Гуманизированные антитела к амилоиду бета

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложено гуманизированное антитело и его фрагмент, способные специфически связывать бета-амилоид, охарактеризованные фрагментами последовательностей на основе антитела мыши 8F5, и Fc-областью человеческого IgG1, содержащей аминокислотную замену D265A; а также кодирующая нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, продуцирующие антитело или его фрагмент клетки, способ продуцирования антитела или его фрагмента; композиция, применение антитела и его фрагмента для изготовления лекарственного средства, способ предупреждения, лечения или облегчения эффектов амилоидоза; способ диагностики амилоид-ассоциированных заболеваний или состояний, способ определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек и тест-набор для выявления и диагностики амилоид-ассоциированных бляшек. Предложенное антитело обладает способностью специфически связываться с мономерами бета-амилоида и высокомолекулярными полимерами бета-амилоида, что может найти применение в терапии амилоидозов. 12 н. и 17 з.п. ф-лы, 20 ил., 6 табл., 16 пр.

 

Перекрестные сведения на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основе предварительной заявки на патент США US 60/943509, поданной 12 июня 2007 г., которая включена в настоящее изобретение в виде ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для диагностики и лечения амилоидозов - группы заболеваний и расстройств, связанных с амилоидным белком, например болезни Альцгеймера.

Амилоидоз означает не единственное заболевание, а разнородную группу прогрессирующих процессов, отличающихся внеклеточными тканевыми отложениями восковидного крахмалоподобного белка, называемого амилоидом, который накапливается в одном или нескольких органах или системах организма. По мере накопления отложений амилоида, они начинают мешать нормальному функционированию органа или системы организма. Имеется по меньшей мере 15 разных типов амилоидоза. Основными формами являются первичный амилоидоз без известных предшествующих проявлений заболевания, вторичный амилоидоз, проявляющийся после некоторого другого болезненного состояния, и наследственный амилоидоз.

Вторичный амилоидоз формируется во время хронической инфекции или воспалительного заболевания, например, туберкулеза, бактериальной инфекции, называемой семейной средиземноморской лихорадкой, костных инфекций (остеомиелитов), ревматоидного артрита, воспаления тонкой кишки (грануломатозного илеита), болезни Ходжкина и лепры.

К амилоидным отложениям относятся пентагональный компонент Р амилоида (amyloid pentagonal - АР), гликопротеин, близкий к нормальному сывороточному амилоиду Р (serum amyloid Р - SAP), и сульфатированные глюкозаминогликаны (glycosaminoglycans - GAG), сложные углеводы соединительной ткани. Амилоидные белковые фибриллы, которые составляют примерно до 90% амилоидного материала, представляют один из нескольких различных типов белков. Эти белки способны складываться в так называемые «бета-складчатые» плоские фибриллы - уникальную белковую конфигурацию, которая имеет сайты связывания для красителя Конго красного, и в результате возникает уникальное для амилоидного белка свойство - окрашивание.

Многие возрастные заболевания основаны или связаны с белками амилоидного типа и В частности, характеризуются накоплением внеклеточных отложений амилоида или амилоидо-подобного материала, который участвует в патогенезе, а также в прогрессировании заболевания. К таким заболеваниям относятся, но ими не ограничиваются, неврологические заболевания, например, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам. К другим заболеваниям, которые связаны с белками амилоидного типа, относятся прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна.

Хотя патогенез этих заболеваний может быть различным, свойственные им отложения часто содержат много общих молекулярных составляющих. В значительной степени это может быть связано с локальной активацией провоспалительных метаболических путей, ведущих к сопутствующему отложению активированных компонентов комплемента, тем самым, приводя к сопутствующему отложению активированных компонентов комплемента, компонентов острой фазы, иммунных модуляторов и других медиаторов воспаления (McGeer и др., 1994).

Болезнь Альцгеймера (БА) является нейрологическим расстройством, предположительно вызываемым амилоидными бляшками, накоплением нарушенного отложения белков в мозге. Наиболее часто тип амилоида, обнаруженного в мозге больных, преимущественно состоит из фибрилл Aβ. Научное подтверждение заключается в том, что повышение выработки и накопления бета-амилоидного белка в бляшках приводит к отмиранию нервных клеток, которое влияет на развитие и прогрессирование БА. Утрата нервных клеток в стратегически важных участках мозга в свою очередь вызывает снижение содержания нейротрансмитеров и ухудшает память. К белкам, играющим основную роль в формировании бляшек, относятся амилоидный белок-предшественник (amyloid precursor protein - АРР) и два презенилина (презенилин I и презенилин II). Последующее расщепление амилоидного белка-предшественника (АРР), который экспрессируется конститутивно и подвергается катаболизму в большинстве клеток, ферментами β и γ секретазами приводит к высвобождению пептида Аβ, включающего от 39 до 43 аминокислот.Разрушение белков АРР вероятно повышает их предрасположенность агрегировать в бляшки. Особенно это относится к фрагменту Аβ(1-42), который имеет высокую предрасположенность к связыванию агрегатов из-за двух в высокой степени гидрофобных аминокислотных остатков по С-концу. Поэтому предполагают, что фрагмент Аβ(1-42) преимущественно вовлечен и ответственен за инициацию формирования старческих бляшек у больных БА, и соответственно обладает высоким патологическим потенциалом. Таким образом, существует потребность в агентах для предупреждения формирования амилоидных бляшек и растворения имеющихся бляшек у больных БА.

Симптомы болезни Альцгеймера проявляются медленно, и первым симптомом может быть небольшая забывчатость. На этой стадии индивидуумы могут забывать недавние события, поступки, имена знакомых людей или названия предметов и могут быть не в состоянии решить простые математические задачи. По мере прогрессирования заболевания симптомы становятся более заметными и достаточно серьезными, чтобы больные БА или их родственники стали обращаться за медицинской помощью. На средней стадии БА к симптомам относятся утрата способности выполнять простые задачи, например, поддержание личной гигиены, и проблемы, связанные с речью, пониманием, чтением или письмом. Пациенты на последующей стадии БА могут пребывать в состоянии обеспокоенности или агрессии, могут уйти из дома, а также могут полностью нуждаться в уходе.

В настоящее время единственным точным способом диагностики БА является идентификация бляшек и сплетений в ткани мозга при аутопсии после смерти индивидуума. Следовательно, врачи могут диагностировать БА только «приблизительно» или «примерно» при жизни пациента. С помощью современных методов врачи могут с точностью диагностировать БА до 90% случаев, используя некоторые средства для диагностики «возможной» БА. Врачи проводят опрос об общем состоянии здоровья пациента, перенесенных заболеваниях, а также о появлении каких-либо осложнений в быту. Поведенческое тестирование памяти, решения задач, внимания, счета и речи дают информацию о когнитивном вырождении, а медицинские анализы, например, крови, мочи, спинномозговой жидкости и сканирование мозга, могут предоставить некоторую дополнительную информацию.

Поддержание состояния пациентов с БА заключается в медицинском и немедицинском уходе. Способы лечения, направленные на изменение течения болезни (откладывая или ревертируя ее прогрессирование) до настоящего времени почти совсем неэффективны. Было показано, что лекарственные средства, которые восстанавливают недостаточность (дефицит) или нарушенное действие химических посредников нервных клеток (нейротрансмиттеров), В частности, ингибиторов холинэстеразы (cholinesterase inhibitor - ChEI), например, такрин и ривастигмин, проявляют улучшение симптомов. Ингибиторы ChEI препятствуют ферментативному разрушению нейротрансмитеров, тем самым, повышая содержание химических посредников, способных передавать нервный сигнал в мозг.

У некоторых людей на ранних и средних стадиях заболевания лекарственные средства такрин (продукт COGNEX®, Morris Plains, NJ), донепезил (продукт ARICEPT®, Токия, Япония), ривастигмин (продукт EXELON®, Восточный Гоновер, Нью-Джерси) или галантамин (продукт REMINYL®, Нью-Брунсвик, Нью-Джерси) могут помочь предупредить наихудшее проявление некоторых симптомов в течение ограниченного периода времени. Другое лекарственное средство, мемантин (продукт NAMENDA®, Нью-Йорк, Нью-Йорк), было одобрено для лечения БА, проявляющейся в формах от умеренных до тяжелых. Медикаментозные средства также применимы для лечения психиатрических проявлений БА. Кроме того, некоторые медикаментозные средства могут способствовать контролю поведенческих симптомов при БА, например, бессонницы, беспокойства, блуждания, состояния тревоги и депрессии. Лечение этих симптомов часто облегчает существование больных, делая его более комфортабельным, и облегчает уход за ними для персонала. К сожалению, несмотря на существенные преимущества лечения, показавшего, что агенты этого класса стабильно лучше плацебо, болезнь продолжает прогрессировать и обычное воздействие на ментальное функционирование проявляется умеренно. Многие лекарственные средства, используемые для лечения БА, например, ChEI, также обладают побочными эффектами, к которым относятся желудочно-кишечные расстройства, печеночная токсичность и потеря массы тела.

Другим заболеванием, связанным или основанным на накоплении и отложении белка типа амилоида, является дегенерация желтого пятна.

Дегенерация желтого пятна представляет распространенное заболевание, при котором происходит повреждение желтого пятна, являющегося центральной областью сетчатки (ткани, толщиной с лист бумаги в задней части глаза, из которой светочувствительные клетки посылают зрительные сигналы в мозг). Острое, четкое, «прямое» зрение перерабатывается желтым пятном. Повреждение желтого пятна приводит к развитию слепых пятен и расплывчатому или искаженному восприятию. Возрастная дегенерация желтого пятна (ВДЖП) представляет основную причину ухудшения зрения в США, а для людей старше 65 лет она представляет основную причину развития практической (гражданской) слепоты среди представителей европеоидной расы. Примерно 1,8 миллионов американцев в возрасте 40 лет и старше, имеющие продвинутую форму ВДЖП, и другие 7,3 миллионов американцев, имеющие промежеточную форму ВДЖП, подвержены значительному риску потери зрения. По оценке правительства к 2020 году у 2,9 миллионов людей будет продвинутая форма ВДЖП. Жертвы ВДЖП часто удивляются и расстраиваются, узнав, что о причинах слепоты и ее лечении известно слишком мало.

Имеется две формы дегенерации желтого пятна: сухая дегенерация желтого пятна и влажная дегенерация желтого пятна. Сухая форма, при которой клетки желтого пятна начинают медленно разрушаться, диагностируют в 85% случаев дегенерации желтого пятна. Оба глаза обычно поражены сухой формой ВДЖП, хотя один глаз может потерять зрение при сохранности второго глаза. Старческие бляшки, которые представляют желтые отложения под сетчаткой, обычно представляют ранние симптомы сухой формы ВДЖП. Риск развития продвинутой сухой формы ВДЖП или влажной формы ВДЖП повышается по мере увеличения числа или размера старческих бляшек. Сухая форма ВДЖП может прогрессировать и вызвать потерю зрения без перехода к влажной форме заболевания, однако также возможен для ранней стадии сухой формы ВДЖП внезапный переход во влажную форму.

Влажная форма, хотя она встречается только в 15% случаев, в 90% приводит к слепоте, и рассматривается в виде продвинутой формы ВДЖП (нет ранней или промежуточной стадии у влажной формы ВДЖП). Влажной форме ВДЖП всегда предшествует сухая форма заболевания. По мере ухудшения сухой формы у некоторых людей начинается патологический рост кровеносных сосудов за желтым пятном. Эти сосуды очень хрупкие, и могут быть кровотечения (отсюда «влажная» дегенерация желтого пятна), вызывающие быстрое разрушение желтого пятна.

Сухая форма ВДЖП может в начальной стадии часто вызывать слегка расплывчатое зрение. Центр изображения В частности, затем может стать расплывчатым, и эта область разрастается по мере прогрессирования заболевания. Симптомы могут остаться незамеченными, если поражен только один глаз. При влажной форме ВДЖП прямые линии могут казаться волнистыми, а утрата центрального зрения может происходить быстро.

Диагностика дегенерации желтого пятна обычно включает расширенный анализ глаз, используя метод, называемый фундоскопией, который способствует диагностике ВДЖП, и, если предполагается влажная форма ВДЖП, также могут проводить флуоресцентную ангиографию. Если сухая форма ВДЖП достигает продвинутых стадий, в настоящее время нет лечения для предупреждения потери зрения. Однако специфические высокие дозы формулы антиоксидантов и цинка могут отсрочить или предупредить промежуточную стадию ВДЖП от прогрессирования до продвинутой стадии. Продукт Macugen® (инъекция пегаптаниба натрия), коагуляция лазером и фотодинамическая терапия могут контролировать патологический рост кровеносных сосудов и кровотечение в желтом пятне, что полезно для некоторых людей с влажной формой ВДЖП, однако, такими способами утраченное зрение восстановить нельзя. Если зрение уже утрачено, существует мало средств, которые могут помочь улучшить качество жизни.

Одним из ранних признаков возрастной дегенерации желтого пятна (ВДЖП) является накопление внеклеточных отложений, известных под названием «старческих бляшек», между базальным слоем пигментированного эпителия сетчатки (retinal pigmented epithelium - RPE) и базальной пластинки, также называемой оболочкой Бруха (Bruch's membrane - ВМ). Предшествующие исследования, выполненные Anderson и др., подтвердили, что старческие бляшки содержат амилоид бета (Experimental Eye Research 78, 2004, cc.243-256).

Современные исследования продолжают исследовать факторы внешней среды, генетические факторы и факторы питания, которые могут содействовать ВДЖП. Также исследуются новые стратегии лечения, включая трансплантаты клеток сетчатки, лекарственные средства, которые могут предупредить или понизить прогрессирование заболевания, радиационную терапию, генную терапию, имплантацию компьютерного чипа в сетчатку, которые могут помочь стимулировать зрение, и агенты, которые могут предупредить рост новых кровеносных сосудов под желтым пятном.

Важным фактором, который рассматривают при разработке новых лекарственных средств, является легкость применения пациентами, для которых они предназначены. Средства доставки пероральных лекарственных средств, особенно таблетки, капсулы и мази, составляют до 70% от всех потребляемых лекарственных форм, поскольку они удобнее для пациентов. Разработчики лекарственных средств полагают, что пациенты предпочитают пероральное введение в большей степени, чем инъекции или другие более инвазивные формы медикаментозного введения. Также предпочтительны составы, с увеличенными интервалами дозирования (т.е. раз в сутки или составы устойчивого высвобождения). Простота введения антибиотиков в пероральной лекарственной форме приводит к повышению соблюдения пациентом режима и схемы лечения.

Необходимы эффективные способы и композиции для предупреждения или выявления осложнения, связанного с амилоидозом, группой заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна. В частности, необходимы агенты, способные противодействовать физиологическим проявлениям заболевания, например, формированию бляшек, ассоциированных с агрегированием волокон амилоида или амилоидоподобного пептида.

Сообщалось, что антиамилоидные антитела, возникшие в результате инокуляции амилоидом Аβ_1-42, смешанным с полным или неполным адъювантом Фройнда, снижают амилоидную нагрузку у трансгенных мышей, связанную с болезнью Альцгеймера человека (Schenk и др., 1999). Внутрибрюшинное введение тетрапальмитоилированного Аβ_1-16, помещенного в липосомы, трансгенным мышам NORBA, высвобождает существенные титры антиамилоидных антител, о которых сообщалось, что они растворяют амилоидные волокна и бляшки in vitro и in vivo (Nicolau и др., 2002).

Возможный механизм, с помощью которого происходит растворение амилоидных бляшек и волокон, впервые был предложен Bard и др. (2000), которые заключили, что опсонизированные антителами бляшки были последовательно разрушены макрофагами микроглии. De Mattos и др. (2001) установили, что моноклональное антитело, направленное против центрального домена β-амилоида, способно связывать и полностью изолировать амилоид плазмы. Они пришли к заключению, что наличие моноклональных антител в кровеносном русле смещает баланс Аβ между мозгом и плазмой, способствую периферическому очищению и катаболизму вместо отложения в мозге.

Пролонгированное лечение человека антителами грызунов может привести к антиглобулиновому ответу, который выявляется примерно на 8-12 сутки после введения и достигает пика примерно на 20-30 сутки. Если такой антиглобулиновый ответ возникает, лечение должно быть прервано после не более чем примерно 10 суток, и возобновление лечения на более поздний срок обычно не допускают, поскольку оно может привести к быстрому началу вторичного антиглобулинового ответа. Хотя антитела грызунов разделяют в значительной степени консервативную последовательность с антителами человека, имеется много отличий в последовательностях у антител грызунов и людей, достаточных для того, чтобы антитела грызунов были иммуногенными для людей.

Эта проблема может быть преодолена выработкой антител непосредственно у людей или созданием «гуманизированных» антител (также называемых «переформированными» антителами). Гуманизированные антитела имеют аминокислотную последовательность вариабельной области, которая содержит полученные от грызунов области CDR, вкрапленные в последовательности каркасных участков человека, или последовательности, близкие к ним. Поскольку специфичность гуманизированного антитела обеспечивается полученными от грызунов областями CDR, их остатки используют в существенной степени неизменными, всего лишь с минорными модификациями, являющимися допустимыми, которые существенно не влияют на сродство и специфичность антитела в отношении его целевого антигена. Остатки каркасного участка могут быть получены от примата, или особенно от какой-либо вариабельной области человека, или могут быть их комбинацией, и получаемая сконструированная вариабельная область может быть существенно перегруппирована.

Для максимизации вероятности того, что сродство будет сохранено у заново собранного антитела, важно произвести правильный отбор каркасной области. Известно, что последовательности каркасных участков способствуют поддержанию областей CDR в их точной пространственной ориентации для взаимодействия с антигеном, и что остатки каркасных участков могут иногда даже участвовать в связывании антигена. Для поддержания сродства антитела с его антигеном полезно выбрать последовательности каркасных участков человека, которые наиболее близки последовательностям каркасных участков грызунов. Кроме того, может понадобиться заместить одну или несколько аминокислот в последовательности каркасного участка человека соответствующим остатком в каркасном участке грызуна, чтобы избежать утраты сродства. Такому замещению может способствовать компьютерное моделирование.

Настоящее изобретение предусматривает новые способы и композиции, включающие высоко специфичные и высоко эффективные антитела, особенно химерные антитела, включая их фрагменты, более предпочтительно частично или полностью гуманизированные антитела, включая их фрагменты, способные специфически распознавать и связывать специфические эпитопы разных β-амилоидных антигенов, которые могут быть презентированы антителу в мономерной, двухмерной, трехмерной и т.д. полимерной форме, в форме агрегата, волокон, филаментов или в конденсированной форме бляшки. Антитела по настоящему изобретению особенно применимы для лечения амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, множественный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна, а также многие другие.

Краткое описание изобретения

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному антителу или его фрагменту, или к гуманизированному антителу или его фрагменту, которые распознают и связываются по меньшей мере с одним отдельным сайтом связывания, особенно по меньшей мере с двумя разными сайтами связывания, и более предпочтительно по меньшей мере с тремя разными сайтами связывания на β-амилоидном белке, причем указанный один, указанные по меньшей мере два и указанные по меньшей мере три сайта связывания каждый включают по меньшей мере один или два последовательно расположенных аминокислотных остатка, участвующих в связывании антитела.

В частности, химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению связывает по меньшей мере два, особенно по меньшей мере три разных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем по меньшей мере два из трех разных сайтов связывания включают по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка, предпочтительно участвующих в связывании антитела и по меньшей мере один из трех по разному связывающих сайта включает по меньшей мере один аминокислотный остаток.

По меньшей мере два разных сайта связывания, включающие по меньшей мере два последовательных аминокислотных остатка, преимущественно вовлеченных в связывание антитела, локализованы в тесной близости друг к другу на антигене, разделенные и/или фланкированные по меньшей мере одним аминокислотным остатком, не участвующим в связывании антитела, или на существенно меньшем расстоянии по сравнению с указанными по меньшей мере двумя последовательными аминокислотными остатками, таким образом, формируя конформационный прерывистый эпитоп.

По меньшей мере три разные сайты связывания, включающие по меньшей мере два последовательных аминокислотных остатка и по меньшей мере один аминокислотный остаток, соответственно, которые преимущественно участвуют в связывании антитела, локализованы в тесной близости друг к другу на эпитопе, разделены и/или фланкированы по меньшей мере одним аминокислотным остатком, не участвующим в связывании антитела, или существенно меньшей протяженности по сравнению с аминокислотными остатками, которые преимущественно вовлечены в связывании антитела, таким образом формируя конформационный прерывистый эпитоп.

В частности, предусмотрены химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которые распознают и связывают по меньшей мере один отличающийся сайт, особенно по меньшей мере два разных сайта связывания, более предпочтительно по меньшей мере три разных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем указанный по меньшей мере один, или указанные по меньшей мере два разных сайта связывания каждый включает по меньшей мере два последовательных аминокислотных остатка, предпочтительно вовлеченных в связывание антитела, причем по меньшей мере двумя последовательными аминокислотными остатками, представляющими первый сайт связывания, являются -Phe-Phe-, встроенный в коровую последовательность (SEQ ID NO:9):

Хаа₃-Phe-Phe-Хаа₄-Хаа₅-Хаа₆, в которой

Хаа₃ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile,

Хаа₄ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, Ser и Ile,

Хаа₅ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp,

Хаа₆ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, причем указанные аминокислотные остатки Хаа₃ Хаа₄ Хаа₅ и Хаа₆ не участвуют в связывании антитела или в существенно меньшей степени по сравнению с сайтом связывания -Phe-Phe-.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, в которых

Хаа₃ обозначает Val или Leu, но особенно Val,

Хаа₄ обозначает Ala или Val, но особенно Ala,

Хаа₅ обозначает Glu или Asp, но особенно Glu,

Хаа₆ обозначает Glu или Asp, но особенно Asp.

В частности, предусмотрены химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которые распознают и связывают по меньшей мере один отличающийся сайт, особенно по меньшей мере два разных сайта связывания, более предпочтительно по меньшей мере три разных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем указанные отличающиеся сайты связывания включают по меньшей мере один и по меньшей мере два последовательных аминокислотных остатка, соответственно, преимущественно участвующие в связывании антитела, причем по меньшей мере двумя последовательно расположенными аминокислотными остатками, представляющими первый сайт связывания, являются -Phe-Phe-, и по меньшей мере одним аминокислотным остатком является -His-, встроенный в следующую коровую последовательность:

- Xaa₁-His-Хаа₃-Хаа₄-Хаа₅-Хаа₆-Phe-Phe-Хаа₇-Xaa₈-Xaa₉-,

в которой

Xaa₁ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из His, Asn, Gln, Lys и Arg

Хаа₃ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn и Gln

Хаа₄ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из His, Asn, Gln, Lys и Arg

Хаа₅ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, Ser и Ile,

Хаа₆ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile

Хаа₇ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu и Ile,

Xaa₈ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp,

Хаа₉ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, причем аминокислотные остатки Xaa₁, Хаа₃, Хаа₆, Хаа₇, Хаа₈ и Хаа₉ не участвуют в связывании антитела или в меньшей или существенно меньшей степени по сравнению с -His- и the -Phe-Phe- сайтом связывания, соответственно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, в которых

Хаа₃ обозначает Gln или Asn, но особенно Gln,

Хаа₄ обозначает Lys

Хаа₅ обозначает Leu

Хаа₆ обозначает Val или Leu, но особенно Val,

Хаа₇ обозначает Ala или Val, но особенно Ala,

Xaa₈ обозначает Glu или Asp, но особенно Glu, и

Хаа₉ обозначает Asp или Glu, но особенно Asp.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которое распознает и связывает по меньшей мере один отличный сайт связывания, особенно по меньшей мере два отличных сайта связывания, более предпочтительно по меньшей мере три отличных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем указанный по меньшей мере один или указанные по меньшей мере два отличных сайта связывания каждый включают по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка, предпочтительно участвующих в связывании антитела, причем по меньшей мере двумя последовательно расположенными аминокислотными остатками, представляющими второй сайт связывания, являются -Lys-Leu-, встроенный в следующую коровую последовательность (SEQ ID NO:10):

Xaa₁-Хаа₂-Lys-Leu-Хаа₃ в которой

Xaa₁ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из His, Asn, Gln Lys и Arg,

Хаа₂ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn и Gln,

Хаа₃ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile, причем указанные аминокислотные остатки Хаа₂, Хаа₃, не участвуют в связывании антитела или в меньшей или в существенно меньшей степени по сравнению с сайтом связывания -Lys-Leu-.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которое распознает и связывает по меньшей мере один отличный сайт связывания, особенно по меньшей мере два отличных сайта связывания, более предпочтительно по меньшей мере три отличных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем указанные отличные сайты связывания включают по меньшей мере один, по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка, соответственно, преимущественно участвующие в связывании антитела, причем по меньшей мере одним и по меньшей мере двумя последовательно расположенными аминокислотами, которые разделены по меньшей мере одним аминокислотным остатком, не участвующим в связывании антитела или участвующим в существенно меньшей степени по сравнению с аминокислотными остатками, преимущественно участвующими в связывании антитела, являются -His- и -Lys-Leu-, соответственно, встроенный в следующую коровую последовательность:

His-Хаа₂-Lys-Leu-Хаа₃-Хаа₄-Хаа₅-Хаа₆-Хаа₇-Xaa₈- в которой

Xaa₂ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn и Gln,

Хаа₃ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile,

Хаа₄ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile,

Хаа₅ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile,

Хаа₆ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, Ser и Ile,

Хаа₇ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp,

Xaa₈ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp,

причем указанные аминокислотные остатки Хаа₂, Хаа₃, Хаа₆, Хаа₇, Xaa₈ не участвуют в связывании антитела, или участвуют в меньшей или существенно меньшей степени по сравнению с -His- и -Lys-Leu- сайтом связывания, соответственно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, причем

Хаа₂ обозначает Gln или Asn, но особенно Gln,

Хаа₃ обозначает Val или Leu, но особенно Val,

Хаа₄ обозначает Phe,

Хаа₅ обозначает Phe,

Хаа₆ обозначает Ala или Val, но особенно Ala,

Хаа₇ обозначает Glu или Asp, но особенно Glu, и

Xaa₈ обозначает Asp или Glu, но особенно Asp.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которое распознает и связывает по меньшей мере два отличных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем указанные по меньшей мере два отличных сайта связывания каждый включают по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка, преимущественно участвующих в связывании антитела, причем по меньшей мере две последовательно расположенные аминокислоты разделены, по меньшей мере, одним аминокислотным остатком, не участвующим в связывании антитела, или участвующим в существенно меньшей степени по сравнению с указанными последовательно расположенными аминокислотными остатками, которыми являются -Phe-Phe- и -Lys-Leu- соответственно, представляющие первый и второй сайт связывания, встроенный в следующую коровую последовательность:

Xaa₁-Хаа₂-Lys-Leu-Хаа₃-Phe-Phe-Хаа₄-Хаа₅-Хаа₆, причем

Xaa₁ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из His, Asn, Gln, Lys и Arg,

Хаа₂ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn и Gln,

Хаа₃ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile,

Хаа₄ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, Ser и Ile,

Хаа₅ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp,

Хаа₆ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, причем указанные аминокислотные остатки Хаа₂, Хаа₃, Хаа₄ Хаа₅ и Xaa₆ are не участвуют в связывании антитела, или участвуют в меньшей степени или в существенно меньшей степени по сравнению с -Lys-Leu-и -Phe-Phe- сайтом связывания соответственно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которое распознает и связывает по меньшей мере один отличный сайт связывания, особенно по меньшей мере два отличных сайта связывания, более предпочтительно по меньшей мере три отличных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем указанные отличные сайты связывания включают по меньшей мере один и по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка, соответственно, преимущественно участвующих в связывании антитела, причем по меньшей мере один и по меньшей мере две последовательно расположенные аминокислоты разделены, по меньшей мере, одним аминокислотным остатком, не участвующим в связывании антитела, или участвующим в существенно меньшей степени по сравнению с аминокислотными остатками, которые преимущественно участвуют в связывании антитела, причем указанными аминокислотными остатками являются -Phe-Phe- и -Lys-Leu-, соответственно, представляющие первый и второй сайт связывания, встроенный в следующую коровую последовательность:

His-Xaa₂-Lys-Leu-Хаа₃-Phe-Phe-Хаа₄-Хаа₅-Хаа₆, в которой

Хаа₂ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn и Gln,

Хаа₃ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile,

Хаа₄ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, Ser и Ile,

Хаа₅ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp,

Хаа₆ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, причем указанные аминокислотные остатки Хаа₂, Хаа₃, Хаа₄, Хаа₅ Хаа₆ не участвуют в связывании антитела или в меньшей или существенно меньшей степени по сравнению с -His-, -Lys-Leu- и -Phe-Phe- сайтом связывания соответственно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, причем

Хаа₂ обозначает Gln или Asn, но особенно Gln,

Хаа₃ обозначает Val или Leu, но особенно Val,

Хаа₄ обозначает Ala или Val, но особенно Ala,

Хаа₅ обозначает Glu или Asp, но особенно Glu, и

Хаа₆ обозначает Asp или Glu, но особенно Asp.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которое распознает и связывает по меньшей мере два отличных сайта на β-амилоидном белке, причем указанные по меньшей мере два отличных сайта связывания включают по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка соответственно, преимущественно участвующих в связывании антитела, причем по меньшей мере две последовательно расположенные аминокислоты разделены, по меньшей мере, одним аминокислотным остатком, не участвующим в связывании антитела, или участвующим в существенно меньшей степени по сравнению с аминокислотными остатками, которыми являются -Phe-Phe- и -Lys-Leu- соответственно, представляющие первый и второй сайт связывания, встроенные в следующую коровую последовательность:

Xaa₁-Хаа₂-Lys-Leu-Хаа₃-Phe-Phe-Xaa₄-Хаа₅-Хаа₆, в которой

Xaa₁ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из His, Asn, Gln, Lys и Arg,

Xaa₂ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn и Gln,

Хаа₃ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Val, Ala, Leu, Met, Phe, норлейцина и Ile,

Xaa₄ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu и Ile,

Хаа₅ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp,

Хаа₆ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, причем указанные аминокислотные остатки Хаа₂, Хаа₃, Xaa₄, Хаа₅, Хаа₆ не участвуют в связывании антитела или участвуют в меньшей или существенно меньшей степени по сравнению с -Lys-Leu- и the -Phe-Phe сайтом связывания соответственно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, причем

Xaa₁ обозначает His или Arg, но особенно His,

Хаа₂ обозначает Gln или Asn, но особенно Gln,

Хаа₃ обозначает Val или Leu, но особенно Val,

Xaa₄ обозначает Ala или Val, но особенно Ala,

Хаа₅ обозначает Glu или Asp, но особенно Glu, и

Хаа₆ обозначает Asp или Glu, но особенно Asp.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которое распознает и связывает по меньшей мере два отличных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем указанные по меньшей мере два отличных сайта связывания каждый включают по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка, преимущественно участвующих в связывании антитела, которыми являются -Phe-Phe-Ala-Glu-, особенно -Phe-Phe-Ala-, более предпочтительно -Phe-Phe- и -Lys-Leu-, соответственно, причем указанные по меньшей мере два отличных сайта связывания проявляют аминокислотную последовательность -Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-, представленную в SEQ ID NO:7, и аминокислотную последовательность His-Gln-Lys-Leu-Val-, представленную в SEQ ID NO:8 соответственно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которое распознает и связывает по меньшей мере один отличный сайт связывания, особенно по меньшей мере два отличных сайта связывания, более предпочтительно по меньшей мере три отличных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем указанные по меньшей мере один или указанные по меньшей мере два отличных сайта связывания включают по меньшей мере один и по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка, соответственно, преимущественно участвующих в связывании антитела, которыми являются -Phe-Phe- и -Lys-Leu-, и -His-, соответственно, причем указанные отличные сайты связывания встроены в аминокислотную последовательность -Val-Phe-Phe-Ala-Glu-, и аминокислотную последовательность -His-Gln-Lys-Leu-Val- соответственно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, включает сайт распознавания и связывания антигена, который распознает и связывает по меньшей мере два отличных сайта связывания на β-амилоидном белке, причем указанные по меньшей мере два отличных сайта связывания каждый включает по меньшей мере два последовательных аминокислотных остатка в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NOs: 7 и 8 соответственно, причем указанные последовательные аминокислотные остатки, особенно -Phe- Phe- и -Lys-Leu-, являются преимущественно вовлеченными в связывание β-амилоидного белка.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сайты распознавания и связывания, описанные выше в настоящем изобретении, формируют конформационный прерывистый эпитоп, локализованный в области β-амилоидного белка между аминокислотными остатками с 12 по 24, особенно между аминокислотными остатками 14-23, более предпочтительно между аминокислотными остатками 14-20, причем по меньшей мере два отличных сайта распознавания и связывания каждый включает по меньшей мере 2 аминокислотных остатка, расположенных в положениях 16 и 17 и в положениях 19 и 20 соответственно, причем по меньшей мере один отличный сайт распознавания и связывания, включающий по меньшей мере 1 аминокислотный остаток, локализованный в положении 14, эти остатки преимущественно участвуют в связывании β-амилоидного белка, причем указанные сайты распознавания и связывания по меньшей мере с одной стороны фланкированы аминокислотными остатками, преимущественно остатками 21 и 22, и разделены одним аминокислотным остатком, локализованным в положениях 15 и 18, эти аминокислотные остатки непосредственно не участвуют в связывании антигена, или по меньшей мере участвуют в существенно меньшей степени.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанные по меньшей мере три отличных сайта распознавания и связывания фланкированы по обеим сторонам аминокислотными остатками, особенно остатками 12 и 13, и остатками 21 и 22 и разделены одним аминокислотным остатком, локализованным в положениях 15 и 18, эти аминокислотные остатки непосредственно не участвуют в связывании антигена, или по меньшей мере участвуют в существенно меньшей степени.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные последовательно расположенные аминокислотные остатки, особенно -Lys-Leu- в положении 16 и 17 и -Phe-Phe- в положении 19 и 20, которые преимущественно участвуют в связывании β-амилоидного белка, встроены в следующую коровую область:

Val-	His-	His-	Gln-	Lys-	Leu-	Val-	Phe-	Phe-	Ala-	Glu-	Asp
12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные аминокислотные остатки, особенно -Lys-Leu- в положении 16 и 17 и -Phe-Phe- в положении 19 и 20, и -His- в положении 14, которые преимущественно участвуют в связывании β-амилоидного белка, встроены в следующую коровую область:

Val-	His-	His-	Gln-	Lys-	Leu-	Val-	Phe-	Phe-	Ala-	Glu-	Asp-	Val-	Gly-
12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело или его фрагмент, который включает в вариабельной области легкой и тяжелой цепи, соответственно, по меньшей мере одну область CDR, происходящую не от человека, особенно две области CDR, происходящие не от человека, более предпочтительно три области CDR, происходящие не от человека, встроенные в одну или несколько областей каркасных участков, полученных от человека или примата, и необязательно константную область, происходящую от антитела человека или примата, причем гуманизированное антитело или его фрагмент способны специфически распознавать и связывать β-амилоидный белок, особенно β-амилоидный мономерный пептид, более предпочтительно β-амилоидный полимерный пептид, еще более предпочтительно β-амилоидные волокна, фибриллы или филаменты отдельно или в качестве части β-амилоидной бляшки, по эпитопу, включающему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:11):

Xaa₁-Хаа₂-Lys-Leu-Хаа₃-Phe-Phe-Xaa₄_Xaa₅_Хаа₆, в которой

Xaa₁ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из His, Asn, Gln, но особенно His,

Хаа₂ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn и Gln, но особенно Gln, и

Хаа₃ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Val, Leu и Ile, но особенно Val,

Хаа₄ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala и Val, но особенно Ala,

Хаа₅ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, но особенно Glu,

Хаа₆ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, но особенно Asp.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело или его фрагмент, которое включает в вариабельной области легкой и тяжелой цепи, соответственно, по меньшей мере одну область CDR, происходящую не от человека, особенно две области CDR, происходящие не от человека, более предпочтительно три области CDR, происходящие не от человека, встроенные в одну или несколько областей каркасного участка, происходящих от человека или примата, и необязательно константную область, происходящую от антитела человека или примата, причем гуманизированное антитело или его фрагмент способно специфически распознавать и связывать β-амилоидный белок, особенно β-амилоидный мономерный пептид, более предпочтительно β-амилоидный полимерный пептид, еще более предпочтительно β-амилоидные волокна, фибриллы или филаменты отдельно или в качестве составляющей β-амилоидной бляшки, по эпитопу, включающему следующую аминокислотную последовательность:

His-Xaa₂-Lys-Leu-Хаа₃-Phe-Phe-Хаа₄_Xaa₅_Хаа₆, причем

Хаа₂ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn и Gln, но особенно Gln, и

Хаа₃ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Val, Leu, и Ile, но особенно Val,

Хаа₄ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala и Val, но особенно Ala,

Хаа₅ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, но особенно Glu,

Хаа₆ обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, но особенно Glu, причем указанные аминокислотные остатки Хаа₂, Хаа₃, Хаа₄, Хаа₅, Хаа₆ не участвуют в связывании антитела или участвуют в меньшей степени по сравнению с -His- и the -Lys-Leu- и the -Phe-Phe- сайтом связывания.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения область CDR, происходящую не от человека, получают от антитела-донора, но особенно антитела-донора мыши, сформировавшегося против фрагмента антигена, который не содержит указанного отличного сайта связывания. Это изменение в области эпитопа может быть по меньшей мере вызвано применением надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, особенно β-амилоидного пептида Aβ_1-16, модифицированный гидрофильной частью молекулы, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), причем указанная гидрофильная часть молекулы ковалентно связана с каждым из концов антигенного пептида через по меньшей мере одну, особенно одну или две аминокислоты, например, лизин, глутаминовую кислоту и цистеин или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аминокислотный аналог, способный выступать в качестве контактного устройства для соединения гидрофильной части молекулы с фрагментом пептида согласно приведенному ниже описанию настоящего изобретения в процессе иммунизации. Если ПЭГ используют в качестве гидрофильной части молекулы, свободные от ПЭГ концы ковалентно связаны с фосфатидилэтаноламином или каким-либо другим соединением, которое может функционировать в качестве заякоривающего элемента, например, для встраивания антигенной конструкции в двойной слой липосомы по описанию, приведенному в настоящем изобретении.

В частности, область CDR, происходящую не от человека, получают от антитела-донора мыши, которое проявляет специфические свойства антитела ACI-01-Ab7C2 (также называемого в настоящем описании антителом «mC2»), депонированным 01 декабря 2005 г. в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) в Брауншвейге по адресу: Mascheroder Weg 1 В, 38124 Branuschweig, по Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры под номером DSM ACC2750.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения область CDR, происходящую не от человека, получают от антитела-донора мыши ACI-01-Ab7C2 (также называемого в настоящем описании антителом «mC2»), депонированным 01 декабря 2005 г. в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) в Брауншвейге по адресу: Mascheroder Weg 1 В, 38124 Branuschweig, по Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры под номером DSM ACC2750.

Кроме того, применение липида А в качестве части протокола иммунизации может повлиять на изменение в области эпитопа.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему интегрированный в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере один пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, состоящих из последовательности SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (Heavy Chain Variable Region - HCVR), и SEQ ID NO:4, представляющей CDR1 вариабельной области легкой цепи (Light Chain Variable Region - LCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, причем указанное гуманизированное антитело включает интегрированный в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере один пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, состоящих из последовательности SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (Heavy Chain Variable Region - HCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, причем указанное гуманизированное антитело включает интегрированный в каркасные участки легкой цепи, происходящей от человека или примата, пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR).

Кроме того, настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи (Light Chain Variable Region - LCVR), включающей интегрированный в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере один пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), включающей интегрированный в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере один пептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, состоящей из SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3 представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR).

Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, которые включают интегрированный в каркасные участки, происходящие от человека или примата, аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей, включающей последовательность SEQ ID NO:1, представляющую CDR1, SEQ ID NO:2, представляющую CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющую CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), и SEQ ID NO:4, представляющую CDR1, SEQ ID NO:5, представляющую CDR2, и SEQ ID NO:6, представляющую CDR3 вариабельной области легкой цепи (LCVR), причем одна и та же область CDR не может присутствовать в антителе дважды. В частности, если по меньшей мере две области CDR обе представляют CDR вариабельной области легкой цепи (LCVR), по меньшей мере одной из указанных CDR должна быть область CDR1, представленная последовательностью SEQ ID NO:4.

Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему интегрированный в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере два пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, состоящей из последовательности SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (Heavy Chain Variable Region - HCVR), но особенно гуманизированному антителу или его фрагменту, причем одна и та же CDR не может содержаться в антителе дважды.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи (Heavy Chain Variable Region - LCVR), включающей интегрированный в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере два пептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, SEQ ID NO:2 представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3 представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR).

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему интегрированный в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере два пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, состоящей из последовательности SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, SEQ ID NO:5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:6, представляющей CDR3 вариабельной области легкой цепи (LCVR).

Кроме того, настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи (Light Chain Variable Region - LCVR), включающей интегрированный в каркасные участки легкой цепи, происходящей от человека или примата, по меньшей мере два пептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, SEQ ID NO:5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:6 представляющей CDR3, вариабельной области легкой цепи (LCVR), причем одна и та же область CDR не может присутствовать дважды в антителе, в частности, по меньшей мере одна из указанных областей CDR должна быть областью CDR1, представленной последовательностью SEQ ID NO:4.

Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему интегрированные в каркасные участки тяжелой цепи, происходящей от человека или примата, пептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), особенно в указанном выше порядке.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), включающей интегрированные в каркасные участки тяжелой цепи, происходящей от человека или примата, пептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), особенно в указанном выше порядке.

Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему интегрированные в каркасные участки легкой цепи, происходящей от человека или примата, пептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, SEQ ID NO:5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:6, представляющей CDR3 вариабельной области легкой цепи (LCVR), особенно в указанном выше порядке.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи (LCVR), включающей интегрированные в каркасные участки легкой цепи, происходящей от человека или примата, пептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, SEQ ID NO:5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:6, представляющей CDR3 вариабельной области легкой цепи (LCVR), особенно в указанном выше порядке.

Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему интегрированные в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере три пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, состоящей из SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), и последовательности SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, SEQ ID NO:5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:6, представляющей CDR3 вариабельной области легкой цепи (LCVR), но особенно гуманизированное антитело или его фрагмент, причем указанные одни и те же CDR не могут содержаться в антителе дважды.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему интегрированные в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере четыре пептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, состоящей из SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), и SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, SEQ ID NO:5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:6, представляющей CDR3 вариабельной области легкой цепи (LCVR), но особенно гуманизированное антитело или его фрагмент, причем указанные одни и те же CDR не могут содержаться в антителе дважды.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему интегрированные в каркасные участки, происходящие от человека или примата, по меньшей мере пять пептидов с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, состоящей из SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), и SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, SEQ ID NO:5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:6, представляющей CDR3 вариабельной области легкой цепи (LCVR), но особенно гуманизированное антитело или его фрагмент, причем указанные одни и те же CDR не могут содержаться в антителе дважды.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему интегрированные в каркасные участки, происходящие от человека или примата, пептиды с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), и SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, SEQ ID NO:5, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:6, представляющей CDR3 вариабельной области легкой цепи (LCVR).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), или его фрагменту, причем указанное гуманизированное антитело, вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) или его фрагмент включает интегрированные в каркасные участки тяжелой цепи, происходящей от человека или примата, по меньшей мере один пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, представляющей CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) или его фрагменту, причем указанное гуманизированное антитело, вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) или его фрагмент включает интегрированные в каркасные участки тяжелой цепи, происходящей от человека или примата, по меньшей мере один пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, представляющей CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) или его фрагменту, причем указанное антитело, вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) или его фрагмент включает интегрированные в каркасные участки тяжелой цепи, происходящей от человека или примата, по меньшей мере два пептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, и SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, вариабельной области тяжелой цепи (HCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) или его фрагменту, причем антитело, вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) или его фрагмент включает интегрированные в каркасные участки тяжелой цепи, происходящей от человека или примата, по меньшей мере два пептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, представляющей CDR1, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3, вариабельной области тяжелой цепи (HCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) или его фрагменту, причем указанное антитело, вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) или его фрагмент включает интегрированные в каркасные участки тяжелой цепи, происходящей от человека или примата, по меньшей мере два пептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, представляющей CDR2, и SEQ ID NO:3, представляющей CDR3, вариабельной области тяжелой цепи (HCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту, включающему вариабельные области с каркасными участками, происходящими от человека или примата, и по меньшей мере одну область CDR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей последовательность SEQ ID NO:1, представляющую CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), SEQ ID NO:2, представляющую CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), и SEQ ID NO:4, представляющую CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, вариабельной области легкой цепи (LCVR) или его фрагменту, причем антитело, вариабельная область легкой цепи (LCVR) или его фрагмент включает интегрированные в каркасные участки тяжелой цепи, происходящей от человека или примата, по меньшей мере два пептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, и SEQ ID NO:5, представляющей CDR2, вариабельной области легкой цепи (LCVR).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, вариабельной области легкой цепи (LCVR) или его фрагменту, причем антитело, вариабельная область легкой цепи (LCVR) или его фрагмент включает интегрированные в каркасные участки тяжелой цепи, происходящей от человека или примата, по меньшей мере два пептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1, и SEQ ID NO:6, представляющей CDR3, вариабельной области легкой цепи (LCVR).

Настоящее изобретение также предусматривает гуманизированное антитело или его фрагмент, причем и вариабельная область тяжелой цепи (HCVR), и вариабельная область легкой цепи (LCVR) антитела мыши С2 каждая вносит по меньшей мере от одной из присущим им областей CDR до по меньшей мере двух областей CDR гуманизированного антитела. Таким образом, образуемое гуманизированное антитело или его фрагмент могут включать:

- по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, представляющую CDR1 (HCVR) в комбинации с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1 (LCVR),

- по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, представляющую CDR2 (HCVR) в комбинации с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1 (LCVR),

- по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, представляющую CDR3 (HCVR) в комбинации с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, представляющей CDR1 (LCVR),

- по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, представляющую CDR2 (HCVR) в комбинации с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, представляющей CDR1 (LCVR),

- по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, представляющую CDR2 (HCVR) в комбинации с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, представляющей CDR2 (LCVR),

- по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, представляющую CDR2 (HCVR) в комбинации с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, представляющей CDR3 (LCVR),

- по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, представляющую CDR3 (HCVR) в комбинации с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, представляющей CDR1 (LCVR),

- по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, представляющую CDR3 (HCVR) в комбинации с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, представляющей CDR2 (LCVR),

- по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, представляющую CDR3 (HCVR) в комбинации с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, представляющей CDR3 (LCVR).

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к химерному антителу или его фрагмент, или гуманизированному антителу или его фрагменту, описанному выше в настоящем изобретении, причем антитело включает константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи, происходящей от человека или примата.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к химерному антителу или его фрагменту, или к гуманизированному антителу или его фрагменту, причем по меньшей мере один аминокислотный остаток, но не более 5 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере один, но не более 4, еще более предпочтительно по меньшей мере один, но не более 3, но особенно предпочтительно по меньшей мере один, но не более 2 аминокислотных остатков областей CDR легкой цепи и/или тяжелой цепи, согласно приведенным последовательностям SEQ ID NO:1-6, изменены путем консервативных замещений таким образом, что антитело полностью поддерживает свою функциональность.

В частности, настоящее изобретение относится к химерному антителу или его фрагменту, или к гуманизированному антителу или его фрагменту, причем в CDR2 вариабельной области легкой цепи (LCVR), приведенной в SEQ ID NO:5, Lys в положении 50 по нумерации Kabat замещен на аминокислотный остаток из группы, состоящей из Arg, Gln и Glu, особенно Arg.

В частности, настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи (LCVR), причем в CDR2, приведенной в SEQ ID NO:5, Lys в положении 50 по нумерации Kabat замещен на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Arg, Gln и Glu особенно Arg.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к химерному антителу или его фрагменту, или к гуманизированному антителу или его фрагменту, причем в CDR2 вариабельной области легкой цепи (LCVR), приведенной в SEQ ID NO:5, Ser в положении 53 по нумерации Kabat замещен на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn или Thr, но особенно Asn.

В частности, настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи (LCVR), причем в CDR2, приведенной в SEQ ID NO:5, Ser в положении 53 по нумерации Kabat замещен на аминокислотный остаток из группы, состоящей из Asn или Thr, но особенно Asn.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, причем вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) имеет аминокислотную последовательность, которая на 90%, предпочтительно 95%, более предпочтительно 98% идентична последовательности SEQ ID NO:15 и 16, соответственно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, причем вариабельная область легкой цепи (LCVR) имеет аминокислотную последовательность, которая на 90%, предпочтительно 95%, более предпочтительно 98% идентична последовательности SEQ ID NO:12 и 13, соответственно.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело или его фрагмент, причем по меньшей мере две, но особенно три из областей CDR вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) имеет аминокислотную последовательность, которая на 90%, предпочтительно 95%, более предпочтительно 98% идентична соответствующей области CDR, обозначенной SEQ ID NO:1-3.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело или его фрагмент, причем по меньшей мере две, но особенно три из областей CDR вариабельной области легкой цепи (LCVR) имеет аминокислотную последовательность, которая на 90%, предпочтительно 95%, более предпочтительно 98% идентична соответствующей области CDR, обозначенной SEQ ID NO:4-6.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному антителу или его фрагменту, или гуманизированному антителу или его фрагменту по настоящему изобретению, описанным выше, причем вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) имеет аминокислотную последовательность, которая на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, обозначенной SEQ ID NO:15 и 16, соответственно.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному антителу или его фрагменту, или гуманизированному антителу или его фрагменту по настоящему изобретению, описанным выше, причем вариабельная область легкой цепи (LCVR) имеет аминокислотную последовательность, которая на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, обозначенной SEQ ID NO:12 и 13, соответственно.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному антителу или его фрагменту, или гуманизированному антителу или его фрагменту по настоящему изобретению, описанному выше, причем по меньшей мере одна область CDR, особенно по меньшей мере две области CDR, но более предпочтительно три области CDR из числа областей CDR вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), имеют аминокислотную последовательность, которая на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, обозначенной SEQ ID NO:1-3.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному антителу или его фрагменту, или гуманизированному антителу или его фрагменту по настоящему изобретению, описанному выше, причем по меньшей мере одна область CDR, особенно по меньшей мере две области CDR, но более предпочтительно три области CDR, из числа областей CDR вариабельной области легкой цепи (LCVR), имеют аминокислотную последовательность, которая на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, обозначенной SEQ ID NO:4-6.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу по настоящему изобретению, описанному выше, причем по меньшей мере одна из аминокислот, представляющих акцепторные последовательности каркасного участка, полученные из последовательностей V_H и V_K зародышевой линии человека, изменена, а именно замещена на аминокислоту из соответствующей области антитела ACI-01-Ab7C2 мыши или на консервативную аминокислоту.

В частности, настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором аминокислота Trp в положении 47 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Leu, норлейцина, Ile, Val, Met, Ala и Phe, особенно Leu и Ile, но особенно Leu.

Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу, в котором Arg по положению 94 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ser и Thr, но особенно Ser.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором Thr по положению 47 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Leu, норлейцина, Ile, Val, Met, Ala и Phe, особенно Leu или Ile, но особенно Leu, и Arg по положению 94 по нумерации Kabat замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ser и Thr, но особенно Ser.

Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу, в котором Gln по положению 45 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_KII вариабельной области легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:12, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Lys, Arg, Gln и Asn, особенно Lys и Arg, но особенно Lys.

Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу, в котором Leu в положении 50 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_K зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_KII вариабельной области легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:12, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Lys, Arg, Gln и Asn, особенно Lys и Arg, наиболее предпочтительно Lys.

Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу, в котором Tyr в положении 87 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_K зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_KII вариабельной области легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:12, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Phe, Leu, Val, Ile и Ala, особенно Leu и Phe, наиболее предпочтительно Phe.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором Tyr в положении 87 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_K зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_KII вариабельной области легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:12, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Phe, Leu, Val, Ile и Ala, особенно Leu и Phe, наиболее предпочтительно Phe.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором Asn в положении 53 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_K зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_KII вариабельной области легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:12, может быть замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Gln, His, Lys и Arg, но особенно His и Gln.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором аминокислота Trp в положении 47 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Leu, норлейцина, Ile, Val, Met, Ala и Phe, особенно Leu и Ile, более предпочтительно Leu, и аминокислота Arg в положении 94 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ser и Thr, но особенно Ser, и аминокислота Tyr в положении 87 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_K зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_KII вариабельной области легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:12, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Phe, Leu, Val и Ala, особенно Leu и Phe, но особенно Phe.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором аминокислота Trp в положении 47 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Leu, норлейцина, Ile, Val, Met, Ala и Phe, особенно Leu и Ile, но особенно Leu.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором аминокислота Arg в положении 94 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ser и Thr, но особенно Ser.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором аминокислота Trp в положении 47 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена Leu или Ile, но особенно Leu и Arg в положении 94 по Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена на Ser.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором аминокислота Tyr в положении 87 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_K зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_KII вариабельной области легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:12, замещена Phe.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, в котором аминокислота Trp в положении 47 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена Leu или Ile, но особенно Leu и Arg в положении 94 по Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_H зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_HIII вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO:15, замещена на Ser и Tyr в положении 87 по нумерации Kabat в акцепторной последовательности каркасного участка, полученной из последовательностей V_K зародышевой линии человека из подгруппы Kabat V_KII вариабельной области легкой цепи, показанной в SEQ ID NO:12, замещена Phe.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:12.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело, которое включает вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:12.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:13.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело, которое включает всю вариабельную область легкой цепи, включая сигнальные последовательности, что показано в последовательности SEQ ID NO:13.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело, которое включает вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:12 и константную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:14.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело, которое включает всю вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:13 и константную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:14.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:15.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело, которое включает вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:15.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи, включая сигнальные последовательности, что показано в SEQ ID NO:16.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело, которое включает всю вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:16.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело, которое включает вариабельную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:15 и константную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:17.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело, которое включает всю вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:16 и константную область тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:17.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело по настоящему изобретению при инкубировании с Аβ мономерным пептидом, имеющим по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, и/или с Аβ полимерным растворимым амилоидным пептидом, включающим множество указанных Аβ мономерных единиц, но особенно с Аβ_1-42 мономерным и/или Аβ полимерным растворимым амилоидным пептидом, включающим множество указанных Аβ_1-42 мономерных единиц, особенно при мольном соотношении концентраций антитела к Аβ_1-42 до 1:1000, но особенно при мольном соотношении концентраций от 1:10 до 1:100, ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы.

В частности, совместное инкубирование антитела по настоящему изобретению с амилоидным мономерными и/или полимерными растворимыми пептидами проводят в течение от 24-60 ч, особенно в течение 30-50 ч, более предпочтительно в течение 48 ч, но особенно предпочтительно в течение 24 ч, при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, но особенно предпочтительно при 37°С.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения совместное инкубирование с амилоидными мономерными и/или полимерными растворимыми амилоидными пептидами проводят в течение от 24 ч при температуре 37°С.

В частности, антитело, особенно гуманизированное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, связывается с Аβ_1-42 мономерным пептидом и/или Аβ полимерным растворимым пептидом, включающим множество указанных Аβ_1-42 мономерных единиц, и при совместном инкубировании с Аβ_1-42 мономерным пептидом и/или Аβ полимерным растворимым амилоидным пептидом, включающим множество указанных Аβ_1-42 мономерных единиц, ингибирует агрегирование Аβ мономеров и/или полимеров до высокомолекулярных полимерных фибрилл.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, особенно гуманизированное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, ингибирует агрегирование Аβ мономеров и/или Аβ растворимых полимеров, включающих множество указанных Аβ мономерных единиц, до высокомолекулярных полимерных фибрилл по меньшей мере на 50%, особенно по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, но особенно предпочтительно по меньшей мере на 85-90% или более по сравнению с соответствующими мономерами амилоидных пептидов, инкубированных в буфере (контроль), при мольном соотношении концентраций антитела и Aβ_1-42 до 1:1000, особенно при соотношении мольной концентрации от 1:10 до 1:100, но особенно при соотношении мольной концентрации 1:10.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, особенно гуманизированное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, ингибирует агрегирование Аβ мономеров и/или Аβ растворимых полимеров, включающих множество указанных Аβ мономерных единиц, до высокомолекулярных полимерных фибрилл по меньшей мере на 30% при мольном соотношении концентраций антитела и Aβ_1-42 1:100.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело, особенно гуманизированное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, ингибирует агрегирование Аβ мономеров и/или Аβ растворимых полимеров, включающих множество указанных Аβ мономерных единиц, до высокомолекулярных полимерных фибрилл по меньшей мере на 80% при мольном соотношении концентраций антитела и Aβ_1-42 1:10.

Связывание антител по настоящему изобретению с описанными в настоящем изобретении амилоидными мономерными и/или полимерными пептидами, но, предпочтительно, с амилоидной формой (1-42), приводит к подавлению агрегирования мономерных и/или полимерных амилоидогенных пептидов до высокомолекулярных фибрилл или филаментов. За счет ингибирования агрегирования амилоидогенных и/или полимерных пептидов антитела по настоящему изобретению способны предотвратить или понизить формирование амилоидных бляшек, особенно амилоидной формы (1-42), о которой известно, что она становится нерастворимой за счет изменения вторичной конформации и является значительной частью амилоидных бляшек в мозге больных животных или людей.

Способность антитела по настоящему изобретению ингибировать способность к агрегированию может быть определена каким-либо соответствующим методом, известным в данной области, В частности, ультрацентрифугированием в градиенте плотности с последующим анализом осадка SDS-PAGE на полученном градиенте и/или с помощью тиофлавин Т (Th-Т) флуоресцентного анализа.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно к гуманизированному антителу по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, причем антитело при совместном инкубировании, особенно в соотношении мольных концентраций от 1:10 до 1:1000, более предпочтительно в соотношении 1:100, с предварительно сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, полученными путем агрегирования Аβ мономерных пептидов, имеющих по меньшей мере 30, особенно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 38, еще более предпочтительно по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, но особенно Аβ_1-42 мономерных пептидов, способно дезагрегировать предварительно сформированные полимерные фибриллы или филаменты по меньшей мере на 20%, особенно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 35%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 40%, но особенно по меньшей мере на 50% или более.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения подавление агрегирования и способность к дезагрегированию антителом, соответственно, определяют ультрацентрифугированием в градиенте плотности с последующим анализом осадка SDS-PAGE на полученном градиенте.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения подавление агрегирования и способность к дезагрегированию антителом, соответственно, определяют с помощью тиофлавин Т (Th-T) флуоресцентного анализа.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению совместно инкубируют с амилоидными заранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами в течение 12-36 ч, особенно в течение 18-30 ч, более предпочтительно в течение 24 ч при температуре от 28°С до 40°С, особенно от 32°С до 38°С, более предпочтительно при 37°С.

В частности, совместное инкубирование с заранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами проводят в течение 24 ч при температуре 37°С.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, особенно к гуманизированному антителу по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое способно к дезагрегированию заранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов по меньшей мере на 24% при мольном соотношении концентраций антитела и Аβ_1-42 1:100.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело, особенно гуманизированное антитело по настоящему изобретению, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, которое способно к дезагрегированию заранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов по меньшей мере на 32% при мольном соотношении концентраций антитела и Aβ_1-42 1:10.

За счет дезагрегирования амилоидогенных полимерных фибрилл или филаментов, антитела по настоящему изобретению способны предупреждать или снижать формирование амилоидных бляшек, которые приводят к облегчению симптомов, связанных с заболеванием и задержкой или отменой его прогрессирования.

Таким образом, это еще один вариант осуществления настоящего изобретения для получения антитела, особенно гуманизированного антитела, в том числе какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, описанные в настоящем изобретении, причем антитело способно понизить общее количество Аβ в мозге животного, особенно млекопитающего, особенно человека с заболеванием или состоянием, приводящим к повышенной концентрации Аβ в мозге.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу по настоящему изобретению, описанному выше, причем антитело обладает двойной эффективностью, заключающейся в том, что оно проявляет и способность подавлять агрегирование, и способность дезагрегировать, особенно связанную с высокой степенью конформационной чувствительности.

В частности, настоящее изобретение относится к описанному выше химерному антителу или его фрагменту, или гуманизированному антителу или его фрагменту по настоящему изобретению, причем антитело при совместном инкубировании с амилоидными мономерными и/или полимерными растворимыми амилоидными пептидами, особенно с β-амилоидными мономерными пептидами, например, Аβ мономерными пептидами 1-39, 1-40, 1-41 или 1-42, и/или полимерным растворимым β-амилоидным пептидом, включающим множество указанных Аβ мономерных единиц, но особенно с Aβ_1-42 мономерными единицами, ингибирует агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы или филаменты, кроме того, при совместном инкубировании с заранее сформированными высокомолекулярными полимерными амилоидными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования амилоидных мономерных пептидов, особенно β-амилоидных мономерных пептидов, например, Аβ мономерных пептидов 1-39, 1-40, 1-41 или 1-42, но особенно Aβ_1-42 мономерных пептидов, способно дезагрегировать заранее сформированные полимерные фибриллы или филаменты.

Другой объект настоящего изобретения относится к описанному выше химерному антителу или его фрагменту, или гуманизированному антителу или его фрагменту по настоящему изобретению, причем антитело способно индуцировать переход конформации β-слоя в α-спираль и/или к конформации произвольной спирали, но особенно к конформации произвольной спирали, еще более предпочтительно к конформации произвольной спирали в конкретном положении в молекуле, особенно в окружении Tyr10 и Val12 белка Аβ, которая приводит к повышению конформации произвольной спирали при расходовании конформации β-слоя и повышенной растворимости ранее сформированных высокомолекулярных полимерных амилоидных фибрилл или филаментов. В частности, количественное снижение конформации β-слоя по меньшей мере на 30%, особенно по меньшей мере на 35% и более предпочтительно по меньшей мере на 40% и более по сравнению с соответствующими ранее сформированными амилоидными полимерными фибриллами или филаментами, инкубированными в буфере (контроль).

Способность антитела индуцировать перемену вторичной структуры определяют с помощью твердотельной 13С ЯМР спектроскопии, в частности, путем измерения интегральной интенсивности конформации Tyr10 и Val12 Сβ в пептиде Aβ_1-42.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к описанному выше химерному антителу или его фрагменту, или гуманизированному антителу или его фрагменту по настоящему изобретению, включающему по меньшей мере одну легкую цепь или ее фрагмент, или по меньшей мере одну тяжелую цепь или ее фрагмент, причем указанное антитело или его фрагмент связывается с Аβ мономером со связывающим сродством от по меньшей мере примерно 1×10^-7 до по меньшей мере примерно 1×10^-12, особенно от по меньшей мере примерно 1×10^-8 до по меньшей мере примерно 1×10^-11, более предпочтительно от по меньшей мере примерно 1×10^-9 до по меньшей мере примерно 2×10^-8, но предпочтительно не проявляет какой-либо существенной перекрестной реакционоспособности с амилоидным белком-предшественником (АРР).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, которые были описаны выше в настоящем изобретении, включающее по меньшей мере одну легкую цепь или ее фрагмент, или по меньшей мере одну тяжелую цепь или ее фрагмент, причем указанное антитело или его фрагмент связывается с Аβ волокном, фибриллами или филаментами со связывающим сродством, составляющим по меньшей мере примерно от 1×10^-7 до по меньшей мере примерно 1×10^-12, особенно по меньшей мере примерно от 1×10^-8 до по меньшей мере примерно 1×10^-11, более предпочтительно по меньшей мере примерно от 1×10^-9 до по меньшей мере примерно 1×10^-10, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно от 2×10^-9 до по меньшей мере примерно 5×10^-9, но предпочтительно не проявляет какой-либо существенной перекрестной реакционно-способности с амилоидным белком-предшественником (АРР).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению или его фрагмент согласно приведенному выше проявляют связывающее сродство с Аβ волокнами, фибриллами или филаментами, которое по меньшей мере в 10 раз, особенно по меньшей мере в 15 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз, но особенно по меньшей мере в 25 раз выше, чем связывающее сродство с Аβ мономером.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения согласно приведенному выше описанию настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, причем антитело существенным образом связывается с агрегированным Аβ, включая бляшки Аβ, у млекопитающих, особенно в мозге человека, но предпочтительно не проявляет какой-либо существенной перекрестной реакционоспособности с амилоидным белком-предшественником (АРР).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения согласно приведенному выше описанию настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, причем антитело существенным образом связывается с растворимым полимерным амилоидом, особенно амилоидом β (Aβ), включая мономеры Аβ, у млекопитающих, особенно в мозге человека, но предпочтительно не проявляет какой-либо существенной перекрестной реакционоспособности с амилоидным белком-предшественником (АРР).

Также согласно приведенному выше описанию настоящего изобретения в нем предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, причем антитело существенным образом снижает нагрузку Аβ бляшек у млекопитающих, особенно в мозге человека, но предпочтительно не проявляет какой-либо существенной перекрестной реакционоспособности с амилоидным белком-предшественником (АРР). Это может быть достигнуто либо связыванием антитела с бляшками, либо сдвигом равновесия между амилоидом, особенно амилоидом β (Аβ) в его растворимой и агрегированной форме, в сторону растворимой формы за счет дезагрегирования волокон в растворимые поли- и мономерные формы путем индукции сдвига конформации и связыванием и стабилизацией дезагрегированных и растворимых амилоидных форм, особенно форм амилоида β (Аβ), в ткани и/или тканевых жидкостях субъекта, включая млекопитающих и людей, особенно в мозге субъектов. Через действие антитела по настоящему изобретению периферическое очищение и катаболизм таким образом преобладает над отложением в ткани и/или тканевых жидкостях субъекта, особенно в мозге. Полезное действие антитела по настоящему изобретению таким образом может быть получено без связывания антитела с бляшками.

За счет такого стабилизирующего действия антитело по настоящему изобретению может нейтрализовывать токсические эффекты полимерного и менее агрегированного растворимого амилоидного белка, особенно амилоидного β (Аβ) белка, в ткани и/или тканевых жидкостях субъекта, особенно млекопитающего, и более предпочтительно человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению может таким образом достичь полезных эффектов без необходимости связывать агрегированный амилоид бета в мозге субъекта.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения согласно приведенному выше описанию настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело или его фрагмент, которое включает по меньшей мере одну легкую цепь или ее фрагмент или по меньшей мере одну тяжелую цепь или ее фрагмент, внедряя по меньшей мере одну, особенно две, и более предпочтительно три области CDR, полученные от антитела-донора мыши, особенно от антитела ACI-01-Ab7C2 мыши (в настоящем описании обозначаемого «mC2», а гуманизированное С2 антитело человека обозначается «hC2»), депонированного 01 декабря 2005 в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) по адресу: Braunschweig, Mascheroder Weg 1 В, 38124 Braunschweig, под номером DSM ACC2750, причем указанное антитело или его фрагмент имеет сродство с Аβ антигеном, которое по меньшей мере в 5 раз, особенно по меньшей мере в 8 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, но особенно предпочтительно по меньшей мере в 15 раз выше по сравнению со сродством к антителу-донору мыши.

Антитело по настоящему изобретению может быть в одном из вариантов осуществления целым антителом (например, с двумя легкими цепями полной длины и двумя тяжелыми цепями полной длины) какого-либо изотипа и подтипа (например, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA1 и IgA2), но особенно антитело изотипа IgG4, в другом варианте в другом осуществлении настоящего изобретения оно может быть антиген-связывающим фрагментом (например, Fab, F(ab')₂, и Fv) целого антитела.

Настоящее изобретение также относится к антиген-связывающим фрагментам антитела, описанным в настоящем изобретении. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab фрагмента, Fab' фрагмента, F(ab)₂ фрагмента и F_v фрагмента, включая продукты библиотеки экспрессии Fab иммуноглобулина и эпитоп-связывающие фрагменты какого-либо антитела и фрагментов, указанных выше.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело или антиген-связывающий фрагмент по настоящему изобретению конъюгирован с полиэтиленгликолем. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения константная область антитела по настоящему изобретению модифицирована для понижения по меньшей мере одной биологической эффекторной функции, связанной с константной областью, относительно немодифицированного антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело или антиген-связывающий фрагмент по настоящему изобретению включает область Fc с измененной эффекторной функцией.

Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной молекуле, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, описанной выше.

В частности, настоящее изобретение относится к нуклеотидной молекуле, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую отрезок расположенных подряд аминокислотных молекул, приведенную в SEQ ID NO:2 и 3, соответственно, или комплементарную последовательность, представляющую комплементарно детерминируемые области (CDR) 2 и 3 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR).

Наиболее часто настоящее изобретение относится к нуклеотидной молекуле, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую отрезок расположенных подряд аминокислотных молекул, приведенную в SEQ ID NO:4, или комплементарную последовательность, представляющую комплементарно детерминируемую область (CDR) 1 вариабельной области легкой цепи (LCVR).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена нуклеотидная молекула, включающая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:19, или комплементарную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность CDR 2 и CDR 3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи (HCVR).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена нуклеотидная молекула, включающая нуклеотидную последовательность, приведенную в виде SEQ ID NO:20, или нуклеотидную последовательность CDR 1 вариабельной области легкой цепи (LCVR).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена нуклеотидная молекула, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:21, или комплементарную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена нуклеотидная молекула, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:22, или комплементарную последовательность, кодирующую всю вариабельную область легкой цепи, включая сигнальные последовательности.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена нуклеотидная молекула, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:22 и константную область легкой цепи последовательности SEQ ID NO:23. Настоящее изобретение также включает комплементарную цепь указанной нуклеотидной молекулы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена нуклеотидная молекула, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:24, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи. Настоящее изобретение также включает комплементарную цепь указанной нуклеотидной молекулы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена нуклеотидная молекула, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:25, кодирующая всю вариабельную область тяжелой цепи, включая сигнальные последовательности. Настоящее время также включает комплементарную цепь указанной нуклеотидной молекулы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена нуклеотидная молекула, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:25 и константную область тяжелой цепи SEQ ID NO:26. Настоящее изобретение также включает комплементарную цепь указанной нуклеотидной молекулы.

К настоящему изобретению также относится нуклеотидная последовательность, которая гибридизируется с одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих описанное выше антитело по настоящему изобретению, В частности, ее комплементарная цепь отдельно или в качестве части более крупной нуклеотидной молекулы.

В частности, настоящее изобретение также относится к нуклеотидной последовательности, которая гибридизируется в обычных условиях гибридизации, особенно в жестких условиях гибридизации, с какой-либо из нуклеотидных последовательностей, приведенных в последовательностях SEQ ID NO:18-26 и 29-32, особенно к их комплемепнтарным цепям.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен вектор экспрессии, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, указанную в настоящем описании выше.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены клетки, включающие вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, указанную в настоящем описании выше.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, включающей антитело по настоящему изобретению, особенно химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению и, согласно описанному выше, включающей какое-либо функционально эквивалентное антитело, или какое-либо его производное или его функциональные части, в терапевтически эффективном количестве, особенно к композиции, которая является фармацевтической или терапевтической композицией, необязательно также включающей терапевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция включает антитело в терапевтически эффективном количестве.

К настоящему изобретению также относится композиция, включающая антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, особенно химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, описанные выше, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или какие-либо его производные или его функциональные части, в терапевтически эффективном количестве и необязательно также биологически действующее вещество, и/или фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.

В частности, настоящее изобретение относится к композиции или смеси, в которых дополнительное биологически действующее вещество является соединением, используемым в лечении амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с амилоидом или амилоидоподобным белком, например Аβ белком, вовлеченным в болезнь Альцгеймера.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения другое биологически действующее вещество или соединение также может быть терапевтическим агентом, который может быть применен в лечении амилоидоза, вызванного амилоидом β, или может быть применен в лечении других нейрологических расстройств.

Другое биологически действующее вещество или соединение может проявлять биологическое действие тем же или сходным механизмом в качестве антитела по настоящему изобретению, или по другому механизму действия, или с помощью множества родственных и/или неродственных механизмов действия.

Обычно к другим биологически активным соединениям могут относиться нейтрон-трансмиссионные энхансеры, психотерапевтические лекарственные средства, ингибиторы ацетихолинэстеразы, блокаторы кальциевых каналов, биогенные амины, бензодиазепиновые транквилизаторы, энхансеры синтеза, сохранности и высвобождения ацетилхолина, агонисты постсинаптического рецептора ацетилхолина, ингибиторы моноаминоксидазы-А или -В, антагонисты рецептора N-метил-D-аспартат-глутамата, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, антиоксиданты и антагонисты серотинэргического рецептора.

Чаще настоящее изобретение относится к композиции или смеси, включающей по меньшей мере одно соединение из группы, состоящей из соединений, эффективных против оксидативного стресса, анти-апоптических соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, например пирензепина и метаболитов, 3-амино-1-пропансульфоновой кислота, 1,3-пропандисульфоната, активаторов α-секретазы, ингибиторов β- и γ-секретазы, тау белков, нейротрансмиттеров, нарушителей β-слоев, аттрактантов для амилоид бета очищающих/истощающих клеточных компонентов, ингибиторов усеченного по N-концу амилоида бета, включая амилоид бета 3-42 в форме пироглутамата, противовоспалительных молекул или ингибиторов холинэстеразы (cholinesterase inhibitor - ChEI), например, такрина, ривастигмина, донепезила и/или галантамина, агонистов M1 и других лекарственных средств, включая какой-либо амилоид или тау модифицированное лекарственное средство и пищевые добавки, и пищевые добавки вместе с антителом по настоящему изобретению, а также необязательно фрамацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.

Настоящее изобретение также относится к композиции или смеси, в которой соединением является ингибитор холинэстеразы (ChEI), особенно смесь, в которой соединение является выбранным из группы, состоящей из такрина, ривастигмина, донепезила, галантамина, ниацина и мемантина.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению могут включать ниацин или мемантин вместе с антителом по настоящему изобретению и необязательно с фармацевтически приемлемым носителем, и/или растворителем, и/или эксципиентом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены композиции, которые включают «атипичные антипсихотические средства», например, клозапин, ципразидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, для лечения положительных и отрицательных психотических симптомов, включающих галлюцинации, бред, нарушения мышления (проявляемые в форме выраженной бессвязности, неадекватности, расстройстве ассоциативного мышления), аномального или дезорганизованного поведения, например, ангедонии, аффекта в форме уныния, апатии и социальной замкнутости у субъекта, нуждающегося в таком лечении, вместе с антителом, особенно моноклональным антителом по настоящему изобретению, но особенно химерным антителом или его фрагментом, или гуманизированным антителом или его фрагментом по настоящему изобретению, описанным в настоящем изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.

В специфическом варианте осуществления настоящего изобретения композиции и смеси по настоящему изобретению, описанные выше в настоящем изобретении, включают антитело и биологически действующее вещество, соответственно, в терапевтически эффективном количестве.

Другие соединения, которые могут быть использованы в смесях в комбинации с антителом по настоящему изобретению, описаны в WO 2004/058258 (особенно см. cc. 16 и 17), включающем мишени для терапевтических лекарственных средств (cc. 36-39), алкансульфоновые кислоты и алканосульфуровые кислоты (cc. 39-51), ингибиторы холинэстеразы (cc. 51-56), антагонисты рецептора NMDA (cc. 56-58), эстрогены (cc. 58-59), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (cc. 60-61), антиоксиданты (cc. 61-62), агонисты рецептора, активированного пролифераторами пероксисом (peroxisome proliferators-activated receptor - PPAR) (cc. 63-67), холестерин-понижающие агенты (cc. 68-75), ингибиторы амилоида (cc. 75-77), ингибиторы формирования амилоида (cc. 77-78), хелаторы металла (cc. 78-79), антипсихотики и антидепрессанты (cc. 80-82), пищевые добавки (cc. 83-89) и соединения, повышающие доступность биологически действующих веществ в мозге (см. cc. 89-93), и пролекарства (cc. 93 и 94), причем указанный документ включен в настоящее изобретение в виде ссылки.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, включающей антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, но особенно химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению и описанные выше в настоящем изобретении, и/или биологически действующее вещество в терапевтически эффективном количестве.

Настоящее изобретение также относится к применению антитела, особенно моноклонального антитела по настоящему изобретению, особенно химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента по настоящему изобретению, описанного выше в настоящем изобретении, и/или его функциональной части, и/или фармацевтической композиции, или смеси, включающей указанное антитело, для получения лекарственного средства для лечения или облегчения проявлений амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например прогрессирующий супрануклеарный паралич, множественный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна, для субъекта, нуждающегося в таком применении.

Настоящее изобретение также относится к способу получения антитела, особенно моноклонального антитела по настоящему изобретению, предпочтительно химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента по настоящему изобретению, описанных в настоящем изобретении выше, и/или их функциональной части, и/или фармацевтической композиции, или смеси, включающей указанное антитело и/или его функциональную часть, особенно в терапевтически эффективном количестве, для применения в способе предупреждения, лечения или облегчения проявлений амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна, для субъекта, нуждающегося в таком применении, включающее переработку антитела, особенно моноклонального антитела по настоящему изобретению, но особенно химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемой форме.

Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения, лечения или облегчения проявлений амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна, для субъекта, нуждающегося в таком применении, путем введения антитела и/или его функциональной части, особенно гуманизированного антитела и/или его функциональной части, предпочтительно гуманизированного антитела и/или его функциональной части, и/или композиции или смеси, включающей такое антитело и/или его функциональную часть, субъекту, включая млекопитающее или человека с указанным расстройством в терапевтически эффективном количестве.

Настоящее изобретение также предусматривает способ лечения амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), особенно заболевание или состояние, отличающееся утратой когнитивного объема памяти, у субъекта, особенно млекопитающего или человека, с указанным заболеванием или расстройством, особенно фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ сохранения или повышения когнитивного объема памяти, особенно восстановления когнитивного объема памяти у субъекта, особенно млекопитающего или человека, с ухудшением памяти путем введения субъекту, особенно млекопитающему или человеку, нуждающемуся в этом, антитела, особенно фармацевтической или терапевтической композиции по настоящему изобретению, описанной выше.

Согласно еще одному объекту настоящего изобретения предусматривается терапевтическая композиция и способ получения такой композиции, а также способ лечения амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), особенно заболевание или состояние, отличающееся утратой когнитивного объема памяти, у субъекта, нуждающегося в этом, используя антитело по настоящему изобретению, описанное выше.

В частности, настоящее изобретение относится к лечению субъекта, особенно млекопитающего или человека, с состоянием, связанным с амилоидом, отличающееся утратой когнитивного объема памяти, которое приводит к удержанию когнитивного объема памяти.

Настоящее изобретение также относится к способу диагностики заболевания или состояния, связанного с амилоидом, у субъекта, включающему выявление иммуноспецифического связывания антитела или его действующего фрагмента с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, который включает следующие стадии:

(а) приведение образца, или специфической части тела, или области тела субъекта, в котором предположительно содержится амилоидный белок, в соприкосновение с антителом, особенно моноклональным антителом по настоящему изобретению, предпочтительно химерным антителом или его фрагментом, или гуманизированным антителом или его фрагментом по настоящему изобретению, описанным выше, и/или его функциональной частью, причем указанное антитело связывает эпитоп амилоидного белка,

(б) осуществления связывания антитела и/или его функциональной части с амилоидным белком для формирования иммунологического комплекса,

(в) выявления формирования иммунологического комплекса, и

(г) корреляции наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, образца, или специфической части тела, или области тела субъекта.

Также предусмотрен способ определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек в ткани и/или жидкостях тела субъекта, нуждающегося в нем, включающее:

(а) получение образца, представляющего ткань и/или жидкостях тела исследуемого субъекта,

(б) тестирование указанного образца на наличие амилоидного белка с помощью антитела, особенно моноклонального антитела по настоящему изобретению, предпочтительно химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента по настоящему изобретению, описанных выше, и/или их функциональных частей,

(в) определения количества антитела, связанного с белком, и

(г) подсчета нагрузки бляшек в ткани и/или жидкостях тела субъекта. В частности, настоящее изобретение относится к способу определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек в ткани и/или жидкостях тела субъекта, нуждающегося в нем, причем формирование иммунологического комплекса на стадии (в) определяют таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен набор для выявления и диагностики связанных с амилоидом заболеваний и состояний у субъекта, включающий антитело, особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, предпочтительно химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, описанное выше, и/или его функциональную часть.

В частности, настоящее изобретение относится к набору для выявления и диагностики связанных с амилоидом заболеваний и состояний у субъекта, нуждающегося в этом, включающему контейнер, содержащий одно или несколько антител по настоящему изобретению, и/или его функциональную часть, и инструкции по применению антитела для связывания амилоидного белка для формирования иммунологического комплекса и выявления формирования иммунологического комплекса таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка.

В другом объекте настоящего изобретения предусмотрены способы и композиции для предупреждения, лечения или выявления заболевания, связанного с амилоидозом у субъекта, нуждающегося в этом, используя иммуноглобулины, согласно описанию настоящего изобретения, которые также включают вариант области Fc, причем указанный вариант области Fc включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты относительно области Fc дикого типа. Область Fc опосредует эффекторную функцию антитела или его фрагмента. С помощью модулирования способности части Fc антитела или его фрагмента связывать или активировать соответствующий рецептор, можно аннулировать или повысить эффекторную функцию антитела или его фрагмента.

Таким образом, в другом объекте настоящего изобретения предусмотрено антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, дополнительно включающее вариант области Fc, включая по меньшей мере одну мутацию аминокислоты, которая снижает эффекторную функцию. В одном таком объекте по меньшей мере одна мутация аминокислоты снижает гликозилирование антитела или его фрагмента. В другом таком объекте по меньшей мере одна мутация аминокислоты снижает связывание с родственным рецептором Fc. В другом таком объекте по меньшей мере одна мутация аминокислоты снижает активирование родственного рецептора Fc по связыванию антитела или его фрагмента. В одном таком объекте вариант области Fc является вариантом области Fc IgG1. В одном из таких объектов антитело или его фрагмент включает мутацию D265A в области Fc.

В другом объекте настоящего изобретения предусмотрено антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, дополнительно включающий вариант области Fc, включая по меньшей мере одну аминокислотную мутацию, которая повышает эффекторную функцию. В одном таком объекте по меньшей мере одна мутация аминокислоты повышает гликозилирование антитела или его фрагмента. В другом таком объекте по меньшей мере одна мутация аминокислоты повышает связывание с родственным рецептором Fc. В другом таком объекте по меньшей мере одна мутация аминокислоты повышает активирование родственного рецептора Fc по связыванию антитела или его фрагмента. Эти и другие объекты, свойства и преимущества настоящего изобретения станут яснее после рассмотрения подробного описания вариантов его осуществления и приводимой формулы изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг.1 (пример 2). Вектор экспрессии тяжелой цепи химерного антитела. Фиг.2 (пример 2). Вектор экспрессии легкой цепи химерного антитела. Фиг.3 (пример 2). Кассета экспрессии вариабельной области легкой цепи мыши химерного антитела. Фиг.4 (пример 2). Кассета экспрессии вариабельной области тяжелой цепи мыши химерного антитела. Фиг.5 (пример 5.2). Сравнение вариабельной области тяжелой цепи мыши с наиболее близкой последовательностью зародышевой линии мыши. Фиг.6 (пример 8). Действие очищенного гуманизированного антитела С2. Фиг.7 (пример 9). Связывающее действие антитела, вырабатываемого кратковременной экспрессией конструкций модифицированной области CDRL2 антитела С2 в соединении с химерной тяжелой цепью антитела С2, по сравнению с химерным антителом C2ChVHAF/ChVK, вырабатываемым в результате кратковременной трансфекции, и очищенным антителом. Фиг.8 (пример 11). Результаты анализа иммуногистохимического связывания с химерным антителом AF (IgG4) и гуманизированным антителом H4K1 (IgG4). Фиг.9 (пример 12). Функциональность антитела тС2 на амилоидных волокнах. А) сравнение спектра ¹³С CPMAS и сравнение с U-¹³C Tyr10 и Val12 мечеными амилоидными β1-42 волокнами, инкубированными с ФСБ (слева в качестве контроля) или ACI-7-С2 (справа) в течение 24 ч и затем лиофилизированными. Пик при 33 частях на миллион соответствует конформации бета-слоя волокон, а пик при 30 частях на миллион является результатом конформации по типу произвольной спирали. Фиг.9 В) Сравнение соответствующих параметров для двух конформации Val12 Сβ. Соответствующие химические сдвиги для двух конформаций крайне схожи, но полные интенсивности весьма различны, что отражает снижение конформаций исходного бета-слоя примерно на 35% (1-(53.5/81.7)), что соответствует величине, полученной в результате измерения флуоресценции. А) Сравнение 13С CPMAS спектра и установка на U-13C Tyr1- и Val12 меченые амилоид β1-42 волокна, инкубированные с ФСБ (слева, служат контролем) или ACI-7-C2 (справа) в течение 24 ч с последующим лиофилизированием. Установки для двух конформаций Val 12 Сβ. Показаны зеленым (слой) и синим (редкая спираль). Пик при 33 частей на миллион соответствует конформаций бета слоя волокон, а при 30 частях на миллион приводит к конформаций редкой спирали. В) Сравнение установленных параметров для двух конформаций Val 12 Сβ. Установленные химические сдвиги для двух конформаций очень похожи, но внутренние интенсивности сильно различаются, отражая уменьшение в исходной конформаций бета-слоя примерно на 35% (1-(53,5/81,7)). Это хорошо согласуется с величиной, получаемой по измерению флуоресценции. Фиг.10 (пример 12). Связывающее сродство гуманизированного С2 по данным метода ELISA. Фиг.11 (пример 14). Конформационно-специфическое связывание антитела mC2 с амилоидными белками разных классов. Получение осадка, приведенное в легенде к настоящей фигуре, относится к Аβ_1-42 волокнам, получение супернатанта относится к амилоидным мономерам. Фиг.12. Гуманизированные С2 VK последовательности, сравниваемые с последовательностью мыши и акцепторными последовательностями человека DPK15 и J_K1. Фиг.13. Гуманизированные С2 VH последовательности, сравниваемые с последовательностью мыши и акцепторными последовательностями человека DP54 и J_H6. Фиг.14. Полная последовательность ДНК и белка вариабельной области С2 гуманизированного антитела, C2HuVK1. Фиг.15-1 - 15-5. Полная последовательность ДНК и белка константной области легкой цепи (С каппа человека) гуманизированного С2 антитела. Фиг.16-1 - 16-2. Полная последовательность ДНК и белка константной области тяжелой цепи (IgG4 ser228-pro человека) гуманизированного С2 антитела. Фиг.17-1 - 17-3 (пример 15). Результаты экспериментов по картированию эпитопов. Фиг.17-1. hC2 связывается с пептидами 12, 13, 14, 15 и 16 из пептидной библиотеки Aβ1-42. Связывание hC2 с перекрывающимися пептидами Аβ1-42 анализируют методом ELISA. Связывание с полным пептидом Аβ1-42 и связывание с несвязываемым химерным антителом (контрольное антитело) используют в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно. Номер пептида соответствует аминокислоте в последовательности Аβ1-42, с которой пептид начинается. Результаты представлены в виде оптической плотности (ОП). Фиг.17-2. Связывание hC2 с Абета 12-20 полностью зависит от аминокислот 16, 17, 19 и 20 и частично зависит от аминокислот 14, 15 и 18. Связывание с Абета 12-20 и аланином, замещенным с Абета 12-20, исследуют методом ELISA. Связывание с полной последовательностью Абета1-42 используют в качестве положительного контроля. Номер соответствует аминокислоте, которая замещена аланином. Результаты представлены в виде оптической плотности (ОП). Фиг.17-3. Связывание hC2 с Абета 15-23 зависит от аминокислоты 23 и частично от аминокислоты 22. Связывание hC2 с Абета 13-24, 14-22 или 15-23 и с Абета21С21, 14-22А22 или 15-23А23 исследуют методом ELISA. Связывание с полной последовательностью Абета1-42 используют в качестве положительного контроля. Фиг.18 (пример 13). Результаты экспериментов по изучению агрегирования. Фиг.19 (пример 13). Результаты экспериментов по изучению дезагрегирования. Фиг.20 (пример 16). Результаты экспериментов по нейропротекции с гуманизированным антителом С2.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность вариабельной области (CDR1) С2 HuVH AF 4 гуманизированной тяжелой цепи. SEQ ID NO:2. Аминокислотная последовательность вариабельной области (CDR2) С2 HuVH AF 4 гуманизированной тяжелой цепи. SEQ ID NO:3. Аминокислотная последовательность вариабельной области (CDR3) С2 HuVH AF 4 гуманизированной тяжелой цепи. SEQ ID NO; 4. Аминокислотная последовательность вариабельной области (CDR1) С2 HuVK 1 гуманизированной легкой цепи. SEQ ID NO:5. Аминокислотная последовательность вариабельной области (CDR2) С2 HuVK 1 гуманизированной легкой цепи. SEQ ID NO:6. Аминокислотная последовательность вариабельной области (CDR3) С2 HuVK 1 гуманизированной легкой цепи. SEQ ID NO:7. Аминокислотная последовательность области 2 эпитопа Aβ. SEQ ID NO:8. Аминокислотная последовательность области 1 эпитопа Аβ. SEQ ID NO:9. Аминокислотная последовательность модифицированной области 2 эпитопа Аβ. SEQ ID NO:10. Аминокислотная последовательность модифицированной области 1 эпитопа Аβ. SEQ ID NO:11. Аминокислотная последовательность полностью модифицированной области эпитопа. SEQ ID NO:12. Аминокислотная последовательность вариабельной области гуманизированной легкой цепи антитела С2 HuVK I. SEY ID NO:13. Аминокислотная последовательность гуманизированной легкой цепи антитела С2. SEQ ID NO:14. Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи гуманизированного антитела С2. SEQ ID NO:15. Аминокислотная последовательность вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи антитела С2 HuVH AF 4. SEQ ID NO:16. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела С2. SEQ ID NO:17. Модифицированная область аминокислотной последовательности цепи С IG гамма-4. SEQ ID NO:18. Нуклеотидная последовательность области CDR2 вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи антитела С2 HuVH AF 4. SEQ ID NO:19. Нуклеотидная последовательность области CDR3 вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи антитела С2 HuVH AF 4. SEQ ID NO:20. Нуклеотидная последовательность области CDR1 вариабельной области гуманизированной легкой цепи антитела С2 HuVK 1. SEQ ID NO:21. Нуклеотидная последовательность вариабельной области гуманизированной легкой цепи антитела С2 HuVK 1. SEQ ID NO:22. Нуклеотидная последовательность гуманизированной легкой цепи антитела С2. SEQ ID NO:23. Нуклеотидная последовательность константной области гуманизированной легкой цепи антитела С2. SEQ ID NO:24. Нуклеотидная последовательность вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи антитела С2 HuVH AF 4. SEQ ID NO:25. Нуклеотидная последовательность гуманизированной тяжелой цепи антитела С2. SEQ ID NO:26. Нуклеотидная последовательность константной области гуманизированной тяжелой цепи антитела С2. SEQ ID NO:27. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела мыши С2. SEQ ID NO:28. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела мыши С2. SEQ ID NO:29. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела мыши С2. SEQ ID NO:30. Нуклеотидная последовательность легкой цепи антитела мыши С2. SEQ ID NO:31. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела мыши С2. SEQ ID NO:32. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антитела мыши С2.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения

Понятия «полипептид», «пептид» и «белок» в контексте настоящего изобретения взаимозаменяемы и означают биомолекулу, состоящую из аминокислот, связанных пептидными связями. В контексте настоящего изобретения существительные в единственном числе могут означать «один или несколько» или подразумевать множественное число, если это не противоречит контексту. Выражение «заболевания и расстройства, которые вызваны или связаны с амилоидными и амилоидоподобными белками» относится к заболеваниям и расстройствам, но ими не ограничивается, которые вызваны наличием или действием амилоидоподобных белков в виде мономеров, фибрилл или полимеров или какой-либо комбинации всех трех видов. К таким заболеваниям и расстройствам относятся, но ими не ограничиваются, амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерация желтого пятна. Понятие «амилоидоз» относится к группе заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая, но ими не ограничиваясь, вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь ими, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), включая заболевания или состояния, характеризующиеся утратой когнитивного объема памяти, например, умеренное когнитивное нарушение (УКН), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), миозит с включенными тельцами (МВТ), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, а также заболевания глаз, включая дегенерацию желтого пятна, зрительную невропатию, связанную со старческими бляшками, и катаракту, вызванную отложением бета-амилоида. Понятия «обнаружение» и «обнаруженный», применяемые в контексте настоящего изобретения, означают применение известных методик для выявления биологических молекул, например, иммунохимических или гистологических методик, и относятся к качественному или количественному определению наличия или концентрации исследуемой биомолекулы. Понятие «полимерный растворимый амилоид» относится к составным агрегированным мономерам амилоидных пептидов, или амилоид-подобных пептидов, или модифицированных или усеченных амилоидных пептидов или других производных амилоидных пептидов, формируя олигомерные или полимерные структуры, которые растворимы в организме млекопитающего или человека, особенно в мозге, но особенно к составным агрегированным мономерам амилоида β (Аβ) или модифицированных или усеченных амилоидных β (Аβ) пептидов или его производных, которые растворимы в организме млекопитающего или человека, особенно предпочтительно в мозге. Понятия «амилоид β, Аβ или β-амилоид» представляют известный в данной области термин и относятся к белкам и пептидам амилоида β, белку-предшественнику амилоида β (АРР), а также к модификациям, фрагментам и каким-либо их функциональным эквивалентам. В частности, амилоид β в контексте настоящего изобретения означает какой-либо фрагмент, получаемый в результате протеолитического расщепления АРР, но особенно те фрагменты, которые вовлечены или связаны с амилоидными патологиями, включая, но ими не ограничиваясь, Aβ_1-38, Aβ_1-39; Aβ_1-40, Aβ_1-41 Aβ_1-42 и Аβ_1-43. Структуры и последовательности амилоидных β пептидов, указанных выше, известны специалистам в данной области, а способы получения указанных пептидов или их экстракции из мозга и других тканей описаны, например, в работе Glenner, Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 1984, cc. 885-890. Кроме того, амилоидные β пептиды в различных формах также коммерчески доступны. Понятие «выделенный» означает биологическую молекулу, свободную по меньшей мере от некоторых компонентов, с которыми она находится в природных условиях. Понятия «антитело» или «антитела» в контексте настоящего изобретения являются известными в данной области терминами и означают молекулы или действующие фрагменты молекул, которые связываются с известными антигенами, особенно молекулы иммуноглобулина, и иммунологически действующие части молекул иммуноглобулина, т.е. молекул, которые содержат сайт связывания, который специфически связывает антиген. Иммуноглобулин является белком, включающим один или несколько полипептидов, в основном кодируемых генами константных областей каппа и лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также бесчисленными генами вариабельных областей иммуноглобулина. Легкие цепи классифицируют в качестве либо каппа, либо лямбда. Тяжелые цепи классифицируют на гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые в свою очередь представляют классы иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Также известны подклассы тяжелой цепи. Например, тяжелые цепи IgG у людей могут относиться к какому-либо из подклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Иммуноглобулин по настоящему изобретению может принадлежать к какому-либо из классов (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY) или подклассов (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) молекул иммуноглобулинов. В контексте настоящего изобретения понятие «специфически связывает» применительно к антителу означает, что антитело связывается со своим целевым антигеном с повышенным сродством по сравнению со структурно отличным антигеном (антигенами).

Известно, что типичная структурная единица иммуноглобулина представляет тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну «легкую» (примерно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (примерно 50-70 кДа). N-конец каждой цепи означает вариабельную область примерно из 100-110 или более аминокислот, в основном ответственных за распознавание антигена. Понятия вариабельной легкой цепи (V_L) и вариабельной тяжелой цепи (V_H) относятся к легкой и тяжелой цепи соответственно. Антитела представляют интактные антитела полной длины или ряд хорошо охарактеризованных фрагментов, вырабатываемых расщеплением различными пептидазами или химическими реагентами. Например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирной области для формирования F(ab')₂, представляющего димер Fab, который сам означает легкую цепь, соединенную с V_H-CH₁ дисульфидной связью. Фрагмент F(ab')₂ может быть редуцирован в мягких условиях для разрушения дисульфидной связи в шарнирной области, тем самым конвертируя димер F(ab')₂ в мономер Fab'. Мономер Fab' в основном представляет фрагмент Fab с частью шарнирной области (см. кн.: «Fundamental Immunology», 1993, под ред. W. E. Paul, изд-во Raven Press, Нью-Йорк, с более подробным описанием других фрагментов антител). Хотя различные фрагменты антител выражены в понятиях расщепления интактного антитела, специалисту очевидно, что какой-либо из различных фрагментов антител может быть синтезирован de полю или химически, или методом рекомбинантной ДНК. Поэтому понятие «антитело» в контексте настоящего изобретения также подразумевает фрагменты антитела, получаемые путем модификации целых антител или синтезом de novo антител и фрагментов, получаемых методом рекомбинантной ДНК.

В контексте настоящего изобретения понятие «антитела» в рамках охвата настоящего изобретения означает моноклональные антитела, поликлональные антитела, химерные, одноцепочечные, биспецифические, симинизированные, принадлежащие человеку и гуманизированные антитела, а также их действующие фрагменты. К примерам действующих фрагментов молекул, которые связываются с известными антигенами, относятся разделенные легкие и тяжелые цепи, фрагменты Fab, Fab/c, Fv, Fab' и F(ab')₂, включая продукты библиотеки экспрессии Fab иммуноглобулинов и эпитоп-связывающие фрагменты какого-либо антитела и фрагментов, указанных выше.

Такие действующие фрагменты могут быть получены от антитела по настоящему изобретению с помощью ряда методов. Например, моноклональные антитела могут быть расщеплены ферментом, например пепсином, и подвержены гель-фильтрации HPLC. Соответствующая фракция, содержащая фрагменты Fab, затем может быть собрана и сконцентрирована мембранной фильтрацией или другим методом. Дополнительное описание основных методов по выделению действующих фрагментов антитела см., например, работы Khaw В. А. и др. J. Nucl. Med. 23, 1982, cc. 1011-1019, Rousseaux и др. Methods Enzymology, изд-во Academic Press, 121, 1986, cc. 663-669.

Рекомбинантно полученные антитела могут быть антителами обычной полной длины, действующими фрагментами антитела, получаемыми в результате протеолитического расщепления, уникальными фрагментами действующего антитела, например, фрагментом Fv или одноцепочечным фрагментом Fv (single chain Fv - scFv), антителом с делегированным доменом и другими. Фрагмент Fv антитела имеет размер примерно 50 кДа и включает вариабельные области легкой и тяжелой цепи. Одноцепочечный полипептид Fv (single chain Fv - scFv) является ковалентно связанным гетеродимером VH::VL, который может быть экспрессирован с нуклеиновой кислоты, включая VH- и VL-кодирующие последовательности, соединенные непосредственно или через пептид-кодирующий линкер. См. Huston и др. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85, 1988, cc. 5879-5883. Ряд структур для конверсии природно агрегированных, но химически разделенных легкой и тяжелой цепей полипептида от области V антитела в молекулу scFv, которая может сложиться в трехмерную структуру, существенным образом близкую к структуре сайта связывания антигена. См., например, US 5091513, 5132405 и 4956778.

Комбинированный сайт относится к части молекулы антитела, которая участвует в связывании антигена. Сайт связывания антигена сформирован аминокислотными остатками N-концевых вариабельных (variable - V) областей тяжелой (heavy - Н) и легкой (light - L) цепей. Вариабельные области антитела включают три в высокой степени дивергентных отрезка, называемых «гипервариабельными областями» или «комплементарно детерминируемыми областями (complementarity determining region - CDR)», которые размещены между более консервативными фланкирующими отрезками, называемыми «каркасными участками (framework regions - FR)». В молекуле антитела три гипервариабельных области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) и три гипервариабельных области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) расположены относительно друг друга в трехмерном пространстве для формирования поверхности или кармана связывания антигена. Следовательно сайт комбинирования антитела представляет аминокислоты, которые составляют области CDR антитела, и какие-либо остатки каркасного участка, которые составляют карман сайта связывания.

Специфичность аминокислотных остатков в определенном антителе, которые составляют комбинируемый сайт, может быть определена известными в данной области методами. Например, области CDR антитела могут быть идентифицированы в качестве гипервариабельных областей, первоначально определенных Kabat и др. (см. кн.: Е. Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», изд-во Министерства здравоохранения и социального обеспечения США, Johnson G., Wu T.T. Nucleic Acids Research, 29, 2001, cc. 205-206, http://immuno.bme.nwa.edu). Положения областей CDR также могут быть идентифицированы в качестве петлевидных структур, изначально описанных Chothia и др. (см. Chothia, Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, с.901, Chothia и др., Nature 342, 1989. с.877, Tramontane и др., J. Mol. Biol. 215. 1990, с.175). К другим способам относится «определение AbM», которое представляет компромисс между определениями Kabat и Chothia и получается в результате применения компьютерной программы моделирования антитела Oxford Molecular's AbM (которая в настоящее время обозначается «Accelrys») или «определение контакта» CDR по Macallum и др. (J Mol Biol., 262(5), 1996, cc. 732-45). Приводимая ниже схема идентифицирует области CDR по разным известным системам идентификации.

Петля	Kabat	AbM	Chothia	Контакт
L1	L24 -- L34	L24 -- L34	L24 -- L34	L30 -- L36
L2	L50 -- L56	L50 -- L56	L50 -- L56	L46 -- L55
L3	L89 -- L97	L89 -- L97	L89 -- L97	L89 -- L96
H1	Н31 -- Н35В	Н26 -- Н35В	Н26 -- Н32..34	Н30 -- Н35В
Нумерация по Kabat
H1	Н31 -- Н35	Н26 -- Н35	Н26 -- Н32	Н30 -- Н35
Нумерация по Chothia
Н2	Н50 -- Н65	Н50 -- Н58	Н52 -- Н56	Н47 -- Н58
Н3	Н95 -- Н102	Н95 -- Н102	Н95 -- Н102	Н93 -- Н101

Общепринятыми руководящими принципами, с помощью которых можно идентифицировать области CDR в антителе только из одной последовательности, являются следующие:

LCDR1:

Старт - примерно остаток 24.

Остатком впереди всегда является Cys.

Остатком сзади всегда является Trp. Обычно за TRP следует TYR-GLN, но также может следовать LEU-GLN, PHE-GLN или TYR-LEU.

Длина составляет 10-17 остатков.

LCDR2:

Старт - 16 остатков после конца L1.

Последовательностью впереди обычно является ILE-TYR, но также могут быть VAL-TYR, ILE-LYS или ILE-PHE.

Полная длина состоит из 7 остатков.

LCDR3:

Старт - обычно 33 остатка после конца L2.

Остатком впереди является Cys.

Последовательностью после является PHE-GLY-X-GLY.

Длина составляет 7-11 остатков.

HCDR1:

Старт - примерно с остатка 26 (четыре остатка после CYS) [Chothia / AbM определение]

Старт по Kabat - на пять остатков позже.

Последовательностью впереди является CYS-X-X-X.

Остатком после является TRP, обычно затем следует VAL, но также может быть ILE или ALA.

Длина составляет 10-12 остатков по определению AbM, хотя по определению Chothia исключены последние 4 остатка.

HCDR2:

Старт - 15 остатков после конца по определению Kabat /AbM последовательности CDR-H1.

Последовательностью впереди обычно является LEU-GLU-TRP-ILE-GLY (SEQ ID NO. 1), но также возможен ряд вариаций.

Последовательностью после является LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA

Длина составляет 16-19 остатков по определению Kabat (по определению AbM короче на 7 остатков).

HCDR3:

Старт - 33 остатка после конца CDR-H2 (два остатка после CYS).

Последовательность впереди: CYS-X-X (обычно CYS-ALA-ARG).

Последовательность после: TRP-GLY-X-GLY.

Длина составляет 3-25 остатков.

Специфичность аминокислотных остатков в определенном антителе, которые находятся за пределами областей CDR, но, несмотря на это, составляют часть сайта комбинирования за счет боковой цепи, которая является частью сайта комбинирования (т.е. возможна связь через сайт комбинирования), может быть определена, используя способы, известные в данной области, например, метод молекулярного моделирования и рентгенокристаллографии. См., например, Riechmann и др., Nature, 332, 1988, cc. 323-327.

Химерными являются антитела, у которых одна или несколько областей антитела происходят от одного вида животного и одна или несколько областей происходят от другого вида животного. Предпочтительное химерное антитело является антителом, которое включает области от иммуноглобулина примата. Обычно известно, что химерное антитело для клинического применения людьми содержит вариабельные области от животного (но не от человека), например, от грызуна, вместе с константными областями от человека. Напротив, гуманизированное антитело содержит области CDR от антитела, не от человека, с большинством или со всеми вариабельными каркасными участками от всех константных областей от иммуноглобулина человека. Обычно известно, что химерное антитело человека содержит вариабельные области от грызуна. Типичное химерное антитело человека содержит константные области тяжелой цепи человека и константные области легкой цепи человека с вариабельными областями и тяжелой, и легкой цепи, полученной от антитела грызуна. Химерное антитело может включать некоторые изменения в нативной аминокислотной последовательности константных областей человека и последовательности нативной вариабельной области грызуна. Химерное и гуманизированное антитела могут быть получены методами, известными в данной области, включая подходы к пересадке CDR (см., например, US 5843708, 6180370, 5693762, 5585089, 5530101), стратегию перетасовки цепи (см., например, US 5565332, Rader и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:8910-8915), стратегии молекулярного моделирования (US 5639641) и др.

В контексте настоящего изобретения понятие «гуманизированное антитело», используемое в случае двух цепей человека, означает, что по меньшей мере одна цепь гуманизирована. Цепь гуманизированного антитела содержит вариабельную область, в которой один или несколько каркасных участков происходят от человека. Гуманизированное антитело, являющееся одноцепочечным, представляет антитело, в котором цепь имеет вариабельную область, в которой один или несколько каркасных участков происходят от человека. Части вариабельной области, происходящие не от человека, цепи гуманизированного антитела или его фрагмента происходят не от человека, а обычно от грызуна. Вклад в гуманизированное антитело, происходящий не от человека, обычно предусмотрен в форме по меньшей мере одной области CDR, которая рассеяна среди каркасных участков, происходящих от одного (или нескольких) иммуноглобулинов человека. Кроме того, поддерживающие каркасные участки остатки могут быть изменены для сохранения связывающего сродства.

Гуманизированное антитело может дополнительно включать константные области (например, по меньшей мере одну константную область или ее часть в случае легкой цепи, и предпочтительно три константные области в случае тяжелой цепи). Если имеются константные области гуманизированного антитела, они обычно происходят от человека.

Способы получения «гуманизированного антитела» хорошо известны специалистам в данной области. (См., например, Queen и др., Proc. Natl Acad Sci USA, 86, 1989, cc. 10029-10032, Hodgson и др., Bio/Technology, 9, 1991, с.421).

«Гуманизированное антитело» также может быть получено с помощью нового генно-инженерного подхода, который позволяет получать поликлональные антитела типа антител человека со сформировавшимся сродством у многих животных, например, у кроликов и мышей. См., например, US 6632976.

[* разделы в этом месте замещены приведенными выше определениями]

Понятие «константная область» (constant region - CR) в контексте настоящего изобретения относится к генам константных областей иммуноглобулина. Гены константной области кодируют часть молекулы антитела, которая обусловливает эффекторные функции. Для химерных антител человека и гуманизированных антител, обычно не от человека (например, от мыши), константные области замещены константными областями человека. Константные области химерных или гуманизированных антител субъекта обычно происходят от иммуноглобулинов человека. Константная область тяжелой цепи может быть выбрана из какого-либо из пяти изотипов: альфа, дельта, эпсилон, гамма или мю. Кроме того, тяжелые цепи различных подклассов (например, подклассов тяжелых цепей подклассов IgG) ответственны за разные эффекторные функции и, таким образом, путем выбора определенной требуемой константной области тяжелой цепи, могут быть получены антитела с определенной эффекторной функцией. Константными областями, которые могут применяться в рамках охвата настоящего изобретения, являются гамма 1 (IgG1), особенно Fc областью гамма 1 (IgG1) изотипа, гамма 3 (IgG3) и особенно гамма 4 (IgG4). Константная область легкой цепи может быть типа каппа или лямбда, предпочтительно типа каппа. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения константная область легкой цепи является константной цепью каппа человека (Heiter и др., Cell 22, 1980, cc. 197-207) и тяжелая константная цепь является константной цепью IgG4 человека.

Понятие «область Fc» используют для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. Понятие «область Fc» может относиться к нативной последовательности области Fc или варианта области Fc. Хотя границы области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, область Fc тяжелой цепи иммуноглобулина человека обычно определяют в качестве отрезка от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230 до его С-конца. Область Fc иммуноглобулина обычно включает два константных домена, СН2 и СН3.

«Функциональная область Fc» обладает «эффекторной функцией» области Fc нативной последовательности. К примерам «эффекторной функции» относятся связывание C1q, комплементарно детерминируемая цитотоксичность, связывание рецептора Fc, антитело-зависимая клеточно опосредованная цитотоксичность, фагоцитоз, пониженная регуляция рецепторов на поверхности клеток (например, рецептора В клеток - В cell receptor (BCR)) и др. Такие эффекторные функции обычно нуждаются в том, чтобы область Fc была скомбинирована со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела) и могут быть оценены, используя различные методы анализа, описанные в настоящем изобретении. Функциональная область Fc обычно включает две тяжелые цепи СН2 и СН3, содержащие полипептиды, находящиеся в связи.

«Область нативной последовательности Fc» включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности области Fc, обнаруженной в ее природных вариантах.

«Вариант области Fc» включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности нативной последовательности области Fc на основании по меньшей мере одной «аминокислотной модификации», согласно описанию настоящего изобретения. Предпочтительно вариант области Fc содержит по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с нативной последовательностью области Fc или с областью Fc исходного полипептида, например, примерно от одной до примерно десяти замещенных аминокислот, предпочтительно примерно от примерно пяти аминокислотных замещений в нативной последовательности области Fc или в области Fc исходного полипептида. Вариант области Fc в контексте настоящего изобретения может предпочтительно обеспечивать по меньшей мере примерно 80% гомологии с областью нативной последовательности Fc и/или областью Fc исходного полипептида, и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% гомологии с нею, более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% гомологии с нею.

Понятие «аминокислотной модификации» относится к изменению аминокислотной последовательности предопределенной аминокислотной последовательности. К примерам модификаций относятся аминокислотные замещения, инсерции и/или делеции. Предпочтительная аминокислотная модификация в контексте настоящего изобретения является замещением.

«Аминокислотная модификация» по определенному положению, например в области Fc, относится к замещению или делеции определенного остатка, или к инсерции по меньшей мере одного аминокислотного остатка, смежного с определенным остаткам. Инсерция определенного «смежного» остатка означает инсерцию одного или двух остатков. Инсерция может быть N-концевой или C-концевой применительно к определенному остатку.

«Аминокислотное замещение» относится к замещению по меньшей мере одного имеющегося аминокислотного остатка в предварительно определенной аминокислотной последовательности с другим отличным «замещенным» аминокислотным остатком. Замещенный остаток (остатки) может быть «природным аминокислотным остатком» (т.е. кодированным генетическим кодом) и выбранным из группы, состоящей из: аланина (Ala), аргинина (Arg), аспарагина (Asn), аспарагиновой кислоты (Asp), цистеина (Cys), глутамина (Gln), глутаминовой кислоты (Glu), глицина (Gly), гистидина (His), изолейцина (Ile), лейцина (Leu), лизина (Lys), метионина (Met), фенилаланина (Phe), пролина (Pro), серина (Ser), треонина (Thr), триптофана (Trp), тирозина (Tyr) и валина (Val). Предпочтительно замещенный остаток не является цистеином. Замещение одного или нескольких неприродных аминокислотных остатков также относится к понятию аминокислотного замещения в контексте настоящего изобретения.

Понятие «неприродного аминокислотного остатка» относится к остатку, отличному от перечисленных выше аминокислотных остатков, которые могут ковалентно связывать смежные аминокислотные остатки (остаток) в полипептидной цепи. К примерам неприродных аминокислотных остатков относятся норлейцин, омитин, норвалин, гомосерин и другие аминокислотные остатки, аналогичные описанным Ellman и др., Meth. Enzym. 202, 1991, cc. 301-336. Для выработки таких неприродных аминокислотных остатков может быть использована методика Noren и др. Science 244, 1989, с.182, и Ellman и др., указанная выше. Вкратце, такие методики представляют химическое активирование супрессорной тРНК с остатком неприродной аминокислоты с последующей транскрипцией и трансляцией РНК in vitro.

Понятие «аминокислотные инсерции» относится к включению по меньшей мере одной аминокислоты в заранее определенную аминокислотную последовательность. Хотя инсерция обычно состоит из инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков, в настоящем изобретении рассматриваются более крупные «пептидные инсерции», например, инсерция примерно из 3-5 и до 10 аминокислотных остатков. Инсертированные остатки (остаток) могут быть природными и неприродными, описанными выше.

Понятие «аминокислотной делеции» относится к удалению по меньшей мере одного аминокислотного остатка из заранее сформированной аминокислотной последовательности.

Понятие «антителозависимой клеточно опосредованной цитотоксичности (ADCC)» относится к форме цитотоксичности, при которой секретированное антитело связано с антигеном-мишенью, экспрессированным клетками-мишенями, и распознается рецепторами Fc (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, клетках природных киллерах - Natural Killer (NK), нейтрофилах и макрофагах), благодаря которым эти цитотоксические эффекторные клетки специфически связываются для распознавания покрытых антителом клеток-мишеней и в результате убивают клетки-мишени цитотоксинами. Первичные клетки для опосредования ADCC, клетки NK, экспрессируют только Fc.gamma.RIII, поскольку моноциты экспрессируют Fc.gamma.RI, Fc.gamma.RII и Fc.gamma.RIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в табл.3 на с.464 в статье Ravetch, Kinet, Annu. Rev. Immunol 9, 1991, cc. 457-492. Для оценки действия ADCC исследуемой молекулы может быть проведен анализ ADCC in vitro, например, описанный в US 5500362 или 5821337. К соответствующим эффекторным клеткам для такого анализа относятся мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и клетки киллеры (NK). В другом варианте или дополнительно действие ADCC исследуемой молекулы может быть оценено in vivo, например, в животной модели, например, описанной Clynes и др. PNAS (USA) 95, 1998, cc. 652-656.

«Иммунными эффекторными клетками» являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют по меньшей мере Fc.gamma.RIII и осуществляют эффекторную функцию ADCC. К примерам лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, относятся мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), природные клетки киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, предпочтительно клетки МКПК и NK. Эффекторные клетки могут быть выделены из нативного источника, например, из крови, или МКПК согласно описанию в контексте настоящего изобретения.

«Комплементзависимая цитотоксичность (CDC)» относится к комплементзависимому лизису клеток-мишеней, который связан с реактивностью антитела, антиген которого экспрессируется клетками-мишенями. Активация классического метаболического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с их родственным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть проведено исследование CDC, например, описанное Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. Methods 202, 1996, с.163.

Полипептидом с вариантом IgG Fc с «измененным» FcR связывающим сродством или ADCC действием является полипептид, который имеет либо повышенное, либо пониженное FcR связывающее действие (Fc.gamma.R или FcRn) и/или ADCC действие по сравнению с исходным полипептидом или полипептидом, включающим область Fc нативной последовательности. Вариант Fc, который «проявляет повышенное связывание» с FcR, связывает по меньшей мере один рецептор FcR с повышенным сродством по сравнению с исходным полипептидом. Улучшение связывания по сравнению с исходным полипептидом может быть примерно в 3 раза, предпочтительно примерно в 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200 и до 500 раз или примерно от 25% до 1000%. Вариант полипептида, который «проявляет пониженное связывание» с FcR, связывает по меньшей мере один рецептор FcR с ухудшенным сродством по сравнению с исходным полипептидом. Снижение связывания по сравнению с исходным полипептидом может составлять примерно 40% или быть еще ниже. Такие варианты Fc, которые проявляют пониженное связывание с FcR, могут обладать малым или неприемлемым связыванием с FcR, например, 0-20% связыванием с FcR по сравнению с областью Fc нативной последовательности IgG, например, связыванием, описанным ниже в примерах.

Полипептид, включающий вариант области Fc, который «проявляет повышенную цитотоксичность ADCC» или опосредует антителозависимую клеточно опосредованную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно по сравнению с полипептидом, имеющим Fc IgG дикого типа, является полипептидом, который in vitro или in vivo существенно более эффективен в опосредовании ADCC, если количества полипептида с вариантом области Fc и полипептида с вариантом области Fc дикого типа, использованных в анализе, существенно те же (все другие факторы равноценны). Обычно такие варианты могут быть идентифицированы, используя анализ ADCC in vitro, но также рассматриваются другие анализы или методы определения действия ADCC, например, в животной модели, и др. Предпочтительный вариант более эффективен в опосредовании ADCC примерно в 5-100 раз, например, примерно в 25-50, по сравнению с Fc дикого типа.

Понятие «моноклональное антитело» также известно в данной области и относится к антителу, которое является продуктом одной клонированной продуцирующей антитело клетки. Моноклональное антитела обычно получают путем гибридизации нормально короткоживущих клеток, антитело-продуцирующих В-клеток с быстрорастущими клетками, например, раковыми клетками (иногда называемыми «бессмертными» клетками). Образуемые гибридные клетки, или гибридомы, быстро размножаются, создавая клон, который вырабатывает антитело.

Для цели настоящего изобретения понятие «моноклональное антитело» также подразумевает антитела, которые вырабатываются материнским клоном, который еще не достигает полной моноклональности.

Понятие «функционально эквивалентное антитело» в рамках охвата настоящего изобретения относится к антителу, которое существенным образом разделяет по меньшей мере одно важное функциональное свойство с указанным выше антителом, и в контексте настоящего изобретения включает: связывающую специфичность в отношении β-амилоидного белка, особенно Аβ_1-42 белка, и более конкретно в отношении области эпитопа 16-21 белка Аβ_1-42, иммунореактивность in vitro, подавление агрегирования мономеров Аβ_1-42 в высокомолекулярные полимерные фибриллы и/или дезагрегирования заранее сформированных полимерных фибрилл Aβ_1-42, и/или свойство разрушения β-слоя и облегчения проявлений амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна, при профилактическом или терапевтическом введении. Антитела могут принадлежать к какому-либо классу, например, IgG, IgM или IgA и др., или к какому-либо подклассу, например, IgG1, IgG2a и др., и другим подклассам, указанным выше в контексте настоящего изобретения или известным в данной области, но особенно класса IgG4. Кроме того, антитела могут быть получены каким-либо способом, например, фаговым дисплеем, или получены в каком-либо организме или линии клеток, включая бактерий, насекомых, млекопитающих или клетки и клеточные линии другого типа, которые вырабатывают антитела с желательными свойствами, например, гуманизированные антитела. Антитела также могут быть сформированы путем комбинирования части Fab и области Fc от разных видов.

Понятие «гибридизировать» в контексте настоящего изобретения относится к обычным условиям гибридизации, предпочтительно к условиям гибридизации, к которым относятся 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × раствор Денхардта, который используют в качестве раствора, и/или температуры гибридизации, находящиеся в интервале от 35°С до 70°С, предпочтительно 65°С. После гибридизации промывание предпочтительно проводят сначала с помощью 2 × SSC, 1% SDS и затем с помощью 0,2 × SSC при температуре от 35°С до 70°С, предпочтительно при 65°С (расшифровку SSPE, SSC и раствора Денхардта см. в статье Sambrook и др., приведенной выше). Условия жесткой гибридизации, например, описанные Sambrook и др., выше, являются особенно предпочтительными. Особенно предпочтительные условия жесткой гибридизации, например, применяют, если гибридизацию и промывку проводят при 65°С согласно указанному выше. Условия гибридизации, не являющиеся жесткими, например, с гибридизацией и промывкой проводят при 45°С или меньше, предпочтительно при 35°С или меньше.

«Гомологию» между двумя последовательностями определяют по идентичности последовательностей. Если две сравниваемые друг с другом последовательности отличаются по длине, идентичность последовательностей предпочтительно относится к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, которая идентична нуклеотидным остаткам более длинной последовательности. Идентичность последовательности обычно может быть определена с применением компьютерных программ, например, программы Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, фирма Genetics Computer Group по адресу: University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Программа Bestfit использует алгоритм гомологии Smith и Waterman, Advances in Applied Mathematics 2, 1981, cc. 482-489, чтобы установить сегмент, имеющий самую высокую идентичность двух последовательностей. При использовании программы Bestfit или другой программы выравнивания последовательностей для определения, может ли определенная последовательность иметь, например, 95% идентичность с референсной последовательностью по настоящему изобретению, параметры предпочтительно так подобраны, что процент идентичности рассчитывают по всей длине референсной последовательности, и что допустимы гомологичные гэпы до 5% от общего числа нуклеотидов в референсной последовательности. При использовании программы Bestfit так называемые необязательные параметры предпочтительно оставляют в их заранее установленных («по умолчанию») величинах. Отклонения, проявляемые при сравнении определенной последовательности с описанными выше последовательностями по настоящему изобретению, могут быть вызваны, например, путем добавления, делеции, замещения, инсерции или рекомбинации. Такое сравнение последовательностей предпочтительно также может выполняться по программе «fasta20u66» (версия 2.0u66, сентябрь 1998, предложена William R. Pearson и Университетом Вирджинии, см. также W.R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 1990, cc. 63-98, приводимые в настоящем изобретении примеры и сайт http://workbench.sdsc.edu/). Для этой цели могут быть применены установки «параметров по умолчанию.

Антитело по настоящему изобретению может быть иммуноглобином или антителом, о котором известно, что оно имеет каждый из сайтов связывания, который идентичен (при поливалентности), или, в другом варианте, может быть «биспецифичным» или «бифункциональным» антителом.

«Биспецифичное» или «бифункциональное антитело» является искусственным гибридным антителом, имеющим две разные пары тяжелой/легкой цепей и два разных сайта связывания. Биспецифичные антитела могут быть получены различными способами, включая гибридизацию гибридом или связывание фрагментов Fab'. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79, 1990, cc. 315-321, Kostelny и др., J. Immunol. 148, 1992, cc. 1547-1553.

Понятие «фрагмент» относится к части или порции антитела или цепи антитела, включающей несколько аминокислотных остатков по сравнению с интактным или полным антителом или цепочкой антитела. Фрагменты могут быть получены путем химической и ферментативной обработки интактного полного антитела или цепочки антитела. Фрагменты также могут быть получены методами рекомбинации. К примерам фрагментов относятся фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc и/или Fv. Понятие «антигенсвязывающий фрагмент» относится к фрагменту полипептида иммуноглобулина или антитела, которое связывает антиген или конкурирует с интактным антителом (т.е., с интактным антителом, от которого они происходят) за связывание антигена (т.е., специфическое связывание).

Связывающие фрагменты получают методами рекомбинации ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc, Fv, отдельные цепи и одноцепочечные антитела.

Понятие «фрагмент» также относится к пептиду или полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 5 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 70 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 подряд расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 подряд расположенных аминокислотных остатков, или по меньшей мере 250 подряд расположенных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности другого плипептида. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент полипептида сохраняет по меньшей мере одну функцию полипептида.

Понятие «антиген» относится к целому соединению или к его фрагменту, способному связываться с антителом. Иммуноген относится к антигену, который может вызвать в организме иммунный ответ, особенно у животного, более предпочтительно у млекопитающего, включая человека. Понятие «антиген» включает области, известные в качестве антигенных детерминантов или эпитопов, которые относятся к части антигена и контактируют или играют важную роль в поддержании контактного остатка в антигене, ответственном за антигенность, или антигенных детерминантах.

В контексте настоящего изобретения понятие «растворимый» означает частичную или полную растворимость в водном растворе.

Также в контексте настоящего изобретения понятие «иммуногенный» относится к веществам, которые вызывают выработку антитела, Т-клеток и реактивных иммунных клеток, направленных против антигена иммуногена.

Иммунный ответ происходит, когда индивидуум производит достаточное количество антител, Т-клеток и других реактивных иммунных клеток против введенной иммуногенной композиции настоящего изобретения для ослабления или облегчения расстройства, подвергаемого лечению.

Понятие «иммуногенности» в контексте настоящего изобретения относится к измерению способности антигена вызывать иммунный ответ (гуморальный или клеточный) при введении реципиенту. Настоящее изобретение относится к подходам, которые снижают иммуногенность химерных или гуманизированных антител человека у субъекта.

Гуманизированное антитело с пониженной иммуногенностью относится к гуманизированному антителу, проявляющему пониженную иммуногенность относительно родительского антитела, например, антитела мыши.

Гуманизированное антитело, которое в существенной степени сохраняет связывающие свойства родительского антитела, относится к гуманизированному антителу, которое сохраняет способность специфически связывать антиген, распознаваемый исходным антителом, используют для получения такого гуманизированного антитела. Предпочтительно гуманизированное антитело может проявлять те же или в существенной степени те же антигенсвязывающее сродство и авидность, что и исходное антитело. В идеале сродство антитела может быть не менее 10% от сродства исходного антитела, более предпочтительно не менее чем примерно 30%, и наиболее предпочтительно сродство не менее 50% исходного антитела. Способы определения антигенсвязывающего сродства известны в данной области и включают определение половины максимального связывания, анализ конкурентного связывания и анализ Scatchard. Соответствующие антигенсвязывающие исследования описаны в настоящей заявке.

Понятие «обратная мутация» означает мутацию, внедренную в нуклеотидную последовательность, которая кодирует гуманизированное антитело, мутация приводит к аминокислоте, соответствующей аминокислоте в исходном антителе (например, антителе-доноре, например, антителе мыши). Определенные остатки из каркасного участка исходного антитела могут быть сохранены во время гуманизирования антитела по настоящему изобретению для существенного сохранения связывающих свойств исходного антитела, но одновременно происходит минимизирование потенциальной иммуногенности получаемого антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения исходное антитело происходит от мыши. Например, обратная мутация изменяет остаток в каркасной области человека на исходный остаток мышиного антитела. К примерам остатков каркасной области мыши, которые могут обратно мутировать, относятся, но ими не ограничиваются, канонические остатки, остатки поверхности раздела, необычные исходные остатки, которые близки к сайту связывания, остатки в «зоне Vernier» (которая формирует платформу, на которой сохраняются области CDR) (Foote, Winter, J. Mol. Biol. 224, 1992, cc. 487-499), и те, которые близки к CDR Н3.

В контексте настоящего изобретения понятие «консервативное изменение» относится к изменениям, которые в существенной степени конформационно и антигенно нейтральны, производя минимальные изменения в третичной структуре мутантных полипептидов, или производя минимальные изменения в антигенных детерминантах мутантных полипептидов, соответственно по сравнению с нативным белком. Применительно к антителам и фрагментам антител по настоящему изобретению консервативное изменение означает аминокислотное замещение, которое не изменяет способности антитела связываться с рецептором субъекта. Специалист в данной области может прогнозировать, какие аминокислотные замещения могут быть получены при поддержании высокой вероятности поддержания конформационной и антигенной нейтральности. Такой подход предусмотрен, например, в публикациях Berzofsky, Science 229, 1985, cc. 932-940, и Bowie и др., Science 247, 1990, cc. 1306-1310. К факторам, которые рассматривают в качестве влияющих на возможность поддерживать конформационный и антигенный нейтралитет, относятся, но ими не ограничиваются: (а) замещение гидрофобных аминокислот менее вероятно влияет на антигенность, поскольку гидрофобные остатки более вероятно локализованы во внутренней части белка, (б) замещение физически и химически сходно, аминокислоты менее вероятно влияют на конформацию, поскольку замещенные аминокислоты структурно подражают нативным аминокислотам, и (в) изменение эволюционно консервативных последовательностей предположительно отрицательно влияет на конформацию, поскольку такая консервативность означает, что аминокислотные последовательности могут иметь важное значение для проявления функциональности. Специалист в данной области может оценить изменения конформации белка, используя известные методы, например, но ими не ограничиваются, методы фиксации микросохранений (Wasserman и др., J. Immunol. 87, 1961, cc. 290-295, Levine и др., Meth. Enzymol. 11, 1967, cc. 928-936) и методы анализа связывания, используя конформационнозависимые моноклональное антитела (Lewis и др., Biochem. 22, 1983, cc. 948-954).

Кроме того, понятие «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела, которое при введении человеку или животному достаточно для получения терапевтического эффекта у указанного человека или животного. Эффективное количество легко определить специалисту в данной области с помощью рутинных процедур.

В контексте настоящего изобретения понятия «лечение» и «предупреждение» относится к предупреждению рецидива или начала проявления одного или нескольких симптомов расстройства у субъекта, возникающего в результате введения профилактического или терапевтического

агента.

Конструирование гуманизированных антител

Настоящее изобретение может быть легче понято с помощью ссылки на нижеследующее подробное описание специфических вариантов осуществления настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные подробности определенных вариантов его осуществления, их не следует рассматривать в качестве ограничений при рассмотрении настоящего изобретения.

Настоящее изобретение предусматривает новые способы и композиции, включающие высокоспецифичные и высокоэффективные антитела, способные специфически распознавать и связываться со специфическими эпитопами из числа β-амилоидных антигенов. Антитела, которые могут быть получены с помощью способов настоящего изобретения, особенно применимы для лечения амилоидоза - группы заболеваний и расстройств, связанных с формированием амилоидных бляшек, включая вторичный амилоидоз и возрастной амилоидоз, включая, но ими не ограничиваясь, неврологические расстройства, например, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам, а также другие заболевания, которые основаны или связаны с белками амилоидного типа, например, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз (amyotropic lateral sclerosis - ALS), диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включая дегенерацию желтого пятна, которые являются примерами подобных заболеваний и расстройств.

Полностью гуманизированная или переформированная вариабельная область по настоящему изобретению может быть создана в рамках охвата настоящего изобретения, во-первых, конструированием вариабельной области аминокислотной последовательности, которая содержит области CDR, полученные не от человека, предпочтительно от грызуна, особенно предпочтительно полученные от антитела мыши ACI-01-Ab7C2 (называемого антителом «mC2» в настоящем изобретении, которое было депонировано 01 декабря 2005 в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) по адресу: Braunschweig, Mascheroder Weg 1 В, 38124 Braunschweig, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры, под номером DSM ACC2750), встроенные в последовательности каркасных участков, производных от антитела человека. Области CDR, производные не от человека, особенно от грызуна, которые могут быть получены от антитела по настоящему изобретению, предусматривают требуемую специфичность. Следовательно, остатки являются включенными в конструкцию переформированной вариабельной области в значительной степени неизменными. Какие-либо модификации, таким образом, могут быть сведены к минимуму, и тщательно контролируются изменения в специфичности и сродстве антитела. С другой стороны, теоретически остатки каркасных участков могут быть производными от какой-либо вариабельной области человека.

Для создания переформированного антитела, которое показывает приемлемое, и даже повышенное сродство, должны быть выбраны последовательности каркасного участка человека, которые равно применимы для создания переформированной вариабельной области и для сохранения сродства антитела.

Для достижения указанной цели была разработана оптимальная стратегия. Известно, что последовательности каркасного участка призваны поддерживать области CDR в правильной пространственной ориентации для взаимодействия с антигеном, и что остатки каркасного участка могут иногда даже участвовать в связывании антигена, эта стратегия направлена на минимизирование изменений, которые могут отрицательно воздействовать на трехмерную структуру антитела, путем изменения последовательности каркасного участка человека, применяемой для переформирования антитела из вариабельной области человека, которая наиболее гомологична или сходна с вариабельной областью, происходящей не от человека, особенно от грызуна. Это также может сделать максимальной вероятность того, что сродство может сохраниться в переформированном антителе.

В самом простом варианте «оптимальная» стратегия включает сравнение V-области грызуна-донора со всеми известными аминокислотными последовательностями V-области человека, и затем отбор наибольшей гомологии для обеспечения акцепторных каркасных участков для проведения гуманизирования. В реальности имеется несколько других факторов, которые следует учитывать, и которые могут влиять на конечный отбор акцепторных каркасных участков. В связи с этим могут быть применены прогнозы молекулярного моделирования в экспериментальной работе в попытке максимизации сродства получаемого переформированного антитела. По существу, цель моделирования заключается в прогнозировании того, какие ключевые остатки (если они есть) большинства гомологичных каркасных участков человека следует оставить, как и у грызуна, для получения наилучшего сродства в переформированном антителе.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения области CDR получают из мышиного моноклонального антитела, особенно из мышиного моноклонального антитела ACI-01-Ab7C2 (называемого в настоящем изобретении «mC2»), описанного в одновременно подаваемой заявке на патент ЕР 05 02 7092.5, поданной 12.12.2005, описание которой включено в настоящее изобретение в виде ссылки.

Клетки гибридомы FP-12H3-C2, вырабатывающие мышиное моноклональное антитело ACI-01-Ab7C2 (называемое в настоящем изобретении «mC2» и «hC2» для гуманизированного С2 антитела), были депонированы 01 декабря 2005 в связи с находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявкой ЕР05027092.5 в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) по адресу: Braunschweig, Mascheroder Weg 1 В, 38124 Braunschweig, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры, под номером DSM ACC2750.

Мышиное антитело может сформироваться против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, особенно β-амилоидного пептида Aβ_1-15, Аβ_1-16 и Аβ_1-16(Δ14), модифицированного гидрофобной частью молекулы, например, пальмитиновой кислотой или гидрофильной частью молекулы, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), или комбинацией обоих, причем гидрофобные и гидрофильные части молекулы, соответственно, ковалентно связаны с каждым из концов антигенного пептида через по меньшей мере одну, особенно одну или две аминокислоты, например, лизин, глутаминовую кислоту и цистеин, или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аминокислотный аналог, способные выступить в качестве связующего механизма для соединения гидрофобной и гидрофильной частей с пептидным фрагментом. Если ПЭГ используют в качестве гидрофильной части молекулы, свободный от ПЭГ конец ковалентно связан с фосфатидилэтаноламином или каким-либо другим соединением, способным функционировать в качестве элемента заякоривания, например, для внедрения антигенной конструкции в двойной слой липосомы.

В частности, мышиное антитело может сформироваться против надмолекулярной антигенной конструкции, включающей антигенный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности β-амилоидного пептида, особенно β-амилоидного пептида Aβ_1-16, модифицированного гидрофильной частью молекулы, например, гидрофильной частью молекулы полиэтиленгликолем (ПЭГ), ковалентно связанным с каждым из концов антигенного пептида через по меньшей мере одну, особенно одну или две аминокислоты, например, лизин, глутаминовую кислоту и цистеин, или какую-либо другую соответствующую аминокислоту или аминокислотный аналог, способные выступить в качестве связующего механизма для соединения гидрофобной и гидрофильной частей с пептидным фрагментом. Если ПЭГ используют в качестве гидрофильной части молекулы, свободный от ПЭГ конец ковалентно связан с фосфатидилэтаноламином или каким-либо другим соединением, способным функционировать в качестве элемента заякоривания, например, для внедрения антигенной конструкции в двойной слой липосомы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, которые включают в вариабельную область по меньшей мере одну область CDR, происходящую не от человека, встроенную в одну или несколько областей каркасного участка, производных от человека или примата, и комбинированную с константной областью, производной от антитела человека или примата, причем указанное химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент способно специфически распознавать и связывать β-амилоидный мономерный пептид.

Области CDR содержат остатки, которые наиболее вероятно связывают антиген, и которые должны сохраниться в переформированном антителе. Области CDR определены по последовательности, классифицированной по Kabat и др. В кн.: «Sequence of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5 изд., министерство здравоохранения и социального развития, правительство США. Области CDR относятся к каноническим классам (Chothia и др., Nature, 342, 1989, cc. 877-883), в которых ключевые остатки определяют по большой протяженности структурной конформации петли CDR. Эти остатки почти всегда сохраняются в переформированном антителе.

В процессе приготовления гуманизированного антитела по настоящему изобретению, аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела С2 (V_H и V_K) сравнивают с последовательностями V_H и V_K антитела грызуна в базах данных NCBI и Kabat.

Наиболее плотно совпадающим геном зародышевой линии мыши с С2 V_K является ген bb1, локус MMU231201 (Schable и др., 1999). Сравнение показывает, что имеются отличия по двум аминокислотам в от этой последовательности зародышевой линии, причем обе локализованы в CDRL1. Могут быть обнаружены зрелые антитела мыши со сходной, но не идентичной, последовательностью. Некоторые имеют идентичную последовательность CDRL2 и идентичную последовательность CDRL3, но область CDRL1 антитела С2 представляется уникальной. Сравнение с V_K последовательностями зародышевой линии человека показывает, что гены из подгруппы V_KII наилучшим образом спариваются с С2 V_K (Сох и др., 1994). Таким образом, последовательность С2 V_K может быть оценена по последовательности подгруппы MuV_KII по Kabat.

DPK15 вместе с областью J антитела HuJ_K1 может быть выбрана для обеспечения последовательностей акцепторного каркасного участка для гуманизированной области V_K.

Остатки на границе вариабельной легкой и тяжелой цепи определены (Chothia и др., J. Mol. Biol., 186, 1985, cc. 651-663). Они обычно сохраняются в переформированном антителе. Аминокислота Phe в положении 87 в С2 V_K мыши обычно не располагается на границе раздела, где Tyr более обычен в подгруппе V_KII, показывая, что этот остаток каркасного участка может быть важным для действия антитела. Остаток Tyr в положении 87 присутствует в зародышевой линии человека и гуманизированной области C2VK.

Последовательности гуманизированной области V_K таким образом могут быть сконструированы таким образом, что C2HuVK1 состоит из областей CDR мышиного С2 V_K с каркасными участками DPK 15 мыши и J_K1 человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения остатки мыши могут быть замещены в области каркасного участка человека по положениям 45, и/или 87, и/или 50 и/или 53. Остаток 45 может быть вовлечен в поддержание конформации областей CDR. Остаток 87 локализован по границе доменов V_H и V_K. Следовательно, эти остатки могут быть принципиально важными для поддержания связывания антитела.

Наиболее тесное спаривание гена зародышевой линии мыши С2 V_H AF является ген VH7183, локус AF120466, (Langdon и др., 2000). Сравнение с последовательностями V_H зародышевой линии человека показывает, что гены из подгруппы V_HIII наилучшим образом спариваются с С2 V_H. С2 V_H AF может быть отнесен к подгруппе MuV_HIIID по Kabat. Последовательность DP54 вместе с областью J в HuJ_H6 человека может быть выбрана для получения последовательностей акцепторного каркасного участка для гуманизированной области V_H.

Сравнение показывает, что имеется девять аминокислотных отличий между последовательностями С2 VH и акцепторной последовательностью зародышевой линии человека DP54, и J_H6 в большинстве случаев локализована в CDRH2. Обнаружены зрелые антитела мыши с идентичной или сходной (отличие в один остаток) областью CDRH1 или со сходной CDRH2 (отличие в один остаток), но ни одной области из трех областей CDR, идентичных С2 V_H AF. Область CDRH3 в антителе С2 обычно короткая, состоящая только из трех остатков. Однако другие антитела обнаружены в базе данных по областям CDRH3 указанной длины. Остаток 47 в С2 V_H является скорее Leu, а не более распространенным Trp, и остаток 94 является скорее Ser, а не в норме Arg, показывая, что эти остатки каркасного участка могут быть важны для действия антитела.

Могут быть сконструированы различные гуманизированные последовательности V_H. C2HuVH1 состоит из С2 V_H AF CDR с каркасными участками из DP54 и HuJ_H6. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения остатки мыши могут быть замещены в каркасном участке человека по положениям 47, или 94, или по обоим. Остаток 47 в каркасном участке 2 осуществляет контакт и с областями CDR, и с доменом V_K. Остаток 94 может быть вовлечен в поддержку конформации областей CDR. Следовательно, эти остатки могут быть критическими для поддержания связывания антитела.

Могут быть сконструированы различные области HCVR и LCVR, которые включают области CDR не от человека, получаемые от антитела-донора, например, антитела мыши, встроенного в нативную или модифицированную область каркасного участка, производного от человека или примата. Модификация может особенно касаться замены одного или нескольких аминокислотных остатков в каркасном участке на остатки, полученные не от человека, особенно на остатки мыши, более часто обнаруживаемые в положении в соответствующих подгруппах, или на остатки, которые обладают сходными свойствами с остатками, чаще обнаруживаемыми в этом положении в соответствующих подгруппах.

Модификация последовательностей каркасного участка области каркасного участка призваны поддержать области CDR в их правильной пространственной ориентации для взаимодействия с антигеном, причем остатки каркасного участка могут иногда даже участвовать в связывании антигена. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения проводят измерения по дальнейшей адаптации выбранных каркасных участков человека, чтобы сделать их наиболее схожими с поверхностями каркасных участков грызунов для максимизации вероятности того, что сродство может быть сохранено в восстановленном антителе.

Таким образом, остатки грызунов в области каркасного участка человека могут быть замещены. В частности, остатки грызунов могут быть замещены в каркасном участке вариабельной области тяжелой цепи человека (HCVR) в положениях 47, или 94, или в обоих положениях, а также в каркасном участке вариабельной области легкой цепи человека (LCVR) в положениях 45, и/или 87, и/или 50, и/или 53, соответственно.

Остатки, выявленные в указанных выше положениях в каркасном участке человека, могут быть заменены на остатки мыши, наиболее часто выявляемые в указанных положениях в соответствующих подгруппах. В частности, аминокислота Trp в положении 47 по Kabat в каркасном участке вариабельной области тяжелой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:15, может быть замещена на Leu или на аминокислотный остаток, который имеет сходные признаки, и замещение которого приведет к изменениям, которые в существенной степени конформационно или антигенно нейтральны, получая минимальные изменения в третичной структуре мутантных полипептидов, или получая изменения в антигенных детерминантах. В частности, аминокислота Trp в положении 47 по Kabat в каркасном участке вариабельной области тяжелой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:15, может быть дополнительно замещена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из норлейцина, Ile, Val, Met, Ala, и Phe, особенно Ile. Другие консервативные замещения могут быть рассмотрены, которые конформационно и антигенно нейтральны.

Аминокислота Arg в положении 94 по Kabat в каркасном участке вариабельной области тяжелой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:15, может быть замещена на Ser или на аминокислотный остаток со сходными свойствами, замещение которого приводит к изменениям, которые в существенной степени конформационно или антигенно нейтральны, получая минимальные изменения в антигенных детерминантах. В частности, Arg в положении 94 по Kabat в каркасном участке вариабельной области тяжелой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:15, может быть в другом варианте замещена на Thr.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения оба остатка могут быть замещены в гуманизированном антителе.

Аминокислота Gln в положении 45 по Kabat в каркасном участке вариабельной области легкой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:12, может быть замещена на Lys или на аминокислотный остаток со сходными свойствами, замещение которого приводит к изменениям, которые в существенной степени конформационно или антигенно нейтральны, получая минимальные изменения в третичной структуре мутантных полипептидов, или получая минимальные изменения в антигенных детерминантах. В частности, аминокислота Gln в положении 45 по Kabat в каркасном участке вариабельной области легкой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:12, может быть в другом варианте замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Arg, Gln и Asn, особенно Arg.

Аминокислота Leu в положении 50 по Kabat в каркасном участке вариабельной области легкой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:12, может быть замещена на Lys или на аминокислотный остаток со сходными свойствами, замещение которого приводит к изменениям, которые в существенной степени конформационно или антигенно нейтральны, получая минимальные изменения в третичной структуре мутантных полипептидов, или получая минимальные изменения в антигенных детерминантах. В частности, аминокислота Leu в положении 50 по Kabat в каркасном участке вариабельной области легкой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:12, может быть замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Arg, Gln и Asn, особенно Arg.

Аминокислота Asn в положении 53 по Kabat в каркасном участке вариабельной области легкой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:12, может быть замещена на His и Gln или на аминокислотный остаток со сходными свойствами, замещение которого приводит к изменениям, которые в существенной степени конформационно или антигенно нейтральны, получая минимальные изменения в третичной структуре мутантных полипептидов, или получая минимальные изменения в антигенных детерминантах. В частности, аминокислота Asn в положении 53 по Kabat в каркасном участке вариабельной области легкой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:12, может быть замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Gln, His, Lys и Arg.

Аминокислота Thr в положении 87 по Rabat в каркасном участке вариабельной области легкой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:12, может быть замещена на Phe или на аминокислотный остаток со сходными свойствами, замещение которого приводит к изменениям, которые в существенной степени конформационно или антигенно нейтральны, получая минимальные изменения в третичной структуре мутантных полипептидов, или получая минимальные изменения в антигенных детерминантах. В частности, аминокислота Tyr в положении 87 по Kabat в каркасном участке вариабельной области легкой цепи, производном от человека или примата, показанном в SEQ ID NO:12, может быть замещена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Leu, Val, Ile и Ala, особенно Leu.

Полученная таким образом вариабельная область, включающая по меньшей мере одну область CDR, происходящую не от человека, которая встроена в один или несколько каркасных участков, производных от человека или примата, затем может быть скомбинирована с константной областью, производной от антитела человека или примата, особенно с константными областями IgG4 или к человека, соответственно. Константная область IgG4 может быть модифицирована, например, заменяя серин в положении 228 в шарнирной области на пролин (HuIgG4 Ser-Pro). Такая мутация стабилизирует межцепочечную дисульфидную связь и предупреждает формирование половинок молекул, что возможно в препаратах нативного IgG4 человека. Константная область IgG4 может быть дополнительно модифицирована делецией концевого Lys в положении 439, показанном в SEQ ID NO:16.

Модифицированные вариабельные области могут быть сконструированы методом, известным в данной области, например перекрывающейся ПЦР рекомбинацией. Экспрессирующие кассеты для химерного антитела, С2 ChV_H AF и С2 ChV_K, могут быть применены в качестве матриц для мутагенеза каркасных участков в требуемые последовательности. Наборы пар мутагенных праймеров синтезируют, включая области, подвергаемые изменению. Полученные гуманизированные V_H и V_K экспрессирующие кассеты могут быть клонированы в соответствующих векторах клонирования, известных в данной области, например, pUC19. После подтверждения, что целая последовательность ДНК соответствует V_H и V_K, модифицированные гены V-области тяжелой и легкой цепи могут быть исключены из вектора клонирования в качестве кассет экспрессии и переносят на соответствующие векторы экспрессии.

Мутирование области Fc

Настоящее изобретение предусматривает методы получения варианта полипептида, особенно антитела, включающего область варианта. Такое антитело включает, например, вариант области Fc, и может применяться для лечения заболевания или расстройства, например, амилоидоза.

«Исходный», «стартовый» или «безвариантный» полипептид получают, используя методы, применяемые в данной области для получения полипептидов, включающих, например, область Fc. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения исходный полипептид является антителом, а примеры методов получения антитела более подробно описаны в последующих разделах. Исходный полипептид, однако, может быть каким-либо другим полипептидом, включающим область Fc region, например, иммуноадгезином. Способы получения иммуноадгезинов более подробно рассмотрены ниже.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения вариант области Fc может быть выработан способами, описанными в настоящем изобретении, и такой «вариант области Fc» может быть гибридизирован с гетерологичным полипептидом выбора, например, вариабельным доменом антитела или связывающим доменом рецептора, или лигандом.

Исходный полипептид включает область Fc. Обычно область Fc исходного полипептида может включать нативную последовательность области Fc, и предпочтительно нативную последовательность области Fc человека. Однако область Fc исходного полипептида может иметь одно или несколько изменений или модификаций в имеющейся аминокислотной последовательности из области Fc нативной последовательности. Например, способность области Fc связывать C1q может быть ранее изменена (другие типы модификаций области Fc подробнее описаны ниже). В другом варианте осуществления настоящего изобретения область Fc исходного полипептида является «умозрительной» и, хотя она физически не существует, специалист по конструированию антител может принять решение по желаемой аминокислотной последовательности варианта области Fc и получить полипептид, включающий эту последовательность или ДНК, кодирующую требуемый вариант аминокислотной последовательности области Fc.

Однако в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая область Fc исходного полипептида, доступна, и такая последовательность нуклеиновой кислоты изменена для получения варианта последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант D265A области Fc.

ДНК, кодирующую вариант аминокислотной последовательности стартового полипептида, получают разными методами, известными в данной области. К этим методам относятся, но ими не ограничиваются, получение сайт-направленным мутагенезом (или ологонуклеотид-опосредованным), ПЦР-мутагенезом и кассетным мутагенезом ранее полученной ДНК, кодирующей полипептид.

Сайт-направленный мутагенез - предпочтительный способ для получения замещенных вариантов. Этот способ известен в данной области (см., например, Carter и др., Nucleic Acids Res. 13, 1985, cc. 4431-4443, и Kunkel и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1987, с.488). Вкратце, при выполнении сайт-направленного мутагенеза ДНК стартовую ДНК изменяют первым гибридизированием олигонуклеотида, кодирующего требуемую мутацию, с одной цепью такой стартовой ДНК. После гибридизации ДНК-полимеразу используют для синтеза целой второй цепи, используя гибридизированный олигонуклеотид в качестве праймера, и используя одну цепь стартовой ДНК в качестве матрицы. Таким образом, олигонуклеотид, кодирующий требуемую мутацию, внедряют в получаемую двухнитевую ДНК.

ПЦР-мутагенез также применим для получения вариантов аминокислотной последовательности стартового полипептида. См. Higuchi в кн.: «PCR Protocols», 1990, изд. Academic Press, cc. 177-183, и Vallette и др., Nuc. Acids Res. 17, 1989, cc. 723-733. Вкратце, если используют малые количества матричной ДНК в качестве стартового материала в ПЦР, праймеры, мало отличающиеся по последовательности от соответствующей области в матричной ДНК, могут применяться для получения относительно больших количеств специфического фрагмента ДНК, который отличается от последовательности матрицы только по положениям, в которых праймеры отличаются от матрицы.

Другой способ получения вариантов - кассетный мутагенез, основан на методе, описанном Wells и др., Gene 34, 1985, cc. 315-323. Стартовым материалом является плазмида (или другой вектор), включающая ДНК стартового полипептида, подвергаемого мутированию. Кодон (ко доны) в стартовой ДНК, подвергаемые мутированию, идентифицированы. Должен быть уникальный сайт для эндонуклеазы рестрикции на каждой стороне идентифицированного сайта (сайтов) мутирования. Если сайтов рестрикции нет, они могут быть получены с помощью указанного выше метода олигонуклеотид-опосредованного мутагенеза для их внедрения по определенным местам в ДНК стартового полипептида. Плазмидную ДНК разрезают по сайтам для линеаризации. Двухнитевую кодирующую олигонуклеотид последовательность ДНК между сайтами рестрикции, включающую требуемые мутации (мутацию) синтезируют, используя стандартные процедуры, причем две нити олигонуклеотида синтезируют отдельно и затем гибридизируют вместе, используя стандартные методики. Двухнитевой олигонуклеотид называется кассетой. Такая кассета конструируется для получения концов 5' и 3', которые совместимы с концами линеаризованной плазмиды, таким образом, что могут быть прямо лигированы в плазмиду. В результате плазмида содержит последовательность мутантной ДНК.

В другом варианте или дополнительно требуемая последовательность аминокислоты, кодирующая полипептидный вариант, может быть определена, а нуклеотидная последовательность, кодирующая такой вариант аминокислотной последовательности, может быть получена синтетически.

Аминокислотная последовательность исходного полипептида модифицируется для получения варианта области Fc с измененным связывающим сродством или действием рецептора Fc in vitro, и/или in vivo, и/или измененным действием антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) in vitro, и/или in vivo, и/или с измененным действием клеточно опосредованной цитотоксичности (CDC) in vitro и/или in vivo.

Обычно модификация вызывает одно или несколько аминокислотных замещений. Замещение может быть, например, «консервативным замещением». Существенным модификации биологических свойств области Fc могут быть дополнены выбором замещений, которые существенно отличаются по их воздействию на поддержание (а) структуры каркаса полипептида в области замещения, например, в виде конформации плоскости или спирали, (б) заряда или гидрофобности молекулы по сайту-мишени, или (в) объема боковой цепи. Природные остатки поделены на группы, основанные на общих свойствах боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile,

(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr,

(3) кислотные: asp, glu,

(4) основные: asn, gln, his, lys, arg,

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro, и

(6) ароматические: trp, tyr, phe.

Помимо аминокислотных замещений настоящее изобретение рассматривает другие модификации аминокислотной последовательности исходной области для получения, например, варианта области Fc с измененной эффекторной функцией.

Например, можно делегировать один или несколько аминокислотных остатков области Fc для снижения связывания с рецептором FcR. Обычно можно делегировать один или несколько остатков области Fc, идентифицированных в настоящем изобретении в качестве влияющих на связывание FcR, для того, чтобы получить такой вариант области Fc. Обычно можно делегировать не более примерно 1-10 остатков в таком варианте осуществления настоящего изобретения. Область Fc в настоящем изобретении, включающая одну или несколько аминокислотных делеций, предпочтительно сохраняет по меньшей мере примерно 80%, предпочтительно по меньшей мере примерно 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 95%, исходной области Fc или нативной области последовательности Fc человека.

Путем внедрения модификаций соответствующей аминокислотной последовательности в исходную область Fc, например, можно получить вариант области Fc, который (а) опосредует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более или менее эффективно, и/или (б) связывает рецептор Fc гамма (Fc.gamma.R) с большим или меньшим сродством по сравнению с исходным полипептидом. Такие варианты области Fc могут обычно включать по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в области Fc. Комбинирование аминокислотных модификаций предположительно особенно желательно. Например, вариант области Fc может включать две, три, четыре, пять и более замещений, например, в определенных положениях области Fc, выявленных в настоящем изобретении.

Например, в составе IgG1 может быть получен вариант области Fc с уменьшенным связыванием Fc.gamma.R за счет внедрения аминокислотной модификации по какому-нибудь одному или нескольким положениям аминокислот 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 или 439 области Fc. См., например, US 6737056.

Варианты IgG1, которые проявляют пониженное связывание с Fc.gamma.RI, включают варианты, содержащие аминокислотную модификацию области Fc по какому-нибудь одному или нескольким положениям аминокислот 238, 265, 269, 270, 327 или 329. См., например, US 6737056.

К вариантам IgG1, которые проявляют пониженное связывание с Fc.gamma.RII, относятся варианты, содержащие аминокислотную модификацию области Fc по какому-нибудь одному или нескольким положениям аминокислот 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 или 439. См., например, US 6737056.

К вариантам IgG1, которые проявляют пониженное связывание с Fc.gamma.RIII, относятся варианты, содержащие аминокислотную модификацию области Fc по какому-нибудь одному или нескольким положениям аминокислот 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 или 437. См., например, US 6737056.

Специалисту в данной области следует учитывать, что сходные эффекты могут быть получены путем варьирования остатков в других областях Ig Fc, хотя нумерация остатков может быть другой. См., например, US 6737056.

Может быть сконструирована область Fc с измененной эффекторной функцией, например, путем модифицирования связывания C1q и/или связывания FcR и за счет этого изменения действия CDC и/или действия ADCC. Например, можно получить вариант области Fc с улучшенным связыванием C1q и улучшенным связыванием Fc.gamma.RIII, например, имеющий и улучшенное действие ADCC, и улучшенное действие CDC. В другом варианте, если требуется, чтобы эффекторная функция была снижена или ликвидирована, может быть сконструирован вариант области Fc с пониженным действием CDC, и/или пониженным действием ADCC. В других вариантах осуществления настоящего изобретения можно повысить только одно из указанных действий, а также необязательно понизить другие действия, например, получить вариант области Fc с улучшенным действием ADCC, но пониженным действием CDC, и наоборот. См., например, US 6737056.

Дальнейшие изменения аминокислотной последовательности могут заключаться в том, что остаток цистеина, который не участвует в поддержании должной конформации варианта полипептида, также может быть замещен, обычно на серин, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предупреждения неправильного поперечного сшивания. См., например, US 6737056.

Другой тип аминокислотного замещения призван изменять шаблон гликозилирования полипептида. Такое изменение может быть достигнуто делецией одной или нескольких углеводных частей, обнаруженных в полипептиде, и/или добавлением одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые не содержатся в полипептиде. Гликозилирование полипептидов обычно N-связанное или O-связанное. N-связанное относится к присоединению углеводной части молекулы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, в которых Х обозначает какую-либо аминокислоту за исключением пролина, являются последовательностями распознавания для ферментативного присоединения углеводной части молекулы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие одной из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает сайт потенциального гликозилирования. O-связанное Гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров, N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы, к гидроксиаминокислоте, в большинстве случаев к серину или треонину, хотя также может быть и к 5-гидроксипролину или 5-гидроксилизину. Добавление сайтов гликозилирования к полипептиду обычно сопровождается изменением аминокислотной последовательности, например, таким образом, что она содержит одну или несколько указанных выше трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение также может быть получено добавлением или замещением одного или нескольких остатков серина или треонина на последовательность исходного полипептида (для O-связанных сайтов гликозилирования). Пример варианта гликозилирования имеет аминокислотное замещение остатка Asn 297 в тяжелой цепи. См., например, US 6737056.

Кроме того, класс, подкласс или аллотип области Fc при желании может быть изменен замещением одной или нескольких аминокислот для получения области Fc с аминокислотной последовательностью, более гомологичной по отношению к другому классу, подклассу или аллотипу. Например, область Fc мыши может быть изменена для получения аминокислотной последовательности, которая более гомологична к области Fc человека; область Fc не-А аллотипа IgG1 человека может быть модифицирована для получения области Fc А аллотипа IgG1 человека, и т.д. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения амино-модификации (модификацию) в контексте настоящего изобретения с измененным FcR связыванием и/или ADCC действием получают в домене СН2 области Fc, а домен СН3 делегируют или замещают другим доменом димеризации. Предпочтительно домен СНЗ сохраняют (независимо от аминокислотных модификаций, которые изменяют эффекторную функцию, согласно описанию настоящего изобретения). См., например, US 6737056.

Исследование связывания

Способность варианта полипептида связывать рецептор FcR может быть повышена. Если FcR является рецептором области Fc и обладает высоким сродством, например, Fc.gamma.RI, FcRn или Fc.gamma.RIIIA-V158, связывание может быть измерено путем титрования варианта мономерного полипептида и измерения связанного варианта полипептида, используя антитело, которое специфически связывает вариант полипептида в стандартном формате метода ELISA. См., например, US 6737056. Исследования связывания FcR для рецепторов FcR, обладающих низким сродством, известны в данной области и описаны, например, в US 6737056.

Для оценки действия ADCC варианта полипептида может быть проведен анализ ADCC in vitro, используя варьирующие соотношения эффектор:мишень. Применимыми «эффекторными клетками» для такого исследования могут быть мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). В другом варианте, или дополнительно, действие варианта полипептида может быть оценено in vivo, например, в модели животного, например, описанной Clynes и др., PNAS (USA) 95, 1998, cc. 652-656.

Векторы экспрессии

Какой-либо соответствующий вектор экспрессии может применяться в практике настоящего изобретения. Например, специалист в данной области мог бы экспрессировать IgG1, например, в pSVgpt. Вектор экспрессии pSVgpt основан на pSV₂gpt (Mulligan и Berg, 1980) и включает ген устойчивости к ампициллину для отбора бактериальных клеток, ген gpt для отбора в клетках млекопитающих, энхансерную область тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, геномную последовательность, кодирующую ген константной области, и SV40 поли-А последовательности. Вариабельную область тяжелой цепи для экспрессии внедряют в виде фрагмента от сайта HindIII до сайта BamHI.

Вектор экспрессии pSVhyg включает ген устойчивости к ампициллину для отбора в бактериальных клетках, ген hyg для отбора в клетках млекопитающих, энхансерную область тяжелой цепи иммуноглобулина, геномную последовательность, кодирующую ген константной области каппа, и последовательности энхансера каппа и SV40 поли-А. Вариабельная область легкой цепи для экспрессии инсертирована в виде фрагмента от сайта HindIII до сайта BamHI.

Правильность последовательности ДНК затем может быть подтверждена для векторов экспрессии для гуманизированных V_H и V_K.

Для получения антитела векторы экспрессии гуманизированной тяжелой и легкой цепи могут быть внедрены в соответствующие линии продуцирующих клеток, известных в данной области, например в клетки NS0. Внедрение векторов экспрессии может сопровождаться совместной трансфекцией через электропорацию или каким-либо другим соответствующим методом, известным в данной области. Линии клеток, вырабатывающих антитело, затем могут быть отобраны и размножены, а гуманизированное антитело очищено. Очищенные антитела затем могут быть проанализированы стандартными методами, например, SDS-PAGE.

Антитела с повышенным сродством, специфичностью, стабильностью

Последовательность CDRL2 («KVSNRFS») антитела мыши С2 может быть незначительно модифицирована без побочного воздействия на проявляемую активность антитела. Консервативные замещения могут быть получены через замену R на К в положении 50 и S на N в положении 53. Двумя другими последовательностями CDRL2 являются «RVSNRFS» и «KVSSRFS» соответственно. Они включены в последовательность V_K мыши без других изменений и обозначены С2 VK-R и С2 VK-S соответственно.

Сродство, специфичность и стабильность антитела по настоящему изобретению, описанного выше, или его фрагмента, могут быть модифицированы путем изменения профиля гликозилирования или структуры, приводящих к повышенным терапевтическим показателям.

Для достижения такого изменения в структуре гликозилирования, клетки-хозяева могут быть сконструированы таким образом, что они способны экспрессировать предпочтительный диапазон активности гликопротеин-модифицированной гликозилтрансферазы, которая повышает разветвленные GIcNA, несущие сложные N-связанные олигосахариды. Кроме того, могут быть получены модифицированные гликоформы гликопротеинов, например, антитела, в том числе целые молекулы антител, фрагменты антител или гибридные белки, которые включают область, эквивалентную области Fc иммуноглобулина, имеющую повышенную Fc-опосредованную клеточную цитотоксичность.

Способы получения антитела с модифицированным типом гликозилирования известны специалистам в данной области и описаны, например, в ЕР 1071700, US 2005272128, Ferrara и др., J Biol Chem 281(8), 2006, cc. 5032-5036, Ferrara и др., Biotechnology и Bioengineering 93(5), 2006, cc. 851-861.

Фармацевтическое приготовление и введение

Антитела по настоящему изобретению, но особенно моноклональное антитело по настоящему изобретению, может быть приготовлено в физиологически приемлемом составе и может включать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель и/или эксципиент, используя известные методики. Например, антитело по настоящему изобретению, описанное выше, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, в частности моноклональное антитело, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, комбинируют с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем и/или эксципиентом для формирования терапевтической композиции. Соответствующие фармацевтические носители, растворители и/или эксципиенты известны в данной области и включают, например, фосфатно-солевые буферные растворы, воду, эмульсии, например, по типу масло/вода, различные типы увлажняющих агентов, стерильных растворов и т.д.

Состав композиции по настоящему изобретению может быть получен стандартным методом, известным специалистам в данной области.

Композиции по настоящему изобретению могут быть введены субъекту в твердой, жидкой или аэрозольной форме в соответствующей фармацевтически эффективной дозе. К примерам твердых композиций относятся таблетки, мази, имплантируемые дозированные единицы. Таблетки могут вводиться перорально. Терапевтические мази могут применяться местно. Имплантируемые дозированные единицы могут вводиться местно, например, в место опухоли, или могут имплантироваться для системного высвобождения терапевтической композиции, например, подкожно. Примерами жидкой композиции являются составы, адаптированные для инъекций внутримышечных, подкожных, внутривенных, внутриартериальных, и составы для местного и внутриглазного введения. Примерами аэрозольных составов являются ингаляционные составы для введения в легкие.

Композиции могут вводиться стандартными способами введения. Обычно композиция может вводиться местно, перорально, ректально, внутриназально, внутрикожно, внутрибрюшинно или парентерально (например, внутривенно, подкожно или внутримышечно). Кроме того, композиция может быть включена в матрицу устойчивого высвобождения, например биоразрушаемые полимеры, полимеры, имплантированные поблизости от целевого места высвобождения, например в месте опухоли. Способ включает введение единичной дозы, введение повторяющихся доз с заранее установленными интервалами и устойчивое введение на протяжении заранее определенного периода времени.

Матрицей устойчивого высвобождения, используемой в настоящем изобретении, может быть матрица из материалов, обычно полимерных, поддающихся разрушению ферментами, или кислотным/щелочным гидролизом, или растворением. После внедрения в организм матрица подвергается воздействию ферментов и тканевых жидкостей. Матрицу устойчивого высвобождения желательно выбирать по биосовместимости материалов, например, липосом, полилактидов (полимолочной кислоты), полигликолидов (полимера из гликолевой кислоты), сополимера полилактида и гликолида (сополимера молочной и гликолевой кислот), полиангидридов, поли(орто)эфиров, полипептидов, гиалуроновой кислоты, коллагена, хондроитина сульфата, полиаминокислот, жирных кислот, фосфолипидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот, полиаминокислот, аминокислот, например, фенилаланина, тирозина, изолейцина, полинуклеотидов, поливинилпропилена, поливинилпирролидона и силикона. Предпочтительной биоразрушаемой матрицей является матрица одного из материалов: полилактида, полигликолида или сополимера полилактида и гликолида (сополимера молочной и гликолевой кислот).

Специалистам в соответствующей области известно, что доза композиции может зависеть от разных факторов, например подвергаемого лечению состояния, определенной используемой композиции и других клинических факторов, например, массы тела, размера, пола и общего состояния пациента, площади поверхности тела, определенного вводимого соединения или композиции, других одновременно вводимых лекарственных средств, а также от способа введения.

Композиция может вводиться в комбинации с другими композициями, включающими биологически активное соединение, особенно по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений против окислительного стресса, антиапоптозных соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, например, пирензепина и метаболитов, 3-амино-1- пропансульфоновой кислота, 1,3-пропандисульфоната, активаторов α-секретазы, ингибиторов β- и γ-секретазы, тау белков, нейротрансмиттеров, нарушителей β-слоев, аттрактантов для амилоид бета очищающих/истощающих клеточных компонентов, ингибиторов усеченного по N-концу амилоида бета, включая амилоид бета 3-42 в форме пироглутамата, противовоспалительных молекул или ингибиторов холинэстеразы (cholinesterase inhibitor - ChEI), например, такрина, ривастигмина, донепезила и/или галантамина, агонистов M1 и других лекарственных средств, включая какой-либо амилоид или тау модифицированное лекарственное средство и пищевые добавки, пищевые добавки вместе с антителом по настоящему изобретению, а также необязательно фрамацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент и продуценты для лечения заболеваний.

Белковые фармацевтического действия материалы могут быть представлены в количестве от 1 нг до 10 мг на дозу. Обычно режим введения находится в диапазоне от 0,1 мкг до 10 мг антитела по настоящему изобретению, особенно в диапазоне от 1,0 мкг до 1,0 мг, и более предпочтительно в диапазоне от 1,0 мкг до 100 мкг, с индивидуальными количествами, попадающими в эти диапазоны, что также составляет часть настоящего изобретения. Если введение проводят путем непрерывной инфузии, уточненная доза может быть в диапазоне от 0,01 мкг до 10 мг на кг массы тела в час, с индивидуальными количествами, попадающими в эти диапазоны, что также составляет часть настоящего изобретения.

Введение обычно парентеральное, например внутривенное. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные и неводные растворы, суспензии и эмульсии. К неводным растворителям относятся, но ими не ограничиваются, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, инъекционные органические сложные эфиры, например этилолеат. Водные растворы могут быть выбраны из группы, состоящей из воды, водноспиртовых растворов, эмульсий или суспензий, включая солевые и буферные среды. К парентеральным растворителям относятся раствор хлорида натрия, раствор Рингера декстрозный, раствор декстрозы и хлорида натрия, раствор Рингера лактат или нелетучие масла. К внутривенным растворителям относятся жидкие и пищевые наполнители, электролитные наполнители (например, основанные на растворе Рингера декстрозном) и другие. Также могут содержаться консерванты, например, антимикробные, антиоксидантные, хелатирующие агенты, инертные газы и др.

Фармацевтическая композиция может дополнительно включать носители, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, особенно от человека. Другими агенты биологического действия могут быть в фармацевтических композициях настоящего изобретения в зависимости от их предназначения.

Если связываемая мишень расположена в мозге, предусмотрены некоторые варианты осуществления настоящего изобретения для проникновения антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалический барьер. Некоторые нейродегенеративные заболевания связаны с повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера, поэтому антитело или его действующий фрагмент легко проникают в мозг. Если гематоэнцефалический барьер сохраняется интактным, могут быть применены некоторые известные подходы для транспортировки молекул через него, включая, но ими не ограничиваясь, физические методы, методы, основанные на липидах, и методы, основанные на рецепторе и канале.

К физическим методам транспортировки антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалический барьер относятся, но ими не ограничиваются, обход гематоэнцефалического барьера или создание отверстий в гематоэнцефалитном барьере. К обходным методам относятся, но ими не ограничиваются, прямая инъекция в мозг (см., например, Papanastassiou и др., Gene Therapy 9, 2002, cc. 398-406) и имплантация высвобождающего устройства в мозг (см., например, Gill и др., Nature Med. 9, 2003, cc. 589-595, и Gliadel Wafers™, фирма Guildford Фармацевтическая). К средствам преодоления барьера относятся, но ими не ограничиваются, ультразвук (см., например, US 2002/0038086), осмотическое давление (например, введением гипертонического раствора маннита (кн.: Neuwelt E. A. «Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation», 1989, изд-во Plenum Press, т.1-2, Нью-Йорк), проницаемость за счет применения, например, брадикинина или агента проницаемости А-7 (см., например, US 5112596, 5268164, 5506206 и 5686416), и трансфекция нейронов, которые преодолевают гематоэнцефалитный барьер с помощью векторов, содержащих гены, кодирующие антитело или антигенсвязывающий фрагмент (см., например, US 2003/0083299).

Методы на основе липидов по доставке антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалический барьер включают, но ими не ограничиваются, инкапсулирование антитела или его действующего фрагмента в липосомы, которые соединяются с антитело-несущими фрагментами, связывающимися с рецепторами на эндотелии сосудов гематоэнцефалического барьера (см., например, US 20020025313), и наносят антитело или его действующий фрагмент на частицы липопротеина низкой плотности (см., например, US 20040204354) или на аполипопротеин Е (см., например, US 20040131692).

Способы, основанные на рецепторе и канале, по транспортировки антитела или его действующего фрагмента через гематоэнцефалический барьер, включают, но ими не ограничиваются, применение глюкокортикоидных блокаторов для повышения проницаемости через гематоэнцефалический барьер (см., например, US 2002/0065259, 2003/0162695 и 2005/0124533), активации калиевых каналов (см., например, US 2005/0089473), подавления переносчиков ABC лекарственного средства (см., например, US 2003/0073713), нанесения антитела с трансферрином и модулирования действия одного или нескольких рецепторов трансферина (см., например, US 2003/0129186) и катионизировании антитела (см., например, US 5004697).

Выявление/диагностика

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы и наборы для выявления и диагностики связанных с амилоидом заболеваний и состояний. К этим способам относятся известные иммунологические способы, обычно используемые для выявления или подсчета веществ в биологических образцах или в состоянии in situ.

Диагноз связанного с амилоидом состояния или заболевания пациента может быть поставлен путем выявления иммуноспецифического связывания моноклонального антитела или его действующего фрагмента с эпитопом амилоидного белка в образце или in situ, которое включает получение образца, или определенной части тела, или определенной области тела, предположительно содержащих амилоидный белок, и приведение его в контакт с антителом, которое связывает эпитоп на амилоидном белке, позволяя антителу связать амилоидный белок с формированием иммунологического комплекса, выявляя формирование иммунологического комплекса и корреляцию наличия или отсутствия иммунологического комплекса с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или определенной части тела, или определенной области тела.

Биологическими образцами, которые могут применяться для диагностики связанного с амилоидом заболевания или состояния, например, могут быть жидкости, например сыворотка, плазма, слюна, секреты пищеварительной системы, слизь, спинномозговая жидкость, лимфатическая жидкость и др., или образцы тканей или клеток, полученные от организма, например образцы нервной ткани, образцы мозга, сердца или ткани сосудов. Для определения наличия или отсутствия амилоидного белка в образце могут быть применены какие-либо из методов, известных специалистам в данной области. (См. Harlow и Lane в кн.: «Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, изд. Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, cc. 555-612). Могут быть, например, использованы анализы, которые используют методы непрямого определения, используя вторичные реагенты для выявления, методы ELISA и методы анализа иммунопреципитации и агглютинации. Подробное описание этих методов, например, приведено в WO96/13590 и WO96/29605.

Для диагностики in situ антитело или какая-либо его действующая и функциональная часть могут быть введены в диагностируемый организм методами, известными в данной области, например, инъекцией внутривенно, интраназально, внутрибрюшинно, интрацеребрально, внутриартериально таким образом, что может быть осуществлено специфическое связывание между антителом по настоящему изобретению с областью эпитопа на амилоидном белке. Комплекс антитело/антиген может быть обнаружен по метке, присоединенной к антителу или его функциональному фрагменту.

Иммуноисследования, используемые для диагностики, обычно основаны на меченых антигенах, антителах или вторичных реагентах. Эти белки или реагенты могут быть помечены соединениями, обычно известными специалистам в данной области, к которым относятся ферменты, радиоизотопы, а также флуоресцентные, люминесцентные и хромогенные вещества, включая окрашенные частицы, например, коллоидное золото и латексные гранулы. Из них может применяться радиоактивная метка для почти всех типов исследования с большим числом вариаций. Конъюгированные с ферментом метки особенно применимы, если требуется избежать радиоактивности или если нужны быстрые результаты. Флуорохромы, хотя необходимо дорогое оборудование для их применения, предоставляют очень чувствительный метод детекции. Антитела, применимые в этих исследованиях, включают моноклональные антитела, поликлональные антитела и очищенные по сродству поликлональные антитела.

В другом варианте на антитело может быть нанесена метка непрямой реакцией с мечеными веществами, которые имеют сродство к иммуноглобулину, например, белком А или G или вторые антитела. Антитело может быть объединено со вторым веществом и выявлено меченым третьим веществом, имеющим сродство со вторым веществом, объединенным с антителом. Например, антитело может быть объединено с биотином, и конъюгат антитело-биотин выявляют, используя меченый авидин или стрептавидин. Сходным образом антитело может быть объединено с гаптеном, и конъюгат антитело-гаптен выявляют, используя меченое анти-гаптеновое антитело.

Специалистам в данной области могут быть известны эти и другие соответствующие метки, которые могут быть применены в соответствии с настоящим изобретением. Связывание таких меток с антителами или их фрагментами могут быть произведены, используя стандартные методы, известные специалистам в данной области. Типичные методики описаны Kennedy J. Н. и др., (Clin. Chim. Acta 70, 1976, cc. 1-31), Schurs A. H. W. М. и др. (Clin. Chim Acta 81, 1977, cc. 1-40). Методами соединения, упоминаемыми позднее, являются метод с применением глутаральдегида, метод с применением периодата, метод с применением дималеимида и другие, каждый из которых включен в настоящее изобретение в виде ссылки.

В современном иммуноанализе используют двойное антитело для выявления наличия определяемого соединения. Антитело метят косвенным образом путем взаимодействия со вторым антителом, которое помечают выявляемой меткой. Второе антитело предпочтительно является антителом, которое связывается с антителами животного, от которого получено моноклональное антитело. Иначе говоря, если моноклональное антитело является мышиным антителом, тогда меченое второе антитело является антителом против мышиного антитела. Для моноклонального антитела, используемого в описанном ниже анализе, такая метка предпочтительно является покрытой антителом гранулой, особенно магнитной гранулой. Для поликлонального антитела, используемого в иммуноанализе, описанном в настоящем изобретении, метка предпочтительно является выявляемой молекулой, например, радиоактивной, флуоресцентной или электрохемилюминесцентным веществом.

Другие системы двух антител являются системой быстрого формата, поскольку они адаптированы для быстрого определения наличия исследуемого соединения, и также могут использоваться в рамках охвата настоящего изобретения. Эта система требует высокого сродства между антителом и исследуемым соединением. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения наличие амилоидного белка определяют, используя пару антител, каждое из которых специфично для амилоидного белка. Одно антитело из указанной пары обозначается в контексте настоящего изобретения «антителом-детектором», а другое антитело из указанной пары называется «антителом-ловушкой». Моноклональное антитело по настоящему изобретению может применяться в качестве или антитела-ловушки, или антитела-детектора. Моноклональное антитело по настоящему изобретению также может использоваться в качестве и антитела-ловушки, и антитела-детектора вместе в одном анализе. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения таким образом используют метод сэндвича с двойным антителом для выявления амилоидного белка в образце биологической жидкости. В этом методе исследуемое соединение (амилоидный белок) зажимается между антителом-детектором и антителом-ловушкой, причем антитело-ловушка необратимо иммобилизовано на твердой основе. Антитело-детектор может содержать выявляемую метку для идентификации наличия сэндвича антитело-исследуемое соединение и, таким образом, наличие исследуемого соединения.

К примерам твердофазных веществ относятся, но ими не ограничиваются, планшеты для микротитрований, тест-пробирки из полистерола, магнитные, пластиковые или стеклянные гранулы и пластины, которые известны в области иммуноанализа и ферментного иммуноанализа. Методы соединения антитела с твердыми фазами известны специалистам в данной области. Ранее ряд пористых материалов, например, нейлона, нитроцеллюлозы, ацетата целлюлозы, стеклянных волокон и других пористых материалов, был использован в качестве твердой основы.

Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для выявления амилоидного белка в биологическом образце, включающем композицию, согласно описанному выше. Кроме того, настоящее изобретение относится к последнему диагностическому набору, который помимо композиции, описанной выше, также включает реагент для выявления, согласно описанному выше. Понятие «диагностический набор» относится в основном к какому-либо диагностическому набору, известному в данной области. Более конкретно, последний термин относится к диагностическому набору согласно описанию Zrein и др. (1998).

Еще один объект настоящего изобретения предусматривает новые иммунозонды и наборы для тестирования и диагностики связанных с амилоидом заболеваний и состояний, включая антитела по настоящему изобретению. Для иммунозондов антитела прямо или опосредованно присоединены к соответствующей репортерной молекуле, например, к ферменту или радионуклиду. Тест-набор включает контейнер, несущий одно или несколько антител по настоящему изобретению, и инструкции по применению антител для цели связывания с амилоидным белком для формирования иммунологического комплекса и выявления формирования иммунологического комплекса таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка.

Примеры

Материалы

Разработка и приготовление мышиного моноклонального антитела ACI-01-Ab7C2 (называемого в настоящем изобретении «mC2» и «hC2» для гуманизированного антитела С2) описаны в находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке ЕР 05 02 7092.5, сущность которой включена в контекст настоящего изобретения в виде ссылки.

Клетки гибридомы FP-12H3-C2, вырабатывающие мышиное моноклональное антитело ACI-01-Ab7C2 (называемое в настоящем изобретении «С2» и «hC2» для гуманизированного С2 антитела), были депонированы 01 декабря 2005 в связи с находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявкой ЕР05027092.5 в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) по адресу: Braunschweig, Mascheroder Weg 1 В, 38124 Braunschweig, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры, под номером DSM ACC2750.

Клетки гибридомы культивируют в среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle Medium - DMEM), обогащенной 10% фетальной сывороткой теленка и антибиотиками (пенициллином/стрептомицином). Изотип получаемого антитела проверяют и подтверждают ожидаемую принадлежность к мышиному IgG2b/каппа.

Анализ

Метод ELISA для определения связывания амилоида бета обеспечивает надежное измерение эффективности антитела С2. Положительным контролем антитела является мышиное антитело FP-12H3-C2 (фирма Genovac, номер в каталоге AK379/01) и стандартное антитело 1560 фирмы Chemicon (номер в каталоге 0508008791).

Выбор константных областей человека

Поскольку для клинического антитела-кандидата восстановление иммунной системы не является желательным, выбранной константной областью человека для тяжелой цепи является IgG4 человека, модифицированный для замене серина в положении 228 в шарнирной области на пролин (HuIgG4 Ser-Pro). Эта мутация стабилизирует межцепочечную дисульфидную связь и предупреждает формирование половинных молекул, которые могут быть в препаратах нативного IgG4 человека. Антитело, экспрессируемое вырабатываемыми клеточными линиями может также иметь удаленный концевой лизин. Последовательности константных областей человека HuIgG4 Ser-Pro и каппа человека представлены в виде SEQ ID NO:17 и 14, соответственно.

Пример 1. Клонирование и сиквенс вариабельных областей антитела

Суммарную РНК получают из 3×10⁶ клеток гибридом (одна колба Т175), используя мини-набор Qiagen RNeasy (номер в каталоге 74104). РНК элюируют в 50 мкл воды и контролируют в 1,2% агарозном геле. Кондиционированную среду от клеток сохраняют, и образцы используют для тестирования в анализе действия антитела.

V_H и V_K кДНК получают, используя обратную транскриптазу с праймерами мышиного IgG и к константной области. Первую цепь кДНК амплифицируют методом ПЦП, используя большой набор праймеров сигнальных последовательностей. Амплифицированные ДНК очищают в геле и клонируют в векторе pGem® Т Easy (фирма Promega). Полученные клоны V_H и V_K подвергают скринингу на инсерты ожидаемого размера методом ПЦР и последовательность ДНК выбранных клонов определяют автоматическим секвенированием ДНК. Расположения областей, определяющих комплементарность, (complementarity determining regions - CDR) в последовательностях определяют относительно последовательностей других антител (Kabat EA и др., 1991). В настоящей заявке используют нумерацию Kabat для вариабельных областей антитела, следовательно, номера остатков могут отличаться от прямой линейной нумерации.

Последовательность ДНК и логически установленная аминокислотная последовательность mC2 V_K представлены в виде SEQ ID NO:29 и 27, соответственно. Четыре клона вырабатывают указанную идентичную продуктивную последовательность. Непродуктивную отклоняющуюся последовательность V_K, которая образуется от партнера гибридомы по слиянию, также обнаруживают у ряда клонов.

Для mC2 V_H, выделяют две разные продуктивные последовательности. Последовательность mC2 V_H AF (см. SEQ ID NO:30) обнаруживают в общей сложности у 29 клонов, с 14 заменами единичных оснований в отдельных клонах. Последовательность mC2 V_H В обнаруживают в общей сложности у 8 клонов. Пять из них представляют последовательность большинства, последовательности трех других клонов представляют ее вариации. Возможно, что эти сходные последовательности V_H В возникают в качестве артефакта ПЦР амплификации. Непродуктивную нарушенную последовательность V_H также получают из гибридомы С2 и приписывают дефектному сочленению V-D-J.

Для того чтобы определить правильную действующую последовательность mC2 V_H, получают два химерных антитела с двумя разными последовательностями V_H, AF и В, комбинированными с mC2 V_K, проверяемых на правильное действие антитела.

Пример 2. Конструирование генов химерного антитела

Химерное антитело человека в наиболее общей форме состоит из константных областей человека, связанных в мышиными (или другими, но не принадлежащими человеку) вариабельными областями. Химерное антитело предоставляет весьма полезный инструмент, во-первых, для подтверждения, что были идентифицированы корректные вариабельные области, во-вторых для применения в качестве контрольного антитела в антиген-связывающих исследованиях с теми же эффекторными функциями, используя те же реагенты вторичного обнаружения, что и гуманизированное или сконструированное антитело, и также могут применяться для исследования фармакокинетики и других свойств константных областей человека относительно определенной мишени для антитела.

Векторы экспрессии химерной тяжелой цепи конструируют, совмещая mC2 V_H AF или mC2 V_H В вариабельные области, связанные с константной областью HuIgG4 (Ser-Pro) в векторе экспрессии pSVgpt (фиг.1). Основой является pSV₂gpt (Mulligan и Berg, 1980), которая включает ген устойчивости к ампициллину для отбора в бактериальных клетках, ген gpt для отбора в клетках млекопитающих, энхансерную область тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, геномную последовательность, кодирующую ген константной области и SV40 поли-А последовательности. Вариабельную область тяжелой цепи для экспрессии инсертируют в качестве фрагмента HindIII - BamHI.

Вектор химерной легкой цепи конструируют, совмещая С2 VK, связанный с константной областью С каппа человека в векторе экспрессии pSVhyg (фиг.2). pSVhyg включает ген устойчивости к ампициллину для отбора в бактериальных клетках, ген hyg для отбора в клетках млекопитающих, энхансерную область тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, геномную последовательность, кодирующую ген константной области каппа и включающую энхансер каппа и SV40 поли-А последовательности. Вариабельная область легкой цепи для экспрессии инсертируют в виде фрагмента HindIII - BamHI.

Кассеты экспрессии для последовательностей мыши С2 VH и VK конструируют путем добавления 5' фланкирующей последовательности, включающей лидерный сигнальный пептид, лидерный интрон и промотор иммуноглобулина мыши, а также 3' фланкирующей последовательности, включающей сайт сплайсирования и интронную последовательность, используя векторы VH-PCR1 и VK-PCR1 в качестве матриц (Riechmann и др., 1988). Корректность последовательности ДНК подтверждают для VH и VK в химерных векторах экспрессии. Последовательности ДНК и аминокислот VH и VK генов в кассетах экспрессии показаны на фиг.3 и 4.

Пример 3. Экспрессия химерного антитела

3.1 Экспрессия в стабильных линиях клеток

Для экспрессии антитела используют линию клеток NS0 миеломы мыши, не продуцирующих иммуноглобулин, полученную из Европейской коллекции культур клеток животных, Нортон, Великобритания (European Collection of Animal Cell Cultures - ЕСАСС, номер в каталоге 85110503). Векторы экспрессии тяжелой и легкой цепи совместно трансфецируют в клетки NSO путем электропорации. Колонии, экспрессирующие ген gpt, отбирают в среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium - DMEM), обогащенной 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ), 0,8 мкг/мл микофеноловой кислоты и 250 мкг/мл ксантина. Проводят скрининг трансфецированных клонов на выработку антитела человека методом ELISA на IgG человека. Линии клеток, секретирующих антитело, нарабатывают, и наиболее продуктивные клоны отбирают и замораживают в жидком азоте. Наиболее продуктивные линии клеток для каждого антитела нарабатывают в среде, согласно указанному выше, но только с 5% ФСТ. Химерное антитела очищают, используя Prosep®-A (фирма Bioprocessing Ltd). Концентрацию определяют методом ELISA для IgGK антитела человека. Антитела также анализируют методом SDS-PAGE.

3.2. Кратковременная экспрессия химерного антитела

Для ускорения тестирования разных химерных антител используют кратковременную экспрессию для быстрой выработки малых количеств супернатантов клеток, содержащих рекомбинантное антитело для тестирования. Кассеты экспрессии mC2 V_H и V_K переносят на векторы, основанные на pcDNA3.1 (фирма Invitrogen) для кратковременной экспрессии. Вектор тяжелой цепи включает константную область IgG человека. Вектор легкой цепи включает константную область каппа человека. И mC2 V_H AF, и mC2 V_H В трансфецируют с mC2 V_K в эмбриональные клетки почки человека (HEK 298) с реагентом Lipofectamine 2000 (фирма Invitrogen, номер в каталоге 11668) по протоколу производителя. Кондиционированную среду от клеток собирают через 3 суток после трансфекции. Количество вырабатываемого антитела определяют методом ELISA для IgGκ антитела человека.

Пример 4. Действие химерных С2 антител

4.1. Действие химерного С2 антитела, вырабатываемого путем кратковременной трансфекции

Образцы кондиционированной среды после кратковременной трансфекции тестируют на два разных химерных антитела методом ELISA по связыванию амилоида бета. Результаты четко показывают, что С2 VH AF является корректной последовательностью. Химерное антитело С2 V_H AF/C2 V_K связывается хорошо в данном анализе, но С2 V_H B/C2 V_K не проявляет какого-либо связывания. Контрольное антитело Миши Chemicon 1560 показывает хорошее связывание, но связывание поставленным очищенным мышиным антителом С2 было низким. Следует отметить, что другое вторичное антитело применяют для мышиных антител с мышиными константными областями по сравнению с химерными антителами с константными областями человека, поэтому результаты непосредственно нельзя сопоставить. Позднее было установлено, что кондиционированная среда от гибридомы С2 в настоящем анализе показывает хороший результат.

4.2. Действие очищенных химерных С2 антител

Два разных С2 химерных антитела очищают от стабильной линии клеток NS0 согласно описанию и тестированию методом амилоид бета ELISA. Полученные результаты находятся в соответствии с результатами, полученными с кратковременно экспрессированным антителом. Антитело С2 ChVH AF/ChVK связывается хорошо в методе ELISA, а антитело С2 ChVH B/ChVK не связывается совсем.

Пример 5. Конструкция генов гуманизированного С2 антитела

Аминокислотные последовательности mC2 V_H и V_K сравнивают с последовательностями антителом V_H и V_K антитела грызуна по базам данных NCBI и Kabat.

5.1. Вариабельная область легкой цепи

Наиболее близким геном зародышевой линии мыши к mC2 V_K является ген bb1, локус MMU231201, (Schable и др., 1999). Только две аминокислоты отличаются от указанной последовательности зародышевой линии, которые обе расположены в CDRL1. Установлены зрелые антитела мыши с близкой, но не идентичной последовательностью. Некоторые идентичны CDRL2 и идентичны CDRL3, но последовательность CDRL1 в антителе mC2 представляется уникальной. mC2 V_K может быть по классификации Kabat отнесена к подгруппе MuV_KII. Положение 87 в mC2 V_K скорее означает F, чем Y, что более свойственно в данной подгруппе, показывая, что этот остаток каркасного участка может быть важен для действия антитела. Сравнение с последовательностями V_K зародышевой линии человека показывает, что гены из подгруппы V_KII наилучшим образом совпадают с mC2 V_K (Сох и др., 1994). Последовательность DPK15 вместе с областью J region HuJ_K1 человека выбирают для обеспечения акцепторный последовательности каркасного участка для гуманизированной последовательности V_K.

Конструируют четыре гуманизированные последовательности V_K. C2HuVK1 состоит из mC2 V_K областей CDR с каркасными участками от DPK 15 и J_K1 человека. В версиях 2, 3 и 4 остатки мыши замещены в каркасном участке по положениям 45, или 87, или по обоим. Остаток 45 может быть вовлечен в поддержку конформации областей CDR. Остаток 87 локализован на границе раздела доменов V_H и V_K. Следовательно, эти остатки могут быть критическими для поддержания связывания антитела.

Положения и изменения, которые были произведены в областях каркасных участков легкой цепи, представлены в табл.1. Сравнение гуманизированных последовательностей с последовательностью mC2 V_K, а также с DPK15 и J_K1 человека.

5.2. Вариабельная область тяжелой цепи

Наиболее близким геном зародышевой линии мыши к mC2 V_H AF является ген VH7183, локус AF120466, (Langdon и др., 2000). Сравнение показано на фиг.5. Девять аминокислот отличаются от этой последовательности зародышевой линии, большинство расположено в CDR2. Обнаружены зрелые антитела мыши с идентичной или близкой (отличие в одном остатке) областью CDR1 или с близкой областью CDR2 (отличие в одном остатке), но не обнаружено ни одного со всеми тремя CDR, идентичными mC2 V_H AF. Область CDR3 антитела mC2 необычно короткая, состоящая только из трех остатков. Однако другие антитела обнаружены в базе данных с CDR3 данной длины. Последовательность mC2 V_H AF может быть отнесена по системе Kabat к подгруппе MuV_HIIID. Остаток Residue 47 в mC2 V_H означает скорее L, чем более распространенный W, а остаток 94 означает скорее S, чем в норме R, свидетельствуя, что такие остатки в каркасном участке могут быть важны для действия антитела. Сравнение с последовательностями V_H зародышевой линии человека показывает, что гены из подгруппы V_HIII наилучшим образом сочетаются с mC2 V_H. Последовательность DP54 вместе с областью J человека HuJ_H6 отбирают для обеспечения акцепторных последовательностей каркасного участка для гуманизированной V_H.

Конструируют четыре гуманизированные последовательности V_H. C2HuVH1 состоит из областей CDR mC2 V_H AF с каркасными участками их DP54 и HuJ_H6. В версиях 2, 3 и 4 мышиные остатки были замещены в каркасном участке по положениям 47 или 94, или по обоим. Остаток 47 в каркасном участке 2 создает контакт и с областями CDR, и с доменом V_K. Остаток 94 может участвовать в поддержке конформации областей CDR. Следовательно, эти остатки могут быть критическими для поддержания связывания антитела.

Положения и изменения, произведенные в областях каркасного участка тяжелой цепи, показаны в табл.2.

Пример 6. Конструкция генов гуманизированного антитела

Модифицированные вариабельные области конструируют методом перекрывающейся ПЦР рекомбинации. Кассеты экспрессии для химерного антитела, С2 ChV_H AF и С2 ChV_K, используют в качестве матриц для мутагенеза областей каркасного участка для требуемых последовательностей. Наборы пар мутагенных праймеров синтезируют, охватывают области, подвергаемые изменению. Полученные кассеты экспрессии гуманизированных V_H и V_K клонируют в pUC19 и подтверждают, что целая последовательность ДНК корректна и для V_H, и для V_K. Модифицированные гены V-области тяжелой и легкой цепи удаляют из pUC19 в виде кассет экспрессии HindIII - BamHI. Их трансферируют на векторы экспрессии pSVgpt и pSVhyg, которые включают Ser-pro или к константные области IgG4 человека, соответственно, как и для векторов химерного антитела. Подтверждают, что последовательность ДНК корректна для гуманизированных V_H и V_K в векторах экспрессии.

Пример 7. Экспрессия гуманизированных антител

7.1. Экспрессия в стабильных клеточных линиях

Векторы экспрессии гуманизированных тяжелой и легкой цепей совместно трансфецируют в клетки NS0 путем электропорации для экспрессии химерного антитела. Линии клеток, вырабатывающие антитело, отбирают и размножают, гуманизированные антитела очищают, точно так же, как химерное антитело. Очищенные антитела анализируют методом SDS-PAGE.

7.2. Краткосрочная экспрессия гуманизированных антител

Для ускорения тестирования разных гуманизированных конструкций V_H и V_K экспрессирующие кассеты гуманизированных V_H и V_K антитела С2 также переносят на векторы для краткосрочной экспрессии, описанной в разделе 7.2. Четыре конструкции V_K гуманизированного антитела С2 совместно трансфецируют с конструкцией V_H химерного антитела С2 в клетки HEK293. Подобным образом четыре конструкции V_H гуманизированного антитела С2 совместно трансфецируют с конструкцией V_K химерного антитела С2 в клетки HEK293. Кондиционированную среду от клеток собирают через трое суток после трансфекции. Количество вырабатываемого антитела определяют методом ELISA для антитела IgGK человека.

Пример 8. Действие гуманизированных антител С2

8.1. Действие гуманизированного антитела С2, выработанного путем краткосрочной трансфекции

Образцы кондиционированной среды при краткосрочной трансфекции тестируют методом амилоид-бета ELISA. Полученные результаты четко показывают, что конструкции гуманизированной VH C2 HuVH AF версий 2 и 4 являются функциональными при комбинации с каппа цепью химерного антитела C2, и сопоставимы с химерным C2 антителом в настоящем исследовании. Напротив, у антител, содержащих C2 HuVH AF версии 1 и 3, объединенные с каппа цепью химерного антитела C2, в данном анализе показано, что связывание полностью отсутствует. Это означает, что замещение остатка мыши по положению 94 важно для действия антитела. Антитела, содержащие тяжелую цепь химерного антитела C2, комбинированные с четырьмя каппа цепями гуманизированного антитела C2, все показывают хорошее связывание, сопоставимое со связыванием химерного антитела при использовании метода ELISA.

8.2. Действие очищенного гуманизированного антитела C2

Восемь разных гуманизированных C2 антител, включающих все комбинации двух гуманизированных тяжелых цепей и четырех гуманизированных легких цепей, очищают от стабильной линии клеток NSO согласно описанному, и тестируют, используя метод амилоид-бета ELISA (фиг.6).

Полученные результаты четко указывают, что C2 HuVH4 антитела действуют лучше в анализе, чем C2 HuVH2 антитела. Из C2 HuVH2 антител, C2 HuVH2/HuVK3 показывает наилучшее связывание, но оно примерно в 2 раза ниже по сравнению с химерным контрольным антителом C2 ChVHAF/ChVK. Действие C2 HuVH2/HuVK2 в четыре-пять раз ниже по сравнению с контролем. Действие антител, включающих C2HuVH4 с четырьмя разными гуманизированными легкими цепями, сходно. Наибольшее действие устанавливают у C2HuVH4/HuVK1, и все четыре антитела близки к контрольному химерному антителу в данном анализе.

Пример 9. Модификации области CDRL2

9.1. Конструирование легкой цепи с модифицированной областью CDR 2

Выше указано, что многие антитела имеют ту же последовательность CDRL2 ("KVSNRFS"), что и антитело C2. Было решено исследовать, может ли область CDRL2 быть немного модифицирована без неблагоприятного воздействия на действие антитела. Были выбраны две консервативные замены: R для К в положении 50 и S для N в положении 53. Две разные последовательности CDRL2 следовательно представляют «RVSNRFS» и «KVSSRFS». Они были включены в последовательность V_K мыши без других изменений в виде mC2 VK-R и mC2 VK-S, соответственно.

9.2. Краткосрочная экспрессия модифицированного антитела CDRL2

Две конструкции легкой цепи антитела С2 с модифицированной областью CDRL2, описанной в разделе 11.2.1, клонируют в вектор легкой цепи для кратковременной экспрессии. Каждую конструкцию совместно трансфецируют с вектором V_H химерного антитела С2 в клетки HEK293. Кондиционированную среду от клеток собирают через трое суток после трансфекции. Количество вырабатываемого антитела определяют методом ELISA для IgGκ антитела человека.

9.3 Действие антитела С2 с модифицированной областью CDRL2

Образцы кондиционированной среды при краткосрочной трансфекции mC2 V_K с модифицированной областью CDRL2, комбинированной с V_H антитела mC2, тестируют методом амилоид-бета ELISA (фиг.7). Оба, и VK-R, и VK-S антитела, сравнимы с химерным антителом С2, указывая, что индивидуальные выбранные модификации CDRL2 существенно не влияют на действие антитела в этом анализе.

Пример 10. Определение сродства

Для оценки связывающей специфичности и сродства мышиного (ACI-01-Ab-7-С2) химерного (AF) и гуманизированного антитела (H4K1, H4K4), проводят анализ BIACORE.RTM., используя амилоид-бета 1-42 мономеры и волокна в качестве антигена, иммобилизованного на чипе СМ5. Технология BIACORE.RTM. использует изменения в показателе преломления на поверхностном слое при связывании антитела с антигеном, иммобилизованным на слое. Связывание определяют с помощью поверхностного плазменного резонанса (surface plasmon resonance - SPR) света лазера, отраженного от поверхности. Анализ кинетики падающего и отраженного сигнала позволяет различать неспецифическое и специфическое взаимодействие. Применяют концентрацию антитела в диапазоне от 0,05 мкМ до 1,0 мкМ.

	Мономеры	Волокна
	ka(1/мсек)	kd(1/сек)	KD(М)	ka(1/Ms)	kd(1/сек)	KD(M)
Мышиное ACI-01-Ab-7-C2	1,8Е+04	2,7E-03	1,5Е-07	2,4Е+04	9,9Е-04	4,1Е-08
химерное AF	4,7Е+04	9,5Е-04	2Е-08	5,1Е+04	3,3Е-04	6,5Е-09
гуманизированное H4K1	5,0Е+04	9,5Е-04	1,9Е-08	4,9Е+04	2,3Е-04	4,7Е-09
гуманизированное H4K4	2,5Е+04	4,4Е-04	1,8Е-08	1,3Е+05	3,0Е-04	2,3Е-09

Пример 11. Иммуногистохимический анализ связывания

11.1. Срезы мозга человека

Мозг здоровых людей, больных на стадии, предшествующей БА без проявления слабоумия, и больных БА получают из Университетской клиники в Бонне после соблюдения этических норм. Мозг фиксируют формальдегидом, и область гиппокампа обезвоживают, погружая в парафин, затем с помощью микротома нарезают срезы толщиной 5 мкм. Парафиновые срезы хранят при комнатной температуре до применения. Для свежего материала криосекции толщиной 5 мкм нарезают криостатом, и срезы хранят при -80°С до использования.

11.2. Иммуногистохимия

Из срезов в парафине удаляют парафин и проводят обводнение путем погружения срезов в ксилен, затем в 100% этанол, 90% этанол и 70% этанол. Фон понижают путем 30 мин инкубирования в 10% НзОз, 10% метаноле в воде. Восстановление антигена производят путем инкубирования срезов в 100% муравьиной кислоте в течение 3 мин. После 3 промываний в трисе в буферном солевом растворе (TBS, рН 7,5), неспецифическую метку блокируют 2-часовым инкубированием срезов в 10% БСА, 0,25% Triton Х-100 в TBS. После промывки (3 промывки в TBS) блокируют эндогенные антитела путем добавления немеченого антитела против IgG человека (фирма Biomeda) и инкубирования срезов во влажных камерах в течение ночи при комнатной температуре. Еще через 3 промывания первичное анти-амилоидное антитело человека добавляют к среде и инкубируют еще 24 ч при комнатной температуре. После промывания меченое щелочной фосфатазой вторичное антитело против IgG человека (фирма Sigma) добавляют к срезам и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывания срезы обрабатывают красителем Liquid permanent Red (фирма Dakocytomation), промывают водой и высушивают на воздухе до закрепления с постоянной поддерживающей средой (корбитбальзамом).

Криосрезы фиксируют в метаноле в течение 30 мин при -80°С и снижают фон добавлением H₂O₂ к холодному метанолу до конечной концентрации 10% и инкубированием в течение 30 мин при комнатной температуре. После трех промываний в трис-солевом буфере (TBS, рН 7,5), неспецифическую метку блокируют путем 2-часового инкубирования срезов в 10% БСА, 0,25% Triton X 100 в TBS согласно указанному выше и проводят окрашивание методом, описанным выше.

Срезы исследуют с помощью микроскопа Leica DMLB и фотографируют, используя камеру Leica DC500 и программное обеспечение Leica FireCam1.2.0.

Оба антитела человека А и С метят бляшки в мозге больных БА (фиг.8). Мечеными являются и диффузные, и коровые бляшки. Кроме того, диффузные бляшки у пациентов без слабоумия, находящихся на стадии, предшествующей проявлению БА, также могут быть выявлены с помощью антител А и С. Амилоид при церебральной амилоидной ангиопатии (cerebral amyloid angiopathy - САА) несет метку обоих антител и некоторое окрашивание нейронов, которое может соответствовать внутриклеточному амилоиду, также было обнаружено. Метку не выявляют в контрольных образцах мозга от здоровых пациентов. Бляшки могут быть обнаружены на парафиновых срезах, предварительно обработанных муравьиной кислотой, но не было меченых бляшек на парафиновых срезах без предварительной обработки муравьиной кислотой и на криосрезах, фиксированных в метаноле. Антитело В человека не выявляет бляшек на парафиновых срезах, и мышиное антитело не окрашивает ни парафиновые, ни криосрезы мозга человека.

Аббревиатуры:

А = связывающее химерное антитело AF (IgG4)

В = несвязывающее химерное антитело В (IgG4)

С = связывающее гуманизированное антитело H4K1 (IgG4)

Мышь = ACI-01-Ab-С2 мышиное антитело (IgG2b)

Пример 12. Функциональность антитела mC2 на амилоидных волокнах

12.1. Модификация конформации волокон Аβ1-42 и инициация дезагрегирования после связывания антитела mC2

Для оценки механизма, с помощью которого антитело может дезагрегировать заранее сформированные бета-амилоидные (Аβ_1-42) волокна, проводят в непосредственном противостоянии сравнение тиофлавин-Т (Th-T) флуоресцентный анализ, измеряя дезагрегирование, и твердотельный ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) U-¹³С тирозин 10 и валин12-меченого Аβ1-42 пептида, анализируя вторичную конформацию (фиг.9А). Антитело mC2 растворяет 35,4% заранее сформированных Аβ1-42 волокон и одновременно индуцирует сдвиг вторичной конформации от бета-слоя к произвольной спирали. Снижение в популяции конформации бета-листов в сторону произвольной спирали составляет примерно 35% и следовательно хорошо согласуется с измерением, используя флуоресцентный Th-T анализ (фиг.9В). Эти данные показывают, что связывание антитела mC2 инициирует переход вторичной структуры, в результате которого возможно происходит дестабилизация параллельной межмолекулярной сборки бета-листов, вызывающая разрушение удлиненных волокон и образование более коротких фрагментов.

12.2. Конформационно-зависимое связывание сродства антитела mC2

Поскольку из научной литературы известно, что пропорция антитело-антиген связывающей энергии может быть использована для зависящей от энергии модификации конформации антигена (Blond и Goldberg, 1987), проводят сравнительный эксперимент по связывающему сродству С2 антитела с целым Aβ_1-42 белком и с меньшим, длиной в девять аминокислот, пептидом, включающим эпитоп (фиг.10). Для такого сравнения сродство гуманизированного антитела С2 анализируют методом ELISA, используя биотинилированные пептиды, покрывая полную аминокислотную последовательность эпитопа С2 (от фирмы Mimotopes, продажа фирмой ANAWA Trading SA), и биотинилированный полный Аβ1-42 пептид (фирма Bachem). Анализ проводят по инструкциям производителя (фирма Mimotopes). Из фиг.10 следует, что антитело связывается со связывающим сродством, которое на 36,0% выше сродства с пептидом, включающим его специфический эпитоп (аминокислоты 13-21 последовательности Аβ_1-42), по сравнению с целым белком Аβ1-42. Из этого следует, что различие в энергии связывающего сродства используют для переноса поглощающей энергии вторичной конформации амилоидного белка для презентации антигена в более приемлемом положении для взаимодействия с антителом. Это объясняет, почему сродство антитела ниже к нативному белку (целому амилоидному белку), а не к выделенной субъединице.

Пример 13. Воздействие антиамилоидного антитела hC2 на агрегирование амилоид-бета 1-42 пептида

Для оценки способности гуманизированного моноклонального антитела hC2 против амилоида бета человека опосредовать антиагрегирующее и дезагрегирующее воздействие на амилоид бета (Аβ) проводят тиофлавин Т спектрофлуоресцентный анализ.

13.1. Исследование подавления агрегирования

Лиофилизированный порошок Aβ1-42 восстанавливают в гексафторизопропаноле (hexafluoroisopropanol - HFIP) до концентрации 1 мМ. Пептидный раствор обрабатывают ультразвуком в течение 15 мин при комнатной температуре, перемешивают в течение ночи и аликвоты помещают в микроцентрифужный пробирки (без силикона). Затем HFIP выпаривают под струей аргона. Получаемую пептидную пленку высушивают под вакуумом в течение 10 мин и хранят при -80°С до использования.

Для исследования опосредованного антителом подавления агрегирования Aβ1-42 антитело hC2 предварительно разводят в ФСБ, и раствор для исследования, содержащий приведенные ниже компоненты, получают в пробирках без силикона: 3,3 или 0,33 ммоля предварительно разведенного антитела, 10 ммолей тиофлавина Т, 33 ммоля Aβ1-42 и 8,2% ДМСО. Следовательно, итоговые мольные соотношения антитела к А? 1-42 составляют 1:10 и 1:100. Также получают соответствующие контрольные растворы. Растворы затем инкубируют в течение 24 ч при 37°С и спектральную флуоресценцию (в относительных единицах флуоресценции - ОЕФ) считывают в шести повторах в черных 384-луночных планшетах (фирма Perkin-Elmer) на спектрофлуорометре Perkin-Elmer FluoroCount. Спектральную флуоресценцию затем измеряют и процент дезагрегирования подсчитывают методом, описанным ниже.

13.2. Исследование дезагрегирования

Для анализа опосредованной антителом дезагрегации предварительно агрегированного Аβ1-42, низкомолекулярный Аβ1-42, приготовленный согласно описанному выше, готовят в виде 110 мМ раствора в 27% ДМСО и 1× ФСБ. Этот раствор затем подвергают агрегированию при 37°С в течение 24 ч, после чего добавляют: 3,3 или 0,33 мМ предварительно разведенного антитела и 10 мМ тиофлавина Т. Это приводит к мольному соотношению 1:10 и 1:100 антитела к Aβ1-42. Этот раствор затем инкубируют дополнительно в течение 24 ч при 37°С. Спектральную флуоресценцию затем измеряют, и процент дезагрегирования подсчитывают методом, описанным ниже.

13.3. Расчеты

Подавление агрегирования или дезагрегирования выражают в виде среднего процента подавления или дезагрегирования, соответственно, ± стандартная ошибка средней величины (СО) по следующему уравнению:

$$\begin{array}{l}\text{Процент}\\ \text{подавления}=\frac{\begin{array}{l}\text{(ОЕФ положительного контроля-ОЕФ отрицательного контроля)-}\\ \text{(ОЕФ образца подавления с A}\beta \text{1-42-ОЕФ образца без A}\beta \text{1-42)}\end{array}}{(ОЕФ\text{ положительного контроля-ОЕФ отрицательного контроля})}\times 100\%\end{array}$$

13.4. Результаты

13.4.1. Подавление агрегирования Aβ1-42

Подавление агрегирования Aβ1-42, используя hC2 антитело, показано в табл.1 и на фиг.18. Мольное соотношение антитела к Aβ1-42 1:100 подавляет в среднем на 30% (2 независимых эксперимента), причем при мольном соотношении 1:10 подавление составляет 80% (2 независимых эксперимента, см. табл.1).

Таблица 1
Опосредованное антителом hC2 подавление агрегирования Aβ1-42 при мольных соотношениях 1:100 и 1:10 антитела к Аβ1-42
Антитело	Мольное соотношение (антитела к Aβ1-42)
1:100	1:10
hC2	30,0±4,1%	80,4±6,9%

13.4.2. Дезагрегирование предварительно агрегированного Aβ1-42

Дезагрегирование предварительно агрегированного Aβ1-42, используя hC2 антитело, показано в табл.2 и на фиг.19. При мольном соотношении антитела к Aβ1-42 1:100 Дезагрегирование в среднем составляет 24%, а при мольном соотношении 1:10 дезагрегирование составляет 32% (3 независимых эксперимента, см. табл.2).

Таблица 2
Опосредованное антителом hC2 дезагрегирование Аβ1-42 при мольных соотношениях 1:100 и 1:10 антитела к Aβ1-42
Антитело	Мольное соотношение (антитела к Аβ1-42)
1:100	1:10
hC2	23,9±4,4%	31,9±3,5%

Применение исследования с тиофлавином Т могут быть показаны бифункциональные свойства анти-Аβ гуманизированного антитела hC2, а именно, подавление агрегирования Аβ1-42 в патогенную протофибриллярную конформацию и кроме того дезагрегирование предварительно сформированные Аβ1-42 протофибриллы. Антитело hC2 ингибирует Аβ1-42 агрегирование на 80% при мольном соотношении антитела к Аβ1-42 1:10. Установлено, что способность hC2 дезагрегировать предварительно агрегированные протофибриллы Аβ1-42 в мольном соотношении 1:10 составляет 32%.

Пример 14. Конформационно-специфическое связывание mC2 с разными классами амилоидных белков

Для оценки специфичности mC2 в отношении разных стадий полимеризованного амилоидного белка, мономерного, полимерного растворимого и фибрильного амилоида, получают планшеты для метода ELISA, с нанесенным полимерным амилоидом на разных стадиях бета-амилоида (фиг.11). Мономеры получают опубликованным модифицированным способом Klein (2002), растворимый полимерный амилоид бета получают способом Barghorn и др. (2005), а волокна получают путем инкубирования амилоида (фирма Bachem, Швейцария) с конечной концентрацией 1 мкг/мкл в Tris/HCl pH 7,4 при 37°С в течение 5 суток с последующей стадией центрифугирования (10000 об/мин в течение 5 мин). Затем амилоидные полимеры наносят на планшеты для ELISA до конечной концентрации 55 мкг/мл и проводят связывающее сродство методом ELISA с применением моноклонального антитела против мышиного IgG (фирма Jackson), меченое щелочной фосфатазой. На фиг.11 показано, что антитело mC2 связывается с повышенным сродством с растворимым полимерным амилоидом бета по сравнению с волокнами и наименьшим образом с мономерами. Эти данные показывают, что на связывание антитела влияет амилоидный эпитоп и конформация разных амилоидных агрегатов.

Пример 15. Картирование эпитопа АС иммунного моноклонального антитела hC2

Картирование эпитопа гуманизированного моноклонального антитела hC2 проводят методом ELISA, используя три разные пептидные библиотеки. Одна библиотека включает в общей сложности 33 биотинилированных пептида, полностью перекрывающих аминокислотную (аа) последовательность Аβ1-42 (от фирмы Mimotopes, продажа фирмой ANAWA Trading SA), вторая библиотека включает биотинилированные пептиды, включая пептид 12 (аа12-20 из Аβ) из первой пептидной библиотеки, и замещение каждой аа в последовательности на аланин (см. табл.3 ниже), а третья библиотека содержит биотинилированные пептиды 13, 14, или 15 (аа 13-21, 14-22 и 15-23 из Аβ) и замещение в каждом случае последних аминокислот на аланин или на глицин для аа 21, которые уже представляют аланин (см. табл.4 ниже). Полностью биотинилированный пептид Аβ1-42 используют в качестве положительного контроля (фирма Bachem). Картирование эпитопа проводят по инструкциям производителя (фирма Mimotopes). Вкратце, планшеты с покрытием из стрептавидина (NUNC) блокируют с помощью 0,1% БСА В ФСБ в течение ночи при 4°С. После промывки ФСБ-0,05% твин 20 планшеты покрывают в течение 1 ч при комнатной температуре разными пептидами из библиотеки, разведенными в 0,1% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ до конечной концентрации 10 мкМ. После промывки планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре с антителом hC2 или несвязывающим Аβ химерным IgG4 антителом, разбавленным до 200 нг/мл в 2% БСА, 0,1% азиде натрия в ФСБ. Планшеты промывают еще раз и инкубируют со щелочной фосфатазой, конъюгированной с козьим антителом против IgG человека в течение 1 ч при комнатной температуре. После последнего промывания планшеты инкубируют с фосфатазным субстратом (pNPP) и снимают показания при 405 нм, используя ридер для планшетов ELISA.

Было установлено, что гуманизированное моноклональное антитело hC2 связывается специфически с пептидами 12, 13, 14, 15 и 16 из первой пептидной библиотеки. Эти пептиды представляют аа 12-20, 13-21, 14-22, 15-23 и 16-24 соответственно из Аβ1-42, следовательно, эпитом расположен в области 12-24 в последовательности Аβ. Вторую библиотеку с замещениями аланина используют для определения принципиально важных аминокислот (аа) для связывания с Аβ12-20 (VHHQKLVFF). Связывание антитела hC2 полностью утрачивается, если аминокислоты 16, 17, 19 или 20 замещены на аланин, свидетельствуя о том, что эти аминокислоты принципиально важны для связывания антитела с Аβ. Связывание антитела hC2 частично утрачивается, если аминокислоты 15 и 18 замещены.

Связывание также почти полностью утрачивается, если аминокислота 14 замещена на аланин, свидетельствуя о том, что аминокислота 14 также крайне важна для связывания.

В заключении используют третью библиотеку для определения, важны ли аминокислоты 21, 22 или 23 для связывания с эпитопом. Связывание антитела с аминокислотами 15-23 снижается, если аминокислота 23 замещена на аланин, следовательно, аминокислота 23 также важна для связывания. Связывание частично утрачивается, если аминокислота 21 замещается на глицин и незначительно уменьшается, если аминокислота 22 замещена на аланин.

Пример 16. Нейропротекция антителом hC2

Способность антитела hC2 защищать нейроны от Абета олигомер-индуцированной дегенерации оценивают анализом in vitro. Нейроны коры эмбрионов мышей в возрасте 16,5-17,5 суток выделяют, разобщают и культивируют in vitro в среде N3-F12. Клетки выращивают в общей сложности в течение 9 суток и вносят питание на 3 сутки и в день, когда добавляют олигомер Абета, или олигомер Абета плюс анти-Абета антитело hC2. На пятые сутки («4 суток Абета») или шестые сутки («3 суток Абета») определенные лунки с клетками обрабатывают либо 2 мкмолями только одного олигомера Абета, либо комбинацией 2 мкмолей олигомера Абета и 50 мкг/мл анти-Абета антитела hC2.

Олигомер Абета получают растворением Абета 1-42 (фирма rPeptide) в HFIP, из раствора Абета пептиды разливают аликвотами по 10 мкл при концентрации 1 мг/мл и затем выпаривают в пароуловителе в течение 30 мин и пептидные пленки хранят при -80°С до использования. При использовании пептидную пленку растворяют в 10 мкл ДМСО, затем 78,6 мкл HAMS F12, и Abeta пептидного раствора инкубируют при 4°С в течение 24-48 ч (конечная концентрация Абета составляет 25 мкМ).

Для контрольных клеток добавляют только ДМСО-F12 в том же объеме, что и Абета-ДМСО на 5 сутки, и клетки культивируют в течение дополнительных 4 суток без дополнительной обработки. На 9 сутки нейроны из всех условий культивирования фиксируют и окрашивают Tuj1 (анти-бета-тубулиновое антитело), затем окрашивают вторичными антителами, мечеными FITC, для визуализации микротрубочек и, таким образом, нейрональный процесс в целом. Результаты представлены на фиг.20. Необработанные эмбриональные нейроны коры мыши показывают нормальные морфологические признаки через девять суток в культуре (фиг.20, крайняя левая панель). Лечение клеток олигомером Абета в течение трех суток индуцирует дегенерацию аксона и вызывает снижение общего числа аксонов (фиг.20, нижняя центральная панель), и этот эффект еще более выражен на четвертые сутки лечения (фиг.20, верхняя центральная панель). Напротив, клетки, обработанные комбинацией Абета олигомера и анти-Абета антитела hC2, выглядят сходно с контрольными клетками (фиг.20, верхняя и нижняя правые панели). Эти результаты показывают, что анти-Абета антитело hC2 способно защитить эмбриональные нейроны коры мыши от Абета-олигомер-индуцированной дегенерации.

Таблица 1
Положения и изменения, произведенные в каркасных участках легкой цепи гуманизированного антитела С2
Положение легкой цепи	45	87	50	53
Мышиное C2VK	K	F	K	N
Гуманизированное C2HuVK1	Q	Y	K	N
Гуманизированное C2HuVK2	Q	F	K	N
Гуманизированное C2HuVK3	K	Y	K	N
Гуманизированное C2HuVK4	K	F	K	N
Зародышевой линии человека dpk15	Q	Y	L	N
Мышиное C2VK-R			R
Мышиное C2VK-S				S

Таблица 2
Положения и изменения, произведенные в каркасных участках тяжелой цепи гуманизированного антитела С2
Положение тяжелой цепи	47	94
Мышиное C2VHAF	L	S
Гуманизированное C2HuVHAF1	W	R
Гуманизированное C2HuVHAF2	W	S
Гуманизированное C2HuVHAF3	L	R
Гуманизированное C2HuVHAF4	L	S
Зародышевой линии человека DP-54	W	R

В общей сложности 8 разных антител было сконструировано с легкими цепями гуманизированных антител C2HuVK1, C2HuV_K2, C2HuVK3, C2HuV_K4 и тяжелыми цепями C2HuVHAF4 и C2HuVHAF2.

Таблица 3
Свойства пептидов, используемых во второй библиотеке
Аминокислоты, важные для связывания, обозначены курсивом и подчеркнуты, а аминокислоты, безусловно, важные для связывания, обозначены курсивом и жирным шрифтом
р12-20	V	Н	Н	Q	K	L	V	F	F
А12	А	Н	Н	Q	K	L	V	F	F
А13	V	А	Н	Q	K	L	V	F	F
А14	V	Н	А	Q	K	L	V	F	F
А15	V	Н	Н	A	K	L	V	F	F
А16	V	Н	Н	Q	А	L	V	F	F
А17	V	Н	Н	Q	K	А	V	F	F
А18	V	Н	Н	Q	K	L	А	F	F
А19	V	Н	Н	Q	K	L	V	А	F
А20	V	Н	Н	Q	K	L	V	F	А
Номера аминокислот	12	13	14	15	16	17	18	19	20

Таблица 4

Свойства пептидов, используемых в третьей библиотеке

Аминокислоты, важные для связывания, обозначены курсивом и подчеркнуты, а аминокислоты, безусловно важные для связывания, обозначены курсивом и жирным шрифтом

р13-21

Н

Н

Q

K

L

V

F

F

A

р13-21

G21

Н

Н

Q

K

L

V

F

F

G

р14-22

Н

Q

K

L

V

F

F

A

E

р14-22

А22

Н

Q

K

L

V

F

F

A

A

р15-23

Q

K

L

V

F

F

A

E

D

р15-23

А23

Q

K

L

V

F

F

A

E

A

Номера аминокислот

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

Литература

1. Barghorn S., Nimmrich V., Striebinger A., Krantz C., Keller P., Janson В., Bahr M., Schmidt M., Bitner R.S., Harlan J., Barlow E., Ebert U., Hillen H. Globular amyloid beta-peptid oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease. J Neurochem 95, 2005, cc. 834-847.

2. Blond, Goldberg, PNAS, 84(5), 1987, cc. 1147-1151.

3. Сох J.P.L., Tomlinson I.M., Winter G. A directory of human germ-line Vk segments reveals a strong bias in their usage. Eur. J. Immunol. 24, 1994, cc. 827-836.

4. Kabat E.A., Wu T.T., Perry H.M., Gottesman K.S., Foeller C. Suquences of proteins od immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991.

5. Klein W.L., Abeta toxicity in Alzheimer's disease: globular soluble polymeric amyloid beta (ADDLs) as new vaccine and drug targets. Neurochem Int 41(5), 2002, cc. 345-352.

6. Langdon S.D., Inakioki M., Kelsoe G., Tedder T.F. Germline sequences of V(H)7183 gene family members in C57BL/6 mice demonstrate natural selection of particular sequences during recent evolution. Immunogenetics, 51, 2000, cc. 241-245.

7. Milligan R.C., Berg P. Expression of bacterial gene in mammalian cells. Science, 209, 1980, cc. 1422-1427.

8. Reichmann L., Clark M., Waldmann H., Winter G., Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332, 1988, cc. 323-327.

9. Schable K.F., Thiebe R., Bensch A., Brensing-Kueppers J., Heim V., Kirschebaum Т., Lamm R., Ohnrich M., Pourrajabi S., Roschentaller F., Schwendinger J., Wichelhaus D., Zocher I., Zachau H.G. Characteristics of immunoglobulin V kappa genes, pseudogenes, relics and orphans in the mouse genome. Eur. J. Immunol., 29, 1999, cc. 2082-2086.

10. Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. The repertoire of human germline V_H sequences reveals about 50 groups of V_H segments with different hypervariable loops. J. Mol. Biol., 227, 1992, cc. 776-798.

1. Гуманизированное антитело или его фрагмент, способные специфически связывать β-амилоид, причем гуманизированное антитело или его фрагмент включают:
a) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, представляющую область CDR1 LCVR, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, аминокислотную последовательность RVSNRFS или аминокислотную последовательность KVSSRFS, представляющую область CDR2 LCVR, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, представляющую область CDR3 LCVR, или
b) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, представляющую область CDR1 HCVR, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, представляющую область CDR2 HCVR, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, представляющую область CDR3 HCVR, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;
при этом гуманизированное антитело или его фрагмент включают Fc область человеческого IgG1, содержащую D265A аминокислотную замену, причем аминокислотная замена приводит к снижению эффекторной функции.

2. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, у которого в аминокислотной последовательности области CDR2 вариабельной области легкой цепи, представленной в виде последовательности SEQ ID NO: 5 Lys в положении 50 по нумерации Kabat замещен на Arg или Asn в положении 53 по нумерации Kabat замещен на Ser.

3. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, причем гуманизированное антитело или его фрагмент включает вариабельные области с производными от каркасного участка человека или примата, и при этом по меньшей мере одна из аминокислот производного от каркасного участка человека или примата изменена путем замещения на аминокислоту из соответствующего участка антитела мыши ACI-01-Ab7C2, продуцируемого гибридомой FP-12H3-C2, депонированной в коллекции Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры под номером DSM ACC2750, или на соответствующее ей консервативное замещение.

4. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.3, в котором гуманизированное антитело или его фрагмент включает каркасные участки вариабельных областей, производные от каркасных участков человека или примата, и в котором
(a) аминокислота в положении 47 по нумерации Kabat в производной от каркасных участков человека или примата вариабельной области тяжелой цепи является Leu; и/или
(b) аминокислота в положении 94 по нумерации Kabat в производной от каркасных участков человека или примата вариабельной области тяжелой цепи является Ser; и/или
(c) аминокислота в положении 87 по нумерации Kabat в производной от каркасных участков человека или примата вариабельной области легкой цепи является Phe и Tyr; и/или
(d) аминокислота в положении 45 по нумерации Kabat в производной от каркасных участков человека или примата вариабельной области легкой цепи является аминокислотой, выбранной из группы, включающей Lys и Gln.

5. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, причем гуманизированное антитело или его фрагмент включают вариабельные области с производными от каркасного участка человека или примата, и при этом вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) имеет аминокислотную последовательность, которая крайней мере на 98% идентична последовательности, представленной в виде последовательности SEQ ID NO: 15.

6. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, причем гуманизированное антитело или его фрагмент включают вариабельные области с производными от каркасного участка человека или примата, и при этом вариабельная область легкой цепи (LCVR) имеет аминокислотную последовательность, которая по крайней мере 98% идентична последовательности, представленной в виде последовательности SEQ ID NO: 12.

7. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гуманизированное антитело или его фрагмент по любому из пп.1-6.

8. Нуклеиновая кислота по п.7, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25.

9. Вектор экспрессии для получения гуманизированного антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.7 или 8.

10. Клетка, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по п.7 или 8, где эта клетка продуцирует гуманизированное антитело или его фрагмент по любому из пп.1-6, способные специфично связывать бета-амилоид.

11. Композиция для лечения амилоидоза, включающая терапевтически эффективное количество гуманизированного антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6.

12. Композиция по п.11, также включающая дополнительное биологически активное вещество в терапевтически эффективном количестве, и/или фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент, причем дополнительное биологически активное вещество выбрано из соединений, используемых в лечении амилоидоза, соединений против окислительного стресса, анти-апоптических соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, например пирензепина и метаболитов, 3-амино-1-пропансульфоновой кислота, 1,3-пропандисульфоната, активаторов α-секретазы, ингибиторов β- и γ-секретазы, тау-белков, нейротрансмиттеров, нарушителей β-слоев, аттрактантов для амилоида бета очищающих/истощающих клеточных компонентов, ингибиторов усеченного по N-концу амилоида бета, включая амилоид бета 3-42 в форме пироглутамата, противовоспалительных молекул и ингибиторов холинэстеразы, например такрина, ривастигмина, донепезила и/или галантамина, агонистов M1 и других лекарственных средств, включая какой-либо амилоид или тау модифицированное лекарственное средство и пищевые добавки, а также необязательно фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.

13. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1-6 в терапевтически эффективном количестве, предназначенные для использования при предупреждении, лечении или облегчении воздействия одного или нескольких эффектов амилоидоза.

14. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.13, где лечение субъекта, в частности млекопитающего или человека с амилоид-ассоциированным состоянием, характеризующимся утратой когнитивного объема памяти, приводит к повышению сохранения когнитивного объема памяти или его полному восстановлению.

15. Способ диагностики амилоид-ассоциированных заболеваний или состояний у субъекта, включающий:
(а) приведение образца ткани, или специфической части тела, или области тела субъекта, предположительно содержащих амилоидный белок, в контакт гуманизированным антителом или его фрагментом по любому из пп.1-6,
(б) предоставление возможности для антитела связать амилоидный белок,
(в) выявление антитела, связанного с белком, и
(г) корреляцию наличия или отсутствия связывания антитела с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической области тела субъекта.

16. Способ определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек в ткани и/или жидкостях тела субъекта, включающий:
(а) исследование в указанном образце наличия амилоидного белка с гуманизированным антителом или его фрагментом по любому из пп.1-6,
(б) определение количества антитела, связанного с белком, и
(в) подсчет нагрузки бляшек в ткани и/или жидкостях тела субъекта.

17. Тест-набор для выявления и диагностики амилоид-ассоциированных заболеваний и состояний, включающий гуманизированное антитело или его фрагмент по любому из пп.1-6 и необязательно дополнительно включающий инструкции для применения антител с целью связывания амилоидного белка для формирования иммунологического комплекса и выявления формирования таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка.

18. Способ продуцирования гуманизированного антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6, включающий культивирование клеток, содержащих вектор экспрессии по п.9.

19. Применение гуманизированного антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6 в терапевтически эффективном количестве при изготовлении лекарственного средства для предупреждения, лечения или облегчения воздействия одного или нескольких эффектов амилоидоза.

20. Способ предупреждения, лечения или облегчения воздействия одного или нескольких эффектов амилоидоза, включающий введение нуждающегося в этом субъекту гуманизированного антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6 в терапевтически эффективном количестве.

21. Композиция по п.11, где композиция включает терапевтически эффективное количество гуманизированного антитела или его фрагмента и необязательно дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.

22. Композиция по п.12, где композиция включает терапевтически эффективное количество гуманизированного антитела или его фрагмента и необязательно дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.

23. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.13 в терапевтически эффективном количестве, предназначенное для использования при предупреждении, лечении или облегчении воздействия одного или нескольких эффектов амилоидоза, где амилоидозом является нейродегенеративное расстройство, такое как болезнь Альгеймера.

24. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.13 в терапевтически эффективном количестве, предназначенное для использования при предупреждении, лечении или облегчении воздействия одного или нескольких эффектов амилоидоза у субъекта, нуждающегося в этом, где амилоидозом является болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция Гуама, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз, диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли, бета амилоид-индуцированная нейронная деградация и дегенерация желтого пятна.

25. Применение гуманизированного антитела или его фрагмента по п.19 в терапевтически эффективном количестве для приготовления лекарственного средства, предназначенного для использования при предупреждении, лечении или облегчении воздействия одного или нескольких эффектов амилоидоза, где амилоидозом является нейродегенеративное расстройство, такое как болезнь Альцгеймера.

26. Применение гуманизированного антитела или его фрагмента по п.19 в терапевтически эффективном количестве для приготовления лекарственного средства, предназначенного для использования при предупреждении, лечении или облегчении воздействия одного или нескольких эффектов амилоидоза у субъекта, нуждающегося в этом, где амилоидозом является болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция Гуама, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз, диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли, бета амилоид-индуцированная нейронная деградация и дегенерация желтого пятна.

27. Способ предупреждения, лечения или облегчения воздействия одного или нескольких эффектов амилоидоза по п.20, где амилоидозом является неврологическое расстройство, например болезнь Альцгеймера (БА).

28. Способ предупреждения, лечения или облегчения воздействия одного или нескольких эффектов амилоидоза по п.20, где амилоидоз выбирают из группы, включающей болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция Гуама, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз, диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли, бета амилоид-индуцированная нейронная деградация и дегенерация желтого пятна.

29. Клетка, включающая вектор экспрессии по п.9, где эта клетка продуцирует гуманизированное антитело или его фрагмент по любому из пп.1-6, способное(ый) специфично связывать бета-амилоид.