centella asiatica на язвенные заболевания желудка, индуцированные уксусной кислотой, у крыс.Также Cheng et al., 2000, ("Effects of Centella asiatica on ethanol induced gastric mucosal lesions in rats, Life Sciences, vol. 67, pp.2647-2653) сообщают о предупредительном эффекте водного экстракта Centella asiatica на поражения слизистой желудка, индуцированные этанолом, в экспериментах ех-vivo. Однако язвенные заболевания желудка, на которые указывается в данной области, ограничиваются моделями образования язвенных заболеваний, индуцированных химическими агентами или лекарственными средствами. Кроме того, в данных моделях поражение создается конкретно путем местного введения раздражителя (уксусной кислоты) в желудок, что не обязательно может быть направлено на заболевания толстой кишки, такие как воспалительные заболевания кишечника. Кроме того, азиатикозидные продукты заявлены в данной области для лечения язвенных заболеваний, но не могут определять применение азиатикозида для предупреждения язвенных заболеваний.
Воспалительное заболевание кишечника характеризуется трудноизлечимыми хроническими воспалительными состояниями, такими как язвенный колит и болезнь Крона, при которых проявляются мучительные симптомы боли в области живота, диареи, рвоты, гематохезии (кровь в кале), пониженный аппетит, потеря массы тела, лихорадка и различные ассоциированные осложнения, такие как, например, анальные трещины, свищи, периректальный абсцесс, геморроидальные узлы. Язвенный колит и болезнь Крона обычно оцениваются по индексу активности заболевания, который включает частоту стула, присутствие крови в кале, внешний вид при эндоскопии и общую оценку лечащим врачом. Стойкость приведенных выше состояний приводит к хроническому воспалению и затем становится причинным фактором развития раковых заболеваний толстой кишки. Существующие способы лечения воспалительных заболеваний кишечника включают ослабление боли в области живота, диареи, слабости, анемии, недостаточностей питательных веществ, воспаления слизистой, внекишечных проявлений, госпитализаций, операций и осложнений, таких как абсцессы, свищи, инфекции и злокачественные образования.
Лечение воспалительных заболеваний кишечника состоит в пероральном введении сульфасалазина, иммунодепрессантов и кортикостероидов. Обычно сульфасалазин является предпочтительной терапией первого ряда для язвенного колита и болезни Крона от легких до умеренных. Однако побочные эффекты, такие как непереносимость лекарственного средства, ослабленное поглощение фолиевой кислоты, вредное действие на почки, делают сульфасалазин нежелательным для лечения воспалительного заболевания кишечника. Кроме того, доступность сульфасалазина в толстой кишке ограничивается из-за его поглощения в желудке и последующей экскреции в моче. Язвенный колит и болезнь Крона, при острых состояниях, требуют лечения кортикостероидами, но данные лекарственные средства не могут предупреждать ремиссию. Долговременное применение кортикостероидов ассоциировано с утоньшением кожи, предрасположенностью к разрывам, набором массы тела, увеличением кровяного давления, диабетом и родственными вредными состояниями. Иммунодепрессанты являются эффективными при долговременном лечении язвенного колита и болезни Крона. Данные лекарственные средства также имеют значительные побочные реакции, такие как подавление активности костного мозга, лимфомы (у пациентов с пересаженной почкой), рак кожи и панкреатит.Воспалительное заболевание кишечника в тяжелых случаях требует хирургического вмешательства, такого как резекция кишки, стриктуропластика или временная или постоянная колостомия, или илеостомия, которое включает применение общей анестезии и осложнения послеоперационного выздоровления. Изъязвление желудочно-кишечного тракта путем повреждения слизистой является ассоциированным осложнением воспалительного заболевания кишечника. Хроническая природа воспалительного заболевания кишечника и ассоциированных воспалительных заболеваний требует долговременного управления лечением. Современные способы лечения воспалительного заболевания кишечника имеют ограничения (в виде) вредных побочных эффектов при длительном лечении и высокий риск ремиссии заболевания.
Воспаления, которые индуцируются патогенными бактериями, такими как Helicobacter pylori, помогают облегчать усугубление симптомов воспалительных заболеваний кишечника. Кроме того, факторы окружающей среды, такие как стресс, потребление пищи и алкоголя, усиливают активность Helicobacter pylori. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) классифицировала Helicobacter pylori в качестве карциногена группы-1 для стимуляции карциномы желудка. Инфекция Helicobacter pylori запускает хроническую воспалительную реакцию, которая повреждает эпителиальные клетки с последующей индукцией атрофии желудка, которая, в конечном счете, приводит к карциноме желудка. Лечение карциномы желудка или рака желудка имеет весьма фатальные возможности лечения, такие как, например, хирургическое удаление раковой ткани гастрэктомией, удаление части/всего желудка, химиотерапия, радиотерапия и хемо-радиотерапия. Однако данные способы лечения имеют весьма сильные побочные эффекты, которые приводят к низкому качеству жизни пациентов. Также, данные способы лечения не обеспечивают полного выздоровления, так как имеется высокая вероятность рецидива карциномы. Своевременные диагностика и лечение для устранения Helicobacter pylori из инфицированной слизистой желудка могут значительно снизить риск карциномы желудка. Пользователь может оценить эффективные средства устранения инфекции Helicobacter pylori, что может косвенно помочь в предупреждении карциномы желудка, индуцированной инфекцией Helicobacter pylori.
Требуется рентабельный способ экстракции азиатикозида из Centella asiatica, который имеет очень высокую чистоту для эффективного применения в качестве фармацевтической композиции. Кроме того, требуется композиция азиатикозида, которая обеспечивает более мягкий и более щадящий способ эффективного долговременного управления воспалительным заболеванием кишечника в присутствии Helicobacter pylori. Кроме того, требуется композиция азиатикозида, которая предупреждает желудочные заболевания и раковые заболевания толстой кишки, которые индуцируются из-за воспалительных заболеваний кишечника. Кроме того, требуется композиция азиатикозида для эффективного устранения инфекции Helicobacter pylori, которая предупреждает карциному желудка.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Главной целью настоящего изобретения является предложение способа или процесса получения фармацевтической композиции азиатикозида, происходящей из Centella asiatica, которая имеет чистоту по меньшей мере 99%.
Другой целью настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции азиатикозида, возможно наряду с приемлемыми фармацевтическими эксципиентами, для лечения воспалительных заболеваний кишечника, таких как язвенный колит, болезнь Крона.
Еще одной другой целью настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции азиатикозида, возможно наряду с приемлемыми фармацевтическими эксципиентами, для лечения ассоциированных осложнений воспалительных заболеваний кишечника, таких как, но не ограничивающихся, геморроидальными узлами, анальными трещинами, свищами.
Еще одной другой целью настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции азиатикозида, возможно наряду с приемлемыми фармацевтическими эксципиентами, для предупреждения рака толстой кишки.
Еще одной другой целью настоящего изобретения является применение фармацевтической композиции азиатикозида, возможно наряду с приемлемыми фармацевтическими эксципиентами, для лечения инфекции Helicobacter pylori.
Еще одной другой целью настоящего изобретения является применение фармацевтической композиции азиатикозида, возможно наряду с приемлемыми фармацевтическими эксципиентами, для предупреждения желудочных заболеваний и карциномы желудка.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении раскрыта рентабельная композиция азиатикозида фармацевтического качества, экстрагированная из растительного материала Centella asiatica, имеющая чистоту по меньшей мере 99%. В настоящем изобретении раскрыт способ лечения in vivo у людей и животных, где способ лечения включает пероральное введение композиции азиатикозида, адаптированной для лечения воспалительных заболеваний кишечника, лечения геморроидальных узлов, анальных трещин и свищей, предупреждения язвы и рака толстой кишки, лечения или устранения инфекции Helicobacter pylori, предупреждения желудочных заболеваний и предупреждения карциномы желудка.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В контексте настоящего изобретения раскрытое здесь соединение азиатикозид имеет следующую структуру:
Азиатикозид:
Настоящее раскрытие относится к способу получения азиатикозида, по меньшей мере 99%-ной чистоты, причем указанный способ включает следующие действия:
а) обработка измельченного материала источника азиатикозида первым растворителем;
б) экстрагирование обработанного измельченного материала вторым растворителем с получением экстракта или фильтрата;
в) перегонка и растворение экстракта или фильтрата в третьем растворителе с получением раствора;
г) пропускание раствора через адсорбент и элюирование спиртовым растворителем с получением элюата; и
д) концентрирование элюата в вакууме с получением порошка азиатикозида; и
е) растворение порошка в спирте и кристаллизация с получением азиатикозида по меньшей мере 99%-ной чистоты.
Настоящее раскрытие также относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей азиатикозид по меньшей мере 99%-ной чистоты наряду с фармацевтически приемлемым эксципиентом(ами), причем указанный способ включает следующие действия:
а) обработка измельченного материала источника азиатикозида первым растворителем;
б) экстрагирование обработанного измельченного материала вторым растворителем с получением экстракта или фильтрата;
в) перегонка и растворение экстракта или фильтрата в третьем растворителе с получением раствора;
г) пропускание раствора через адсорбенты и элюирование спиртовым растворителем с получением элюата;
д) концентрирование элюата в вакууме с получением порошка азиатикозида;
е) растворение порошка в спирте и кристаллизация с получением азиатикозида; и
ж) добавление к азиатикозиду фармацевтически приемлемого эксципиента(тов) с получением фармацевтической композиции, содержащей азиатикозид по меньшей мере 99%-ной чистоты.
В одном воплощении настоящего раскрытия материал источника азиатикозида выбран из группы, состоящей из растений и животных.
В другом воплощении настоящего раскрытия растительным источником является Centella asiatica.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия экстрагирование проводится при температуре, варьирующей от примерно 20°С до примерно 30°С, в период времени от примерно 8 часов до примерно 24 часов.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия первый растворитель выбран из группы, состоящей из алифатических соединений, кетонов, спиртов, нитритов, сложных эфиров, простых эфиров или их любых комбинаций, предпочтительно петролейного эфира или метилизобутилкетона.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия второй растворитель представляет собой алифатический спирт, выбранный из группы, состоящей из метилового спирта, этилового спирта, пропилового спирта, изопропилового спирта и бутилового спирта, либо одного, либо в комбинации с водой в соотношении, варьирующем от примерно 60% до примерно 99%.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия экстракт растворяют в деминерализованной воде.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия третий растворитель выбран из группы, состоящей из гексана, метилизобутилкетона и петролейного эфира или их любой комбинации.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия адсорбент представляет собой слой смолы.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия спиртовой растворитель имеет число атомов углерода, варьирующее от С-1 до С-4, и выбран из группы, состоящей из метанола и изопропилового спирта или их любой комбинации.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия указанное концентрирование в вакууме проводится при температуре, варьирующей от примерно 50°С до примерно 65°С.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия водный спирт выбран из группы, состоящей из этилового спирта, метилового спирта, изопропилового спирта и их любой комбинации.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия кристаллизацию проводят при температуре, варьирующей от примерно -15°С до примерно 0°С.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия композиция приготовлена в виде препарата таблеток, лепешек, пастилок, водных или масляных суспензий, мазей, пластырей, гелей, лосьонов, средств для ухода за полостью рта, капсул, эмульсий, кремов, спрэев, капель, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий в твердых или мягких гелевых капсулах, сиропов, эликсиров, фитоцевтиков, нутрицевтиков и продуктов питания или их любых комбинаций.
Настоящее раскрытие также относится к способу лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из следующих: воспалительное заболевание кишечника, геморрой, анальная трещина, свищ, желудочное заболевание, карцинома жеудка, и устранения инфекции Helicobacter pylori, или к их любой комбинации, причем указанный способ включает акт введения дозы азиатикозида, возможно наряду с фармацевтически приемлемым эксципиентом(ами), субъекту, нуждающемуся в этом.
Настоящее раскрытие также относится к способу предупреждения заболевания, выбранного из группы, состоящей из следующих: рак толстой кишки, желудочное заболевание, карцинома желудка и эффект лекарственных средств, вызывающий язву, или любой их комбинации, причем указанный способ включает акт введения дозы азиатикозида, возможно наряду с фармацевтически приемлемым эксцииентом(ами), субъекту, нуждающемуся в этом.
В одном воплощении настоящего раскрытия фармацевтически приемлемый эксципиент выбран из группы, состоящей из гранулирующих агентов, связующих агентов, смазок, разрыхлителей, подсластителей, скользящих веществ, антиадгезивных средств, антистатиков, поверхностно-активных веществ, антиоксидантов, камедей, веществ покрытий, красителей, корригентов, веществ покрытий, пластификаторов, консервантов, суспендирующих агентов, эмульгаторов и сферообразующих агентов или их любых комбинаций.
В другом воплощении настоящего раскрытия субъектом является животное, включая человека.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия композицию вводят животным в дозировке, варьирующей от примерно 1 мг/кг до примерно 360 мг/кг.
В еще одном другом воплощении настоящего раскрытия композицию вводят людям в дозировке, варьирующей от примерно 1 мг/кг до примерно 60 мг/кг.
В предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению предложены высокочистая композиция азиатикозида, имеющая чистоту по меньшей мере 99%, и способ ее изготовления. Азиатикозид по настоящему изобретению имеет молекулярную формулу C48H78O19. В данном предпочтительном воплощении азиатикозид получают из растительного источника Centella asiatica, однако, понятно, что в других альтернативных воплощениях настоящего изобретения азиатикозид может быть получен из животных источников.
В частности, согласно настоящему изобретению предложен способ или процесс получения композиции, имеющей 99% или более азиатикозида, где указанный процесс включает следующие стадии:
а) измельчение растительного материала Centella asiatica
б) обработка измельченного материала первым растворителем с удалением жирных веществ, хлорофилла и других пигментов;
в) экстрагирование биоактивных молекул с использованием второго растворителя;
г) перегонка экстракта с удалением растворителей и образованием пасты;
д) растворение перегнанной пасты в третьем растворителе с получением раствора; s
е) экстрагирование третьим растворителем с удалением кислотных примесей;
ж) пропускание очищенного экстракта через адсорбенты с получением прозрачного раствора;
з) элюирование слоя смолы спиртовым растворителем с получением элюата;
и) концентрирование элюата в вакууме с получением порошка; и
й) растворение порошка в водном спирте и кристаллизация с получением композиции азиатикозида, которая имеет чистоту, определенную ВЭЖХ, по меньшей мере 99%.
Подробный способ или процесс получения 99%-ной или более чистой композиции азиатикозида описан ниже.
Согласно настоящему изобретению сухие листья Centella asiatica, включая стебли, измельчают до размера 40 меш (40 ячеек на квадратный дюйм, примерно 6,2 ячейки/см2). Измельченный материал упаковывают в экстрактор, имеющий перфорированные пластинки в верхней и нижней частях сосуда, который оснащен матерчатыми фильтрами.
На следующей стадии первый растворитель циркулирует через экстрактор путем противотока при температуре, варьирующей от 20°C до 30°C, наиболее предпочтительно при 30°C, в течение периода времени, варьирующего от 8 ч до 24 ч, наиболее предпочтительно в течение 12 ч. В данном предпочтительном воплощении первым используемым растворителем является петролейный эфир, имеющий интервал кипения от 60°C до 80°C. Однако понятно, что первый растворитель можно выбрать из группы, содержащей алифатические соединения, кетоны, спирты, нитриты, сложные эфиры, простой (диэтиловый) эфир и смеси одного или более чем одного из них в других воплощениях настоящего изобретения. На следующей стадии из экстракта удаляют хлорофилл и другие липиды, и дают массе высохнуть от растворителя.
На следующей стадии высушенную массу экстрагируют путем противотока с использованием второго растворителя. Второй растворитель в данном предпочтительном воплощении представляет собой комбинацию алифатических спиртов, которые имеют число атомов углерода, варьирующее от 1 до 4, как спиртов с прямой цепью, так и с разветвленной, в комбинации с водой или без нее. В других альтернативных воплощениях настоящего изобретения второй растворитель может быть выбран из метилового спирта, этилового спирта, пропилового спирта, изопропилового спирта и бутилового спирта, либо одного, либо в комбинации с водой в соотношении, варьирующем от 60% до 99%.
На следующей стадии прозрачный экстракт перегоняют при пониженном давлении с выпариванием растворителя и образованием пасты. На следующей стадии пасту растворяют в деминерализованной воде и фильтруют от нерастворимых веществ до прозрачного состояния. На следующей стадии прозрачный водный слой многократно экстрагируют и промывают третьим растворителем для того, чтобы избавиться от кислотного вещества и получить прозрачный водный экстракт. Третий растворитель в данном предпочтительном воплощении представляет собой метилизобутилкетон. В еще одном другом воплощении настоящего изобретения растворитель можно выбрать из группы, содержащей гексан и петролейный эфир.
На следующей стадии прозрачный слой водного экстракта адаптируют для пропускания через слой смолы адсорбирующего класса и промывают 5 объемами или, более предпочтительно, 8 объемами деионизированной воды для того, чтобы избавиться от всех пигментов и примесей из слоя.
На следующей стадии слой, промытый водой, элюируют спиртовым растворителем, имеющим число атомов углерода, варьирующее от С-1 до С-4, предпочтительно метанолом или изопропиловым спиртом, или смесью указанных спиртов. Элюированный растворитель собирают, и слой многократно промывают для извлечения всех центеллосапонинов из слоя.
На следующем этапе элюат концентрируют под вакуумом при низкой температуре предпочтительно от 50°C до 65°C до порошка. Порошок вновь растворяют в водном спирте с получением раствора. Водный спирт, использованный в данном предпочтительном воплощении, представляет собой метиловый спирт.Однако понятно, что водный спирт может быть выбран из группы этилового, пропилового спирта или изопропилового спирта - либо одного, либо в комбинации с водой в соотношениях, варьирующих от 50% до 99% спирта.
На следующем этапе раствор охлаждают до менее чем 0°C, предпочтительно при -15°C или менее для кристаллизации азиатикозида. На следующем этапе полученные кристаллы чистого азиатикозида отфильтровывают и промывают холодной водой до тех пор, пока они не будут содержать солей, и сушат под вакуумом с получением сыпучего порошка, который может быть проанализирован на предмет его чистоты с использованием ВЭЖХ для анализа.
Краткое изложение самого предпочтительного процесса является следующим:
а) Сухие листья Centella asiatica, включая стебли, измельчали до размера 40 меш (примерно 6,2 ячейки/см2).
б) Измельченный материал упаковывают в экстрактор, имеющий перфорированные пластинки в верхней и нижней частях сосуда, имеющего матерчатые фильтры.
в) Петролейный эфир, имеющий интервал кипения от 60°C до 80°C, циркулирует способом противотока при температуре, варьирующей от 20°C до 30°C, предпочтительно при 30°C в течение периода времени, варьирующего от 8 ч до 24 ч, предпочтительно в течение 12 ч.
г) Образующийся экстракт, состоящий из хлорофилла и других липидов, удаляют, и дают массе высохнуть от растворителя.
д) Высушенную массу вновь экстрагируют способом противотока с использованием комбинации растворителей на основе алифатических спиртов, имеющих число атомов углерода, варьирующее от 1 до 4, как спиртов с прямой, так и с разветвленной цепью, в комбинации с водой или без нее. Указанные спирты могут представлять собой метиловый, этиловый, пропиловый, изопропиловый, бутиловый спирт, либо один, либо в комбинации с водой в соотношении, варьирующем от 60% до 99% указанного спирта.
е) Прозрачный экстракт превращают в пасту путем выпаривания растворителя перегонкой при пониженном давлении.
ж) Пасту растворяют в деминерализованной воде и многократно промывают метилизобутилкетоном.
з) Прозрачный водный экстракт затем пропускают через слой смолы сорбирующего качества и промывают 5 объемами или, более предпочтительно, 8 объемами деионизированной воды для удаления из слоя всех пигментов и примесей.
и) Промытый водой слой элюировали спиртовым растворителем, имеющим число атомов углерода, варьирующее от C-1 до C-4, предпочтительно метанолом или изопропиловым спиртом, или смесью указанных спиртов.
й) Элюированный растворитель собирали, и слой многократно промывали для удаления из слоя всех центеллосапонинов.
к) Элюат концентрировали под вакуумом при низкой температуре, предпочтительно от 50°C до 65°C, до порошка.
л) Порошок вновь растворяют в водном спирте, в котором использованный спирт является этиловым, метиловым, пропиловым или изопропиловым в комбинации или с водой в соотношениях, варьирующих от 50% до 99% спирта, и охлаждают до менее чем 0°C, предпочтительно при -15°C или менее для кристаллизации азиатикозида.
м) Чистый азиатикозид, образующийся таким образом, отфильтровывают и промывают холодной водой до тех пор, пока он не будет содержать солей, и сушат под вакуумом с получением сыпучего порошка.
н) Выделенное таким образом вещество анализируется на его чистоту следующим способом: с использованием ВЭЖХ для анализа азиатикозида, а также примесей.
Способ ВЭЖХ для анализа является следующим:
| Колонка: 250 мм X 4,6 мм, С18 с обращенной фазой, размер частиц 5 мкм | ||
| Длина волны детектора: 220 нм | ||
| Скорость тока: 1,4 мл/мин | ||
| Использованный стандарт: Chromadex, № партии 11030-291 | ||
| Время | Ацетонитрил | Вода |
| Исходное | 75% | 25% |
| 30 мин | 45% | 55% |
| 40 мин | 75% | 25% |
В еще одном другом воплощении настоящего изобретения композиция азиатикозида возможно является применимой наряду с приемлемыми фармацевтическими эксципиентами, выбранными из группы, таких как, но не ограничивающихся, гранулирующими агентами, связующими агентами, смазками, разрыхлителями, подсластителями, скользящими веществами, антиадгезивными средствами, антистатиками, поверхностно-активными веществами, антиоксидантами, камедями, веществами покрытий, красителями, корригентами, веществами покрытий, пластификаторами, консервантами, суспендирующими агентами, эмульгаторами и сферообразующими агентами.
В еще одном другом воплощении настоящего изобретения композицию азиатикозида можно приготовить в виде препарата в разных лекарственных формах, выбранных из такой группы, как, например, таблетки, лепешки, пастилки, водные или масляные суспензии, мази, пластыри, гели, лосьоны, средства для ухода за полостью рта, капсулы, эмульсии, кремы, спрэи, капли, диспергируемые порошки или гранулы, эмульсии в твердых или мягких гелевых капсулах, сиропы, эликсиры, фитоцевтики, нутрицевтики и продукты питания.
В еще одном другом воплощении настоящего изобретения композиция представляет собой либо порошок, либо жидкость, и имеет минимальные побочные эффекты, где композиция находится в интервале дозировки 1-360 мг/кг у животных и 1-60 мг/кг у людей. Композиция азиатикозида адаптирована для введения в виде терапевтической или профилактической дозы для эффективного лечения области, пораженной болезнью.
В предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ лечения in vivo воспалительных заболеваний кишечника (далее IBD), таких как язвенный колит (далее UC), болезнь Крона (далее CD) и ассоциированных осложнений в виде геморроидальных узлов, анальных трещин, свищей, и предупреждения рака толстой кишки, индуцированного приведенными выше состояниями.
В предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения in vivo инфекции Helicobacter pylori (далее Н.pylori). Кроме того, согласно настоящему изобретению также предложен способ устранения in vivo Н.pylori при язвенных заболеваниях, индуцированных NSAID (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство).
В предпочтительном воплощении согласно настоящему изобретению также предложен способ предупреждения in vivo желудочных заболеваний и карциномы желудка.
Соответственно, в контексте настоящего изобретения далее подробно описаны тесты, которые проводятся для установления противовоспалительной активности, лечащей активности, способ применения и установление способа действия композиции азиатикозида (далее тестируемое лекарственное средство):
а) В фармакокинетическом исследовании тестируемое лекарственное средство вводится, и анализируются его биодоступность в крови и экскреция в моче и кале. Наблюдается, что азиатикозид не поглощается в кровь, но полностью экскретируется в неизменном виде в каловых массах. Это свойство тестируемого лекарственного средства подтолкнуло к дополнительному исследованию для лечения IBD и родственных заболеваний.
б) В модели IBD, индуцированного тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), тестируемое лекарственное средство при последующей обработке в течение 10 суток после введения TNBS давало значимое снижение массы толстой кишки и соотношения масса/длина толстой кишки. Помимо повышенной массы тела наблюдается пониженная степень язвенного заболевания и миелопероксидазная активность в толстой кишке. Также после 3-их суток введения тестируемого лекарственного средства значимо уменьшается аноректальное кровотечение.
в) В модели IBD, индуцированного уксусной кислотой, тестируемое лекарственное средство после 10 суток лечения значимо уменьшало массу толстой кишки, длину толстой кишки, ширину толстой кишки, отношение масса/длина толстой кишки и макроскопический балл для толстой кишки. Тестируемое лекарственное средство также показывало пониженную степень язвенного заболевания и значимое снижение миелопероксидазной активности.
г) In vivo модель крыс, инфицированных Н.pylori, с язвенными заболеваниями, индуцированными нестероидным противовоспалительным лекарственным средством (далее NSAID), тестировали на потенциальную активность тестируемого лекарственного средства против Н.pylori и против язвы. Тестируемое лекарственное средство показало дозозависимое и зависимое от времени уменьшение площади язвы, наряду с полным устранением инфекции Н.pylori.
д) В модели язвенных заболеваний, индуцированных стрессом, для индукции язвенных состояний крысам вводится гистамин, и эффект тестируемого лекарственного средства в предупреждении язвы, индуцированной стрессом, подтверждается путем предобработки животного тестируемым лекарственным средством. Было обнаружено, что тестируемое лекарственное средство является эффективным в предупреждении язвенных заболеваний, индуцированных гистамином.
е) В модели язвенных заболеваний, индуцированных алкоголем, для индукции язвенных состояний крысам, которые предобработаны тестируемым лекарственным средством, вводится этанол. Тестируемое лекарственное средство показало профилактический эффект против язвенных заболеваний, индуцированных этанолом.
Изобретение дополнительно конкретизировано с помощью следующих примеров. Однако понятно, что данные примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
10 килограммов листьев Centella asiatica измельчали до размера 40 меш (примерно 6,2 ячейки/см2) с использованием молотковой мельницы. Измельченный материал многократно экстрагировали 50 литрами петролейного эфира в противоточном экстракторе с неподвижным слоем в течение периода 8 ч при 30°C. Экстрагированную массу, не содержащую хлорофилл и жиры, высушивали циркуляцией воздуха в слой. Высушенную массу экстрагировали 75 литрами изопропилового спирта при 30°С в течение 8 ч. После экстракции прозрачный фильтрат концентрировали под вакуумом с получением пасты. Пасту растворяли в 25 литрах деминерализованной воды и отфильтровывали от нерастворимых веществ до прозрачного состояния. Прозрачный водный слой многократно экстрагировали и промывали метилизобутилкетоном для того, чтобы избавиться от всего кислотного вещества. Проводили мониторинг данной операции на отсутствие кислотных компонентов с использованием ТСХ (тонкослойная хроматография), где подвижная фаза ТСХ состояла из верхнего слоя смеси и-бутанол:этилацетат:вода в соотношении 4:1:5. Прозрачный слой пропускали через хроматографическую колонку с адсорбентом, представляющую собой вертикальную колонку, содержащую 250 мл Amberlite® XAD-4, и промывали водой для того, чтобы избавиться от всех связывающихся пигментов и частиц. После этого следовал цикл элюции, когда колонку элюировали метиловым спиртом, и элюат концентрировали под вакуумом с получением 500 г порошка. Данный порошок растворяли в 2500 мл водного спирта, содержащего 80% метилового спирта и 20% воды, с получением прозрачного раствора. Данный раствор охлаждали до -15°C с получением кристаллов азиатикозида. Массу отфильтровывали, промывали водой и сушили при 80°C. Выход составлял 158 г азиатикозида, имеющего чистоту 99,6% при определении ВЭЖХ.
ПРИМЕР 2
10 килограммов листьев Centella asiatica измельчали до размера 40 меш (примерно 6,2 ячейки/см2) с использованием молотковой мельницы. Измельченный материал многократно экстрагировали 50 литрами петролейного эфира в противоточном экстракторе с неподвижным слоем в течение периода 8 ч при 30°C. Экстрагированную массу, не содержащую хлорофилл и жиры, высушивали циркуляцией воздуха в слой. Высушенную массу экстрагировали 75 литрами 80%-ного водного этилового спирта при 30°C в течение 8 ч. После экстракции прозрачный фильтрат концентрировали под вакуумом с получением пасты. Пасту растворяли в 25 литрах деминерализованной воды и отфильтровывали от нерастворимых веществ до прозрачного состояния. Прозрачный водный слой многократно экстрагировали и промывали метилизобутилкетоном для того, чтобы избавиться от всего кислотного вещества. Проводили мониторинг данной операции на отсутствие кислотных компонентов с использованием ТСХ, где подвижная фаза ТСХ состояла из верхнего слоя смеси н-бутанол:этилацетат:вода в соотношении 4:1:5. Прозрачный слой пропускали через хроматографическую колонку с адсорбентом, представляющую собой вертикальную колонку, содержащую 250 мл Amberlite® XAD-4, и промывали водой для того, чтобы избавиться от всех связывающихся пигментов и частиц. После этого следовал цикл элюции, когда колонку элюировали метиловым спиртом, и полученный элюат концентрировали под вакуумом с получением 500 г порошка. Порошок растворяли в 2500 мл водного спирта, содержащего 80% метилового спирта и 20% воды, с получением прозрачного раствора. Данный раствор охлаждали до -15°C с получением кристаллов азиатикозида. Массу отфильтровывали, промывали водой и сушили при 80°C. Полученный выход составлял 150 г азиатикозида, имеющего чистоту 99,2% при определении ВЭЖХ.
ПРИМЕР 3
10 килограммов листьев Centella asiatica измельчали до размера 40 меш (примерно 6,2 ячейки/см2) с использованием молотковой мельницы. Измельченный материал многократно экстрагировали 50 литрами петролейного эфира в противоточном экстракторе с неподвижным слоем в течение периода 8 ч при 30°C. Экстрагированную массу, не содержащую хлорофилл и жиры, высушивали циркуляцией воздуха в слой. Высушенную массу экстрагировали 75 литрами метилового спирта при 30°C в течение 8 ч. Прозрачный фильтрат, полученный после экстракции, концентрировали под вакуумом с получением пасты. Пасту растворяли в 25 литрах деминерализованной воды и отфильтровывали от нерастворимых веществ до прозрачного состояния. Прозрачный водный слой многократно экстрагировали и промывали метилизобутилкетоном для того, чтобы избавиться от кислотного вещества. Проводили мониторинг данной операции на отсутствие кислотных компонентов с использованием ТСХ. Прозрачный слой пропускали через хроматографическую колонку с адсорбентом, представляющую собой вертикальную колонку, содержащую 250 мл Amberlite® XAD-4, и промывали водой для того, чтобы избавиться от всех связывающихся пигментов и частиц. После этого следовал цикл элюции, когда колонку элюировали метиловым спиртом с получением элюата. Элюат концентрируют под вакуумом с получением 500 г порошка. Данный порошок растворяли в 2500 мл водного спирта, содержащего 80% метилового спирта и 20% воды, с получением прозрачного раствора. Данный раствор охлаждали до -15°C с получением кристаллов азиатикозида. Массу отфильтровывали, промывали водой и сушили при 80°C. Полученный выход составлял 145 г азиатикозида, имеющего чистоту 99,8% при определении ВЭЖХ.
ПРИМЕР 4
10 килограммов листьев Centella asiatica измельчали до размера 40 меш (примерно 6,2 ячейки/см2) с использованием молотковой мельницы. Измельченный материал многократно экстрагировали 50 литрами петролейного эфира в противоточном экстракторе с неподвижным слоем в течение периода 8 ч при 30°C. Экстрагированную массу, не содержащую хлорофилл и жиры, высушивали циркуляцией воздуха в слой. Высушенную массу экстрагировали 75 литрами изопропилового спирта, содержащего 80% изопропилового спирта и 20% воды, при 30°C в течение 8 ч. После экстракции прозрачный фильтрат концентрировали под вакуумом с получением пасты. Пасту растворяли в 25 литрах деминерализованной воды и отфильтровывали от нерастворимых веществ до прозрачного состояния. Прозрачный водный слой многократно экстрагировали и промывали метилизобутилкетоном для того, чтобы избавиться от всего кислотного вещества. Проводили мониторинг данной операции на отсутствие кислотных компонентов с использованием ТСХ. Прозрачный слой пропускали через хроматографическую колонку с адсорбентом, представляющую собой вертикальную колонку, содержащую 250 мл Amberlite® XAD-4, и промывали водой для того, чтобы избавиться от всех связывающихся пигментов и частиц. После этого следовал цикл элюции, когда колонку элюировали метиловым спиртом, и полученный элюат концентрируют под вакуумом с получением 500 г порошка. Порошок растворяли в 2500 мл водного спирта, содержащего 80% метилового спирта и 20% воды, с получением прозрачного раствора. Прозрачный раствор охлаждали до -15°C с получением кристаллов азиатикозида. Массу азиатикозида отфильтровывали, промывали водой и сушили при 80°C. Выход составлял 158 г азиатикозида, имеющего чистоту 99,6% при определении ВЭЖХ.
ПРИМЕР 5
10 килограммов листьев Centella asiatica измельчали до размера 40 меш (примерно 6,2 ячейки/см2) с использованием молотковой мельницы. Измельченный материал многократно экстрагировали 50 литрами петролейного эфира в противоточном экстракторе с неподвижным слоем в течение периода 8 ч при 30°C. Экстрагированную массу, не содержащую хлорофилл и жиры, высушивали циркуляцией воздуха в слой. Высушенную массу экстрагировали 75 литрами 70% изопропилового спирта, содержащего 30% воды, при 30°C в течение 8 ч. После экстракции прозрачный фильтрат концентрировали под вакуумом с получением пасты. Пасту растворяли в 25 литрах деминерализованной воды и отфильтровывали от нерастворимых соединений до прозрачного состояния. Прозрачный водный слой многократно экстрагировали и промывали метилизобутилкетоном для того, чтобы избавиться от всего кислотного вещества. Проводили мониторинг данной операции на отсутствие кислотных компонентов с использованием ТСХ. Прозрачный слой пропускали через хроматографическую колонку с адсорбентом, представляющую собой вертикальную колонку, содержащую 250 мл Amberlite® XAD-4, и промывали водой для того, чтобы избавиться от всех связывающихся пигментов и частиц. После этого следовал цикл элюции, когда колонку элюировали метиловым спиртом, и полученный элюат концентрируют под вакуумом с получением 500 г порошка. Данный порошок растворяли в 2500 мл водного спирта, содержащего 80% метилового спирта и 20% воды, с получением прозрачного раствора. Прозрачный раствор охлаждали до -15°C с получением кристаллов азиатикозида. Массу отфильтровывали, промывали водой и сушили при 80°C. Полученный выход составлял 157 г азиатикозида, имеющего чистоту 99,8% при определении ВЭЖХ.
ПРИМЕР 6: доступность тестируемого лекарственного средства в месте действия
Фармакокинетические параметры тестируемого лекарственного средства исследовали у здоровых крыс для определения биодоступности тестируемого лекарственного средства.
Методика: в данном исследовании животные голодали в течение ночи перед экспериментом, и им давали одиночную пероральную дозу 250 мг/кг тестируемого лекарственного средства. Пробы крови отбирали через 0; 0,25; 0,50; 1, 2, 3, 4, 5 и 6 часов после дозировки. Плазму получали центрифугированием крови при 7000 об./мин в течение 15 мин при 4°C и хранили при -20°C до проведения анализа. Для отбора мочи и кала животных содержали в метаболических клетках. Для детекции тестируемого лекарственного средства в плазме, моче и кале разработали способ ВЭЖХ с обращенной фазой. Удаление тестируемого лекарственного средства с мочой и калом определяли на протяжении периодов времени 0-4 ч, 4-8 ч и 8-24 ч.
Наблюдение: наблюдали, что лекарственное средство не адсорбируется в кровь системно даже при высокой дозе 250 мг/кг. Это подтверждалось, отсутствием азиатикозида в моче. Наблюдали, что тестируемое лекарственное средство проходит через желудочно-кишечный тракт в неизменном виде и полностью экскретируется с фекальной массой. Кроме того, наблюдали, что тестируемое лекарственное средство не поглощается в кровь, что значительно увеличивает биодоступность композиции азиатикозида в месте заболевания. В экспериментах, проведенных в данном контексте, наблюдали, что примерно 81,42% лекарственного средства выделялось из фекальной массы. Следовательно, подтвердили, что для тестируемого лекарственного средства имеется потенциал в лечении IBD и родственных заболеваний.
ПРИМЕР 7: эффект тестируемого лекарственного средства у крыс при колите, индуцированном TNBS
Колит, индуцированный тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), представляет собой одну из стандартных животных моделей, используемых для IBD. В данной модели однократное введение TNBS в толстую кишку повреждает эпителий толстой кишки и индуцирует длительное хроническое воспаление. Трансмуральное гранулематозное воспаление толстой кишки является сходным с гистопатологическими характеристиками, проявляющимися при болезни Крона.
Методика: в данном исследовании самцы крыс Wistar (280-291 г) голодали в течение 48 ч и были введены в состояние наркоза. В анус на глубину 8 см вставляли канюлю диаметром 3 мм, и каждой крысе инъецировали 25 мг TNBS, растворенной в 0,25 мл 30%-ного раствора этанола. Крыс располагали хвостом вверх на 1 минуту. Через 1 сутки тестируемое лекарственное средство вводили перорально один раз в сутки в течение 10 суток. Сохраняли здоровую контрольную группу, получающую только физиологический раствор, но не TNBS. На сутки 11 крыс из каждой группы умерщвляли смещением шейных позвонков, и выделяли толстую кишку для физического обследования. Образцы толстой кишки консервировали в 10%-ном нейтральном растворе формалина для гистопатологической оценки.
Наблюдения: в проведенных экспериментах состояния IBD, индуцированного TNBS, такие как повышенные масса толстой кишки, отношение массы к длине толстой кишки и миелопероксидазная активность, значимо обращались посредством обработки тестируемым лекарственным средством в течение 10 суток в дозе 50 мг/кг (перорально) один раз в сутки. Тестируемое лекарственное средство также излечивало поражения, продуцированные TNBS, как видно по уменьшению баллов микроскопической оценки и степени язвы толстой кишки. Обращение миелопероксидазной активности тестируемым лекарственным средством подтверждало его потенциал в заживлении поражений толстой кишки, наблюдавшихся при IBD.
| ТАБЛИЦА 1: | |||
| ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА МАССУ И ДЛИНУ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ IBD, ИНДУЦИРОВАННОМ TNBS, У КРЫС ПОСЛЕ 10 СУТОК ЛЕЧЕНИЯ | |||
| Здоровый контроль | Контроль, обработанный TNBS | Тестируемое лекарственное средство | |
| Масса толстой кишки (г) | 1,15±0,02 | 2,22±0,1### | 1,7110,07*** |
| Длина толстой кишки (мм) | 17,2±0,53 | 13,64±0,34### | 14,1410,53 |
| Ширина толстой кишки (мм) | 0,377±0,32 | 0,99±0,88### | 0,7310,13 |
| Отношение масса/длина толстой кишки | 0,00±0,00 | 8,80±0,58### | 4,4010,68** |
| Миелопероксидазная активность (U/мг) | 0,01±0,0002 | 0,05±0,0003### | 0,02±0,0003*** |
| n=6; для каждого из параметров данные анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим критерием Даннетта. | |||
| ###Р<0,001 по сравнению со здоровой контрольной группой; *Р<0,05, **Р<0,01 и ***Р<0,001 по сравнению с контрольной группой, обработанной TNBS |
| ТАБЛИЦА 2: | |||
| ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА БАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ МИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ IBD, ИНДУЦИРОВАННОМ TNBS, У КРЫС ПОСЛЕ 10 СУТОК ЛЕЧЕНИЯ | |||
| Здоровый контроль | Контроль, обработанный TNBS | Тестируемое лекарственное средство | |
| Бальный показатель микроскопической оценки | 0,00±0,00 | 8,80±0,58### | 4,40±0,68*** |
| Степень язвенного заболевания толстой кишки | 0,00±0,00 | 9,9210,31### | 2,85±0,17*** |
| n=6; для каждого из параметров данные анализировали с использованием критерия Крускала-Уоллиса с последующим критерием множественного сравнения _ана. ###P<0,001 по сравнению со здоровой контрольной группой; *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой, обработанной TNBS. |
| ТАБЛИЦА 3: | |||
| ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА МАССУ ТЕЛА ПРИ IBD, ИНДУЦИРОВАННОМ TNBS, У КРЫС ПОСЛЕ 10 СУТОК ЛЕЧЕНИЯ | |||
| Сутки | Здоровый контроль | Контроль, обработанный TNBS | Тестируемое лекарственное средство |
| Нормальные (Сутки-2) | 291,00±1,83 | 280,33±2,62нз | 286,50±3,14нз1 |
| Сутки 0 | 264,17±2,21 | 250,00±2,00# | 252,67±3,12нз1 |
| Сутки 11 (10 суток лечения) | 296,33±1,45 | 229,60±0,81### | 293,00±0,84*** |
| n=6; данные анализировали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с последующими апостериорными критериями Бонферрони. #P<0,05, ###P<0,001 по сравнению со здоровой контрольной группой; ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой, обработанной TNBS, в соответствующие сутки, нз - не значимо по сравнению со здоровым контролем; нз1 - не значимо по сравнению с крысами, индуцированными TNBS. |
Эффекты тестируемых лекарственных средств на IBD, индуцированное TNBS, явно указывали на терапевтическое значение тестируемого лекарственного средства в лечении и управлении IBD.
ПРИМЕР 8: эффект тестируемого лекарственного средства на колит, индуцированный уксусной кислотой, у крыс
Колит, индуцированный уксусной кислотой, представляет собой модель IBD со сходством воспалительных медиаторов с воспалительными медиаторами острого воспаления кишечника человека.
Методика: в данной модели исходное повреждение представляло собой некроз и отек эпителия, которые переменчиво простирались в собственную пластинку, подслизистую оболочку или наружные мышечные слои, в зависимости от концентраций и продолжительности воздействия уксусной кислоты. Тестируемое лекарственное средство давали самцам крыс Wistar (280-291 г) один раз в сутки в дозе 50 мг/кг (перорально), начиная за 72 ч до индукции колита. Крысы голодали в течение 24 ч, их подвергали анестезии и вставляли в анус на глубину 8 см канюлю, которая имеет диаметр 3 мм, для введения по каплям 2 мл 3%-ной уксусной кислоты в толстую кишку в течение 30 с.Через 24 часа животных умерщвляли смещением шейных позвонков, выделяли толстую кишку и измеряли параметры колита.
Наблюдения: предобработка тестируемым лекарственным средством у крыс в течение 3 суток имела значимый обращающий эффект при симптомах колита, индуцированного уксусной кислотой. Наблюдали обращение состояний, индуцированных уксусной кислотой, таких как повышенные масса толстой кишки и отношение массы к длине толстой кишки, что указывало на полезные эффекты тестируемых лекарственных средств на колит. Данные эффекты дополнительно подтверждались снижением бального показателя макроскопического поражения и миелопероксидазной активности в тканях толстой кишки.
| ТАБЛИЦА 4: | |||
| ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ПАРАМЕТРЫ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ КОЛИТЕ, ИНДУЦИРОВАННОМ УКСУСНОЙ КИСЛОТОЙ, У КРЫС ПОСЛЕ ПРЕДОБРАБОТКИ В ТЕЧЕНИЕ 3 СУТОК | |||
| Здоровый контроль | Контроль, обработанный уксусной кислотой | Тестируемое лекарственное средство | |
| Масса толстой кишки (г) | 1,11±0,07 | 2,49±0,14### | 1,5310,10"" |
| Длина толстой кишки (мм) | 17,73±0,18 | 13,55±0,44### | 16,22±0,63*** |
| Ширина толстой кишки (мм) | 0,40±0,03 | 1,07±0,06### | 0,71±0,05*** |
| Отношение масса/длина толстой кишки | 0,06±0,0002 | 0,18±0,006### | 0,09±0,01*** |
| Миелопероксидазная активность (U/мг) | 0,01±0,001 | 0,04±0,006### | 0,02±0,002*** |
| n=6; для каждого из параметров данные анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим критерием Даннетта. | |||
| ###P<0,001 по сравнению со здоровой контрольной группой; ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой, обработанной уксусной кислотой. |
| ТАБЛИЦА 5: | |||
| ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА БАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ МИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ КОЛИТЕ, ИНДУЦИРОВАННОМ УКСУСНОЙ КИСЛОТОЙ, У КРЫС ПОСЛЕ ПРЕДОБРАБОТКИ В ТЕЧЕНИЕ 3 СУТОК | |||
| Здоровый контроль | Контроль, обработанный уксусной кислотой | Тестируемое лекарственное средство | |
| Бальный показатель микроскопической оценки | 0,00±0,00 | 9,33±0,33### | 4,33±0,71** |
| Степень язвенного заболевания толстой кишки | 0,00±0,00 | 13,72±0,48### | 4,34±0,29*** |
| n=6; для каждого из параметров данные анализировали с использованием критерия Крускала-Уоллиса с последующим критерием множественного сравнения Данна. ###P<0,001 по сравнению со здоровой контрольной группой; **P<0,01 и ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой, обработанной уксусной кислотой. |
Эффекты тестируемых лекарственных средств на колит, индуцированный уксусной кислотой, явно указывали на терапевтическое значение тестируемого лекарственного средства при управлении IBD.
ПРИМЕР 9: эффект тестируемого лекарственного средства на желудочные заболевания при инфекции Н.pylori
Эффект тестируемого лекарственного средства на устранение Н.pylori тестировали при язвенных заболеваниях, индуцированных NSAID, у крыс после хронического введения в течение 9 недель. Инфекцию Н.pylori отслеживали полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и быстрым уреазным тестом (RUT) для подтверждения хронической обработки.
Методика: самцы крыс Wistar (200-230 г) голодали в течение 24 ч, и им давали напроксен в дозе 30 мг/кг (перорально) в течение 3 последовательных суток. Через 24 часа вводили бруцельный питательный раствор жизнеспособной H.pylori (АТСС (Американская коллекция типовых культур) 26695, штамм MS-5, 108 CFU (колониеобразующая единица)) (1 мл/животное) последовательно в течение 3 суток. Через 1 неделю вводили тестируемое лекарственное средство либо в дозе 120 мг/кг (перорально) дважды в сутки, либо 240 мг/кг (перорально) один раз в сутки, либо 360 мг/кг (перорально) один раз в сутки. Животных умерщвляли при завершении 9-недельной обработки. Выделяли желудок умерщвленного животного, слизистую желудка промывали физиологическим раствором и отделяли привратник желудка для RUT. Слизистую оболочку соскабливали для оценки миелопероксидазы, и ДНК амплифицировали ПЦР, проводя гель-электрофорез для двух немутировавших генов 16S rRNA и hrgA.
Наблюдения: статус инфекции отслеживали в желудке крыс посредством RUT и ПЦР-амплификации двух генов Н.pylori после 4, 6 и 9 недель обработки. Наблюдали, что тестируемое лекарственное средство в дозе 360 мг/кг (перорально) демонстрирует быстрое антибактериальное действие на 3-ю неделю и последующее устранение инфекции Н.pylori в 9 недель. Однако тестируемое лекарственное средство, введенное в меньших дозах 120 мг/кг (перорально) дважды в сутки и 240 мг/кг (перорально) один раз в сутки не было эффективным в устранении Н.pylori. Эффект тестируемого лекарственного средства явно показал терапевтическое значение при устранении инфекции Н. pylori в высоких дозах и также предоставил фармакологическое доказательство терапевтического потенциала для лечения желудочных заболеваний и карцином желудка, связанных с Н.pylori.
ПРИМЕР 10: профилактический эффект тестируемого лекарственного средства на желудочные заболевания, индуцированные лекарственными средствами.
Желудочные поражения, индуцированные NSAID лекарственными средствами, такими как напроксен, могут усугублять воспалительные реакции в ЖК тракте. Потенциал тестируемого лекарственного средства в предупреждении желудочных поражений, индуцированных лекарственными средствами, исследовали в животных моделях язвенных заболеваний, индуцированных напроксеном.
Методика: самцов крыс Wistar (220-230 г) предобрабатывали тестируемым лекарственным средством в дозах 30 мг/кг (перорально), либо 60 мг/кг (перорально), либо 120 мг/кг (перорально), и затем вводили напроксен в дозе 30 мг/кг (перорально). Образование язвы и область изъязвления сравнивали с контрольной группой, обработанной напроксеном, которая не подвергалась предобработке тестируемым лекарственным средством.
Наблюдения: наблюдали, что предобработка тестируемым лекарственным средством предупреждала образование язвы дозозависимым образом. Обнаружили, что наивысшая доза 120 мг/кг является наиболее эффективной в защите против вызывающего язву действия напроксена. Соответственно, тест показал потенциальный профилактический эффект против вызывающего язву действия лекарственных средств.
| ТАБЛИЦА 6: | |
| ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ИНДУЦИРОВАННЫЕ НАПРОКСЕНОМ ЖЕЛУДОЧНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ У КРЫС | |
| Область изъявления (мм2) | |
| Напроксен Контроль | 5,50±0,158 |
| Тестируемое лекарственное средство (30 мг/кг)+напроксен | 5,49±0,212нз |
| Тестируемое лекарственное средство (60 мг/кг)+напроксен | 4,52±0,169** |
| Тестируемое лекарственное средство (120 мг/кг)+напроксен | 2,632±0,146*** |
| n=6; данные анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Даннетта. нз - не значимо; **P<0,01, ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой, обработанной напроксеном. |
ПРИМЕР 11: профилактический эффект тестируемого лекарственного средства на желудочные заболевания, индуцированные стрессом
Желудочное поражение, индуцированное стрессом, представляет собой состояние, которое может вызвать или усугублять воспалительные реакции в ЖК тракте. Потенциал тестируемого лекарственного средства в предупреждении желудочных поражений, индуцированных стрессом, исследовали в животных моделях язвенных заболеваний, индуцированных гистамином.
Методика: самцов крыс Wistar (220-230 г) предобрабатывали тестируемым лекарственным средством в дозах 30 мг/кг (перорально), либо 60 мг/кг (перорально), либо 120 мг/кг (перорально), и затем вводили гистамин в дозе 300 мг/кг (внутрибрюшинно). Образование язвы и площадь изъязвления сравнивали с контрольной группой, которая не подвергалась предобработке тестируемым лекарственным средством.
Наблюдения: наблюдали, что предобработка тестируемым лекарственным средством предупреждала образование язвы дозозависимым образом. Наивысшая доза 120 мг/кг была наиболее эффективной в защите против вызывающего язву действия гистамина. Следовательно, подтвердили, что тестируемое лекарственное средство имеет потенциальный профилактический эффект против язвенных заболеваний, индуцированных стрессом.
| ТАБЛИЦА 7: | |
| ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ИНДУЦИРОВАННЫЕ ГИСТАМИНОМ ЖЕЛУДОЧНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ У КРЫС | |
| Область изъязвления (мм) | |
| Гистамин Контроль | 10,66±0,1302 |
| Тестируемое лекарственное средство (30 мг/кг)+напроксен | 9,242±0,415* |
| Тестируемое лекарственное средство (60 мг/кг)+напроксен | 7,062±0,362*** |
| Тестируемое лекарственное средство (120 мг/кг)+напроксен | 4,598±0,323*** |
| n=6; данные анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Даннетта. *P<0,05, ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой, обработанной гистамином. |
ПРИМЕР 12: профилактический эффект тестируемого лекарственного средства на желудочные заболевания, индуцированные алкоголем, у крыс.
Потребление алкоголя является другим важным фактором, приводящим к желудочным поражениям. Соответственно, исследовали потенциал тестируемого лекарственного средства в предупреждении язвенных заболеваний, индуцированных этанолом, у животных.
Методика: самцов крыс Wistar предобрабатывали тестируемым лекарственным средством в дозах 30 мг/кг (перорально), либо 60 мг/кг (перорально), либо 120 мг/кг (перорально), и затем вводили этанол в дозе 8 мл/кг (перорально). Образование язвы и область изъязвления сравнивали с контрольной группой, которая не подвергалась предобработке тестируемым лекарственным средством. В данном исследовании было измерено, что средняя площадь язвы составляла 174,4 мм2±5,814 мм2 в контрольной группе, указывая на вызывающий язву эффект этанола.
Наблюдения: наблюдали, что предобработка тестируемым лекарственным средством предупреждала образование язв дозозависимым образом. Наивысшая доза 120 мг/кг была самой эффективной в защите против вызывающего язву действия этанола. Соответственно, был подтвержден значимый профилактический эффект тестируемого лекарственного средства против язвенных заболеваний, индуцированных потреблением алкоголя.
| ТАБЛИЦА 8: | |
| ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ЖЕЛУДОЧНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ЭТАНОЛОМ, У КРЫС | |
| Область изъязвления (мм2) | |
| Этанол Контроль | 174,4±5,814 |
| Тестируемое лекарственное средство (30 мг/кг)+напроксен | 159,3±4,846* |
| Тестируемое лекарственное средство (60 мг/кг)+напроксен | 137,6±4,069*** |
| Тестируемое лекарственное средство (120 мг/кг)+напроксен | 110,4±2,305*** |
| n=6; данные, проанализированные с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Даннетта. *P<0,05, ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой, обработанной этанолом. |
ПРИМЕР 13: эффект тестируемого лекарственного средства при лечении IBD у людей
Провели перспективное исследование для оценки эффективности тестируемого лекарственного средства у пациентов с IBD.
Методика: в данном исследовании трем пациентам, страдающим от хронических симптомов воспалительного заболевания кишечника, давали тестируемое лекарственное средство в дозе 300 мг дважды в сутки в течение периода 6 месяцев. Затем анализировали эффективность тестируемого лекарственного средства на основе результата, доложенного пациентом, в начале и в конце исследуемого периода.
Наблюдения: наблюдали, что все пациенты испытывали облегчение симптомов, относящихся к IBD, таких как боль в области живота, диарея, аноректальное кровотечение, лихорадка, тошнота и рвота. Кроме того, наблюдали то, что имелось значимое улучшения контроля за кишечником, которое было заметно из-за пониженной частоты посещений туалетов, пониженной зависимости от лекарственных средств против диареи и ослабленной боли, ассоциированной с перистальтикой кишечника. Кроме того, наблюдали то, что не было случаев боли в суставах, кожных заболеваний или осложнений, связанных с глазами. Кроме того, наблюдали то, что тестируемое лекарственное средство хорошо переносилось и демонстрировало эффективность при лечении IBD.
| ТАБЛИЦА 9: | ||||||
| ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ПРИ ЛЕЧЕНИИ IBD У ЛЮДЕЙ В ТЕЧЕНИЕ 6 МЕСЯЦЕВ | ||||||
| Симптомы | Результат, записанный пациентом† | |||||
| Пациент 1 | Пациент 2 | Пациент 3 | ||||
| До | После | До | После | До | После | |
| Боль в области живота | 3 | 1 | 3 | 0 | 3 | 1 |
| Диарея | 3 | 0 | 3 | 0 | 3 | 2 |
| Кровотечение | 3 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 |
| Частое посещение туалета | 3 | 0 | 3 | 1 | 3 | 0 |
| Зависимость от лекарственного средства против диареи и боли | 3 | 0 | 3 | 0 | 3 | 1 |
| 1 - Шкала тяжести симптомов IBD (0 - отсутствие; 1 - легкие; 2 - умеренные; 3 - тяжелые). |
ПРИМЕР 14: эффект тестируемого лекарственного средства при лечении геморроидальных узлов у людей
Провели перспективное неконтролируемое пилотное исследование для оценки эффективности тестируемого лекарственного средства у пациентов с геморроидальными узлами.
Методика: в данном исследовании пяти пациентам, страдающим от хронических геморроидальных симптомов в виде аноректального кровотечения, боли во время дефекации и ректального раздражения, давали тестируемое лекарственное средство в дозе 300 мг дважды в сутки в течение 15 суток. Эффективность тестируемого лекарственного средства анализировали на основе результата, доложенного пациентом, в начале и в конце периода исследования.
Наблюдения: наблюдали, что тестируемое лекарственное средство имело эффективность в предоставлении немедленного облегчения симптомов геморроидальных узлов и анальных трещин. Кроме того, наблюдали, что у всех пациентов облегчалось аноректальное кровотечение на 3-тьи сутки лечения тестируемым лекарственным средством. Кроме того, наблюдали, что имелось значимое облегчение боли и раздражения, ассоциированных с перистальтикой кишечника, к концу периода лечения.
| ТАБЛИЦА 10: | ||
| ЭФФЕКТ ТЕСТИРУЕМОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ПРИ ЛЕЧЕНИИ ГЕМОРРОИДАЛЬНЫХ УЗЛОВ У ЛЮДЕЙ В ТЕЧЕНИЕ 15 СУТОК | ||
| Симптомы | Значение медианы результата, доложенного пациентом† (n=5) | |
| До лечения | После лечения | |
| Боль | 5 | 2 |
| Отек | 3 | 1 |
| Зуд | 5 | 2 |
| Кровяной стул | 5 | 0 |
| Затруднения при сидении или хождении | 5 | 1 |
| †Шкала оценки (от 0 - отсутствие до 5 - тяжелый) |
Настоящее изобретение было описано иллюстративным образом, и следует понимать, что использованная терминология предназначена для того, чтобы относиться к сущности описания, а не к ограничению.
Оно (описание) не предназначено для того, чтобы быть исчерпывающим или ограничивать изобретение точной раскрытой формой. В свете приведенных выше идей возможны многие модификации и подтверждения. Подразумевается, что объем изобретения ограничивается не этим подробным описанием, но скорее приложенной к нему формулой изобретения. Также следует понимать, что следующая формула изобретения предназначена для того, чтобы охватывать все из описанных здесь видовых и конкретных характеристик изобретения.
1. Способ получения азиатикозида по меньшей мере 99%-ной чистоты, включающий стадии:
а) обработки измельченного материала Centella asiatica петролейным эфиром;
б) экстрагирования обработанного измельченного материала алифатическим спиртом, одним или в комбинации с водой, с получением экстракта или фильтрата;
в) перегонки и растворения экстракта или фильтрата в метилизобутилкетоне с получением раствора;
г) пропускания раствора через слой смолы и элюирования спиртовым растворителем с получением элюата; и
д) концентрирования элюата в вакууме с получением порошка азиатикозида; и
е) растворения порошка в спирте, выбранном из группы, включающей метиловый спирт, этиловый спирт, пропиловый спирт, изопропиловый спирт и любые их комбинации, и кристаллизации с получением азиатикозида по меньшей мере 99%-ной чистоты.
2. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей азиатикозид по меньшей мере 99%-ной чистоты наряду с фармацевтически приемлемым эксципиентом(ами), включающий акты:
а) обработки измельченного материала Centella asiatica петролейным эфиром;
б) экстрагирования обработанного измельченного материала алифатическим спиртом, одним или в комбинации с водой, с получением экстракта или фильтрата;
в) перегонки и растворения экстракта или фильтрата в метилизобутилкетоне с получением раствора;
г) пропускания раствора через слой смолы и элюирования спиртовым растворителем с получением элюата;
д) концентрирования элюата в вакууме с получением порошка азиатикозида;
е) растворения порошка в спирте, выбранном из группы, включающей метиловый спирт, этиловый спирт, пропиловый спирт, изопропиловый спирт и любые их комбинации, и кристаллизации с получением азиатикозида; и
ж) добавления к азиатикозиду фармацевтически приемлемого эксципиента(тов) с получением фармацевтической композиции, содержащей азиатикозид по меньшей мере 99%-ной чистоты.
3. Способ по п. 1 или 2, где указанная экстракция проводится при температуре, варьирующей от примерно 20°C до примерно 30°C, в период времени от примерно 8 часов до примерно 24 часов.
4. Способ по п. 1 или 2, где указанный алифатический спирт выбран из группы, состоящей из метилового спирта, этилового спирта, пропилового спирта, изопропилового спирта и бутилового спирта, где соотношение алифатического спирта в комбинации с водой составляет от примерно 60% до примерно 99%.
5. Способ по п. 1 или 2, где указанный экстракт растворен в деминерализованной воде.
6. Способ по п. 1 или 2, где указанный спиртовой растворитель имеет число атомов углерода, варьирующее от С-1 до С-4, выбранный из группы, состоящей из метанола и изопропилового спирта или их любой комбинации.
7. Способ по п. 1 или 2, где указанное концентрирование в вакууме проводится при температуре, варьирующей от примерно 50°C до примерно 65°C.
8. Способ по п. 1 или 2, где указанная кристаллизация проводится при температуре, варьирующей от примерно -15°C до примерно 0°C.
9. Способ по п. 2, где указанная композиция приготовлена в виде препарата таблеток, лепешек, пастилок, водных или масляных суспензий, мазей, пластырей, гелей, лосьонов, средств для ухода за полостью рта, капсул, эмульсий, кремов, спреев, капель, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий в твердых или мягких гелевых капсулах, сиропов, эликсиров, фитоцевтиков, нутрицевтиков и продуктов питания или их любых комбинаций.
10. Способ лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, геморроя, анальной трещины, свища, желудочного заболевания, карциномы желудка и устранения инфекции Helicobacter pylori или их любой комбинации, включающий акт введения субъекту, нуждающемуся в этом, дозы азиатикозида, полученного способом по п. 1.
11. Способ предупреждения заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака толстой кишки, желудочного заболевания, карциномы желудка и вызывающего язву эффекта лекарственных средств или их любой комбинации, включающий акт введения субъекту, нуждающемуся в этом, дозы азиатикозида, полученного способом по п. 1.
12. Способ по п. 10 или 11, где доза азиатикозида вводится наряду с фармацевтически приемлемым эксципиентом(ами).
13. Способ по п. 10 или 11, где указанный фармацевтически приемлемый эксципиент выбран из группы, состоящей из гранулирующих агентов, связующих агентов, смазок, разрыхлителей, подсластителей, скользящих веществ, антиадгезивных средств, антистатиков, поверхностно-активных веществ, антиоксидантов, камедей, веществ покрытий, красителей, корригентов, пластификаторов, консервантов, суспендирующих агентов, эмульгаторов и сферообразующих агентов или их любой комбинации.
14. Способ по п. 10 или 11, где указанный субъект представляет собой животное, включая человека.
15. Способ по п. 10 или 11, где указанная композиция вводится животным в дозировке, варьирующей от примерно 1 мг/кг до примерно 360 мг/кг.
16. Способ по п. 10 или 11, где указанная композиция вводится людям в дозировке, варьирующей от примерно 1 мг/кг до примерно 60 мг/кг.
