Концентрированный состав и способ защиты семенного картофеля от вирусов x и y
Владельцы патента RU 2567643:
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Федерального агентства научных организаций (RU)
Изобретение относится к сельскому хозяйству. Для защиты семенного картофеля от вирусов X и Y создан концентрированный состав, содержащий в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, степенью деацетилирования 75-90% - 4-5, янтарная кислота - 4-5, натрий салицилово-кислый - 1-2, бензиламинопурин (6-БАП) - 0,02-0,04, вода - остальное. Способ защиты семенного картофеля предполагает его обработку вышеуказанным концентрированным составом в процессе оригинального семеноводства на всех этапах размножения оздоровленного растительного материала, а именно: при размножении оздоровленных растений микрочеренкованием in vitro - вносят в среду Мурасиге-Скуга при норме 1-2 мл на 1 л среды; при размножении мини-клубней и клубней супер-суперэлиты проводят предпосадочную обработку с расходом препарата 0,2 л/т в 10 л рабочего раствора; при выращивании растений первого полевого поколения и супер-суперэлиты их опрыскивают в период вегетации с расходом 0,4 л/га в 200 л рабочего раствора. Концентрированный состав и способ высокоэффективны, менее трудоемки, обеспечивают получение безвирусного семенного картофеля. 2 н.п. ф-лы, 8 табл., 8 пр.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к средствам защиты растений от вирусных болезней. Рекомендуется для использования в оригинальном семеноводстве путем обработки на всех этапах процесса размножения оздоровленного материала - внесения в среду Мурасиге-Скуга при размножении оздоровленных микрорастений картофеля черенкованием in vitro, для обработки мини-клубней, клубней супер-суперэлиты, а также вегетирующих растений первого полевого поколения и супер-суперэлиты.
Известно более 20 вирусов, поражающих растения картофеля, среди которых наиболее вредоносны вирусы X и Y, часто совместно присутствующие в растениях и снижающие урожай клубней на 40-60%. Они вызывают общее угнетение растений, скручивание, морщинистость или пятнистость (мозаичность) листьев, снижают урожай и качество клубней и являются основной причиной вырождения картофеля. Поскольку картофель размножают вегетативно и большинство вирусов может переходить в дочерние клубни, доля зараженных вирусами растений увеличивается по мере размножения посадочного материала.
В настоящее время нет составов, которые могли бы защитить картофель от вирусов, в том числе вируса X, заражение которым происходит в основном механическим путем, при контакте больных и здоровых растений во время окучивания и других мероприятий по уходу за растениями. Вирус Y также переносится тлями и механическим путем, а его штамм YC передается, главным образом, механическим путем. Кроме того, растения поражаются вирусами не только в поле, но вирусная (вторичная) инфекция передается через посадочные клубни в следующее поколение. В семеноводстве картофеля проблема вирусных болезней требует постоянных больших денежных и трудовых затрат для создания безвирусных исходных клонов и их последующего размножения.
Поэтому существует необходимость в новых средствах защиты от вирусов, особенно в процессе оздоровления сортов картофеля и размножения оздоровленного исходного материала - микрорастений, мини-клубней, первого полевого поколения и супер-суперэлиты, т.е. в процессе оригинального (первичного) и элитного семеноводства.
Известно средство для борьбы с вирусами растений, включающее альфа- и бета-полилизин. Недостатком данного средства является его неспецифичность и низкая эффективность в отношении вирусов различных семейств растений, не превышающая 50% (Fujii et al., US №4867974, 1989).
Для борьбы с вирусами растений, в том числе картофеля, известно применение интерферона человека. Кроме низкой эффективности против вирусов растений, его недостатком является сложность получения и высокая стоимость (Sela I., US №4980161, 1990).
Известно средство для борьбы с вирусами растений табака, томата и картофеля, содержащее химическое соединение 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин и маннаны из клеток дрожжей Candida sp.(Шустер и др., 1995, РФ №2036583). Недостатком средства является сложность получения маннанов из дрожжей рода Candida, высокая стоимость и неопределенность состава получаемого препарата, а также его низкая эффективность против вирусов X и Y картофеля.
Известен состав для повышения устойчивости растений к вирусам с помощью арахидоновой кислоты (Трофимец и др., 1997, РФ №2072779). Недостатком состава является то, что арахидоновая кислота, получаемая из животного сырья, нестабильна. Еще один недостаток заключается в том, что арахидоновая кислота действует как неспецифический индуктор устойчивости растений к болезням в пределах узкого диапазона концентраций, при превышении которых она ингибирует рост обрабатываемых ею растений.
В исследовании Чиркова С.Н. показано, что низкомолекулярный хитозан индуцирует в растениях устойчивость к вирусной инфекции (Чирков С.Н. Противовирусные свойства хитозана. В кн. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. М., Наука, 2002, с. 327-338). Однако недостатком предлагаемого средства является невысокая - не более 50% эффективность против вирусов картофеля. Кроме того, используется низкомолекулярный хитозан с М.м. 1,2 и 2 кДа, с низкой степенью дисперсности, которая достигается фракционированием исходного низкомолекулярного хитозана посредством ультрафильтрации через мембраны. Этот состав очень дорогой, не является концентрированным и, возможно, из-за этого не нашел применения в сельском хозяйстве.
Описания концентрированных составов для защиты растений картофеля от вирусов X и Y в известных нам до настоящего времени патентах и литературных источниках не обнаружено. За базовый образец принят низкомолекулярный хитозан (Чирков С.Н. Противовирусные свойства хитозана. В кн. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. М., Наука, 2002, с. 327-338). В настоящее время в сельском хозяйстве РФ не используются составы для борьбы с вирусами X и Y на растениях картофеля.
Задачей данного изобретения является разработка концентрированного состава для защиты картофеля, стабильного в процессе длительного хранения, с высокой биологической эффективностью против вирусов X и Y, экономически выгодного для хранения и применения, безопасного для человека и окружающей среды.
Задача решена путем создания концентрированного состава на основе хитозана с М.м. 30-40 кДа, степенью деацетилирования 75-90%, натриевой соли салициловой кислоты и 6-бензиламинопурина (6-БАП) при следующем соотношении компонентов в мас.%:
| Хитозан с М.м. 30-40 кДа, СД 75-90% | 4-5 |
| Янтарная кислота | 4-5 |
| Натрий салицилово-кислый | 1-2 |
| Бензиламинопурин (6-БАП) | 0,02-0,04 |
| Вода | Остальное |
Состав представляет собой водорастворимый концентрат вышеперечисленных соединений, предназначенный для применения на стадии размножения микрорастений картофеля in vitro, обработки клубней и опрыскивания вегетирующих растений.
Действие заявленного состава основано на неизвестной ранее способности хитозана - нетоксичного, экологически безопасного биологически активного вещества - в совокупности с остальными ингредиентами композиции выступать в качестве активатора реакций защиты растений от вирусов, служить осмотически активным веществом и посредством этого повышать устойчивость растений картофеля к вирусным заболеваниям на всех этапах оригинального семеноводства.
Только специфичное сочетание хитозана со строго определенными органическими кислотами и некоторыми другими из заявляемых нами соединений проявляет высокую антивирусную активность. Это связано с тем, что состав повышает устойчивость растений к вирусам четырьмя способами:
- активацией генов и ключевых ферментов сигнального пути защиты растений к биотрофным патогенам, регулируемого салициловой кислотой, за счет присутствия в композиции салициловой кислоты;
- активации в результате действия салициловой кислоты РНК-зависимой РНК-полимеразы - ключевого фермента в пути инактивации РНК вирусов с участием РНКаз и специфичных к данному вирусу коротких РНК (siPHK);
- повышения содержания в растениях гликозида салициловой кислоты и снижения фитотоксичности салициловой кислоты в результате действия хитозана;
- лечебного действия цитокинина - 6-бензиламинопурина (6-БАП), повышающего содержание хлорофиилла, интенсивность фотосинтеза и способность клетки разрушать вирус посредством образования активных форм кислорода (АФК). 6-Бензиламинопурин и салициловая кислота, адсорбируясь на матрице хитозана, хорошо удерживаются на листьях и проявляют более длительное действие как активаторы образования АФК и синтеза хлорофилла, чем при их отдельном применении.
Все вышеперечисленные доводы подтверждают наличие функциональной зависимости, ранее неизвестной, «состав-свойства». Это определяет соответствие заявленного решения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».
Заявленный состав водорастворим и обладает хорошей пленкообразующей и прилипающей способностью, высокой адгезией к растительному материалу и проницаемостью в ткани растений, активен и устойчив в водных растворах при pH, близких к нейтральным, равным 5,0-5,5, не обладает фитотоксичностью в диапазоне рабочих концентраций.
Хитозан, янтарная, салициловая кислота (в виде натриевой соли), 6-бензиламинопурин используются как действующие вещества и являются известными природными соединениями, которые могут быть получены любыми известными методами - химическим синтезом, микробиологически, ферментным синтезом, экстракцией из природных источников и т.п. Они являются коммерчески доступными веществами.
Хитозан - ключевой ингредиент состава в предлагаемом изобретении. Он является деацетилированной формой природного полимера хитина и может быть получен при действии на хитин концентрированным водным раствором КОН при температуре ~ 40°C. Этот процесс приводит к деацетилированию хитина. Степень деацетилирования не является узкоспецифичной для эффективности заявляемого состава, поэтому рекомендуется использовать хитозан со степенью деацетилирования 75-90%.
Хитозан, растворенный в водном растворе янтарной кислоты, в сочетании с салициловой кислотой, являющейся активатором и регулятором сигнального пути защиты от вирусов в растениях, цитокинином (6-бензиламинопурином), стимулирующим в растениях образование хлорофилла, повышает устойчивость растений картофеля к вирусам, действуя профилактически, а также проявляет лечебное действие, вмешиваясь в репродукцию вирусов на стадии синтеза их генома - рибонуклеиновой кислоты.
Хитозан повышает устойчивость растений к вирусам, действуя как сигнал для активации реакций защиты через усиление экспрессии большой группы генов.
В качестве активаторов сигнального пути защиты растений, регулируемого салициловой кислотой, композиция содержит натриевую соль салициловой кислоты в концентрации 1% по массе.
Концентрированный состав для защиты картофеля стабилен в процессе длительного хранения не менее 1 года, с высокой биологической эффективностью против вирусов X и Y, экономически выгоден в применении, безопасен для человека и окружающей среды.
Существенное повышение устойчивости растений картофеля к вирусам X и Y под действием предлагаемого состава является вновь найденным нами и его нельзя ожидать из ранее предложенных средств и методов.
Способ получения. Для приготовления 1 л состава растворяют в 500 мл воды 40-50 г янтарной кислоты, затем при постоянном перемешивании добавляют порциями 40-50 г хитозана, перемешивают смесь до полной однородности, добавляют 1-2 г салицилово-кислого натрия и 0,02-0,04 г 6-бензиламинопурина. После полного растворения всех компонентов объем смеси доводят водой до 1 л.
Задачей изобретения является надежный способ защиты картофеля от вирусов X и Y, эффективный, удобный, выгодный, безопасный для окружающей среды. В настоящее время нет способа надежной защиты семенного картофеля от этих вирусов.
Задача решается путем обработки растений растворами на основе концентрированного состава на всех этапах размножения оздоровленного картофеля в процессе оригинального семеноводства.
Способ основан на использовании для защиты картофеля от вирусов X и Y концентрированного состава в виде растворов с pH 5,0-5,5. Картофель обрабатывают рабочими растворами на основе концентрированного состава, содержащего хитозан с М.м. 30-40 кДа, степенью деацетилирования 75-90%, натриевую соль салициловой кислоты и 6-бензиламинопурин (6-БАП), при следующем соотношении компонентов в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, СД 75- 90% - 4-5; янтарная кислота - 4-5; натрий салицилово-кислый - 1-2; бензиламинопурин (6-БАП) - 0,02-0,04; вода - остальное, на следующих этапах технологии размножения оздоровленных растений:
1) При размножении микрорастений картофеля in vitro вносят в среду Мурасиге-Скуга в соотношении 1-2 мл на 1 л среды, т.е. в разведении в 500-1000 раз.
2) При обработке мини-клубней и клубней картофеля класса супер-суперэлиты перед посадкой расход композиции составляет 0,2 л на 1 тонну клубней (расход рабочей жидкости 10 л/т).
3) При опрыскивании вегетирующих растений первого полевого поколения и супер-суперэлиты расход композиции составляет 0,4 л на 1 га в 200 л/га рабочей жидкости.
Количество и частота применения композиции зависит от этапа оздоровления сорта картофеля от вирусов:
1) На стадии размножения микрорастений in vitro ее вносят в среду однократно на каждом новом цикле микрочеренкования.
2) Обработку клубней проводят однократно перед посадкой. Растения раннеспелых сортов рекомендуется опрыскивать 1-2 раза, позднеспелых - 3-4 раза в период вегетации, начиная с фазы полных всходов.
Приемы способа в таком сочетании ранее не применялись.
Для хитозана с молекулярной массой 30-40 кДа и степенью деацетилирования 75-90% антивирусная активность ранее не была известна, и как средство борьбы с вирусами X и Y на картофеле он не применялся (Новожилов и др., 1999, РФ, №2127056).
Для салициловой кислоты была известна способность повышать устойчивость растений к вирусам, но она не нашла практического применения как средство для защиты растений картофеля от вирусов вследствие узкого диапазона нефитотоксичных концентраций и высокой фитотоксичности (вплоть до гербицидного действия) при их превышении (Chivasa et al., 1997).
Для синтетического цитокинина - 6-бензиламинопурина была известна лишь способность стимулировать рост и деление клеток растений, т.е. свойства гормона роста (Кулаева, 1973).
Для доказательства соответствия предложенного решения концентрированного состава и способа условию «промышленная применимость», а также для лучшего понимания сущности изобретения приводим примеры конкретной реализации, которые не могут исчерпать сущность заявленного изобретения.
Пример 1 показывает, что при минимальной заявленной концентрации компонентов, а именно в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, СД 75-90% - 40 г (4%), янтарная кислота - 40 г (4%), натрий салицилово-кислый - 10 г (1%), бензиламинопурин (6-БАП) - 0,2 г (0,02%), остальное - вода, концентрированный состав стабилен и сохраняет биологическую эффективность в течение 1 года.
Для определения биологической эффективности готовили 1 л концентрированного состава с минимальной заявленной концентрацией компонентов, указанных выше. Половину объема концентрированного состава (0,5 л) хранили при комнатной температуре и через 1 год хранения определяли его биологическую эффективность. Другую половину состава (0,5 л) использовали для определения биологической эффективности сразу после приготовления. Биологическую эффективность концентрированного состава непосредственно после приготовления и через год хранения определяли аналогичным образом. Растения картофеля сорта Елизавета выращивали из здоровых клубней и через 20 дней опрыскивали 0,1% водным рабочим раствором (расход концентрированного состава из расчета 0,2 л/га в 200 л рабочего раствора). В контроле растения обрабатывали водой. Через 1 сутки после обработки растения заражали вирусом Y (5 мкг/мл в 0,01 Μ натрий-фосфатном буфере, pH 8). На листья картофеля распыляли порошок карборунда с размером частиц 600 меш. С помощью стерильного ватного тампона на всю поверхность каждого листа растения наносили вирус в фосфатном буфере, начиная с черешка и заканчивая кончиком листа. Для приготовления буфера использовали следующие растворы: раствор A: NaH2PO4 × H2O - 27,6 г/л, раствор Б: Na2HPO4 × 7H2O - 53,65 г/л или Na2HPO4 × 12H2O - 71,64 г/л. Смешивали 2,65 мл раствора A и 47,35 мл раствора B и доводили до 100 мл дистиллированной водой. Растения после заражения закрывали от света бумагой, которую убирали через 1 сутки. Через 12 дней после заражения определяли число здоровых и зараженных вирусом Y растений методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) гомогенатов листьев с помощью диагностикума Биотехнологического центра Всероссийского НИИ картофельного хозяйства (ВНИИКХ) по прилагаемой к нему инструкции (Инструкция по применению ИФА диагностического набора для определения вирусов картофеля, Коренево, 2011). Опыт проводили в трех повторностях, по 10 растений в каждой.
Стабильность концентрированного состава подтверждается данными в таблице 1, которые свидетельствуют, что водные рабочие растворы состава, содержащего минимальные из заявленных концентрации компонентов, имеют одинаковую эффективность против вируса Y в растениях картофеля сразу после приготовления и через год хранения при комнатной температуре. При этом биологическая эффективность против вируса Y превышает все имеющиеся аналоги.
| Таблица 1 | |||
| Биологическая эффективность против вируса Y в растениях картофеля сорта Елизавета концентрированного состава с минимальным заявленным содержанием компонентов сразу после приготовления и через 1 год хранения при комнатной температуре | |||
| Вариант | Число растений, зараженных вирусом Y, через 12 дней после заражения | Снижение, % к контролю* | |
| штук | % от общего | ||
| Контроль I, растения обрабатывали водой и через сутки заражали вирусом Y | 9±0,59 | 90,0 | - |
| Опыт I, растения обрабатывали 0,1% рабочим раствором концентрированного состава сразу после приготовления и через сутки заражали вирусом Y | 0 | 0 | 100,0 |
| Контроль II, растения обрабатывали водой и через сутки заражали вирусом Y | 9±0,20 | 93,0 | - |
| Опыт II, растения обрабатывали 0,1% водным рабочим раствором концентрированного состава, хранившимся 1 год, и через сутки заражали вирусом Y | 0 | 0 | 100,0 |
| * Биологическая эффективность |
В примере 2 так же, как и в примере 1, испытывали состав, но при максимальной заявленной концентрации компонентов, а именно в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, СД 75-90% - 50 г (5%), янтарная кислота - 50 г (5%), натрий салицилово-кислый - 20 г (2%), бензиламинопурин (6-БАП) - 0,4 г (0,04%), остальное - вода до 1 л. Этот концентрированный состав стабилен и сохраняет высокую биологическую эффективность в течение 1 года.
Для определения биологической эффективности готовили 1 л концентрированного состава с максимальной заявленной концентрацией компонентов. Половину объема концентрированного состава (0,5 л) хранили при комнатной температуре и через 1 год хранения определяли его биологическую эффективность, Другую половину состава (0,5 л) использовали для определения биологической эффективности сразу после приготовления.
Биологическую эффективность концентрированного состава непосредственно после приготовления и через год хранения определяли аналогичным образом. Растения картофеля сорта Елизавета выращивали из здоровых клубней и через 20 дней опрыскивали 0,1% водным рабочим раствором, приготовленным разведением концентрированного состава в 1000 раз (1 мл состава доводят до 1 л водой). В контроле растения обрабатывали водой. Через 1 сутки после обработки растения заражали вирусом Y (5 мкг/мл в 0,01 Μ натрий-фосфатном буфере, pH 8). На листья картофеля распыляли порошок карборунда с размером частиц 600 меш. С помощью стерильного ватного тампона на всю поверхность каждого листа растения наносили вирус в фосфатном буфере, начиная с черешка и заканчивая кончиком листа. Буфер готовили, как в примере 1. Определение вируса проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) через 12 дней после заражения, как описано в примере 1.
Стабильность концентрированного состава подтверждается данными в таблице 2, которые свидетельствуют, что водные рабочие растворы состава, содержащего максимальную из заявленных концентрацию компонентов, имеют одинаковую эффективность против вируса Y сразу после приготовления и через год хранения при комнатной температуре.
| Таблица 2 | |||
| Биологическая эффективность против вируса Y в растениях картофеля сорта Елизавета концентрированного состава с максимальным заявленным содержанием компонентов сразу после приготовления и через 1 год хранения при комнатной температуре | |||
| Вариант | Число растений, зараженных вирусом Y , через 12 дней после заражения | Снижение, % к контролю* | |
| штук | % от общего | ||
| Контроль I, растения обрабатывали водой и через сутки заражали вирусом Y | 9±0,20 | 93,0 | - |
| Опыт I, растения обрабатывали 0,1% рабочим раствором концентрированного состава сразу после приготовления и через сутки заражали вирусом Y | 0 | 0 | 100,0 |
| Контроль II, растения обрабатывали водой и через сутки заражали вирусом Y | 9±0,20 | 93,0 | - |
| Опыт II, растения обрабатывали 0,1% водным рабочим раствором концентрированного состава, хранившимся 1 год, и через сутки заражали вирусом Y | 0 | 0 | 100,0 |
| * Биологическая эффективность |
В примере 3 так же, как в примерах 1 и 2, испытывали состав, но концентрации компонентов меньше минимальной, заявленной в концентрированном составе, а именно в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, СД 75-90% - 35 г (3,5%), янтарная кислота - 35 г (3,5%), натрий салицилово-кислый - 15 г (1,5%), бензиламинопурин (6-БАП) - 0,15 г (0,015%), остальное - вода, его биологическая эффективность против вируса Y значительно ниже - 33% от контроля, каковым является базовый состав.
Для определения биологической эффективности готовили 1 л концентрированного состава с концентрацией компонентов меньше, чем минимальная заявленная концентрация, и определяли его биологическую эффективность.
Растения картофеля сорта Елизавета выращивали из здоровых клубней и через 20 дней опрыскивали 0,1% водным рабочим раствором, приготовленным разведением в 1000 раз (1 мл состава доводят до 1 л водой) концентрированного состава, с содержанием компонентов меньше минимального заявленного. В контроле растения обрабатывали водой. Через 1 сутки после обработки растения заражали вирусом Υ (5 мкг/мл в 0,01 Μ натрий-фосфатном буфере, pH 8). На листья картофеля распыляли порошок карборунда с размером частиц 600 меш. С помощью стерильного ватного тампона на всю поверхность каждого листа растения наносили вирус в фосфатном буфере, начиная с черешка и заканчивая кончиком листа. Буфер готовили, как описано в примерах 1 и 2. Определение вируса проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) через 12 дней после заражения, как описано в примере 1. Опыт проводили в трех повторностях по 10 растений в каждом варианте.
Данные в таблице 3 свидетельствуют, что водные рабочие растворы состава, содержащего компоненты в концентрации меньше минимальной заявленной, имеют биологическую эффективность против вируса Y в 3 раза меньшую, чем рабочие растворы состава с минимальной заявленной концентрацией, т.е. ниже аналогов и базового образца.
| Таблица 3 | |||
| Биологическая эффективность против вируса Y в растениях картофеля сорта Елизавета концентрированного состава с содержанием компонентов менее минимального заявленного | |||
| Вариант | Число растений, зараженных вирусом Y, через 12 дней после заражения | Снижение, % к контролю* | |
| штук | % от общего | ||
| Контроль I, растения обрабатывали водой и через сутки заражали вирусом Y | 8,7±0,34 | 87,0 | - |
| Контроль II, растения обрабатывали 0,1% рабочим раствором концентрированного состава с содержанием компонентов в минимальной заявленной концентрации и через сутки заражали вирусом Y | 0 | 0 | 100,0 |
| Опыт, растения обрабатывали 0,1% водным рабочим раствором концентрированного состава с содержанием компонентов менее минимального заявленного и через сутки заражали вирусом Y | 6,7±0,34 | 67,0 | 33,0 |
| *Биологическая эффективность |
Пример 4 показывает биологическую эффективность лечебного действия концентрированного состава в заявленной концентрации, а именно в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, СД 75-80% - 50 г (5%), янтарная кислота - 50 г (5%), натрий салицилово-кислый - 20 г (2%), бензиламинопурин (6-БАП) - 0,04 г (0,04%), остальное - вода, против вируса Υ при размножении микрорастений картофеля сорта Елизавета in vitro по сравнению с отдельными компонентами состава в тех же концентрациях.
Для определения биологической эффективности по 5 микрорастений картофеля сорта Елизавета, зараженных вирусом Y, черенковали и черенки выращивали на обычной среде Мурасиге-Скуга (контроль) и на среде с добавлением компонентов состава или состава в концентрации 1 мл на 1 л среды (опыт). Через 25 дней выросшие из черенков контрольные и опытные растения снова черенковали и помещали на соответствующие среды. Через 25 дней после второго черенкования в микрорастениях контрольного и опытного вариантов определяли вирус Υ методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), как в примере 1.
Данные по примеру 4, приведенные в таблице 4, свидетельствуют, что при двукратном черенковании на среде Мурасиге-Скуга, содержащей состав в концентрации 1 мл/л, произошло оздоровление 100% исходно зараженных вирусом Υ растений, что существенно выше, чем при внесении в среду компонентов состава (хитозана, салицилово-кислого натрия, 6-бензиламинопурина) по отдельности.
| Таблица 4 | |||
| Лечебное действие состава против вируса Y при двукратном цикле черенкования микрорастений картофеля сорта Елизавета на среде Мурасиге-Скуга | |||
| Вариант опыта | Получено клонов через 2 цикла черенкования | ||
| Всего, штук | Не содержащих вирус Y | ||
| штук | % | ||
| Контроль, зараженные вирусом Y растения, размножали черенкованием на среде МС без добавок | 50 | 0 | 0 |
| Зараженные вирусом Y растения, размножали черенкованием на среде МС с салицилово-кислым натрием, 10 мг/л | 52 | 39 | 75,0 |
| Зараженные вирусом Y растения, размножали черенкованием на среде МС с хитозаном, 50 мг/л | 49 | 20 | 40,8 |
| Зараженные вирусом Y растения размножали черенкованием на среде МС с 6-бензиламинопурином, 0,2 мг/л | 50 | 2 | 4,0 |
| Зараженные вирусом Y растения размножали черенкованием на среде МС с внесением состава в концентрации 1 мл на 1 л среды | 50 | 50 | 100,0 |
Пример 5 показывает высокую биологическую эффективность лечебного действия концентрированного состава в заявленной концентрации, а именно в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, СД 75-80% - 5, янтарная кислота - 5%, натрий салицилово-кислый - 2%, бензилами-нопурин (6-БАП) - 0,04%, остальное - вода, против вируса X при размножении микрорастений картофеля сорта Елизавета in vitro по сравнению с отдельными компонентами состава в тех же концентрациях.
По 5 микрорастений картофеля сорта Елизавета, зараженных вирусом X, черенковали и черенки выращивали на обычной среде Мурасиге-Скуга (контроль) и на среде с добавлением компонентов состава или состава в концентрации 1 мл на 1 л среды (опыт). Через 25 дней выросшие из черенков контрольные и опытные растения снова черенковали и помещали на соответствующие среды. Через 25 дней после второго черенкования в микрорастениях контрольного и опытного вариантов определяли вирус X методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), как описано в примере 1. Данные по примеру 5, приведенные в таблице 5, свидетельствуют, что при двукратном черенковании на среде Мурасиге-Скуга, содержащей состав в концентрации 1 мл/л, произошло оздоровление 95% исходно зараженных вирусом X растений, что существенно выше, чем при внесении в среду компонентов состава (хитозана, салицилово-кислого натрия, 6-бензиламинопурина) по отдельности.
| Таблица 5 | |||
| Лечебное действие состава против вируса X при двукратном цикле черенкования микрорастений картофеля сорта Елизавета на среде Мурасиге-Скуга | |||
| Вариант опыта | Получено клонов через 2 цикла черенкования | ||
| Всего, штук | Не содержащих вирус Y | ||
| штук | % | ||
| Контроль, зараженные вирусом X растения, размножали черенкованием на среде МС без добавок | 42 | 0 | 0 |
| Зараженные вирусом X растения, размножали черенкованием на среде МС с салицилово-кислым натрием, 10 мг/л | 43 | 29 | 67,4 |
| Зараженные вирусом X растения, размножали черенкованием на среде МС с хитозаном, 50 мг/л | 44 | 21 | 47,7 |
| Зараженные вирусом X растения размножали черенкованием на среде МС 6-бензиламинопурином, 0,2 мг/л | 45 | 3 | 6,7 |
| Зараженные вирусом X растения размножали черенкованием на среде МС с внесением состава в концентрации 1 мл на 1 л среды | 47 | 47 | 100,0 |
Пример 6 показывает высокую биологическую эффективность профилактического (защитного) действия концентрированного состава в заявленной концентрации, а именно в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, СД 75-80% - 50 г (5%), янтарная кислота - 50 г (5%,) натрий салицилово-кислый - 20 г (2%), бензиламинопурин (6-БАП) - 0,04 г (0,04%), остальное - вода, против вируса Y при размножении микрорастений картофеля сорта Елизавета in vitro.
Для определения биологической эффективности по 5 здоровых (не зараженных вирусами) микрорастений картофеля сорта Елизавета двукратно черенковали на обычной среде Мурасиге-Скуга (контроль), а также среде Мурасиге-Скуга, содержащей состав в концентрации 2 мл/л. В конце 2 цикла черенкования микрорастения контрольных и опытных вариантов высаживали в вегетационные сосуды в теплице. Через 10 дней роста в почве все растения заражали вирусом Υ (5 мкг/мл в 0,01 Μ натрий-фосфатном буфере, pH 8). На листья картофеля распыляли порошок карборунда с размером частиц 600 меш. С помощью стерильного ватного тампона на всю поверхность каждого листа растения наносили вирус в фосфатном буфере, начиная с черешка и заканчивая кончиком листа. Буфер готовили, как описано в примере 1. Определение вируса проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) через 12 дней после заражения, как описано в примере 1.
Данные в таблице 6 свидетельствуют, что при двукратном черенковании на среде Мурасиге-Скуга, содержащей состав в концентрации 2 мл/л, ни одно из высаженных в почву растений не заразилось вирусом Υ, в то время как в контроле (черенкование на обычной среде МС без добавления состава) вирус Υ обнаружен во всех растениях.
| Таблица 6 | |||
| Эффективность профилактического действия против вируса Y размножения микрорастений картофеля на среде МС, содержащей состав в концентрации 2 мл/л | |||
| Вариант опыта* | Число растений, высаженных в почву и зараженных вирусом Y | ||
| Всего, штук | Растения, в которых не обнаружен вирус Y через 10 дней после заражения | ||
| штук | % | ||
| Растения 2-кратно черенковали на среде МС без добавок (контроль) | 15 | 0 | 0 |
| Растения 2-кратно черенковали на среде МС с добавлением состава, 2 мл/л | 15 | 15 | 100,0 |
| * Через 25 дней после второго черенкования растения высаживали в почву в теплице |
Пример 7 показывает высокую биологическую эффективность профилактического действия состава и способа защиты от вируса X в растениях картофеля по сравнению с компонентами состава.
Для определения эффективности по 10 здоровых (не зараженных вирусом X) клубней картофеля сорта Невский обрабатывали водой (контроль), составом или его компонентами и высаживали в почву. Через 20 дней растения опрыскивали водой, составом или его компонентами в соответствии с вариантами обработки клубней. Через 2 дня после обработки растения заражали чистым препаратом вируса X (5 мкг/мл в 0,01 Μ натрий-фосфатном буфере, pH 8). На листья картофеля распыляли порошок карборунда с размером частиц 600 меш. С помощью стерильного ватного тампона на всю поверхность каждого листа растения наносили вирус в фосфатном буфере, начиная с черешка и заканчивая кончиком листа. Буфер готовили, как описано в примере 1. Определение вируса проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) через 10 дней после заражения, как описано в примере 1.
Данные по примеру 7, приведенные в таблице 7, свидетельствуют, что при обработке клубней водными растворами состава с расходом из расчета 0,2 мл на 1 кг клубней в 10 мл воды и последующем опрыскивании растений водным раствором состава с расходом из расчета 0,02 мл на 5 растений в 20 мл воды ни в одном из искусственно зараженных растений вирус X не обнаруживался, в то время как в контроле (обработка клубней и опрыскивание растений водой) вирус X обнаружен во всех растениях.
| Таблица 7 | ||
| Эффективность против вируса X обработки клубней и 1-кратного опрыскивания растений картофеля сорта Невский водными растворами композиции | ||
| Вариант опыта | Растений в которых обнаружен вирус X, штук | Снижение, % к контролю* |
| Контроль, обработка клубней водой перед посадкой с расходом 10 мл/кг и опрыскивание растений водой, 20 мл/5 растений | 10,0 | |
| Обработка клубней раствором салицилово-кислого натрия с расходом 20 мг/кг в 10 мл воды и опрыскивание растений салицилово-кислым натрием с расходом 2 мг/5 растений в 20 мл воды | 4,2±0,21 | 58 |
| Обработка клубней хитозаном с расходом 20 мг/кг в 10 мл воды и опрыскивание растений водой, 2 мг/5 растений в 20 мл воды | 3,5±0,12 | 65 |
| Обработка клубней 6-бензиламинопурином перед посадкой с расходом 0,4 мг/кг в 10 мл воды и опрыскивание растений с расходом 0,04 мг/5 растений в 20 мл воды | 9,8±0,54 | 2,0 |
| Обработка клубней водным раствором композиции 0,4 мл на 1 кг клубней в 10 мл воды и 1-кратное опрыскивание растений с расходом 0,02 мл на 5 растений в 20 мл воды | 0 | 100,0 |
| * Биологическая эффективность |
Пример 8 показывает высокую биологическую эффективность против вирусов Υ и X обработки клубней перед посадкой и двукратного опрыскивания растений картофеля сорта Елизавета в полевом опыте рабочими растворами концентрированного состава в заявленной концентрации, а именно в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, СД 75-80% - 50 г (5%), янтарная кислота - 50 г (5%), натрий салицилово-кислый - 20 г (2%,) бензиламинопурин (6-БАП) - 0,04 г (0,04%), остальное - вода, а также их положительное влияние на урожай клубней.
Инфекционный фон на опытном участке создавали путем высадки по его периметру клубней, инфицированных вирусами Y и X.
Клубни картофеля сорта Невский обрабатывали водным рабочим раствором состава с расходом по препарату 0,2 л/т в 10 л рабочего раствора и высаживали в почву. В фазу полных всходов растения опрыскивали водным рабочим раствором состава с расходом из расчета 0,4 л/га в 200 л/га рабочей жидкости. Через 12 дней проводили вторую обработку с такой же нормой расхода. Вирусы X и Y определяли в листьях растений за 15 дней до уборки урожая методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), как описано в примере 1. Определяли урожай клубней с делянки. Опыт проводили в трех повторностях, площадь каждой повторности - 10,5 м2.
Данные, приведенные в таблице 8, свидетельствуют, что предпосадочная обработка клубней водным раствором состава с расходом 0,2 л/т в 10 л рабочей жидкости и последующее двукратное опрыскивание с расходом 0,4 л/га по препарату в 200 л/га рабочей жидкости полностью защитило растения от заражения вирусами X и Y при высокой зараженности растений в контроле к концу вегетации. На таком высоком инфекционном фоне урожай клубней растений в варианте обработки концентрированным составом был статистически достоверно выше, чем урожай в контроле.
| Таблица 8 | |||||
| Биологическая эффективность против вирусов Y и X и действие на урожай предпосадочной обработки клубней и двукратного опрыскивания растений картофеля сорта Невский рабочими растворами состава | |||||
| Вариант опыта | Заражено растений картофеля (%) вирусами: | Биологическая эффективность, (%) против вирусов: | Урожай клубней с 10 м2, кг | ||
| X | Y | X | Y | ||
| Обработка клубней водой и 2-кратное опрыскивание растений водой | 35±4 | 23±3 | - | - | 18,4 |
| Обработка клубней составом с расходом 0,2 л/т в 10 л/т рабочей жидкости и 2-кратное опрыскивание растений с расходом 0,4 л/га в 200 л/га рабочей жидкости | 0 | 0 | 100 | 100 | 26,7 |
| * Биологическая эффективность |
Положительный эффект от состава и способа защиты растений картофеля от вирусов X и Y.
Концентрированный состав и способ позволяет защитить растения картофеля от наиболее вредоносных вирусов X и Y, а также получать свободные от вирусов семенные клубни картофеля.
Преимуществами концентрированного состава при применении на картофеле против вирусов X и Υ является безопасность для человека и окружающей среды, отсутствие каких-либо токсичных метаболитов в растениях, продуктах урожая, почве и воде после опрыскивания. Состав безопасен для здоровья человека при получении и применении. Ни один из компонентов состава, а именно хитозан, салицилово-кислый натрий, 6-бензиламинопурин, не является мутагеном, канцерогеном или тератогеном. Состав является концентрированным, хорошо хранится и длительно (в течение 1 года хранения) сохраняет биологическую эффективность против вирусов X и Υ картофеля. Состав не требует больших объемов для хранения и при перевозках, удобен в применении, т.к. хорошо разводится в воде и экономически выгоден. Концентрированный состав имеет высокую активность - в 2-3 раза превышает уровень базового образца при сравнительно низкой стоимости (в пределах 300 руб./л). Способ защиты растений картофеля обеспечивает 95-100% защиту от вирусов X и Υ и позволяет надежно защитить семенной картофель от этих вирусов, гарантировать безвирусную технологию получения картофеля с меньшей трудоемкостью и затратами.
Литература
Инструкция по применению иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля. ВНИИКХ им. А.Г. Лорха, Коренево, 2011, 8 с.
Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. М.: Наука, 1973. 264 с.
Новожилов К.В., Тютерев С.Л., Якубчик М.С., Тарлаковский С.А., Коломиец А.Ф., Панарин Е.Ф., Исмаилов Е.Ф., Гамзазаде А.И., Исмаилов В.Я., Бегунов И.И. Патент РФ №2127056, 1999.
Трофимец Л.Н., Озерецковская О.Л., Гилязетдинов Ш.Я., Балахонцев Ε.Н., Янишевский Л.В., Марданшин И.С. Индуктор устойчивости пасленовых к возбудителям вирусных болезней. Патент РФ №2072779, 1997.
Чирков С.Н. Противовирусные свойства хитозана. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. М.: Наука, 2002. С. 327-338.
Шустер Г., Клуге З., Коваленко А.Г. Средство борьбы с вирусами растений. Патент РФ №2036583, 1995.
Chivasa S., Murphy, A.M., Naylor, Μ. Carr, J.P. Salicylic acid interferes with tobacco mosaic virus replication via a novel salicylhydroxamic acid-sensitive mechanism. Plant Cell, 1997, v.9, 547-557.
Fujii M., Morita H., Hiraki J., Hatakeyama M. Agent for preventing plant virus diseases. United States Patent №4867974, 1989.
Sela I. Method of treating viral infection in plants. United States Patent №4980161, 1990.
1. Концентрированный состав для защиты семенного картофеля от вирусов X и Y, содержащий хитозан с молекулярной массой 30-40 кДа, степенью деацетилирования 75-90%, янтарную кислоту, натрий салицилово-кислый и цитокинин - 6-бензиламинопурин (6-БАП) при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Хитозан с М.м. 30-40 кДа, степенью деацетилирования 75-90% | 4,0-5,0 |
| Янтарная кислота | 4,0-5,0 |
| Натрий салицилово-кислый | 1,0-2,0 |
| Бензиламинопурин (6-БАП) | 0,02-0,04 |
| Вода | Остальное |
2. Способ защиты картофеля от вирусов X и Y на всех этапах оригинального семеноводства концентрированным составом, содержащим следующие компоненты в мас.%: хитозан с М.м. 30-40 кДа, степенью деацетилирования 75-90% - 4-5, янтарная кислота - 4-5, натрий салицилово-кислый - 1-2, бензиламинопурин (6-БАП) - 0,02-0,04, вода - остальное, причем
при размножении оздоровленных растений микрочеренкованием in vitro вносят в среду Мурасиге-Скуга с расходом 1-2 мл на 1 л среды;
при размножении мини-клубней и клубней супер-суперэлиты проводят их предпосадочную обработку с расходом концентрированного состава 0,2 л/т в 10 л рабочего раствора;
при выращивании растений первого полевого поколения и супер-суперэлиты их опрыскивают в период вегетации с расходом 0,4 л/га в 200 л рабочего раствора.
