Идентификация низкомолекулярных соединений, распознаваемых антителами у индивидуумов с нейродегенеративными заболеваниями

Группа изобретений относится к области медицины, в частности молекулярной биологии, иммунологии и нейробиологии. Предложены способ ex vivo детекции антител в содержащем антитела образце, включающий контактирование содержащего антитела образца с подложкой с закрепленным на ней пептоидом и детекцию антител, связавшихся с указанным пептоидом, и способ детекции антитела в биологической жидкости, включающий стадии инкубации панели пептоидов с блокирующим буфером, удаления блокирующего буфера, инкубации панели пептоидов с раствором образца, содержащим бактериальный лизат и детекции антитела, связавшегося с панелью пептоидов. Предложены наборы и композиции для осуществления вышеуказанных способов, выделенное антитело и выделенный пептоид для детекции антител. Предложенная группа изобретений позволяет эффективно диагностировать болезнь Альцгеймера или предсказать нейродегенеративное заболевание у индивидуумов. 9 н. и 10 з.п. ф-лы, 16 ил., 6 табл., 3 пр.

 

Предшествующий уровень техники

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительных заявок США с серийными №№ 61/183260, поданной 2 июня 2009 г., и 61/318655, поданной 29 марта 2010 г., каждая из которых, таким образом, во всей своей полноте включена в данное описание посредством ссылки.

Настоящее изобретение сделано с поддержкой правительства по гранту № NO1-HV28185 института National Heart, Lung and Blood Institute и гранту № DP10D00066301 института National Institutes of Health. Правительство имеет определенные права на изобретение.

I. Область техники, к которой относится изобретения

Настоящее изобретение в основном относится к областям молекулярной биологии, иммунологии и нейробиологии. Более конкретно, оно относится к идентификации пептоидов, которые распознаются специфичными к нейродегенеративным заболеваниям (ND) антителами. Эти пептоиды можно использовать для идентификации индивидуумов, страдающих ND или с риском ND.

II. Описание уровня техники

Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой прогрессирующее и летальное заболевание головного мозга, поражающее до 5,3 миллионов американцев. AD разрушает клетки головного мозга, вызывая расстройства памяти, мышления и поведения. Эти симптомы с течением времени ухудшаются, и в конечном итоге заболевание становится летальным. В настоящее время оно является шестой лидирующей причиной смертных случаев в Соединенных Штатах Америки и является наиболее общей формой деменции, составляя 50-70% всех случаев деменции. К сожалению, хотя существуют способы лечения симптомов, выздоровления не происходит.

Диагностика болезни Альцгеймера представляет собой эмпирический процесс, включающий несколько типов анализов, и до завершения может занимать от многих дней до недель. Анализы включают получение подробного анамнеза и физическое обследование. Кроме того, для помощи в исключении других возможных состояний в основном предназначены стандартные лабораторные анализы, включая анализы крови, мочи и CSF. Также проводят нейропсихологическое тестирование с использованием множества средств для оценки памяти, способности решать задачи, внимания, зрительно-моторной координации и абстрактного мышления. Также следует включать тесты на депрессию. Кроме того, для исключения опухолей головного мозга или тромбов в головном мозге в качестве причины симптомов рекомендована томография головного мозга. В целом, в настоящее время не существует единого теста, посредством которого можно достоверно диагностировать болезнь Альцгеймера, причем окончательный диагноз болезни Альцгеймера возможен, только при посмертном исследовании ткани головного мозга.

Болезнь Паркинсона (PD) представляет собой другое дегенеративное заболевание головного мозга (центральной нервной системы), которое часто ухудшает двигательные навыки, речь и другие функции. Оно влияет на двигательную активность (моторные симптомы), и другие типичные симптомы включают нарушения настроения, поведения, мышления и восприятия (немоторные симптомы). Индивидуальные симптомы у пациента могут довольно сильно различаться, и прогрессирование заболевания также в значительной степени индивидуально. Симптомы PD являются следствием потери (идиопатической или генетической, токсической или травматической) пигментированных секретирующих дофамин (дофаминергических) клеток в области компактной части черной субстанции (в буквальном смысле "черного вещества"). Эти нейроны проецируются в полосатое тело, и их потеря приводит к изменению активности нервных цепей в базальных ганглиях, регулирующих движение, по существу к ингибированию прямого пути и возбуждению непрямого пути.

Диагноз PD является подходящим, если что-либо другое является сомнительным. При проведении неврологического обследования для оценки пациента с любыми нарушениями движений, врач должен составлять историю болезни и проводить медицинский осмотр. Кроме того, неврологическое обследование проводят с получением подробной оценки нервной системы, включая наблюдение за проблемами с движением, координацией и поддержанием баланса у пациента. Лабораторное тестирование крови пациентов с симптомами, типичными для болезни Паркинсона, только иногда обнаруживают какие-либо отклонения. На электроэнцефалограммах (EEG) иногда записываются некоторые проблемы с электрической активностью головного мозга, но они не эффективны для выявления PD. Сканирование МРТ и КАТ головного мозга дают очень хорошие и тонкие анатомические изображения, но головной мозг людей с PD выглядит нормальным даже при этом исследовании, так как изменения, ассоциированные с PD, являются микроскопическими и не выявляются посредством сканирования этого типа. Без точных диагностических тестов, дающих конкретные ответы, врачам приходится основывать свой диагноз PD по своему усмотрению.

Таким образом, остается потребность в диагностических способах для обоих этих заболеваний и других неврологических заболеваний, которые являются (i) точными и объективными, (ii) простыми и воспроизводимыми и (iii) пригодными в случаях ранней и поздней стадий.

Сущность изобретения

Согласно настоящему изобретению предоставлены композиции, содержащие пептоид(ы), которые связывают антитела, характерные для нейродегенеративных заболеваний, и способы детекции антител в содержащем антитела образце, включающие контактирование содержащего антитела образца с подложкой с закрепленным на ней пептоидом. Пептоиды настоящего изобретения имеют формулы:

,

где R¹ и R⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; C_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; лизила; карбоксила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже. R², R³ и R⁵ независимо выбраны из группы, состоящей из C_0-6алкиларила; C_0-6алкилгетероарила; C_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из OH, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкила или C_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкинила); OC_1-6алкила; C_2-6алкенила; C_2-6алкинила; C_2-6алкенила и C_2-6алкинила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже;

или

,

где R₆ выбран из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; C_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; лизила; карбоксила и гидроксильной группы - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже. R⁷ и R⁸ независимо выбраны из группы, состоящей из C_0-6алкиларила; C_0-6алкилгетероарила; C_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из OH, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкила или C_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкинила); OC_1-6алкила; C_2-6алкенила; C_2-6алкинила; C_2-6алкенила и C_2-6алкинила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже;

или

,

где R⁹, R¹¹ и R¹³ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; C_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; лизила; карбоксила и гидроксильной группы - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже. R¹⁰, R¹² и R¹⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из C_0-6алкиларила; C_0-6алкилгетероарила; C_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из OH, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкила или C_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкинила); OC_1-6алкила; C_2-6алкенила; C_2-6алкинила; C_2-6алкенила и C_2-6алкинила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже;

или

,

где в одном из вариантов осуществления R¹⁷-R²⁰ и R²³ формулы 1D независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; C_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; лизила; карбоксила и гидроксильной группы - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже. R²¹, R²² и R²⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из C_0-6алкиларила; C_0-6алкилгетероарила; C_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из OH, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкила или C_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкинила); OC_1-6алкила; C_2-6алкенила; C_2-6алкинила; C_2-6алкенила и C_2-6алкинила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже.

В другом варианте осуществления R¹⁷-R²⁰, R²³ и R²⁴ формулы 1D независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; C_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; лизила; карбоксила и гидроксильной группы - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже. R²¹ и R²² независимо выбраны из группы, состоящей из C_0-6алкиларила; C_0-6алкилгетероарила; C_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из OH, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкила или C_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкинила); OC_1-6алкила; C_2-6алкенила; C_2-6алкинила; C_2-6алкенила и C_2-6алкинила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже.

В еще одном дополнительном варианте осуществления R¹⁷, R¹⁹, R²⁰ и R²³ формулы 1D независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; C_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; лизила; карбоксила и гидроксильной группы - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже. R¹⁸, R²¹ и R²⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из C_0-6алкиларила; C_0-6алкилгетероарила; C_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из OH, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкила или C_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкинила); OC_1-6алкила; C_2-6алкенила; C_2-6алкинила; C_2-6алкенила и C_2-6алкинила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже.

В формуле 1A R2, R3, R4 и R5 могут быть дополнительно выбраны из групп, представленных в таблицах 1 и 2 для эквивалентных буквенных обозначений, которые предоставлены для конкретных положений пептоидных мономеров в олигомерах ADP1-3 и PDP1-3. Например, в формуле 1A, переменные R, выбранные из R2, R3 и R5, могут быть независимо выбраны из боковых цепей или мономеров, показанных в таблицах 1 и/или 2 для конкретного пептоида ADP1, как A, B или C, и так далее для ADP2 (D, E или F) и ADP3 (G, H или I).

В формуле 1B R7 и R8 могут быть дополнительно выбраны из групп, представленных в таблицах 1 и 2 для эквивалентных буквенных обозначений, предоставленных для конкретных положений пептоидных мономеров в олигомерах ADP1-3. Например, в формуле 1B, переменные R, выбранные из R7 и R8, могут быть независимо выбраны из боковых цепей или мономеров, представленных в таблицах 1 и/или 2 для конкретного пептоида ADP1, как C, и так далее для ADP2 (E или F) и ADP3 (I).

В формуле 1C R10, R11, R12 и R14 могут быть дополнительно выбраны из групп, представленных в таблицах 1 и 2 для эквивалентных буквенных обозначений, предоставленных для конкретных положений пептоидных мономеров в олигомер ADP1-3. Например, в формуле 1C переменные R, выбранные из R7 и R8, могут быть независимо выбраны из боковых цепей или мономеров, представленных в таблицах 1 и/или 2 для конкретного пептоида ADP1, как A, B или C; и так далее для ADP2 (D, E или F) и ADP3 (G, H или I).

В формуле 1D, R21, R22, R23 и R24 могут быть дополнительно выбраны из групп, представленных в таблицах 1 и 2 для эквивалентных буквенных обозначений, предоставленных для конкретных положений пептоидных мономеров в олигомер ADP1-3. Например, в формуле 1D переменные R, выбранные из R7 и R8, могут быть независимо выбраны из боковых цепей или мономеров, представленных в таблицах 1 и/или 2 для конкретного пептоида ADP1, как A, B или C; и так далее для ADP2 (D, E или F) и ADP3 (G, H или I).

В формулах, описанных в данном описании, Z представляет собой связующую группу, которая может включать одну или несколько аминокислотных или функциональных групп; L представляет собой необязательный линкерный фрагмент, M представляет собой субстрат или подложку, или метку; и m, n, o и/или p равны 0-6.

Способы также могут включать (b) детекцию антител, связавшихся с указанным пептоидом.

В определенных аспектах, как описано в данном описании, пептоид может содержать концевую функциональную группу на карбокси- или амино-конце; функциональная группа способна связываться с подложкой, линкерным фрагментом, меткой или другими частями молекулы. В определенном аспекте с пептоидом связан концевой остаток цистеина, и он может предоставлять сульфгидрильную группу для дальнейшего связывания пептоида с субстратом. В других аспектах карбокси-конец может содержать NH₂, OH или другую химическую группу, которая в дальнейшем может взаимодействовать с субстратом (прямо или косвенно) или линкером, или другим фрагментом.

Можно использовать широкий спектр линкеров. Линкерный компонент в его простейшей форме представляет собой связь между пептоидом и вторым фрагментом, таким как субстрат или другая молекулярная структура. В более общем смысле, линкер предоставляет моно- или мультимолекулярный каркас, ковалентно или нековалентно связывающий один или несколько пептоидов с одним или несколькими субстратами или с одной или несколькими частями молекулярной структуры. Таким образом, связывание пептоида, описываемого в данном описании, с желаемыми субстратом или фрагментом можно достигать посредством ковалентного или нековалентного связывания, как правило, включающего взаимодействие с одной или несколькими функциональными группами, расположенными на пептоиде и/или субстрате или второй молекулярной структуре. Примеры химически реакционноспособных функциональных групп, которые можно использовать для этой цели, включают аминогруппу, гидроксильную, сульфгидроксильную, карбоксильную и карбонильную группы, а также углеводные группы, смежные диолы, тиоэфиры, 2-аминоспирты, 2-аминотиолы, гуанидинильные, имидазолильные и фенольные группы.

Способы могут дополнительно включать получение образца от индивидуума. Способ также может дополнительно включать постановку у индивидуума, от которого получали указанный образец, диагноза болезни Альцгеймера, если уровень связывания антитела с указанным пептоидом, превосходит уровень, наблюдаемый у контрольных не подверженных заболеванию пациентов. В еще одном дополнительном аспекте способы могут дополнительно включать предписание индивидууму конкретного лекарственного средства или терапии.

В определенных вариантах осуществления пептоид может быть выбран из группы, состоящей из AD1 (ADP1), AD2 (ADP2) и AD3 (ADP3), где Z является таким, как описано выше. Образец можно контактировать более чем с одним пептоидом формул 1A-1D, например, с такими как три структурно различные пептоиды (например, AD1, AD2 и AD3).

В определенных аспектах подложка может представлять собой гранулу, планшет, тест-полоску, фильтр, мембрану, иглу или лунку. Образец может представлять собой кровь, сыворотку, слюну или CSF. Стадия детекции может включать RIA, FIA, ELISA, вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, FRET или поверхностный плазмонный резонанс.

В определенных аспектах пептоид настоящего изобретения может содержать одну из следующих формул:

(i) (X)_0-4(метилбензил)(метилбензил)(н-бутиламин)(н-бутиламин),

(ii) (X)_0-4(аллил)(аллил)(н-бутиламин)(X) или

(iii) (X)(пиперонил)(X)_0-2(н-бутиламин)(X)_0-2(глицин),

где X может представлять собой водород; алкил; аллил; метил; этил; н-пропил; изопропил; н-бутил; изобутил; н-бутиламин; втор-бутил; трет-бутил; пентил; гексил; изопентил или гидроксильную группу. В предпочтительном варианте осуществления мономерные амины или аминокислоты выбраны из глицина, цистеина, аллиламина, этаноламина, изобутиламина, диаминобутана, метилбензиламина, пиперониламина, 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонамида, фурфуриламина, бензиламина, 3-метоксипропиламина (MPOA), 2-метоксиэтиламина и циклогексиламинамина. Такие мономеры можно использовать в любой комбинации с формированием олигомеров длиной 3-12 мономеров.

Варианты осуществления включают пептоиды из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более мономерных единиц. В определенных аспектах пептоид может содержать пептоидную последовательность от положения 1, 2, 3, 4, 5, 6 до положения 8 или от положения 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 до положения 1 или любой пептоид из 2, 3, 4, 5, 6, 7 мономеров между ними.

Мономеры могут содержать различные комбинации групп R, например, водород; алкил; аллил; метил; этил; н-пропил; изопропил; н-бутил; изобутил; н-бутиламин; втор-бутил; трет-бутил; пентил; гексил; изопентил; арил; гетероарил; фуранил; индолил; тиофенил; тиазолил; имидазолил; изоксазоил; оксазоил; пиперонил; пиразоил; пирролил; пиразинил; пиридил; пиримидил; пиримидинил; пуринил; циннолинил; бензофуранил; бензотиенил; бензотриазолил; бензоксазолил; хинолин; изоксазолил; изохинолин циклоалкил; алкенил; циклоалкенил; фенил; пиридил; метоксиэтил; (R)-метилбензил; C_1-6алкил, незамещенный или замещенный группой NH₂, OH или SH; C_2-6алкинил, незамещенный или замещенный группой NH₂, OH или SH; лизил; карбоксил или гидроксильную группу - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже.

В определенных аспектах определенные мономерные единицы формул ADP1, ADP2 и/или ADP3 могут представлять собой выбранные группы и в конкретных положениях, как указано в таблицах 1-3. Наиболее предпочтительные варианты осуществления представляют собой конкретные соединения, представленные как ADP1, ADP2, ADP3, и они дополнительно включают активные соединения, идентифицированные при сканировании саркозином, которое идентифицирует конкретные мономеры, указанные в положениях A-I на структурах, представленных ниже для ADP1-3. В таблицах 1 и 2 ниже эти буквенные обозначения представлены в левой колонке для конкретных положений на ADP1-3, которые дополнительно могут иметь боковые цепи, показанные в таблице 1 (используя амины с указанными боковыми цепями), или замещенные амины, показанные в таблице 2, и в таких конкретных предпочтительных положениях. Остатки A-I в структурах ADP1, ADP2 и ADP3 также могут быть замещены группами, независимо выбранными из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; C_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, OH или SH; лизила; карбоксила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2 ниже. R², R³ и R⁵ независимо выбраны из группы, состоящей из C_0-6алкиларила; C_0-6алкилгетероарила; C_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из OH, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкила или C_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкинила); OC_1-6алкила; C_2-6алкенила; C_2-6алкинила; C_2-6алкенила и C_2-6алкинила.

Таблица 3
Соединения для болезни Альцгеймера
	Положение 1	Положение 2	Положение 3	Положение 4	Положение 5	Положение 6	Положение 7	Положение 8
1	Изобутил	Этанол	N-бутиламин	Изобутил	Метилбензил	Метилбензил	N-бутиламин	N-бутиламин
2	Аллил	Этанол	Пиперонил	Аллил	Аллил	Аллил	N-бутиламин	N-бутиламин
3	N-бутиламин	Пиперонил	Изобутил	N-бутиламин	N-бутиламин	Метилбензил	N-бутиламин	Глицин
4	Метил	Этанол	N-бутиламин	Изобутил	Метилбензил	Метилбензил	N-бутиламин	N-бутиламин
5	Метил	Этанол	Пиперонил	Аллил	Аллил	Аллил	N-бутиламин	N-бутиламин
6	Метил	Пиперонил	Изобутил	N-бутиламин	N-бутиламин	Метилбензил	N-бутиламин	Глицин
7	Изобутил	Метил	N-бутиламин	Изобутил	Метилбензил	Метилбензил	N-бутиламин	N-бутиламин
8	Аллил	Метил	Пиперонил	Аллил	Аллил	Аллил	N-бутиламин	N-бутиламин
9	Изобутил	Этанол	Метил	Изобутил	Метилбензил	Метилбензил	N-бутиламин	N-бутиламин
10	Аллил	Этанол	Метил	Аллил	Аллил	Аллил	N-бутиламин	N-бутиламин
11	N-бутиламин	Пиперонил	Метил	N-бутиламин	N-бутиламин	Метилбензил	N-бутиламин	Глицин
12	Изобутил	Этанол	N-бутиламин	Метил	Метилбензил	Метилбензил	N-бутиламин	N-бутиламин
13	Аллил	Этанол	Пиперонил	Метил	Аллил	Аллил	N-бутиламин	N-бутиламин
14	N-бутиламин	Пиперонил	Изобутил	Метил	N-бутиламин	Метилбензил	N-бутиламин	Глицин
15	Аллил	Этанол	Пиперонил	Аллил	Метил	Аллил	N-бутиламин	N-бутиламин
16	N-бутиламин	Пиперонил	Изобутил	N-бутиламин	Метил	Метилбензил	N-бутиламин	Глицин
17	Аллил	Этанол	Пиперонил	Аллил	Аллил	Метил	N-бутиламин	N-бутиламин
18	N-бутиламин	Пиперонил	Изобутил	N-бутиламин	N-бутиламин	Метил	N-бутиламин	Глицин
19	Изобутил	Этанол	N-бутиламин	Изобутил	Метилбензил	Метилбензил	Метил	N-бутиламин
20	Аллил	Этанол	Пиперонил	Аллил	Аллил	Аллил	Метил	N-бутиламин
21	N-бутиламин	Пиперонил	Изобутил	N-бутиламин	N-бутиламин	Метилбензил	Метил	Глицин
22	Аллил	Этанол	Пиперонил	Аллил	Аллил	Аллил	N-бутиламин	Метил

Таблица 4
Соединения для болезни Паркинсона
	Положение 1	Положение 2	Положение 3	Положение 4	Положение 5	Положение 6	Положение 7	Положение 8
1	N-бутиламин	N-бутиламин	Аллил	N-бутиламин	Метилбензил	Метилбензил	N-бутиламин	Изобутил
2	Аллил	N-бутиламин	Этанол	Изобутил	Этанол	Аллил	N-бутиламин	N-бутиламин
3	Пиперонил	Аллил	Этанол	Аллил	N-бутиламин	Аллил	N-бутиламин	Аллил

В другом варианте осуществления предоставлены пептоиды, которые связывают антитела, характерные для болезни Паркинсона, и способы детекции антител в содержащем антитела образце, включающие (a) контактирование содержащего антитела образца с подложкой с закрепленным на ней пептоидом формулы:

В одном из вариантов осуществления R²⁷ представляет собой алкиларильную группу. В определенных аспектах R²⁷ представляет собой метилбензильную группу. R²⁵, R²⁶, R²⁸-R³² формулы 2A независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_0-6алкиларила; C_0-6алкилгетероарила; C_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из OH, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкила или C_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкинила); OC_1-6алкила; C_2-6алкенила; C_2-6алкинила; C_2-6алкенила и C_2-6алкинила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2. В определенных аспектах R²⁶, R²⁹, R³¹ и/или R³² представляет/представляют собой алкиламин, например, N-бутиламин. В еще одном дополнительном аспекте R³⁰ представляет собой алкенил, такой как аллильная группа.

В другом варианте осуществления пептоид может иметь формулу 2B, где R³⁴ представляет собой алкиламин, например N-бутиламин. В другом варианте осуществления R³⁵ представляет собой алкенил, такой как аллильная группа. В определенных вариантах осуществления R³⁷ представляет собой алкоксигруппу, такую как этанол. В определенных аспектах R³³, R³⁶ и R³⁸-R⁴⁰ формулы 2B независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_0-6алкиларила; C_0-6алкилгетероарила; C_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из OH, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкила или C_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из H или C_1-6алкинила); OC_1-6алкила; C_2-6алкенила; C_2-6алкинила; C_2-6алкенила и C_2-6алкинила - включая одну или несколько химических групп, описанных в таблицах 1 и 2.

В формулах, описанных в данном описании, Z представляет собой связующую группу, которая может включать одну или несколько аминокислотных или функциональных групп; L представляет собой необязательный линкерный фрагмент, M представляет собой субстрат или подложку, или метку; и m, n, o и/или p равны 0-6.

В определенных аспектах способы также могут включать (b) детекцию антител, связавшихся с указанным пептоидом.

Способ может дополнительно включать получение указанного образца от индивидуума. Способ также может дополнительно включать постановку диагноза болезни Паркинсона у индивидуума, от которого получали указанный образец, если уровень связывания антитела с указанным пептоидом, превосходит уровень, наблюдаемый у контрольных не подверженных заболеванию пациентов. В еще одном дополнительном аспекте способы могут включать предписание индивидууму конкретного лекарственного средства или терапии.

В определенных вариантах осуществления пептоид может быть выбран из группы, состоящей из PD1, PD2 и PD3. Образец можно контактировать с одним или несколькими пептоидами формул 2A-2B, такими как три структурно различных пептоида (например, PD1, PD2 и PD3).

В определенных аспектах подложка может представлять собой гранулу, планшет, тест-полоску, фильтр, мембрану, иглу или лунку. Образец может представлять собой кровь, сыворотку, слюну или CSF. Детекция может включать RIA, FIA, ELISA, вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, FRET или поверхностный плазмонный резонанс.

В еще одном варианте осуществления предоставлен способ лечения индивидуума, у которого предполагают наличие нейродегенеративного заболевания (ND), включающий: (a) контактирование содержащего антитела образца, полученного от указанного индивидуума, с одной или несколькими подложками с закрепленным на них пептоидом, содержащим дипептоидную единицу формулы (1A), формулы (1B), формулы (1C), формулы (1D), формулы (2A) и/или формулы (2B); (b) детекцию антител, связавшихся с указанными пептоидами; и (c) принятие решения о лечении на основе результатов стадии (b). Способ может дополнительно включать получение указанного образца от индивидуума. Способ также может дополнительно включать постановку у индивидуума, от которого получен указанный образец, диагноза болезни Паркинсона, если уровень связывания антитела с пептоидом для PD выше, чем уровень, наблюдаемый у контрольных не подверженных заболеванию пациентов, или постановку у индивидуума, от которого получен указанный образец, диагноза болезни Альцгеймера, если уровень связывания антитела с пептоидом для AD выше, чем уровень, наблюдаемый у контрольных не подверженных заболеванию пациентов. Способ также может дополнительно включать принятие решения о лечении указанного индивидуума. Образец можно контактировать более чем с одним пептоидом формул 1A-1D и/или 2A-2B. Образец можно контактировать с тремя структурно различными пептоидами, реагирующими с антителами для каждой из PD и AD. Подложка может представлять собой гранулу, планшет, тест-полоску, фильтр, мембрану, иглу или лунку. Образец может представлять собой кровь, сыворотку, слюну или CSF. Детекция может включать RIA, FIA, ELISA, вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, FRET или поверхностный плазмонный резонанс.

В дополнительных вариантах осуществления нейродегенеративные заболевания в качестве неограничивающих примеров включают болезнь Альцгеймера; болезнь Паркинсона; рассеянный склероз (MS); боковой амиотрофический склероз (ALS или болезнь Лу Герига); деменцию; болезнь мотонейронов; прионную болезнь; болезнь Хантингтона; таупатии; деменции связанные с хромосомой 17; врожденные нейропатии и заболевания, включающие дегенерацию мозжечка.

Дополнительный вариант осуществления относится к композиции антител, выделенных из биологической жидкости, которая характеризует нейродегенеративные заболевания. В определенных вариантах осуществления антитела выделяют контактированием образца с такими антителами с пептоидной композицией, специфически связывающейся с антителами, характерными для нейродегенеративных заболеваний или ассоциированными с нейродегенеративными заболеваниями. Антитела можно отделять, выделять или очищать от других не содержащих антител или неспецифичных для ND компонентов. Затем антитела можно отмывать и/или отделять от пептоидных захватывающих средств(а).

В определенных вариантах осуществления панель пептоидов гибридизуют с биологическим образцом, который дополнен бактериальным лизатом, например, лизатом E. coli. Биологический образец включает контрольный образец и образец с маркером нарушения центральной нервной системы. Например, стекла микропанелей покрывают, используя камеру для гибридизации, и уравновешивают 1X TBST (50 мМ Tris, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20) в течение приблизительно 15 минут. Затем стекла блокируют бактериальным лизатом с концентрацией по меньшей мере, максимально или приблизительно 0,5, 1, 1,5, 2 мг/мл лизата. Лизат удаляют, и стекла инкубируют приблизительно с миллилитром биологического образца (с концентрацией белка приблизительно 5, 10, 15, 20 или 25 мкг/мл, включая все диапазоны и значения между ними) в бактериальном лизате при осторожном перемешивании. Затем микропанели отмывают 1X TBST и гибридизуют с мечеными антителами к IgG (например, при разведении 1:400). Затем стекла отмывают соответствующим буфером. Стекла сушат с использованием центрифуги (например, в течение 5 мин при 1500 об/мин) и сканируют на сканере для микропанелей, например, с использованием 635-нм лазера при 100% мощности и коэффициентом усиления фотоэлектронного умножителя 600 или 650. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу снижения фонового шума антисыворотки в диагностическом анализе, включающему обработку контрольного образца плазмы и образца плазмы заболевшего индивидуума лизатом E. coli и контактирование указанных образцов с панелью пептоидов или лигандов. Полагают, что данный способ можно использовать для обработки подложки любой панели, используемой для детекции и различения антител в сыворотках в случае сравнения контрольного образца с образцом, полученным от заболевшего индивидуума.

Предусмотрено, что любой способ или композицию, раскрытые в данном описании, можно использовать применительно к любому другому способу или композиции, раскрытым в данном описании.

Использование формы единственного числа при использовании в сочетании с выражением "содержащий" в формуле изобретения и/или в описании может означать "один", но она также согласуется со значением "один или несколько", "по меньшей мере один" и "один или более одного".

Предусмотрено, что любой вариант осуществления, описанный в данном описании, можно использовать применительно к любому способу или композиции настоящего изобретения и наоборот. Кроме того, композиции и наборы настоящего изобретения можно использовать для осуществления способов настоящего изобретения.

На всем протяжении данного описания термин "приблизительно" применяют для указания того, что значение включает неустранимую характерную вариацию ошибки прибора, используемого в способе для определения значения, или вариацию, существующую у исследуемых индивидуумов.

Краткое описание чертежей

Приведенные далее чертежи составляют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение может быть лучше понято со ссылкой на одно или несколько из этих чертежей в комбинации с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленным в данном описании.

ФИГ.1A-B. Структуры пептоидов, для которых обнаружено, что они захватывают специфичные для заболевания антитела (фиг.1A). Пептоиды AD1-AD3 идентифицируют антитела для болезни Альцгеймера (фиг.1B). Пептоиды PD1-PD3 идентифицируют антитела для болезни Паркинсона. Z представляет собой функциональную группу, которую затем можно связывать с субстратом, линкером или второй молекулярной структурой.

ФИГ.2A-C. Профили антител, которые позволяют отличить индивидуумов с болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона от контрольных индивидуумов (фиг.2A). Профили связывания сывороточных антител для пептоидов AD1-AD3 (фиг.2B). Профили связывания сывороточных антител для пептоидов PD1-PD3. (фиг.2C) Профили связывания сывороточных антител для ADPD1-ADPD3.

ФИГ.3. Снижение содержания AD в образцах сыворотки (подтвержденных аутопсией). В образцах сыворотки снижали содержание антител, связывающих ADP1, посредством пропускания через колонку с избытком иммобилизованного ADP1. Затем в сыворотке со сниженным содержанием оценивали связывание с ADP1-3. Диаграмма демонстрирует, что пептоиды ADP1 и ADP3 связывают одни и те же антитела, тогда как пептоид ADP2 связывает различные антитела.

ФИГ.4. Подтверждение пептоида ADP1 в качестве селективного маркера для болезни Альцгеймера на микропанелях.

ФИГ.5. Подтверждение пептоида ADP2 в качестве селективного маркера для болезни Альцгеймера на микропанелях.

ФИГ.6. Подтверждение пептоида ADP3 в качестве селективного маркера для болезни Альцгеймера на микропанелях.

ФИГ.7. Подтверждение промежуточного диагноза AD12 у индивидуума через 5 лет.

ФИГ.8. Титрование с использованием Luminex® болезни Альцгеймера по отношению к здоровому контролю (фиг.8A). Подтвержденный аутопсией образец AD по отношению к здоровому контролю (фиг.8B), AD5 по отношению к NC9 (фиг.8C), AD8 по отношению к NC11 (фиг.8D). Подтвержденный аутопсией образец AD по отношению к пулу образцов здоровых контролей.

ФИГ.9. Титрование с использованием Luminex® различных образцов здоровых контролей (фиг.9A). Два различных нормальных контрольных образца по отношению к пулу образцов здоровых контролей (фиг.9B). AD8 по отношению к NC11 (фиг.9C). Подтвержденный аутопсией образец AD по отношению к пулу образцов здоровых контролей.

ФИГ.10. Подтверждение пептоида ADP1 в качестве селективного маркера для болезни Альцгеймера на гранулах Luminex®.

ФИГ.11. Подтверждение пептоида ADP2 в качестве селективного маркера для болезни Альцгеймера на гранулах Luminex®.

ФИГ.12. Подтверждение пептоида ADP3 в качестве селективного маркера для болезни Альцгеймера на гранулах Luminex®.

ФИГ.13. Титрование с использованием Luminex® образцов, полученных от индивидуумов с промежуточным диагнозом.

ФИГ.14. Результаты сканирование саркозином ADP1-3.

ФИГ.15. Сравнение панели пептоидов, инкубируемой с блокирующим средством из бактериального лизата или без него.

Описание иллюстративных вариантов осуществления

I. Нейродегенеративные заболевания

Нейродегенеративные заболевания (ND) включают широкий спектр ослабляющих здоровье заболеваний центральной и периферической нервной системы. Однако большинство из них поражает ЦНС. Такие заболевания включают болезнь Альцгеймера, болезнь Пика, сенильную деменцию, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, множественную системную атрофию, деменцию с тельцами Леви, болезнь Хантингтона, прогрессирующий супрануклеарный паралич, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, боковой амиотрофический склероз, деменцию, болезнь мотонейронов, прионную болезнь, болезнь Хантингтона, таупатии, деменции, связанные с хромосомой 17, врожденные нейропатии и заболевания, включающие дегенерацию мозжечка.

Вследствие того, что, как правило, не существует одного определяющего теста для таких заболеваний, и вследствие перекрывающихся симптомов, которые демонстрируют многие из указанных заболеваний, врачи теряют недели и миллионы долларов, проводя тесты с целью "исключения", которые в конечном итоге приносят небольшую пользу для диагностики или не приносят пользы для диагностики. В связи с этим очень необходим простой и точный тест.

Авторы изобретения идентифицировали ряд низкомолекулярных "пептоидов", которые представляют собой специфические лиганды для антител, продуцируемых исключительно у индивидуумов с болезнью Паркинсона или болезнью Альцгеймера. Пептоиды или N-замещенные олигоглицины являются особым подклассом пептидомиметиков. Они являются близкородственными с их природными пептидными аналогами, но химически отличаются тем, что их боковые цепи на всем протяжении каркаса молекулы прикреплены к атомам азота, а не к α-углеродным атомам (как это происходит в аминокислотах). Вследствие сильной селективности, которые эти пептоиды демонстрируют в отношении специфичных для заболевания антител, становится возможным поставить окончательный диагноз по меньшей мере некоторым индивидуумам с PD и AD, используя простой иммунологической анализ, который является недорогим и простым в использовании. Ниже изложены эти и другие аспекты изобретения.

A. Болезнь Паркинсона

Болезнь Паркинсона (PD) представляет собой одну из группы состояний, классифицируемых как нарушения движений. Она является хронической и прогрессирующей. Болезнь Паркинсона возникает, когда нарушается функционирование клеток черной субстанции, и в конечном итоге они погибают. Это приводит к снижению синтеза дофамина, химического мессенджера, передающего сигналы к частям головного мозга, контролирующим инициацию и координацию движений. Первичные симптомы представляют собой тремор, ригидность или тугоподвижность конечностей и туловища, брадикинезию или замедленность движений и постуральную неустойчивость или нарушение баланса и координации. Вторичные симптомы включают изменения речи, утрату мимики, трудности с глотанием, слюнотечение, боль, деменцию или спутанность сознания, нарушения сна, депрессию, страх или тревогу, затруднения с памятью, проблемы с мочеиспусканием, утомляемость и ноющие боли и слабость. Однако симптомы варьируют, и прогресс заболевания может быть быстрым или нет.

PD страдают более одного миллиона американцев. Хотя приблизительно 15% пациентов диагностируют в возрасте до 40 лет, заболеваемость увеличивается с возрастом. Причина неизвестна, и хотя в настоящее время не существует лечения, существует множество способов лечения, таких как лекарственные средства и хирургия для контроля симптомов. Степень успеха каждого вида лечения у разных индивидуумов варьирует, также как и длительность периода времени, когда способ лечения остается эффективным.

Леводопа представляет собой предшественник дофамина, который рассматривали как прорыв в лечении PD. К сожалению, у пациентов наблюдали изнуряющие побочные эффекты, включая тяжелую тошноту и рвоту, и при увеличении дозирования и увеличении длительности лечения у пациентов наблюдали другие побочные эффекты, включая дискинезию. Значительным улучшением является синемет (леводопа+карбидопа) в том отношении, что добавление карбидопа предотвращает метаболизм леводопа в кишечнике, печени и других тканях, обеспечивая его большую доставку в головной мозг. Таким образом, необходима меньшая доза леводопа, и значительно снижаются тяжелая тошнота и рвота.

Сталево (карбидопа+леводопа+энтакапон) представляет собой комбинированную таблетку для пациентов, у которых наблюдают признаки и симптомы "истощения" в конце действия дозы. Таблетка комбинирует карбидопа/леводопа с энтакапоном. В то время как карбидопа снижает побочные эффекты леводопа, энтакапон увеличивает период активности леводопа в головном мозге (до 10% дольше).

Симметрел (гидрохлорид амантадина) активирует высвобождение дофамина из участков хранения и возможно блокирует обратный захват дофамина в нервных окончаниях. Он также обладает блокирующей активностью в отношении глутаминатных рецепторов. Его дофаминергическое действие приводит к его пригодности для снижения дискинезии, индуцированной леводопа и, таким образом, его называют косвенно действующим агонистом дофамина и широко применяют в качестве ранней монотерапии и с более сильнодействующим синеметом, добавляемым при необходимости.

Антихолинергические средства (тригексифенидил, мезилат бензатропина, проциклидин и т.д.) не действуют непосредственно на дофаминергическую систему. Вместо этого они действуют, снижая активность другого нейромедиатора, ацетилхолина. В головном мозге существует сложное взаимодействие между уровнями ацетилхолина и уровнями дофамина. Многие клиницисты находят, что если агонист или леводопа не ослабляют тремор, тогда эффективным часто является добавление антихолинергического лекарственного средства. Неблагоприятные воздействия включают размытое зрение, сухость во рту и задержку мочеиспускания. Эти лекарственные средства могут быть противопоказаны пожилым пациентам, так как они могут вызывать спутанность сознания и галлюцинации.

Другие лекарственные средства включают селегилин или депренил (элдеприл), которые, как показано, отсрочивают необходимость в синемете при прописывании на самой ранней стадии PD. Агонисты дофамина представляют собой лекарственные средства, непосредственно активирующие рецепторы дофамина, и их можно принимать отдельно или в комбинации с синеметом. Такие агонисты включают бромокриптин (парлодел), перголид (пермакс), прамипексол (мирапекс) и ропинирол (реквип). Ингибиторы COMT, такие как толкапон (тасмар) и энтакапон (комтан), пролонгируют длительность ослабления симптомов посредством блокирования действия фермента, разрушающего леводопа.

Одним из вариантов для некоторых пациентов после того, как лекарственных средств становится недостаточно, является хирургическая операция. Перед принятием любого решения пациент должен всесторонне обсудить хирургическую операцию со своим неврологом. Две более давние операции рассечения представляют собой паллидотомию и таламотомию. Паллидотомия может облегчать симптомы ригидности и брадикинезии, а таламотомия помогает контролировать тремор. Любую из этих операций врачи проводят редко вследствие того, что они обе необратимо разрушают части головного мозга и приводят к серьезным побочным эффектам. Повреждение может делать невозможным проведение хирургических операций, которые могут стать доступными в будущем, таких как трансплантация тканей головного мозга.

Глубокая стимуляция головного мозга (DBS) является более безопасной и более эффективной, и, таким образом, заменяет эти способы. Она является предпочтительным хирургическим вариантом, так как она дает такие же, если не лучшие, результаты, что и паллидотомия и таламотомия. DBS также оставляет возможными другие способы терапии, которые должны стать доступными в будущем. Как и при любой хирургической операции существуют риски и побочные эффекты. Основным преимуществом хирургического вмешательства DBS является снижение моторных флуктуаций, например, улучшения и ухудшения, вызываемые снижением эффективности синемета. Как правило, электрод помещают на одну часть головного мозга. Электрод DBS, имплантированный в левую часть головного мозга, контролирует симптомы на правой стороне тела, и наоборот. В некоторых случаях, пациентам необходима стимуляция обеих частей головного мозга.

B. Болезнь Альцгеймера

Деменция представляет собой нарушение головного мозга, которое в значительной степени воздействует на способность индивидуума осуществлять повседневную деятельность. Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее частой формой деменции у пожилых людей. Исследователи полагают, что AD страдают до 4 миллионов американцев. Как правило, заболевание начинается в возрасте после 60 лет, и риск с возрастом возрастает. Хотя более молодые люди также могут заболеть AD, это является значительно менее частым. AD страдают приблизительно 3 процента мужчин и женщин в возрасте от 65 до 74 лет, а в возрасте 85 лет и старше заболеванием могут страдать приблизительно половина из них. Являясь объектом интенсивных исследований, точные причины AD все еще неизвестны, и лечения не существует.

AD поражает отделы головного мозга, контролирующие мышление, память и речь. Ее назвали в честь д-ра Алоиза Альцгеймера, немецкого врача. В 1906 г. д-р Альцгеймер выявил изменения в ткани головного мозга женщины, умершей вследствие необычного психического заболевания. Он выявил аномальные скопления (в настоящее время называемые амилоидными бляшками) и спутанные пучки волокон (в настоящее время называемые нейрофибриллярными клубками). В настоящее время, эти бляшки и клубки в головном мозге считают отличительными признаками AD.

Исследователи также выявили у индивидуумов с AD другие изменения головного мозга. Они представляют собой потерю нервных клеток в областях головного мозга, необходимых для памяти и проявления других умственных способностей. Также в головном мозге выявляют сниженные уровни химических веществ, передающих сложные сигналы между нервными клетками в прямом и обратном направлениях. Таким образом, AD может нарушать нормальное мышление и память, физически и химически ингибируя передачу сигналов между нервными клетками.

AD является прогрессирующей, характеризующейся потерей памяти, нарушением речи, нарушенными зрительно-пространственными навыками, плохой способностью связывать понятия, безразличием, но сохранением двигательной функции. Как указано, AD, как правило, начинается в возрасте после 65 лет, но ее начало может происходить уже в возрасте 40 лет, впервые проявляясь в виде ухудшения памяти и, через несколько лет, разрушая познавательную способность, личность и способность к осознанному действию. Также могут возникать спутанность сознания и возбужденное состояние. Тип, тяжесть, последовательность и прогрессирование изменений психического состояния изменяются в широких пределах. Ранние симптомы AD, которые включают забывчивость и потерю концентрации, можно легко пропустить, так как они имеют сходство с естественными признаками старения. Сходные симптомы также могут являться результатом усталости, огорчения, депрессии, болезни, потери зрения или слуха, применения алкоголя или других лекарственных средств или просто тяжести слишком большого количества подробностей для одновременного запоминания.

Лечения для AD не существует, и способа замедлить прогрессирование заболевания нет. У некоторых людей на ранних и средних стадиях заболевания некоторые когнитивные симптомы может облегчить лекарственное средство, такое как такрин. Арицепт (донепезил) и экселон (ривастигмин) представляют собой обратимые ингибиторы ацетилхолинэстеразы, которые показаны для лечения деменции по типу Альцгеймера в степени от слабой до умеренной. Также некоторые лекарственные средства могут помочь контролировать поведенческие симптомы, такие как бессонница, возбуждение, бессвязность речи, тревога и депрессия. Эти лекарственные средства предназначены для создания большего комфорта пациенту.

Течение заболевания варьирует от индивидуума к индивидууму. Некоторые люди болеют только в течение 5 последних лет жизни, тогда как другие могут болеть в течение срока до 20 лет. Наиболее частой причиной гибели пациентов с AD является инфекция.

Молекулярная характеристика AD является сложной и еще не до конца определенной. Как указано выше, AD характеризуется формированием амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков в головном мозге, в частности, в гиппокампе, который является центром обработки памяти. В эти структуры вносят вклад несколько молекул: β-амилоидный белок (Aβ), пресенилин (PS), холестерин, аполипопротеин E (ApoE) и тау-белок. Из них центральную роль, по-видимому, играет Aβ.

Aβ содержит приблизительно 40 аминокислотных остатков. Формы с 42 и 43 остатками являются намного более токсичными, чем форма с 40 остатками. Aβ образуется из белка-предшественника амилоида (APP) посредством последовательного протеолиза. У одного из ферментов отсутствует специфичность к последовательности и, таким образом, могут образовываться Aβ различной (39-43) длины. Токсические формы Aβ вызывают аномальные процессы, такие как апоптоз, образование свободных радикалов, агрегация и воспаление.

Пресенилин кодирует протеазу, ответственную за расщепление APP в Aβ. Существует две формы - PS1 и PS2. Мутации в PS1, вызывающие образование Aβ₄₂, являются типичной причиной раннего начала AD.

Полагают, что восстановители холестерина обладают способностью профилактики AD, хотя определенных данных о том, что повышенный уровень холестерина связан с повышенным риском AD, нет. Однако открытие того, что Aβ содержит домен, связывающий сфинголипиды, придает дополнительное доверие этой теории.

Подобным образом, в настоящее время полагают, что в развитие AD вносит вклад ApoE, который вовлечен в перераспределение холестерина. У индивидуумов с аллелем ε4, демонстрирующим большую степень выхода холестерина из нейронов, существует более высокая вероятность развития AD.

Тау-белок, ассоциированный в нормальном головном мозге с микротрубочками, в пораженном AD головном мозге формирует спаренные спиральные филаменты (PHF), которые являются первичной составляющей нейрофибриллярных клубков. Последние данные позволяют предположить, что белки Aβ могут вызывать гиперфосфорилирование тау-белков, что приводит к диссоциации с микротрубочками и агрегации в PHF.

При AD для ограничения прогрессирования заболевания и для облегчения или улучшения определенных из ассоциированных симптомов использовали лекарственные средства. Эти лекарственные средства в основном входят в широкую категорию ингибиторов холинэстеразы, агонистов мускариновых рецепторов, антиоксидантов или противовоспалительных средств. Галантамин (реминил), такрин (когнекс), селегилин, физостигмин, ревистигмин, донепезил, (арицепт), ривастигмин (экселон), метрифонат, миламелин, ксаномелин, селузол, ацетил-L-карнитин, идебенон, ENA-713, мембрик, кветиапин, неурестрол и неуромидал являются только некоторыми лекарственными средствами, предлагаемыми в качестве терапевтических средств для AD.

II. Диагностические/прогностические/терапевтические определения при нейродегенеративных заболеваниях

Настоящее изобретение впервые обеспечивает установку окончательного диагноза таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Это обеспечивает врачам уверенность в понимании того, что они корректно идентифицируют лежащую физиологическую основу для симптомов у пациента, тем самым, делая доступным раннее воздействие на заболевание и его контроль.

Вследствие того, что способы лечения AD в основном замедляют, но не предотвращают заболевания, и некоторые способы лечения PD действуют таким же образом, способность обеспечить раннюю диагностику данных заболеваний является критичной для задержки начала проявления более тяжелых симптомов. Это также будет сохранять качество и продлевать жизнь таких пациентов. Кроме того, возможность предоставить пациентам правильные лекарственные средства для воздействия на их симптомы без "проб и ошибок", которые иногда являются результатом неправильно поставленного диагноза, будет значительно снижать стоимость ухода и позволит избежать дискомфорта у пациента и возможного вреда.

Анализы все будут основаны на использовании содержащего антитела образца, полученного от пациента. Используемым чаще всего биологическим образцом является кровь или сыворотка благодаря присутствию в них большого количества антител. Однако подходящими также могут являться другие образцы, такие как слеза, слюна, мокрота, цереброспинальная жидкость, семенная жидкость или моча.

При оценке уровней антител у индивидуума наблюдаемые уровни сравнивают со стандартом. Стандарт может основываться на известных значениях, установленных для обоих заболеваний и здоровых индивидуумов, и, таким образом, может устранять необходимость пользователю обеспечивать что-либо, кроме контроля реакции, например, контроля, демонстрирующего то, что реагенты и условия, необходимые для положительной реакции, присутствуют. Альтернативно, можно выбрать анализ фактического контроля, содержащего сходный образец, полученный от фактического индивидуума с известным статусом здорового или больного. Кроме того, можно анализировать ряд образцов, полученных от одного и того же индивидуума в течение периода времени, в поиске тенденции увеличения уровня антител PD или AD в качестве показателя прогрессирования заболевания.

III. Основанные на антителах диагностические анализы

Как указано выше, применением данного анализа является (a) идентификация пациентов, профиль антител в сыворотке которых определяет риск развития или наличия у них ND; (b) идентификация пациентов, симптомы у которых являются такими, что у них может присутствовать и отсутствовать ND (т.е. получение окончательного диагноза ND); (c) анализ действия терапии против ND и (d) наблюдение за прогрессированием ND.

Способы детекции по настоящему изобретению сходны со способами детекции для основанной на антителах детекции и, таким образом, включают в качестве неограничивающих примеров такие форматы, как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA), количественный радиоиммунологический анализ, иммунофлуоресцентный анализ, хемилюминесцентный анализ, биолюминесцентный анализ, FACS, FRET и вестерн-блоттинг. Стадии различных пригодных способов иммунологического анализа описаны в научной литературе, такой как, например, Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993) и Nakamura et al. (1987). Как правило, способы иммунологического связывания включают получение содержащего антитела образца, контактирование образца с пептоидом настоящего изобретения в условиях, оптимальных для обеспечения формирования комплексов пептоид-антитело, и детекцию антител, связавшихся с пептоидом.

Как правило, пептоид связан с твердой подложкой, такой как в форме матрикса колонки, гранулы, фильтра, мембраны, тест-полоски, планшета или лунки, и образец наносят на иммобилизованный пептоид. Нежелательные компоненты смывают с подложки, оставляя антитела, образующие комплексы с пептоидом, которые затем детектируют различными способами, такими как последующее добавление антител к Fc, которые связаны с детектируемыми молекулами.

Контактирование выбранного биологического образца с пептоидом в оптимальных условиях и в течение периода времени, достаточного для обеспечения формирования комплексов пептоид-антитело, в основном осуществляют посредством простого контактирования образца c пептоидом и инкубации смеси в течение периода времени с достаточной продолжительностью для связывания антител с пептоидами. После этого периода времени композицию образец-пептоид, такую как планшет ELISA, дот-блот или вестерн-блоттинг, как правило, отмывают для удаления любых неспецифически связывающихся молекул антител, оставляя только такие антитела, которые специфически связываются с иммобилизованными комплексами антитело-пептоид для детекции.

Как правило, детекция формирования комплексов пептоид-антитело хорошо известна в данной области и ее можно проводить, применяя множество способов. Как правило, эти способы основаны на детекции метки или маркера, таких как любая из радиоактивной, флуоресцентной, биологической и ферментативной меток. Патенты, относящиеся к применению таких меток, включают патенты США 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241. Понятно, что дополнительные преимущества может обеспечить применение вторичного связывающегося лиганда, такого как вторичное антитело и/или связывающаяся структура лигандов биотина/авидина, как известно в данной области.

Предусмотрены и хорошо известны специалистам в данной области различные другие форматы. Ниже описаны три конкретных анализа, предусмотренных для легкого применения настоящего изобретения.

A. ELISA

Иммунологические анализы в их наиболее простом и прямом смысле представляют собой анализы связывания. Определенные иммунологические анализы, находящие конкретное применение в настоящем изобретении, представляют собой различные типы твердофазных иммуноферментных анализов (ELISA) и радиоиммунологических анализов (RIA), известных в данной области.

В одном из иллюстративных ELISA пептоиды настоящего изобретения иммобилизуют на выбранной поверхности, такой как лунка в полистирольном планшете для микротитрования. Затем в лунки добавляют тестируемую композицию, в которой предполагают наличие антител. После связывания и отмывки для удаления неспецифически связанных комплексов можно детектировать связанные антитела. Детекцию можно проводить посредством добавления другого пептоида, связанного с детектируемой меткой. Этот тип анализа аналогичен простому "сэндвич ELISA", за исключением того, что связывание меченого средства происходит с Fab-частью связанных антител. Детекцию также можно проводить, добавляя меченые антитела, связывающиеся со связанными антителами, например, антитела, распознающие Fc-часть связанных антител. Необязательно, эти антитела не являются мечеными, и за их добавлением следует добавление второго антитела с аффинностью связывания в отношении первого, где вторые антитела связаны с детектируемой меткой.

В другом иллюстративном ELISA образцы, в которых предполагают наличие антител, иммобилизуют на поверхности лунки, а затем контактируют с мечеными пептоидами настоящего изобретения. После связывания и отмывки с удалением неспецифически связанных иммунных комплексов детектируют связанные меченые пептоиды. Альтернативно, пептоиды не метят, и их можно детектировать против искусственного антитела (не являющегося образцом), которое выбрано для специфического связывания отобранного пептоида, это второе антитело можно связывать с детектируемой меткой, обеспечивая, таким образом, детекцию.

Вне зависимости от применяемого формата, ELISA обладают определенными общими свойствами, такими как покрытие, инкубация и связывание, отмывка с удалением неспецифически связанных молекул и детекция связанных иммунных комплексов. Они описаны ниже.

При покрытии планшета пептоидом или антителом, как правило, лунки планшета инкубируют с раствором пептоида или антитела в течение ночи или в течение указанного количества часов. В определенных аспектах планшет можно блокировать, используя бактериальный лизат, такой как лизат E. coli (см. пример 1). Затем лунки планшета отмывают для удаления неполностью адсорбированного вещества. Любые оставшиеся доступные поверхности лунок затем "покрывают" неспецифическим белком, который является антигенно-нейтральным в отношении тестируемых антисывороток. Они включают бычий сывороточный альбумин (BSA), казеин или растворы порошкового молока. Покрытие позволяет блокировать участки неспецифической адсорбции на иммобилизующей поверхности и, таким образом, снижает фон, вызываемый неспецифическим связыванием антисывороток на поверхности. Альтернативно, вследствие простоты и предсказуемости химического состава пептоидов, их можно присоединять к подложке посредством специфической химической реакции.

В ELISA вероятно более общепринято использовать вторичные или третичные средства детекции, а не прямой способ. Таким образом, после связывания пептоида или антитела с лункой, покрытия инертным веществом для снижения фона и отмывки с удалением несвязанного вещества, иммобилизующую поверхность контактируют с биологическим образцом или пептоидом для тестирования в условиях, оптимальных для обеспечения формирования иммунных комплексов. Затем для детекции иммунных комплексов необходим меченый вторичный связывающийся пептоид или антитело или вторичный связывающийся пептоид или антитело в сочетании с меченым третичным антителом (со специфичностью к Fc-области антитела или к пептоиду).

"В условиях, оптимальных для обеспечения формирования иммунных комплексов (антиген/антитело)" означает, что условия предпочтительно включают разведение антигенов и/или антител растворами, такими как BSA, бычий гамма-глобулин (BGG) или забуференный фосфатом солевой раствор (PBS)/Tween. Эти добавляемые средства также способствуют снижению неспецифического фона.

"Подходящие" условия также означают, что инкубацию проводят при температуре или в течение периода времени, достаточных для обеспечения эффективного связывания. Как правило, стадии инкубации составляют от 1-2 до 4 часов или около этого, при температурах предпочтительно от 25°C до 27°C, или ее можно проводить в течение ночи приблизительно при 4°C или около этого.

После всех стадий инкубации при ELISA контактную поверхность отмывают, чтобы удалить не образующее комплексы вещество. Предпочтительный способ отмывки включает отмывку таким раствором, как PBS/Tween или боратный буфер. После образования специфических иммунных комплексов между тестируемым образцом и исходно связанным веществом и последующей отмывки, можно определять наличие даже минимальных количеств иммунных комплексов.

При детекции можно использовать фермент, который индуцирует образование окраски при инкубации с подходящим хромогенным субстратом. Таким образом, например, можно контактировать или инкубировать первый и второй иммунный комплекс с конъюгированным с уреазой, глюкозооксидазой, щелочной фосфатазой или пероксидазой водорода антителом или пептоидом в течение периода времени и в условиях, благоприятных для образования дополнительных иммунных комплексов (например, инкубация в течение 2 часов при комнатной температуре в содержащем PBS растворе, таком как PBS-Tween).

После инкубации с меченым антителом или пептоидом и последующей отмывки с удалением несвязанного вещества, определяют количество метки, например, посредством инкубации с хромогенным субстратом, таким как мочевина или бромкрезоловый пурпурный, или 2,2'-азиноди(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота (ABTS), или H₂O₂, в случае пероксидазы в качестве ферментативной метки. Затем проводят количественное определение, определяя степень полученного окрашивания, например, с использованием спектрофотометра в видимой части спектра.

B. Резонансный перенос энергии Ферстера (FRET)

FRET представляет собой явление, в котором энергия возбужденного состояния одной молекулы (называемой донором) переходит к другой молекуле посредством безизлучательного сопряжения. Этот механизм впервые корректно описан Ферстером и отличается от других типов переноса энергии, таких как обобщение электронов (Декстер) или обычный перенос (излучение фотона донором и повторное поглощение акцептором). Для механизма Декстера необходим физический контакт двух молекул, тогда как обычный перенос имеет очень низкую вероятность. В отличие от этого, когда две молекулы находятся в пределах радиуса Ферстера, который определен для любой данной пары флуорофоров, механизм Ферстера имеет высокую вероятность.

Общая эффективность FRET зависит от радиуса Ферстера, и определяется различными факторами, и напрямую зависит от степени перекрытия между спектром поглощения акцепторной молекулы и спектром испускания донорной молекулы. Степень FRET также зависит от расположения донорной и акцепторной молекул, хотя большинство биологических систем не расположены жестко. На эффективность FRET также влияет способность акцепторной молекулы поглощать свет, на что указывает ее молярный коэффициент экстинкции, и общая стабильность возбужденного состояния донорной молекулы, на что указывает вероятность того, что поглощение приведет к флуоресценции (квантовый выход) и время жизни возбужденного состояния.

FRET между двумя различными флуорофорами можно анализировать несколькими способами: изучая изменения окраски флуоресценции, измеряя продолжительность флуоресценции донора, исследуя изменения при фотообесцвечивании донора или акцептора или, как показали авторы в настоящем изобретении: измеряя поляризацию флуоресценции акцептора. Вне зависимости от подхода, в большинстве таких анализов используют общие свойства контрольно-измерительных устройств.

Типы микроскопов, используемых для измерения FRET, можно подходящим образом выбрать в зависимости от цели. Если необходимы частые измерения для контроля зависимости изменений от времени, предпочтительным является общепринятый микроскоп для флуоресценции в отраженном свете. Если необходимо увеличить разрешение, как в случае, когда необходимо контролировать точную межклеточную локализацию, предпочтительным является конфокальный лазерный микроскоп. В качестве системы микроскопирования для большинства измерений живых клеток предпочтительным является инвертированный микроскоп, ввиду сохранения физиологического состояния клеток и предотвращения контаминации. Когда используют прямой микроскоп, могут быть использованы водно-иммерсионные линзы в случае использования линз большой мощности.

Набор фильтров можно подходящим образом выбрать в зависимости от длины волны флуоресценции флуоресцентного белка. Для исследования GFP предпочтительно использовать фильтр с излучением возбуждения приблизительно 470-490 нм и с флуоресцентным излучением приблизительно 500-520 нм. Для исследования YFP предпочтительно использовать фильтр с излучением возбуждения приблизительно 490-510 нм и с флуоресцентным излучением приблизительно 520-550 нм. Для исследования CFP предпочтительно использовать фильтр с излучением возбуждения приблизительно 425 нм и с флуоресцентным излучением приблизительно 460-500 нм. Для целей настоящего изобретения конкретных требований в отношении микроскопов и фильтров нет, за исключением того, что они могут подходить для минимизации использования деполяризующих элементов на пути света. Все производители микроскопов продают неискажающие оптические устройства для измерения поляризованного света в микроскопии в проходящем и в отраженном свете, и такие оптические устройства также могут подходить для таких измерений поляризованной флуоресценции.

Кроме того, когда проводят измерения зависимости от времени в живых клетках с использованием флуоресцентного микроскопа, клетки необходимо фотографировать в течение короткого периода, и, таким образом, используют высокочувствительную охлаждаемую камеру CCD. При использовании охлаждаемой камеры CCD можно уменьшать тепловые помехи посредством охлаждения CCD, и можно отчетливо фиксировать слабое флуоресцентное изображение при кратковременной экспозиции. Также для получения изображений живых клеток можно использовать конфокальные микроскопы, при условии, что предприняты усилия для минимизации времени экспозиции.

C. Гранулы Luminex

Технология xMAP® Luminex основана на существующих технологических платформах, включая проточную цитометрию, микросферы, лазеры, цифровую обработку сигналов и традиционную химию. Представляющую собой легко приспособляемое решение с открытой архитектурой технологию xMAP® можно конфигурировать для быстрого проведения широкого спектра экономичных и точных биологических анализов.

В Luminex маркируют микросферы цветом в 100 различных наборов. Каждый набор гранул можно покрывать пептоидом настоящего изобретения, таким образом, обеспечивая захват и детекцию специфических антител из образцов. В компактном анализаторе Luminex лазеры возбуждают внутренние красители, которые идентифицируют каждую микросферическую частицу, а также любой репортерный краситель, захваченный при анализе. Для каждого набора гранул проводят множество считываний, дополнительно подтверждая результаты. Таким образом, технология xMAP обеспечивает быстрое и точное комбинирование до 100 уникальных анализов в одном образце.

Технология xMAP адаптирована для множества областей биологической науки, включая определение профилей экспрессии белков, молекулярную и иммунодиагностику, тестирование HLA и биозащиту/охрану окружающей среды.

D. Гранулы Tentagel

В определенных аспектах в композициях и способах детекции антител, относящихся к конкретному ND, можно использовать гранулы или смолу Tentagel. Одной из самых распространенных структур микросфер является Tentagel, сополимер стирола-полиэтиленгликоля. Эти микросферы не разбухают в неполярных растворителях, таких как гексан, и разбухают приблизительно на 20-40% объема при воздействии более полярных или водных сред.

Пептоиды можно прикреплять к твердой подложке, такой как гранулы Tentagel, или синтезировать на ней. Гранулы Tentagel содержат полистирольную сердцевину, и к сердцевине прикреплено множество полиоксиэтиленовых участков, где каждый участок на своем свободном конце несет первичный амин. Пептоиды можно синтезировать посредством последовательной конъюгации каждого остатка, добавляемого к пептоиду с использованием химии синтеза пептоидов. Способ раздельного синтеза позволяет получать гранулы, каждая из которых содержит множество копий одной пептоидной последовательности.

Вследствие того, что полиоксиэтиленовые участки гранул Tentagel являются водорастворимыми, конформации пептоидов определяют в основном термодинамически и по их первичной последовательности.

E. Наборы для иммунологического анализа

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к наборам для детекции для применения в описанных выше способах. Пептоиды настоящего изобретения включены в набор. Таким образом, наборы для иммунологического анализа в подходящем контейнере содержат один или несколько пептоидов, связывающих антитела для болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона или для обеих, необязательно связанные с реагентом для детекции и/или подложкой.

В определенных вариантах осуществления, где пептоид предварительно связан с твердой подложкой, предоставлена подложка, и она включает матрикс колонки, гранулу, тест-полоску или лунку планшета для микротитрования. Реагенты для иммунологического анализа набора могут находиться в любой из ряда форм, включая детектируемые метки, которые ассоциированы или связаны с данным пептоидом или вторичным антителом. Иллюстративные вторичные антитела представляют собой антитела с аффинностью связывания в отношении антител образца.

Контейнер, как правило, содержит по меньшей мере одно из флакона, тестовой пробирки, колбы, бутылки, шприца или другого контейнера, в которые можно помещать пептоид или предпочтительно подходящим образом добавлять определенное количество. Также наборы по настоящему изобретению, как правило, включают средства для содержания пептоида, антител и любых других контейнеров для реагентов в закрытой оболочке для продажи. Такие контейнеры могут включать полученные литьем под давлением или полученные выдувным формованием пластиковые контейнеры, в которых содержаться желаемые флаконы.

Определенные варианты осуществления относятся к наборам, содержащим пептоиды, описанные в данном описании, и к способам их применения. Описан набор и/или способ детекции, подтверждения и/или классификации по меньшей мере одного болезненного состояния. Проводимые стадии включают получение образца от индивидуума, например, человека, и проведение для образца анализа связывания пептоидов с использованием реагентов или субстрата на панели, поставляемых в формате набора. В результате из образца выделяют или в образце идентифицируют по меньшей мере одно антитело, характерное для болезненного состояния. Антитела, связывающие пептоиды, описанные в данном описании, связаны по меньшей мере с риском развития заболевания или с наличием конкретного болезненного состояния.

Кроме того, для применения по настоящему изобретению предусмотрены различные наборы. Один из таких наборов предоставлен для определения присутствия специфичного для заболевания антитела, включая одно или несколько антител, связанных с болезнью Альцгеймера и/или болезнью Паркинсона. В набор включен по меньшей мере один пептоид, способный к специфическому связыванию со специфичным для заболевания антителом. В определенных аспектах также можно включать реагенты для определения связывания пептоида и антитела. Пептоиды, описанные в данном описании, можно иммобилизовать на твердой подложке или субстрате, и они включают по меньшей мере один реагент для детекции для определения наличия связанного с пептоидом антитела. Образец, используемый для любого из наборов, может представлять собой фракционированную или нефракционированную жидкость организма или образец ткани. Неограничивающие примеры таких жидкостей представляют собой кровь, продукты крови, мочу, слюну, цереброспинальную жидкость и лимфу.

Кроме того, предусмотрен набор для диагностики, оценки риска и идентификации терапевтических способов, относящихся к нейродегенеративному болезненному состоянию. Такой набор содержит по меньшей мере один пептоид, способный к специфическому связыванию антител, характерных для болезненного состояния. Также могут быть включены реагенты для определения связывания пептоида и антител.

Специфичные для заболевания антитела, которые анализируют способом настоящего изобретения, высвобождаются в циркуляцию и могут присутствовать в крови или в любом продукте крови, например, плазме или сыворотке, и в их разведениях и препаратах, а также в других жидкостях организма, например, цереброспинальной жидкости (CSF), слюне, моче, лимфе и т.п. Для определения уровня определяемых антител можно использовать любой подходящий способ прямого или непрямого анализа. Анализы могут представлять собой конкурентные анализы, анализы типа "сэндвич", и метки могут быть выбраны из группы хорошо известных меток, таких как метки для радиоиммунологического анализа, флуоресцентного или хемилюминесцентного иммунологического анализа или технологии иммуноПЦР.

IV. Композиции антител

Определенные варианты осуществления включают способы и композиции для характеристики антител и антигенных детерминант, распознаваемых антителами, характерными для конкретного ND. Для целей настоящего изобретения и прилагаемой формулы изобретения "эпитоп" и "антигенную детерминанту" используют взаимозаменяемо для обозначения участка на антигене на который реагируют или который распознают B- и/или T-клетки. B-клеточные эпитопы могут образовывать последовательные аминокислоты или непоследовательные аминокислоты, располагающиеся рядом вследствие третичной укладки белка. Эпитопы, образованные последовательными аминокислотами, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные вследствие третичной укладки, как правило, при обработке денатурирующими растворителями разрушаются. Как правило, эпитоп содержит по меньшей мере 3 и более, как правило, по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеноструктурную кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols (1996). Антитела, распознающие один и тот же эпитоп, можно идентифицировать в простом иммунологическом анализе, демонстрирующем способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.

T-клетки распознают непрерывные эпитопы приблизительно из девяти аминокислот для CD8 клеток или приблизительно 13-15 аминокислот для CD4 клеток. T-клетки, распознающие эпитоп, могут быть идентифицированы в анализах in vitro, где определяют зависимую от антигена пролиферацию, как определено по включению ³H-тимидина примированными T-клетками в ответ на эпитоп (Burke et al., 1994), по зависимому от антигена цитолизу (анализ цитотоксических T-лимфоцитов, Tigges et al., 1996) или по секреции цитокинов.

Как использовано в данном описании и в формуле изобретения, термины "антитело" или "иммуноглобулин" используют взаимозаменяемо и означают любой из нескольких классов структурно родственных белков, функционирующих как часть иммунного ответа животного или реципиента, где белки включают IgG, IgD, IgE, IgA, IgM и родственные белки.

В нормальных физиологических условиях антитела находятся в плазме и других жидкостях организма и в мембране определенных клеток, и их продуцируют лимфоциты типа, обозначаемого как B-клетки, или их функциональным эквивалентом. Антитела класса IgG состоят из четырех полипептидных цепей, связанных вместе дисульфидными связями. Четыре цепи интактных молекул IgG представляют собой две идентичные тяжелые цепи, обозначаемые как H-цепи, и две идентичные легкие цепи, обозначаемые как L-цепи.

Антитело можно связывать с субстратом твердой подложки или конъюгировать с детектируемым фрагментом, или его можно одновременно связывать и конъюгировать, как хорошо известно в данной области. Для общего описания конъюгации флуоресцентных или ферментативных молекул см. Johnstone et al. (1982). Связывание антител с субстратом твердой подложки также хорошо известно в данной области (Harlow et al., 1988; Borrebaeck, 1992).

После идентификации антигена или антитела, характерных для ND, можно использовать рекомбинантные способы получения антигена и/или вариантов идентифицированного антитела, включая моноклональные антитела. Например, одноцепочечные антитела (SCA) представляют собой генетически сконструированные белки, сконструированные для расширения терапевтических и диагностических применений, возможных для моноклональных антител. SCA обладают специфичностью связывания и аффинностью моноклональных антител, и в своей нативной форме составляют приблизительно от одной пятой до одной шестой от размера моноклонального антитела, что, как правило, обеспечивает им очень короткое время полужизни. SCA обеспечивают некоторые преимущества по сравнению с большинством моноклональных антител, включая их способность прямого слияния с полипептидом, который можно использовать для детекции (например, с люциферазой или флуоресцентными белками). В дополнение к указанным преимуществам, полностью человеческие SCA можно выделять непосредственно из библиотек SCA человека без необходимости в дорогостоящих и требующих длительного времени способов "гуманизирования".

Одноцепочечные рекомбинантные антитела (scFv) состоят из доменов VL и VH антитела, связанных сконструированным гибким пептидным линкером (Atwell et al., 1999). По сравнению с интактными IgG scFv обладают преимуществами малого размера и структурной простоты со сравнимой антигенсвязывающей аффинностью, и они могут являться намного более стабильными, чем аналогичные 2-цепочечные Fab-фрагменты (Colcher et al., 1998; Adams and Schier, 1999). Длина вариабельных областей тяжелых и легких цепей (VH и VL) составляет приблизительно 110 аминокислот. Их можно связывать линкером из 15 аминокислот или более, например, с последовательностью, которая обладает достаточной гибкостью, чтобы позволить сборку двумя доменами антигенсвязывающего "кармана". В конкретных вариантах осуществления добавление различных сигнальных последовательностей позволяет нацеливать scFv на различные органеллы в клетке или секретировать их. Добавление константной области легкой цепи (Ck) обеспечивает димеризацию посредством дисульфидных связей, обеспечивая увеличенную стабильность и авидность. Таким образом, для одноцепочечных Fv (scFv) SCA, хотя два домена Fv-фрагмент кодируют отдельные гены, доказана возможность получения синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде единой белковой цепи scFv (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988) рекомбинантными способами. Кроме того, их часто используют из-за простоты из выделения из библиотек фагового дисплея и их способности распознавать консервативные антигены (для обзора см. Adams and Schier, 1999). Таким образом, в некоторых аспектах изобретения антитело может представлять собой SCA, которое выделяют из библиотеки фагового дисплея, в отличии от того, когда их получают более традиционными способами получения антител, описанными выше.

"По существу чистый" в отношении белков, как правило, означает, что белок отделяют от других загрязняющих белков, нуклеиновых кислот и других биологических структур, происходящих из исходного организма. Степень чистоты или "выделения" можно оценивать стандартными способами, и, как правило, она составляет по меньшей мере приблизительно 50% чистоты, более часто, по меньшей мере приблизительно 60% чистоты, как правило, по меньшей мере приблизительно 70% чистоты, в более общем смысле, по меньшей мере приблизительно 80% чистоты, часто, по меньшей мере приблизительно 85% чистоты, более часто, по меньшей мере приблизительно 90% чистоты, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95% чистоты, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 98% чистоты и в наиболее предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере 99% чистоты.

Способы получения или выделения поликлональных антител известны специалистам в данной области. Как правило, поликлональные антитела получают с использованием источника, содержащего представляющие интерес антитела, и фракционируя источник для обогащения на антитела с представляющей интерес реакционной способностью, например, со связыванием пептоидов. См., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH press, NY.

Кратко, пример выделения антител, связывающих конкретные пептоиды, может в качестве неограничивающих примеров включать получение образца, содержащего такие антитела; осаждение антител из образца сульфатом аммония и выделение антител посредством иммуноаффинной очистки стандартными способами и с использованием в качестве аффинного реагента одного или нескольких пептоидов. Используемой аффинной смолой может являться активированная CH-сефароза, связанная с пептоидом(ами) со структурой, описанной в данном описании. Осадок антител можно наносить на колонку и промывать PBS или другим подходящим буфером или промывочным раствором. Затем осадок можно элюировать и собирать. Концентрацию полученных антител можно определять с использованием колориметрического определения общего белка (Bio-Rad).

Не следует понимать, что настоящее изобретение ограничено использованием данного конкретного протокола получения и очистки антител, так как специалистам в данной области доступно и известно множество протоколов (см., например, Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press [1989]; Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press [1988]; и Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York [1994]). Единственным критерием для способов получения антител, находящих применение в настоящем изобретении, является то, что получают в достаточной степени очищенные препараты антител.

При использовании в отношении химической группы, "водород" означает -H; "гидрокси" означает -OH; "оксо" означает =O; "галоген" независимо означает -F, -Cl, -Br или -I; "амино" означает -NH₂; "гидроксиамино" означает -NHOH; "нитро" означает -NO₂; имино означает =NH; "циано" означает -CN; "азидо" означает -N₃; "меркапто" означает -SH; "тио" означает =S; "простой тиоэфир" означает -S-; "сульфонамидо" означает -NHS(O)₂-; "сульфонил" означает -S(O)₂-; "сульфинил" означает -S(O)- и "силил" означает -SiH₃.

Для структур, предоставленных в данном описании, приведенные ниже заключенные в скобки нижние индексы дополнительно определяют группы, как указано ниже: "(Cn)" означает точное количество (n) атомов углерода в группе. Например, "алкил_(C2-10)" означает алкильные группы с количеством атомов углерода от 2 до 10 (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, или любой диапазон, получаемый отсюда (например, 3-10 атомов углерода)).

Термин "алкил" при использовании без модификатора "замещенный" относится к неароматической одновалентной группе с насыщенным атомом углерода в качестве точки присоединения, линейной или разветвленной, цикло, циклической или ациклической структуры, без двойных или тройных углерод-углеродных связей и без атомов, отличных от углерода и водорода. Неограничивающими примерами алкильных групп являются группы -CH₃ (Me), -CH₂CH₃ (Et), -CH₂CH₂CH₃ (n-Pr), -CH(CH₃)₂ (iso-Pr), -CH(CH₂)₂ (циклопропил), -CH₂CH₂CH₂CH₃ (n-Bu), -CH(CH₃)CH₂CH₃ (втор-бутил), -CH₂CH(CH₃)₂ (изобутил), -C(CH₃)₃ (трет-бутил), -CH₂C(CH₃)₃ (неопентил), циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогексилметил. Термин "замещенный алкил" относится к неароматической одновалентной группе с насыщенным атомом углерода в качестве точки присоединения, линейной или разветвленной, цикло, циклической или ациклической структуры, без двойных или тройных углерод-углеродных связей и по меньшей мере с одним атомом, независимо выбранным из группы, состоящей из N, O, F, Cl, Br, I, Si, P и S. Неограничивающими примерами замещенных алкильных групп являются следующие группы: -CH₂OH, -CH₂Cl, -CH₂Br, -CH₂SH, -CF₃, -CH₂CN, -CH₂C(O)H, -CH₂C(O)OH, -CH₂C(O)OCH₃, -CH₂C(O)NH₂, -CH₂C(O)NHCH₃, -CH₂C(O)CH₃, -CH₂OCH₃, -CH₂OCH₂CF₃, -CH₂OC(O)CH₃, -CH₂NH₂, -CH₂NHCH₃, -CH₂N(CH₃)₂, -CH₂CH₂Cl, -CH₂CH₂OH, -CH₂CF₃, -CH₂CH₂OC(O)CH₃, -CH₂CH₂NHCO₂C(CH₃)₃ и -CH₂Si(CH₃)₃.

Термин "алкенил", когда его используют без модификатора "замещенный", относится к одновалентной группе с неароматическим атомом углерода в качестве точки присоединения, линейной или разветвленной, цикло, циклической или ациклической структуры, по меньшей мере с одной неароматической двойной углерод-углеродной связью, без тройных углерод-углеродных связей и без атомов, отличных от углерода и водорода. Неограничивающие примеры алкенильных групп включают: -CH=CH₂ (винил), -CH=CHCH₃, -CH=CHCH₂CH₃, -CH₂CH=CH₂ (аллил), -CH₂CH=CHCH₃, и -CH=CH-C₆H₅. Термин "замещенный алкенил" относится к одновалентной группе с неароматическим атомом углерода в качестве точки присоединения, по меньшей мере с одной неароматической двойной углерод-углеродной связью, без тройных углерод-углеродных связей, линейной или разветвленной, цикло, циклической или ациклической структуры и по меньшей мере с одним атомом, независимо выбранным из группы, состоящей из N, O, F, Cl, Br, I, Si, P и S. Неограничивающими примерами замещенных алкенильных групп являются группы -CH=CHF, -CH=CHCl и -CH=CHBr.

Термин "алкинил", когда его используют без модификатора "замещенный", относится к одновалентной группе с неароматическим атомом углерода в качестве точки присоединения, линейной или разветвленной, цикло, циклической или ациклической структуры, по меньшей мере с одной тройной углерод-углеродной связью и без атомов, отличных от углерода и водорода. Неограничивающими примерами алкинильных групп являются группы -C≡CH, -C≡CCH₃, -C≡CC₆H₅ и -CH₂C≡CCH₃. Термин "замещенный алкинил" относится к одновалентной группе с неароматическим атомом углерода в качестве точки присоединения и по меньшей мере с одной тройной углерод-углероденой связью, линейной или разветвленной, цикло, циклической или ациклической структуры и по меньшей мере с одним атомом, независимо выбранным из группы, состоящей из N, O, F, Cl, Br, I, Si, P, и S. Неограничивающим примером замещенной алкинильной группы является группа -C≡CSi(CH₃)₃.

Термин "арил", когда его используют без модификатора "замещенный", относится к одновалентной группе с ароматическим атомом углерода в качестве точки присоединения, где указанный атом углерода формирует часть одного или нескольких шестичленных ароматических циклических структур, где все циклические атомы представляют собой углерод и где одновалентная группа не содержит атомов, отличных от углерода и водорода. Неограничивающие примеры арильных групп включают фенил (Ph), метилфенил, (диметил)фенил, -C₆H₄CH₂CH₃ (этилфенил), -C₆H₄CH₂CH₂CH₃ (пропилфенил), -C₆H₄CH(CH₃)₂, -C₆H₄CH(CH₂)₂, -C₆H₃(CH₃)CH₂CH₃ (метилэтилфенил), -C₆H₄CH=CH₂ (винилфенил), -C₆H₄CH=CHCH₃, -C₆H₄C≡CH, -C₆H₄C≡CCH₃, нафтил и одновалентную группу, полученную из бифенила. Термин "замещенный арил" относится к одновалентной группе с ароматическим атомом углерода в качестве точки присоединения, где указанный атом углерода формирует часть одного или нескольких шестичленных ароматических циклических структур, где все циклические атомы представляют собой углерод, и где одновалентная группа дополнительно содержит по меньшей мере один атом, независимо выбранный из группы, состоящей из N, O, F, Cl, Br, I, Si, P и S. Неограничивающие примеры замещенных арильных групп включают группы: -C₆H₄F, -C₆H₄Cl, -C₆H₄Br, -C₆H₄I, -C₆H₄OH, -C₆H₄OCH₃, -C₆H₄OCH₂CH₃, -C₆H₄OC(O)CH₃, -C₆H₄NH₂, -C₆H₄NHCH₃, -C₆H₄N(CH₃)₂, -C₆H₄CH₂OH, -C₆H₄CH₂OC(O)CH₃, -C₆H₄CH₂NH₂, -C₆H₄CF₃, -C₆H₄CN, -C₆H₄CHO, -C₆H₄CHO, -C₆H₄C(O)CH₃, -C₆H₄C(O)C₆H₅, -C₆H₄CO₂H, -C₆H₄CO₂CH₃, -C₆H₄CONH₂, -C₆H₄CONHCH₃ и -C₆H₄CON(CH₃)₂.

Термин "гетероарил", когда его используют без модификатора "замещенный", относится к одновалентной группе с ароматическим атомом углерода или атомом азота в качестве точки присоединения, где указанный атом углерода или атом азота формирует часть ароматической циклической структуры, где по меньшей мере один из циклических атомов представляет собой азот, кислород или серу и где одновалентная группа не состоит из атомов, отличных от углерода, водорода, ароматического азота, ароматического кислорода и ароматической серы. Неограничивающие примеры арильных групп включают акридинил, фуранил, имидазоимидазолил, имидазопиразолил, имидазопиридинил, имидазопиримидинил, индолил, индазолинил, метилпиридил, оксазолил, фенилимидазолил, пиридил, пирролил, пиримидил, пиразинил, хинолил, хиназолил, хиноксалинил, тетрагидрохинолинил, тиенил, триазинил, пирролопиридинил, пирролопиримидинил, пирролопиразинил, пирролотриазинил, пирролоимидазолил, хроменил (где точкой присоединения является один из ароматических атомов) и хроманил (где точкой присоединения является один из ароматических атомов). Термин "замещенный гетероарил" относится к одновалентной группе с ароматическим атомом углерода или атомом азота в качестве точки присоединения, где указанный атом углерода или атом азота формирует часть ароматической циклической структуры, где по меньшей мере один из циклических атомов представляет собой азот, кислород или серу и где одновалентная группа дополнительно содержит по меньшей мере один атом, независимо выбранный из группы, состоящей из неароматического азота, неароматического кислорода, неароматической серы, F, Cl, Br, I, Si и P.

Термин "ацил", когда его используют без модификатора "замещенный", относится к одновалентной группе c атомом углерода карбонильной группы в качестве точки присоединения, дополнительно содержащей линейную или разветвленную, цикло, циклическую или ациклическую структуру, кроме того, не содержащей дополнительных атомов, которые не являются атомами углерода или водорода, кроме атома кислорода карбонильной группы. Неограничивающими примерами ацильных групп являются группы -CHO, -C(O)CH₃ (ацетил, Ac), -C(O)CH₂CH₃, -C(O)CH₂CH₂CH₃, -C(O)CH(CH₃)₂, -C(O)CH(CH₂)₂, -C(O)C₆H₅, -C(O)C₆H₄CH₃, -C(O)C₆H₄CH₂CH₃, -COC₆H₃(CH₃)₂ и -C(O)CH₂C₆H₅. Таким образом, термин "ацил" в качестве неограничивающих примеров включает группы, иногда обозначаемые как "алкилкарбонильные" и "арилкарбонильные" группы. Термин "замещенный ацил" относится к одновалентной группе c атомом углерода карбонильной группы в качестве точки присоединения, дополнительно содержащей линейную или разветвленную, цикло, циклическую или ациклическую структуру, в дополнение к кислороду карбонильной группы, дополнительно содержащей по меньшей мере один атом, независимо выбранный из группы, состоящей из N, O, F, Cl, Br, I, Si, P и S. Неограничивающими примерами замещенных ацильных групп являются группы -C(O)CH₂CF₃, -CO₂H (карбоксил), -CO₂CH₃ (метилкарбоксил), -CO₂CH₂CH₃, -CO₂CH₂CH₂CH₃, -CO₂C₆H₅, -CO₂CH(CH₃)₂, -CO₂CH(CH₂)₂, -C(O)NH₂ (карбамоил), -C(O)NHCH₃, -C(O)NHCH₂CH₃, -CONHCH(CH₃)₂, -CONHCH(CH₂)₂, -CON(CH₃)₂, -CONHCH₂CF₃, -CO-пиридил, -CO-имидазоил и -C(O)N₃. Термин "замещенный ацил" в качестве неограничивающих примеров включает "гетероарилкарбонильные" группы.

Термин "алкокси", когда его используют без модификатора "замещенный", относится к группе -OR, в которой R представляет собой алкил, как определено выше. Неограничивающие примеры алкоксигрупп включают: -OCH₃, -OCH₂CH₃, -OCH₂CH₂CH₃, -OCH(CH₃)₂, -OCH(CH₂)₂, -O-циклопентил и -O-циклогексил. Термин "замещенный алкокси" относится к группе -OR, в которой R представляет собой замещенный алкил, как определено выше. Например, замещенную алкоксигруппу представляет собой -OCH₂CF₃.

Подобным образом, термины "алкенилокси", "алкинилокси", "арилокси", "аралкокси", "гетероарилокси", "гетероаралкокси" и "ацилокси", когда их используют без модификатора "замещенный", относятся к группам, определенным как -OR, в которых R представляет собой алкенил, алкинил, арил, аралкил, гетероарил, гетероаралкил и ацил, соответственно, как определено выше. Когда любой из терминов алкенилокси, алкинилокси, арилокси, аралкилокси и ацилокси модифицирован модификатором "замещенный", он относится к группе -OR, в которой R представляет собой замещенный алкенил, алкинил, арил, аралкил, гетероарил, гетероаралкил и ацил, соответственно.

Термин "алкиламино", когда его используют без модификатора "замещенный", относится к группе -NHR, в которой R представляет собой алкил, как определено выше. Неограничивающие примеры алкиламиногрупп включают: -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -NHCH₂CH₂CH₃, -NHCH(CH₃)₂, -NHCH(CH₂)₂, -NHCH₂CH₂CH₂CH₃, -NHCH(CH₃)CH₂CH₃, -NHCH₂CH(CH₃)₂, -NHC(CH₃)₃, -NH-циклопентил и -NH-циклогексил. Термин "замещенный алкиламино" относится к группе -NHR, в которой R представляет собой замещенный алкил, как определено выше. Например, замещенной алкиламиногруппой является -NHCH₂CF₃.

Термин "амидо" (ациламино), когда его используют без модификатора "замещенный", относится к группе -NHR, в которой R представляет собой ацил, как определено выше. Неограничивающий пример ациламиногруппы представляет собой -NHC(O)CH₃. Когда термин амидо применяют с модификатором "замещенный", он относится к группам, определенным как -NHR, в которых R представляет собой замещенный ацил, как определено выше. Неограничивающими примерами замещенных амидогрупп являются группы -NHC(O)OCH₃ и -NHC(O)NHCH₃.

Термин "насыщенный" при обозначении атома означает, что атом связан с другими атомами только одинарными связями.

VI. Примеры

Приведенные ниже примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что описанные в приведенных ниже примерах способы представляют собой способы, описанные авторами изобретения, как хорошо функционирующие в практическом осуществлении изобретения, и, таким образом, их можно рассматривать, как составляющие предпочтительные способы для практического осуществления. Однако специалистам в данной области в свете настоящего описания будет понятно, что в конкретных вариантах осуществления можно производить множество изменений и все еще получать такой же или сходный результат, не отходя от сущности и объема изобретения.

ПРИМЕР 1

Подтверждение пептоидов в качестве селективных маркеров для болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона

Авторы изобретения применяли микропанели, содержащие наряду с различными маркерами и контрольными точками две копии панели из 4680 октамерных пептоидов. С микропанелями гибридизовали сыворотку (кровь), собранную у 6 пациентов с болезнью Альцгеймера и 6 здоровых контролей. Образцы сыворотки в значительной степени разбавляли для получения конечной концентрации общего белка в сыворотке 20 мкг/мл и этот раствор гибридизовали с микропанелью пептоидов. После инкубации и промывки, визуализировали профиль связывания IgG посредством последующей инкубации с меченными Alexa-647 вторичными антителами. В качестве контроля панель контактировали только со вторичными антителами и любые элементы, которые в значительных количествах связывали меченые вторичные антитела в последующем анализе игнорировали.

Анализ GenePix всех элементов на панели выявил несколько пептоидов (фиг.1A), которые при взаимодействии с сывороткой, полученной у пациента с AD, воспроизводимо давали большую яркость, чем с сывороткой, полученной у здорового индивидуума (интенсивность >30000 относительно <10000 при данной конкретной концентрации белка) (фиг.2A). Таким образом реагировали три представляющих интерес пептоида. Для тестирования специфичности пептоидов с данными пептоидами гибридизовали сыворотку, собранную у пациентов с болезнью Паркинсона. Однако с полученными образцами сыворотки посредством пептоидов получали только фоновые уровни антител IgG, что позволяет утверждать, что данные пептоиды являются специфичными захватывающими средствами для антител, образуемых при болезни Альцгеймера (фиг.2A).

Затем после применения такого обучающего набора авторы изобретения тестировали способность трех данных пептоидов различать AD посредством анализа образцов сыворотки, полученных от пациентов, которых не включали в тренировочный набор (фиг.4-13). Пептоиды также проверяли в анализе на микропанелях и анализе с гранулами Luminex (фиг.7). Все три идентифицированных при "обучении" пептоида великолепно функционировали в "слепых" экспериментах. Три указанных пептоида секвенировали посредством масс-спектрометрии, повторно синтезировали и очищали ВЭЖХ.

Таким образом, авторы изобретения продемонстрировали, что при скрининге пептоидной комбинаторной библиотеки можно выделять синтетические молекулы, способные к специфическому захвату конкретных IgG при болезни Альцгеймера.

Таблица 5
Результаты анализа на микропанелях
Оценка	Прогноз	Клинический диагноз
Положительно	16	Все правильно
Отрицательно	16	Все правильно
Промежуточное значение	4	AD(2) NC(2)
Общее количество протестированных образцов = 36.

Таблица 6
Оценка анализа с использованием платформы Luminex
Оценка	Прогноз	Клинический диагноз
Положительно	47	Все правильно
Отрицательно	54	Все правильно
Промежуточное значение	9	AD(3) NC(2) PD(4)
Общее количество протестированных образцов = 110.

Проводили дополнительные исследования, анализируя характеристики связывания сыворотки с содержанием, сниженным до анализа с использованием пептоида ADP1, на панели пептоидов, содержащих ADP1-3 (фиг.3). Эксперименты по снижению содержания антител показали, что ADP1 и ADP3 связывают сходную группу антител. В то же время ADP2, по-видимому, связывает вторую группу антител.

Синтез библиотеки и протокол печати: Библиотеку 8-мерных пептоидов с одним постоянным остатком (цистеин на C-конце) синтезировали общепринятым способом разделения и смешения на 500 мкм полистирольных макрогранулах. Затем гранулы помещали в 96-луночный планшет с одной гранулой в каждой лунке. Затем от гранул отщепляли пептоиды с использованием смеси для отщепления из 95% трифторуксусной кислоты, 2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана. В каждую лунку добавляли пятьдесят (50) мкл этой смеси и гранулы выдерживали в этой смеси в течение двух часов. Раствору смеси давали возможность испариться. После испарения смеси в каждую лунку добавляли 40 мкл 50% ацетонитрила и 50% воды.

Затем жидкое содержимое четырех 96-луночных планшетов (40 мкл на лунку) переносили в 384-луночный планшет с использованием Tecan Genesis Workstation 200. Тридцать четыре (34) мкл из каждого планшета переносили в новый 384-луночный планшет. Планшеты, содержащие по 6 мкл в каждой лунке, помечали как "остаточные" планшеты и оставляли, чтобы могла испариться смесь ацетонитрил/вода. Затем планшеты заклеивали клеящейся пленкой и хранили в морозильнике при -80°C для целей секвенирования по мере необходимости. Планшеты с 34 мкл жидкости помечали как "основной" и также оставляли для испарения смеси ацетонитрил/вода.

Когда жидкость из основных планшетов испаряется, в каждую лунку добавляли 20 мкл ДМСО (диметилсульфоксида) с использованием Tecan Genisis Workstation. Затем пять (5) мкл из каждой лунки отбирали и помещали в другой 384-луночный планшет. Этот планшет содержал 5 мкл ДМСО, добавленных в каждую лунку и его помечали как планшет "копия". Затем основные планшеты заклеивали клеящейся пленкой и хранили в морозильнике при -80°C. Планшеты-копии хранили в холодильнике при 4°C и использовали для печати микропанелей по мере необходимости.

Затем содержимое планшетов-копий печатью наносили на покрытые малеинимидом предметные стекла с использованием NanoPrint с MP946 Micro Spotting Pins. Для промывки игл перед печатью и между каждым циклом печати использовали смесь 10% этанола и воды. Между каждым забором образца и циклом печати использовали несколько циклов промывки/обработки ультразвуком/сушки. Сложные панели печатали с использованием всей головки из 48 игл и с расстоянием между точками 410 мкм в решетке 10 на 10. Часть панели наносили одной иглой MP946 в формате Whatman Fast Frame, 16 панелей на стекле в формате 2 на 8 и с расстоянием между точками 480 мкм в решетке 10 на 10. Стекла перед печатью выдерживали при 50% влажности в течение 12 часов. После печати увлажнитель выключали, и стекла перед сканированием с использованием сканера GenePix Autoloader 4200AL Scanner выдерживали в течение 12 часов. Стекла сканировали с использованием PMT 500 для проверки размещения и структуры точек.

Протокол получения предметных стекол: стекла маркировали на одном из углов с использованием алмазного стеклореза. Затем стекла помещали в подставки для предметных стекол и поставки помещали в сосуд для окрашивания стекол.

В ведерки со льдом помещали стеклянные стаканы (2 л) и их обкладывали льдом. В этом стакане готовили раствор 70/30 концентрированной H₂SO₄ и H₂O₂ (Piranha) и давали охладиться до комнатной температуры. Раствор Piranha переливали в сосуды для окрашивания стекол таким образом, чтобы жидкость покрывала стекла. Их закрывали и оставляли на 12 часов при комнатной температуре. Затем их вынимали и тщательно промывали деионизированной водой. Стекла помещали в центрифугу для сушки.

Нагревали водяную баню до 80°C. Предметные стекла погружали в 3-глицидоксипропилтриметоксисилан и помещали на водяную баню на 5-6 часов при осторожном перемешивании. Затем стекла оставляли охлаждаться, и затем два раза промывали ДМФА. Стекла снова помещали в центрифугу для сушки и хранили в атмосфере аргона до необходимости использования на следующей стадии.

Температуру водяной бани поддерживали на уровне 80°C. Стекла погружали в смесь 2 л поли(этиленгликоля) с 8 мл H₂SO₄ и помещали на водяную баню. Водяную баню перемешивали при скорости от средней до низкой в течение 6 часов. Стеклам давали охладиться и промывали DI водой при перемешивании в течение приблизительно одного часа. Стекла снова помещали в центрифугу для сушки и хранили в атмосфере аргона до необходимости использования на следующей стадии.

Отмеряли PMPI и растворяли в безводном ДМСО с получением 50 мМ раствора. Затем помещали стекла вверх помеченной стороной и верху реакционного сосуда с PMPI. PMPI вводили ниже стекол таким образом, чтобы он полностью заполнял сосуд и создавал некоторый избыток в резервуарах. С нижней поверхности стекол удаляли все воздушные пузырьки. В реакционном сосуде проводили перемешивание в течение ночи в атмосфере аргона на шейкере. Стекла удаляли из реакционного сосуда и промывали в ДМСО в течение одного часа. Данную стадию повторяли один раз. Следующую промывку проводили с использованием ДМФА в течение одного часа. Стекла снова помещали в центрифугу для сушки и хранили в атмосфере аргона до необходимости для следующей стадии.

Протокол гибридизации: Стекла микропанелей закрывали камерой для гибридизации и уравновешивали 1X TBST (50 мМ Tris, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20) в течение 15 минут. Затем стекла блокировали 1 мл блокирующего буфера в течение 1 часа при 4°C. Блокирующий буфер удаляли и стекла инкубировали с 1 мл сыворотки (20 мкг/мл) в течение 16 часов при 4°C при осторожном перемешивании. В альтернативном способе стекла блокировали 1 мл лизата E. coli (1,5 мг/мл) в течение 1 часа при 4°C. Лизат E. coli удаляли и стекла инкубировали с 1 мл сыворотки (15 мкг/мл) в лизате E. coli (1,5 мг/мл) в течение 18 часов при 4°C при осторожном перемешивании. Затем микропанели три раза промывали 1X TBST и гибридизовали с меченным Alexa-647 антителом к IgG (5 мкг/мл) в течение 2 часов на орбитальном шейкере при 4°C. Кассеты камер удаляли со стекол микропанелей и промывали 1X TBST (3×15 мин) с последующим 0,1X TBST (1×10). Затем стекла сушили на центрифуге (5 мин при 1500 об/мин) и сканировали на сканере микропанелей (Gene Pix Autoloader 4200) с использованием 635-нм лазера при 100% мощности и коэффициентом усиления фотоэлектронного умножителя 600 или 650. Все сканированные изображения анализировали посредством программного обеспечения Gene Pix Pro 6.0 и программного обеспечения Genespring.

ПРИМЕР 2

Сканирование саркозином ADP1-3

Сканирование саркозином имеет эффект замены каждой из боковых цепей по очереди метильной группой вместо водорода, сохраняя третичную амидную связь, но удаляя большую часть боковой цепи. В каждом из пептоидов ADP1-3 существует восемь положений, которые изменяли при синтезе исходной библиотеки (фиг.14). Для определения того, какие из боковых цепей в данных восьми положениях могут являться важными для связывания специфичных для AD антител, синтезировали двадцать четыре производных, в которых каждую из боковых цепей по очереди заменяли метильной группой. Каждое соединение получали твердофазным "субмономерным" химическим способом, где для замены бромида в положении, где желательна замена, использовали метиламин. Для тестирования характеристик связывания антител каждого производного, содержащего метил в боковой цепи, все 24 соединения, а также пептоиды ADP1-3 печатью наносили на микропанель. С теми же панелями гибридизовали сыворотку пациентов с подтвержденной аутопсией AD. После промывки на панель наносили флуоресцентно меченое вторичное антитело. После дополнительной промывки определяли интенсивность флуоресценции в каждом положении с использованием сканера флуоресценции. Интенсивности представлены на фиг.14. Когда в данной точке наблюдали значимое относительно исходного соединения уменьшение флуоресценции (означающее захват меньшего количества антитела), это интерпретировали как показатель того, что боковая цепь, находящаяся в исходном соединении в данном положении важна для связывания со специфичными для AD антителами.

ПРИМЕР 3

Материалы и способы

Примеры материалов и способов, использованных в данных исследованиях включают приведенное ниже.

Синтез и очистка пептоидов. Пептоиды можно синтезировать с использованием пептидного синтезатора ABI 433A или робота с параллельным синтезом на амидной смоле Ринка субмономерным способом (см., например, Zuckermann, R.N., Kerr, J.M., Kent, S.B.H., & Moos, W.H. (1992) J. Am. Chem. Soc., 114, 10646-10647). Кратко, амид на образующейся цепи является бромацетилированным с последующим замещением S_N2 бромида первичным амином с формированием боковой цепи. После синтеза пептоиды можно расщеплять и удалять защиту в смеси трифторуксусная кислота (TFA):триизопропилсилан:вода (95:2,5:2,5 по объему). Соединения можно очищать ОФ-ВЭЖХ на колонке C18 с линейным градиентом ацетонитрил/вода. Для подтверждения молекулярной массы очищенного продукта можно использовать масс-спектрометрию.

Мономер растущего пептоидного полимера можно собирать в две стадии с использованием двух легкодоступных субмономерных единиц. Амидную смолу Ринка бромацетилировали с использованием активированной диизопропилкарбодиимидом бромуксусной кислоты. Затем бромацетилированную смолу подвергали замещению S_N2 бромида первичным амином, что вносит желаемую боковую цепь. Коммерчески доступными или доступными для синтеза являются сотни потенциальных аминных субмономеров и соответствующих боковых цепей. Синтез пептоидов по протоколу с субмономерами обеспечивает легкий доступ к последовательностям с большим химическим разнообразием, что легко осуществить посредством мономерного подхода, и ограниченный только порядком, длиной последовательности и/или структурой присоединенной к N боковой цепи, достаточной для обеспечения желаемой активности.

Более конкретно, амидную смолу Ринка (4-(2',4'-диметоксифенил(9-флуоренилметилоксикарбонил)аминометил)феноксисмолу, 0,25 ммоль; Novabiochem) сначала подвергали набуханию в течение 30 мин в CH₂Cl₂. После набухания смолы удаляли 9-флуоренилметилоксикарбонильную (Fmoc) защитную группу путем обработки 20% раствором пиперидина в 1-метил-2-пирролидоне (NMP). Затем связанный смолой лишенный защиты амин подвергали бромацетилированию путем взаимодействия с 4,2 мл 1,2М бромуксусной кислоты (50 ммоль) в N,N-диметилформамиде (ДМФА) и 1,0 мл (11 ммоль) чистого N,N'-диизопропилкарбодиимида (DIC) в течение 60 минут при комнатной температуре при постоянном перемешиванием. Затем смолу промывали ДМФА (3×10 мл) с последующими промывками NMP (3×10 мл). 6 мл 1М Раствора (6 ммоль) "субмономера" первичного амина в NMP или CH₂Cl₂ подвергали взаимодействию со смолой, связанной бромацетильным фрагментом, заменяя бромид. Для получения N-(4-аминобутил)глицинового остатка (Nlys) синтезировали защищенный субмономер. Затем смолу снова промывали NMP (3×10 мл) с последующим ДМФА (3×10 мл). Продукт двух данных реакций давал пептоидный "остаток", отличительные признаки которого зависит от используемого субмономерного амина. Пептоиды удлиняли субмономерным способом до достижения желаемой длины цепи.

После синтеза пептоидные олигомеры могут быть отщеплены от смолы, одновременно удаляя трет-бутоксикарбонильную (Boc) защитную группу из остатков Nlys, путем обработки смесью 2,2,2-трифторуксусная кислота (TFA)/триизопропилсилан/H₂O (95:2,5:2,5 по объему). После расщепления пептоиды можно очищать до >97% гомогенности ВЭЖХ с обращенной фазой в препаративном масштабе. Точный градиент, используемый для ВЭЖХ, зависит от отличительных признаков и гидрофобности пептоида.

Такой синтез и характеристика также описаны в патенте США 6887845, который включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте. Как проиллюстрировано в данном описании и как будет понятно специалистам в данной области, ознакомленным с настоящим изобретением, присутствующие N-замещенные остатки глицина и образуемые в результате пептоидные соединения ограничены только доступностью для синтеза или коммерческой доступностью соответствующих аминных реагентов.

Печать микропанелей. Библиотеку 8-мерных пептоидов с одним постоянным остатком (цистеин на C-конце) синтезировали общепринятым способом разделения и смешения на 500 мкм полистирольных макрогранулах. Использовали семь различных аминов с применением общепринятого способа разделения и смешения и протокола с использованием микроволн. Затем гранулы помещали в 96-луночный планшет с одной гранулой в каждой лунке. Затем от гранул отщепляли пептоиды с использованием смеси для отщепления из 95% трифторуксусной кислоты, 2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана. Затем жидкое содержимое четырех 96-луночных планшетов переносили в 384-луночный планшет с использованием Tecan Genesis Workstation. Когда жидкость выпаривалась из основных планшетов, в каждую лунку добавляли ДМСО (диметилсульфоксид) с использованием Tecan Genisis Workstation. Планшеты хранили в холодильнике при 4°C и использовали для печати микропанелей по мере необходимости. Затем содержимое 384-луночных планшетов печатью наносили на покрытые малеинимидом предметные стекла с использованием NanoPrint LM 360. Сложные панели печатали с использованием всей головки из 48 игл и с использованием расстояния между точками 410 мкм в решетке 10 на 10. После печати стекла выдерживали в течение 12 часов, затем сканировали с использованием сканера GenePix Autoloader 4200AL Scanner. Стекла сканировали с использованием PMT 500 для проверки размещения и структуры точек.

Протокол гибридизации. Стекла микропанелей закрывали камерой для гибридизации и уравновешивали 1X TBST (50 мМ Tris, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20) в течение 15 минут. Затем стекла блокировали 1 мл блокирующего буфера в течение 1 часа при 4°C. Блокирующий буфер удаляли и стекла инкубировали с 1 мл сыворотки в течение 16 часов при 4°C при осторожном перемешивании. Затем микропанели три раза промывали 1X TBST и гибридизовали с меченным Alexa-647 антителом козы к антителу мыши в течение 2 часов на орбитальном шейкере при 4°C. Кассеты камер удаляли со стекол микропанелей и промывали 1X TBST с последующим 0,1X TBST. Затем стекла сушили на центрифуге и сканировали на сканере микропанелей с использованием 635-нм лазера при 100% мощности и коэффициентом усиления фотоэлектронного умножителя 600. Все сканированные изображения анализировали посредством программного обеспечения Gene Pix Pro 6.0 и программного обеспечения Genespring.

Конструирование вариантов пептоидов. Сканирование саркозином имеет эффект замещения каждой из боковых цепей по очереди метильной группой вместо водорода, сохраняя третичную амидную связь, но удаляя большую часть боковой цепи. Представляющие интерес пептоиды можно изменять в одном или нескольких положениях в пептоиде с определением того, какие положения боковых цепей влияют на связывание пептоида. Каждый пептоид можно получать твердофазной "субмономерной" химии (см. выше), где для замещения бромида в положении, где желательна замена, использовали метиламин. Для тестирования характеристик связывания указанных вариантов пептоидов для каждого варианта пептоид с соответствующими контролями можно печатью наносить на микропанель или какую-либо другую платформу для скрининга. С данными панелями гибридизовали образцы, содержащие мишени пептоидов. После промывки на панель наносили вторичное антитело или применяли другой способ детекции и определяли интенсивность флуоресценции в каждом определяемом положении. Когда в данной точке наблюдали значимое относительно исходного соединения уменьшение флуоресценции (означающее меньшую аффинность связывания), это интерпретировали как показатель того, что боковая цепь, находящаяся в исходном соединении в данном положении влияет на связывание.

Затем включали варианты пептоидов, содержащие один или несколько аминов или групп R, как описано в данном описании, и варианты идентифицировали сходными способами синтеза и скрининга.

Все композиции и способы, описанные и представленные в формуле изобретения в данном описании, можно получать и осуществлять без излишнего экспериментирования с учетом настоящего описания. Хотя композиции и способы настоящего изобретения описаны в отношении предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области будет очевидно, что композиции и способы и стадии или последовательности стадий способов, раскрытых в данном описании, можно изменять без отклонения от принципов, сущности и объема изобретения. Более конкретно, очевидно, что определенные средства, которые являются химически и физиологически родственными можно заменять средствами, описанными в данном описании, при этом можно достигать таких же или сходных результатов. Подразумевают, что все такие сходные заместители и модификации, очевидные специалистам в данной области, определены сущностью, объемом и принципами изобретения, как определено приложенной формулой изобретения.

VII. Ссылки

Приведенные ниже ссылки, поскольку они предоставляют иллюстративные процедурные или другие подробности, дополняющие приведенные в данном описании подробности, конкретно включены в настоящее описание посредством ссылки.

Патент США 3817837.

Патент США 3850752.

Патент США 3939350.

Патент США 3996345.

Патент США 4275149.

Патент США 4277437.

Патент США 4366241.

De Jager et al, Semin. Nucl. Med., 23(2): 165-179, 1993.

Doolittle and Ben-Zeev, Methods Mol Biol, 109:215-237, 1999.

Gulbis and Galand, Hum. Pathol, 24(12): 1271-1285, 1993.

Nakamura et al, In: Handbook of Experimental Immunology (4^th Ed.), Weir et al. (Eds), 1:27, Blackwell Scientific Publ, Oxford, 1987.

1. Способ ex vivo детекции антител в содержащем антитела образце, включающий:
(а) контактирование содержащего антитела образца с подложкой с закрепленным на ней пептоидом:
(iv) формулы (1D):

где R¹⁷-R²⁰ и R²³ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; C_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, ОН или SH; С_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, ОН или SH; лизила; карбоксила и гидроксильной группы; и
где R²¹, R²² и R²⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из С_0-6алкиларила; С_0-6алкилгетероарила; С_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из ОН, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из Н или С_1-6алкила или С_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из Н или С₁. ₆алкинила); OC_1-6алкила; С_2-6алкенила; С_2-6алкинила; С_2-6алкенила и С_2-6алкинила,
(v) формулы (ID):
где R¹⁷-R²⁰, R²³ и R²⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; С_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, ОН или SH; С_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, ОН или SH; лизила; карбоксила и гидроксильной группы; и
где R²¹ и R²² независимо выбраны из группы, состоящей из С_0-6алкиларила; С_0-6алкилгетероарила; С_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из ОН, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из Н или С_1-6алкила или С_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из Н или С_1-6алкинила); OC_1-6 алкила; С_2-6алкенила; С_2-6алкинила; С_2-6алкенила и С_2-6алкинила; или
(vi) формулы (1D):
где R¹⁷, R¹⁹, R²⁰ и R²³ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода; алкила; аллила; метила; этила; н-пропила; изопропила; н-бутила; изобутила; н-бутиламина; втор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазоила; оксазоила; пиперонила; пиразоила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пуринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензотриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина; циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (R)-метилбензила; С_1-6алкила, незамещенного или замещенного группой NH₂, ОН или SH; С_2-6алкинила, незамещенного или замещенного группой NH₂, ОН или SH; лизила; карбоксила и гидроксильной группы; и
R¹⁸, R²¹ и R²⁴ независимо выбраны из группы, состоящей из С_0-6алкиларила; С_0-6алкилгетероарила; С_1-6алкила, замещенного группой, выбранной из ОН, SH, галогена, OR¹⁵, COOR¹⁵, NR¹⁵ (где R¹⁵ выбран из группы, состоящей из Н или С_1-6алкила или С_1-6алкинила) или R¹⁶ (где R¹⁶ выбран из группы, состоящей из Н или С_1-6алкинила); OC_1-6алкила; С_2-6алкенила; С_2-6алкинила; С_2-6алкенила и С_2-6алкинила; и
где Z представляет собой NH₂, -ОН, аминокислоту или -NH(CCH₂SH)-C(O)NH₂; L отсутствует или представляет собой линкерный фрагмент, М представляет собой субстрат или подложку; и m, n, о и/или р равны 0-6; и
(b) детекцию антител, связавшихся с указанным пептоидом.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию постановки диагноза болезни Альцгеймера (AD) у индивидуума, от которого получали указанный образец, если уровень антитела, связавшегося с пептоидом любой из формул (iv)-(vi), превосходит уровень антитела, наблюдаемого у контрольных не подверженных заболеванию пациентов.

3. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию (с) принятие решения о лечении на основе результатов стадии (b).

4. Способ по п. 2, где указанный пептоид выбран из группы, состоящей из

где Z представляет собой NH₂, -ОН, аминокислоту или -NH(CCH₂SH) -C(O)NH₂.

5. Способ по п. 1 или 3, где указанный образец контактируют более чем с одним пептоидом по п. 1, имеющим любую из формул (iv)-(vi), и предпочтительно, с пептоидами AD1, AD2 и AD3.

6. Способ по п. 1 или 3, где указанная подложка представляет собой гранулу, планшет, тест-полоску, фильтр, мембрану, иглу или лунку, или где указанный образец представляет собой кровь, сыворотку, слюну или цереброспинальную жидкость CSF.

7. Способ по п. 1 или 3, где стадия детекции включает радиоиммунологический анализ (RIA), иммунофлуоресцентный анализ (FIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, резонансный перенос энергии Ферстера (FRET) или поверхностный плазмонный резонанс.

8. Способ по п. 1, где
содержащий антитела образец представлет собой сыворотку,
сыворотку подвергают воздействию множества пептоидов, имеющих любую из формул (iv)-(vi), определенных в п. 1, и
AD диагностируют у субъекта, у которого ожидается наличие AD путем детекции ассоциированного с AD антитела 1, связавшегося с пептоидом А, и, необязательно, детекции ассоциированного с AD антитела 2, связавшегося с пептоидом В.

9. Набор для детекции антител, характерных для нейродегенеративного заболевания, где набор содержит один или несколько пептоидов любой из формул (iv)- (vi) со всеми переменными, как определено в п. 1.

10. Набор по п. 9, где один или несколько пептоидов выбраны из любого из AD1, AD2, AD3, как определено в п. 4, и где Z также является таким, как определено в п. 4.

11. Композиция для идентификации индивидума, от которого получали сыровотку, как имеющего болезнь Альцгеймера, содержащая антитело, выделенное из сыворотки индивидуума с нейродегенеративным заболеванием, где антитело специфически связывает любой из AD1, AD2, AD3, как определено в п. 4, и где Z также является таким, как определено в п. 4.

12. Набор для детекции антигенов, ассоциированных с болезнью Альцгеймера, содержащий антитело, определенное в п. 11.

13. Антитело, выделенное стадиями, включающими:
(a) контактирование образца, содержащего антитело, характерное для нейродегенеративного заболевания, с иммуноаффинным субстратом, содержащим пептоид по п. 1, который связывает антитела, характерные для нейродегенеративного заболевания;
(b) элюирование связанных антител с иммуноаффинного субстрата.

14. Композиция для диагностирования болезни Альцгеймера, содержащая пептоид, имеющий любую из формул (iv)-(vi), как определено в п. 1.

15. Пептоидная композиция, содержащая любой из AD1, AD2, AD3, как определено в п. 4, и где Z также является таким, как определено в п. 4.

16. Пептоидная композиция по п. 15, дополнительно содержащая антитело, характерное для нейродегенеративного заболевания.

17. Выделенный пептоид для детекции антител, имеющий любую из формул (iv)-(vi), как определено в п. 1.

18. Выделенный пептоид по п. 17, где пептоид представляет собой любой из AD1, AD2, AD3, как определено в п. 4, и где Z также является таким, как определено в п. 4.

19. Способ детекции антитела в биологической жидкости, включающий стадии:
(a) инкубации панели пептоидов, состоящей из пептоидов, имеющих формулы (iv)-(vi), как определено в п. 1, с блокирующим буфером, содержащим бактериальный лизат в концентрации от 0,5 до 2 мг/мл;
(b) удаления блокирующего буфера;
(c) инкубации панели пептоидов, как определено в п. 1, с раствором образца, содержащим бактериальный лизат; и
(d) детекции антитела, связавшегося с панелью пептоидов.