Иммунохимическое определение одиночных мишеней

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для визуализации одиночной отдельной единицы мишени в образце, где указанная мишень иммобилизирована. Для этого проводят инкубацию образца, содержащего популяцию отдельных единиц мишени со связывающим агентом, содержащим фермент; при этом связывающий агент способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей мишени, и формирование дискретного одиночного сайта-мишени с фракционной субпопуляцией мишени, где каждый одиночный дискретный сайт-мишень представляет собой комплекс из одной отдельной одиночной единицы указанной фракционной субпопуляции и связывающего агента. Инкубацию образца в водном растворе, содержащем пероксидное соединение в количестве, которое составляет от 0,1 мМ до 5 мМ, первый субстрат фермента, связанный с дискретными одиночными сайтами-мишенями, и второй субстрат указанного фермента, где указанный первый субстрат является водорастворимым богатым электронами соединением, с образованием нерастворимого в воде полимерного продукта. При этом второй субстрат представляет собой конъюгированную молекулу с определяемой меткой, где определяемая метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцентных, люминесцентных, радиоактивных или хромогенных веществ или членов пар специфического связывания, с образованием дискретных депозитов второго субстрата. Визуализация одиночных сайтов-мишеней. Также предложен способ количественной оценки иммобилизованной мишени в образце, способ диагностики, прогнозирования риска развития заболевания и оценки эффективности терапевтического лечения у пациента. 7 н. и 56 з.п.ф-лы, 3 ил., 5 табл., 10 пр.

 

Область изобретения

Данное изобретение относится к области иммунохимической визуализации и количественной оценки одиночных мишеней, таких как одиночные молекулы, одиночные молекулярные структуры, одиночные частицы и т.д., в образцах, в которых иммобилизированы указанные одиночные объекты. В частности, изобретение относится к способам визуализации и количественной оценки одиночных единиц биологических или химических мишеней, в частности, к иммунохимической визуализации одиночных молекул биологических мишеней в гистологических образцах. Способы изобретения включают этап формирования дискретных депозитов определяемых молекул на одиночных сайтах-мишенях образца при посредничестве фермента с оксидоредуктазной активностью, где отдельный сайт-мишень содержит одну единицу мишени.

Уровень техники

Иммунохимия является распространенным инструментом в медицинской диагностике, а также она обычно используется для оценки терапевтических биомаркеров. Последние, в частности, часто требуют количественной оценки степени их присутствия. Применение антител к клеткам и тканям имеет специфические трудности помимо тех, которые возникают, когда эти реагенты применяются для очищенных белков, иммобилизированных на твердых субстратах или в растворе. Существует много факторов, которые могут влиять на иммунодетекцию, среди них фиксация и подготовка ткани, продолжительность и тип извлечения антигена и специфичность антитела. Дополнительной трудностью является возможность определять мишени, присутствующие на низком уровне. В целом, для растворимых анализов это становится вопросом увеличения сигнала без повышения уровня неспецифического фона. Подход, который был наиболее широко изучен, представляет собой усиление сигнала, которое достигается путем проведения последовательных циклов ферментативных реакций.

DAB представляет собой хромогенный субстрат пероксидазы хрена (HRP, radish peroxidase), который широко используется для визуализации белков-мишеней в гистологических образцах, которые помечены пероксидазной активностью. В способе используется тот факт, что HRP, связанная с антителами, направленными против белков образца, депонирует DAB из раствора на сайтах белков-мишеней и тем самым метит белки. Этот способ не особенно чувствителен и поэтому подходит для определения относительно избыточных белков-мишеней. Сигнал, связанный с депозитами DAB, не может быть в дальнейшем усилен. Другие недостатки, которые нужно учитывать, заключаются в том, что способ требует довольно больших количеств целевых специфических антител для насыщения всех сайтов-мишеней и является относительно медленным. Кроме того, этот способ обеспечивает одинаковый характер окрашивания, который проявляется при микроскопии как однородный цвет с внутриклеточным разрешением клеточных структур, например, мембраны, цитоплазмы, ядра, что делает невозможной точную количественную оценку окрашивания.

Катализированное усиление сигнала (CSA, catalized signal amplification) (описанное в патентах США 5863748, 5688966, 5767267, 5721158, 5583001, 5196306, 6372937, 6593100, 6593100) адоптирует биотинил- и флуоресцеил-тимидин для увеличения сигнала от HRP-меченых белков-мишеней и, таким образом, позволяет определять мишени с низким содержанием, которые в противном случае не определяются обычным способом (т.е. указанным выше способом). Тем не менее, из-за сильного окрашивания фона и трудной интерпретации результатов окрашивания, в частности, образцов флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и иммуногистохимии (IHC), CSA никогда не было широко принято в качестве рутинного подхода к оценке гистологических образцов в клинической гистопатологии.

Недавно был описан другой способ усиления на основе HRP, позволяющий определять в IHC-образцах молекулы-мишени с низким содержанием (описан в патентах WO 2009036760, WO 2010094283 и WO 2010094284). Способ использует DAB не в качестве хромогенного субстрата HRP, а как сшивающий агент, который опосредует депонирование с помощью HRP других определяемых HRP-субстратов. Способ обеспечивает значительное усиление сигнала депонированного HRP-субстрата, что делает чувствительность способа сравнимой со способом CSA, но по сравнению с последним новый способ выгодно не дает окрашивания фона. Среди других преимуществ этого нового способа стоит отметить, что скорость процедуры определения намного выше, чем скорость традиционной процедуры определения DAB или процедуры определения биотинил-тирамидом. Тем не менее, проблема предыдущих способов, а именно оценка количества мишени в IHC-образцах, которая основана на количественной оценке определяемого красителя, не была решена. Новый способ обеспечивает характер окрашивания, который является очень четким, но также обеспечивает одинаковое окрашивание внутриклеточного разрешения клеточных структур, как традиционные способы DAB или способ CSA. Этот характер окрашивания не позволяет напрямую приблизить количество мишени к количеству красителя в образце, потому что корреляция между этими двумя величинами не является линейной. Соответственно, количество мишени в гистологическом образце, визуализированной всеми этими способами, может быть оценено только относительно, но не точно.

Таким образом, в то время как схемы, обеспечивающие качество методики, были усовершенствованы и повысили стандарты IHC-окрашивания, схемы, связанные с интерпретацией результатов окрашивания изменены не были. Как правило, для оценки антигенов используются различные системы подсчета с применением различных уровней отсечения для оценки того, является ли ткань «положительной» или «отрицательной». Такая используемая в настоящее время оценка неизбежно связана с ошибками, которые могут иметь решающее значение в медицинской диагностике.

Оценка экспрессии мишени, основанная на оценке точного количества отдельных молекул-мишеней, присутствующих в образцах, так называемый подход определения одиночных молекул (SMD, single molecule detection), может быть путем к новой системе подсчета в IHC, которая была бы более надежной и авторитетной и для медицинской диагностики, и для терапии. К сожалению, количество доступных методик, позволяющих визуализировать одиночные молекулы белков-мишеней в гистологических образцах, в настоящее время очень ограничено, и они являются довольно трудоемкими и длительными процедурами.

В принципе, все доступные методики определения одиночных белковых молекул используют системы усиления на основе ДНК. Определение одиночной белковой молекулы впервые было продемонстрировано с появлением иммуно-ПЦР (Sano Т, Smith CL, Cantor CR. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science 1992;258:120-122; Adler M, Wacker R, Niemeyer CM. A real-time immuno-PCR assay for routine ultrasensitive quantification of proteins. Biochem Biophys Res Commun 2003;308:240-250; Niemeyer CM, Adler M, Wacker R. Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification. Trends Biotechnol 2005;23:208-216). Применяя гибридную конструкцию антитело-ДНК, аффинность связывания антитела дополнили чувствительным определением, достижимым с помощью ПЦР. Кроме того, иммуно-ДНК-стратегии определения были расширены применением круговой амплификации (RCA, rolling circle amplification), изотермической методики, которая создает длинный оцДНК-олигомер, связанный с иммуно-ДНК-конъюгатом (Gusev Y, Sparkowski J, Raghunathan A, Ferguson H Jr, Montano J, Bogdan N, Schweitzer B, Wiltshire S, Kingsmore SF, Maltzman W, Wheeler V. Rolling circle amplification: a new approach to increase sensitivity for immunohistochemistry and flow cytometry. Am J Pathol 2001;159:63-69).

Некоторые из существенных недостатков этих подходов SMD, которые нужно иметь в виду, заключаются в том, что

(i) синтез гибридов антитело-ДНК может быть проблематичным, так как контролировать расположение и количество ДНК-конъюгатов на одну молекулу белка не всегда просто, что часто приводит к гетерогенным соотношениям ДНК-меток и антитела; трудно контролировать реакцию амплификации; этап амплификации чувствителен к температуре; мечение не является стабильным, метка будет удаляться от цели с течением времени и т.д. Несмотря на то, что последние разработки в сайт-специфической конъюгации олигонуклеотидных меток с белками с использованием химии интеина (или химического связывания) были весьма успешными, изготовление конъюгатов по-прежнему остается трудоемким;

(ii) этапы способов требуют температурного контроля;

(iii) процедуры определения включают слишком много этапов; и

(iv) весь процесс определения занимает довольно длительное время. SMD-подход данного изобретения преодолевает указанные выше

препятствия и делает простой и надежной визуализацию и количественную оценку одиночных единиц мишеней в образцах, в которых иммобилизированы указанные одиночные объекты.

Сущность изобретения

Данное изобретение предлагает быстрый, простой и надежный способ визуализации, определения и количественной оценки одиночных элементов множества мишеней в различных образцах, в которых иммобилизированы мишени. Эти способы особенно выгодны для оценки сложных биологических образцов, таких как гистологические образцы.

Способы изобретения включают новую мощную систему усиления сигнала, которая делает возможной визуализацию одиночных элементов мишеней, таких как одиночные молекулы, одиночные молекулярные структуры, одиночные молекулярные комплексы, одиночные частицы и т.д., в очень широком динамическом диапазоне концентраций в целом ряде различных образцов. Термин «одиночный элемент мишени» в данном документе используется взаимозаменяемо с термином «одиночная/отдельная единица мишени». Способы изобретения включают следующие этапы:

а) формирование в образце одного или более чем одного сайта-мишени, меченого ферментативной активностью, где каждый из указанных сайтов-мишеней содержит одиночную единицу мишени, где указанные сайты-мишени создаются с фракционной субпопуляцией общего количества одиночных единиц-мишеней образца; а также

б) формирование дискретных депозитов определяемых молекул (также называемых в данном документе «репортерными молекулами» или «репортерами») на каждом одиночном сайте-мишени.

В некоторых воплощениях этап (а), приведенный выше, может быть излишним, так как образец уже может содержать сайты-мишени в соответствии с изобретением.

В других воплощениях способы изобретения могут включать один или более чем один дополнительный этап, например,

в) определение дискретных депозитов репортерных молекул на одиночных сайтах-мишенях как визуально различимых точек.

В одном воплощении изобретение предусматривает способ (способ (1)) визуализации отдельных одиночных единиц мишени в образце, где иммобилизирована указанная мишень, который включает

а) инкубацию образца, содержащего популяцию одиночных единиц мишени, с одним или более чем одним связывающим агентом, где

(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей мишени,

и формирование одного или более чем одного дискретного одиночного сайта-мишени с фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный сайт-мишень содержит комплекс из одной отдельной одиночной единицы указанной фракционной субпопуляции и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;

а) инкубацию образца (а) в водном растворе (i), содержащем

пероксидное соединение в количестве, которое составляет менее 2 мМ,

первый субстрат фермента, связанный с дискретными одиночными сайтами-мишенями (а),

второй субстрат указанного фермента,

где указанный первый субстрат является водорастворимым богатым электронами органическим соединением, которое

(1) способно образовывать радикал в реакции с указанным ферментом; и

(2) способно сшивать молекулы указанного второго субстрата в присутствии указанного фермента и пероксидного соединения, образуя нерастворимый в воде полимерный продукт указанного второго субстрата,

и где указанный второй субстрат является конъюгированной молекулой, содержащей по меньшей мере два соединения, которые способны выступать в качестве субстратов указанного фермента, и определяемую метку, где определяемая метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцентных, люминесцентных, радиоактивных или хромогенных веществ и членов пары специфического связывания,

таким образом, образуя дискретные депозиты второго субстрата на дискретных одиночных сайтах-мишенях (а) и визуализируя указанные одиночные сайты-мишени (а).

Способ изобретения, включающий этапы (а) и (б), указанные выше, может дополнительно содержать один или более чем один этап определения дискретных депозитов на одиночных сайтах-мишенях.

В одном воплощении способ (1), указанный выше, может быть использован для определения и визуализации одиночных отдельных единиц иммобилизированной мишени в образце, в котором мишень присутствует в широком динамическом диапазоне концентраций, при этом способ включает следующие этапы:

а) инкубация образца с одним или более чем одним связывающим агентом, где

(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с одиночной отдельной единицей мишени,

и формирование одного или более чем одного дискретного первого сайта-мишени с первой фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый отдельный дискретный первый сайт-мишень содержит комплекс из одной отдельной одиночной единицы указанной первой фракционной субпопуляции отдельных одиночных первых единиц и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент с оксидоредуктазной активностью;

б) инкубация образца (а) с первым субстратом фермента, связанным с первыми сайтами-мишенями (а), первой популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п.1, с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях (а)

в) инкубация образца (б) с раствором перекиси водорода в количестве, достаточном для гашения остаточной активности, связанной с первыми одиночными сайтами-мишенями (а);

г) инкубация образца (в) с одним или более чем одним связывающим агентом, где

(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной единицей мишени,

с формированием, таким образом, одного или более чем одного дискретного второго сайта-мишени со второй фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный второй сайт-мишень содержит комплекс из одной одиночной единицы указанной второй фракционной субпопуляции отдельных одиночных единиц и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;

д) инкубация образца (г) с первым субстратом фермента, связанным со вторыми одиночными сайтами-мишенями, второй популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) способа 1, указанного выше (т.е. этап (б) п.1), с формированием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях (г);

е) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях как первых визуально различимых точек, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной одиночной единицы первой популяции мишени;

ж) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях как вторых визуально различимых точек, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной одиночной единицы второй популяции мишени.

В другом воплощении изобретения способ (1) может быть использован для определения и визуализации отдельных единиц по меньшей мере двух иммобилизированной мишени в образце, при этом способ включает следующие этапы:

а) инкубация образца с одним или более чем одним связывающим агентом, способным связываться с первой мишенью, где

(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей первой мишени,

и формирование, таким образом, одного или более чем одного дискретного первого одиночного сайта-мишени с отдельными одиночными единицами первой мишени, где каждый одиночный дискретный первый сайт-мишень содержит комплекс из одной отдельной одиночной единицы указанной первой мишени и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;

б) инкубация образца (а) с первым субстратом фермента, связанным с первыми одиночными сайтами-мишенями (а), первой популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) способа (1), с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых одиночных сайтах-мишенях (а)

в) инкубация образца (б) с раствором перекиси водорода в количестве, достаточном для гашения остаточной активности фермента, связанной с первыми одиночными сайтами связывания (а);

г) инкубация образца (в) с одним или более чем одним связывающим агентом, способным связываться со второй мишенью, где

(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной единицей второй мишени,

с формированием, таким образом, одного или более чем одного дискретного второго одиночного сайта-мишени с отдельными одиночными единицами второй мишени, где каждый одиночный дискретный второй сайт-мишень содержит комплекс из одной отдельной единицы второй мишени и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;

д) инкубация образца (г) с первым субстратом, связанным со вторыми одиночными сайтами связывания, второй популяцией молекул второго субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) способа (1) описанного выше (т.е. этап (б) п.1), с формированием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях (г);

е) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях как первых визуально различимых точек, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной одиночной единицы первой мишени;

ж) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях как вторых визуально различимых точек, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной одиночной единицы второй мишени.

Другой аспект изобретения предусматривает способ количественной оценки мишени в образце, включающий

а) обработку биологического образца в соответствии с любым из способов изобретения (см. выше);

б) количественную оценку визуально различимых точек в образце;

в) оценку количества мишени в образце.

Другой аспект изобретения предусматривает применение способов определения и количественной оценки одиночных мишеней, описанных в данном документе, в медицинской диагностике, в частности, в прогностическом и терапевтическом приложении, где визуализация и количественная оценка одиночных единиц биологических маркеров имеет важное значение для точности диагностики, оценки эффективности терапевтического лечения, прогнозирования исхода заболевания, прогнозирования риска заболевания или стратификации пациентов для терапевтического режима и т.д.

В другом аспекте изобретение предусматривает анализы для определения и количественной оценки отдельных одиночных единиц различных мишеней с использованием способов изобретения.

Система усиления изобретения, будучи очень мощной и надежной, в то же время является гибкой и легко управляемой. Она значительно расширяет границы современных способов определения, в частности, способов определения с помощью обычной микроскопии в светлом поле или флуоресцентной микроскопии, для оценки образцов. В частности, при применении способов определения, включающих систему усиления изобретения:

(i) отдельные элементы иммобилизированной мишени можно визуализировать и количественно оценить в сложных образцах, таких как гистологические образцы;

(ii) отдельные элементы иммобилизированной мишени можно определить и количественно оценить, используя различные форматы анализа;

(iii) отдельные элементы иммобилизированной мишени можно определить и количественно оценить очень быстро, например, в течение 10-20 минут, тем не менее, в случае необходимости, процедуры визуализации и определения могут быть продлены или прерваны на длительный период времени без ущерба качеству результатов;

(iv) блокировка, обычно используемая для уменьшения мечения фона, не является необходимой;

(v) температурный контроль не требуется;

(vi) отдельные элементы иммобилизированной мишени можно определить и количественно оценить в очень широком динамическом диапазоне,

(vii) отдельные элементы сложных иммобилизированных мишеней можно определить и количественно оценить в образце за одну процедуру.

Таким образом, большие преимущества системы визуализации SMD изобретения заключаются в том, что она является простой, быстрой, прочной, надежной и гибкой. Это позволяет визуализировать и количественно оценивать одиночные элементы различных мишеней в различных образцах с помощью различных анализов. Дополнительные преимущества заключаются в том, что способы используют соединения, которые являются четко определенными химическими соединениями, которые либо коммерчески доступны, либо легко производятся. Еще одним преимуществом является то, что все процедуры способов можно осуществлять как вручную, так и автоматически.

Краткое описание графических материалов

На фиг.1 показаны типичные микрофотографии иммунохимического окрашивания образцов тканей, экспрессирующих Her2 (+2), где (1) является образцом, в котором Her2 визуализируется в соответствии с изобретением, а (2) является образцом, в котором Her2 визуализируется в соответствии со способом, описанным в WO 2009036760. Правая панель представляет собой схематическое представление характера окрашивания способом (1) и способом (2).

Фиг.2 является схематическим представлением процесса определения отдельных молекул в соответствии со способом изобретения (показан этап (б) п.1 и этап (в) пп.23-24).

На фиг.3 приведены результаты количественной оценки Her2 в клетках в соответствии со способом изобретения (см. пример 10): а. Сегментирование по одному цвету 10* изображения 0+Herceptest контрольной клеточной линии. Выявлена 21 точка (черный цвет) в одном изображении; b. Сегментирование по одному цвету 10* изображения 1+Herceptest контрольной клеточной линии: Выявлено 36 точек (черный цвет) в одном изображении; с. Сегментирование по одному цвету 10* изображения 3+Herceptest контрольной клеточной линии. Выявлено 2567 точек (черный цвет) в одном изображении; d. Сегментирование по двум цветам 10* изображения карциномы молочной железы. Точки белые, ядра черные, фон серый; е. Сегментирование по двум цветам 10^х изображения 3+Herceptest контрольной клеточной линии. Точки черные, ядра белые, фон серый. Тот же образец, что и в с.

Подробное описание изобретения

Способ визуализации отдельных единиц иммобилизированных мишеней в образцах

Один из аспектов изобретения предусматривает способы визуализации одиночных единиц мишеней, например, одиночных молекул-мишеней, одиночных частиц и т.д., в образце, в котором иммобилизированы одиночные отдельные единицы мишени.

В одном воплощении изобретение предусматривает способ визуализации одиночных единиц иммобилизированной мишени, при этом указанный способ включает следующие этапы:

а) формирование одного или более чем одного дискретного одиночного сайта-мишени, при этом каждый дискретный одиночный сайт-мишень содержит одиночную отдельную единицу мишени;

б) формирование дискретных депозитов определяемых молекул на дискретных отдельных сайтах-мишенях (а) и, тем самым, визуализация указанных одиночных сайтов-мишеней, и, возможно,

в) определение дискретных депозитов на дискретных одиночных сайтах-мишенях.

В частности, этапы (а), (б) и, возможно, (в) описанного выше способа могут быть выполнены следующим образом:

а) инкубация образца, содержащего популяцию отдельных единиц мишени, с одним или более чем одним связывающим агентом, где

(1) по меньшей мере один из связывающих агентов включает фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей мишени,

и формирование одного или более чем одного дискретного одиночного сайта-мишени с фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный сайт-мишень содержит комплекс из одной отдельной одиночной единицы указанной фракционной субпопуляции и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;

б) инкубация образца (а) в водном растворе (i), содержащем

пероксидное соединение в количестве, которое составляет менее 2 мМ,

первый субстрат фермента, связанный с дискретными одиночными

сайтами-мишенями (а), и

второй субстрат указанного фермента,

где указанный первый субстрат является водорастворимым богатым электронами органическим соединением, которое

(1) способно образовывать радикал в реакции с указанным ферментом; и

(2) способно сшивать молекулы указанного второго субстрата в присутствии указанного фермента и пероксидного соединения, образуя нерастворимый в воде полимерный продукт указанного второго субстрата,

и где указанный второй субстрат является конъюгированной молекулой, содержащей по меньшей мере два соединения, которые способны выступать в качестве субстратов указанного фермента, и определяемую метку, где определяемая метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцентных, люминесцентных, радиоактивных или хромогенных веществ или членов пары специфического связывания,

таким образом, образуя дискретные депозиты второго субстрата на дискретных одиночных сайтах-мишенях (а) и визуализируя указанные одиночные сайты-мишени (а) как визуально различимые точки,

и, возможно,

в) определение дискретных депозитов первого субстрата на первых сайтах-мишенях (а) и визуализация одиночных сайтов-мишеней (а) как визуально различимых точек и, таким образом, визуализация одиночных отдельных единиц мишени.

В некоторых воплощениях этап (б) может состоять из последовательных подэтапов:

(б') инкубация образца (а) в водном растворе (и), содержащем пероксидное соединение и

первый субстрат фермента, связанный с сайтами-мишенями (а), где указанный первый субстрат является водорастворимым богатым электронами органическим соединением, которое

(1) способно образовывать радикал в реакции с указанным ферментом; и

(2) способно сшивать молекулы указанного второго субстрата в присутствии указанного фермента и пероксидного соединения, образуя нерастворимый в воде полимерный продукт указанного второго субстрата,

где количество пероксидного соединения составляет менее 2 мМ

(б") инкубация образца (б') в водном растворе (i) (см. выше).

В некоторых воплощениях этап (в) может включать следующие подэтапы:

в') инкубация образца (б), содержащего дискретные депозиты второго субстрата на одиночных сайтах-мишенях (а) со связывающим агентом, способным специфически связываться с определяемой меткой депонированного второго субстрата и формировать комплекс, состоящий из одной или более чем одной молекулы депонированного второго субстрата и одной или более чем одной молекулы указанного связывающего агента,

(в″) определение в образце (в') связывающего агента, связанного с дискретными депозитами второго субстрата, тем самым, определение одиночных сайтов-мишеней и, тем самым, определение отдельной одиночной единицы мишени, связанной с указанным одиночным сайтом-мишенью.

Способы изобретения (указанные выше и описанные ниже) могут дополнительно включать один или более чем один дополнительный этап, например, этапы, предшествующие этапу (а), (б) или (в) например, этап гашения образца с помощью соединения, ингибирующего эндогенную или остаточную пероксидазную активность образца, предшествующих этапу (а), или один или более чем один этап между этапами (а), (б) и/или (в), или этапы, следующие за этапом (в), например, один или более чем один этап промывания, предшествующий, следующий за или идущий между этапами (а), (б) и (в). В одном воплощении способы могут включать по меньшей мере один автоматизированный этап.

Другие воплощения способа обсуждаются в следующих разделах.

Образец

Термин «образец» означает представительную часть или одиночный элемент большего целого или группы, количество или часть материала или объекта, который предположительно содержит мишень, которая должна быть определена, например, часть или некоторое количество биологического, химического материала, материала окружающей среды, содержащего молекулу-мишень, частицу, структуру, которая должна быть проанализирована, например, биоптат, образец пищи, образец грунта и т.д. Типичный пример показывает, что остальная часть материала или объекта является или должна быть такой же. В одном воплощении образцом изобретения может быть образец окружающей среды, например, образец почвы или образец утечки. В другом воплощении образцом может быть образец пищи. В другом воплощении образцом может быть часть библиотеки органических молекул. В другом воплощении образцом может быть образец боевого вещества.

В одном воплощении образцом изобретения является биологический образец.

Биологический образец может представлять собой, например:

1) образец, содержащий суспендированные клетки и/или клеточный дебрис, например, образец крови, супензию клонированных клеток, гомогенат тканей организма и т.д.;

2) образец, содержащий интактные или поврежденные клетки организма животного, ткань организма, мазок или жидкость или образец опухоли, например, биоптат; это может быть свежий образец ткани или консервированный образец ткани, например, фиксированный формалином и залитый парафином образец ткани;

3) образец, содержащий живой организм, например, образец среды, содержащей животных, растения, бактерии, грибы и т.д.;

4) образец, содержащий вирусные частицы, их дебрис или продукты вирусной жизнедеятельности, например, мазок из организма, содержащий вирусные нуклеиновые кислоты, белки, пептиды и т.д.;

5) образец, содержащий клеточную органеллу(ы);

6) образец, содержащий природные или рекомбинантные биологические молекулы, например, образец плазмы крови, кондиционированные культуральные клеточные среды и т.д.;

7) образец, содержащий растительные клетки или их дербис.

Приведенные выше примеры биологических образцов даны для иллюстрации, но не ограничивают воплощения изобретения.

Примеры химических образцов могут быть проиллюстрированы и не ограничиваются образцами библиотек химических соединений, например, пептидных библиотек. Примеры образцов окружающей среды могут быть проиллюстрированы, но не ограничиваясь ими, образцами почвы, воды или воздуха и образцами пищи.

Изобретение относится к образцам (например, любому из приведенных выше примеров), содержащим иммобилизированную мишень, т.е. к образцам, в которых мишень не может свободно перемещаться во время процедуры определения в соответствии с данным изобретением, например, к образцам, в которых перемещение мишени существенно сокращено или ликвидировано с помощью механических или химических средств, как, например, в случае прикрепленных образцов или мишеней или находящихся на определенной подложке или в среде. Таким образом, образец, содержащий одиночные отдельные единицы мишени, представляющей интерес, может в одном воплощении быть иммобилизирован на твердой подожке перед процедурой определения, например, образцы твердых тканей организма, иммобилизированные на стекле. Примеры образцов, содержащих иммобилизированные мишени изобретения, включают, но не ограничиваясь ими, образцы тканей организма, иммобилизированные на стеклянных или пластиковых слайдах, или образцы, содержащие биологические или химические молекулы, иммобилизированные на мембранах или планшетах для ELISA, и т.д. Мишень образца в этих воплощениях либо может быть иммобилизирована в образце, например, белок, зафиксированный внутри образца ткани, либо может быть иммобилизирована на поверхности или внутри определенного материала, такого как, например, часть твердого материала или геля, например нитроцеллюлозной мембраны и т.д. В одном воплощении твердая подложка может быть трехмерной структурой, например, коллагеновым или агаровым блоком. В этом воплощении мишень, например молекула или частица, может быть иммобилизирована в структуре.

В одном воплощении изобретение относится к образцу, который не содержит мишень, например, к контрольному образцу. В другом воплощении изобретение относится к образцу, который предположительно содержит мишень, например, к образцу неизвестного состава.

Термин «твердая подложка», упоминаемый выше, означает часть любого материала, который не растворяется в условиях процедуры в соответствии с изобретением, например, это может быть нитроцеллюлозная мембрана, стеклянный слайд и т.д. Примеры подложек, подходящих для иммобилизации образцов и/или мишеней, включают, но не ограничиваясь ими, синтетические полимерные подложки, такие как полистирол, полипропилен, замещенный полистирол, например, аминированный или карбоксилированный полистирол, полиакриламиды, полиамиды, поливинилхлорид, стекло, агарозу, нитроцеллюлозу, нейлон, поливинилидендифторид, нейлон с модифицированной поверхностью и т.д. Изобретение относится к твердой подложке, которая является химически инертной в условиях, описанных в данном документе, т.е. выбранная подложка может не иметь серьъезного влияния на результаты определения, полученные данным способом. Соответственно, может быть выбрана любая такая инертная подложка, подходящая для иммобилизации образца или мишени и соответствующая формату выбранного анализа, например, IHC, ELISA (иммуноферментному анализу), блоттингу и т.д.

Мишень

Термин «мишень» означает в данном контексте объект, представляющий интерес, который предположительно присутствует в образце, который можно охарактеризовать конкретными физическими и/или функциональными особенностями. Понятно, что в контексте данного изобретения термин «мишень» относится ко всему пулу практически одинаковых элементов этого объекта, а не к одному элементу этого объекта в образце. Термин «по существу идентичны» в данном контексте означает, что все или почти все одиночные элементы общего пула мишени в образце обладают одной или более чем одной особенностью, которая делает их узнаваемыми в качестве мишени. Например, мишень может быть конкретным белком, включая все молекулы данного белка в образце; другой пример мишени изобретения может быть конкретным молекулярным комплексом или структурой, включая практически все объекты образца, который содержит этот конкретный молекулярный комплекс или молекулярную структуру; еще одним примером мишени изобретения может быть вирусная частица или бактерия, где мишенью является общая популяция этих вирусных частиц или бактерий образца.

Биологические объекты, такие как молекулы, молекулярные комплексы, структуры, частицы или организмы, которые связаны с функциями, характерными для определенного типа клеток, ткани, клеточной структуры, физиологического состояния и т.д., часто называют «биологическими маркерами» этого конкретного типа клеток, ткани, клеточной структуры или физиологического состояния. Неограничивающие примеры таких биологических маркеров включают, но не ограничиваясь ими, конкретные нуклеотидные последовательности, белки или другие биологические молекулы, например, углеводы или липиды, хромосомные или мембранные структуры, вирусы, бактерии, микроорганизмы и т.д. В некоторых воплощениях изобретения термин «мишень» используется взаимозаменяемо с термином «биологический маркер» и относится к молекуле, молекулярному комплексу, структуре или частице, характерной для определенного типа клеток, ткани, физиологического состояния и т.д., где общая популяция любого из последних биологических маркеров в анализируемом образце считается мишенью.

В одном воплощении мишень может быть белком, например, клеточным мембранным рецептором или цитоплазматическим белком, в другом воплощении мишень может быть нуклеиновой кислотой, например, цитоплазматической нуклеиновой кислотой. Производные любой из последних указанных мишеней, например, фрагменты, предшественники, мутанты целевых белков или нуклеиновых кислот и т.д., также могут быть мишенью в некоторых воплощениях изобретения.

Таким образом, в различных воплощениях изобретения мишень может быть биологической или химической молекулой-мишенью, или частицей, или молекулярным или клеточным комплексом, или молекулярной или клеточной структурой, или вирусом, или микроорганизмом, или фрагментом указанной молекулы-мишени, частицей, комплексом, структурой, вирусом или микроорганизмом. Среди мишеней, содержащихся в химических образцах и образцах окружающей среды, могут быть различные загрязняющие вещества, токсины, боевые вещества, члены молекулярных библиотек, соединения промышленных вредных отходов и т.д.

В частности, изобретение относится к мишеням, которые могут быть представлены в образце множеством независимых по существу одинаковых единиц, в частности, изобретение относится к одиночным отдельным единицам мишени.

Под термином «единица» понимается единичное количество мишени, которое рассматривается как целое при расчете и служит для выполнения одной определенной функции. Термин «отдельная» означает, что единица отделена от других единиц того же вида или других компонентов окружающей среды (физическими особенностями функции) и может рассматриваться и учитываться отдельно. Термин «отдельная единица» является взаимозаменяемым с термином «одиночная единица». Термин «одиночная» в данном контексте означает единицу-мишень, состоящую из отдельного целого, состоящую только из одного, состоящую из одного, а не из множества. Например, отдельная/одиночная единица белка-мишени означает одиночную отдельную белковую молекулу белка-мишени, т.е. одну молекулу из множества молекул одного и того же вида. Термин «по существу одинаковые единицы» означает, что множество одиночных единиц мишени обладают одной или более чем одной особенностью, из-за которой эти единицы можно рассматривать как мишень. Термин «независимая» означает, что одиночная единица мишени существует как отдельный элемент и не зависит от существования других отдельных элементов того же вида в образце.

Изобретение в некоторых воплощениях относится к одиночной единице, которая является отдельной частью молекулы. Термин «отдельная часть молекулы» относится к такой части молекулы, которая имеет особые свойства, которые позволяют рассматривать эту часть молекулы отдельно от других частей той же молекулы, такой части как протеолитический фрагмент белка-мишени, часть гибридного белка, определенный домен белка-мишени, определенная структура нуклеиновой кислоты, эпитоп и т.д.

Таким образом, в одном воплощении изобретение может относиться к одиночным/отдельным единицам мишени, которые являются одиночными отдельными молекулами-мишенями, т.е. к множеству одиночных отдельных молекул-мишеней, присутствующих в образце; в другом воплощении изобретение может относиться к одиночным/отдельным единицам молекулы-мишени, которые являются одиночными отдельными частями молекулы, например, к определенным молекулярным структурам, присутствующим среди множества молекул-мишеней в образце, например, к эпитопу. В другом воплощении изобретение может относиться к множеству одиночных отдельных вирусных частиц, которые создают пул вирусных частиц, присутствующих в образце.

В разных воплощениях множество одиночных единиц мишени может быть представлено одиночными отдельными биологическими или химическими молекулами, одиночными отдельными частицами, одиночными отдельными молекулярными или клеточными комплексами, одиночными отдельными молекулярными или клеточными структурами, или одиночными отдельными вирусами, или одиночными отдельными микроорганизмами, или одиночными отдельными фрагментами указанных молекул, частиц, комплексов, структур, вирусов или микроорганизмов.

В одном предпочтительном воплощении мишень представляет собой биологический маркер, связанный с раком, например, нуклеиновые кислоты и полипептиды гормонов и факторов роста и их рецепторов, молекулы клеточной адгезии, молекулы трансдукции сигнала, молекулы регуляции клеточного цикла и т.д., например, гены, РНК и белки из группы, включающей факторы роста PDGF, VEGF, TGF, HGF и EGF, их рецепторы и связанные с путем их сигналинга молекулы, гены и их продукты, связанные с путями трансдукции сигнала, например, с путем JAK/STAT или путем контроля выживаемости клеток AktMPKB, или путем 5-FU, рецептор эстрогена ER и его ген (ERS1) и т.д. Способы изобретения позволяют просто и быстро визуализировать и количественно оценить указанные биологические маркеры.

Способы изобретения позволяют визуализировать и количественно оценивать одиночные отдельные единицы мишени, присутствующие в образце в широком динамическом диапазоне. И очень большие, и очень малые количества мишени можно визуализировать и количественно оценить в одном и том же образце, либо их можно оценить в отдельных образцах. В одном или и том же образце можно визуализировать две или более двух различных мишеней, например, белок-мишень и целевую нуклеиновую кислоту, или два или более двух различных белков-мишеней, или две или более двух различных целевых нуклеиновых кислот и т.д.

В одном воплощении одиночные единицы мишени могут быть распределены по существу равномерно по всему образцу, в других воплощениях одиночные единицы мишени могут присутствовать в большем количестве в одной части образца и в меньшем количестве в других его частях. Во всех последних воплощениях отдельные единицы мишени можно визуализировать и количественно оценивать в одном и том же образце с использованием способов данного изобретения. В некоторых воплощениях, в которых отдельная единица мишени связана с другой мишенью, представляющей интерес, например, находящейся в конкретной молекулярной ассоциации или структуре, которая является биомаркером патологического состояния, указанная другая мишень, представляющая интерес, также может быть визуализирована и количественно оценена путем визуализации и количественной оценки одиночных единиц мишени в образце.

В одном воплощении изобретение относится к фракционной субпопуляции одиночных единиц мишени, присутствующих в образце, например, к большинству или меньшинству от общего числа одиночных отдельных единиц мишени, присутствующих в образце. Термин «фракционная субпопуляция» в данном контексте означает часть общей популяции одиночных единиц мишени, которая равна или менее 99%, например, равна или менее 90% от общего числа одиночных единиц мишени в образце, например, менее 85%, например, 75-80% от общего числа единиц мишени в образце, например, менее 75%, например, от 1% до 50% от общего числа одиночных единиц мишени в образце, например, от 1% до 25% от общего числа единиц мишени в образце и т.д. Отдельные единицы мишени фракционной субпопуляции, которая представлена 50%-99% общей популяции, определяются в соответствии с изобретением как большинство одиночных единиц мишени, представленных в образце. Фракционная субпопуляция, которая представлена менее 50% общей популяции одиночных единиц мишени в образце, определяется в соответствии с изобретением как меньшинство одиночных единиц мишени, присутствующих в образце.

В одном воплощении большинство отдельных одиночных единиц мишени может быть вовлечено в формирование дискретных одиночных сайтов мишени изобретения; в другом воплощении меньшинство отдельных одиночных единиц мишени может быть вовлечено в формирование дискретных отдельных сайтов мишени изобретения. В одном воплощении, когда мишень или отдельные единицы мишени присутствуют в образце в очень низких количествах, может быть предпочтительным, чтобы практически все отдельные одиночные единицы мишени участвовали в формировании дискретных одиночных сайтов связывания изобретения.

Связывающий агент

Способы изобретения включают этап, в котором образец, предположительно содержащий мишень, инкубируют с одним или более чем одним связывающим агентом, по меньшей мере один из которых способен распознавать и специфически связываться с одиночной отдельной единицей мишени.

Термин «связывающий агент» обозначает молекулу, которая способна прямо или косвенно специфически связываться с одиночной единицей мишени, например, с отдельной молекулой белка-мишени. Термин «специфически» означает, что связывающий агент обладает конкретной аффинностью к мишени, например, аффинностью к молекуле-мишени, или конкретной аффинностью к агенту, который связан с мишенью, например, аффинностью к первичному антителу, связанному с белком-мишенью, аффинностью к гаптену, конъюгированному с первичным антителом и т.д. Термин «прямо» означает, что связывающий агент со специфической аффинностью к отдельной одиночной единице мишени взаимодействует и формирует непосредственную связь с этой одиночной отдельной единицей при взаимодействии, например, первичное антитело связывается непосредственно с одиночной отдельной молекулой-мишенью, которая была использована в качестве антигена для увеличения количества указанного первичного антитела. Термин «косвенно» в данном контексте относится к связывающему агенту, который не обладает специфической аффинностью к одиночной отдельной единице мишени, но имеет специфическую аффинность к другому веществу, способному специфически связываться с указанной одиночной отдельной единицей, например, с гаптеном; указанный связывающий агент непосредственно взаимодействует с последними веществами и образует связь с указанным веществом, и, тем самым, связывающий агент становится косвенно связанным с одиночной единицей мишени.

Связывающий агент, который способен напрямую специфически связываться с одиночной единицей мишени, как правило, представлен здесь первым связывающим агентом. Связывающий агент, который способен косвенно специфически связываться с отдельной единицей мишени, как правило, представлен вторым связывающим агентом. Тем не менее, система определения в соответствии с изобретением может включать другие связывающие агенты, которые могут быть косвенно связаны с одиночной единицей мишени, например, третий, четвертый связывающие агенты и т.д.

Как правило, первый связывающий агент или, в некоторых воплощениях, второй или третий связывающий агент используется для контактирования образца для распознавания мишени, связывания с ней и образования с ней комплекса. Второй, третий и другие связывающие агенты могут быть использованы в дальнейших этапах способов в соответствии с изобретением, например, для определения депозитов определяемых молекул на сайтах-мишенях, описанных ниже. В некоторых воплощениях второй, третий и другие связывающие агенты используются для усиления сигнала, связанного с мишенью. Эти связывающие агенты также используют для добавления системе определения гибкости, например, для изменения исходного сигнала, связанного с мишенью, например, с красного флуоресцентного сигнала на зеленый и т.д.

Связывающие агенты изобретения могут быть членами различных пар специфического связывания.

Известно большое количество различных пар специфического связывания, это пары из двух разных молекул, которые способны специфически связываться друг с другом. Члены пар специфического связывания, пригодные для применения в практике изобретения, могут быть иммунного или неиммунного типа.

Неиммунные пары специфического связывания включают системы, в которых два компонента имеют природную аффинность друг к другу, но не являются антителами. Примерами неиммунных пар специфического связывания являются биотин-авидин или биотин-стрептавидин, фолиевая кислота-фолат-связывающий белок, комплементарные нуклеиновые кислоты, рецептор-лиганд и т.д. Кроме того, изобретение включает неиммунные пары специфического связывания, которые образуют ковалентную связь друг с другом. Примеры пар ковалентного связывания включают сульфгидрильные реактивные группы, такие как малеимиды и производные галоацетила, и аминные реактивные группы, такие как изотиоцианаты, сукцинимидил-эфиры, сульфонилгалогениды, и связанные красители, такие как 3-метил-2-бензотиазолинон гидразон (МВТН) и 3-(диметил-амино)бензойную кислоту (DMAB) и т.д.

Примерами иммунных пар специфического связывания могут быть системы антитело-антитело или системы гаптен-антигаптен. В одном воплощении иммунной парой специфического связывания изобретения может быть пара связывания антитело-антитело, состоящая из двух или более молекул антител с аффинностью друг к другу, например, пара первичного антитела и вторичного антитела, где первичное антитело является первым связывающим агентом, а вторичное антитело является вторым связывающим агентом; в другом воплощении может быть использована система антител, состоящая из 3 или 4 или более членов. В других воплощениях изобретения иммунная пара связывания может быть представлена системой гаптен-антигаптен. В таких воплощениях первый связывающий агент может быть представлен конъюгатом, содержащим молекулу с аффинностью к мишени и гаптен, например, первичное антитело или последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с гаптеном, а второй связывающий агент может быть представлен антигаптеновым антителом.

Термин «гаптен» обозначает небольшую молекулу, которая может рассматриваться как изолированный эпитоп, к которому может быть сделано антитело, хотя гаптен сам по себе не индуцирует иммунный ответ при введении животному, он должен быть конъюгирован с носителем (обычно с белком). Так как гаптены являются малыми молекулами, множественные копии гаптена могут быть присоединены к большой молекуле, например, полимерной молекуле, например к белку, нуклеотидной последовательность, декстрану и т.д. Гаптены могут служить удобными молекулами-метками для анализов таких форматов, в которых необходимо или выгодно усиление сигнала. Таким образом, связанные множественные копии гаптена обеспечивают повышенную чувствительность, например, увеличенную силу сигнала. Неограничивающие примеры подходящих гаптенов включают флуоресцеин (FITC), 2,4-динитрофенол (DNP), дигоксигенин (DIG), тирозин, нитротирозин, биотин и красители, например тетраметилродамин, Texas Red, дансил, Alexa Fluor 488, BODIPY FL, краситель люцеферовый желтый и флуорофоры Alexa Fluor 405/Cascade Blue. Гаптены, описанные в патенте США 20080305497, также могут быть использованы для целей изобретения.

Термин «антитело», используемый в данном документе, обозначает иммуноглобулин или его часть, и включает любой полипептид, содержащий антиген-связывающий сайт, независимо от источника, способа получения и других характеристик. Этот термин включает, например, поликлональные, моноклональные, моноспецифические, полиспецифические, гуманизированные, одноцепочечные, химерные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутированные и CDR-привитые антитела. Часть антитела может включать любой фрагмент, который по-прежнему может связывать антиген, например, Fab, F(ab')₂, Fv, scFv. Происхождение антитела определяется геномной последовательностью независимо от способа получения.

Первичное антитело в контексте данного изобретения относится к агенту, связывающему антитело, например, к целой молекуле антитела, фрагменту или производному указанной молекулы, например, конъюгату, содержащему антитело, или полимеризованному антителу, которое специфически связывается с мишенью, в частности с одиночной единицей мишени в образце, например, с одиночной молекулой-мишенью. В некоторых воплощениях первичное антитело может быть двухвалентным антителом, которое способно связываться с двумя (или более) одиночными отдельными единицами различных мишеней, например, это может быть антитело, способное связываться с рецепторным димером, например, с димером Her2/Her3. В этом воплощении одиночная единица мишени в соответствии с изобретением является одиночным димером Нег2/НегЗ, а мишень является популяцией димеров Нег2/НегЗ в образце, включающем все указанные димеры образца. Первичные антитела могут быть получены от любых теплокровных видов, например, млекопитающих, птиц.

Вторичное антитело в контексте данного изобретения относится к агенту, связывающему антитело, например, к целой молекуле антитела, фрагменту или производному указанной молекулы, например, конъюгату, содержащему антитело, или полимеризованному антителу, которое имеет антегенсвязывающий домен, который специфически связывается с первичным антителом, или гаптен, депонированный на сайте-мишени, или гаптен, прямо или косвенно связанный с первичным антителом или другим связывающим агентом.

Третичное антитело в контексте данного изобретения относится к агенту, связывающему антитело, например, к целой молекуле антитела, фрагменту или производному указанной молекулы, например, конъюгату, содержащему антитело, или полимеризованному антителу, которое имеет антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с вторичным антителом, или гаптен, связанный с полимером, конъюгированным с вторичным антителом, или гаптен, депонированный на сайте-мишени,.

Иногда антитело может функционировать и как вторичное, и как третичное антитело.

Антитела, используемые в изобретении, в том числе первичные антитела, вторичные антитела и третичные антитела, могут быть получены от любого вида млекопитающих, например, от крысы, мыши, козы, морской свинки, осла, кролика, лошади, ламы, верблюда, или, например, от вида птиц, например, курицы, утки. Понятие «полученный от любого вида млекопитающих или птиц», используемое в данном документе, означает, что по меньшей мере часть нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей конкретное антитело, получена из геномной последовательности конкретного млекопитающего, например, крысы, мыши, козы или кролика или конкретной птицы, например, курицы, утки. Антитело может быть любого изотипа, например IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, или любого подкласса, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.

В некоторых воплощениях первичное антитело содержит антиген-связывающую область, которая может специфически связываться с биологическим маркером, в частности, с одиночной отдельной единицей указанного биологического маркера, экспрессированного клетками биологического образца. Маркер может быть экспрессирован на поверхности клетки или в клеточной мембране, т.е. во внутренней части клетки, например, в цитоплазме, в эндоплазматической сети и т.д. В некоторых воплощениях биологический маркер может быть выделен из клетки и, таким образом, он присутствует в бесклеточной среде, например, в водном растворе, либо он является растворимой молекулой, присутствующей в культуральной клеточной среде, плазме крови, спинномозговой жидкости и т.д. Примеры соответствующих образцов описаны выше.

В некоторых воплощениях вторичное антитело содержит антиген-связывающую область, которая специфически связывается с первичным антителом, например, с константной областью первичного антитела. В некоторых воплощениях вторичное антитело может быть конъюгировано с полимером. В некоторых воплощениях с полимером может быть конъюгировано 2-20 вторичных антител, например, 5-15 вторичных антител. В других воплощениях полимер может быть конъюгирован с 1-10 вторичными антителами, например с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 вторичными антителами.

В некоторых воплощениях третичное антитело может содержать антиген-связывающую область, которая специфически связывается с вторичным антителом, например, с константной областью вторичного антитела, или с гаптеном, связанным со вторичным антителом, или с полимером, конъюгированным с вторичным антителом. В некоторых воплощениях третичное антитело конъюгировано с полимером. В некоторых воплощениях с полимером может быть конъюгировано 1-20 третичных антител. В других воплощениях с полимером может быть конъюгировано 1-5 третичных антител, например 1, 2, 3, 4 или 5 третичных антител.

В некоторых воплощениях предпочтительными могут быть полимеры, содержащие одиночную связывающую единицу связывающего агента, например, полимера, конюгированного с одной молекулой первичного, вторичного или третичного антитела.

Антитела, которые могут быть использованы для целей данного изобретения, включают моноклональные и поликлональные антитела, в том числе антитела, полученные путем инженерии, включая химерные, CDR-привитые и искусственно выбранные антитела, полученные с использованием фагового дисплея или альтернативных методик.

Агенты изобретения, связывающие антитело, могут быть получены с помощью любой из многочисленных методик, хорошо известных в данной области, например, в соответствии с Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Методики изготовления рекомбинантных молекул антител описаны в приведенных выше ссылках, а также в ряде других ссылок, например, EP 0623679, EP 0368684 и ЕР 0436597. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, могут быть выделены из библиотеки кДНК. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, могут быть выделены из фаговой библиотеки (см., например, McCafferty ef а/. 1990, Nature 348:552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363; EP 0589877 B1). Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, могут быть получены путем перетасовки генов известных последовательностей (Mark et al. 1992, Bio/Technol. 10:779).

Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела могут быть выделены путем рекомбинации in vivo (Waterhouse et al. 1993, Nucl. Acid Res. 21:2265). Антитела, используемые в способах изобретения, включают гуманизированные иммуноглобулины (см. патент США 5585089, Jones et al. 1986, Nature 332:323). Антитела изобретения можно изменить любым возможным способом, полагая, что они сохранят свою аффинность связывания, например, они могут быть слиты с эффекторным белком, токсином, меткой и т.д. Способы конъюгации антитела с различными агентами также хорошо известны и описаны ниже в примерном воплощении изобретения.

В одном воплощении изобретения агент, связывающий антитело, представлен Fab-областью.

В одном воплощении агент, связывающий антитело, может быть композицией, содержащей два или более двух агентов, связывающих антитело, например, композицией, содержащей первый агент, связывающий антитело, и второй агент, связывающий антитело, где два или более двух различных агентов, связывающих антитело, принадлежат к различным парам иммунного связывания. В одном воплощении в композиции по меньшей мере одно из двух или более двух различных агентов, связывающих антитело, является антителом, которое способно специфически связываться с мишенью, и по меньшей мере одно другое является антителом, содержащим фермент.

В другом воплощении изобретение относится к связывающим агентам, которые являются членами неиммунных пар специфического связывания, таких как комплементарные нуклеотидные последовательности или молекулы нуклеиновокислотных аналогов.

Связывающий агент, содержащий нуклеиновокислотную молекулу или молекулу нуклеиновокислотного аналога, например молекулу ДНК, молекулу РНК, молекулу ПНК, может быть использован для визуализации и количественной оценки отдельных единиц нуклеиновокислотных мишеней.

Последовательности нуклеиновых кислот, используемые в качестве связывающих агентов для целей данного изобретения, могут быть синтезированы химически или произведены в рекомбинантных клетках. Оба способа производства хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press). В некоторых воплощениях агент, связывающий нуклеиновую кислоту, может включать пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК, PNA, peptide nucleic acid). Пептидная нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в которой дезоксирибозный или рибозный сахарный остов, обычно присутствующий в ДНК и РНК, заменен на пептидный остов. Способы создания ПНК хорошо известны в данной области (см., например, Nielson, 2001, Current Opinion in Biotechnology 12:16)) (включен в данный документ посредством ссылки). В других воплощениях связывающий агент может включать закрытую нуклеиновую кислоту (ЗНК, LNA, locked nucleic acid) (Sorenson et al. 2003, Chem. Commun. 7(17):2130).

Агент, связывающий нуклеиновую кислоту, в некоторых воплощениях может включать по меньшей мере одну олиго- или по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, которая специфически гибридизируется с одиночной единицей последовательности-мишени в биологическом образце, например, одиночной последовательностью мРНК, в определенных условиях жесткости. Термин «гибридизация в жестких условиях» используется в данном документе для описания условий гибридизации, при которых нуклеотидные последовательности, которые значительно комплементарны друг другу, например, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85-90% комплементарны друг другу, остаются связанными друг с другом. Процент комплементарности определяется, как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (включен в данный документ посредством ссылки).

Специфические условия жесткости известны в данной области и могут быть найдены в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ausubel et al. 1995 eds.), разделы 2, 4 и 6 (включены в данный документ посредством ссылки). Кроме того, специфические условия жесткости описаны в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, разделы 7, 9 и 11 (включены в данный документ посредством ссылки). В некоторых воплощениях условиями гибридизации являются условия высокой жесткости. Примером условий гибридизации высокой жесткости является гибридизация в 4^× хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при температуре 65-70°C или гибридизация в 4^×SSC с 50% формамида при 42-50°С, после которой идет одно или более чем одно промывание в 1^×SSC при температуре 65-70°C. Следует иметь в виду, что в буфер для гибридизации и/или промывания могут быть добавлены дополнительные реагенты, например, блокирующие агенты (BSA ли ДНК спермы лосося), детергенты (SDS), хелатирующие агенты (EDTA), Ficoll, PVP и т.д.

В некоторых воплощениях связывающие агенты могут гибридизироваться с последовательностью-мишенью в образце в умеренно жестких условиях. Умеренная жесткость, упоминаемая в данном документе, включает условия, которые могут быть легко определены специалистами в данной области на основе, например, длины ДНК. Типичные условия изложены в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 26 ed. Vol.1, pp.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (включен в данный документ посредством ссылки) и включают применение раствора для предварительного промывания 5^×SSC, 0,5% SDS, 1.0 мМ EDTA (pH 8,0), условия гибридизации в 50% формамиде, 6^×SSC при 42°C (или другом подобном растворе для гибридизации, таком как раствор Старка, в 50% формамиде при 42°C), и условия промывания 60°C, 0,5^×SSC, 0,1% SDS.

В некоторых воплощениях связывающие агенты могут гибридизироваться с последовательностью-мишенью в образце в условиях низкой жесткости. Условия низкой жесткости, упоминаемые в данном документе, могут включать условия, которые могут быть легко определены специалистами в данной области на основе, например, длины ДНК. Низкая жесткость может включать, например, предварительную обработку ДНК в течение 6 часов при 40°C в растворе, содержащем 35% формамида, 5^×SSC, 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 5 мМ EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизацию осуществляют в таком же растворе с учетом следующих изменений: 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, 10% (w/v) сульфата декстран, и используется 5-20×10⁶ СРМ-связывающего агента. Образцы инкубируют в гибридизационной смеси в течение 18-20 часов при температуре 40°С, а затем промывают в течение 1,5 ч при 55°C в растворе, содержащем 2^×SSC, 25 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 5 мМ EDTA и 0,1% SDS. Промывочный раствор заменяют свежим раствором и инкубируют 1,5 ч при 60°C.

В других воплощениях изобретение может относиться к связывающим агентам, которые представляют собой пептидные последовательности или включают пептидные последовательности, полученные из белков, не являющихся антителами, например, пептидные последовательности, полученные из доменов различных белков, связывающих нуклеиновые кислоты, лиганды различных клеточных и ядерных рецепторов и их производные. Некоторыми неограничивающими примерами таких связывающих агентов могут быть dq-белок классического пути каскада комплемента, который может связываться с константной областью антитела, МНС-молекула, например, МНС класса I и МНС класса II и нетрадиционные МНС, молекулы с партнером специфического связывания, например, молекулы, участвующие в клеточных сигнальных путях, такие как молекулы с доменом лейциновой застежки, например, fos/jun, myc, GCN4, молекулы с SH1- или SH2-доменами, такие как Src или Grb-2; иммуноглобулиновый рецептор, например, Fc-рецептор; химерный белок, т.е. белок, разработанный для соединения особенностей двух или более двух партнеров специфического связывания, например, лейциновая застежка может быть сконструирована в Fc-области антитела, SH2-домен может быть сконструирован для экспрессии в Fc-области антитела. В других воплощениях могут быть разработаны гибридные белки, которые включают Fc-часть антитела с замененным вариабельным доменом.

Связывающий агент также может быть небольшой молекулой, которая может специфически связываться с определенными структурными единицами больших биологических молекул.

В некоторых воплощениях связывающий агент может включает определяемую метку, например, флуоресцентное вещество, гаптен, фермент и т.д. В одном воплощении изобретения относится к меченым связывающим агентам, т.е. меченому третьему или другому связывающему агенту, который способен специфически связываться с депонированными определяемыми молекулами и используется для визуализации сайтов-мишеней изобретения. В одном воплощении изобретение предусматривает связывающий агент, содержащий ферментную метку. Неограничивающими примерами подходящих ферментных меток могут быть пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза (AP), бета-галактозидаза (GAL), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, бета-N-ацетилглюкозаминидаза, β-глюкуронидаза, инвертаза, ксантиноксидаза, люцифераза светлячков, глюкозооксидаза (GO). В одном воплощении связывающий агент может включать HRP в качестве метки. В другом воплощении связывающий агент может включать AP в качестве метки.

Количества связывающих агентов, необходимые для формирования сайтов-мишеней изобретения, могут варьировать в зависимости от различных факторов, например, от вида образца, вида мишени, вида связывающего агента, аффинности связывания связывающего агента и т.д. Используя общие знания, специалист в данной области может выбрать подходящий связывающий агент и определить количество, необходимое для каждого конкретного воплощения. В некоторых воплощениях может быть предпочтительным, чтобы количества связывающих агентов, формирующих сайты-мишени, подбирались таким образом, чтобы не все одиночные единицы мишени присутствовали в образце, но их фракционная популяция участвовала в формировании сайтов-мишеней изобретения, например, в воплощениях, когда образец содержит мишень в избыточных количествах, или мишень присутствует в широком динамическом диапазоне концентраций. В других воплощениях может быть предпочтительным, чтобы все или практически все одиночные единицы мишени участвовали в формировании сайтов-мишеней изобретения, например, в случае образцов с очень низкой экспрессией мишени или отдельными единицами мишени. В последних воплощениях может быть предпочтительным применение связывающих агентов в количествах, которые обеспечивают формирование сайтов связывания с подавляющим большинством отдельных одиночных единиц образца, т.е. с подавляющим большинством имеющихся одиночных единиц мишени, которые будут участвовать в формировании сайтов-мишеней.

Фермент

В соответствии с изобретением образец содержит одну или более чем одну отдельную единицу мишени. В соответствии с изобретением по меньшей мере один связывающий агент, содержащий фермент, прямо или косвенно связывает одиночную единицу мишени и образует комплекс с указанной единицей.

Фермент в соответствии с изобретением представляет собой фермент с оксидоредуктазной активностью (термины «оксидоредуктаза» и «фермент изобретения» используются взаимозаменяемо).

Под термином «фермент с оксидоредуктазной активностью» понимается фермент, классифицируемый как EC 1 по классификации EC ферментов, катализирующих перенос электронов от одной молекулы (восстановителя, называемого также донором водорода или электронов) к другой (окислителю, также называемому акцептором водорода или электронов). В некоторых предпочтительных воплощениях изобретение относится к оксидоредуктазам, классифицируемым какЕ 1.10. (фенолоксидазам) и E 1.11. (пероксидазам).

В одном предпочтительном воплощении изобретение относится к фенолоксидазам, в частности, к семейству медьсодержащих оксидазных ферментов, лакказам (E 1.10.3.2). Лакказы воздействуют на фенол и подобные молекулы, выполняя одноэлектронное окисление. Лакказы играют важную роль в формировании лигнина путем содействия окислительному связыванию лигнолов, семейству природных фенолов. Лакказой, пригодной для целей данного изобретения, может быть, например, фермент, описанный Phillips LE и Leonard TJ (Benzidine as a Substrate for Measuring Phenoloxidase Activity in Crude Cell-Free Extracts of Schizophyllum commune. Mycologia 1976, 68: 277-285), или Kunamneni A, Plou FJ, Ballesteros A, Alcalde M. (Laccases and their applications: a patent review. Recent Pat Biotechnol. 2008,2(1): 10-24), или Rodriguez Couto S, Toca Herrera JL (Industrial and biotechnological applications of laccases: a review. Biotechnol Adv. 2006, 24(5):500-13.)

Термин «лакказа» используется в данном документе для обозначения фермента с фенолоксидазной активностью изобретения, однако следует понимать, что лакказа является одним из многих воплощений фенолоксидазы, пригодных для целей данного изобретения.

В другом предпочтительном воплощении изобретение предусматривает пероксидазную ферментативную активность, катализирующую реакцию в виде:

ROOR'+донор электронов(2 e^-)+2Н⁺→ROH+R'OH

В одном предпочтительном воплощении изобретения фермент с пероксидазной активностью представляет собой пероксидазу хрена (HRP). В другом воплощении изобретения фермент с пероксидазной активностью представляет собой пероксидазу сои (SP).

Для некоторых пероксидаз оптимальным субстратом является перекись водорода, некоторые другие более активны с органическими гидропероксидами, такими как органические пероксиды. Природа донора электронов сильно зависит от структуры фермента, например, пероксидаза хрена (HRP) может использовать различные органические соединения, такие как и доноры, и акцепторы электронов. HRP имеет доступный активный центр, и многие соединения могут достигать места реакции.

Ферментативная активность, т.е. оксидоредуктазная активность, например, фенолоксидазная или пероксидазная активность, может быть представлена молекулой фермента полной длины, которая прямо или косвенно связана с молекулой связывающего агента, или фрагментом фермента, объединенного с ферментативной активностью, например, от 51% до 99,9% молекулы фермента полной длины, или менее 51%, например, 40%, 30% или меньше.

Связывающий агент изобретения может быть прямо или косвенно конъюгирован с одной или более чем одной ферментной группировкой (термин «группировка» в данном документе означает часть молекулы фермента, которая способна к оксидоредуктазной активности, он включает как целую или по существу целую молекулу фермента, так и части указанной молекулы, способные к оксидоредуктазной ферментативной активности). Молекулы обоих или первого и/или второго связывающего агента могут быть конъюгированы с одной или более чем одной функционально активной группировкой оксидоредуктазы. В одном воплощении по меньшей мере одна молекула первого связывающего агента может быть конъюгирована с одной или более чем одной ферментативной группировкой, способной к оксидоредуктазной активности; в другом воплощении по меньшей мере одна молекула второго связывающего агента может быть конъюгирована с одной или более чем одной такой группировкой. Молекулы третьего и других связывающих агентов могут быть конъюгированы с оксидоредуктазой. Термин «напрямую конъюгирован» означает, что группировка фермента связана с молекулой связывающего агента через химическую связь. Термин «косвенно конъюгирован» означает, что группировка фермента связана с молекулой связывающего агента через связывающую молекулу, которая имеет одну химическую связь со связывающим агентом и другую химическую связь с ферментом. Способы конъюгирования биологических молекул и линкерных молекул хорошо известны, и их примеры приведены ниже.

В одном воплощении группировка оксидоредуктазы представляет собой группировку HRP, например, фрагмент целой молекулы HRP, способный к ферментативной активности HRP; она также может быть рекомбинантным белком, содержащим часть HRP, обладающую ферментативной активностью, и т.д. В другом воплощении группировка оксидоредуктазы может быть группировкой соевой пероксидазы (SP). В другом воплощении группировка оксидоредуктазы может быть группировкой лакказы.

Неограничивающими примерами связывающих агентов, которые содержат фермент с оксидоредуктазной активностью, могут быть молекулы антител или их производных, например, Fab, конъюгированные с одной или более чем одной группировкой HRP, и агенты, связывающие нуклеиновые кислоты, конъюгированные с HRP. Такие связывающие агенты могут связываться напрямую или косвенно с одиночными единицами мишени, например, с одиночными молекулами-мишенями, и тем самым формировать комплексы, где одиночный такой комплекс содержит одиночную отдельную единицу мишени и один или более чем один связывающий агент, где один или более чем один связывающий агент содержит фермент с оксидоредуктазной активностью.

В одном воплощении связывающий агент представляет собой конъюгат, содержащий одну, две или более двух группировок пероксидазы, где указанные группировки непосредственно связаны со связывающим агентом, например, молекула антитела непосредственно конъюгирована с одной или более чем одной группировкой HRP. В другом воплощении связывающий агент может быть конъюгатом, который включает два или более двух ферментов с пероксидаэной активностью, например, две или более двух группировок HRP, которые связаны со связывающим агентом косвенно, например, конъюгатом, в котором одна или более чем одна молекула антитела и одна или более чем одна группировка HRP независимо связаны с полимерным остовом, т.е. фермент с пероксидазной активностью косвенно связан со связывающим агентом, т.е. с антителом.

Количество HRP на одну молекулу связывающего агента может варьировать от одной ферментной группировки на связывающий агент до 20-50 на связывающий агент или еще выше. В некоторых воплощениях предпочтительным может быть применение связывающих агентов, где количество HRP-группировок составляет по меньшей мере два, предпочтительно от двух до двадцати-двадцати пяти ферментных группировок на связывающий агент, например, от трех до двадцати, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д. Было обнаружено, что предпочтительно применение связывающих агентов, где количество ферментных группировок на связывающий агент составляет более одного, предпочтительно более двух на связывающий агент, предпочтительно более трех на связывающий агент. В некоторых воплощениях может быть предпочтительным применение связывающих агентов, содержащих более четырех ферментных группировок на связывающий агент, предпочтительно от 5 до 20, например, от 5 до 15. Связывающие агенты с более чем четырьмя ферментными группировками являются благоприятными для формирования сайтов-мишеней, которые можно визуализировать как точки практически одинаковых размеров. В некоторых воплощениях может быть еще более предпочтительно, чтобы каждая молекула связывающего агента, содержащая фермент пула таких связывающих молекул, содержала примерно такое же количество ферментных группировок, например, 4-6 на связывающие агенты пула, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10 и т.д. группировок фермента на молекулу связывающего агента, например, 5-6 или 6-7 HRP-группировок на молекулу антитела, например, на молекулу первичного или вторичного антитела. Последние упомянутые конструкции связывающего агента, содержащие множество группировок из HRP, являются примерами. Для достижения указанного эффекта связывающий агент может содержать множество группировок любого из ферментов изобретения с оксидоредуктазной активностью, описанных выше. Связывающий агент может также содержать комбинацию множества группировок различных оксидоредуктазных ферментов.

В некоторых других воплощениях могут быть предпочтительны относительно небольшие конъюгированные молекулы связывающих агентов, например, одиночные молекулы антител или изолированных Fab-областей антител, которые конъюгированы с одной, двумя, или более группировками фермента, например, HRP. Такие связывающие агенты являются относительно компактными молекулами, и это может быть выгодным для определения отдельных единиц мишеней, которые являются «скрытыми» или маскируются в мишени или в образце, например, отдельные одиночные молекулы-мишени могут быть замаскированы другими окружающими молекулами, отдельные структуры-мишени могут быть скрыты в молекуле-мишени, или отдельные вирусные частицы могут быть трудно доступны в сложных биологических образцах, содержащих клетки.

В некоторых других воплощениях могут быть предпочтительны большие конъюгаты, содержащие связывающий агент и от нескольких десятков до сотен ферментных группировок. Такие связывающие агенты могут быть выгодны, например, в тех случаях, когда требуется очень быстрое определение мишени или желательно получить крупные депозиты на отдельном сайте-мишени.

Одиночная единица мишени, связанная (прямо или косвенно) со связывающим агентом, содержащим фермент с оксидоредуктазной активностью, например, пероксидазной активностью, представляет собой одиночный сайт-мишень изобретения.

В одном воплощении одиночный сайт-мишень изобретения содержит одиночную единицу мишени, по меньшей мере одно первичное антитело или его производное и по меньшей мере одно вторичное антитело или его производное, конъюгированное с одним, двумя или более ферментами с пероксидазной активностью, например, HRP.

В другом воплощении одиночный сайт-мишень может содержать одиночную единицу мишени, по меньшей мере одну молекулу первичного антитела, конъюгированную с гаптеном, и антитело против гаптена, которое конъюгировано с одним, двумя или более ферментами с пероксидазной активностью, например, HRP.

В другом воплощении сайт-мишень может содержать одиночную единицу мишени, один или более чем один первый агент, связывающий нуклеиновую кислоту/аналог нуклеиновой кислоты, специфичный для мишени, и один или более чем один второй агент, связывающий нуклеиновую кислоту/аналог нуклеиновой кислоты, специфичный для первого агента, связывающего нуклеиновую кислоту/аналог нуклеиновой кислоты.

Приведенные выше воплощения не являются ограничивающими. Изобретение в других воплощениях может относиться к любой комбинации одиночной единицы любой мишени, приведенной выше, с любым связывающим агентом, приведенным выше, образующей сайт-мишень изобретения.

Одиночный сайт-мишень изобретения в одном воплощении может быть одиночным сайтом твердой поддержки, содержащим одиночную единицу мишени, помеченную ферментативной активностью изобретения, т.е. конъюгированную прямо или косвенно с ферментом с оксидоредуктазной активностью, или одиночную единицу рекомбинантной гибридной молекулы, содержащей фермент с оксидоредуктазной активностью. В одном воплощении оксидоредуктазный фермент может быть мишенью сам по себе, соответственно, сайт-мишень в этом воплощении может включать только одиночную единицу оксидоредуктазного фермента, такую как иммобилизированная группировка оксидоредуктазного фермента, например, HRP или лакказы, которая иммобилизирована на или в твердой подложке.

Ферментные субстраты

После инкубации с одним или более чем одним связывающим агентом и формирования сайтов-мишеней изобретения, описанных выше, образец, содержащий один или более чем один одиночный сайт-мишень в соответствии с изобретением, инкубировали в водном растворе (i). Водный раствор (i) в соответствии с изобретением содержал первый субстрат фермента, связанный с одиночным сайтом-мишенью изобретения, где указанный первый субстрат является водорастворимым богатым электронами органическим соединением, которое (1) способно образовывать стабильный радикал в реакции с ферментом; и (2) способно сшивать молекулы второго субстрата указанного фермента в присутствии как указанного фермента, так и пероксидного соединения, образуя нерастворимый в воде полимерный продукт указанного второго субстрата. Водный раствор (i) в соответствии с изобретением также содержал второй субстрат фермента, связанный с одиночным сайтом-мишенью изобретения, где указанный второй субстрат представляет собой конъюгированную молекулу, содержащую по меньшей мере два соединения, которые способны выступать в качестве субстратов указанного фермента, и определяемую метку, где определяемая метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцентных, люминесцентных, радиоактивных или хромогенных веществ или членов пар специфического связывания.

Первый субстрат

Первый субстрат фермента, связанный с одиночным сайтом-мишенью изобретения (также называемый в дальнейшем «первым субстратом»), является субстратом фермента с оксидоредуктазной активностью. Этот субстрат (1) является водорастворимым богатым электронами органическим соединением, (2) способен образовывать радикал в реакции с указанным ферментом; и (3) способен сшивать водорастворимые молекулы второго субстрата указанного фермента (в присутствии указанного фермента и пероксидного соединения), образуя нерастворимый в воде полимерный продукт указанного второго субстрата.

Термин «водорастворимые» означает, что молекулы первого субстрата растворимы в воде и водосодержащих растворах. Термин «богатое электронами соединение» в данном документе означает органическое соединение, которое содержит конъюгированную систему связанных р-орбиталей, включая соединения с чередующимися одиночными и множественными связями. Отдельные пары и радикалы могут быть частью системы. Соединение может быть циклическим, нециклическим или обоими. Термин «конъюгированный» означает, что существует перекрывание одной р-орбитали с другой поперечной промежуточной сигма-связью (в атомах большего размера могут быть задействованы d-орбитали). Конъюгированная система имеет область перекрытия р-орбиталей, соединяющую промежуточные одиночные связи. Они позволяют делокализовать пи-электроны по всем соседним соответствующим р-орбиталям, что в целом может привести к снижению общей энергии молекулы и увеличению стабильности. Пи-электроны конъюгированной системы не принадлежат к одиночной связи или атому, а также к группе атомов.

Группа ферментов с оксидоредуктазной активностью изобретения включает разнообразные ферменты, которые могут использовать большое количество субстратов. Среди этих субстратов субстратами изобретения являются те соединения, которые представляют собой водорастворимые богатые электронами органические соединения, содержащие конъюгированную пи-систему, которые способны образовывать радикалы, предпочтительно стабильные радикалы, в реакции с ферментом с оксидоредуктазной активностью изобретения. Термин «стабильный радикал» в данном контексте означает, что в условиях данного изобретения, например, в водном растворе (i), радикал первого субстрата имеет время полужизни по меньшей мере 20 секунд, предпочтительно от 1 минуты до 15 минут или дольше, например, 2, 3, 4 или 5 минут, от 5 до 10 минут, и т.д. Кроме того, радикалы соединений, которые входят в группу первых субстратов изобретения, способны сшивать водорастворимые молекулы второго субстрата изобретения и тем самым превращать указанные водорастворимые молекулы в нерастворимый в воде полимерный продукт.

В частности, в одном воплощении изобретение относится к первому субстрату, который представлен группой водорастворимых органических богатых электронами соединений, которые содержат группу взаимосвязанных атомов углерода, где каждая вторая связь является двойной связью, предпочтительно соединений, которые содержат цепочку как минимум из трех (С-С=) повторов, или соединений, которые содержат ароматическую кольцевую структуру.

В одном воплощении первый субстрат может быть представлен соединением, содержащим структуру формулы (I):

где

R1 представляет собой арил или винил,

R2, R3 и R4 независимо представляют собой H, N-(X)₂, O-(X)₂, где X представляет собой алкил, винил, арил или H, и где R2, R3 и R4 не одновременно представляют собой H,

где

H представляет собой водород;

O представляет собой кислород.

Неограничивающими примерами соединений приведенной выше формулы, которые могут выступать как первый субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью изобретения, могут быть 3′3′-диаминобензидин, феруловая кислота, альфа-циано-4-гидроксикоричная кислота и их производные.

В одном предпочтительном воплощении изобретение предусматривает 3′3′-диаминобензидин (DAB) в качестве первого субстрата.

Данное изобретение использует способность DAB формировать стабильный радикал, который может сшивать молекулы второго субстрата в присутствии фермента с оксидоредуктазной активностью, т.е. пероксидазы хрена (HRP), а также в присутствии пероксидного соединения, т.е. перекиси водорода, и депонировать сшитые молекулы второго субстрата дискретно на одиночных сайтах-мишенях.

В другом предпочтительном воплощении изобретение предусматривает феруловую кислоту в качестве первого субстрата.

Феруловая кислота также способна сшивать молекулы вторых субстратов изобретения в присутствии фермента с оксидоредуктазной активностью, т.е. пероксидазы хрена (HRP), и пероксидного соединения, т.е. перекиси водорода, и депонировать указанный второй субстрат дискретно на одиночных сайтах-мишенях изобретения.

В некоторых других предпочтительных воплощениях изобретение может предусматривать производные 3′3′-диаминобензидина, феруловой кислоты. Термин «производное» в данном контексте обозначает соединение, которое получено из 3′3′-диаминобензидина, феруловой кислоты, или соединение, которое условно может быть получено из 3′3′-диаминобензидина, феруловой кислоты, если один атом в последних был заменен другим атомом или группой атомов. Изобретение относится к производным 3′3′-диаминобензидина, феруловой кислоты, которые отвечают требованиям к первому субстрату изобретения, указанным выше.

Количество первого субстрата в водной среде (i) и/или водной среде (ii) может варьировать от примерно 0,05 мМ до примерно 2 мМ в зависимости от структуры соединения, представляющего первый субстрат. Как правило, соединения формулы (I), в которых R1 является винилом или виниловым производным, используются в больших количествах, чем соединения, в которых R1 представляет собой арил или его производное. Таким образом, DAB выступает в качестве первого субстрата в соответствии с данным изобретением, когда его количество в водном растворе (ii) составляет менее 1 мМ, предпочтительно в диапазоне от 0,05 до 1 мМ, например, между 0,05 мМ и 0,08 мМ, например, примерно 0,07 мМ, т.е. от 0,066 мМ до 0,074 мМ, или между 0,08 мМ и 0,1. мМ, например, примерно 0,09 мМ, или от 0,1 мМ до 0,3 мМ, например, примерно 0,15 мМ, примерно 0,2 мМ, примерно 0,25 мМ, или между 0,3 мМ и 0,6 мМ, например, примерно 0.35 мМ, примерно 0,4 мМ, примерно 0,45 мМ, примерно 0,5 мМ, примерно 0,55 мМ, или от 0,6 мМ до 1 мМ, например, примерно 0,7 мМ, примерно 0,75 мМ, примерно 0,8 мМ, между 0,8 мМ и 1 мМ. Было обнаружено, что когда DAB присутствует в последних количествах, то можно сформировать дискретные округлые депозиты второго субстрата, размер которых превышает 0,4 мкм в диаметре, например, примерно 1 мкм, 1,5 мкм, 2 мкм или более, например, примерно 3 или 4 мкм. Для получения таких депозитов второго субстрата феруловая кислота в качестве первого субстрата может присутствовать в водной среде (ii) в количестве, которое составляет от примерно 1 мМ до примерно 2 мМ, как, например, примерно 1,5 мМ.

Второй субстрат

В соответствии с изобретением второй субстрат фермента изобретения (также называемый в данном документе «вторым субстратом») представляет собой конъюгированную молекулу, содержащую по меньшей мере два соединения, которые способны выступать в качестве субстратов указанного фермента, и определяемую метку, выбранную из группы, состоящей из флуоресцентных, люминесцентных, радиоактивных или хромогенных веществ или членов пар специфического связывания.

В некоторых предпочтительных воплощениях изобретение относится к большой группе конъюгированных молекул в качестве второго субстрата, которые имеют следующие особенности:

1. Конъюгированные молекулы являются водорастворимыми молекулами, содержащими два или более двух веществ, которые могут выступать в качестве субстратов фермента изобретения, предпочтительно в качестве субстрата HRP, и одну или более чем одну метку, где субстраты и метки связаны друг с другом с помощью водорастворимого линкерного соединения (называемого далее «линкером»);

2. Группировки субстрата фермента «сконцентрированы» в конъюгированной молекуле в одной части указанной молекулы, а метки «сконцентрированы» в другой части указанной молекулы, где метка(и) находится на расстоянии от субстрата примерно в 30 или более последовательных взаимосвязанных атомов, т.е. отделена примерно на 2,5 нм или более, предпочтительно более чем на 3 нм.

3. Ферментные субстраты отделены друг от друга на расстояние, составляющее менее 2,5 нм, например, отделены в молекуле конъюгата менее чем на 30 связанных атомов углерода или гетероатомов, таких как атомы углерода, азота, серы и/или кислорода, предпочтительно не более чем на 5-20 атомов;

4. Линкер представляет собой соединение, которое содержит по меньшей мере 30 последовательно связанных атомов;

5. Конъюгаты не осаждаются из водного раствора (и), содержащего пероксидное соединение и первый субстрат изобретения, при отсутствии в среде фермента с оксидоредуктазной активностью.

6. Конъюгаты не осаждаются из водного раствора (ii), содержащего пероксидное соединение, в присутствии фермента с оксидоредуктазной активностью и в отсутствие первого субстрата указанного фермента в среде.

7. Конъюгаты осаждаются из водного раствора (ii), содержащего пероксидное соединение и первый субстрат фермента изобретения с оксидоредуктазной активностью изобретения в присутствии в среде указанного фермента.

Депозиты второго субстрата можно непосредственно определить с помощью визуальных средств, потому что они в некоторых воплощениях могут содержать хромогенную, флуоресцентную или люминесцентную метку. В других воплощениях осажденный второй субстрат, чтобы стать видимым, может быть «окрашен» на этапах, следующих после депонирования. В обоих случаях депозиты второго субстрата будут «сообщать» наблюдателю о присутствии одиночного сайта-мишени изобретения поблизости. Молекулы второго субстрата изобретения, таким образом, также называют в данном документе «репортерными» молекулами.

Неограничивающие воплощения молекул второго субстрата подробно описаны ниже и в примерах.

В одном воплощении изобретение предусматривает второй субстрат, который представляет собой водорастворимую конъюгированную молекулу, которая включает:

(i) одно или более чем одно определяемое вещество (называемое также «меткой»),

(ii) по меньшей мере два вещества, которые способны выступать в качестве субстратов фермента изобретения, и

(iii) линкер

где

указанный линкер представляет собой соединение, содержащее по меньшей мере одну линейную цепочку, состоящую из по меньшей мере 30 последовательно связанных атомов, содержащее по меньшей мере две точки разветвления, в котором указанные точки разветвления отделены молекулярным расстоянием по меньшей мере в 30 последовательно связанных атомов;

где

метки (i) и группировки субстрата оксидоредуктазы (ii) присоединены к линкеру в его двух точках ветвления, разделенных расстоянием по меньшей мере в 30 последовательно связанных атомов, и

где

любые два соседних ферментных субстрата отделены друг от друга на молекулярное расстояние менее 30 последовательных взаимосвязанных атомов.

Термин «определяемое вещество» означает, что вещество может испускать определяемый хромогенный, флуоресцентный, люминесцентный или радиоактивный сигнал, который может быть определен с помощью визуальных средств, либо оно может быть определено с помощью его партнера специфического связывания, например, антитела, нуклеиновокислотной последовательности, последовательности нуклеиновокислотного аналога, гаптена, антигена, рецептора, рецепторного лиганда, фермента и т.д.

В некоторых воплощениях водорастворимая конъюгированная молекула изобретения также может содержать группировки, которые могут усиливать его особенности, например, улучшать его способность выступать в качестве метки или ферментного субстрата, или увеличивать/уменьшать его растворимость в воде.

В одном воплощении конъюгированные молекулы изобретения могут быть выбраны из группы соединений формулы (II):

(Y)n-L-(Z)m,

где

Y представляет собой группировку, способную выступать в качестве субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью;

Z представляет собой определяемую метку;

L представляет собой линкерное соединение, где

n представляет собой целое число от 2 до 150, а

m представляет собой целое число от 1 до 150.

В одном предпочтительном воплощении Y выбран среди соединений следующей формулы (II):

R1 представляет собой -H, -O-Х, N(X)₂ или-S-X;

R2 представляет собой -H, -O-Х, -N(X)₂ или -S-X;

R3 представляет собой -H, -OH, -NH₂ или -SH;

R4 представляет собой -H, -O-Х, -N(X)₂ или -S-X;

R5 представляет собой - H, -O-Х, N(X)₂ или-S-X;

R6 представляет собой -CON(X)₂ или СО-Х, где

H представляет собой водород;

O представляет собой кислород;

S представляет собой серу;

N представляет собой азот;

X представляет собой H, алкил или арил.

В одном воплощении по меньшей мере одно из соединений, которые способны выступать в качестве субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью, является соединением формулы (ii).

В одном воплощении по меньшей мере два соединения, которые способны выступать в качестве субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью в конъюгированной молекуле, представляют собой соединения формулы (ii).

В одном воплощении по меньшей мере два соединения, которые способны выступать в качестве субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью в конъюгированной молекуле, представляют собой идентичные соединения формулы (ii).

В одном воплощении по меньшей мере два соединения, которые способны выступать в качестве субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью в конъюгированной молекуле, представляют собой различные соединения формулы (ii).

В одном воплощении все соединения, которые способны выступать в качестве субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью в конъюгированной молекуле, определяются формулой (ii). В одном воплощении они являются идентичными соединениями, в другом воплощении конъюгированная молекула содержит любую комбинацию различных соединений, определяемых формулой (ii).

В одном предпочтительном воплощении Y может быть остатком коричной кислоты; в другом предпочтительном воплощении Y может быть остатком феруловой кислоты. В другом предпочтительном воплощении Y может быть остатком кофейной кислоты; в другом предпочтительном воплощении Y может быть остатком аминокоричной кислоты. В другом предпочтительном воплощении Y может быть остатком синапиновой кислоты. В другом предпочтительном воплощении Y может быть производным феруловой кислоты, коричной кислоты, кофейной кислоты, аминокоричной кислоты или синапиновой кислоты.

Предпочтительно остаток Y, определяемый формулой (ii), связан с линкером L через группу R6.

В одном предпочтительном воплощении конъюгат содержит от двух до четырех идентичных остатков Y. В другом предпочтительном воплощении конъюгат содержит комбинацию из 2-4 различных остатков Y. В одном предпочтительном воплощении 2-4 остатка Y представляют собой соединения, определенные по формуле (ii).

В одном предпочтительном воплощении конъюгат может содержать 2-4 остатка феруловой кислоты или остатка ее производных; в другом воплощении конъюгат может содержать 2-4 остатка коричной кислоты или остатка ее производных; в другом воплощении конъюгат может содержать 2-4 остатка кофейной кислоты или остатка ее производных; в другом воплощении конъюгат может содержать 2-4 остатка аминокоричной кислоты; в другом воплощении конъюгат может содержать 2-4 остатка синапиновой кислоты или остатка ее производных. 2-4 производных последних соединений могут быть одинаковыми соединениями, либо могут быть различными соединениями.

В одном предпочтительном воплощении конъюгированная молекула может содержать два Y-соединения формулы (ii) или два их производных, например, два остатка феруловой кислоты, или два остатка коричной кислоты, или два остатка аминокоричной кислоты, или два остатка кофейной кислоты, или два остатка синапиновой кислоты и т.д., и одну или более чем одну определяемую метку; в другом воплощении конъюгат может содержать три молекулы формулы (ii) или три их производных, например, три феруловых кислоты, коричных кислоты, кофейных кислоты, аминокоричных кислоты, синапиновых кислоты и т.д., а также одну или более чем одну определяемую метку; в другом воплощении конъюгат может содержать четыре соединения формулы (ii) или четыре их производных, например, четыре феруловых кислоты, коричных кислоты, кофейных кислоты, аминокоричных кислоты, синапиновых кислоты или четыре производных последних, и одну или более чем одну определяемую метку.

В некоторых воплощениях количество соединений Y может быть больше 4, например, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50, 50-100 или 100-150 соединений. Неограничивающие примеры таких конъюгированных молекул описаны в примерах. В некоторых предпочтительных воплощениях такие конъюгаты могут содержать более одной линейной цепочки длиной не менее 30 последовательно связанных атомов, например, 30-150 атомов, где 2-4 Y-соединения прикреплены к каждой линейной цепи в первой и одной и той же точке разветвления цепи, и несколько таких линейных цепей связаны с другой водорастворимой линкерной молекулой, например, декстраном, через вторую (другую) точку разветвления указанных линейных цепей.

В одном предпочтительном воплощении конъюгированная молекула может содержать комбинацию двух или четырех различных соединений формулы (ii) или комбинацию двух или четырех их производных, например, двух остатков феруловой кислоты и одного остатка коричной кислоты, двух остатков синапиновой кислоты и двух остатков кофейной кислоты, и т.д.

В одном предпочтительном воплощении Y может быть остатком аминокислоты тирозина и остатком его производного. Конъюгат может содержать от 2 до 4 или более таких остатков.

В одном воплощении конъюгированная молекула может содержать комбинацию субстратов фермента с оксидоредуктазной активностью, в которых по меньшей мере один из указанных субстратов представляет собой тирозин. В одном воплощении конъюгированная молекула содержит по меньшей мере один остаток тирозина и по меньшей мере одно соединение формулы (ii) или его производное и по меньшей мере одно другое соединение формулы (ii) или его производное, например, один остаток тирозина и два остатка синапиновой кислоты или ее производных.

В некоторых воплощениях может быть предпочтительным, чтобы конъюгат содержал от 4 до 6 остатков Y, где Y представляет собой любое соединение или сочетание любых соединений, описанных выше.

В соответствии с изобретением соединения Y находятся в конъюгированной молекуле в виде группы, предпочтительно сгруппированные как 2-4 соединения Y на группу (т.е. конъюгат, содержащий более четырех соединений Y, может включать несколько групп из 2-4 соединений Y, где указанные группы в конъюгированной молекуле разделены группой атомов, например, молекулярным расстоянием, соответствующим 30 связанным атомам или более). Предпочтительно, 2-4 соединения Y в таких группах связаны друг с другом через спейсерное соединение, которое обеспечивает расстояние между двумя соседними остатками Y, не превышающее 5-15 взаимосвязанных атомов, например, 5-10, 6-12, 7-13, 8-14, 9-15 и т.д., например, 2-4 соединения Y могут быть присоединены к аминокислотам, составляющим пептидную цепь из 2-4 аминокислотных остатков, например, остатков лизина, серина, цистеина и т.д., где соединения Y прикреплены к реактивным группам аминокислотных остатков пептида, например, к эпсилон-аминогруппе остатков лизина. 2-4 соединения Y также могут быть связаны друг с другом с помощью других коротких полимеров, которые содержат ряд точек разветвления, где молекулярное расстояние между этими точками разветвления соответствует цепи длиной не более 3-7 атомов, предпочтительно 3-5 атомов, где соединения Y могут быть связаны напрямую или косвенно с указанными точками разветвления. 2-4 соединения Y также могут быть сгруппированы, будучи конъюгированными с неполимерной молекулой, которая имеет 2-4 реакционноспособные группы, позволяющие присоединять любые 2-4 соединения Y. Такое сгруппированное расположение соединения Y называется далее «Y-головой» конъюгированной молекулы.

В одном предпочтительном воплощении Y-голова содержит от двух до четырех Y-остатков, связанных через короткий полимер, например, короткую молекулу ПНК или короткий пептид, где пептид предпочтительно включает остатки лизина, серина, глутаминовой кислоты и/или цистеина. Тем не менее, подходящими могут быть любые другие полимерные или неполимерные водорастворимые молекулы, которые содержат 15 атомов или меньше, которые могут быть конъюгированы по меньшей мере с двумя Y-остатками и линкером L.

В одном воплощении одна Y-голова, содержащая от двух до четырех соединений Y, может быть связана с полимером, содержащим два или более двух повторов следующей формулы (III)^

где R₁ и R₂ выбраны среди NH и O, a R₃ выбран среди метила, этила, пропила, СН₂ОСН₂ и (СН₂ОСН₂)₂, и где имеется не более трех последовательно повторяющихся этилокси-групп. Полученный конъюгат может быть также конъюгирован с одной (или более чем одной) определяемой меткой, или он может быть конъюгирован с другой водорастворимой молекулой, которая включает одну или более чем одну реакционноспособную группу, позволяющую присоединять один или нескольких таких конъюгатов. Одним неограничивающим примером такой водорастворимой молекулы может быть полимер декстран.

Близкое расположение соединений Y в конъюгированных молекулах влияет на функциональные возможности конъюгатов в качестве вторых субстратов изобретения, а именно, конъюгаты остаются растворимыми в водных растворах, содержащих пероксидное соединение и 3.3′-диаминобензидин (DAB) в отсутствие фермента с оксидоредуктазной активностью в среде, но быстро и эффективно осаждаются из таких растворов, когда фермент с оксидоредуктазной активностью находится в среде (по сравнению с конъюгатами, которые содержат только одно Y-соединение или содержат несколько Y-соединений, которые не «сконцентрированы» в молекуле конъюгата в форме Y-головы, т.е. молекулярное пространство между двумя соседними остатками Y больше, чем обсуждаемое выше расстояние. Такие соединения не являются эффективными в плане формирования дискретных депозитов на одиночных сайтах-мишенях изобретения).

Определяемая метка конъюгированной молекулы может представлять собой любое вещество, которое может быть визуально определено, например, флуоресцентное или люминесцентное вещество, или любой материал, который можно определить с помощью некоторых средств определения, например, радиоактивную метку, член пары специфического связывания, например, нуклеиновокислотную последовательность, гаптен и т.д.

Любые флуоресцентные, люминесцентные, биолюминесцентные или радиоактивные молекулы могут быть использованы в качестве меток. Многие из них являются коммерчески доступными, например, флуоресцентные красители Alexa Fluors (Molecular Probes) и DyLight Fluors (Thermo Fisher Scientific). Другими неограничивающими примерами флуоресцентных меток могут быть следующие молекулы: 5- (и 6)-карбоксифлуоресцеин, 5- или 6-карбоксифлуоресцеин, 6-(флуоресцеин)-5-(и 6)-карбоксамидогексановая кислота, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, тетраметиродамин, Cy2, Cy3, Cy5, АМСА, PerCP, R-фикоэритрин (RPE), аллофикоэритрин (АРС), Texas Red, Princeton Red, покрытые зеленым флуоресцентным белком (GFP) нанокристаллы CdSe (кадмий-селеновые), производные рутения, люминол, изолюминол, эфиры акридиния, 1,2-диоксетаны и пиридопиридазины, радиоактивные изотопы водорода, углерода, серы, йода, кобальта, селена, трития или фосфора.

В некоторых воплощениях определяемая метка может быть ферментом. Неограничивающими примерами подходящих ферментных меток могут быть щелочная фосфатаза (АР), бета-галактозидаза (GAL), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, бета-N-ацетилглюкозаминидаза, бета-глюкуронидаза, инвертаза, ксантиноксидаза, люцифераза светлячков, глюкозооксидаза (GO).

В других воплощениях определяемая метка может быть членом пары специфического связывания, например, гаптеном. В качестве неограничивающих примеров подходящих гаптенов можно упомянуть 2,4-динитрофенол (DNP), дигоксигенин, флуоресцеин, Texas Red, тетраметилродамин, нитротирозин, ацетиламинофлуорен, ртуть, тринитрофенол, эстрадиол, бромдезоксиуридин, диметиламинонафталена сульфонат (дансил), аминокислоты тирозин, серии и т.д. В качестве примеров подходящих пар специфического связывания можно также отметить биотин - стрептавидин, комплементарные природные и неприродные олигонуклеотидные последовательности, пары, связывающие домен «цинковые пальцы» и т.д. Другие примеры приведены выше.

В одном предпочтительном воплощении метка представляет собой гаптен. В другом предпочтительном воплощении метка представляет собой флуоресцентное вещество. В другом предпочтительном воплощении метка является членом пары специфического связывания. Другие метки могут быть предпочтительными в других воплощениях.

Количество определяемой метки на молекулу конъюгата (как и любой из описанных выше) может варьировать. В некоторых воплощениях количество меток может составлять от 1 до 3, например, 1, 2 или 3 метки на молекулу конъюгата. В некоторых других воплощениях конъюгат может содержать от 4 до 150 меток на молекулу конъюгата.

В одном предпочтительном воплощении конъюгат (как и любой из описанных выше) содержит одну определяемую метку. В одном предпочтительном воплощении молекула конъюгата может содержать одну Y-голову (любую из рассмотренных выше) и одну метку.

В соответствии с изобретением в молекуле конъюгата определяемое вещество (одиночная метка или их множество) отделено от соединений, которые являются субстратом фермента с оксидоредуктазной активностью, например, от Y-головы, на молекулярное расстояние более 2,5 нм, например, отделено цепями по меньшей мере из 30 последовательных атомов, например, 30-150 или более последовательных атомов. В воплощениях, в которых конъюгат содержит одну цепь связанных атомов как L-линкер между Y-головой и одной (или более) меткой, Y-голова и метка (метки) связаны с указанной цепью в точках ветвления, расположенных на расстоянии не менее 30 атомов друг от друга, например, на противоположных концах цепи, состоящей из 30 связанных атомов.

В некоторых воплощениях, когда конъюгат содержит более одной метки, предпочтительно, чтобы метки были сгруппированы так, чтобы молекулярное расстояние между метками соответствовало цепи по меньшей мере из 30 последовательно связанных атомов (называемых «спейсером»), предпочтительно из 60 последовательно связанных атомов или более, например, из 90 последовательно связанных атомов. Предпочтительно спейсер между метками представляет собой гидрофильное соединение. Последняя группа меток затем прикрепляется к линкерному соединению, связывающему указанные метки и группировки ферментного субстрата в молекулу-конъюгат, таким образом, как описано выше, т.е. метка группы, которая расположена ближе всего к Y-голове, находится на расстоянии от любого из ферментных субстратов Y-головы по меньшей мере на 30 взаимосвязанных атомов, т.е. по меньшей мере на расстоянии 2,5 нм. Такое расположение множества меток в молекуле-конъюгате называется далее «Z-хвостом»

Предпочтительно, спейсер по меньшей мере из 30 последовательных атомов между метками Z-хвоста представляет собой полимерное соединение, состоящее из двух или более повторений следующей формулы (III):

где R₁ и R₂ выбраны среди NH и O, a R₃ выбран среди метила, этила, пропила, СН₂ОСН₂ и (СН₂ОСН₂)₂, и где имеется не более трех последовательно повторяющихся этилокси-групп.

Множество меток, прикрепленных к указанному выше спейсеру и отделенных им, могут быть конъюгированы с одной Y-головой или несколькими Y-головами через любой подходящий линкер, например, водорастворимые полимеры, позволяющие множественные прикрепления, например, декстран. В некоторых воплощениях несколько Y-голов может быть конъюгировано с несколькими Z-хвостами через такой полимер.

В одном воплощении множественные метки молекулы-конъюгата изобретения могут быть одними и теми же определяемыми веществами, в другом воплощении метки могут быть различными определяемыми веществами.

Z-хвостовое расположение меток имеет преимущества в том, что (1) конъюгаты, содержащие множественные гидрофобные метки, сохраняют хорошую растворимость в водных растворах, а также (2) метки лучше доступны для связывающих агентов, когда связывающие используются для определения депонированных конъюгатов.

Линкер между оксидоредуктазными субстратами и метками (например, между Y-головой и Z-хвостом), L, в соответствии с изобретением представляет собой молекулу, которая содержит цепочку по меньшей мере из 30 смежных атомов, например, 30-150 атомов или более, например, 30, 45, 60, 90, 150, 300, 500 или более атомов. В одном предпочтительном воплощении L предпочтительно содержит 150 смежных атомов. В некоторых воплощениях линкерная молекула содержит линейную цепь атомов, в которой после каждых двух соединенных атомов углерода следует атом кислорода или азота.

В одном предпочтительном воплощении L может быть одиночной линейной полимерной молекулой; в другом предпочтительном воплощении L может быть молекулой-конъюгатом, которая может содержать несколько различных полимеров, конъюгированных друг с другом.

В одном предпочтительном воплощении L представляет собой линейный полимер, который содержит цепь атомов, в которой после двух соединенных атомов углерода следует гетероатом, выбранный среди кислорода или азота, например, такой как линкер, описанный ниже, или полиэтиленгликоль и т.д.

В другом предпочтительном воплощении линкер представляет собой соединение, содержащее два или более двух повторов следующей формулы (III):

где R₁ и R₂ выбраны среди NH и O, a R₃ выбран среди метила, этила, пропила, СН₂ОСН₂ и (СН₂ОСН₂)₂, и где имеется не более трех последовательно повторяющихся этилокси-групп.

Предпочтительно, L содержит по меньшей мере два повтора приведенной выше формулы, где и R₁, и R₂ представляют собой NH, a R₃ представляет собой СН₂ОСН₂. Предпочтительно, L содержит один или более чем один повтор следующей формулы (IV):

где n представляет собой число от 1 до 10, а (B) представляет собой точку разветвления. L-молекулы этой формулы и их синтез подробно описаны в WO 2007/015168, который включен в данный документ посредством ссылки.

Под термином «точка разветвления» понимается точка в полимерной молекуле, к которой может быть прикреплена ветвь, например, боковая цепь того же самого полимера, или другие молекулы. Точка разветвления может быть атомом, группой атомов или функциональной группой, через которую соединения Y и Z могут быть прямо или косвенно конъюгированы с L.

Существует большое разнообразие полимерных молекул, которые могут быть использованы в качестве линкера L. Примеры включают полисахариды, такие как декстран, карбоксиметилдекстран, полиальдегид декстрана, карбоксиметилдекстран лактон и циклодекстрины; пуллуланы, шизофиллан, склероглюкан, ксантан, геллан, О-этиламиногуаран, хитины и хитозаны, такие как 6-О-карбоксиметилхитин и N-карбоксиметилхитозан; производные целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлозу, карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, 6-амино-6-дезокси-целлюлозу и О-этиламинцеллюлозу; гидроксилированный крахмал, гидроксипропиловый крахмал, гидроксиэтиловый крахмал, каррагинаны, альгинаты и агарозу; синтетические полисахариды, такие как фиколл и карбоксиметилированный фиколл; виниловые полимеры, в том числе полиакриловую кислоту), поли(акриламиды), поли(акриловые эфиры), поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(малеиновую кислоту), поли(малеиновый ангидрид), поли(акриламид), поли(этилвинилацетат), поли(метакриловую кислоту), поли(виниловый спирт), сополимер винилового спирта и винилхлорацетата, аминированный поливиниловый спирт), и их блок-сополимеры; полиэтиленгликоль (PEG), или полипропиленгликоль, или сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленоксида, содержащие полимерный остов, включая линейные, гребенчатые или сверхразветвленные полимеры и дендримеры, в том числе разветвленные РАМАМ-дендримеры; полиаминокислоты, в том числе полилизины, полиглутаминовую кислоту, полиуретаны, поли(этиленимины), плюриол; белки, включая альбумины, иммуноглобулины и вирус-подобные белки (VLP), и полинуклеотиды, ДНК, ПНК, ЗНК, олигонуклеотиды и олигонуклеотидные дендримерные конструкции; смешанные полимеры, т.е. полимеры, содержащие один или более из приведенных выше примеров полимеров, блок-сополимеры и случайные сополимеры.

Свойства выбранного полимера могут быть изменены для оптимизации производительности, например, может быть оптимизирована длина или разветвление. Кроме того, полимер может быть химически модифицирован путем введения различных заместителей. Заместители могут быть дополнительно химически защищены и/или активированы, позволяя получать из полимера дальнейшие производные.

В одном предпочтительном воплощении линкерное соединение между оксидоредуктазными субстратами и метками представляет собой декстрановый полимер или конъюгированную молекулу, содержащую декстрановый полимер.

Способы конъюгации полимеров с различными химическими веществами, например метками, хорошо известны в данной области и могут быть использованы для создания конъюгатов изобретения. Например, полимер может быть активирован с винилсульфоном и смешан с определяемой меткой и молекулой формулы (II) для формирования полимерного конъюгата. В других воплощениях для активации полимера могут использоваться альдегиды, например, декстран, который затем смешивается с определяемой меткой и молекулой формулы (II). Еще один способ получения полимерных конъюгатов заключается в применении так называемых схем селективного связывания для связывания компонентов вместе, например, молекулы могут быть производными с тиоловыми реактивными малеимидовыми группами до образования ковалентной связи с тиоловым модифицированным полимерным остовом. В некоторых других воплощениях молекула формулы (I) и определяемая метка могут быть присоединены к полимеру с помощью связывающего соединения. Примеры этого способа включают применение гомобифункциональных линкерных соединений, таких как глутаровый диальдегид, гексан-ди-изоцианат, диметилапимидат, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол, гетеробифункциональные сшиватели, такие как, например, N-гамма-малеимидобутиролоксисукцинимид эфир, и поперечные сшиватели нулевой длины, такие как 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид.

Способы получения производных полимеров, содержащих один или более чем один повтор формулы (III) (называемых в дальнейшем «L30»), подробно описаны в WO 2007/015168, который включен в данный документ посредством ссылки.

Типичные конъюгаты, содержащие линкеры, которые являются полимерами, содержащими различное число повторов формулы (III), например, полимером, содержащим два повтора L30 (называемым L60), например, полимером, содержащим три повтора L30 (называемым L90), например, полимером, содержащим пять повторов L30 (называемым L150), описаны в примерах.

Количество второго субстрата в водной среде (ii) может варьировать от примерно 10^-10 М до примерно 10^-4 М, например, в случае конъюгата (как любого из описанных выше), который содержит радиоактивную метку, применимое количество может составлять от примерно 10^-10 М до 10^-6 М, и примерно от 10^-9 М до 10^-4 М в случае конъюгата, который содержит флуоресцентную метку или метку, которая является членом пары специфического связывания.

Инкубационные среды

В одном воплощении образец, содержащий одиночные единицы мишени, инкубируют во время процедуры визуализации в соответствии с изобретением в различных водных средах (в совокупности называемых здесь «инкубационными средами»).

Термин «инкубационная среда» означает в данном контексте водный раствор, в котором образец поддерживается в течение определенного периода времени (называемого здесь «временем инкубации») в целях достижения результатов желаемой реакции.

Время для поддержания/инкубации образца в инкубационной среде, т.е. время инкубации, может варьировать в зависимости от технического результата, которого нужно достичь после инкубации. В разных воплощениях инкубация может продолжаться от 3 секунд до примерно 3 минут, например, примерно 10 секунд, 20 секунд, 30 секунд, 1 минуту, 2 минуты, 5 минут, 10 минут или более, например, один-два часа, в течение ночи. В одном воплощении время инкубации на всех этапах способа может иметь одну и ту же длительность, т.е. каждая инкубация может длиться от 5 до 10 минут и т.д. В другом образце в водном растворе, содержащем связывающий агент (называемом далее «раствором связывающего агента»), инкубация может длиться 1-3 минуты, инкубация в водной среде (i) и/или водном растворе (ii) может длиться 10 минут.

Инкубация может быть выполнена при различных температурах в зависимости от типа мишени, связывающего агента и т.д. Процедуры в соответствии с изобретением существенно не зависят от температуры и могут быть выполнены при температуре от примерно +4°C до примерно +40°C, тем не менее, при необходимости, температура может быть использована для увеличения или сокращения продолжительности инкубации, например, более низкую температуру можно использовать, чтобы продлить время инкубации, и, наоборот, более высокую температуру можно использовать, чтобы сократить время инкубации.

Неограничивающие воплощения композиций инкубационных сред обсуждаются ниже.

Среда связывающего агента

На стадии (а) способов изобретения образец инкубируют с одним или более чем одним связывающим агентом, как описано выше. Таким образом, в одном воплощении изобретение относится к водному раствору, содержащему связывающий агент, такому как, например, связывающий агент, содержащий фермент с оксидоредуктазной активностью. Эта среда называется в данном документе «средой связывающего агента».

Одним из желаемых технических эффектов, которые достигаются за счет инкубации образца в такой среде, является формирование сайтов-мишеней в соответствии с изобретением. Таким образом, среда связывающего агента является водной средой, в которой выбранный связывающий агент растворяется и способен связываться с одиночной единицей мишени. В принципе, среда связывающего агента является буферным водным раствором одного или более чем одного связывающего агента, который имеет pH в диапазоне от 4 до 9. В некоторых воплощениях среда связывающего агента может содержать органические или неорганические соли. Неорганические соли могут быть выбраны, например, среди хлорида натрия, хлорида магния, хлорида калия, хлорида кальция, фосфата натрия или сульфата аммония. Органические соли могут быть выбраны, например, среди ацетата натрия, ацетата аммония или имидазоловых солей, например гидрохлорида имидазола и т.д.

Количество соли в среде связывающего агента может варьировать от примерно 10^-3 М до насыщения, например, от примерно 20 мМ до примерно 200 мМ, или от примерно 50 мМ до примерно 500 мМ. В одном предпочтительном воплощении среда может содержать соль в количестве примерно от 10 до 500 мМ. В другом предпочтительном воплощении среда может быть свободной от соли.

Как уже упоминалось, как правило, pH-значение среды связывающего агента может варьировать от 4 до 9, например, от pH 3,5 до pH 9,5, например, от pH 5 до pH 7, от pH 5,5 до pH 6,5 или от pH 6.5 до pH 7.5, а также от pH 7 до pH 8, или от pH 7,5 до pH 8,5 или от pH 8 до pH 9. Может быть использован любой буфер с подходящей буферной емкостью, например, фосфатный буфер (PBS) и имидазольный буфер. Другие подходящие буферы можно найти в Good, NE., et al (1966) Hydrogen ion buffers for biological research. Biochem. 5(2), 467-477. pH-значение среды может быть важным для связывания связывающего агента с мишенью; оно может быть оптимизировано в зависимости от природы связывающего агента и мишени.

В некоторых воплощениях среда связывающего агент может содержать органические модификаторы (под термином «органические модификаторы» понимается любой не водный растворитель), например, N-метилпирролидон (NMP), диметилсульфоксид (DMSO), моно- и диэтиленгликоль, сульфолан, N,N-диметилформамид (DMF), полиэтиленгликоль (PEG), пропиленгликоль и т.д. Количество органического модификатора может варьировать от примерно 1% до 20% (v/v или w/v), или, в некоторых воплощениях, будет составлять больше 20%.

В некоторых воплощениях среда связывающего агента может содержать детергент, например, эфир полиэтиленгликоля и p-изооктифенила (NP-40)) или поверхностно-активное вещество (например, выбранное среди поверхностно-активных веществ на основе сорбитанмонолаурата полиоксиэтилена (Tween) или поверхностно-активных веществ на основе блок-сополимеров (плуроник и т.д.)) и т.д. Количество детергента может варьировать от примерно 0,001% до примерно 5% (v/v или w/v).

В некоторых воплощениях среда связывающего агента может содержать агент, стабилизирующий связывающий агент, например, бычий сывороточный альбумин или декстран. Количество стабилизирующего агента может варьировать от 0,01% до 20% (w/v).

В некоторых воплощениях среда связывающего агент может содержать хелатирующий ион (например, этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) или хелатор типа этилендиамингидроксилфенилуксусной кислоты (EDHPA) и т.д.). Количество хелатора может варьировать от примерно 10^-9 М до примерно 10^-6 М.

В некоторых воплощениях среда связывающего агента может включать один или более чем один блокирующий агент для насыщения сайтов неспецифического связывания, т.е. сайтов твердой подложки, которые не содержат мишень. Некоторыми неограничивающими примерами блокирующих агентов, подходящими для различных воплощений, могут быть раствор Денхарта, бычий сывороточный альбумин, обезжиренное молоко и т.д.

Как уже говорилось выше, изобретение предполагает большое разнообразие видов мишеней, связывающих агентов и форматов анализа, соответственно, состав среды связывающего агента может варьировать и должен быть скорректирован для каждого конкретного воплощения с использованием знаний в данной области. Некоторые неограничивающие примеры среды связывающего агента описаны в примерах.

В одном воплощении, когда образец содержит мишень, которая находится в диапазоне низких концентраций, может быть предпочтительным использовать относительно высокие количества связывающих агентов в среде связывающего агента, состав которой (например, pH, концентрация солей и т.д.) и условия инкубации (например, длительность инкубации, температура) оптимизированы для облегчения взаимодействия между связывающим агентом и мишенью. Такая оптимизация обеспечивает связывание максимального числа одиночных единиц мишени со связывающими агентами и формирование максимального числа дискретных одиночных сайтов-мишеней. В этом воплощении в связи с низкой экспрессией мишени в образце не ожидается значительного числа перекрываний между одиночными сайтами-мишенями.

В одном воплощении, когда образец содержит мишень, которая находится в диапазоне низких концентраций, может быть предпочтительным использовать относительно высокие количества связывающих агентов в среде связывающего агента, состав которой (например, pH, концентрация солей и т.д.) и условия инкубации (например, длительность инкубации, температура) оптимизированы для облегчения взаимодействия между связывающим агентом и мишенью. Такая оптимизация обеспечивает связывание максимального количества отдельных единиц со связывающими агентами и формирование максимального числа дискретных сайтов-мишеней. В этом воплощении, в связи с низкой экспрессией мишени в образце, не ожидается значительного числа перекрываний между отдельными сайтами-мишенями.

В одном предпочтительном воплощении количество связывающих агентов в среде связывания регулируется так, чтобы связывались все или подавляющее большинство имеющихся отдельных единиц мишени, присутствующих в образце и образующих дискретные одиночные сайты-мишени с ними.

В другом воплощении, когда мишень избыточно экспрессируется в образце, количество одного или более чем одного связывающего агента в среде, например, первого, второго и/или третьего связывающего агента, должно быть отрегулировано так, чтобы связывающие агенты были способны образовывать дискретные одиночные участки-мишени только с фракционной субпопуляцией одиночных единиц в образце. Кроме того, в таких воплощениях состав среды связывающего агента, например pH, содержание солей и т.д., или условия инкубации, такие как температура и т.д., могут быть отрегулированы так, чтобы они влияли на способность мишени связываться с одним или более чем одним связывающим агентом, участвующим в образовании одиночных сайтов-мишеней, и связывающие агенты, таким образом, будут формировать целевые сайты только с фракционной субпопуляцией одиночных единиц мишени, присутствующих в образце.

Таким образом, в одном воплощении образец, содержащий мишень, которая экспрессирована избыточно и в широком динамическом диапазоне концентраций, инкубирут в среде связывающего агента в условиях, в которых связывающие агенты способны образовывать дискретные одиночные сайты-мишени с фракционной субпопуляцией одиночных единиц-мишеней. Термин «фракционная субпопуляция» в данном контексте определяется как доля от общей популяции, равная 99% или менее, например, равная 90% или менее от общего количества одиночных единиц мишени в образце, например, менее 85%, например, 75-80% от общего количества единиц мишени в образце, например, менее 75%, например, от 1% до 50% от общего количества одиночных единиц мишени в образце, например, от 1% до 25% от общего количества единиц мишени в образце и т.д. В одном воплощении условия инкубации могут быть отрегулированы таким образом, чтобы связывающие агенты образовывали дискретные одиночные сайты-мишени с дробной субпопуляцией одиночных единиц-мишеней, которая составляет менее 1% от общего количества одиночных единиц мишени, присутствующих в образце, например, примерно от 0,1% до 1%.

Водные растворы (i)

После инкубации в среде связывающего агента образцы инкубируют в водном растворе (i), содержащем первый субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью, второй субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью и пероксидное соединение.

Возможно, перед инкубацией в водном растворе (i) образец можно инкубировать в водном растворе (ii), который представляет собой водный раствор (i) без второго субстрата.

Соответственно, в одном воплощении изобретение предусматривает инкубационную среду, которая представляет собой водный раствор (i), а в другом воплощении изобретение предусматривает инкубационную среду, которая представляет собой водный раствор (ii).

И водный раствор (i), и водный раствор (ii) могут быть водными буферными растворами с подходящей буферной емкостью, например, фосфатным буфером (PBS) и имидазольным буфером. Другие подходящие буферы можно найти в Good, NE., et al (1966) Hydrogen ion buffers for biological research. Biochem. 5(2), 467-477. рН-значение растворов может быть отрегулировано для достижения технического эффекта инкубации, а именно формирования дискретных депозитов второго субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью на дискретных одиночных сайтах-мишенях изобретения, например, pH может быть доведен до значения в диапазоне от 4 до 9. Тем не менее, pH водных растворов (i) и (ii) имеет второстепенное значение для технического эффекта инкубации.

И водный раствор (i), и водный раствор (ii) также могут содержать органическую или неорганическую соль.

Неорганическая соль может быть выбрана среди, например, хлорида натрия, хлорида магния, хлорида калия, хлорида кальция, фосфата натрия или сульфата аммония и т.д.

Органическая соль может быть выбрана среди, например, ацетата натрия, ацетата аммония или имидазольных солей, например гидрохлорида имидазола, и т.д.

Количество соли в водном растворе (i) и водном растворе (ii) может варьировать от примерно 10^-3 М до насыщения, например, от примерно 20 мМ до примерно 200 мМ, или от примерно 50 мМ до примерно 500 мМ. В одном предпочтительном воплощении среда может содержать соль в количестве примерно от 10 до 500 мМ. В другом предпочтительном воплощении среда может быть свободной от соли.

И водный раствор (i), и водный раствор (ii) могут в разных воплощениях также содержать:

(i) органический модификатор, и/или

(ii) усилитель фермента, и/или

(iii) хелат железа, и/или

(iv) детергент, и/или

(v) противомикробный агент.

Органический модификатор может находиться в среде в количестве от примерно 1% до примерно 20% (v/v или w/v), тем не менее, в некоторых воплощениях могут быть необходимы более высокие концентрации органического модификатора. Органическим модификатором может быть, например, полиэтиленгликоль (PEG). Другие примеры включают, но не ограничиваясь ими, органические модификаторы, выбранные из группы, состоящей по существу из C1-C4, т.е. низших спиртов, N-метилпирролидона (NMP), диметилсульфоксида (DMSO), моно- и диэтиленгликоля, сульфолана, N,N-диметилформамида (DMF), полиэтиленгликоля (PEG), например, PEG2000, или пропиленгликоля. Количество полиэтиленгликоля в средах в этих случаях может варьировать от примерно 0,1% (v/v) до примерно 20% (v/v), например, от примерно 1% (v/v) до примерно 15%, например 5-10% (v/v).

Под термином «усилитель фермента» понимается любое соединение, которое повышает каталитическую активность пероксидазы. Такой усилитель фермента может быть выбран из группы, состоящей по существу из производных фенилбороновой кислоты и ионов двухвалентных металлов, таких как никель или кальций. Количество усилителя фермента может варьировать от примерно 10^-7 до примерно 10^-3 М.

Хелатор железа может быть хелатором типа этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) или этилендиамингидроксилфенилуксусной кислоты (EDHPA). Концентрация хелатора железа может варьировать от примерно 10^-9 до примерно 10"⁶ М.

Детергент может быть выбран среди эфира полиэтиленгликоля и р-изооктифенила (NP-40), поверхностно-активное вещество может быть выбрано среди поверхностно-активных веществ на основе сорбитанмонолаурата полиоксиэтилена (Tween) или поверхностно-активных веществ на основе блок-сополимеров (плуроник и т.д.). Концентрация детергента может варьировать от примерно 0,001% до примерно 5%.

Основными компонентами водного раствора (i) являются первый субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью, второй субстрат указанного фермента и пероксидное соединение.

Воплощения первого субстрата и второго субстрата подробно обсуждались выше.

В одном предпочтительном воплощении первый субстрат может быть 3,3′-диаминобензидином (DAB) или его производным. В другом предпочтительном воплощении первый субстрат может быть феруловой кислотой или ее производным.

Количество первого субстрата в водном растворе (i) может варьировать в зависимости от соединения, выбранного в качестве первого субстрата (см. выше). Например, в воплощениях, когда в качестве первого субстрата выбран DAB, количество DAB в водном растворе (i) и в водном растворе (ii) составляет менее 1,4 мМ, предпочтительно менее 1,2 мМ, предпочтительно менее 1 мМ, например, от примерно 0,005 мМ до примерно 0,5 мМ, например, примерно 0,3 мМ или примерно 0,2 мМ, например, примерно 0,15 мМ, и т.д. В воплощениях, когда в качестве первого субстрата используется феруловая кислота, количество указанного соединения составляет менее 2,5 мМ, предпочтительно менее 2 мМ, например, примерно 1,5. мМ. Термин «примерно» в данном контексте означает +/-0,05-0,5 мМ.

Водный раствор (i) может содержать различные количества второго субстрата фермента, например, от примерно 10^-10 М до примерно 10^-4 М. Например, в воплощениях, когда второй субстрата (как любой из описанных выше) содержит радиоактивную метку, применимое количество может находиться в диапазоне от примерно 10^-10 М до примерно 10^-6 М. В других воплощениях, например, когда второй субстрат содержит флуоресцентную метку или метку, которая является членом пары специфического связывания, количество может находиться в диапазоне от примерно 10"⁹ М до примерно 10^-4 М.

В одном воплощении водный раствор (i) может содержать популяцию одинаковых конъюгированных молекул второго субстрата. В другом воплощении водный раствор (i) может содержать популяцию различных конъюгированных молекул второго субстрата.

Предпочтительным пероксидным соединением изобретения является перекись водорода, тем не менее, другие пероксидные соединения также могут быть использованы в различных воплощениях, например, в некоторых воплощениях могут быть предпочтительны органические пероксиды, такие как, например, третбутилпероксид, дитретбутилпероксид, надуксусная кислота и т.д., или, в некоторых воплощениях, это может быть продукт присоединения перекиси водорода, такой как пероксид мочевины.

Количество пероксидного соединения в водном растворе (i) и водном растворе (ii) не может быть выше 5 мМ, предпочтительно составляет менее 5 мМ, предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 мМ до 5 мМ, например, от 0,1 мМ до 1 мМ, от 1 мМ до 2 мМ, от 2 мМ до 3 мМ или от 3 мМ до 4 мМ, предпочтительно в диапазоне от примерно 1 мМ до примерно 2 мМ, например, примерно 1,5 мМ. Термин «примерно» в данном контексте означает +/-0,05-0,5 мМ.

Водный раствор (i), содержащий первый субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью, второй субстрат указанного фермента и пероксидное соединение, называется в данном документе «средой депонирования».

Водный раствор (ii) может содержать те же соединения в тех же количествах, что и водный раствор (i), с тем исключением, что водный раствор (ii) не включает второй субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью.

В некоторых воплощениях образец, содержащий одиночные сайты-мишени, можно сначала инкубировать в водном растворе (ii), а затем в водной среде (i)

В другом воплощении образец, содержащий одиночные сайты-мишени, инкубируют в водном растворе (i) без предварительной инкубации в водном растворе (ii).

В соответствии с изобретением среда депонирования является стабильным раствором, т.е. осаждение растворенных соединений не происходит в течение относительно длительного периода времени, например, минимум в течение 5 часов. Чтобы продлить срок хранения среды, может быть полезным хранение среды при температуре ниже +20°C, например, при температуре от +4 до +10°C, и/или добавление к среде антимикробного соединения. Антимикробным соединением может быть любое антимикробное соединение, обычно используемое для таких целей, например, азид натрия, ProClin™ или Bronidox®.

Среда депонирования

В одном воплощении изобретение предусматривает способ, включающий один или более чем один этап после этапа (b), который включает определение дискретных одиночных депозитов второго субстрата на одиночных сайтах-мишенях, например, образец, содержащий дискретные депозиты второго субстрата, можно инкубировать в инкубационной среде, содержащей связывающий агент, способный специфически связываться с определяемой меткой депонированных молекул второго субстрата.

Инкубационная среда, содержащая связывающий агент, способный специфически связываться с определяемой меткой депонированных молекул второго субстрата, как правило, имеет похожий или такой же состав, как и среда связывающего агента, описанная выше.

Связывающий агент, связывающийся с определяемой меткой депонированного второго субстрата, в одном воплощении может содержать фермент, например, пероксидазу хрена (HRP) или щелочную фосфатазу (AP). Такой связывающий агент может быть определен с помощью стандартной системы визуализации с использованием хромогенных субстратов ферментов, например, раствора ферментного субстрата или раствора с развивающимся окрашиванием. Такого рода средой может быть любая подходящая среда, известная в данной области, которая будет выбрана в зависимости от доступных средств визуализации и в соответствии с общими знаниями в данной области о природе определяемой метке депозитов. Неограничивающие примеры такого определения описаны в примерах.

Кроме того, в случае, когда связывающий агент содержит HRP, способ визуализации изобретения может включать еще один этап инкубации образца, содержащего дискретные депозиты второго субстрата, связанные с указанным связывающим агентом, в среде депонирования, описанной выше. Такой дополнительный этап может быть выгодным в некоторых воплощениях, когда сигнал, связанный с депонированным вторым субстратом, является слабым, или размер первичного депозита является относительно небольшим. Дополнительный этап депонирования также позволяет усилить сигнал, связанный с депозитом, а также он может увеличить размер определяемых депозитов на одиночных сайтах-мишенях. Кроме того, этап также позволяет изменять характер определяемого сигнала, например, изменять спектральные характеристики сигнала, например, изначальная метка, определяемая как красный сигнал, может быть заменена на метку, определяемую как зеленый сигнал, используя для этого дополнительного депонирования конъюгированные молекулы, содержащие указанную зеленую метку, вместо конъюгированных молекул, содержащих красную метку, используемых для первоначального депонирования (на этапе (б) способа). Такая гибкость способа изобретения, тем не менее, не добавляет дополнительной сложности реагентам, используемым на дополнительных этапах определения, так что все воплощения инкубационных сред этапов (а) и (б) (см. выше) способа могут успешно использоваться без существенных изменений в этих дополнительных этапах.

В одном воплощении изобретение предусматривает промывочные среды, т.е. среды для удаления остатков соединений (инкубационной среды) из образца после того, как произошел технический эффект инкубации. Способ изобретения может включать один или более чем один этап промывания, обычно после этапа инкубации образца в средах, описанных выше, например, между этапами (а) и (б) и т.д. Как правило, промывочная среда является той же самой средой, которая использовалась для инкубации образца на предыдущем этапе промывания без существенных соединений инкубационной среды, т.е. без связывающего агента, субстратов фермента и т.д.

В одном воплощении изобретения предусматривает среды для гашения эндогенной оксидоредуктазной активности. Средой этого типа может быть любая среда такого рода, которая обычно используется с этой целью в данной области, например, раствор перекиси водорода. Эта среда может быть использована перед этапом (а) способа. Она также может быть использована после этапа (б) и перед дополнительными этапами определения депонированного второго субстрата. Применение этой среды на данном этапе процедуры может использоваться для гашения остаточной оксидоредуктазной активности в образце.

Дискретные депозиты второго субстрата

Было обнаружено, что применение особых условий среды депонирования, содержащей конкретные конъюгированные молекулы второго субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью и относительно небольшое количество первого субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью, пероксидное соединение, такое как DAB и перекись водорода, делает возможным формирование дискретных депозитов указанных конъюгированных молекул на одиночных сайтах-мишенях изобретения с различными физическими свойствами, а именно, депозитов округлой формы размером боле 0,4 мкм в диаметре, которые можно непосредственно наблюдать с помощью обычной микроскопической оптики или визуализировать как отдельные точки. Применение подобной системы усиления (которая использует HRP-DAB-опосредованное депонирование определяемых конъюгированных молекул, см. подробнее WO 2009036760, WO 2010094283 и WO 2010094284) позволило улучшить традиционное HRP-DAB IHC-окрашивание, в том плане, что однородно окрашенный образец с окрашиванием мишени стал более четким, улучшая тем самым внутриклеточное разрешение клеточных структур, например, мембраны, цитоплазмы и ядра. Данная система визуализации обеспечивает вместо этого точечный характер окрашивания мишени, при котором одна одиночная точка соответствует одной отдельной единице мишени, такой как отдельная молекула-мишень, обеспечивая тем самым внутриклеточное разрешение отдельных одиночных единиц-мишеней, таких как одиночные молекулы-мишени.

Депозиты определяемых конъюгированных молекул изобретения, полученные способом изобретения, являются трехмерными и имеют по существу сферическую форму, т.е. в двумерном поле, например в микроскопическом поле, наблюдаются по существу как округлые точки. Таким образом, термин «округлая точка» (взаимозаменяемый в данном документе с терминами «точка» и «отдельная точка») означает в данном контексте сферический депозит определяемых конъюгированных молекул изобретения, наблюдаемый в двумерном поле как отдельная по существу округлая точка. Термин «отдельная» в данном контексте означает, что точка изобретения различима для глаза и воспринимается как дискретная. Термин «по существу округлая» означает, что отдельная точка изобретения имеет эксцентриситет, который является округлым или менее 0,65. Точка в соответствии с изобретением имеет диаметр примерно или больше 0,4 мкм. Термин «примерно» в данном контексте означает +/-0,05-0,5 мкм. Для сравнения, «точка» депозита DAB-пятна в традиционном DAB-HRP-способе или одиночный депозит пятна на сайтах-мишенях, полученный способами из WO 2009036760, WO 2010094283 и WO2010094284, или биотинил- и флуоресцилтирамидные депозиты, полученный способом CARD, имеют такой размер, который находится в пределах разрешения обычной микроскопической оптики (например, 4^× или 10^× увеличение в светлом поле или флуоресцентной оптике), т.е. менее 0,1 мкм. Соответственно, невозможно непосредственно наблюдать отдельные одиночные единицы мишени, визуализированные последними способами, в микроскопическом поле с малым увеличением (например,. 4^× или 10^×). Способ, описанный в данном документе, позволяет определять и визуализировать одиночные депозиты определяемых конъюгированных молекул изобретения на отдельных сайтах-мишенях, и при этом наблюдать иммобилизированные одиночные единицы мишеней в образцах с помощью оптики с малым увеличением.

Термин «один одиночный депозит второго субстрата» (фермента с оксидоредуктазной активностью) или «один одиночный депозит определяемых конъюгированных молекул» (изобретения) относится к одиночному накоплению множества конъюгированных молекул второго субстрата. В соответствии с изобретением один отдельный депозит второго субстрата изобретения может содержать от 1000 до 1000000 или более конъюгированных молекул.

Как уже говорилось выше, второй субстрат, депонированный на одиночном сайте-мишени, может включать визуально идентифицируемые молекулы, например, молекулы, которые содержат визуально определяемую метку, например, флуоресцентную метку. Соответственно, в одном воплощении точка депозита такого второго субстрата может быть определена путем микроскопии с помощью обычного флуоресцентного микроскопа прямо после того, как депозит был сформирован. Депозиты репортерных молекул, содержащих метки, которые непосредственно не наблюдаются с помощью стандартной микроскопической оптики, например, член пары специфического связывания, будут визуализированы в соответствии с изобретением с использованием по меньшей мере одного дополнительного этапа определения, например, дополнительного этапа (в), описанного выше.

Количество точек, их размер и внешний вид можно регулировать. Например, в разных воплощениях могут быть получены точки определенного размера и с определенными чертами (например, определенного цвета).

В одном воплощении размер депозита и размер точки может быть изменен с помощью связывающих агентов, участвующих в формировании сайтов-мишеней изобретения, содержащих разное количество ферментных группировок (термины «ферментные группировки» или «фермент» в данном контексте означают фермент с оксидоредуктазной активностью), например, количество HRP на молекулу связывающего агента. В другом воплощении размер точки можно регулировать посредством продолжительности процесса депонирования. В другом воплощении размер точки можно регулировать через состав сред депонирования, например, через количество первого и/или второго субстрата или пероксидного соединения в среде депонирования.

Таким образом, в одном воплощении количество ферментных единиц на молекулу связывающего агента, используемое для формирования сайта-мишени, может повлиять на размер точки. Установлено, что размер точки может быть напрямую связан с количеством ферментных группировок на комплекс, содержащий один или более чем один связывающий агент и одну одиночную единицу мишени. Большие точки наблюдаются, когда связывающие агенты, используемые для образования сайтов-мишеней, содержат большее количество ферментных группировок на молекулу (при прочих одинаковых условиях депонирования (т.е. такое же время инкубации, такой же состав сред депонирования)) по сравнению с точками, полученными с применением того же связывающего агента, но содержащего меньше ферментных группировок на молекулу.

Для получения в условиях изобретения видимой точки, соответствующей одному одиночному депозиту, достаточно, что сайт-мишень содержал одиночную, т.е. одну, ферментную группировку, например, связывающий агент, вовлеченный в формирование сайта-мишени, содержит одиночную HRP-группировку; тем не менее, в воплощениях, когда две или более двух ферментных группировок присутствует на одном и том же сайте-мишени, точка, связанная с этим сайтом-мишенью, больше, чем точка в первом случае. Соответственно, в одном воплощении связывающий агент, связанный с одним одиночным сайтом-мишенью, может содержать одну одиночную группировку HRP, в другом воплощении, связывающий агент может содержать две или более двух группировок HRP, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном воплощении количество ферментных группировок на связывающий агент составляет по меньшей мере 2, предпочтительно от 3 до 10, например, от 4 до 8 группировок.

Было обнаружено, что применение связывающих агентов, которые участвуют в формировании сайтов-мишеней изобретения, в которых количество ферментных группировок составляет по меньшей мере 2 на молекулу связывающего агента, можно получить точки примерно одинакового размера при прочих одинаковых условиях, т.е. в тех же условиях, что и процедура визуализации. Таким образом, в одном воплощении изобретение предусматривает способ, в котором образец, содержащий иммобилизированную мишень, инкубируют с одним или более чем одним связывающим агентом, где по меньшей мере один из связывающих агентов содержит по меньшей мере два фермента с оксидоредуктазной активностью. Таким образом, отдельные единицы мишени в этом воплощении визуализируются как отдельные в значительной степени идентичные точки, т.е. как точки одного и того же размера. В одном воплощении пул молекул связывающего агента, содержащего фермент с пероксидазной активностью, может быть гетерогенным в том смысле, что указанные молекулы содержат разное количество ферментных группировок на молекулу, такое как, например, от 2 до 10 молекул, от 11 до 20 молекул и т.д. В другом воплощении изобретение относится к способу, при котором каждая молекула пула молекул связывающего агента, содержащих фермент с пероксидазной активностью, содержит практически одинаковое количество ферментных группировок на одну молекулу связывающего агента, такое как 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12 и т.д. ферментных группировок на молекулу связывающего агента.

В другом воплощении размер точки регулируется количеством первого субстрата в среде депонирования, например, количеством DAB. Большие точки, т.е. точки, диаметр которых равен или больше 0,4 мкм, или равен или больше 1 мкм, или равен или больше 2 или 3 мкм, например, 4 или 5 мкм, где количество депонированного репортера (на точку) не менее 1000 молекул, могут быть образованы, когда количество DAB в среде депонирования (прочие условия процедуры визуализации те же, т.е. тот же связывающий агент, тот же репортер, такое же количество репортера, такая же концентрация пероксида, такое же время инкубации и т.д.) находится в диапазоне от примерно 0,01 мМ до примерно 1 мМ, например, между 0,05 мМ и 0,75 мМ, например от примерно 0,075 мМ до примерно 0,5 мМ, например, примерно 0,1 мМ, например, 0,15 мМ, или примерно 0,3 мМ, например, 0,28 мМ и т.д. Точки меньшего размера, т.е. менее 0,4 мкм, можно наблюдать, когда используются и высокие, и низкие количества DAB в среде депонирования.

Состав и структура конъюгированных молекул изобретения влияют на способность указанных молекул быть депонированными в качестве второго субстрата изобретения (см. выше) и, следовательно, они влияют на размер депозитов и видимый размер точки. Кроме того, метка конъюгата может влиять на внешний вид точки. Например, в воплощении, когда конъюгированная молекула содержит флуоресцентную метку, характер флуорофорной группы метки будет влиять на внешний вид точки, например, в одинаковых условиях конъюгаты, содержащие лиссамин (красную флуорофорную группу), дают более интенсивные точки, чем подобные конъюгаты, содержащие флуоресцеин (зеленую флуорофорную группу). Кроме того, большее количество второго субстрата в среде депонирования, при прочих одинаковых условиях, может привести к образованию более крупных депозитов.

Размер точки также можно регулировать через время, используемое для депонирования второго субстрата. Большее время инкубации в средах депонирования позволяет депонировать большее количество конъюгированных молекул на одиночных сайтах-мишенях, увеличивая тем самым размер одиночного депозита и, следовательно, размер одиночной точки. Увеличение времени инкубации от 30 секунд до 10 минут, при прочих равных условиях, т.е. с тем же связывающим агентом, теми же средами и т.д., может позволить ферменту произвести депозиты, которые можно наблюдать как одиночные точки диаметром примерно 5 мкм. Тем не менее, дальнейшее увеличение продолжительности инкубации не увеличивает размер одиночного депозита. Тем не менее, более длительное время инкубации в среде депонирования не уменьшает размер одиночных депозитов, и, при необходимости, может быть использовано более длительное время инкубации, например, до 20 до 30 минут или дольше. Таким образом, в разных воплощениях продолжительность этапа депонирования способа может варьировать от примерно 30 секунд до примерно 20 минут, например, 1, 2, 3, 4, 5, 10 или 15 минут, например, в одном воплощении время инкубации может составлять примерно 30 секунд, в другом воплощении время может составлять примерно 2 минуты. В одном воплощении предпочтительно, чтобы конъюгированные молекулы депонировались в течение 5-10 минут.

Количество пероксидного соединения в средах депонирования также может быть использовано как фактор регуляции размера депозита репортера и, соответственно, размера точки. Для получения одиночных точек размером до 5 мкм в диаметре количество пероксидного соединения, такого как, например, перекись водорода, в среде депонирования должно составлять менее 2 мМ, предпочтительно количество не превышает 1,5 мМ. Большее количество пероксидного соединения приводит к образованию точек меньшего размера.

Все рассмотренные выше факторы называются в данном контексте «основными факторами», так как они влияют на формирование первоначального, т.е. основного депозита второго субстрата. Как уже упоминалось, такие первичные депозиты можно наблюдать сразу после того, как произошло депонирование, например, в случае, когда конъюгированные молекулы второго субстрата содержат флуоресцентную метку. В других воплощениях первичные депозиты не наблюдаются непосредственно, однако их можно визуализировать в одном или более чем одном этапе определения (называемом в данном контексте «процедурой вторичной визуализации») после этапа депонирования, например, в случае, когда конъюгаты содержат метку, которая является членом пары специфического связывания, например, гаптеном. Некоторые факторы процедуры вторичной визуализации также могут влиять на визуальный размер и внешний вид депозита в виде точка, добавляя, таким образом, гибкость системе визуализации данного изобретения. Эти факторы называются соответственно «вторичными факторами».

Депозиты репортерных молекул, содержащих метку, которая является членом пары специфического связывания, могут быть визуализированы путем проведения следующих этапов определения (в′) и (в″), которые прямо или косвенно следуют за этапом депонирования:

(в′) инкубация образца, содержащего дискретные депозиты второго субстрата на отдельных сайтах-мишенях, с одним или более чем одним связывающим агентом, способным прямо или косвенно связываться с определяемой меткой депонированного второго субстрата, где по меньшей мере один из связывающих агентов содержит одну или более чем одну определяемую метку, выбранную среди радиоактивных, флуоресцентных или люминесцентных веществ, членов пар специфического связывания или ферментов, с образованием комплекса, содержащего депонированный репортер и указанный по меньшей мере один связывающий агент,

(в″) определение в образце связывающего агента, содержащего определяемую метку, и, таким образом, визуализация одного или более чем одного репортерного депозита на одном или более чем одном отдельном сайте-мишени, и, таким образом, визуализация одной или более чем одной отдельной единицы мишени в образце.

Термин «косвенно» в данном контексте означает, что это между этапами (б) и (в′) может быть один или более чем один дополнительный этап, например, этап промывания.

С помощью распознающего репортер связывающего агента, который содержит множество ферментных группировок (в качестве определяемых меток), которые могут использовать хромогенные или флуоресцентные субстраты, например, HRP или щелочную фосфатазу (AP), можно «покрасить» депозиты и получить явно различные определяемые точки. В этом случае исходный размер одиночного депозита может быть «увеличен» или «уменьшен» путем получения отдельных визуально определяемых точек определенного размера. В одном воплощении с помощью связывающего агента, меченного HRP или другим оксидоредуктазным ферментом, и оптимальных условий депонирования (обсуждаемых выше) этап депонирования можно повторить один или более чем один раз, увеличивая тем самым размер определяемого депозита на отдельном сайте-мишени после каждого повтора. В другом воплощении с помощью связывающего агента, помеченного HRP или другим оксидоредуктазным ферментом, и субоптимальных условий депонирования (обсуждаемых выше), этап депонирования можно повторить, получая депозиты меньшего размера и, соответственно, определяемые точки меньшего размера. В одном воплощении этап депонирования можно повторить с использованием конъюгированных молекул в качестве второго субстрата, которые отличаются от конъюгированных молекул, используемых для первичного депонирования, например, содержащих другую метку, например, метку лиссамин вместо метки флуоресцеина. В другом воплощении время депонирования и среда депонирования могут быть оптимизированы для получения вторичных депозитов меньшего или большего размера на первичных одиночных сайтах-мишенях.

Таким образом, способ визуализации данного изобретения является гибкой и мощной системой усиления. Двойная система регулирования обеспечивает дополнительную гибкость, которая может быть особенно полезной в некоторых воплощениях, например, в воплощении, когда желательно визуализировать большие первичные депозиты в виде точек меньшего размера. Точки меньшего размера могут обеспечить более точное позиционирование единиц мишени в образце, а также могут обеспечить определение большего динамического диапазона мишени.

Двойная регуляция, описанная выше, также может быть желательной в воплощениях, когда нужно определить две или более двух различных мишеней, или в воплощениях, когда мишень находится в образце в широком динамическом диапазоне концентраций, или в воплощениях, когда первичный депозит дает слабо определяемый сигнал, и т.д. Визуализация и количественная оценка мишени, присутствующей в образце в широком динамическом диапазоне концентраций, т.е. когда есть градиент концентрации мишени в образце, может оказаться непростой задачей. В нижнем конце диапазона количество точек, связанных с сайтами-мишенями, может быть недостаточным для обеспечения статистически достоверной информации о наличии мишени во всем образце, в то время как в высшем конце динамического диапазона визуализация отдельных единиц мишени мишени может быть неполноценной из-за присутствия ряда перекрывающихся точек, которые нельзя визуально отличить друг от друга. Применение первичных и/или вторичных факторов, описанных выше, для уменьшения видимого размера точек, соответствующих большим первичным депозитам, позволяет преодолеть эти проблемы и визуализировать и количественно оценить мишени, присутствующие в образцах в широком динамическом диапазоне.

Способы определения первичных депозитов второго субстрата могут отличаться в зависимости от типа образца, особенностей депонированных молекул и т.д. Может быть использован любой подходящий способ, известный в данной области, например, в других воплощениях в гистологических образцах депозиты могут быть определены с помощью любого стандартного IHC-окрашивания, например, HRP-DAB-окрашивания, ELISA-визуализации или иммуноблот-окрашивания и т.д.

Воплощения способа определения отдельных единиц мишеней в образцах

Ниже приведены неограничивающие примеры воплощений способа изобретения.

Способ определения одиночных молекул-мишеней биологического маркера в гистологическом образце

В одном воплощении способ изобретения может быть использован для визуализации одиночных молекул-мишеней, таких как одиночные молекулы биологического маркера, в гистологическом образце, где указанный способ включает следующие этапы:

а) инкубация образца, предположительно содержащего одну или более чем одну одиночную молекулу биологического маркера с одним или более чем одним связывающим агентом, где по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с одной отдельной молекулой указанного биологического маркера, и где по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент с пероксидазной активностью, образуя один или более чем один сайт-мишень, каждый из которых содержит комплекс одной одиночной молекулы биологического маркера и одного или более чем одного связывающего агента, причем по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент с пероксидазной активностью;

б) инкубация образца, предположительно содержащего один или более чем один сайт-мишень (а) в водном растворе, содержащем

(i) 3,3′-диаминобензидин (DAB),

(ii) пероксидное соединение,

где количество DAB составляет от примерно 0,1 мМ до примерно 1 мМ, а количество пероксидного соединения составляет от примерно 0,5 мМ до примерно 2 мМ,

и

(iii) одну или более чем одну популяцию конъюгированных молекул, где указанные конъюгированные молекулы выбраны из группы соединений, определенных по формуле:

(Y)n-L-(Z)m, где

Y представляет собой субстрат фермента с пероксидазной активностью;

Z представляет собой определяемую метку;

L представляет собой линкер, а

n представляет собой целое число от 2 до 150, и n представляет собой целое число от 1 до 150,

с образованием одного или более чем одного дискретного депозита указанных репортерных молекул на одиночном сайте-мишени (а); и визуализацией указанных одиночных сайтов-мишеней в образце в виде отдельных точек, и, возможно,

в) визуализация дискретных депозитов на одиночных сайтах-мишенях в виде отдельных точек;

тем самым, визуализация одной или более чем одной молекулы биологического маркера в образце.

Воплощения связывающих агентов, конъюгированных молекул, инкубационных сред (например, водного раствора этапа (б)), средств визуализации и т.д., описаны выше.

Понятно, что вместо HRP может быть использован другой фермент семейства оксидоредуктаз, описанного выше, и другие соединения, отличные от DAB, могут выступать в качестве первого субстрата. Кроме того, другие соединения, которые подходят в качестве второго субстрата изобретения, могут быть использованы вместо соединений формулы (Y)n-L-(Z)m, определенных выше.

В одном воплощении способ, указанный выше, может включать любые другие этапы, о которых говорилось выше. В одном воплощении способ может включать один или более чем один этап после любого из этапов а, б или в. В другом воплощении этот способ может включать один или более чем один этап, предшествующий любому из этапов а, б или в. Способ может включать по меньшей мере один автоматизированный этап или может дополнительно включать по меньшей мере один автоматизированный этап.

В некоторых воплощениях, например, когда биологический маркер чрезмерно экспрессирован в образце или экспрессирован в широком динамическом диапазоне концентраций, может быть предпочтительной инкубация образца с одним или более чем одним связывающим агентом, участвующим в формировании одиночных сайтов-мишеней, в условиях, когда связывающие агенты способны образовывать сайты-мишени с дробной субпопуляцией одиночных молекул-мишеней. Воплощения таких условий обсуждались выше.

В другом воплощении, например, когда биологический маркер представляет собой мишень с низкой экспрессией, может быть предпочтительным, чтобы практически все одиночные молекулы биологического маркера участвовали в формировании сайтов-мишеней. В этих воплощениях предпочтительно инкубировать образец с одним или более чем одним связывающим агентом в оптимальных условиях, т.е. в условиях, когда связывающий агент способен образовывать сайты-мишени с использованием всех имеющихся единиц мишени.

В одном воплощении мишень представляет собой рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) или соответствующую ему нуклеиновую кислоту, в частности HER2-рецептор, или нуклеиновую кислоту, кодирующую его.

Любой белок или другая биологическая молекула, структура или молекулярный комплекс, известный в данной области как биологический маркер заболевания, включен в объем изобретения. В частности, изобретение относится к биологическим маркерам рака.

Способ определения одиночных единиц по меньшей мере двух различных иммобилизированных мишеней в одном образце

В другом воплощении способ изобретения может быть использован для определения и визуализации одиночных единиц двух или более двух различных мишеней, например, одиночных молекул двух или более двух различных биологических маркеров, в одном и том же образце.

Способ визуализации и определения одиночных единиц по меньшей мере двух различных иммобилизированных мишеней в образце, например, гистологическом образце, в соответствии с изобретением включает:

а) инкубацию образца с одним или более чем одним связывающим агентом, способным связывать первую мишень, где (1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей первой мишени,

с образованием, таким образом, одного или более чем одного дискретного первого одиночного сайта-мишени с отдельными одиночными единицами первой мишени, где каждый одиночный дискретный первый сайт-мишень содержит комплекс одной отдельной одиночной единицы первой мишени и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;

б) инкубацию образца (а) с первым субстратом фермента, связанным с первыми одиночными сайтами-мишенями, первой популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) способа (1) выше (т.е. этапа (б) п.1), с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых одиночных сайтах-мишенях (а);

в) инкубацию образца (б) с раствором перекиси водорода в количестве, достаточном для гашения остаточной активности фермента, связанной с первыми одиночными сайтами связывания (а);

г) инкубацию образца (в) одним или более чем одним связывающим агентом, способным связываться со второй мишенью, где

(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной единицей второй мишени,

с образованием, таким образом, одного или более чем одного дискретного второго одиночного сайта-мишени с отдельными одиночными единицами второй мишени, где каждый одиночный дискретный второй сайт-мишень содержит комплекс одной отдельной единицы второй мишени и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;

д) инкубацию образца (г) с первым субстратом, связанным со вторыми одиночными сайтами связывания, второй популяцией молекул второго субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) способа (1), описанным выше (т.е. этапа (б) п.1), с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях (г);

е) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях как первых визуально различимых точек, таким образом, определение одной или более чем одной одиночной единицы первой мишени;

ж) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях как вторых визуально различимых точек, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной одиночной единицы второй мишени.

Мишени способа, описанного выше, в одном воплощении являются различными биологическими маркерами, например, различными биологическими молекулами. В одном воплощении мишени являются различными нуклеиновокислотными последовательностями и различными белковыми молекулами. В одном воплощении первая мишень может быть нуклеиновой последовательностью, а вторая мишень может быть белковой молекулой, например, HER2-рецептором и Her2-связанной нуклеиновой последовательностью.

В одном воплощении по меньшей мере одна мишень может быть биологическим маркером, и по меньшей мере одна другая может быть референсным маркерем, например, одна мишень представляет собой HER2-рецептор (биологический маркер), а другая мишень представляет собой цитокератин (референсный маркер). Выбор биологического маркера и референсного маркера зависит от образца и может быть сделан в соответствии со знаниям, накопленными в данной области, в частности, в воплощениях, когда вовлечены биологические и референсные маркеры заболевания или иного физиологического состояния.

Способ, приведенный выше, может включать любые другие этапы, обсуждаемые выше. В одном воплощении способ может включать один или более чем один этап после любого из этапов а, б или в. В другом воплощении этот способ может включать один или более чем один этап, предшествующий любому из этапов а, б или в. Способ может включать по меньшей мере один автоматизированный этап или может дополнительно включать по меньшей мере один автоматизированный этап.

В одном воплощении образец представляет собой гистологический образец.

В одном воплощении фермент с оксидоредуктазной активностью представляет собой HRP. В одном воплощении первый субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью представляет собой DAB. Воплощения, связанные с HRP и DAB, могут быть любыми из тех, что рассмотрены выше. В других воплощениях предпочтительный фермент может быть любым другим оксидоредуктазным ферментом, например, выбранным из тех, о которых говорилось выше. В других воплощениях предпочтительный первый субстрат может быть любым другим соединением, пригодным в качестве первого субстрата, например, может быть выбран из рассмотренных выше.

Молекулы второго субстрата любых популяций для определения одиночных единиц различных мишеней могут быть, например, конъюгированными соединениями, описанными выше. Некоторые типичные соединения также описаны в разделе Примеры. Конъюгированные молекулы первой популяции и конъюгированные молекулы второй популяции отличаются различными определяемыми метками, которые они содержат. В другом воплощении молекулы первой популяции и репортерные молекулы второй популяции могут еще больше отличаться по составу соединений, которые способны выступать в качестве субстратов для фермента с оксидоредуктазной активностью. В других воплощениях молекулы также могут отличаться другими чертами, например, структурой конъюгированных молекул, длиной линкера между субстратом фермента с оксидоредуктазной активностью и меткой, числом определяемых меток и т.д.

Этап депонирования молекул второго субстрата, т.е. этап (б) и/или (д), может осуществляться в соответствии с любым из воплощений, описанных выше, например, образец предварительно может быть инкубирован в растворе с первым субстратом фермента с оксидоредуктазной активностью и пероксидным соединением, и затем инкубирован в растворе, содержащем комбинацию первого субстрата, второго субстрата и пероксидного соединения.

В одном воплощении по меньшей мере одна из по меньшей мере двух мишеней присутствует в образце в широком динамическом диапазоне концентраций.

Неограничивающими примерами визуализации по меньшей мере двух мишеней в одном образце могут быть визуализация биологического маркера и референсного маркера.

Способ определения одиночных единиц иммобилизированной мишени, присутствующей в образце в широком динамическом диапазоне концентраций

Определение и визуализация одиночных единиц мишени в образце в широком диапазоне концентраций могут быть неполноценными на самом низком конце диапазона, чтобы обеспечить статистически достоверную информацию, из-за образования очень малого количества фактических репортерных депозитов по сравнению с уровнем шума и ложными депозитами во всем образце, в то время как на самом высоком конце диапазона визуализация одиночных единиц может быть ограничена наличием перекрытия точек, которые не могут быть визуально разделены. Соответственно, может быть выгодным применение по меньшей мере двух отдельных этапов депонирования двух репортеров, где молекулы первого репортера депонируются на первых сайтах-мишенях, которые находятся в области образца с отсутствием единиц мишени, а молекулы второго репортера депонируются на вторых сайтах-мишенях, расположенных в области с низким присутствием мишени.

Таким образом, способ определения и визуализации одиночных единиц мишени в образце, в котором мишень присутствует в широком диапазоне концентраций, в соответствии с изобретением включает:

а) инкубацию образца с одним или более чем одним связывающим агентом, где

(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей указанной мишени,

с образованием, таким образом, одного или более чем одного дискретного первого сайта-мишени с первой фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый отдельный дискретный первый сайт-мишень содержит комплекс одной отдельной одиночной единицы указанной первой фракционной субпопуляции отдельных одиночных единиц и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент с оксидоредуктазной активностью;

б) инкубацию образца (а) с первым субстратом фермента, связанным с первыми сайтами-мишенями (а), первой популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п.1, с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях (а),

в) инкубацию образца (б) с раствором перекиси водорода в количестве, достаточном для гашения остаточной активности, связанной с первыми одиночными сайтами-мишенями (а);

г) инкубацию образца (в) с одним или более чем одним связывающим агентом, где

(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;

(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной единицей указанной мишени,

с образованием, таким образом, одного или более чем одного дискретного второго сайта-мишени со второй фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный второй сайт-мишень содержит комплекс одной отдельной единицы указанной второй фракционной субпопуляции отдельных одиночных единиц и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;

д) инкубацию образца (г) с первым субстратом фермента, связанным со вторыми одиночными сайтами мишени, второй популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) способа (1), описанным выше (т.е. этапа (б) п.1), с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях (г);

е) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях как первых визуально различимых точек и, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной одиночной единицы первой популяции мишени;

ж) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях как вторых визуально различимых точек и, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной одиночной единицы второй популяции мишени.

В одном воплощении связывающие агенты в (а) и (г) могут быть одинаковыми связывающими агентами. В одном воплощении может быть предпочтительным, чтобы количество связывающего агента, используемого на этапе (а) для формирования одиночных сайтов-мишеней с первой фракционной субпопуляцией мишени, было меньше, чем количество связывающего агента, используемого для формирования одиночных сайтов-мишеней со второй дробной субпопуляцией мишени на этапе (г).

В другом воплощении связывающие агенты в (а) и (г) могут быть различными связывающими агентами, например, двумя различными агентами, связывающими антитела, двумя различными агентами, связывающими нуклеиновые кислоты, антителом в качестве связывающего агента (а) и нуклеиновой кислотой в качестве связывающего агента (б), двумя мишеньспецифическими антителами, которые имеют различную аффинность к мишени, и т.д.

В одном воплощении репортерные молекулы первой популяции и репортерные молекулы второй популяции отличаются различными определяемыми метками, которые они содержат. В другом воплощении молекулы первой популяции и репортерные молекулы второй популяции различаются по составу соединений, которые способны выступать в качестве субстратов для фермента с оксидоредуктазной активностью. В других воплощениях молекулы могут отличаться другими особенностями, например, структурой конъюгированной молекулы, длиной линкера между субстратом фермента с оксидоредуктазной активностью и меткой, количеством определяемых меток и т.д.

Количественная оценка иммобилизированной мишени в образце

В одном аспекте изобретение предусматривает способ количественной оценки иммобилизированной мишени в образце. Способы визуализации и определения одиночных единиц мишеней изобретения (описаны выше) могут быть использованы для количественной оценки относительного количества таких мишеней в образцах, в частности, в гистологических образцах.

Способ количественной оценки иммобилизированной мишени в образце, например, количественной оценки экспрессии биологического маркера в образце, в одном воплощении может включать:

а) обработку образца в соответствии с одним из способов изобретения, например

(i) по п.1 (как описано выше в разделе Способ визуализации отдельных единиц иммобилизированной мишени в образцах или в разделе Способ определения одиночных молекул-мишеней биологического маркера в гистологическом образце;

(ii) по п.36 (как описано выше в разделе Способ определения одиночных единиц иммобилизированной мишени, присутствующей в образце в широком динамическом диапазоне концентраций); или

(iii) по п.40 (как описано выше в разделе Способ определения одиночных единиц по меньшей мере двух различных иммобилизированных мишеней в одном образце);

б) количественную оценку отдельных точек в образце; а также

в) оценку количества мишени в образце.

Количественную оценку отдельных точек изобретения в обработанном образце можно провести вручную или автоматически, учитывая различные особенности точек, например, в связи с тем, что точки различимы для глаза или понимания как дискретные, они могут считаться так, что количество подсчитанных точек будет указывать на уровни экспрессии маркера в образце, цветовые характеристики точек могут быть использованы для разделения и подсчета точек, связанных с двумя различными мишенями в одном образце и т.д. Используя программное обеспечение для обработки изображений образцов, содержащих отдельные единицы мишени, визуализируемые с помощью способов изобретения, можно провести оценку экспрессии мишени, основанную на различных особенностях, например, на цветовых характеристиках точки, на интенсивности сигнала, связанного с одной точки или со всем образцом, на относительном распределении точек в образце и т.д.

В одном воплощении подсчет может быть выполнен вручную, т.е. микроскопистом, наблюдающим микроскопическое поле образца, или наблюдателем, который анализирует цифровое изображение образца. Подсчет может быть проведен автоматически с помощью любого доступного программного обеспечения, разработанного в данной области для обработки клеточных изображений, например, программного обеспечения CellProfiler. Типичная количественная оценка Her2 в образце описана в примерах.

В одном воплощении количество мишени в образце может быть оценено без какого-либо референса, например, как относительное количество мишени или относительное количество одиночных единиц мишени в образце. В другом воплощении количество мишени можно оценить с учетом референсного маркера, например, относительно конкретной биологической молекулы или клеточной структуры образца, относительно объема образца, относительно площади образца и т.д.

Способы, описанные выше, имеют особое преимущество для количественной оценки мишеней в сложных гистологических образцах. Таким образом, в одном предпочтительном воплощении изобретение предусматривает количественную оценку мишени в гистохимическом образце.

С помощью способа изобретения мишень в гистологическом образце можно количественно оценить без применения какого-либо референсного маркера, например, образец конкретной ткани организма можно охарактеризовать с помощью такого референса, как количество точек, соответствующих мишени, предполагая, что образцы данной конкретной ткани обрабатываются с помощью таких же процедур визуализации в соответствии с изобретением. В одном воплощении мишень можно количественно оценивать по отношению к объему образца, к площади образца (т.е. к площади микроскопического поля или площади цифрового изображения образца), каждый раз на окрашивание биологических мишеней и количественную оценку результатов окрашивания.

Диагностические применения

Оценка экспрессии биологических маркеров, т.е. маркеров, экспрессия которых имеет диагностическое, прогностическое или терапевтическое значение, обычно используется для постановки или подтверждения медицинских диагнозов или для прогнозирования результатов лечебных процедур, а также для контроля за развитием заболевания. Если такая оценка основана на анализе таких сложных образцов, как гистологические образцы, то она имеет относительное значение, так как результаты анализа сильно зависят от качества образца, чувствительности способа определения, изменений уровней экспрессии и т.д., и поэтому оценка экспрессии биологического маркера в серии гистологических образцов одной и той же ткани от одного и того же пациента может давать очень разные результаты и приводить к ошибочному предположению и диагнозу, и, как следствие, к неэффективной терапии. Оценка экспрессии диагностических и терапевтических маркеров на основе оценки содержания отдельных молекул указанных маркеров в образце от пациента в соответствии с описанным здесь способом может обеспечить более надежную оценку и безошибочную медицинскую диагностику и, более того, персонализированную направленную на мишень терапию.

Таким образом, в одном воплощении способы изобретения могут быть использованы для диагностики заболевания у пациента, где указанная диагностика включает этап обработки биологического образца, полученного от пациента, в соответствии с любым из способов изобретения.

В другом воплощении способы изобретения могут быть использованы для оценки эффективности терапевтического лечения у пациента, где указанная оценка включает анализ образца от пациента, который был обработан в соответствии с любым из способов изобретения.

В другом воплощении способы изобретения могут быть использованы для получения медицинского прогноза, например, для прогнозирования риска развития заболевания у пациента или прогноза вероятности восстановления или ухудшения заболевания, где способ указанного прогнозирования включает этап обработки и анализа биологического образца, полученного от пациента, в соответствии с любым из способов изобретения.

В другом воплощении способы изобретения могут быть использованы для стратификации пациентов по терапевтическому режиму, где указанная стратификация включает анализ образцов от пациентов, которые были обработаны в соответствии с любым из способов изобретения.

Способ также может быть использован для контроля над заболеванием, например, над прогрессированием заболевания или улучшением, а также может быть использован в процессе отбора новых лекарственных препаратов, например, для оценки терапевтического потенциала нового препарата в анализе in vitro и т.д.

Способы визуализации изобретения могут быть использованы в различных форматах анализа, которые обычно используются для этих применений, например, в формате проточной цитометрии (FC), иммуноферментного анализа (ELISA), гистохимии (как IHC, так и ISH), блоттинга и т.д. Например, в одном воплощении биологический образец может быть суспензией клеток. Целевые биологические молекулы или целевые структуры клеток в суспензии могут быть определены с помощью FC, ELISA, IHC или ISH. Когда для определения используются ELISA, IHC или ISH, клетки в суспензии должны быть прикреплены к твердой подложке, например, планшету (ELISA) или слайду (IHC). В другом воплощении биологический образец может быть образцом ткани организма, например, срезом фиксированного и залитого в парафин образца опухоли. Целевые молекулы или структуры клеток из таких образцов будут, как правило, оопределяться с помощью IHC или ISH.

Анализы формата IHC и ISH обычно требуют ряда этапов обработки, предшествующих визуализации молекул-мишеней, которые могут проводиться на тканевом срезе, закрепленном на подходящей твердой подложке для микроскопического исследования или получения микрофотографии, например, на стеклянном слайде или другой плоской подложке для выделения путем селективного окрашивания определенных морфологических индикаторов болезненных состояний или определения биологических маркеров. Так, например, при IHC образец сначала берут у человека, затем фиксируют, и только затем подвергают его воздействию антител, которые специфически связываются с биологическим маркером, представляющим интерес. Этапы обработки образцов могут также включать другие этапы, предшествующие процедуре визуализации в соответствии с изобретением, например, могут включать этапы: разрезания и обрезания ткани, фиксации, дегидратации, парафиновой пропитки, разрезания на тонкие срезы, прикрепления к стеклянным слайдам, термообработки, депарафинизации, регидратации, извлечения антигена, этапы блокировки и т.д. Этапы промывания могут быть выполнены с использованием соответствующих буферов или растворителей, например, фосфатно-солевого буфера (PBS), трис-буферного раствора (TBS), дистиллированной воды. Промывочный буфер дополнительно может содержать детергент, например, Tween-20. Все эти процедуры являются хорошо известными в лабораториях стандартными процедурами.

Обе категории гистологических образцов: (1) препараты, содержащие свежие ткани и/или клетки, которые обычно не фиксируют с помощью фиксаторов на основе альдегида, и (2) препараты фиксированных и залитых образцов ткани, часто сохраняемые материалы, могут быть обработаны с помощью способов изобретения.

Известно множество способов фиксации и заливки образцов тканей, например, фиксация спиртом и фиксация формалином и последующая заливка парафином (FFPE).

Фиксаторы необходимы для сохранения клеток и тканей в воспроизводимой и жизнеподобной манере. Чтобы добиться этого, тканевые блоки, срезы или мазки погружают в фиксирующую жидкость или, в случае мазка, сушат. Фиксированные стабилизированные клетки и ткани, тем самым, защищают от жесткости методик обработки и окрашивания.

Может быть использован любой подходящий фиксирующий агент, например, этанол, уксусная кислота, пикриновая кислота, 2-пропанол, тетрагидрохлорид дигидрат, ацетоин (смесь мономера и димера), акролеин, кротональдегид (цис+транс), формальдегид, глутаральдегид, глиоксаль, бихромата калия, перманганат калия, тетраоксид осмия, параформальдегид, хлорид ртути, толуилен-2,4-диизоцианат, трихлоруксусная кислота, вольфрамовая кислота. Другие примеры включают формалин (водный раствор формальдегида) и нейтральный буферный формалин (NBF), глутаральдегид, акролеин, карбодиимид, имидаты, бензохинон, осмиевую кислоту и тетраоксид осмия.

Свежие образцы биоптатов, цитологические препараты (в том числе препараты-отпечатки и мазки крови), замороженные срезы и ткани для иммуногистохимического анализа, как правило, фиксируют в органических растворителях, в том числе в этиловом спирте, уксусной кислоте, метаноле и/или ацетоне.

Для облегчения специфического распознавания в фиксированной ткани часто бывает необходимо извлечь или выявить мишени, т.е. биологические маркеры, представляющие интерес, через предварительную обработку образцов для увеличения реакционной способности большинства мишеней. Эта процедура называется «извлечением антигена», «извлечением мишени» или «извлечением эпитопа», «выявлением мишени» или «выявлением антигена». Обширный обзор извлечения антигена (выявления антигена) можно найти в Shi et al. 1997, J Histochem Cytochem, 45(3):327.

Извлечение антигена включает различные способы, с помощью которых максимизируют доступность мишени для взаимодействия со специфическим определяемым реагентом. Наиболее распространенными методиками являются ферментативное расщепление протеолитическим ферментом (например, протеиназой, проназой, пепсином, папаином, трипсином или нейраминидазой) в соответствующем буфере или индуцированное теплом извлечение эпитопа (HIER) с использованием микроволнового излучения, нагревания на водяной бане, на пару, в обычной печи, автоклаве или скороварке в соответствующем pH-стабилизированном буфере, как правило, содержащем EDTA, EGTA, Трис-HCI, цитрат, мочевину, глицин-HCI или борную кислоту. Можно добавить детергенты к HIER-буферу для увеличения извлечения эпитопа или к средам дл разведения и/или промывочным буферам для снижения неспецифического связывания.

Буфер извлечения антигена чаще всего является водным, но может также содержать другие растворители, в том числе растворители с температурой кипения выше, чем у воды. Это позволяет обрабатывать ткань при температуре выше 100°C при нормальном давлении.

Кроме того, отношение сигнал-шум может быть увеличено, если это необходимо, с помощью различных физических способов, включая применение вакуума и ультразвука, замораживание и оттаивание срезов до или во время инкубации реагентов.

Эндогенные биотин-связывающие сайты или эндогенная активность фермента (например, фосфатазная, каталазная или пероксидазная) могут быть удалены в качестве предварительного этапа перед определением в процедуре определения, например, эндогенная биотиновая и пероксидазная активности могут быть удалены при обработке пероксидами. Эндогенная фосфатазная активность может быть удалена путем обработки левамизолом. Эндогенные фосфатазы и эстеразы можно разрушить путем нагревания. Также могут быть использованы другие способы такой предварительной обработки, известные в данной области.

Блокирование неспецифических сайтов связывания не является необходимым при использовании способов данного изобретения, тем не менее, если необходимо, блокировку можно провести с использованием стандартного в данной области подхода, например, с помощью инертных белков, таких как лошадиный сывороточный альбумин (HSA), казеин, бычий сывороточный альбумин (BSA) и овальбумин, эмбриональной телячьей сыворотки или других сывороток, или могут быть использованы детергенты, такие как Tween-20, Тритон Х-100, сапонины, Brij или Pluronics. Также может быть проведено блокирование неспецифических сайтов связывания в ткани или клетках с помощью немеченых и неспецифических к мишени версий специфических реагентов.

Также образцы могут быть получены и молекулы-мишени определены с применением методики свободного флоатинга. В этом способе срез ткани подвергают контактированию с различными реагентами и промывочными буферами в суспензии или свободном плавании в соответствующих контейнерах, например, микропробирках.

Срезы тканей можно переносить из пробирки в пробирку с различными реагентами и буферами во время процедуры окрашивания, используя, например, устройство «типа рыболовного крючка», шпатель или стеклянное кольцо. Различные реагенты и буферы можно заменять путем аккуратной декантиции или вакуумного отсасывания. Кроме того, контейнеры со срезами тканей можно опустошать в специальной сетке для окрашивания, такой как Corning «Netwells» (Corning), и промывать срез ткани перед переносом обратно в пробирку для следующего этапа окрашивания.

Все этапы, включая, например, фиксацию, извлечение антигена, промывание, инкубацию с блокирующими реагентами, иммуноспецифическими реагентами и опосредованное оксидоредуктазой депонирование, проводятся в то время, пока срезы ткани свободно плавали и удерживались в сетке. После депонирования репортера срез ткани прикрепляют к слайдам, определяют репортер и покрывают слайд покровным стеклом, а затем анализируют, например, путем световой или люминесцентной микроскопии.

В некоторых воплощениях срез ткани может быть расположен на стеклах после критической инкубации с иммуноспецифическими реагентами после процедуры (а) способа. Затем проводится остальная часть процесса определения на срезах ткани, расположенных на стекле.

Любой из анализов, использующих способы изобретения, может включать один или более чем один автоматизированный этап. В одном воплощении анализы могут включать ручное определение, в другом воплощении анализы могут быть полностью автоматизированы, в другом воплощении анализы могут быть настроены для полуавтоматического определения.

Примеры

Ниже приведен неограничивающий рабочий пример раскрытого изобретения.

Сокращения

МВНА	4-метилбензгидриламин
NMP	N-метилпирролидон
HATU	2-(1п-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурониум гексафторфосфат; метенамин
DIPEA	диизопропиловый этиламин
DCM	дихлорметан
TFA	трифторуксусная кислота
TFMSA	трифторметансульфокислота
Flu	флуоресцеин
Dex	декстран
HPLC	высокоэффективная жидкостная хроматография
equi.	эквивалент
L30	1,10,16,25-тетрааза-4,7,13,19,22,28-гексаокса-11-, 15,26,30-тетраоксотриаконтан
L60, L90, L120, L150	различные полимеры L30, содержащие 2, 3, 4 или 5 повторов L30
CIZ	2-хлорZ=2-хлорбензилоксикарбонил
FITC	флуоресцеинизотиоцианат
HRP	пероксидаза хрена
GaM	козлиное противомышиное антитело
DNP	2,4-динитрофторбензен (динитрофенил)
ACim	4-аминокоричная кислота
LPR	Liquid Permanent Red (Dako K0540)
Sin	синапиновая кислота (4-гидрокси-3,5-диметоксикоричная кислота)
Caf	кофейная кислота (3,4-дигидроксикоричная кислота)
PNA-X	пептидный нуклеиновокислотный олигомер (N-(2-аминоэтил)глицин), содержащий различные заместители, связанные с центральным азотом
A	аденин-9-уксусная кислота
C	цитозин-1-уксусная кислота
D	2,6-диаминопурин-9-уксусная кислота
G	гуанин-9-уксусная кислота
Gs	6-тиогуанин-9-уксусная кислота
P	2-пиримидинон-1-уксусная кислота
T	тимин-1-уксусная кислота
Us	2-тиоурацил-1-уксусная кислота
Dpr	2,3-диаминопропионовая кислота
Phe	фенилаланин
Tyr	тирозин
Trp	триптофан
Lys	лизин
Cys	цистеин
betaala	β-аланин-N,N-диуксусная кислота
FFPE	фикирован формалином и залит в парафин
SMD	определение одиночной молекулы

Перекрестный линкер - первый субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью

Репортер - второй субстрат с ферментом с пероксидазной активностью

Молекулы второго субстрата

Таблица 1: Конъюгированные молекулы, промежуточные продукты их синтеза и контрольные конструкции

	ID конъюгата	Структура	Протокол синтеза №
1	D19112/D19057	Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L150-Lys(Flu)	2
2	D19185/D20068/D20171/D20166/D21025/D21030/D21032/D 21045	Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L 150-Lys(Flu)	2
3	D20086	Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L30-Lys(Flu)	2
4	D20118	Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L60-Lys(Flu)	2
5	D20120	Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-Glu-L30-Lys(Flu)	2
6	D19048/D21053	Fer-Lys(Fer)L150-Lys(Lissamine)	2
7	D19059	Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L150-Lys(DNP)	2
8	D18146	ACin-(Lys(ACin)L30)5-(L90-Lys(Flu))3	2
9	D18044	Ac-(Tyr-L30)5-(L90-Lys(Flu))3	1
10	D21008	(D18074)18,5-Dex70-(D18118)27,7	8
11	D18074/D17120/D17137/D18114(промежуточный)	Fer(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH2)	3
12	D21020	Caf-Lys(Caf)-Lys(Caf)-L150-Lys(Flu)	2
13	0328-018/D21047/D21067	Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(Flu)	2
14	D17093 промежуточный	Fer(PNA-Fer)5L30-Lys(NH2)	3
15	D17127/D18118 промежуточный	NH2-Cys(SH)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)	1
16	D17128	(D17093)18,6-Dex70-(D17127)26,2	8
17	D17130	(D17120)18,8-Dex70-(D17127)18,6	8
18	D17132 контроль (без субстрата фермента)	Dex70-(D17127)23	7
19	D17126/D17165 промежуточный	Betaala-L90-Lys(Flu)-L90-l_ys(Flu)-L90-Lys(Flu)	1
20	D17134/D17135/D17136	Fer(Lys(Fer)-L30)5-Lys-(betaala)-(L90-Lys(Flu))3	6
21	D17138	Fer(Lys(Fer)-L90)5-Lys(NH2)	3
22	D17139	Fer-Lys(Fer)L30-(Lys(Fer))2-L30(Lys(Fer))2L30-Lys(NH2)	3
23	D17140	Fer-Lys(Fer)L60-(Lys(Fer))2-L60(Lys(Fer))2L30-Lys(NH2)	3
25	D17148/D17150/D17151	Fer-Lys(Fer)-(L30-Lys(Fer)-Lys(Fer))2-L30-Lys-(betaala)-(L90-Lys(Flu))3	6
24	D17152	Fer-L30-Lys(L30Fer)-(L30Lys(L30Fer))4- L30-Lys(NH2)	5
26	D17156	Fer-L30-Lys(L30Fer)-(L30Lys(L30Fer))4-L30-Lys(betaala)-(L90-Lys(Flu))3	6
27	D17157	Fer-L150-Lys(Flu)	2
28	D17158	Fer-L30-Lys(Flu)	2
29	D17161 контроль (без субстрата фермента)	Flu-L150-Lys(Flu)	1
30	D17162 контроль (без субстрата фермента)	Dex270-(D17127)62,9	7
31	D17104 промежуточный	Fer-(Lys(Fer)-Gly)4-Lys(Fer)-L30-Lys(NH2)	3
32	D17188	Fer-(Lys(Fer)-Gly)4-Lys(Fer)-L30-Lys(betaala)-(L90-Lys(Flu))3	6
33	D17192 промежуточный	7-OH-Cou-(Lys(7-OH-Cou)-L30)5-Lys(NH2)	3
34	D18003	7-OH-Cou-(Lys(7-OH-Cou)-L30)5-Lys(betaala)-(L90-Lys(Flu))3	6
35	D18007 контроль (без субстрата фермента)	Ac-(PNA-D)5-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)	1
36	D18008 контроль (без субстрата фермента)	Ac-(PNA-G)5-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)	1
37	D18009 контроль (без субстрата фермента)	Ac-(PNA-Gs)5-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)	1
38	D18010 контроль (без субстрата фермента)	Ac-(PNA-P)5-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)	1
39	D18011 контроль (без субстрата фермента)	Ac-(PNA-A)5-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)	1
40	D18012 контроль(без субстрата фермента)	Ac-(PNA-C)5-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)- L90-Lys(Flu)	1
41	D18013 контроль	Ac-(PNA-T)5-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)	1
42	D18014 контроль (без субстрата фермента)	Ac-(PNA-Us)5-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)	1
43	D18015/D18126/D 19130	Fer-(Lys(Fer)-L30)5-(L90-Lys(Flu))3	2
44	D18019/D18029 промежуточный	Fer-(Lys(Fer)-L30)5-L270-Lys(NH2)	3
45	D18031	(D18019)6-Dex70-(D17127)22,3	8
46	D18049	Ac-(Tyr)6-L30-(L90Lys(Flu))3	1
47	D18077 подобен D17130	(D18074)17.8-Dex70-(D17127)22.2	8
48	D18079 подобен D17130	(D18074)16.8-Dex70-(D17127)23	8
49	D18080/19028 промежуточный	Fer-(Lys(Fer)-L30)5-(L90-Lys(NH2))3	3
50	D18081	Fer-(Lys(Fer)-L30)5-(L90-Lys(Texas-Red-X))3	4
51	D18084	NH2-Dpr(NH2)-(L30-Tyr)7	1
52	D18085	NH2-Dpr(NH2)-(L90-Lys(Flu))3	1
53	D18086 контроль (без субстрата фермента)	Dex70(D18085)2,6	7
54	D18088 контроль (без субстрата фермента)	Dex70-(D17127)8,6	7
55	D18090 подобен D17130	(D18074)16,8-Dex70-(D17127)23,9	8
56	D18096	Fer-(Lys(Fer)-L30)5-(L90-Lys(7-OH-Cou))3	4
57	D18122	(D18114)17,6-Dex70-(D18118)з2,9	8
58	D18128	NH2-Cys(SH)-(L30-Tyr)5-(L90Lys(Flu))3	1
59	D18130	Dex70-(D18128)12,4	7
60	D18132	NH2-Cys(SH)-(Tyr)5-(L90Lys(Flu))3	1
61	D18133	Dex70-(D18132)21,8	7
62	D18137	Ac-(Tyr)5-(L90Lys(Flu))3	1
63	D18138	Ac-(Tyr)5-(L90Lys(DNP))3	1
64	D18141/D18155/D19032	Fer-(Lys(Fer)-L30)5-(L90-Lys(DNP))3	2
65	D18157	Fer-(L30-Lys(Fer))5-(L90-Lys(Flu))3	2
66	D19037	Fer-Lys(Fer)-L150-Lys(Flu)	2
67	D19040/D19046	Fer-Lys(Fer)-L150-Lys(DNP)	2
68	D21028	Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(Flu)	2
69	D21048	Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(DNP)	2
70	D21150	Sin-Lys(Sin)-Lys(Tyr)-L150-Lys (Flu)	2

Различные конъюгаты и их промежуточные соединения классифицированы в колонке 3 таблицы в соответствии со способами их синтеза, примерно в порядке возрастания сложности:

1. Только твердофазная химия.

2. Твердая фаза, затем один этап растворной фазы.

3. Твердая фаза, затем два этапа растворной фазы.

4. Твердая фаза, затем два этапа растворной фазы

5. Твердая фаза, затем четыре этапа растворной фазы.

6. Растворная фаза связывания промежуточных продуктов амино- и betaala-ангидрида.

7. Декстрановые конъюгаты с одним заместителем.

8. Декстрановые конъюгаты с двумя заместителями.

1. Эта группа включает 8 конъюгатов, изготовленных из меченных трифлуоресцеином ПНК-пентамеров из 4 природных и еще 4 неприродных оснований. (D18007-D18014). Есть 4 тирозиновых конъюгата с 5-6 тирозинами и 3 флуоресцеинами, D18044, D18049, D18137 и D18138 с тремя DNP вместо флуоресцеиновых меток. D18128 и D18132 имеют 5 тирозинов и 3 флуоресцеина каждый и сами по себе являются потенциальными конъюгатами, но также они включают N-концевой остаток цистеина для дальнейшей связывания с декстраном, что переводит их в группу «промежуточных продуктов». Промежуточные продукты также содержат важный цистеиновый (D17127) и В-аланиновый (D17126) трифлуоресцеиновые линкеры, а также диаминопропионовокислотный линкер с 7 тирозинами (D18084) или тремя флуоресцеинами (D18085). Наконец, небольшой дифлуоресцеиновый линкер (D17161), используемый в качестве контроля, также получают путем только твердофазного синтеза. Стратегия синтеза всех этих соединений очень проста: Boc-защищенные мономеры получают коммерческим путем или изготавливают самостоятельно, а конъюгаты и промежуточные продукты получают путем линейного твердофазного синтеза с последующим отщеплением от смолы смесью TFMSA: TFA: м-крезол: тиоанизол 6:2:1:1. Для достижения наилучших результатов используется последовательное двойное связывание всех мономеров. Флуоресцеины вводят на боковые цепи лизина (и N-концевые, D17161) после снятия Fmoc-защиты на твердой фазе. HATU-активированный карбоксифлуоресцеин (смесь изомеров) используют для флуоресцентного мечения (0,2 М в NMP в течение 20 минут×3 раза). DNP-мечение получают с помощью 2,4-динитрофторбензола (0,5 М в NMP с DIPEA в течение 10 минут × 2 раза).

2. Эта группа включает большое число конъюгатов, меченых производными коричной кислоты в растворной фазе после твердофазного синтеза промежуточных продуктов, несущих свободные N-концевые аминогруппы лизина и свободные аминогруппы боковых цепей. Альфа-N-Boc-(эпсилон-N-2-Cl-Z)-лизин используют для введения остатков лизина, дающих свободные эпсилон-N-аминогруппы после отщепления от смолы. Мечение в растворной фазе является основным расширением твердофазной методики, используя которое относительно высокомолекулярные промежуточные продукты можно почти количественно осаждать с помощью диэтилового эфира из раствора TFA или NMP.

3. С точки зрения синтеза, эта группа промежуточных продуктов имеет еще более высокую степень сложности. Твердофазный синтез и мечение в растворной фазе являются такими же, как в 1 и 2, затем следует дополнительный этап снятия Fmoc-защиты в растворной фазе. Объединяя Boc-L30-линкеры с Boc-2CIZ и Вос-Fmoc-лизином, получены промежуточные продукты с комбинацией защищенными (Fmoc) боковыми цепями лизина и свободной N-концевой и другими свободными аминогруппами боковой цепи лизина (из N-концевого Boc и 2-CLZ-лизинового остатков во время отщепления смолы). Этот промежуточный продукт может быть помечен феруловой кислотой в растворе, как в 2. Тем не менее, перед этапом очистки с помощью этилендиамина используется дополнительный 5-минутный этап с 5% этанол амином. Этот дополнительный этап очистки деактивирует аминореактивные формы перед снятием Fmос-защиты с помощью этилендиамина. Без этого дополнительного этапа этилендиамин снимает защиту Fmoc-групп быстрее, чем он деактивирует HATU-активированную феруловую кислоту, и Fmoc-«защищенные» аминогруппы становятся мечеными феруловой кислотой. Эта группа со свободными аминогруппами включает D17120 (шесть феруловых кислот), D17093 (пять феруловых кислот, прикрепленных к ПНК-остову), D17138 (L90-линкеры между феруловыми кислотами), D17139 (шесть феруловых кислот в трех близких парах), D17104 (глициновые спейсеры между феруловыми кислотами), D17192 (с шестью 7-гидроксикумаринами вместо феруловых кислот), D18019 (удлиненный L270-линкер между ближайшими феруловой кислотой и свободной аминогруппой), D18080 (три свободных аминогруппы с L90-спейсером).

4. Из промежуточного продукта D18080 с шестью феруловыми кислотами и тремя свободными аминогруппами два конъюгата были получены путем дальнейшего мечения в растворной фазе. D18081 с тремя Texas-Red-X и D18096 с тремя 7-гидроксикумаринами. Это показывает, как конъюгаты могут быть помечены в растворе с двумя разными заместителями. Преимущество заключается в том, что промежуточный продукт D18080 может быть очищен перед окончательным мечением, это преимущество при использовании лабильных или дорогих меток, таких как Texas Red.

5. Синтез D17152 иллюстрирует рамки химических веществ для твердофазного синтеза, которые могут быть добавлены к линкерам в растворе с последующим повторным осаждением с помощью диэтилового эфира для удаления низкомолекулярных реагентов и растворителей: на твердой фазе NH₂-Lys(NH₂)-(L30-Lys(NH₂))4-L30-Lys(Fmoc) был получен и отщеплен из смолы. Затем Boc-l-ЗО-линкеры связывали с шестью свободными аминогруппами в растворе. Промежуточные продукты осаждали и растворяли в 5% м-крезоле в TFA дважды. Затем проводили мечение феруловой кислотой, как в 2, на теперь уже L30-удлиненной аминогруппе, а затем очищали этаноламином и этилендиамином, как в 3 и, наконец, осаждали в TFA, как в 1.

6. Связывание фрагментов проводили между промежуточными продуктами с амино-заменами и промежуточными продуктами, активированными «betaala-ангидридом». D17126 с тремя флуоресцеинами также нес N-концевую β-аланин-N,N-диуксусную кислоту. Путем активации (NMP: диизопропиловый карбодиимид: пиридин; 88:10:2) в течение 10 минут формировали циклический «betaala-ангидрид», который можно использовать для связывания с аминогруппами. Это давало D17134 (шесть феруловых кислот с L30-промежутком) из D17120, D17148 (шесть феруловых кислот в трех парах с L30-промежутком) из D17139, D17156 (шесть L30-удлиненных феруловых кислот) из D17152 и D18003 (с шестью 7-гидроксикумаринами) из D17192. Преимущество такого связывания фрагментов заключается в том, что промежуточные продукты могут быть очищены путем HPLC перед связыванием при наличии больших и сложных, но довольно чистых конъюгатов. Другим преимуществом является то, что отдельный промежуточный продукт, такой как D17126, может быть использован для получения ряда родственных, но различных конъюгатов.

7. Декстрановые конъюгаты с одним заместителем включают контрольные конъюгаты только с флуоресцеином D17132, D18130 и D18088 (все Dex70-конъюгаты из D17127 через цистеиновую связь), D17162 (dex 270-конъюгат из D17127) и D18086 (из D18085 с менее эффективным связыванием через диаминопропионовую кислоту). Их использовали в качестве контролей, чтобы продемонстрировать, что конъюгаты только с флуоресцеином не работают. Конъюгаты получали таким же образом, путем связывания множества промежуточных конъюгатов с декстраном. К ним относятся D18133 (dex 70 с L30-разделенным тирозин-флуоресцеиновым конъюгатом D18132) и D18130 (dex 70 с тирозин-флуоресцеиновым конъюгатом D18128). Преимущество связывания одного конъюгата и с HRP-субстратами, и с метками заключается в том, что это обеспечивает фиксированное соотношение двух заместителей.

8. Декстрановые конъюгаты с двумя различными заместителями включают D17130, D18077, D18079, D18090, D18122 и D21008, которые представляют собой dex70 с шестиферуловокислотным линкером D18074 и трехфлуоресцеиновым линкером D17127 (или копиями линкеров). Существует хорошая воспроизводимость среди D17130, D18077, D18079 D21008 примерно со 100 феруловыми кислотами и 70 флуоресцеинами, при этом D18122 связывается с дальнейшим избытком флуоресцеинового линкера, образуя конъюгат примерно с 100 феруловыми кислотами и флуоресцеинами каждый. D17128 напоминает D17130, но используемый феруловокислотный линкер (D17093) имеет феруловые кислоты, присоединенные к ПНК-остову, а не к боковым цепям лизина. Конъюгат D18031 также содержит D17127, но с L270-удлиненным феруловокислотным линкером D18019. Этот конъюгат был попыткой сделать феруловую кислоту более доступной для HRP-ферментов.

Примеры процедур синтеза для выбранных соединений

D19185: Boc-(Lys(2-CI-Z))3-L150-Lys (Fmoc) получали на твердой фазе. Группу Fmoc удаляли, а затем выполняли мечение флуоресцеином, как описано выше. Промежуточный продукт NH₂-((Lys(NH₂))3-L150-Lys(Flu) получали путем отщепления от смолы. Его осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в TFA, осаждали, затем растворяли в NMP и подщелачивали с помощью DIPEA. Этот раствор смешивали с равным объемом 0,2 М феруловой кислоты в NMP, активированной HATU и DIPEA. Через 10 минут мечение было полным, и сырьевой продукт далее «очищали» путем добавления этилендиамина до концентрации 10% на 5 минут. После осаждения с помощью диэтилового эфира продукт далее растворяли в TFA и осаждали с помощью диэтилового эфира три раза для удаления низкомолекулярных загрязнителей. Перед «очисткой» с помощью этилендиамина масс-спектроскопия показывала два вида продуктов присоединения (и их комбинации):+(176)n указывает на дополнительные феруловые кислоты (фенольные эфиры на других феруловых кислотах и флуоресцеине) и +98 (продукты присоединения N,N′-тетраметилурония, также на незащищенных фенольных группах). Их полностью удаляли путем обработки этилендиамином, и активные сложные эфиры и феруловокислотные олигомеры также разлагались.

Синтез D19185 показан на фиг.1.

В соответствии с этой схемой получали следующие флуоресцеин-феруловокислотные конъюгаты: D17157, D17158, D19112, D19185, D18015, D20086, D20118, D20120, D19037 и D18157 (подробный синтез некоторых из этих конъюгатов описан ниже). Феруловокислотные конъюгаты с другими метками включают: D19048 (меченый лиссамином), D19059, D18141 и D19040 (мечены DNP). Конъюгаты с синапиновой кислотой вместо феруловой кислоты были получены по той же методике и включали 0328-018 и D21028 с флуоресцеиновыми метками и DNP-меченый D21048. D21020 включал три кофейные кислоты и флуоресцеин, D18146 включал шесть 4-аминокоричных кислоты и три флуоресцеина, и оба были получены в соответствии с той же стратегией.

D17158 МВНА-смолу нагружали Fmoc-Lys(ivDDE) до загрузки 150 мкмоль/г. 200 мг смолы подвергали удалению Fmoc с помощью 20% пиперидина в NMP, подвергали одному связыванию с Boc-L30-OH (1,5 мл 0,26 М в NMP, предварительно активированного с помощью 0,9 экв. HATU, 2 экв. DIPEA в течение 2 минут) в течение 20 минут. Группу ivDDE удаляли с помощью 5% гидразина в NMP, и боковую цепь лизина метили карбоксифлуоресцеином (Flu) (1,5 мл 0,2 М в NMP, предварительно активированного с помощью 0,9 экв. HATU, 2 экв. DIPEA в течение 2 минут) в течение 20 минут 2 раза. Смолу обрабатывали 20% пиперидинои в NMP, NMP, DCM и DCM. Промежуточный продукт H-L30-Lys(Flu)-NH₂ отщепляли от смолы с помощью смеси TFA: TFMSA: м-крезол (7:2:1, 1,5 мл в течение 1 ч), осаждали с помощью диэтилового эфира, ресуспендировали в TFA, осаждали с помощью диэтилового эфира, ресуспендировали в NMP и снова осаждали с помощью диэтилового эфира. Это делали в основном с 100 мкл DIPEA и растворяли непосредственно в 0,5 мл 0,3 М феруловой кислоты, предварительно активированноя с помощью 0,9 экв. HATU и 2 экв. DIPEA. Через 25 минут сырьевой продукт осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в 450 мкл NMP и 50 мкл этилендиамина. Через 5 минут продукт осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в 15% ацетонитриле в воде (8 мл), подкисляли с помощью 100 мкл TFA и подвергали очистке путем RP-HPLC.

D17157 МВНА-смолу загружали Boc-Lys(Fmoc) до загрузки 100 мкмоль/г.100 мг смолы подвергали 5 циклам связывания с Boc-L30-OH (а. Связывание с Boc-L30-ОН, как в 1. б. Покрытие 2% раствором уксусной кислоты в смеси NMP: пиридин 1:1, 2 минуты, в. Удаление Вс с помощью 5% м-крезола в TFA в течение 5 минут 2 раза). С боковой цепи лизина удаляли Fmoc и метили карбоксифлуоресцеином, как в 1. Промежуточный продукт H-L150-Lys(Flu)-NH₂ отщепляли от смолы, метили N-конец феруловой кислотой и очищали как в 1.1.

D16127 Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc) получали на 0,5 г смолы МВНА стандартной твердофазной химией (как в 1.1. и 1.2). Fmoc-группы удаляли с боковых цепей лизина с помощью 20% пиперидина в NMP, и соединение подвергали повторному мечению с помощью карбоксифлуоресцеина (по 30 минут 3 раза). После удаления Вос-групп с помощью TFA N-конец метили на твердой фазе трет-бутиловым эфиром β-аланин-N,N-диуксусноЙ кислоты (betaala). После отщепления от смолы и HPLC-очистки выделяли betaala-L90-Lys(Flu)L90Lys(Flu)-L90-Lys (Flu)-NH₂.

D17127 Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)L90Lys(Fmoc)-смолу получали и метили флуоресцеином с использованием процедуры, описанной в 1.3. После удаления Вос-групп N-конец метили N-Boc-S(4-метоксибензил)-Cys-OH. Соединение отщепляли из колонки и очищали путем HPLC:

D18074/D17128 К МВНА-смоле последовательно присоединяли Вос-Lys(Fmoc) (2 цикла), Boc-L30-OH (5 циклов) и Boc-Lys(2CIZ)-OH. Промежуточный продукт отщепляли от смолы в присутствии 10% тиоанизольного мусорщика для удаления 2CIZ-групп. N-конец и 5 боковых цепей лизина со снятой защитой метили феруловой кислотой, как в 1.1 (2 раза по 30 минут). Fmoc-группы на N С-концевых остатков лизина удаляли с помощью 10% этилендиамина в NMP перед очисткой.

D17134 500 нмоль betaala-L90-Lys(Flu)L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH₂ (D16126) (см. 1.4 выше) растворяли в 88 мкл NMP и 2 мкл пиридина и превращали в циклический ангидрид с помощью реакции с 10 мкл диизопропилового карбодиимида в течение 10 минут. Ангидрид осаждали с помощью диэтилового эфира, а осадок растворяли в 100 мкл NMP, содержащего 250 нмоль Fer(Fer-L30)₅-Lys(NH₂)-NH₂. Через 20 минут добавляли 5 мкл этилендиамина, и через 5 минут продукт осаждали с помощью диэтилового эфира, подкисляли и очищали путем HPLC.

D18044 Ac-(Tyr(2BrZ)-L30)₆-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc) получали на смоле МВНА. На твердой фазе удаляли Fmoc-группы, а боковые цепи лизина метили карбоксифлуоресцеином. После отщепления от смолы продукт очищали путем HPLC.

D17140 Boc-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L30-Lys (Fmoc) получали на смоле МВНА. После отщепления от смолы промежуточный продукт H-Lys(NH₂)-L60-Lys(NH₂)-Lys(NH₂)-L60-Lys(NH₂)-Lys(NH₂)-L30-Lys(Fmoc) выделяли путем осаждения и метили феруловой кислотой, как в 1.1. Конечный продукт выделяли путем HPLC.

D18090 Декстран с молекулярным весом 70 кДа, активированный с помощью дивинилсульфона, 10 нмоль, подвергали взаимодействию с Fer-(Fer-L30)₅-Lys(NH₂)-NH₂ (D18074) (см. 1.4 выше). 500 нмоль в общем объеме 300 мкл 0.16М NaHC0₃ с pH 9,5 в течение 30 минут при 40°C. После получения небольшого осадка добавляли еще 100 мкл воды и реакцию проводили еще в течение 30 минут. Еще 200 мкл 0,15 М NaHCO₃ добавляли вместе с 500 нмоль H-Cys-L90-Lys(Flu)L90Lys(Flu), L90-Lys(Flu)-NH₂ (D17127) (см. 1.5 выше). Через 1 ч при 40°C реакционную смесь гасили добавлением 50 мкл 0,165М цистеина на 30 минут, раствор фильтровали и продукт очищали путем FPLC на Superdex 200 с помощью 20% этанола в водном растворе, содержащем 10 мМ CHES, pH 9,0, и 0,1 М NaCl. Элюированный продукт представлял собой декстрановый конъюгат, содержащий примерно 56 флуоресцеиновых и 113 феруловокислотных остатков.

D19112 На твердой фазе получали МВНА-смолу Boc-Lys (2Clz)-Lys(2CIZ)-L150-Lys(Fmoc) с использованием стандартной твердофазовой Вос-химии. Группу Fmoc удаляли с помощью 20% пиперидина в NMP (2 раза по 5 минут), а свободную аминогруппу метили карбоксифлуоресцеином (0,2 М карбоксифлуоресцеин, активированный 0,9 экв. HATU и 1 экв. DIPEA в NMP 3 раза по 20 минут). Затем смолу подвергали обработке 20% пиперидином в NMP в течение 5 минут 2 раза. Отщепление из смолы проводили в смеси TFA: TFMSA: м-крезол: тиоанизол (6:2:1:1) в течение одного часа, получая промежуточный продукт H₂N-Lys(NH₂)-Lys(NH₂)-L150-Lys(Flu). Этот продукт растворяли в TFA, осаждали с помощью диэтилового эфира, а затем растворяли в NMP и снова осаждали с помощью диэтилового эфира. Осадок растворяли в 0,3 М феруловой кислоте, активированной 0,9 экв. HATU и 2 экв. диизопропилэтиламина. Через 10 минут продукт реакции осаждали с помощью диэтилового эфира и растворяли в 10% этилендиамине в NMP в течение 2 минут. Конечный продукт осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в 30% ацетонитриле в воде и очищали путем HPLC на колонке С18.

D19185. D20068 и D20171 получали таким же образом, как D19112. с введением дополнительной Lys(Fer)-rpynnbi.

D21020: Caf-Lys(Caf)-Lys(Caf)-L150-Lys(Flu) получали, как D19185. После твердофазного синтеза проводили мечение кофейной кислотой в растворе.

0328-018: Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(Flu) получали как D19185. После твердофазного синтеза проводили мечение синапиновой кислотой в растворе.

D20118: получали так же, как D19112. используя L60-линкер.

D20086: получали так же, как D19112, используя L30-линкер.

D20120: получали так же, как D19112, используя L30-линкер, и, кроме того, остаток глутаминовой кислоты. Вос-вЦО-бензил) использовали для твердофазного синтеза для построения в остатке глутаминовой кислоты.

D19048: На 0,5 г смолы МВНА получали Boc-L150-Lys(Fmoc). Группу Fmoc удаляли и аминогруппу боковой цепи лизина метили лиссамином (Molecular Probes, № продукта L20, родамин-B-сульфонилхлорид) с использованием 100 мг в 2 мл NMP с добавлением 80 мкл DIPEA 3 раза по 10 минут. Группу Вос удаляли с помощью TFA, и Boc-Lys (2CIZ) связывали с N-концом. Промежуточный продукт H₂N-Lys(NH₂)-L150-Lys(лиссамин) отщепляли от смолы с помощью смеси TFA: TFMSA: м-крезол: тиоанизол (6:2:1:1) и метили феруловой кислотой, как описано для D19112, образуя Fer-Lys(Fer)-L150-Lys(nnccaMHH). Продукт очищали путем RP-HPLC, разделяли на два отдельных пика, представляющих различные изомеры лиссамина. Первый изомер оказался почти бесцветным в основном водном растворе и был удален. Второй изомер сохранил цвет и флуоресценцию в основном водном растворе и был отобран.

D19059: получали так же, как D19112, но метили аминогруппу боковой цепи С-концевого лизина на твердой фазе динитрофенилом с использованием 100 мг 2,4-динитрофторбензола в 1,5 мл NMP с добавлением 50 мкл DIPEA в течение 20 минут 2 раза.

D18126: Fer-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)=Fer-(Lys(Fer)-L30)5-(L90-Lys(Flu))3. Этот удлиненный конъюгат получали тем же путем, что и D19112: Boc-(Lys(2CIZ)-L30)5-(L90-Lys(Fmoc))3 получали на твердой фазе. Три Fmoc-группы удаляли с помощью пиперидина в NMP, и вводили три карбоксифлуоресцеина, как в D19112. Промежуточный продукт, NH₂-(Lys(NH₂)-L30)5-(L90-Lys(Flu))3 отщепляли от смолы и метили феруловой кислотой на N-конце и 5 свободных боковых цепях лизина, промывали 10% этилендиамином в NMP, осаждали из TFA и очищали путем HPLC.

D18146: ACim-(Lys(ACim)L30)5-(L90-Lys(Flu)) получали на том же лизин-линкерном остове, что и D18126. После отщепления от твердой фазы промежуточный меченный флуоресцеином линкер растворяли в NMP и подщелачивали с помощью DIPEA. 4-аминокоричную кислоту, 0,1 М в NMP, активировали с помощью 0,9 экв. HATU и 3 экв. DIPEA в течение 30 секунд, и добавляли линкер. Реакцию гасили через 2 минуты добавлением этилендиамина до конечной концентрации 10%. После осаждения продукт очищали путем RP-HPLC.

D18074: Fer(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH₂). Этот промежуточный линкер с 6 феруловыми кислотами и свободной аминогруппой боковой цепи лизина был получен путем твердофазовой химии с помощью С-концевой Boc-Lys(Fmoc), после чего проводили альтернативное связывание с Вос-L30-линкером и Boc-Lys(2CIZ). После отщепления от смолы промежуточный продукт NH₂(Lys(NH₂)-L30)5-Lys(Fmoc) метили феруловой кислотой в растворе, как описано для D19112. При окончательной обработке 10% этилендиамином группу Fmoc также удаляли. Этот гомоферуловокислотный олигомер использовали при получении декстранового конъюгата D21008.

D18118: NH₂-Cys-(L90Lys(Flu)). Этот промежуточный трифлуоресцеиновый линкер получали непосредственно на твердой фазе с использованием Вос-Lys(Fmoc) для введения лизинов, которые после удаления Fmoc метили карбоксифлуоресцеином. N-концевой цистеин вводили с помощью Boc(S-p-метоксибензил)цистеина.

D18044: На твердой фазе Fer-(Tyr-L30)5-(L90-Lys(Flu))3 получали как D18126. N-Boc-0-2BrZ-Tnpo3HH использовали для введения тирозинов. Отщепленный затем от смолы продукт очищали путем HPLC.

D21008: Dех70-конъюгат с D18074 и D18118. 10 нмоль винилсульфона, активированного 70 кДа декстраном в 140 мкл воды, смешивали с еще 200 мкл воды и 60 мкл 0,8 М натрия гидрокарбоната, pH 9,5. Эту смесь использовали для растворения 500 нмоль сублимированного D18074. Реакционную смесь инкубировали при 40°C в течение 60 минут, а затем еще 500 нмоль D18118, растворенного в 250 мкл воды, добавляли к реакционной смеси вместе с еще 50 мкл 0,8М гидрокарбоната натрия, pH 9,5. После инкубации еще в течение 60 минут при 40°C реакцию останавливали добавлением 70 мкл 0,165 мМ цистеина в 0,8 М бикарбонате натрия, pH 9,5. Конъюгат очищали на Superdex 200, используя 10 мМ CHES pH 9,0, 100 мМ NaCl в 20% этаноле в воде в качестве элюента. Результатом был первый пик, содержащий конъюгат, и последующие неконъюгированные линкеры. На основании общего восстановления 81% флуоресцеина и феруловой кислоты, и предполагая такую же скорость восстановления (81%) для декстранового конъюгата, было рассчитано соотношение 111 феруловых кислот и 83 флуоресцеинов на декстран, соответствующее (D18074)18,5-Dex70-(D18118)_27,7.

D19059: На 0,1 г смолы МВНА путем стандартной твердофазной химии получали Boc-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L₁₅₀-Lys(Fmoc). Fmoc-защиту боковой цепи лизина снимали с помощью 20% пиперидина в NMP (2 раза по 5 минут) и подвергали мечению с помощью 150 мг 2-4-динитрофторбензола, растворенного в 1,5 мл NMP и 50 мкл DIPEA в течение 20 минут 2 раза. Смолу обрабатывали 20% пиперидином в NMP, NMP и DCM.

Промежуточный продукт отщепляли от смолы с помощью смеси TFA: TFMSA: тиоанизол: м-крезол (6:2:1:1, 1,5 мл, в течение 1 ч), осаждали с помощью диэтилового эфира, ресуспендировали в TFA, осаждали с помощью диэтилового эфира, ресуспендировали в NMP и снова осаждали с помощью диэтилового эфира. Подщелачивали с помощью 100 мкл DIPEA и растворяли непосредственно в 0,5 мл 0,3 М феруловой кислоты, предварительно активированной с помощью 0,9 экв. HATU и 2 экв. DIPEA. Через 10 минут сырьевой продукт осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в 900 мкл NMP и 100 мкл этилендиамина. Через 2 минуты продукт осаждали с помощью диэтилового эфира. Ресуспендировали в TFA, осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в 22% ацетонитриле в воде (8,2 мл) и подвергали очистке путем RP-HPLC.

Выход 8 мкмоль, MS 3582 (М+Na), рассчитанный 3558,784 для Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L₁₅₀-Lys (DNP)

D19112: на 1 г смолы МВНА путем стандартной твердофазной химии получали Boc-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L₁₅₀-Lys(Fmoc). Fmoc-защиту боковой цепи лизина снимали с помощью 20% пиперидина в NMP (2 раза по 5 минут) и подвергали повторному мечению с помощью карбоксифлуоресцеина (3 мл 0,2 М в NMP с предварительной активацией в течение 2 минут с помощью 0,9 экв. HATU и 1 экв. DIPEA) в течение 20 минут 3 раза. Смолу обрабатывали 20% пиперидином в NMP, DCM и TFA. Промежуточный продукт отщепляли от смолы с помощью смеси TFA: TFMSA: тиоанизол: м-крезол (6:2:1:1, 3 мл, в течение 1 ч), осаждали с помощью диэтилового эфира, ресуспендировали в TFA, осаждали с помощью диэтилового эфира, ресуспендировали в NMP и снова осаждали с помощью диэтилового эфира. Подщелачивали с помощью 200 мкл DIPEA и растворяли непосредственно в 2 мл 0,3 М феруловой кислоты, предварительно активированной с помощью 0,9 экв. HATU и 2 экв. DIPEA. Через 10 минут сырьевой продукт осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в 1350 мкл NMP и добавляли 150 мкл этилендиамина. Через 2 минуты продукт осаждали с помощью диэтилового эфира. Ресуспендировали в TFA, осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в 25% ацетонитриле в воде (24 мл) и подвергали очистке путем RP-HPLC.

Выход 19 мкмоль, MS 3749, рассчитанный 3750,998 для Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L₁₅₀-Lys (Flu)

D19185: D19185 получали аналогично D19112 путем твердофазного синтеза с последующим мечением феруловой кислотой в растворе. MS 4054.

D19037: D19037 получали аналогично D19112 путем твердофазного синтеза с последующим мечением феруловой кислотой в растворе. MS 3447.

D18126: на смоле МВНА путем стандартной твердофазной химии получали Boc-(Lys(2CIZ)-L₃₀)₅L₉₀-Lys(Fmoc)-L₉₀Lys(Fmoc)-L₉₀Lys(Fmoc)). Fmoc-защиту боковой цепи лизина снимали с помощью 20% пиперидина в NMP (2 раза по 5 минут) и подвергали повторному мечению с помощью карбоксифлуоресцеина (3 мл 0,2 М в NMP с предварительной активацией в течение 2 минут с помощью 0,9 экв. HATU и 1 экв. DIPEA) в течение 20 минут 3 раза. Смолу обрабатывали 20% пиперидином в NMP, затем промывали с помощью NMP, DCM и TFA. Промежуточный продукт отщепляли от смолы с помощью смеси TFA: TFMSA: тиоанизол: м-крезол (6:2:1:1, 3 мл, в течение 1 ч), осаждали с помощью диэтилового эфира, ресуспендировали в TFA, осаждали с помощью диэтилового эфира, ресуспендировали в NMP и снова осаждали с помощью диэтилового эфира. Подщелачивали с помощью 200 мкл DIPEA и растворяли непосредственно в 2 мл 0,3 М феруловой кислоты, предварительно активированной с помощью 0,9 экв. HATU и 2 экв. DIPEA. Через 10 минут сырьевой продукт осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в 1350 мкл NMP и добавляли 150 мкл этилендиамина. Через 2 минуты продукт осаждали с помощью диэтилового эфира. Ресуспендировали в TFA, осаждали с помощью диэтилового эфира, растворяли в 25% ацетонитриле в воде (24 мл) и подвергали очистке путем RP-HPLC. Выход 2 мкмоль, MS 10666.

Связывающие агенты

Козлиный противомышиный Dex70-HRP (D18033/D18175)

70 кДа декстран активировали с помощью 13,7 нмоль дивинисульфона и вводили в реакцию с 602 нмоль HRP в 600 мкл буфера (100 мМ NaCI, 25 мМ NaHCO₃, pH 9,5) на 3 часа при 30°C. Затем добавляли 41,1 нмоль козлиного противомышиного Р(аb)₂-антитела в 105 мкл воды, и реакция продолжалась еще в течение 16 часов. Реакционную смесь гасили добавлением 70 мкл 0,165М цистеина на 30 минут и продукт очищали на Superdex 200 в 100 мМ NaCl, 10 мМ HEPES pH 7,2. Элюированный продукт представлял собой декстрановый конъюгат, содержащий козлиное противомышиное антитело (GaM) и HRP (8 HRP и 1,3 антитела на конъюгат; соотношение dex/GaM/HRP=1/1,1/7,5).

AHTH-FITC-Dex70-HRP (D18058/D18144)

70 кДа декстран, активированный 10 нмол дивинилсульфона, и 440 нмоль HRP вводили в реакцию в 400 мкл буфера (100 мМ NaCl, 25 мМ NaHCo₃, pH 9,5) на 3 часа при 30°C. Затем добавляли 30 нмоль противомышиного Р(ab′)₂-антитела в 80 мкл воды и проводили реакцию в течение еще 90 минут при 40°C. Реакционную смесь гасили добавлением 50 мкл 0,165М цистеина в течение 30 минут и продукт очищали на Superdex 200 в 100 мМ NaCl, 10 мМ HEPES pH 7,2. Элюированный продукт представлял собой декстрановый конъюгат, содержащий анти-FITC и HRP (9 HRP и 1,5 антитела на конъюгат; соотношение dex/анти-FITC/HRP=1/2/9).

Кроличий анти-FITC F(ab′)₁-HRP конъюгат (D19142/D19154)

Поликлональное кроличье анти-Р1ТС-антитело IgG расщепляли пепсином в течение 4 ч при 37°C и очищали на Superdex 200 для удаления пепсина и Fc-фрагментов.

Далее Р(аb')₂-фрагмент диализировали против 5 мМ EDTA в 0,2 М фосфате натрия, pH 6,0. Раствор концентрировали на спин-колонках Amicon Ultra до получения концентрации белка 25 г/л. К 6,0 мл указанного раствора (150 мг F(ab′)₂) добавляли 487 мкл 50 мг/мл DTT и 423 мкл 56 мМ 2-меркаптоэтанола, оба в воде. Реакционную смесь осторожно перемешивали в течение 40 минут при комнатной температуре и затем сразу же очищали на колонке PD-10 с 5 мМ EDTA в 0,2 М фосфате натрия, pH 6,0. 118 мг F(ab′)₁ восстанавливали в 8,0 мл буфера.

HRP (Servac), 250 мг, растворяли в 2,5 мл 0,15 М NaCI, 0,05 М фосфате калия, pH 8, и диализировали против того же буфера. После диализа раствор фермента концентрировали и концентрацию доводили до 40 мг/мл. К 3,21 мл 128,6 мг раствора HRP добавляли 860 мкл 15 мг/мл SMCC, и реакцию проводили в течение 30 минут в темном месте при комнатной температуре. SMCC активированный HRP-фермент очищали на колонке PD-10 с 0,15 М NaCl, 0,05 М фосфатом калия, pH 8. 126,9 мг восстанавливали в 7,9 мл.

К 8,0 мл F(ab′)₁ добавляли 6,25 мл SMCC-активированного раствора HRP, и общий объем доводили до 43,8 мл с помощью 0,15 М NaCI, 0,05 М фосфата калия, pH 8. Реакцию между фрагментом антитела и ферментом проводили в течение 210 минут в темном месте при комнатной температуре. Затем реакционную смесь гасили добавлением 343 мкл 25 мг/мл цистеамина в воде в течение 15 минут при комнатной температуре, и реакционную смесь оставляли в прохладном месте на ночь до очистки. Образец концентрировали до 8 мл, к 4 частям применяли колонку Superdex 200 и элюировали с помощью 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис, pH 7,6. Продукт элюировали в первом пике, за которым следовал второй пик нереагирующего антитела и фермента. 100 мг конъюгата выделяли в нескольких фракциях. УФ-измерения при 280 нм/403 нм показали соотношение антитела и фермента от 0,8 до 1,2.

Козлиное противомышиное F(ab′)₁-HRP (D19150/D19147)

Козлиное противомышиное F(ab′)₁-HRP получали, как кроличье анти-FITC-F(ab)₁-HRP, путем восстановления F(ab′)₂ с помощью DTT и меркаптоэтанола и связывания с SMCC-активированной HRP. Как и с кроличьим анти-FITC-F(ab′)₁-HRP, для активации HRP использовали 12 эквивалентов SMCC, а используемое молярное соотношение F(ab′)₁ и HRP составляло 1:1.

Козлиное поотивокроличье F(ab′)₁-HRP (АММ 279.168)

Козлиное противокроличье F(ab′)₁-HRP получали, как кроличье анти-FITC-F(ab′)₁-HRP, путем восстановления F(ab′)₂ с помощью DTT и меркаптоэтанола и связывания с SMCC-активированной HRP. Как и с кроличьим aHTH-FITC-F(ab′)₁-HRP, для активации HRP использовали 12 эквивалентов SMCC, а используемое молярное соотношение F(ab′)₁ и HRP составляло 1:1.

Связывающий агент конъюгат козлиный противомышиный F(ab′)₁-HRP Ю19150)

Был получен таким же образом, как D19142 (с GaM вместо FITC).

Связывающий агент кроличий конъюгат aHTH-DNP-F(ab′)₁-HRP (D19053) Этот связывающий агент был получен таким же образом, как D19142, с использованием поликлонального кроличьего aHTH-DNP-антитела.

Связывающий агент конъюгат кроличий анти-FITC-F(ab′)₁-щелочная фосфатаза (D20036)

Кроличий анти-FITC расщепляли пепсином и редуцировали до F(ab′)₁, как описано для D19142. Для конъюгации использовали 44,9 мг фрагментированного антитела в 4,23 мл буфера. Щелочную фосфатазу (Boehringer, молекулярный вес 140000), 56 мг в 2,8 мл буфера (25 мМ борат, 200 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂₎ 0,2 ZnCl₂, pH 8,2), вводили в реакцию с 1,6 мг SMCC (12 эквивалентов по отношению к ферменту), растворенным в 107 мкл DMSO, на 25 минут при комнатной температуре в темноте. Этот раствор активированного фермента подвергали гель-фильтрации с использованием буфера 0,1 М Трис, 0,2 М NaCI, 5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ ZnCl₂, pH 8,2. 55,3 мг фермента выделяли в объеме 7 мл. Фрагментированное антитело и активированный фермент немедленно смешивали и затем добавляли 2,47 мл 0,1 М Трис, 0,2 М NaCl, 5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ ZnCl₂, pH 8,2. Смесь оставляли для реакции в течение 150 минут при комнатной температуре, а затем реакцию гасили добавлением 11,2 мг цистеамина на 15 минут.Продукт очищали на колонке Superdex 200, используя 0,1 М Трис, 5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ ZnCl₂, pH 7,2, элюируя как одиночный широкий пик. Отдельные фракции анализировали на предмет АР-активности и FITC-связывания в анализе IHC с использованием D19150 для депонирования репортера D19185, за которым следовали различные фракции и, наконец, краситель Liquid Permanent red в качестве хромогена. Все основные продукты, содержащие фракции, выступали одинаково хорошо и были объединены.

Связывающий агент козлиное противомышиное антитело, конъюгированное с Dex70, конъюгированным с HRP (D20052)

11 нмоль 70 кДа декстрана вводили в реакцию с 484 нмоль HRP в 316 мкл буфера А (100 мМ NaCl, 25 мМ NaHCO₃, pH 9,5) на 3 часа при 30°C. Затем 66 нмоль козлиного противомышиного F(ab)₂ в 169 мкл воды добавляли к конъюгату декстран-HRP и оставляли для реакции на 1 ч. Реакционную смесь гасили добавлением 70 мкл 0,165 М цистеина на 30 минут и продукт очищали на Sephacryl 300 (GE Medical) в буфере В (100 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, pH 7,2). Элюированный продукт представлял собой декстрановый конъюгат, содержащий козлиное противомышиное антитело (GaM) и HRP. Применение сравнительно короткого времени конъюгации в сочетании с очисткой, оптимизированной для высокой молекулярной массы, позволило разделить конечный конъюгированный продукт на 15 фракций на основе размера конъюгатов. Измерения отдельных фракций продуктов, а также фракций, содержащих неконъюгированное антитело и HRP, показали восстановление конъюгата на 81%, что соответствует 8,91 нмоль декстрана. Вместе конъюгированные фракции (фракции элюата с 7 по 22), содержали 72,3 нмоль HRP и 7,9 нмоль антитела, что, в среднем, соответствовало 8,1 HRP/декстран и 0,88 антитело/декстран. Фракции 7-8 образовывали начальный пик, после которого шел широкий пик (фракции 9-17), который постепенно затихал (фракции 18-22).

Козлиное противомышиное антитело, конъюгированное с Dex70, конъюгированным с HRP (D20168)

Этот конъюгат был получен точно так же, как D20052. Для получения продукта с одинаковым числом HRP, были собраны и объединены только фракции 9 и 10.

Козлиное противомышиное антитело, конъюгированное с Dex150, конъюгированным с HRP (D20060)

Этот конъюгат был получен точно так же, как D20052, хотя был использован декстран с большим молекулярным весом (150 кДа). Во время очистки подавляющее большинство конъюгатов было элюировано в один пик в первые 4 фракции. Расчеты показали, в среднем, 16,5 HRP и 1,8 антитела на молекулу декстрана.

Козлиное противомышиное антитело, конъюгированное с Dex150. конъюгированным с HRP (L348.121)

5,13 нмоль 150 кДа декстрана вводили в реакцию с 484 нмоль HRP в 300 мкл буфера (100 мМ NaCl, 25 мМ NaHCO₃, pH 9,5) на 3 часа при температуре 40°C. Затем 66 нмоль козлиного противомышиного F(ab)₂ в 169 мкл воды добавляли к конъюгату декстран-HRP и проводили реакцию в течение еще 1 часа при 40°C. Реакционную смесь гасили добавлением 70 мкл 0,165 М цистеина на 30 минут и продукт очищали на Sephacryl 300 (GE Medical) в буфере В (100 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, pH 7,2). Элюированный продукт представлял собой декстрановый конъюгат, содержащий козлиный противомышиный F(ab)₂ и HRP. Продукт делили на 3 фракции на основе размеров конъюгатов: первые фракции (8-11), содержащие наибольшие конъюгаты, замыкающие фракции с меньшими конъюгатами и конъюгированные белки. Измерения отдельных фракций продукта, а также фракций, содержащих неконъюгированное антитело и HRP, показали полное восстановление конъюгата на 87%. Предполагая прямую пропорциональность между включенной HRP и декстраном, было показано, что фракции 8-11 содержали 20,6 HRP и 2,32 антитела на молекулу декстрана. Фракции 10-11 содержали 10,9 HRP и 0,96 антитела на молекулу декстрана. Для экспериментов использовали только фракции 8-11.

Этот конъюгат является примером того, как применение более крупных декстрановых конъюгатов позволяет включать больше HRP.

Козлиное противокроличье антитело, конъюгированное с Рех70, конъюгированным с HRP (L348.111, фракции 10-11).

11 нмоль 70 кДа декстрана вводили в реакцию с 484 нмоль HRP в 316 мкл буфера А (100 мМ NaCI, 25 мМ NaHC0₃, pH 9,5) на 3 часа при температуре 40°C. Затем 44 нмоль козлиного противокроличьего антитела в 196 мкл воды добавляли к конъюгату декстран-HRP и проводили реакцию в течение еще 1 часа при 40°C. Реакционную смесь гасили добавлением 70 мкл 0,165 М цистеина на 30 минут и продукт очищали на Sephacryl 300 (GE Medical) в буфере В (100 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, pH 7,2). Элюированный продукт представлял собой декстрановый конъюгат, содержащий козлиное противокроличье антитело и HRP. Продукт делили на 4 фракции на основании размеров конъюгатов: первые две фракции, содержащие продукт (фракции 8-9), элюированный как первый пик, по-видимому, содержащий некоторые сшитые конъюгаты, затем следовало широкое плечо, которые было разделено на фракции 10-11 (однородные крупные конъюгаты) и фракции 12-21 (меньшие разнообразные конъюгаты), и, наконец, неконъюгированные ферменты и антитела в 22-42 фракциях. Измерения на отдельных фракциях продукта, а также фракциях, содержащих неконъюгированное антитело и HRP, показали полное восстановление конъюгата на 87%. Предполагая прямую пропорциональность между включенной HRP и декстраном, было показано, что фракции 10-11 содержали 10,9 HRP и 0,96 антитела на молекулу декстрана. Для экспериментов использовали только эти две фракции.

Анти-НЕК2-антитело, конъюгированное с Dex70, конъюгированным с HRP (D21100, фракции 9-10)

4,6 нмоль 70 кДа декстрана вводили в реакцию с 202 нмоль HRP в 125 мкл буфера А (100 мМ NaCI, 25 мМ NaHCO₃, pH 9,5) на 3 часа при температуре 30°C. Затем 18 нмоль анти-Her2 в 489 мкл воды добавляли к конъюгату декстран-HRP и проводили реакцию в течение еще 21 часа при 30°C. Реакционную смесь гасили добавлением 70 мкл 0,165 М цистеина на 30 минут и продукт очищали на Sephacryl 300 (GE Medical) в буфере В (100 мМ NaCI, 10 мМ HEPES, pH 7,2). Элюированный продукт представлял собой декстрановый конъюгат, содержащий анти-Нег2 и HRP. Продукт делили на 4 фракции на основании размеров конъюгатов: первые две фракции, содержащие продукт (фракции 7-8), элюированный как первый пик, по-видимому, содержащий некоторые сшитые конъюгаты, затем следовало широкое плечо, которые было разделено на фракции 9-10 (однородные большие конъюгаты) и фракции 11-19 (меньшие разнообразные конъюгаты), и, наконец, неконъюгированные ферменты и антитела во фракциях 20-41. Измерения на отдельных фракциях продукта, а также фракциях, содержащих неконъюгированное антитело и HRP, показали полное восстановление конъюгата 68%. Предполагая прямую пропорциональность между включенной HRP и декстраном, было показано, что фракции 9-10 содержали 9,1 HRP и 0,6 антитела на молекулу декстран. Для экспериментов использовали только эти две фракции.

Анти-FITC-антитело, конъюгированное с Dex70, конъюгированным с HRP (АММ 353-022. фракции 8-11)

11 нмоль 70 кДа декстрана вводили в реакцию с 484 нмоль HRP в 316 мкл буфера А (100 мМ NaCI, 25 мМ NaHCO₃, pH 9,5) на 3 часа при температуре 40°C. Затем 66 нмоль анти-FITC в 196 мкл воды добавляли к конъюгату декстран-HRP и проводили реакцию в течение еще 1 часа при 40°С. Реакционную смесь гасили добавлением 70 мкл 0,165 М цистеина на 30 минут и продукт очищали на Sephacryl 300 (GE Medical) в буфере В (100 мм NaCl, 10 мМ HEPES pH 7,2). Элюированный продукт представлял собой декстрановый конъюгат, содержащий анти-FITC и HRP. Продукт делили на 3 фракции на основании размеров конъюгатов: первые две фракции, содержащие продукт (фракции 8-11), элюированный как первый пик, по-видимому, содержащий некоторые сшитые конъюгаты, затем следовало широкое плечо (меньшие разнообразные конъюгаты, фракции 12-27), и, наконец, неконъюгированные ферменты и антитела во фракциях 28-45. Измерения на отдельных фракциях продукта, а также фракциях, содержащих неконъюгированное антитело и HRP, показали полное восстановление конъюгата на 90%. Предполагая прямую пропорциональность между включенной HRP и декстраном, было показано, что фракции 10-11 содержали 11,7 HRP и 0,80 антитела на молекулу декстрана. Для экспериментов использовали только эти две фракции.

Другие реагенты

Антицитокератиновое моноклональное антитело (Dako М3515)

Инкубационная среда (а) (АВСРТ-буфер): 0,1% 4-аминоантипурин, 0,2% проклин, 2% BSA, 0,2% казеин, 2% PEG, 0,1% Tween-20, 0,1 М NaCI, 10 мМ HEPES, рН 7,2.

Инкубационная среда (б): 50 мМ имидазол HCl, pH 7,5, 0,1% нонидет Р40, 0,1% бензалкония хлорид, 0,005% (1,5 мМ) перекись водорода,

раствор хромогена DAB (Dako К3465)

раствор хромогена LPR (Dako К0640)

Краситель гематоксилин (Dako S3301)

Промывочный буфер (Dako S3306)

Раствор для извлечения мишени (Dako S1699)

Пример 1: Размер точки в зависимости от количества репортера, DAB и Н₂O₂ в инкубационных средах или от времени инкубации.

Общая процедура:

Эксперименты по окрашиванию проводили на фиксированных формалином и залитых парафином тканях. В качестве предварительной обработки слайды депарафинизировали в 2 ваннах с ксилолом (по 5 минут в каждой), двух ваннах с 96% этанолом, 2 ваннах с 70% этанолом (по 2 минуты в каждой). Затем слайды кипятили в микроволновой печи в течение 10 минут в растворе для извлечения мишени (Dako S 1699). Слайды остужали, эндогенную пероксидазную активность гасили 10% перекисью водорода в течение 2 минут

Эксперимент 1.

Все слайды: инкубировали с экспериментальным моноклональным мышиным антителом, направленным на С-конец НЕРх2-белка, был использован «клон 6С2». Использовали следующий протокол: инкубация с клоном 6С2, 55 пМ в течение 3 минут, промывание промывочным буфером (Dako S3306), затем инкубация с GaM/HRP (D20052, фракция 8) в концентрации 370 пМ в течение 3 минут, затем промывание. Затем слайды подвергали этапу депонирования, этапу с репортер-связывающим агентом (все репортеры, D19112, D20068, D20086, D20118, D20120, использовали в концентрации 10 мкМ) и этапу окрашивания хромогеном LPR, как указано в таблице 1. Этапы промывания проводили после каждого этапа.

Таблица 1
	Среда депонирования (этап б)	Определение (этап в)
Репортный связывающий агент (этап в′)	Окрашивание (этап в″)
Слайд 1	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 2	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 5 минут
Слайд 3	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 3 минуты
Слайд 4	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 2 минуты
Слайд 5	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 1 минута
Слайд 6	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 5 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 7	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 3 минуты	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 8	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 2 минуты	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 9	D19112: DAB 0,28 мМ, Н202 1,5 мМ, 1 минута	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 10	D19112: DAB 0 мМ, Н202 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 11	D19112: DAB 0,07 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 12	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 13	D19112: DAB 0,56 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 14	D19112: DAB 1,12 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 15	D19112: DAB 2,09 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 16	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 0,6 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 17	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 5,9 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 18	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 14,7 мМ,10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 19	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 58,8 мМ,10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 20	D20068: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 21	D20086: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 22	D20118: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 23	D20120: DAB 0,28 мМ, Н202 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 24	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут

Эксперимент 2

Все слайды обрабатывали, как в примере 1, затем подвергали депонированию, репортер-связывающему агенту и окрашиванию хромогеном, как подробно описано в таблице 2.

Таблица 2
	Среда депонирования (этап б)	Определение (этап в)
Репортный связывающий агент (этап в′)	Окрашивание (этап в″)
Слайд 1	D19112: 10 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 2	D19112: 20 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 3	D19112: 5 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 4	D19112: 3 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 5	D19112: 2 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 6	D19112: 1 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 7	D19112: 10 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 100 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 8	D19112: 10 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 25 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 9	D19112: 10 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 12,5 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 10	D19112: 10 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 6 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 11	D19112: 10 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 3 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 12	D19112: 10 мкМ, DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут

Эксперимент 3

Все слайды обрабатывали, как в примере 1, затем подвергали депонированию, репортер-связывающему агенту и окрашиванию хромогеном, как подробно описано в таблице 3.

Таблица 3
	Среда депонирования (этап б) D19112: все слайды 5 мкМ	Определение (этап в)
Репортный связывающий агент (этап в')
Слайд 1	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 2	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 5 минут
Слайд 3	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 3 минуты
Слайд 4	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 2 минуты
Слайд 5	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 1 минута
Слайд 6	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 20 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 7	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 15 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 8	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 5 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 9	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 3 минуты	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 10	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 2 минуты	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 11	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 1 минута	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 12	D19112: DAB 0 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 13	D19112: DAB 0,07 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 14	D19112: DAB 0,28 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 15	D19112: DAB 0,56 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 16	D19112: DAB 1,12 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 17	D19112: DAB 2,09 мМ, Н2O2 1,5 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 18	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 0 мМ,10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 19	D19112: DAB 0,14 мМ, Н2O2 0,6 мМ,10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 20	D19112,: DAB 0,14 мМ, Н2O2 5,9 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 21	D19112,: DAB 0,14 мМ, Н2O2 14,7 мМ,10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут
Слайд 22	D19112,: DAB 0,14 мМ, Н2O2 58,8 мМ, 10 минут	D20036 50 нМ, 10 минут	LPR 10 минут

Результаты экспериментов 1-3.

Эксперимент 1 (табл.1, слайды 1-5) и 3 (табл.3, слайды 1-5) показывает, что при прочих равных условиях (те же связывающие агенты в той же концентрации, тот же репортер, те же концентрации DAB, репортера и Н₂O₂, такое же время инкубации) размер точки зависит от времени депонирования хромогена на последней стадии процедуры, стадии определения, т.е. от времени депонирования хромогена Liquid Permanent Red (LPR), окрашивающего депозиты репортера. Крупнейшие точки получали при 10-минутном осаждении LPR, размер точек снижался с уменьшением времени осаждения. Тем не менее, даже минутного осаждения (слайды 5) было достаточно, чтобы заметить небольшие, но различимые точки.

Эксперимент 1 (табл. 1: слайд 1 и слайды 6-9) и эксперимент 3 (табл.3: слайд 1 и слайды 6-11) показывает, что размер точки варьирует в зависимости от длительности инкубации образца, содержащего комплексы мишени, т.е. HER2-рецептора, с HRP-меченным связывающим агентом, т.е. D20052, фракцией 8, в средах, содержащих репортер, DAB и Н₂O₂, таким образом, в зависимости от времени, используемого для депонирования репортера из сред (если другие условия фиксированы, т.е. тот же репортер, те же связывающие агенты, те же определяемые агенты, такие же концентрации DAB, Н₂O₂, репортера, связывающего агента и определяемого красителя, такая же продолжительность депонирования красителя на этапе определения). Крупнейшие точки получали при 10-минутном осаждении. Дальнейшее увеличение времени до 15 или 20 минут не приводило к образованию больших точек, но приводило к значительному усилению окрашивания фона. Размер точек уменьшался с уменьшением времени осаждения с 10 минут до 1 минуты.

Эксперимент 1 (табл.1: слайды 1 и 16-19) и 3 (табл.3, слайды 1, 18-22) показывает, что размер точек может быть изменен путем изменения концентрации Н₂O₂ в средах депонирования, содержащих DAB и репортер. Крупнейшие точки получали при концентрации перекиси водорода 1,5 мМ. В отсутствие перекиси водорода точки получены не были (табл.3: слайд 18). И нижние, и верхние концентрации перекиси водорода уменьшали размеры точек. При 58,8 мМ точки становились почти неразличимыми.

Размер точек варьирует в зависимости от концентрации DAB в средах депонирования, содержащих DAB и репортер, как показано в эксперименте 1 (табл.1: слайды 1 и 10-15) и эксперименте 3 (табл.3: слайды 1 и 12-17). Крупнейшие точки получали при DAB, присутствующем в интервале концентраций от 0,14 мМ до 0,28 мМ. В отсутствие DAB точки получены не были. Уменьшение концентрации DAB до 0,07 мМ приводило к получению точек меньшего размера и более размытых, чем при 0,14 мМ, такой же эффект имели более высокие концентрации DAB: при 2,09 ммоль DAB получали очень мелкие точки.

Количество остатков феруловой кислоты (3 против 4 остатков) в молекуле репортера незначительно влияло на размер точек: размер точек незначительно изменялся с разными репортерами. Как показано в эксперименте 1 (табл.1: слайды 20-24), репортер D20068 с 4-мя феруловокислотными группировками давал точки немного большего размера, чем репортеры с 3-мя группировками, но в то же время уровень фонового окрашивания также увеличивался. Лучшее соотношение сигнала и шума было получено с D19112, который содержит 3 группировки феруловой кислоты.

Размер точек варьирует в зависимости от концентрации репортера. Эксперимент 2 (табл.2: слайды 1-6) показал, что в диапазоне от 5 мкМ до 20 мкМ репортер D19112 (при прочих равных условиях) формировал депозиты, которые лишь незначительно отличались по размеру: 10 и 20 мкМ давали немного большие точки, чем 5 мкМ, но окрашивание фона также увеличивалось. При менее 5 мкМ размер точек значительно снижался, но даже при 1 мкМ маленькие точки по-прежнему были хорошо видимы.

Концентрация связывающего агента, способного связываться с депонированным репортером, т.е. с D20036, влияла на размер точек незначительно (как показано в эксперименте 2, табл. 2: слайды 7-12). Крупнейшие точки были получены (при прочих равных условиях) при концентрации анти-Flu-AP-конъюгированных антител (D20036), составляющей 50 нМ. 100 нМ и концентрации ниже 50 нМ не давали точек большого размера. При очень низких концентрациях (6 или 3 нМ) получали очень маленькие, но все еще различимые точки.

Точки, размер которых регулируется, в частности, снижается, концентрацией репортера, концентрацией репортер-связывающего агента и временем осаждения определяемого красителя (например, LPR-красителя на этапе определения) демонстрировали характерный градиент интенсивности, будучи наиболее интенсивно окрашенными в центре и диффузно окрашенными на периферии, что придавало этим точкам общий диффузный вид.

Точки, размер которых регулируется, в частности, снижается, высокой концентрацией DAB, высокой концентрацией перекиси водорода или уменьшенным временем этапа осаждения, имеют четкий вид с равномерной интенсивностью и резкими границами.

Пример 2. Размер точек в зависимости от структуры второго субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью: анализ различных конъюгированных молекул.

Все слайды предварительно обрабатывали, как в примере 1, а затем подвергали обработке по следующему протоколу: инкубация с антицитокератином Dako М3515 2 нМ в течение 3 минут, промывание в промывочном буфере (Dako S3306), затем инкубация с GaM/HRP (D20168, фракции 9+10) в концентрации 100 пМ в течение 3 минут. Затем слайды подвергали этапу депонирования с различными репортерами, но при прочих равных условиях (50 мМ имидазол HCI pH 7,5, 0,1% нонидет Р40, 0,1% бензалкония хлорид, DAB 0,14 мМ, Н₂0₂ 1,5 мМ) в течение 10 минут. Затем следовал этап репортер-связывающего агента D20036 (20 нМ, в течение 10 минут) и этап окрашивания хромогеном LPR в течение 10 минут. Этап промывания проводили после каждого этапа. Следующие репортеры были проанализированы при этих условиях:

D19112, D18044, D181126, D18146, D20171, D21016, 0328-014 (все 5 мкМ). Декстрановый репортерный конъюгат D21008 анализировали в 50 нМ и 250 нМ. В сочетании с репортерами, проанализированными в эксперименте 1, он приводил к следующему выводу:

Характер репортера критически влияет на эффективность происходящего депонирования репортера. Удивительно, что относительно небольшие репортеры, такие как D20171 (1 флуоресцеин, 4 феруловых кислоты) и D19112 (1 флуоресцеин, 3 феруловых кислоты) оказались более эффективными, чем более крупные молекулы, такие как D18126 (3 флуоресцеина, 6 феруловых кислот) или большой декстрановый конъюгат D21008 (83 флуоресцеина и 111 феруловых кислот). В случае декстранового конъюгата это может быть объяснено слабым проникновением в образец. Тот факт, что тип ткани и фиксация влияют на размер точки при использовании этого большого конъюгата, поддерживает эту идею.

В случае D18126, который является сравнительно (для конъюгатов антитело-фермент) небольшой молекулой, отсутствие проникновения не выглядит адекватным объяснением низкой эффективности. Был проведен ряд контрольных экспериментов, чтобы лучше выяснить механизм депонирования: в отсутствие DAB в среде депонирования точки не формировались. Если же реакцию депонирования проводили только с DAB, то потом следующая реакция депонирования с D20171 без DAB давала очень мелкие точки. Эти данные убедительно свидетельствуют, что часть механизма представляет собой HRP-управляемое покрытие образца полимерами DAB, которые впоследствии служат якорями для репортеров. Другой эксперимент был проведен с 10-минутными промываниями в кипящем CHES-буфере после этапа депонирования. Это приводило к уменьшению фона, однако это очень жесткое промывание также приводило к значительному снижению размера точки. Это показывает, что большинство депонированных репортеров не сшиваются ковалентно с образцом, а осаждаются в виде нерастворимых депозитов, где, как другие репортеры, могут считаться действительно иммобилизированными. Этот вывод указывает на два дополнительных механизма; реакции растворной фазы между DAB и репортерами приводят к появлению продуктов присоединения со сниженной растворимостью, которые осаждаются в сочетании с истинным ковалентным связыванием репортера и образца. По-видимому, большие репортеры менее вероятно осаждаются, как это требует нескольких реакций с DAB, чтобы сделать их нерастворимыми, в то время как меньшие репортеры оказываются нерастворимыми в одной или нескольких реакциях с DAB.

Репортеры с уменьшенной длиной линкера, D20086 (L30) и D20118 (L60), давали почти такие же большие точки, как D19112 (L150), хотя эти укороченные репортеры также давали немного больше фона. Этот немного сниженный сигнал (размер точек) по отношению к шуму, скорее всего, в самом деле снижает растворимость, приводя к большей липкости и сниженной доступности флуоресцеиновых гаптенов. Таким образом, длинные отрезки линкера повышают эффективность репортера.

Критически важным фактором является природа реактивных групп в репортере. Тот факт, что репортеры могут быть депонированы в отсутствие DAB, если затем следует этап покрытия DAB, показывает, что HRP-катализируемое образование радикалов репортера играет свою роль. Точно так же тот факт, что репортер D18126 с феруловыми кислотами дает большие точки, чем аналогичный репортер D18146 с 4-аминокоричной кислотой, а также тот факт, что аналогичный D18044 с остатками тирозина не дает точек вообще, показывают важность реактивных групп в репортере. Репортеры D21020 и 0328-014, похожие по структуре на D19112, но, соответственно, с кофейной кислотой и синапиновой кислотой вместо феруловой кислоты, дают либо некоторое количество маленьких точек (D21020), либо немного более крупных (0328-014), чем D19112. Феруловая, кофейная и синапиновая кислоты являются очень хорошими HRP-субстратами, и HRP-радикальная активация репортеров вносит, вероятно, основной вклад в депонирование линкера.

В заключение, многие факторы участвуют в образовании эффективных репортеров: относительно небольшой размер еще удлиненных участков водорастворимого линкера. Сбалансированная общая растворимость в воде, которая значительно снижается при реакции с DAB. Наличие двух или более фенолов или ароматических аминов, которые являются хорошими субстратами HRP, дает хорошие репортеры. Предпочтительными являются производные с 3-4 феруловыми кислотами, наиболее предпочтительно производные с 3 синапиновыми кислотами, т.е. репортер 0328-014 представляется лучшим из всех испытанных.

В таблице ниже суммированы результаты нескольких SMD-окрашиваний с использованием типичных конъюгированных молекул с различными структурами (различными Y-головами, различными молекулярными расстояниями между Y-головой и Z-хвостом, одинаковыми Z-хвостами (один Flu)):

Конъюгат	Молекулярное расстояние между Y-головой и Z-хвостом	Y-голова	Относительный размер точек*
D19112	L150	Fer-Lys(Fer)-Lys(fer)-	3
D20118	L60	Fer-Lys(Fer)-Lys(fer)-	2
D20086	L30	Fer-Lys(Fer)-Lys(fer)-	2
D19185	L150	Fer-Lys(Fer)-Lys(fer)-Lys(Fer)	3
D21047	L150	Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-	4
D21028	L150	Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-Lys(Sin)	3
D21150	L150	Sin-Lys(Sin)-Tyr-	3

* Относительный размер точек приблизительно соответствует максимальному диаметру точек в микронах при оптимальных условиях: высокий pH ткани для извлечения мишени, 10 мкМ репортер, 1,6 мМ перекись водорода и 0,28 мМ DAB в реакции осаждения в течение 10 минут при комнатной температуре, распознавание репортера в течение 10 минут с 20 нМ анти-FITC-AP, затем 10 минут LPR. Относительные оценки были вынесены на основании нескольких экспериментов в различных условиях (извлечения мишени и концентрации репортера) на различных образцах ткани и контрольных клеточных линиях, и являются качественными.

Пример 3: Размер точек в зависимости от количества HRP-меченного связывающего агента и количества группировок HRP на молекулу связывающего агента.

10 слайдов депарафинизировали и мишень извлекали в среде для извлечения мишени Dako (Dako S2763) путем 10-минутного кипячения в микроволновой печи. 100 нМ антицитокератинового мышиного антитела (Dako М3515) предварительно смешивали с различным количеством молярных эквивалентов противомышиных конъюгатов вторичное антитело-HRP, и через 30 минут смеси разбавляли до конечных концентраций, как описано в таблице 4:

Таблица 4
Номер слайда	Конъюгат вторичное антитело-HRP	Эквиваленты конъюгата вторичное антитело-HRP	Конечная концентрация антитела
1	D19150 (1 HRP)	0.5	20 пМ
2	D19150 (1 HRP)	1	20 пМ
3	D19150 (1 HRP)	2	20 пМ
4	D19150 (1 HRP)	4	20 пМ
5	D19150 (1 HRP)	8	20 пМ
6	D19150 (1 HRP)	16	20 пМ
7	D20052 фракция 8 (10HRP)	1	200 пМ
8	D20052 фракция 8 (10 HRP)	2	200 пМ
9	D20052 фракция 8 (10HRP)	3	200 пМ
10	D20052 фракция 8 (10HRP)	4	200 пМ

Все слайды подвергали иммуноокрашиванию в соответствии с тем же протоколом:

1. Смесь первичное антитело/вторичное антитело-HRP; 3-минутная инкубация

2. 50 мМ имидазол HCI, pH 7,5, 0,1% нонидет Р40, 0,1% бензалкония хлорид, 0,005% перекись водорода, 140 мкМ DAB, 5 мкМ D19112; 8-минутная инкубация

3. анти-FITC-HRP, D20154, 100 нМ; 5-минутная инкубация

4. Раствор хромогена DAB; Dako К3468, 2-минутная инкубация

5. Краситель гематоксилин; 1-минутная инкубация

В этапах 1 и 3 в качестве растворителей использовали 0,1%, 4-аминоантипурин, 0,2% проклин, 2% BSA, 0,2% казеин, 2% PEG, 0,1% Tween-20, 0,1 М NaCl, 10 мМ HEPES, pH 7,2 (АВСРТ-буфер).

Все слайды показали специфическое к цитокератину точечное окрашивание, которое выглядело как точки от коричневого до черного цвета. Число точек и их размер увеличивался в слайдах 1-3. На слайдах 3-5 число точек оставалось практически неизменным, но размер точек увеличивался с 3 по 5 слайд. Слайд 6 имел меньше точек, но в целом более крупного размера. Самые большие точки были определены на слайдах 7-10, хотя их размер лишь незначительно увеличивался по сравнению с числом эквивалентов конъюгатов вторичное антитело-HRP в предварительной смеси. Число точек уменьшалось с увеличением числа вторичных HRP-конъюгатов, что поддерживает идею, что предварительное смешивание с избытком вторичных конъюгатов приводит к более крупным скоплениям и более медленному связыванию мишени.

Пример 4: Размер точек в зависимости от количества HRP на молекулу связывающего агента.

Фракции D20052 (7, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21) разводили в АВСРТ-буфере до общей концентрации HRP 100 пМ и оценивали размер точек для каждой фракции. Также анализировали пул фракций, также в анализ был включен D19150 (F(ab)₁-HRP1).

Использовали следующий протокол:

1. Антицитокератин (Dako 3515) 1 нМ; 1 мин

2. Фракции D20052 (100 пМ HRP)/D19150; 1 мин

3. 50 мМ имидазол HCI, pH 7,5, 0,1% нонидет Р40, 0,1% бензалкония хлорид, 0,005% перекись водорода, 140 мкМ DAB, 10 мкМ D19112; 8 мин

4. анти-FITC-HRP, D19154 100 нМ; 5 мин

5. Раствор хромогена DAB; 50 мМ имидазол HCl, pH 7,5, 0,1% нонидет Р40, 0,1% бензалкония хлорид, 0,2% перекись водорода, 5,6 мМ DAB; 1 минута

6. Краситель гематоксилин; 1 мин

Результаты: Фракции 7 и 8 давали значительно меньше точек, чем последующие фракции. Это были также крупнейшие точки, однако фракции 9-12 давали значительно больше точек почти такого же большого размера. Фракции 13-22 давали точки меньшего размера. D19150 с одним ферментом HRP на молекулу давал гораздо больше точек, чем любая из фракций D20052, точки были значительно меньше. Каждая фракция давала точки относительно одинакового размера, а пул всех фракций давал точки сильно различающегося размера.

Пример 5

Анализ фракций 1-4 D20075, большего конъюгата dex150, проводили, как описано в эксперименте 5 выше. Полученные точки напоминали точки фракций 7 и 8 D20052, т.е. было получено несколько точек, хотя они были не значительно больше, чем полученные фракциями 9-12 D12052.

Выводы

Из экспериментов 4-6 мы заключаем, что существует сильная корреляция между количеством HRP на молекулу связывающего агента и размером точек, полученных в аналогичных обстоятельствах. Увеличение числа HRP в каждой молекуле связывающего агента, независимо от того, получен он путем предварительного смешивания или конъюгации, приводит к более крупным точкам. Этот эффект, тем не менее, похоже, стабилизируется на уровне примерно 10 HRP/молекула: более крупные декстрановые конъюгаты не дают более крупных точек. Количество точек показывает обратную корреляцию: более крупные молекулы, особенно очень крупные, производят меньше точек. Это может быть результатом стерических затруднений, возникающих из-за массы ферментов, связанных с каждой молекулы антитела, и медленной скоростью диффузии крупных молекул в целом. Эксперимент 4, слайды 1-3, тем не менее, также указывает, что молекулы связывающего агента, содержащие одиночную ферментную группировку, производят меньше различных точек, чем те, у которых меньше фермента на одну молекулу, по-видимому, из-за того, что некоторые отдельные ферментные молекулы не дают видимых точек из-за быстрого ингибирования фермента. Эксперименты 4-6 все используют очень короткое время осаждения хромогена на стадии определения репортерных депозитов, что приводит к появлению точек, которые выглядят меньше, чем они могли бы выглядеть. Эксперименты 1-3 (см. выше) показывают, что конечное время осаждения хромогена при определении депозитов репортера может влиять на визуальный размер точки. Чтобы минимизировать этот эффект, это время сохранили коротким, чтобы подчеркнуть влияние количества фермента.

Пример 6. Флуоресцентное двойное пятно.

4 слайда предварительно обрабатывали, как описано в примере 1.

D20168, фракции 9-10, предварительно смешивали с эквимолярным количеством антицитокератина (Dako М3515) в АВСРТ-буфере для связывающего агента, оба реагента в концентрации 100 нМ, на 5 минут.После этого этапа предварительного смешивания приготовили 20 пМ раствор в АВСРТ-буфере для связывающего агента, «20 пМ смесь».

Слайд 1 обрабатывали 20 пМ смесью в течение 1 минуты, промывали (Dako промывочный буфер, S3006), а затем обрабатывали 20 мкМ D20171 и 0,28 мМ DAB в среде депонирования в течение 1 минуты и промывали.

Слайд 2 обрабатывали 20 пМ смесью в течение 1 минуты, промывали (Dako промывочный буфер, S3006), а затем обрабатывали 5 мкМ D19048 и 0,28 мМ DAB в среде депонирования в течение 1 минуты и промывали.

Слайд 3 обрабатывали 20 пМ смесью в течение 1 минуты, промывали (Dako промывочный буфер, S3006), а затем обрабатывали 20 мкМ D20171+5 мкМ D19048 и 0,28 мМ DAB в среде депонирования в течение 1 минуты и промывали.

Слайд 4 обрабатывали 20 пМ смесью в течение 1 минуты, промывали (Dako промывочный буфер, S3006), а затем обрабатывали 20 мкМ D20171 и 0,28 мМ DAB в среде депонирования в течение 1 минуты и промывали. Слайд обрабатывали 3 М перекисью водорода в течение 1 минуты, промывали, а затем снова обрабатывали 20 пМ смесью в течение 1 минуты, промывали (Dako промывочный буфер, S3006), а затем обрабатывали 5 мкМ D19048 и 0,28 мМ DAB в среде депонирования в течение 1 минуты.

Все слайды, наконец, промывали водой, дегидратировали в этаноле и помещали во флуоресцентную гистологическую среду (Dako К5331).

Результаты. Слайд 1 давал люминесцентные круглые зеленые точки в цитокератин-положительной ткани. Слайд 2 давал флуоресцентные круглые красные точки в цитокератин-положительной ткани. Слайд 3 давал флуоресцентные круглые точки, которые были зеленого цвета, если смотреть через фильтр FITC, красные, если смотреть через фильтр TRITC, и желтые, если смотреть через двойной фильтр, в цитокератин-положительной ткани. Через двойной фильтр не наблюдалось ни зеленых, ни красных точек. Слайд 4 давал смесь флуоресцентных круглых зеленых и красных точек в цитокератин-положительной ткани, если смотреть через двойной фильтр. В ткани с высокой экспрессией цитокератина наблюдалось некоторое желтое перекрывание зеленых и красных точек. Округлость точек в сочетании с наблюдаемой смесью красных и зеленых точек на слайде 4 приводит к выводу, что каждая точка производится одиночной молекулой: на основании только слайдов 1 и 2 можно утверждать, что, несмотря на крайне низкую используемую концентрацию связывающего агента, наблюдаемые точки не являются производными одиночных молекул. Скорее точки могут быть связаны с субклеточными кластерами высокой концентрации цитокератина, каждая с несколькими связанными молекулами связывающего агента. Тем не менее, если это было так, слайд 4, по-видимому, демонстрировал точки различных оттенков в зависимости от того, сколько молекул связывающего агента было связано с каждым кластером на каждом этапе инкубации на слайде 4, или, в случае множественных молекул, связанных с каждым кластером, желтые точки, как на слайде 3.

Этот пример также иллюстрирует значение одновременного депонирования двух различных репортеров.

Пример 7. Хромогенное двойное окрашивание двух различных совместно локализованных мишеней.

Слайды предварительно обрабатывали, как описано в примере 1. Для этого эксперимента в качестве анализируеого материала использовали тканевый монослой ткани молочной железы с различным НЕ1Ч2-статусом (оцененным от 0 до 3+с помощью Dakos Herceptest). Было использовано экспериментальное моноклональное мышиное антитело, направленное против С-конца НЕРх2-белка, «клон 6С2». Использовали следующий протокол:

1. 10 пМ антицитокератина, предварительно смешенного с D20168, фракциями 9-10, как в примере 7, в АВСРТ-буфере для связывающего агента; 3 мин

2. 5 мкМ D19059 в буфере депонирования с 0,45 мкМ DAB; 8 мин

3. 3 М перекись водорода, 3 мин

4. 15 пМ «клон 6С», предварительно смешенный с D20168, фракциями 9-10, как в примере 7, в АВСРТ-буфере для связывающего агента (а); 3 мин

5. 5 мкМ D19112 в буфере депонирования (б) с 0,45 мкМ DAB; 8 мин

6. 25 нМ D20036 (анти-FITC-AP)+25 нМ D19053 (анти-FITC-AP) в АВСРТ-буфере в течение 10 мин

7. Краситель Liquid Permanent Red, Dako K0640; 6 мин

8. Синий хромоген 400 мг/л в 50 мМ имидазол HCl, pH 7,5, 0,1% нонидет Р40, 0,1% бензалкония хлорид, 5,8 мМ перекись водорода; 6 минут.

Результаты: Этот протокол давал красные (Her2) и синие (цитокератин) точки на ткани молочной железы, и, несмотря на двойное окрашивание, только очень слабый синий фон. Были получены фотоснимки различных тканей и напечатаны изображения с использованием обычного цветного принтера. Это позволило вручную подсчитать несколько сотен точек на изображении. Ткань, которая с помощью Herceptest была оценена как HER2-отрицательная (0+), показала в 9 раз больше синих точек, чем красных. Ткань, которая была оценена как сильно HER2-положительная (3+), показала более чем трехкратное превышение красных точек над синими, т.е. соотношение красных и синих точек было примерно в 30 раз выше в ткани 3+, чем в ткани 0+. Ткани, которые оценивали как 1+ и 2+, демонстрировали промежуточные коэффициенты.

Пример 8. Окрашивание малого числа мРНК-мишеней.

Слайды с FFPE-срезами различных образцов ткани депарафинизировали путем помещения в ксилол (2 раза по 5 минут), а затем в 96% этанол (2 раза по 2 минуты) и 70% этанол (2 раза по 2 минуты).

Слайды промывали деионизированной водой и переносили в раствор для извлечения мишени, 20 мМ MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), pH 6,55, и кипятили в микроволновой печи в течение 5 минут. После 15-минутного охлаждения слайды дважды промывали промывочным буфером (Dako S3006), расщепляли пепсином в течение 2 минут при температуре 37°С, а затем дважды промывали промывочным буфером.

Слайды дегидратировали 70% этанолом в течение 1 минуты, 85% этанолом в течение 1 минуты, 96% этанолом в течение 1 минуты. FITC-меченые анти-Каппа мРНК-зонды (Dako Y5202, Ready То Use) применяли к слайдам и затем покрывали их покровным стеклом. Слайды подвергали денатурации при 82°C в течение 5 минут, а затем гибридизации в течение 1 часа на 45°C. Слайды тщательно промывали в течение 10 минут при температуре 65°C в жестком промывочном буфере (набор от Dako К5201).

Затем слайды подвергали процедурам по следующему протоколу SMD:

Блокировка пероксидазы, 2 минуты с помощью Dako S2023

Промывание, 3 минуты.

анти-FITC-HRP, АММ353.022, в течение 20 минут в инкубационной среде 1. Использовали пять различных концентраций (10, 20, 40, 80, 160 пМ).

Промывание, 3 минуты.

Репортер D21047, 5 мкМ, DAB 0,14 мМ, перекись водорода 1,5 мМ в инкубационной среде 2 в течение 10 минут.

Промывание, 3 минуты.

AHTH-FITC-щелочная фосфатаза (D20036) 20 нМ в течение 10 минут в инкубационной среде 1.

Промывание, 3 минуты.

Краситель Liquid Permanent Red, Dako K0640, 10 минут.

Промывание, 2 минуты.

Окрашивание гематоксилином (Dako S3309, разведенный в 6 раз водой), 2 минуты.

Промывание деионизированной водой.

Помещение в Dako Fairmount, S3025.

Результаты: Все слайды показали отдельные красные точки диаметром примерно 3 мкм. Точки присутствовали во всех типах тканей, и количество точек увеличивалось с увеличением концентрации анти-FITC-HRP. В высоких концентрациях (80 и 160 пМ) каппа-положительные клетки могли быть четко определены в тканях небной миндалины и толстой кишки, так как каждая была окрашена десятками слитых точек. Множественные слитые точки не были определены в других тканях, ни в каппа-отрицательных клетках миндалины, ни в толстой кишке. Это показывает, как данная методика с успехом может применяться качественным образом в случае малого числа мишеней, таких как мРНК.

Пример 9. Феруловая кислота в качестве первого субстрата.

Слайды с FFPE-срезами образцов контрольных клеточных линий депарафинизировали путем помещения в ксилол (2 раза по 5 минут), затем в 96% этанол (2 раза по 2 минуты) и 70% этанол (2 раза по 2 минуты).

Слайды промывали деионизированной водой, переносили в раствор для извлечения мишени, Dako pH 9, S2367, и кипятили в микроволновой печи в течение 10 минут.

Затем слайды подвергали процедурам по следующему протоколу SMD:

Блокировка пероксидазы, 5 минут с помощью Dako S2023

Промывание, 2 минуты.

Антицитокератин Dako М3515, разведенный 1:50 в инкубационной среде 1, в течение 5 минут.

Промывание, 2 минуты.

1 пМ козлиного противомышиного антитела, L348.121, в инкубационной среде 1 в течение 5 минут.

Промывание, 3 минуты.

Репортер D21047, 20 мкМ, перекись водорода 1,5 мМ в инкубационной среде 2 в течение 10 минут с различными концентрациями феруловой кислоты (52 мМ, 16 мМ, 5,2 мМ, 1,6 мМ, 0,52 мМ) или 0,14 мМ DAB

Промывание, 9 минут.

AHTH-FITC-щелочная фосфатаза (D20036) 20 нМ в инкубационной среде 1 в течение 10 минут.

Промывание, 9 минут.

Краситель Liquid Permanent Red, Dako K0640, 10 минут.

Промывание, 2 минуты.

Промывание деионизированной воды

Помещение в Dako Fairmount, S3025.

Результаты.

Чтобы обеспечить очень эффективное депонирование репортера, протокол оптимизировали путем применения связывающего агента с большим количеством (20) HRP-ферментов на молекулу, условий высокого pH среды для извлечения мишени (чтобы обеспечить хорошую доступность ткани) и эффективного репортера, D21047, который использовали в относительно большом количестве. В этих условиях контрольные слайды с 0.14 мМ DAB давали точки размером до 4 мкм в диаметре. В случае феруловой кислоты (в качестве линкера) оптимальной была концентрация 1,6 мМ: были получены точки размером до 2 мкм. Более низкие и более высокие концентрации феруловой кислоты приводили к меньшему размеру точек; при самой высокой концентрации, 52 мМ, точки определены не были. Точки не были определены в слайдах, инкубированных без феруловой кислоты или DAB.

Без связи с какой-либо теорией можно предположить, что феруловая кислота, например, DAB, обладает возможностью сшивать молекулы второго субстрата; хотя DAB является менее эффективной и имеет другую оптимальную концентрацию.

Получение точек до 4 мкм в присутствии линкера и отсутствие точек без него (при прочих одинаковых условиях инкубации) подтверждает, что прямая ферментативная активация репортера играет лишь незначительную роль в реакциях депонирования. И DAB, и феруловая кислота могут подвергаться гомополимеризации в присутствии HRP и пероксидов. Наличие крупных точек (4 мкм) показывает, что репортеры могут депонироваться в нескольких мкм от сайта с HRP-активностью, и позволяет предположить, что возможный механизм депонирования заключается в том, что некоторые молекулы линкера вступают в реакцию с HRP и производят соответствующие радикалы; эти триггерные радикальные цепи реагируют с молекулами линкера и с репортерными молекулами и продуцируют олигомерные радикалы, которые достаточно стабилизированы обширной делокализацией. Это позволяет радикалам диффундировать из ферментов и оставаться в среде депонирования до десяти минут (до того, как происходит депонирование). Оптимум концентрации, наблюдаемый для DAB и феруловой кислоты, поддерживает такой механизм. При высоких концентрациях олигомеры линкер/репортер могут быстро становиться нерастворимыми и депонироваться вблизи сайта ферментативной активности. При слишком низких концентрациях линкера олигомеризация является недостаточной для продукции больших нерастворимых олигомеров.

Пример 10. Количественная оценка Нег2 в образце.

Исследуемый материал

В качестве исследуемого материала использовали ряд срезов осадков клеток, фиксированных формалином и залитых парафином, линий sk45 (+0 линия), df45 (+1 линия), df23 (+3 линия), экспрессирующих Нег2. Осадки клеточных линий заливали в единый блок парафина, чтобы получить срезы, в которых представлены все клеточные линии.

Предварительная обработка исследуемого материала:

Слайды с FFPE-срезами блоков, содержащими три клеточные линии (далее называемые «слайдами»), заливали парафином путем помещения в ксилол (2 раза по 5 минут), а затем в 96% этанол (2 раза по 2 минуты) и 70% этанол (2 раза по 2 минуты). Затем срезы промывали деионизованной водой и переносили в раствор для извлечения мишени, либо в раствор с высоким pH (Dako S2375), разбавленный в 10 раз (примеры 1 и 2 с антицитокератином), либо в раствор с низким pH (Dako S1700) (см. примеры 10.3-10.8 ниже). Затем слайды нагревали до кипения в микроволновой печи (примерно 5 минут) и осторожно кипятили 10 минут. Затем срезы охлаждали в течение минимум 20 минут, а затем переносили в промывочный буфер (Dako S3006), разведенный в 10 раз.

Первичные антитела:

Анти-НЕР2-антитело представляло собой моноклональное кроличье антитело (Dako, клон 25-11-3). Разведения выполняли на основании рассчитанной суммарной концентрации белка в концентрированном растворе и молекулярной массы антитела (150 кДа/моль).

Конъюгаты: Связывающие агенты и репортеры

L348.111, фракции 10-11

D21100, фракции 9-10

АММ 353-022, фракции 8-11

D21047

(подробное описание см. выше).

Инкубационные среды

Раствор (а): 0,1% 4-аминоантипурин, 0,2% проклин, 2% BSA, 0,2% казеин, 2% PEG, 0,1% Tween-20, 0,1 М NaCI, 10 мМ HEPES, pH 7,2. (АВСРТ-буфер).

Раствор (б): 50 мМ имидазол HCI, pH 7,5, 0,1% нонидет Р40, 0,1%, бензалкония хлорид, 0,005% (1,5 мМ) перекись водорода.

Инструменты

Dako Autostainer Classic. Этот инструмент является абсолютно открытым и свободно программируемым автоматизированным инструментом для IHC, где реагенты и время инкубации можно применять и устанавливать по желанию. Прибор выполняет четыре основные действия:

1. Аспирация реагента.

2. Введение потока промывочного буфера на горизонтально расположенные слайды.

3. Распределение реагента по слайду (известное как «sip and spit».)

4. Промывание слайда промывочным буфером.

Типичная программа для одного слайда описана ниже в протоколе 1. Для всех SMD-экспериментов начальная блокировка пероксидазы и этапы формирования точек оставались неизменными:

Протокол

Блокировка пероксидазы, 5 минут в Dako S2023

Промывание

(а) Формирование сайтов-мишеней:

Первичное антитело, 100 пМ в растворе (а)

Промывание

HRP-меченное вторичное антитело, как описано в примерах.

Промывание

(б) Формирование репортерных депозитов на сайтах-мишенях Инкубация образцов (а) в течение 10 минут с 0,28 мМ DAB и 5 мкМ репортера (D21047) в растворе (б).

Промывание

в) Определение репортерных депозитов на одиночных сайтах-мишенях Анти-FITC-AP, 10 минут, 20 нМ D20036 в инкубационной среде 1

Промывание

LPR, 10 минут, Dako К0640 Промывание

г) Окрашивание гематоксилином

Гематоксилин, 5 минут

Промывание деионизированной водой

д) Сборка

В автоматизированный протокол могут быть введены дополнительные промывания. Автоматизированная программа будет поддерживать общее время протокола на минимуме за счет сокращения длительности этапов промывания до минимума; тем не менее, продолжительность промывания будет зависеть от загрузки инструмента. Если запрограммировано окрашивание одного слайда, один этап промывания может быть уменьшен до 20 секунд, в то время как при полной загрузке в 48 слайдов время промывания значительно увеличивается. Чтобы сохранить это изменение времени минимальным, в каждом периоде в среднем окрашивали по 10 слайдов. Соответственно, продолжительность этапа промывания сохранялась примерно на 2 минутах на этап.Множественные промывания после депонирования репортера и инкубации депозитов с анти-FITC-AP обеспечивают минимальное LPR-окрашивание фона. Несмотря на массивное усиление (по оценкам, каждая красная точка, полученная из одной молекулы антитело-декстран-HRP, связанной с мишенью, содержит в среднем 100 миллиардов молекул LPR), фон может практически не определяться.

Подсчет точек изначально производили вручную, путем визуального осмотра SMD-окрашенных слайдов и их изображений. Автоматизированный анализ изображений проводили с использованием бесплатной программы JMicrovision, версия 1.27, В типичном воплощении красные точки LPR, полученные в соответствии с описанием, и окрашенные гематоксилином ядра подсчитывали автоматически. Автоматизированный подсчет подтверждали путем осмотра и ручного подсчета. Сегментирование и обобщение объектов может быть основано в цветовом пространстве HSI (Hue, Saturation, Intensity: оттенок, насыщенность, яркость) только на оттенке, т.е. интенсивность и насыщенность имеют полный диапазон 0-255. Оттенок точек устанавливали на 188(фиолетовый)-255 и 0-16 (оранжевый), оттенок ядер 76 (зеленый)-163 (синий). Контраст точка-ядро усиливали путем чрезмерной экспозиции красного (1,2), нейтральной зеленого (1,0) и недостаточной экспозиции синего (0,56) во время захвата изображения, осуществляемого с помощью микроскопа Olympus ВХ51, оснащенного мегапиксельной камерой DP50 5,5, и программного обеспечения CellD image capture. Фиг.3 показывает обработанные изображения клеток и результаты подсчета точек.

1. Способ визуализации одиночной отдельной единицы мишени в образце, где указанная мишень иммобилизирована, включающий
а) инкубацию образца, содержащего популяцию отдельных единиц мишени с одним или более чем одним связывающим агентом, где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей мишени,
и формирование одного или более чем одного дискретного одиночного сайта-мишени с фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный сайт-мишень представляет собой комплекс из одной отдельной одиночной единицы указанной фракционной субпопуляции и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;
в) инкубацию образца (а) в водном растворе (i), содержащем
пероксидное соединение в количестве, которое составляет от 0,1 мМ до 5 мМ,
первый субстрат фермента, связанный с дискретными одиночными сайтами-мишенями (а), и
второй субстрат указанного фермента,
где указанный первый субстрат является водорастворимым богатым электронами соединением, которое
(3) способно образовывать радикалы в реакции с указанным ферментом, и
(4) способно сшивать молекулы указанного второго субстрата в присутствии указанного фермента и пероксидного соединения, образуя нерастворимый в воде полимерный продукт указанного второго субстрата,
и где указанный второй субстрат представляет собой конъюгированную молекулу, содержащую по меньшей мере два соединения, которые способны выступать в качестве субстратов указанных ферментов, и определяемую метку, где определяемая метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцентных, люминесцентных, радиоактивных или хромогенных веществ или членов пар специфического связывания,
с образованием, таким образом, дискретных депозитов второго субстрата на дискретных одиночных сайтах-мишенях (а) и визуализацией указанных одиночных сайтов-мишеней (а).

2. Способ по п. 1, где один или более чем один связывающий агент является членом пары специфического связывания.

3. Способ по п. 1, где сайты-мишени создаются с меньшинством одиночных отдельных единиц мишени, присутствующих в образце.

4. Способ по п. 1, где сайты-мишени создаются с большинством одиночных отдельных единиц мишени, присутствующих в образце.

5. Способ по п. 1, где фермент является ферментом с оксидоредуктазной активностью.

6. Способ по п. 5, где фермент обладает пероксидазной или фенолоксидазной активностью.

7. Способ по п. 6, где фермент является пероксидазой хрена, пероксидазой сои или лакказой, или функциональным аналогом указанных ферментов.

8. Способ по п. 1, где первый субстрат фермента с оксидоредуктазной активностью является соединением, которое содержит структуру формулы (I):

где
R₁ представляет собой арил или винил,
R₂, R₃ и R₄ независимо представляют собой Н, N-(X)₂, O-(Х)₂, где X представляет собой алкил, винил, арил или Н, и где R2, R3 и R4 неодновременно представляют собой Н,
где
Н представляет собой водород; О представляет собой кислород.

9. Способ по п. 1, где соединение является 3,3′-диаминобензидином или его производным.

10. Способ по п. 1, где соединение является феруловой кислотой или ее производным.

11. Способ по п. 9, где количество 3,3′-диаминобензидина или его производного составляет менее 1 мМ.

12. Способ по п. 1, где конъюгированная молекула содержит по меньшей мере одно соединение в качестве субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью, которое определяется формулой (II):

где
R₁ представляет собой -Н, -О-Х, N(X)₂ или-S-X;
R₂ представляет собой -Н, -О-Х, -N(X)₂ или -S-X;
R₃ представляет собой -Н, -ОН, -NH₂ или-SH;
R₄ представляет собой -Н, -О-Х, -N(X)₂ или -S-X;
R₅ представляет собой - Н, -О-Х, N(X)₂ или-S-X;
R₆ представляет собой -CON(X)₂ или СО-Х,
где
Н представляет собой водород;
О представляет собой кислород;
S представляет собой серу;
N представляет собой азот;
X представляет собой Н, алкил или арил.

13. Способ по п. 12, где по меньшей мере два соединения определяются формулой (II).

14. Способ по п. 13, где по меньшей мере два соединения, определяемые формулой (II), являются одинаковыми соединениями.

15. Способ по п. 13, где по меньшей мере два соединения, определяемые формулой (II), являются различными соединениями.

16. Способ по п. 12, где соединения выбраны из группы, состоящей из коричной кислоты, феруловой кислоты, кофейной кислоты, аминокоричной кислоты, или синапиновой кислоты, или их производных.

17. Способ по п. 1, где конъюгат содержит по меньшей мере один остаток тирозина в качестве субстрата фермента.

18. Способ по п. 1, где конъюгаты каждого из по меньшей мере двух соединений, способных выступать в качестве субстратов фермента, связанных с отдельными сайтами-мишенями, отделены друг от друга в конъюгированной молекуле 30 или менее чем 30 последовательно связанными атомами, а определяемая метка отделена от любого из указанных субстратов 30 или более чем 30 последовательно связанными атомами.

19. Способ по п. 18, где по меньшей мере 30 последовательно связанных атомов, отделяющих в конъюгированной молекуле метку от любого субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью, включают от 2 до 10 повторов следующей формулы (III)

где R₁ и R₂ выбраны среди NH и О, a R₃ выбран среди метила, этила, пропила, СН₂ОСН₂ и (СН₂ОСН₂)₂ и где имеется не более трех последовательно повторяющихся этилокси-групп.

20. Способ по п. 1, где второй субстрат представляет собой популяцию одинаковых конъюгированных молекул или популяцию различных конъюгированных молекул, где конъюгированные молекулы являются такими, как указано в любом из пп. 12-19.

21. Способ по п. 1, где способ включает этап (б′), который предшествует этапу (б), где образец инкубировали в водном растворе (ii), который представляет собой водный раствор (i), не содержащий второй субстрат.

22. Способ по п. 1, который включает по меньшей мере один этап промывания.

23. Способ по п. 1, также включающий этап (в), в котором определяются одиночные сайты-мишени (б).

24. Способ по п. 23, где этап (в) включает следующие подэтапы:
в′) инкубацию образца (б), содержащего дискретные депозиты второго субстрата на дискретных одиночных сайтах-мишенях (а), со связывающим агентом, способным специфически связываться с определяемой меткой депонированного второго субстрата, и формирование комплекса, содержащего одну или более чем одну молекулу депонированного второго субстрата и одну или более чем одну молекулу указанного связывающего агента,
(в″) определение в образце (в′) связывающего агента, связанного с дискретными депозитами второго субстрата, тем самым определение одиночных сайтов-мишеней и тем самым определение одиночной единицы мишени, связанной с указанным одиночным сайтом-мишенью.

25. Способ по п. 24, где связывающий агент включает фермент.

26. Способ по п. 24, где связывающий агент содержит определяемую метку, выбранную среди хромогенных, флуоресцентных, люминесцентных или радиоактивных веществ или членов пары специфического связывания.

27. Способ по п. 1, где одиночный дискретный депозит второго субстрата на одиночном сайте-мишени имеет округлую форму и определяется в двумерном поле как визуально различимая точка.

28. Способ по п. 27, где отдельная точка является точкой с диаметром, который составляет примерно 0,4 мкм или более.

29. Способ по п. 1, где мишень является выбранной биологической или химической молекулой-мишенью, частицей, молекулярным или клеточным комплексом, молекулярной или клеточной структурой, вирусом или микроорганизмом либо фрагментом указанной молекулы-мишени, частицы, комплекса, структуры, вируса или микроорганизма.

30. Способ по п. 29, где мишенью является биологический маркер.

31. Способ по п. 1, где отдельная единица мишени выбрана среди отдельной одиночной биологической или химической молекулы, отдельной одиночной частицы, отдельного одиночного молекулярного или клеточного комплекса, отдельной одиночной молекулярной или клеточной структуры, или отдельного одиночного вируса или микроорганизма, или отдельных одиночных фрагментов указанной молекулы, частицы, комплекса, структуры, вируса или микроорганизма.

32. Способ по п. 1, где образец представляет собой биологический, химический или экологический образец.

33. Способ по п. 1, где образец представляет собой гистологический образец.

34. Способ по п. 29, где мишень представляет собой белок или нуклеиновую кислоту, или их фрагмент, или производное.

35. Способ по п. 34, где белок представляет собой клеточный мембранный рецептор, или цитоплазматический белок, или цитоплазматическую нуклеиновую кислоту.

36. Способ по п. 1, включающий один или более чем один этап после любого из определенных этапов.

37. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере один из этапов автоматизирован или который дополнительно включает по меньшей мере один автоматизированный этап.

38. Способ определения отдельных одиночных единиц иммобилизированной мишени в образце, где мишень присутствует в образце в широком динамическом диапазоне концентраций, включающий
а) инкубацию образца с одним или более чем одним связывающим агентом,
где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов включает фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей указанной мишени,
и формирование одного или более чем одного дискретного первого сайта-мишени с первой фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный первый сайт-мишень содержит комплекс из одной отдельной одиночной единицы указанной первой фракционной субпопуляции отдельных одиночных единиц и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент с оксидоредуктазной активностью;
б) инкубацию образца (а) с первым субстратом фермента, связанным с первыми сайтами-мишенями (а), первой популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п. 1, с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях (а);
в) инкубацию образца (б) с раствором перекиси водорода в количестве, достаточном для гашения остаточной активности, связанной с первыми одиночными сайтами-мишенями (а);
г) инкубацию образца (в) с одним или более чем одним связывающим агентом, где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной единицей указанной мишени,
с образованием, таким образом, одного или более чем одного дискретного второго сайта-мишени со второй фракционной субпопуляцией отдельных одиночных единиц мишени, где каждый одиночный дискретный второй сайт-мишень содержит комплекс из одной отдельной единицы указанной второй фракционной субпопуляции отдельных одиночных единиц и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;
д) инкубацию образца (г) с первым субстратом фермента, связанным со вторыми одиночными сайтами-мишенями, второй популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п. 1, с формированием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях (г);
е) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях как первых визуально различимых точек и определение, таким образом, одной или более чем одной отдельной одиночной единицы первой популяции мишени;
ж) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях как вторых визуально различимых точек и определение, таким образом, одной или более чем одной отдельной одиночной единицы второй популяции мишени.

39. Способ по п. 38, где связывающие агенты этапа (а) и этапа (г) являются одним и тем же связывающим агентом.

40. Способ по п. 38, где связывающие агенты (а) и (г) являются различными связывающими агентами.

41. Способ по п. 38, где молекулы второго субстрата первой популяции и молекулы второго субстрата второй популяции являются различными конъюгированными молекулами.

42. Способ по п. 38, где молекулы второго субстрата выбраны среди соединений, определенных в любом из пп. 12-19, а молекулы первого субстрата выбраны среди соединений, определенных в любом из пп. 8-10.

43. Способ по 38, который включает по меньшей мере один дополнительный этап.

44. Способ по п. 38, где образцом является гистологический образец.

45. Способ по п. 38, включающий один или более чем один этап после любого из определенных этапов.

46. Способ по п. 38, в котором по меньшей мере один из этапов автоматизирован, или который дополнительно включает по меньшей мере один автоматизированный этап.

47. Способ визуализации и определения отдельных одиночных единиц по меньшей мере двух различных иммобилизированным мишеней, присутствующих в образце, включающий
а) инкубацию образца с одним или более чем одним связывающим агентом, способным связывать первую мишень, где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной одиночной единицей первой мишени, с образованием, таким образом, одного или более чем одного дискретного первого одиночного сайта-мишени с отдельными одиночными единицами первой мишени, где каждый одиночный дискретный первый сайт-мишень содержит комплекс одной отдельной одиночной единицы первой мишени и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;
б) инкубацию образца (а) с первым субстратом фермента, связанным с первыми одиночными сайтами-мишенями, первой популяцией молекул второго субстрата указанного фермента и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п. 1, с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых одиночных сайтах-мишенях (а);
в) инкубацию образца (б) с раствором перекиси водорода в количестве, достаточном для гашения остаточной активности фермента, связанной с первыми одиночными сайтами связывания (а);
г) инкубацию образца (в) с одним или более чем одним связывающим агентом, способным связываться со второй мишенью, где
(1) по меньшей мере один из связывающих агентов содержит фермент;
(2) по меньшей мере один из связывающих агентов способен непосредственно связываться с отдельной единицей второй мишени, с образованием одного или более чем одного дискретного второго одиночного сайта-мишени с отдельными одиночными единицами второй мишени, где каждый одиночный дискретный второй сайт-мишень содержит комплекс одной отдельной единицы второй мишени и одного или более чем одного связывающего агента, по меньшей мере один из которых содержит фермент;
д) инкубацию образца (г) с первым субстратом, связанным со вторыми отдельными сайтами связывания, второй популяцией молекул второго субстрата фермента с оксидоредуктазной активностью и пероксидным соединением в соответствии с этапом (б) п. 1, с образованием, таким образом, дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях (г);
е) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата первой популяции на первых сайтах-мишенях в качестве первых визуально различимых точек, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной единицы первой мишени;
ж) определение в образце дискретных депозитов молекул второго субстрата второй популяции на вторых сайтах-мишенях в качестве вторых визуально различимых точек и, таким образом, определение одной или более чем одной отдельной одиночной единицы второй мишени.

48. Способ по п. 47, где по меньшей мере две мишени являются различными биологическими молекулами.

49. Способ по п. 47, где по меньшей мере две мишени являются различными нуклеиновокислотными последовательностями или различными белками.

50. Способ по п. 47, где по меньшей мере одна из мишеней является нуклеиновой кислотой, и по меньшей мере одна другая является белком.

51. Способ по п. 47, где молекулы второго субстрата первой популяции и второго субстрата второй популяции являются различными молекулами второго субстрата.

52. Способ по п. 47, где молекулы второго субстрата выбраны среди соединений, определенных в любом из пп. 12-19, а молекулы первого субстрата выбраны среди соединений, определенных в любом из пп. 8-10.

53. Способ по п. 47, который включает по меньшей мере один дополнительный этап.

54. Способ по п. 47, где образцом является гистологический образец.

55. Способ по п. 47, включающий один или более чем один этап, предшествующий любому из определенных этапов.

56. Способ по п. 47, включающий один или более чем один этап после любого из определенных этапов.

57. Способ по п. 47, в котором по меньшей мере один из этапов автоматизирован или который дополнительно включает по меньшей мере один автоматизированный этап.

58. Способ количественной оценки иммобилизированной мишени в образце, включающий
а) обработку образца в соответствии со способом по пп. 1, 38 или 47;
б) подсчет визуально различимых точек в образце; и
в) количественную оценку мишени в образце.

59. Способ по п. 58, где отдельные точки подсчитывают вручную или автоматически.

60. Способ по п. 58 или 59, в котором количество мишени оценивается относительным образом как количество мишени на референсный маркер, объем образца или площадь образца.

61. Способ диагностики заболевания у пациента, включающий: а) этап оценки экспрессии диагностического(их) или терапевтического(их) маркера(ов) на основе оценки содержания отдельных молекул указанных маркеров в образце, полученном от пациента, где оценка экспрессии маркера(ов) осуществляется в соответствии со способом по любому из пп. 1, 38 или 47; и б) этап диагностики заболевания на основе экспрессионных данных указанных диагностического(их) или терапевтического(их) маркера(ов), полученных на этапе а).

62. Способ прогнозирования риска развития заболевания у пациента, включающий: а) этап оценки экспрессии диагностического(их) или терапевтического(их) маркера(ов) на основе оценки содержания отдельных молекул указанных маркеров в образце, полученном от пациента, где оценка экспрессии маркера(ов) осуществляется в соответствии со способом по любому из пп. 1, 38 или 47; и б) этап прогнозирования риска развития заболевания на основе экспрессионных данных указанных диагностического(их) или терапевтического(их) маркера(ов), полученных на этапе а).

63. Способ оценки эффективности терапевтического лечения у пациента, включающий: а) этап оценки экспрессии диагностического(их) или терапевтического(их) маркера(ов) на основе оценки содержания отдельных молекул указанных маркеров в образце, полученном от пациента, где оценка экспрессии маркера(ов) осуществляется в соответствии со способом по любому из пп. 1, 38 или 47; и б) этап оценки эффективности терапевтического лечения на основе экспрессионных данных указанных диагностического(их) или терапевтического(их) маркера(ов), полученных на этапе а).