Стабильная сухая порошкообразная композиция, содержащая биологически активные микроорганизмы и/или биоактивные материалы, и способ ее изготовления

Группа изобретений относится к стабильной сухой композиции, способу ее изготовления. Композиция содержит биоактивный микроорганизм или материал, два стабилизирующих агента - альгинат натрия и инулин, и два защитных агента - дисахарид и белковый гидролизат. При этом биоактивный микроорганизм или материал заключен в аморфную стекловидную матрицу. Композиция используется при кормлении животного биоактивным микроорганизмом или материалом при условии того, что биоактивный организм или материал не является гербицидом. Способ изготовления композиции включает объединение компонентов в водном растворителе, охлаждение полученной смеси до температуры выше ее температуры замерзания, осуществление первичной сушки охлажденной смеси в вакууме при температуре выше ее температуры замерзания и вторичной сушки смеси при температуре 20°C или выше в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды Aw в смеси до 0,3 или менее. Предложена также композиция для изготовления стабильной сухой композиции, имеющая вязкость от около 10 Па·с до около 450 Па·с. Группа изобретений обеспечивает стабильность композиции при повышенной температуре и высокой влажности. 5 н. и 28 з.п. ф-лы, 11 ил, 21 пр., 4 табл.

 

Ссылка на родственные заявки на изобретения

В данной заявке на изобретение испрашивается приоритет предварительных заявок на патенты США №№61/181248 и 61/223295, поданных в патентное ведомство США 26 мая 2009 года и 6 июля 2009 года, соответственно, содержание которых включено в данное описание полностью путем ссылки.

Предшествующий уровень техники

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области защиты биоактивного микроорганизма и/или материалов в условиях высокой температуры и влажности. В частности, изобретение относится к включению живых микроорганизмов и/или биоактивных материалов в защитную матрицу сухой композиции.

Родственный уровень техники

Биоактивные микроорганизмы, такие как живые или убитые бактерии и вирусы, или биоактивные материалы, такие как белки, витамины, минеральные вещества, гормоны и клетки, как правило являются нестабильными при хранении в условиях высокой температуры и влажности. Например, множество имеющихся в продаже пробиотических бактерий, таких как Lactobacillus rhamnosus, могут терять более 1 log жизнеспособности через менее чем две недели при хранении в атмосфере окружающей среды при комнатной температуре (приблизительно 25°С). Общепринятый способ сушки и защиты этих биоактивных микроорганизмов после сбора из культурального сосуда (например ферментера) заключается в том, что концентрированный раствор живых клеток вносят в виде капель в жидкий азот, затем хранят замороженные гранулы в морозильнике при -80°С для последующей лиофилизации или транспортировки в другие области. Лиофилизация представляет собой преимущественный способ сушки чувствительного биоактивного материала. Другие способы, такие как сушка распылением, сверхкритическая флюидная сушка и осушение, как правило не подходят для чувствительных биоактивных агентов, таких как живые или ослабленные бактерии и вирусы, вследствие высоких температур сушки, используемых в этих способах, что приводит в результате к значительному повреждению самого микроорганизма. Дополнительно, они могут не достаточно высушивать материал для достижения специфических требований к остаточной влаге с обеспечением стабильности продукта и, таким образом, может потребоваться дополнительная стадия сушки при помощи других средств.

При лиофилизации биоактивный микроорганизм или материалы обычно смешивают в растворе или суспензии защитных агентов, замораживают и затем дегидратируют путем сублимации в полном вакууме. Низкие температуры процесса лиофилизации уменьшают реакции дегидратации биоактивного агента и минимизируют потерю активности в конечной сухой форме. Однако минусовые температуры требуют затрат энергии, и низкое отношение площади поверхности к объему для замороженного материала приводит к необходимости использования длительного времени сушки (вплоть до нескольких суток на цикл сушки партии). Медленная сушка в процессе лиофилизации также способствует образованию кристаллов льда, что может повредить или денатурировать чувствительные биоактивные агенты. По этой причине для биоактивного микроорганизма или материалов, таких как вирусы, бактерии и клетки, имеющие клеточную стенку или липидную мембрану, использование лиофилизации вызывает значительные затруднения.

Одна из возможностей для уменьшения образования структуры ледяного кристалла заключается в добавлении криозащитных агентов в раствор биоактивного агента. Такие защитные агенты представляют собой высокорастворимые химические вещества, которые добавляют в композицию для защиты клеточных мембран и внутриклеточных белков во время замораживания и для усиления стабильности во время хранения. Общепринятые стабилизаторы для живых бактерий и вирусов включают сахара, такие как сахароза, глицерин или сорбит, в высоких концентрациях с клеточным материалом или биоактивным агентом (Morgan et al., 2006; Capefa et al., 2006). Однако такие защитные агенты могут недостаточно проникать в клетку для защиты активных компонентов во внутриклеточном объеме. Таким образом, существуют значительные трудности в разработке оптимальных способа сушки и композиции, которые минимизируют потери при сушке, в то же время достигая подходящую стабильность при хранении высушенного материала.

Некоторые из проблем, ассоциированных с лиофилизацией, решали с использованием комбинации определенных композиций и вакуумной сушки в жидком состоянии. Annear (Annear 1962) разработал композицию, содержащую бактерии в растворе Сахаров и аминокислот, и способ вакуумной сушки, в котором используется кипение и образование пены. Roser et al. (патент США 6964771) раскрыл сходную концепцию сушки путем образования пены, включающую стадию концентрирования жидкости с последующим кипением и вспениванием концентрированного раствора (сиропа) в вакууме. Для того чтобы избежать окисления и денатурирующего повреждения, которые могут возникнуть во время стадии кипения, Bronshtein (патенты США №№5766520 и 7153472) ввел улучшенный защитный состав, содержащий углеводы и поверхностно-активные вещества. Сушка защитного раствора также включала постадийный процесс концентрирования в умеренном вакууме перед применением сильного вакуума, для того чтобы вызвать поверхностное кипение остаточной воды с образованием сухой стабильной пены. В попытках исключить стадию кипения Busson и Schroeder (патент США №6534087) предложили способ сушки композиции в жидком состоянии для нечувствительных биоактивных агентов с использованием вакуумной печи без кипения путем приложения весьма умеренного вакуумметрического давления выше 30 Торр (3999,66 Па). После достижения определенной степени сушки без кипения материала подводили тепло на уровне выше 20°С и высушенный материал собирали после всего лишь нескольких часов.

Этот вид способа сушки, в котором биоактивный раствор поддерживается в жидком состоянии в течение всего процесса сушки, обладает преимуществом более быстрой сушки вследствие конвекции жидкости во время кипения и увеличенной площади поверхности, представляемой пенящимися поверхностями. Однако для кипения и вспенивания требуется поступление значительного количества тепла для обеспечения необходимого всплеска раствора. Такой способ сушки недостаточно хорошо адаптирован для сушки чувствительных биологических объектов, таких как живые вирусы, клетки или бактерии, поскольку подводимое тепло ускоряет ферментативные процессы (например протеолиз) и химические процессы (например окисление и атаки свободных радикалов), что может подавить активность или жизнеспособность биологического материала.

Способ сушки, описанный выше, также ограничен по возможности его масштабирования до более крупного промышленного способа. Избегание замораживания требует проведение процесса при более низком уровне вакуума (более 7 Торр (933,25 Па)) по сравнению с обычной лиофилизацией или циклами процесса сушки путем распыления-замораживания. Наиболее существенный недостаток вышеприведенных способов заключается в неспособности контролировать и ограничивать распространение пены внутри сосуда, поддона или флакона. Неконтролируемый всплеск и часто чрезмерное образование пены приводят к невозможности на практике разработать промышленно масштабируемый способ. Характерные для стадии кипения всплески и вспенивание приводят в результате к тому, что часть материала разбрызгивается на стенки сосуда и в сушильную камеру. Для смягчения разбрызгивания во время кипения Bronshtein (патенты США №№6884866 и 6306345) предложил специальные камеры и протокол применения контролируемой температуры/давления, что снижает избыточный нагрев до приемлемого уровня. Еще один подход для преодоления разбрызгивания и чрезмерного вспенивания описан в заявке на патент США №2008/0229609, в котором биоактивный раствор помещают в контейнер или пакет, покрытые воздухопроницаемыми мембранами. Все же эти протоколы являются сложными для реализации на промышленном уровне и трудны для надежного воспроизведения при использовании разных композиций.

Сохраняется потребность в подходящей защитной композиции, которая может быть высушена из жидкого состояния, и промышленно масштабируемом способе сушки биоактивных микроорганизмов, таких как живые или убитые вирусы, бактерии и клетки, в частности, при температурах выше температуры замерзания. В особенности, существует потребность в экономичном масштабируемом способе сушки, который также подходит для применений вне фармацевтической промышленности, таких как пищевая и сельскохозяйственная промышленности. Защитные композиции и мягкие способы сушки требуются для обеспечения подходящей сушки без воздействия высокими температурами. Необходима композиция, которая может защитить такие биологические объекты при хранении в условиях высокой температуры и влажности. В настоящем изобретении, описанном ниже, предложено решение всех этих проблем.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение включает композиции и способы для сохранения биоактивных материалов, таких как пептиды, белки, гормоны, витамины, минеральные вещества, лекарственные средства, микробиоциды, фунгициды, гербициды, инстектициды, спермициды, нуклеиновые кислоты, антитела, вакцины и/или биоактивный микроорганизм, такой как бактерии (пробиотические или другие), вирусы и/или клеточные суспензии, при хранении. Способы сушки обеспечивают процесс контролируемого увеличения объема композиции, содержащей биоактивный микроорганизм или материал, стабилизатор композиции и защитный агент. Композицию готовят путем диспергирования всех твердых компонентов в растворе в условиях вакуума или без него. Раствор охлаждают до температуры выше его температуры замерзания и сушат в вакууме с получением сухой композиции, которая демонстрирует неожиданно высокую стабильность. Эти способы включают стадию первичной сушки композиции при желаемых температуре и периоде времени и стадию ускоренной вторичной сушки при максимальном вакууме и повышенной температуре с достижением желаемой конечной активности воды высушенного материала.

В одном из воплощений композиция содержит достаточные количества стабилизаторов композиции, в которых заключены микроорганизмы. Примеры подходящего стабилизатора композиции включают ацетатфталат целлюлозы (CAP), карбоксиметилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), метилцеллюлозу, каррагинан, гуаровую камедь, аравийскую камедь, ксантановую камедь, смолу плодов рожкового дерева, хитозан и хитозановые производные, коллаген, полигликолевую кислоту, крахмалы и модифицированные крахмалы, циклодекстрины и олигосахариды (инулин, мальтодекстрин, декстраны и так далее); и их комбинации, но не ограничиваются ими.

В одном из конкретных воплощений предпочтительный стабилизатор композиции представляет собой альгинат натрия. Предпочтительно, композиция содержит, в процентном отношении по массе всего сухого вещества, 0,1-10%, предпочтительно 1-6%, более предпочтительно 2-4% стабилизатора композиции. В дополнительном воплощении стабилизатор композиции содержит смесь альгината натрия и олигосахариды в массовом соотношении 1:1-10, более предпочтительно 1:1-5 альгината натрия/олигосахаридов. В еще одном воплощении настоящего изобретения стабилизатор композиции перекрестно связан двухвалентными ионами металлов с образованием прочного гидрогеля.

В еще одном воплощении композиция содержит значительные количества защитных агентов, в которых заключены микроорганизмы. Примеры подходящего защитного агента включают белки, такие как человеческий и бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин, желатин, иммуноглобулин, выделенный соевый белок, пшеничный белок, сухое обезжиренное молоко, казеинат, белок молочной сыворотки и любые белковые гидролизаты; углеводы, включая моносахариды (например галактозу, D-маннозу, сорбозу и так далее), дисахариды (например лактозу, трегалозу, сахарозу и так далее), аминокислоту, такую как лизин, мононатрий-глутамат, глицин, аланин, аргинин или гистидин, а также гидрофобные аминокислоты (триптофан, тирозин, лейцин, фенилаланин и так далее); метиламин, такой как бетаин; соль-эксципиент, такую как сульфат магния; полиол, такой как трехатомные или сахарные спирты высшей атомности (например глицерин, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит); пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; плюроник; поверхностно-активные вещества; и их комбинации, но не ограничиваются ими.

В одном из предпочтительных воплощений защитный агент содержит смесь дисахарида, белка и белкового гидролизата. В конкретном воплощении предпочтительный защитный агент представляет собой смесь трегалозы, выделенного соевого белка или белка молочной сыворотки и их гидролизатов. Предпочтительно композиция содержит, в процентном отношении по массе всего сухого вещества, 10-90% трегалозы, 0,1-30% выделенного соевого белка или белков молочной сыворотки и 0,1-30% гидролизата соевого белка или белка молочной сыворотки. Предпочтительно 20-80% трегалозы, 0,1-20% выделенного соевого белка или белка молочной сыворотки и 1-20% гидролизата соевого белка или белка молочной сыворотки, более предпочтительно 40-80% трегалозы, 0,1-20% выделенного соевого белка или белков молочной сыворотки и 1-20% гидролизата соевого белка или белка молочной сыворотки.

Способ по изобретению, как правило, включает смешивание в условиях вакуума или без него концентрированного раствора или сухого порошка биоактивного микроорганизма (например живых или убитых вакцин, бактерий, водорослей, вирусов и/или клеточных суспензий) или биоактивного материала (например пептидов, белков, гормонов, витаминов, минеральных веществ, лекарственных средств, микробиоцидов, фунгицидов, гербицидов, инстектицидов, спермицидов, нуклеиновых кислот, антител, вакцин), стабилизатора и защитного агента в гомогенную композицию, охлаждение композиции до температуры выше ее температуры замерзания и сушку в вакууме при температуре полки выше 20°С. В соответствии с изобретением процесс сушки может включать первичную вакуумную сушку при температуре полки 20°С или выше с последующей ускоренной вторичной сушкой композиции при максимальном вакууме и повышенной температуре в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды (Aw) высушенной композиции до 0,3 или менее.

В одном из воплощений способа смешивания биоактивный микроорганизм или материал находится в сухой стабилизированной форме, и его дополнительно подвергают сухому смешиванию со стабилизаторами и защитными агентами в сухой форме. Эту сухую смесь затем добавляют к воде и перемешивают в подходящих условиях вакуума и встряхивания с получением гомогенной суспензии с желаемой плотностью.

В еще одном воплощении способа смешивания биоактивный микроорганизм или материал находится в форме концентрированного раствора или пасты. Раствор смешивают со всеми другими ингредиентами композиции перед добавлением к воде.

В еще одном воплощении способа смешивания биоактивный микроорганизм или материал находится в форме сухого порошка. Этот сухой порошок смешивают со всеми другими ингредиентами композиции перед добавлением к воде.

В еще одном воплощении способа смешивания сухой биоактивный микроорганизм или материал смешивают лишь с частью ингредиентов композиции и эту смесь добавляют к предварительно приготовленной суспензии, полученной путем добавления других ингредиентов композиции к воде.

В предпочтительных воплощениях способов сушки биоактивный микроорганизм смешивают в вакууме в растворе, включающем стабилизатор композиции и защитный агент. В одном из конкретных воплощений биоактивный микроорганизм содержит живые бактерии (например пробиотические бактерии). Примеры подходящих микроорганизмов включают дрожжи, такие как Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia и Torulopsis, плесневые грибы, такие как Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium и Torulopsis, и бактерии, такие как бактерии родов Bifidobacterium, Closthdium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Kocuriaw, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus и Lactobacillus. Конкретные примеры подходящих пробиотических микроорганизмов могут быть представлены следующими видами и включают все культуральные биотипы среди этих видов: Aspergillus niger, A.oryzae, Bacillus coagulans, B.lentus, В.licheniformis, В.mesentericus, В.pumilus, В.subtilis, В.natto, Bacteroides amylophilus, Вас.capillosus, Вас.ruminocola, Вас.suis, Bifidobacterium adolescentis, B.animalis, B.breve, B.bifidum, B.infantis, B.lactis, B.longum, B.pseudolongum, B.thermophilum, Candida pintolepesii, Clostridium butyricum, Enterococcus cremoris, E.diacetylactis, E faecium, E.intermedius, E.lactis, E.muntdi, E.thermophilus, Escherichia со//, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus acidophilus, L.alimentarius, L.amylovorus, L crispatus, L.brevis, L.case 4 L.curvatus, L.cellobiosus, L.delbmeckii ss. bulgaricus, L.farciminis, L.fermentum, L.gasseri, L.helveticus, L.lactis, L.plantarum, L.johnsonii, L.reuteri, L rhamnosus, L.sakei, L.salivarius, Leuconostoc mesenteroides, P.cereviseae (damnosus), Pediococcus acidilactici, P.pentosaceus, Propionibacterium freudenreichii, Prop.shermanii, Saccharomyces cereviseae, Staphylococcus camosus, Staph. xylosus, Streptococcus infantahus, Strep.salivarius ss. thermophilus, Strep.thermophilus и Strep.lactis, но не ограничиваются ими.

В предпочтительных способах композицию смешивают в вакууме при комнатной температуре (например от 20°С до 30°С). После смешивания до гомогенности композицию затем охлаждают до температуры выше температуры замерзания композиции. Как правило, композицию охлаждают до температуры от -10°С до +10°С, более предпочтительно композицию охлаждают до температуры от -5°С до +5°С. В предпочтительном воплощении охлажденную композицию затем переносят в сушильную камеру, в которой применяют нагревание (20°С или больше), контролируя исходное вакуумметрическое давление на уровне, поддерживающем исходную температуру до охлаждения. Как правило, желаемое вакуумметрическое давление составляет менее 7 Торр (933,25 Па), но не менее 3 Торр (399,97 Па). В этих предпочтительных условиях достигается контролируемое увеличение объема композиции и последующая более быстрая первичная сушка композиции. Для ускорения вторичной сушки применяют максимальное вакуумметрическое давление, и температура теплоносителя может быть дополнительно увеличена до 30°С-60°С. Для максимизации стабильности конечного продукта композицию предпочтительно сушат в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды в композиции до Aw равной 0,3 или менее. В предпочтительном воплощении изобретения вторичная сушка включает удаление воды при давлении менее 1 Торр (133,32 Па) и в особенно предпочтительном воплощении до менее 0,2 Торр (26,66 Па).

Влажная композиция может находиться в форме вязкой суспензии или частиц гидрогеля в диапазоне от 0,05 до 10 мм. Высушенная композиция может быть использована непосредственно в виде комка или измельчена в порошок со средним размером частиц от приблизительно 10 мкм до приблизительно 1000 мкм. Композиция может быть введена непосредственно животному, включая человека, в виде концентрированного порошка, в виде восстановленной из порошка жидкости (например напитка), или она может быть включена в виде комка или порошка в имеющийся пищевой или кормовой продукт.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 представлен график стабильности пробиотических бактерий, L.rhamnosus, которых подвергали хранению при 40°С и относительной влажности 33%.

На Фиг.2 представлены температуры процесса и кумулятивная потеря жизнеспособности для способа изготовления, завершающегося вторичной стадией сушки с Aw 0,28.

На Фиг.3 показано влияние различных стабилизаторов композиции на стабильность при хранении.

На Фиг.4 показано влияние вязкости альгината на увеличение объема композиции в вакууме.

На Фиг.5 показано влияние различных комбинаций стабилизаторов на жизнеспособность бактерий.

На Фиг.6 показано влияние плотности композиции на степень увеличения объема в вакууме.

На Фиг.7 показано влияние температуры предварительного охлаждения композиции на увеличение объема в вакууме.

На Фиг.8 показано влияние вакуум-метрического давления на температуру композиции во время стадии первичной сушки.

На Фиг.9 показано влияние вакуумметрического давления на скорость сушки композиции.

На Фиг.10 показана стабильность пробиотических бактерий, L.acidophilus, высушенных с композицией и способом по изобретению, во время хранения при 37°С и относительной влажности 33%.

На Фиг.11 представлена схема процесса изготовления стабильной сухой композиции из гидрогелевой композиции в соответствии с изобретением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Следует понимать, что используемая здесь терминология приведена с целью описания только конкретных воплощений и не предназначена для ограничения объема изобретения. Используемые в этом описании и формуле изобретения формы единственного числа включают, если ясно не указано иное, объекты во множественном числе. Таким образом, например ссылка на "белок" включает единичный белок или комбинацию двух или более белков; ссылка на "фермент", "витамин", "бактерии" и так далее включает единичные объекты или смеси нескольких из них и тому подобное.

В описании и формуле настоящего изобретения использована следующая терминология в соответствии с представленными ниже определениями.

Температуры или условия "окружающей среды" представляют собой температуры или условия в любой заданный момент времени в данной окружающей среде. Как правило, температура окружающей среды составляет 22-25°С, давление окружающей атмосферы и влажность окружающей среды легко измерить, и они варьируют в зависимости от времени года, погодных и климатических условий, высоты и так далее.

"Дегазирование" относится к высвобождению газа, растворенного в жидкости, в которой парциальное давление газа больше приложенного давления. Не представляет собой кипение и часто может происходить при давлениях выше давления, при котором может кипеть раствор. Например, бутилированные газированные безалкогольные напитки имеют высокое парциальное давление CO₂. Удаление крышки с бутылки снижает парциальное давление, и напиток интенсивно пузырится (он дегазирует, но не кипит).

"Кипение" относится к быстрому фазовому переходу из жидкости в газ, которое происходит тогда, когда температура жидкости выше ее температуры кипения. Температура кипения представляет собой температуру, при которой давление паров в жидкости равно приложенному давлению. Кипение может быть особенно интенсивным при приложении тепла к жидкости, которая уже находится в точке своего кипения.

"Активность воды" или "Aw" в контексте высушенной композиции относится к доступности воды и отражает энергетическое состояние воды в системе. Оно определено как давление паров воды над образцом, разделенное на давление паров чистой воды при той же самой температуре. Чистая дистиллированная вода имеет активность воды, точно равную единице, или Aw=1,0.

"Относительная влажность" или "RH" в контексте стабильности при хранении относится к количеству паров воды в воздухе при данной температуре. Относительная влажность обычно меньше той, которая требуется для насыщения воздуха, и выражается в процентной доле от влажности насыщения.

"Первичная сушка" в отношении описанных здесь способов относится к сушке, которая протекает с момента первичного применения вакуума до точки, когда начинается вторичная сушка. Как правило, большая часть первичной сушки осуществляется путем обширного испарения, при том что температура продукта остается значительно ниже температур источника тепла.

"Вторичная сушка", в отношении описанных здесь способов, относится к стадии сушки, которая протекает при температурах выше температур замерзания композиции и близко к температуре источника тепла. В типичном способе сушки композиции стадия вторичной сушки снижает активность воды Aw в композиции до 0,3 или менее.

"Биоактивный микроорганизм" или "биологически активный микроорганизм или композиция" относится к препаратам живых или убитых микроорганизмов, которые находятся в такой форме, которая безусловно обеспечивает эффективную биологическую активность микроорганизмов. "Живой микроорганизм в виде сухого порошка" относится к бактериальной биомассе, в которой по меньшей мере 10% масс./масс. бактерий являются живыми. "Убитый микроорганизм в виде сухого порошка" относится к бактериальной биомассе, в которой по меньшей мере 99,999% бактерий являются убитыми.

"Биоактивный материал", "биоактивная композиция", "биологически активный материал" или "биологически активная композиция" относится к препаратам, которые находятся в такой форме, которая безусловно обеспечивает эффективную биологическую активность биоактивных ингредиентов. Такие биоактивные материалы включают пептиды, белки, гормоны, витамины, минеральные вещества, лекарственные средства, микробиоциды, фунгициды, гербициды, инстектициды, спермициды, нуклеиновые кислоты, антитела и вакцины, но не ограничиваются ими.

"Стабилизатор или стабилизирующий агент" относится к соединениям или материалам, которые добавляют в композицию для увеличения вязкости влажной композиции или для образования гидрогеля. Примеры подходящего стабилизирующего агента включают полисахариды, такие как ацетатфталат целлюлозы (CAP), карбоксиметилцеллюлоза, пектин, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), метилцеллюлоза, каррагинан, гуаровая камедь, аравийская камедь, ксантановая камедь, смола плодов рожкового дерева, хитозан и хитозановые производные, коллаген, полигликолевая кислота, крахмалы и модифицированные крахмалы, циклодекстрины и олигосахариды (инулин, мальтодекстрины, раффиноза, декстраны и так далее) и их комбинации, но не ограничиваются ими.

"Защищающий агент", или "защитный агент", или "протектор" в общем относится к соединениям или материалам, которые добавляют для обеспечения или увеличения стабильности биоактивного материала во время процесса сушки и после него, или для обеспечения стабильности при длительном хранении сухого порошкообразного продукта. Подходящие защитные агенты как правило легко растворимы в растворе и не сгущаются или не полимеризуются при контакте с водой. Подходящие защитные агенты описаны ниже и включают белки, такие как человеческий и бычий сывороточный альбумин, белок молочной сыворотки, соевый белок, казеинат, желатин, иммуноглобулины, углеводы, включая моносахариды (галактозу, D-маннозу, сорбозу и так далее), дисахариды (лактозу, трегалозу, сахарозу и так далее), аминокислоты, такие как глутамат мононатрия, лизин, глицин, аланин, аргинин или гистидин, а также гидрофобные аминокислоты (триптофан, тирозин, лейцин, фенилаланин и так далее); метиламин, такой как бетаин; соль-эксципиент, такой как сульфат магния; полиол, такой как трехатомные или высшие сахарные спирты (например глицерин, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит); пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; плюроник; поверхностно-активные вещества и их комбинации, но не ограничиваются ими.

"Стабильный" препарат или композиция представляет собой такой препарат или композицию, где биоактивный микроорганизм или материал по существу сохраняет свою жизнеспособность и/или биологическую активность при хранении. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре и условиях влажности для выбранного периода времени. Анализ тренда может быть использован для оценки ожидаемого срока годности до того, как материал будет реально храниться в течение данного периода времени. Для живых бактерий, например, стабильность определяют как время, затрачиваемое для уменьшения на 1 log CFU (колониеобразующая единица)/г сухой композиции в заранее определенных условиях температуры, влажности и периоде времени.

"Жизнеспособность" в отношении бактерий относится к способности образовывать колонию (CFU или колониеобразующих единиц) на питательных средах, подходящих для роста бактерий. Жизнеспособность в отношении вирусов относится к способности инфицировать и воспроизводиться в подходящей клетке-хозяине, что приводит в результате к образованию бляшек на слое клеток-хозяев.

Композиции и способы по настоящему изобретению позволяют решить проблему обеспечения экономичных и промышленно масштабируемых способов сушки для получения сухой композиции, содержащей биоактивные микроорганизмы или материалы, такие как живые или убитые вакцины, бактерии, водоросли, вирусы и/или клеточные суспензии, пептиды, белки, гормоны, витамины, минеральные вещества, лекарственные средства, микробиоциды, фунгициды, гербициды, инстектициды, спермициды, нуклеиновые кислоты, антитела, вакцины, обладающей значительно увеличенным сроком годности в сухом состоянии. В изобретении предложена композиция, содержащая биоактивный микроорганизм или материал со стабилизатором и защитным агентом в растворе, охлаждение указанной композиции до температуры выше ее температуры замерзания и стабилизация композиции путем удаления влаги в режиме пониженного давления при подведении к композиции тепла.

Большая часть потерь жизнеспособности микроорганизмов во время процессов сушки может быть связана с комбинацией стрессов во время замораживания-оттаивания и образования кристаллов льда, высокими осмотическими и окислительными стрессами, усилиями сдвига и высвобождением энергии во время пузырьковой кавитации, ассоциированной с "кипением" раствора при низком давлении сушки и высокой температуре. В настоящем изобретении предложена композиция и промышленно масштабируемый способ сушки, который минимизует потери во время сушки и защищает биоактивный микроорганизм при последующих жестких условиях хранения.

КОМПОЗИЦИИ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ

Настоящее изобретение включает изготовление композиций биоактивного микроорганизма или материала, стабилизатора и защитного агента в вязком растворе. Обнаружено, что композиции по изобретению по существу отличаются по своей физической структуре и функции от невязких или концентрированных композиций, которые сушили без предварительного охлаждения. Например, композиции предшествующего уровня техники сначала "вспенивали" для облегчения эффективной сушки. Стадия вспенивания в общем приводила в результате к интенсивному кипению и разбрызгиванию раствора, что является неизбежным следствием вакуумной сушки в жидком состоянии, и в результате может быть достигнута лишь очень низкая загрузочная емкость материала во флаконе или сосуде (см., например, патент США №6534087, в котором толщина слоя конечного вспененного продукта составляет менее 2 мм). Композиции и способы сушки по настоящему изобретению приводят лишь к очень ограниченному и контролируемому увеличению объема композиции, тем самым обеспечивая возможность гораздо более высокой загрузочной емкости материала на площадь сушки и, в результате, могут быть легко масштабированы для производства больших количеств материала.

Показано, что для одноклеточных микроорганизмов в особенности благоприятны композиции и способы сушки по настоящему изобретению. В одном из воплощений биоактивный микроорганизм по изобретению представляет собой пробиотические бактерии. Композицию готовят в соответствии с композициями и способами по изобретению, включающими приготовление живых пробиотических бактерий в концентрированном растворе, пасте, замороженных гранулах или сухой порошкообразной форме; смешивание пробиотических бактерий в вакууме со стабилизатором и защитным агентом, охлаждение вязкой композиции до температуры выше ее температуры замерзания, применение достаточного вакуумметрического давления для поддержания этой температуры предварительного охлаждения и применение источника тепла 20°С и выше для облегчения удаления воды. Поддержание температуры композиции после предварительного охлаждения может быть осуществлено путем отведения тепла от композиции и/или путем уменьшения скрытой теплоты вследствие испарения воды. Для дополнительного ускорения процесса сушки применяют стадию вторичной сушки при более высоком вакууме вплоть до 0,1 Торр (13,33 Па) и при повышенной температуре вплоть до 70°С для получения конечной композиции, обладающей активностью воды Aw равной 0,3 или менее. Такая композиция может сохранять стабильность в условиях хранения при 40°С и 33% RH в течение 60 суток или дольше (см. Фиг.1). Показано, что эти специфические способы по изобретению приводят в результате к неожиданной способности клеток сохранять свою жизнеспособность выше той, которая достигается при использовании общепринятых способов сушки. Исходная потеря жизнеспособности при проведении всего процесса сушки в соответствии с настоящим изобретением составила лишь 0,3 log (см. Фиг.2).

Составы для изготовления стабильных сухих порошкообразных композиций

Компоненты, которые необходимо смешать с предпочтительным микроорганизмом или материалом для изготовления сухих порошкообразных композиций в соответствии с изобретением, включают стабилизатор и защитный агент. Такие компоненты, когда их смешивают с предпочтительными биоактивными микроорганизмами или материалом, могут быть обработаны в соответствии со способами по изобретению, обеспечивающими получение больших количеств стабильных сухих композиций для хранения и введения указанных микроорганизмов. Стабилизаторы композиций могут включать смесь полисахарида и олигосахарида. Предпочтительным полисахаридом, в особенности для стабилизации живых микроорганизмов, оказался альгинат, поскольку неожиданно обнаружили, что альгинат превосходит другие полисахариды, такие как пектин и аравийскую камедь, в отношении снижения потерь чувствительных биологических молекул, таких как пробиотики, при сушке (Фиг.3). Он также является предпочтительным благодаря своему свойству образовывать гидрогель с нетоксичными металлами при умеренных температурах. Также было обнаружено, что альгинат эффективно стабилизирует композицию в вакууме путем придания подходящей вязкости композиции и обеспечивая контролируемое увеличение объема композиции при конкретной вязкости (Фиг.4).

Также было обнаружено, что объединение олигосахарида с альгинатом вносит дополнительный вклад в общую стабильность композиции. На Фиг.5 показано влияние различных комбинаций альгината и олигосахаридов на стабильность при хранении. Комбинация альгината и инулина представляла собой предпочтительную комбинацию с точки зрения влияния ее длительного хранения на пробиотические бактерии. В одном из воплощений изобретения по меньшей мере один из стабилизирующих агентов композиции предпочтительно представляет собой смолу, которая может образовывать прочный гидрогель путем перекрестного связывания с ионами металлов.

Защитные агенты по изобретению могут включать различные белки, пептиды, сахара, сахарные спирты и аминокислоты. Защитный агент предпочтительно представляет собой агент, который не кристаллизуется и/или не дестабилизирует биологически активный материал в композиции при температурах замерзания (например -20°С). Может быть благоприятно включать два или более чем два разных защитных агента для ингибирования образования кристаллов и стабилизации высушенной композиции биоактивного материала в условиях хранения в течение длительных периодов времени.

Влажные композиции могут включать значительное количество твердых веществ (компоненты минус растворитель, такой как вода). Значительная доля твердых веществ может состоять из биоактивного материала, стабилизирующего агента и защитного агента.

Например, биоактивный материал может присутствовать в композиции в концентрации, находящейся в диапазоне приблизительно 2-50 масс.%, стабилизирующий агент в диапазоне приблизительно 1-20 масс.% и защитный агент в диапазоне приблизительно 20-80 масс.%. В еще одном примере стабилизирующий агент может присутствовать в композиции в концентрации, находящейся в диапазоне приблизительно 0,5-10 масс.%, и защитный агент в диапазоне приблизительно 10-40 масс.%. Предпочтительно, влажная композиция должна иметь содержание твердых веществ от приблизительно 5% до 80%; более предпочтительно от приблизительно 30% до 60%. Вязкость композиции по изобретению обычно составляет боле 1000 сантипуаз (сП) (1 Па·с); более предпочтительно, более 10000 сП (10 Па·с) и менее 450000 сП (450 Па·с); и наиболее предпочтительно, более 30000 сП (30 Па·с) и менее 100000 сП (100 Па·с).

Вязкость композиций по изобретению может составлять 450000 сП (450 Па·с), при условии, что защитные агенты полностью растворены в растворе. Высоковязкие и гомогенные суспензии, содержащие значительное количество твердых веществ, могут быть получены при повышенной температуре в зависимости от термической и осмотической чувствительности биоактивного материала. Например, композиции живых клеток, содержащие 30-60% твердых веществ, могут быть смешаны при повышенной температуре приблизительно 35-40°С, и смешивание осуществляют до полного растворения всех защитных агентов.

СПОСОБЫ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ СУХИХ КОМПОЗИЦИЙ

Способы изготовления стабильных сухих композиций для сохранения биоактивных микроорганизмов включают получение живой культуры конкретного микроорганизма в концентрированном растворе, пасте, замороженных гранулах или сухой порошкообразной форме (стабилизированной или иной); приготовление композиции путем смешивания в вакууме биоактивного микроорганизма или материала со стабилизатором и защитным агентом в растворе, охлаждение композиции до температуры не более чем 10°С выше ее температуры замерзания и сушку композиции путем испарения влаги при пониженном давлении при подведении к композиции тепла.

Например, в одном из воплощений композиции, содержащей биоактивный микроорганизм или материал, стабилизатор композиции и защитный агент смешивают до гомогенного состояния в умеренном вакууме приблизительно 10-50 Торр (1333,22-6666,1 Па) в растворе. На Фиг.6 показано влияние различных плотностей композиции на увеличение ее объема в вакууме. Введение воздуха во время смешивания компонентов композиции в растворе приводит в результате к интенсивному и неконтролируемому вспениванию даже при относительно высоком вакуумметрическом давлении. Стадия смешивания в вакууме в соответствии с изобретением позволяет преодолеть данную проблему путем устранения введения воздуха или газа в раствор композиции, тем самым устраняя чрезмерное и неконтролируемое вспенивание раствора.

Раствор затем охлаждают до температуры выше его температуры замерзания (обычно от -5°С до +5°С). На Фиг.7 показано влияние предварительного охлаждения раствора композиции на увеличение ее объема при вакуумметрическом давлении. Удивительно и неожиданно обнаружено, что кипение может быть эффективно устранено даже при относительно более высоком вакуумметрическом давлении, и увеличение объема композиции лучше контролируется при снижении температуры раствора до температуры, которая не более чем на 10°С выше его температуры замерзания. Как можно видеть из Фиг.7, вакуумметрическое давление 3 Торр (399,97 Па) можно приложить без чрезмерного вспенивания, при условии, что композицию охлаждают до +5°С и предпочтительно до -3°С.

После охлаждения композицию затем сушат при достаточном вакууме (например приблизительно 3 Торр (399,97 Па)) для поддержания температуры предварительного охлаждения во время стадии первичной сушки. На Фиг.8 показано влияние приложенного вакуумметрического давления на температуру раствора композиции. При относительно высоком вакуумметрическом давлении, выше 8 Торр (1066,58 Па), температура композиции повышается до более 6°С и быстро увеличивается до температуры полки или камеры. В то же время раствор продолжает вспениваться и дополнительно увеличиваться в объеме. Это воплощение отличается от обсуждаемого выше предшествующего уровня техники (см., например, патент США №6534087, где приложенное вакуумметрическое давление составляет 3-7 Торр (399,97-933,25 Па) и даже выше), при котором применяется более жесткое вакуумметрическое давление (<3 Торр (<399,97 Па)) при контролировании увеличения объема композиции. Этот способ приводит в результате к значительно более быстрой сушке (см. Фиг.9) и обеспечивает высокую загрузочную емкость композиции. В этом воплощении чрезмерное вспенивание и кипение устраняются даже при гораздо более низком вакуумметрическом давлении, поскольку способы по изобретению обеспечивают: а) специфическую композицию с контролируемым увеличением объема в вакууме, б) способ, который устраняет введение воздуха в композицию во время смешивания, и в) значительное предварительное охлаждение композиции.

Типичные способы в предшествующем уровне техники включают интенсивное вспенивание и/или разбрызгивание и интенсивное кипение, которое может быть опасным для чувствительных биологических материалов и вызывает трудности для промышленного масштабирования. Дополнительно, полное и эффективное дегазирование вязких суспензий является сложным, и может потребоваться более длительный период времени. Эти препятствия преодолеваются в настоящем изобретении прежде всего путем осуществления способа полного смешивания в умеренном вакууме с устранением введения газов, увлекаемых в композицию в первую очередь. Какое-либо небольшое количество растворимых газов, которое может остаться в композиции, затем осторожно удаляют, что обеспечивает умеренное увеличение объема композиции в условиях низкого вакуума. Дополнительная стадия предварительного охлаждения композиции до температуры выше ее температуры замерзания обеспечивает дополнительный контроль степени увеличения объема и таким образом дает возможность для гораздо более высокой загрузочной емкости на площадь сушки по сравнению с той, которая достигается в соответствии с предшествующим уровнем техники. После завершения стадии первичной сушки стабилизированная сухая композиция может поддерживаться при повышенных температурах вторичной сушки (вплоть до 70°С) и вакуумметрическом давлении менее 0,2 Торр (26,66 Па) для полной сушки композиции в течение очень короткого периода времени.

В еще одном воплощении изобретения предложены способы изготовления гидрогелевой композиции для сохранения биоактивных микроорганизмов или материалов. Например, композиция, содержащая пробиотические бактерии в сухой порошкообразной форме, стабилизатор и защитный агент, смешивают в растворе, перекрестно связывают с гидрогелем путем добавления ионов металла или двухвалентных катионов и затем сушат при низком вакууме и температуре, как описано выше. Температуру предварительного охлаждения композиции можно поддерживать осуществлением отведения тепла от композиции и/или потерей скрытого тепла вследствие испарения воды.

В одном из конкретных воплощений изобретения, например, композиция включает концентрированную свежую, или замороженную, или высушенную культуру живых пробиотических бактерий в растворе от 1 до 2,5% альгината натрия (предпочтительно 1,5% альгината натрия), от 1% до приблизительно 5% инулина (предпочтительно 2,5% инулина), от 20% до 60% трегалозы (предпочтительно 40% трегалозы) и от 3% до 15% гидролизата казеина (предпочтительно 8% гидролизата казеина). Композицию смешивают в вакууме при температуре немного выше комнатной температуры (как правило 25°С-37°С) до полного растворения всех компонентов.

В одном из дополнительных воплощений изобретения все ингредиенты растворяют в растворе при повышенной температуре, затем суспензию охлаждают до температуры от 0°С до -5°С и сухой порошок живого микроорганизма смешивают до полного растворения всех компонентов. Для облегчения смешивания сухого порошка живого организма и для предотвращения образования комков, небольшое количество трегалозы может быть добавлено к этому сухому порошку (как правило, достаточно смеси, содержащей равные доли сухого порошка и трегалозы).

Суспензию композиции распыляют на поддоны при загрузочной емкости приблизительно 200 г/кв. фут (2150 г/м²) и поддоны помещают на полки в лиофильной сушилке. Температуру полки доводят до уровня от 0 до -5°С (предпочтительно -2°С) и суспензию оставляют охлаждаться до указанной температуры. Затем прикладывают вакуумметрическое давление при 1-5 Торр (133,32-666,61 Па) (предпочтительно 3 Торр (399,97 Па)) и температуру полки увеличивают до 20-45°С (предпочтительно 30°С) для кондуктивной теплопередачи. Температуру композиции поддерживали на уровне приблизительно от 0 до -5°С на стадии первичного выпаривания для предотвращения замораживания образца. Стадию вторичной сушки при максимальном вакууме 0,1 Торр (13,33 Па) и температуре полки 40°С начинали тогда, когда температура продукта достигала приблизительно +10°С. Весь процесс сушки осуществляли приблизительно 4 часа, по окончании которых продукт собирали, и активность воды Aw составила 0,3 или менее.

В еще одном воплощении изобретения загрузочные поддоны предварительно охлаждали до -2°С в холодной комнате, затем немедленно загружали в вакуумную печь для теплопередачи путем излучения. Затем проводили стадии первичной и вторичной сушки, как описано выше для кондуктивной теплопередачи.

Изготовление композиции

Композиции по изобретению могут включать свежие, замороженные или высушенные живые микроорганизмы, приготовленные в растворе или суспензии, содержащей стабилизатор композиции и защитный агент. Стабилизатор композиции и/или защитный агент в высокой концентрации могут быть растворены в нагретом водном растворе при встряхивании перед охлаждением и смешиванием с биоактивными микроорганизмами. Микроорганизмы, такие как культура вируса или бактерии, могут быть концентрированы и отделены от культуральных сред путем центрифугирования или фильтрации, затем непосредственно смешаны в композиции по настоящему изобретению, или добавлены с обычными криопротекторами, введенными по каплям в жидкий азот, и небольшие замороженные гранулы можно хранить при -80°С до смешивания в композиции. Альтернативно, замороженные гранулы могут быть лиофилизированы, измельчены в тонкодисперсный порошок, упакованы в контейнеры без доступа воздуха, и их можно хранить замороженными до смешивания в композиции по изобретению. В одном из воплощений настоящего изобретения общее количество воды в композиции содержится в жидкости концентрированного живого организма, и суспензию живого организма поддерживают при температуре несколько выше комнатной температуры. Сухие компоненты стабилизатора композиции и защитного агента смешивают вместе и затем медленно добавляют к теплой суспензии живого организма. Суспензию композиции осторожно встряхивают в умеренном вакууме в планетарном смесителе до тех пор, пока все компоненты не будут полностью диспергированы и не будет получена однородная суспензия.

В еще одном воплощении настоящего изобретения биоактивный микроорганизм находится в форме сухого порошка, и его предварительно смешивают в сухом состоянии с ингредиентами композиции, затем образованную в результате сухую смесь добавляют к воде при температуре слегка выше комнатной температуры.

Биоактивный микроорганизм или материал может обеспечивать какую-либо биологическую активность, такую как ферментативная активность, индуцирование иммунных ответов, размножение клеток, инфицирование, ингибирование клеточного роста, стимулирование клеточного роста, терапевтические воздействия, фармакологические действия, антимикробные действия и/или тому подобное. Биоактивный микроорганизм или материал может представлять собой неживые клетки или липосомы, полезные в качестве вакцин или везикул для доставки терапевтических агентов. Биоактивный микроорганизм по изобретению может представлять собой живые вирусы и живые ослабленные вирусы и/или тому подобное.

Стабилизаторы композиции придают композиции структурную стабильность и/или физические и химические защитные преимущества для биоактивных микроорганизмов. Стабилизаторы могут обеспечивать загущение композиции, лучший контроль над свойствами ее увеличения в объеме при вакуумметрическом давлении и повышенную структурную прочность высушенной композиции по изобретению.

Защитные агенты могут включать различные белки, белковые гидролизаты, сахара, сахарные спирты и аминокислоты. Например, сахара, такие как сахароза или трегалоза, могут физически окружать биоактивный материал для того, чтобы способствовать сохранению молекулярной структуры в процессе сушки и придавать структурную прочность аморфному матриксу в высушенном состоянии. Защитный агент может замещать гидратационную воду, теряемую во время сушки, для предотвращения повреждения клеточных мембран и денатурации ферментов. Другие функции защитных агентов могут включатьзащиту биоактивного материала от воздействия повреждающего света, кислорода, окислителей и влаги. Большинство защитных агентов может быть легко растворено в растворе в количестве, находящемся в диапазоне от приблизительно 0,1 масс.% до приблизительно 60 масс.%.

Предварительное охлаждение композиции

Композиции по изобретению могут быть предварительно охлаждены перед тем, как приложить вакуумметрическое давление для процесса сушки, чтобы обеспечить преимущества, такие как дополнительное загущение суспензии композиции, лучший контроль над увеличением объема композиции при низком вакуумметрическом давлении, стабилизация биоактивного микроорганизма или материала и/или усиление проникновения компонентов композиции через клеточные мембраны. Охлаждение может быть осуществлено любым подходящим способом, известным в данной области техники. Например, охлаждение может быть контактным и представлять собой отведение при помощи холодных поверхностей, отведение скрытого тепла и/или тому подобное. Как правило, композиции хранят во флаконах или наносят на металлические поддоны и приводят в контакт с поверхностью с контролируемой температурой или камерой, в которой они уравновешиваются до контролируемой температуры. Как правило, композиции по изобретению могут быть предварительно охлаждены до температуры выше их температуры замерзания (например, от -5°С до +5°С).

Первичная сушка композиции

Типичные способы для сохранения биоактивных микроорганизмов, таких как живые или ослабленные организмы, включают комбинирование замораживания и условий вакуума, что может приводить в результате к повреждению мембраны и денатурации клеточных компонентов. В предшествующем уровне техники раскрыто применение более высоких уровней вакуум метрического давления (например, менее 100 Торр (13332,2 Па)), добавление специфических криозащитных агентов, стадии концентрирования для получения густых растворов (сиропа) и/или более высокие исходные температуры для предотвращения замерзания. Применение композиции и параметров способа по настоящему изобретению позволяет преодолеть эти ограничения и дают возможность для более высокой загрузочной емкости на поверхность сушки, что значительно улучшает производственный выход.

Композицию по настоящему изобретению сушат путем выпаривания. Удаление растворителя (влаги) из газообразной среды вокруг композиции может направляться конденсацией или обезвоживанием. Выпаривание растворителя из композиции может обеспечивать ускоренную первичную сушку композиции при низком вакуумметрическом давлении. Контролируемое увеличение объема композиции ускоряет первичную сушку композиции благодаря быстрому удалению растворителя из композиции. Контролируемое увеличение объема композиции достигается путем осторожного дегазирования (не кипение) оставшихся растворенных газов при применении сушки в вакууме, поскольку желательно не допускать кипения или чрезмерного вспенивания композиции вследствие кавитаций и усилий сдвига, ассоциированных с образованием пузырьков во время кипения, и/или композиция может выливаться из емкости или оказывать отрицательное воздействие на биоактивный микроорганизм.

По мере протекания первичной сушки структура композиции стабилизируется. Тепло, поступающее в сушильную камеру, компенсирует потерю скрытой теплоты, вызванную испарением растворителя, и температура композиции поддерживается в пределах 10°С выше ее температуры замерзания. В определенный момент во время процесса первичной сушки скорость испарения растворителя уменьшается, и температура композиции начинает повышаться вследствие избыточной подачи тепла в сушильную камеру. Эта точка указывает на завершение стадии первичной сушки в соответствии с данным изобретением. По мере удаления растворителя из композиции защитные агенты в растворе становятся более концентрированными и более густыми до тех пор, пока не прекратится текучесть жидкости. Аморфная и/или стекловидная композиция сохраняет стабильную структуру композиции.

Вторичная сушка

Вторичная сушка структурно стабильных композиций удаляет оставшуюся захваченную или связанную влагу и позволяет получить композицию, которая стабильна при хранении в течение длительного периода времени при температурах окружающей среды. Вторичная сушка включает применение повышенных температур и сильного вакуума в течение от нескольких часов до суток. В предпочтительных воплощениях период времени, необходимый для завершения стадии вторичной сушки, в два раза превышает время, необходимое для стадии первичной сушки. Предпочтительно, активность воды в композиции по окончании стадии вторичной сушки Aw составляет менее 0,3. Температура сушки может находиться в диапазоне от приблизительно комнатной температуры до приблизительно 70°С. Типичный способ вторичной сушки для множества биоактивных микроорганизмов может включать повышение температуры от приблизительно 30°С до приблизительно 40°С и удерживание на этом уровне от приблизительно 30 минут до приблизительно 24 часов (предпочтительно от приблизительно 30 минут до приблизительно 4 часов) для обеспечения стабильной высушенной композиции, обладающей активностью воды Aw менее 0,3. В одном из конкретных воплощений вторичной сушки температура сушки медленно повышается относительно условий первичной сушки со скоростью, которая может дополнительно сохранять активность живых биологических объектов, таких как живые микроорганизмы. Сильный вакуум может быть приложен в способе вторичной сушки для ускорения удаления воды до более низких уровней остаточной влаги. Вакуум во время вторичной сушки может составлять менее 1 Торр (133,32 Па) и, предпочтительно, менее примерно 0,2 Торр (26,66 Па).

Способы сушки по изобретению приводят в результате к биологически активному микроорганизму или биоактивному материалу, который заключен в аморфную стекловидную матрицу, тем самым предотвращая разворачивание белков и значительно замедляя молекулярные взаимодействия или перекрестную реактивность вследствие значительно сниженной подвижности соединения и других молекул в аморфной стекловидной композиции. Пока аморфное твердое вещество находится при температуре ниже его температуры стеклования и остаточная влага остается на относительно низком уровне (т.е. Aw ниже 0,3), лабильный биоактивный микроорганизм может оставаться относительно стабильным. Следует отметить, что достижение стекловидного состояния не является предпосылкой для длительной стабильности, поскольку некоторые биоактивные микроорганизмы или материалы могут сохраняться лучше в более кристаллическом состоянии.

Приготовление сухого порошка

Высушенная композиция может быть использована блоками, нарезана кусочками желаемой формы и размера, или раздроблена и измельчена в свободнотекучий порошок, который обеспечивает легкую последующую обработку, такую как влажная или сухая агломерация, зернение, таблетирование, прессование, гранулирование или любой другой способ производства. Способы дробления, измельчения, перемалывания или пульверизации хорошо известны в данной области техники. Например, может быть использована молотковая мельница, ударная мельница, струйная мельница, дисковая мельница, мельница Wiley или подобное измельчающее устройство.

Предпочтительный размер частиц составляет менее чем приблизительно 1000 мкм и предпочтительно менее 500 мкм.

Описанные здесь композиции и способы сохраняют биологическую активность заключенного биологически активного микроорганизма или биоактивных материалов. Например, композиции тестируют в отношении стабильности, подвергая их воздействию повышенной температуры (например 40°С) и высокой влажности (например 33%RH) и измеряя биологическую активность композиций. В качестве примера для живых пробиотических бактерий результаты этих исследований демонстрируют, что бактерии, приготовленные в этих композициях, стабильны в течение по меньшей мере 60 суток (см. Фиг.1). Стабильность определяют как время для потери активности на величину одного log CFU/г. Такие композиции стабильны даже при использовании высоких концентраций биологически активного материала. Таким образом, эти композиции имеют преимущество в том, что их можно транспортировать и хранить при комнатных или более высоких температурах в течение длительных периодов времени.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены для иллюстрации, но не для ограничения объема заявленного изобретения.

ПРИМЕР 1

Изготовление сухой предварительно смешанной композиции:

Несколько предварительных смесей композиций готовили в соответствии с таблицей 1. Трегалозу получали от Cargill Minneapolis, MN. Выделенный соевый белок получали от Fearn Natural Foods, Mequon, Wl. Концентрат белка молочной сыворотки получали от Agri-Mark Inc., Middlebury, VT. Гидролизат казеина получали от Marcor, Carlstadt, NJ, а альгинат натрия от ISP Corp., Wayne, NJ. Все ингредиенты объединяли вместе и подвергали однородному смешиванию (таблица 1).

Таблица 1.
Состав предварительных смесей (масс.%)
Компонент	Предварительная соевая смесь	Предварительная смесь молочной сыворотки	Предварительная смесь белкового гидролизата
Альгинат натрия	3,0	3,0	3,0
Инулин	5,0	5,0	5,0
Трегалоза	75,3	75,3	75,3
Выделенный соевый белок	14
Концентрат белка молочной сыворотки		14
Гидролизат казеина	2,7	2,7	16,7

ПРИМЕР 2

Стабильный сухой порошок, содержащий пробиотические бактерии:

Lactobacillus acidophilus (100 г замороженного концентрата, собранного из лабораторного ферментера) оттаивали при 37°С. Предварительную смесь белкового гидролизата (100 г, таблица 1) медленно добавляли к оттаявшей суспензии пробиотических бактерий в двойном планетарном смесителе с рубашкой (DPM, Iqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,). Смешивание осуществляли в умеренном вакууме (25 Торр (3333,05 Па)) при 40 об/мин и 37°С в течение 10 минут. Гомогенную суспензию однородно распределяли по поддону при загрузочной емкости 200 г/кв. фут (2150 г/м²) и поддон помещали на полку в лиофильную сушилку (модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Температуру полки устанавливали выше температуры замерзания суспензии при -5°С для охлаждения, но не замораживания суспензии. Вакуум метрическое давление (3 Торр (399,97 Па)) применяли тогда, когда температура композиции достигала приблизительно -1°С. Начинали осторожное дегазирование суспензии при достижении вакуума приблизительно 7 Торр (933,25 Па). Когда вакуум достигал 3 Торр (399,97 Па), температуру полки увеличивали до 50°С. Температуру композиции поддерживали при приблизительно от -1°С до приблизительно +5°С в течение первых 50 минут стадии первичной сушки. Когда температура композиции увеличивалась до +10°С, начинали стадию вторичной сушки. Применяли максимальный вакуум 0,1 Торр (13,33 Па), продолжая поддерживать температуру полки 50°С. Стадию вторичной сушки продолжали в течение еще 100 минут, после чего процесс сушки прекращали и высушенный препарат извлекали из лиофильной сушилки. Активность воды Aw высушенных композиций в этот момент составляла 0,23, как измерено прибором Hygropalm Aw1 (Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY.).

Потеря жизнеспособности во время процессов изготовления и сушки композиции представлена на Фиг.9. Потеря жизнеспособности во время изготовления композиции составляла 0,26 log и во время процесса сушки 0,34 log при общей кумулятивной потере 0,6 log.

На Фиг.10 показана стабильность при хранении сухой композиции в условиях ускоренного хранения 37°С и 33% RH. После четырех недель в этих условиях хранения потеря жизнеспособности пробиотических бактерий, стабилизированных в композиции по изобретению, составила только 0,8 log.

ПРИМЕР 3

Изготовление гидрогелевой композиции:

Концентрированную пробиотическую суспензию готовили в соответствии с Примером 2, но с использованием предварительной смеси белка молочной сыворотки в соответствии с таблицей 1. К этой суспензии добавляли 0,5 г двухосновного фосфата кальция, а затем 0,5 г глюконолактона. Суспензию оставляли затвердевать при комнатной температуре в течение следующих 2 часов с образованием твердого гидрогеля. Застывший гель разрезали на тонкие и длинные полоски с использованием имеющегося в продаже ножа/шредера. Тонкие полоски помещали на поддон при загрузочной емкости 200 г/кв. фут (2150 г/м²) и помещали в лиофильную сушилку для осуществления сушки как описано в Примере 2. Через четыре часа после достижения максимального вакуума 0,1 Торр (13,33 Па) высушенный продукт извлекали из лиофильной сушилки. Активность воды (Aw) в композиции составила 0,05 (измеренная при помощи HygroPalm Awl, Rotonic Huntington, NY). Сухую композицию дополнительно измельчали до тонкодисперсного порошка с использованием стандартной ударной мельницы и просеивали через сита 50-250 микрон. На Фиг.11 представлена схема процесса изготовления стабильной сухой композиции из гидрогелевой композиции в соответствии с изобретением.

ПРИМЕР 4

Изготовление пробиотического корма для домашних питомцев:

Имеющийся в продаже гранулированный корм для собак сушат в конвекционной печи до активности воды 0,1, а затем покрывают стабильной пробиотической сухой композицией, изготовленной как описано в Примере 3. На сухие гранулы распыляют приблизительно 5% жировой влагоудерживающий барьер (смесь 40% куриного жира, 40% масла какао и 20% пчелиного воска), смешанный в галтовочном барабане с сухой порошкообразной композицией (обычно 0,1-0,5% от общей массы корма для домашних питомцев, что обеспечивает дозу 10⁸ CFU/г), и наконец распыляют дополнительное покрытие жировым влагоудерживающим барьером. Общее количество покрывающей оболочки составляет приблизительно 15% (от массы корма для домашних питомцев). Время нанесения оболочки составляет приблизительно 30 мин.

ПРИМЕР 5

Изготовление корма для рыб с использованием нескольких пробиотических микроорганизмов:

Гранулированный корм для рыб в соответствии с настоящим изобретением готовили со смесью нескольких пробиотиков. Стабильную сухую пробиотическую композицию, содержащую смесь L.rhamnosus, L.acidophilus и Bifidobacterium lactis, готовили как описано в Примере 2. Имеющийся в продаже корм для разведения лосося (Zeigler Bros., Gardners, PA) сначала сушили в конвекционной печи до активности воды 0,1 и затем покрывали композицией пробиотика в галтовочном барабане. На гранулы (100 г) сначала наносили путем распыления приблизительно 5 масс.% жирового влагоудерживающего барьера (смесь 40% рыбьего жира, 40% масла какао и 20% пчелиного воска), затем смешивали с 1 г стабильной сухой пробиотической композицией (для достижения дозы 10⁷ cfu/г корма) и, наконец, распыляют дополнительное покрытие жировым влагоудерживающим барьером. Общее количество покрывающей оболочки составляло приблизительно 10% от массы корма для рыб.

ПРИМЕР 6

Детская смесь, содержащая сухую композицию по настоящему изобретению:

Стабильную сухую композицию, содержащую Lactobacillus GG (Valio Corp, Finland), готовят в соответствии с Примером 2 с последующим просеиванием в две группы по размерам частиц (более 50 мкм и менее 150 мкм). Детскую смесь готовят путем смешивания 99 г Nutramigen (Mead Johnson; Evansville, IL) с 0,1 г частиц небольшого размера (менее 50 мкм). Конечный продукт содержит приблизительно 10 cfu Lactobacillus GG на 100 г детской смеси.

ПРИМЕРУ

Стабильный сухой порошок, содержащий фермент:

Гидрогелевую композицию, содержащую 40 масс.% савиназы (Novozymes, Denmark), готовят путем смешивания в умеренном вакууме 60 г предварительной смеси композиции белкового гидролизата (таблица 1) и 40 г савиназы в 100 г водного раствора. Влажную композицию сушат в вакуумной печи при температуре сушки 50°С. Для определения загрузки и стабильности при хранении высушенной композиции: сухой образец точно взвешивают (<100 мг) в микроцентрифужной пробирке. Добавляют 200 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Композицию растворяют в буфере DMSO при встряхивании. К этому образцу добавляют 0,8 мл раствора, содержащего 0,05 н. NaOH, 0,5% SDS (додецилсульфат натрия) и 0,075 М лимонной кислоты (трехнатриевую соль). Пробирки подвергают ультразвуковой обработке в течение 10 мин при 45°С, а затем подвергают кратковременному центрифугированию при 5000 об/мин в течение 10 мин. Аликвоты прозрачного раствора DMSO/NaOH/SDS/цитрат отбирают в лунки микропланшета и анализируют на содержание белка с использованием метода анализа по Брэдфорду. Стабильность при хранении стабильной композиции фермента значительно превосходит стабильность сухого фермента в отсутствие композиции по настоящему изобретению.

ПРИМЕР 8

Стабильный сухой порошок, содержащий витамин А:

Гидрогелевую композицию, содержащую 50 масс.% витамина A (BASF Corp., Florham Park, N.J), готовят путем смешивания в вакууме 25 Торр (3333,05 Па) 50 г предварительной смеси композиции соевого белка (таблица 1) и 50 г порошка витамина А в 100 г водного раствора. Влажную композицию предварительно охлаждают до -5°С, затем распределяют по поддонам при загрузочной емкости 200 г/кв. фут (2150 г/м²) и сушат в вакуумной печи при исходном вакуумметрическом давлении 3 Торр (399,97 Па) и температуре 70°С с последующей стадией с максимальным вакуумом 0,2 Торр (26,66 Па) при 70°С, как только температура композиции достигала 5°С.

ПРИМЕР 9

Изготовление приманки для инвазивных видов:

Готовят гранулированную приманку для специфических инвазивных видов в соответствии с настоящим изобретением, содержащую пестицид. Предварительную смесь белка молочной сыворотки в соответствии с таблицей 1 добавляют к 200 г воды. К этому раствору добавляют 90 г ротенона и 0,5 г двухосновного фосфата кальция, а затем 0,5 г глюконолактона. Суспензию оставляют затвердевать при комнатной температуре в течение 2 часов. Застывший гель режут на тонкие и длинные полоски при помощи ножа/шредера. Тонкие полоски загружают на поддон и помещают в вакуумную печь. Сушку останавливают после достижения активности воды 0,10. Сухую композицию измельчают до достижения подходящего распределения размера частиц для конкретных размеров приманки, соответствующих видам-мишеням.

ПРИМЕР 10

Изготовление защищенного пестицида в водорастворимой композиции:

Защищенную растворимую гранулярную композицию пестицида, который в других условиях мог бы подвергнуться разрушению под действием других ингредиентов в композиции во время хранения, готовят способом по настоящему изобретению. Предварительную смесь соевого белка в соответствии с таблицей 1 добавляют к 200 г воды. К этому раствору добавляют 80 г сухой композиции чувствительного приготовленного пестицида. Суспензию переносят в вакуумную печь и сушат до активности воды 0,1. Сухую композицию измельчают до желаемого размера и упаковывают.

ПРИМЕР 11

Изготовление защищенного пестицида в нерастворимой в воде композиции:

Защищенную нерастворимую гранулярную композицию пестицида, который в других условиях мог бы подвергнуться разрушению под действием других ингредиентов в композиции во время хранения, готовят способом по настоящему изобретению. Предварительную смесь соевого белка в соответствии с таблицей 1 добавляют к 200 г воды. К этому раствору добавляют 90 г сухой композиции чувствительного пестицида и 0,5 г двухосновного фосфата кальция, а затем 0,55 г глюконолактона. Суспензию оставляют затвердевать при комнатной температуре в течение 2 часов и затем режут на тонкие и длинные полоски при помощи ножа/шредера. Тонкие полоски загружают на поддоны и сушат в вакуумной печи до достижения активности воды 0,1. Сухую композицию дополнительно измельчают до желаемого распределения размера частиц и упаковывают,

ПРИМЕР 12

Десять (10) грамм сухого Lactobacillus rhamnosus GG смешивают со 100 г предварительной смеси белкового гидролизата в соответствии с Примером 1 (таблица 1). Эту сухую смесь медленно добавляют к 100 г деионизированной воды при 35°С в планетарном смесителе с рубашкой и смешивают в течение 10 минут при 40 об/мин. Гомогенную суспензию однородно распределяют по поддону с загрузочной емкостью 100 г/кв. фут (1076 г/м²) и поддон помещают на полку в лиофильную сушилку (модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Температуру полки устанавливают на уровне 5°С для охлаждения суспензии. Вакуум применяют до снижения давления до 3 Торр (399,97 Па), после чего температуру полки увеличивают до 30°С. Через 2 часа давление дополнительно снижают до 150 миллиТорр (20 Па) при поддержании температуры полки на уровне 30°С. Сушку продолжают в течение еще 3 часов, после чего температуру продукта повышают до температуры в пределах 2°С относительно температуры полки. Высушенный продукт затем извлекают из лиофильной сушилки и измеряют активность воды высушенной композиции в этот момент времени при помощи прибора Hygropalm Aw1. Потерю жизнеспособности во время процессов изготовления и сушки измеряют и регистрируют. Тестирование стабильности при хранении сухой композиции осуществляют в условиях ускоренного хранения 32°С и 20% RH.

Результаты исследования при 30°С, а также для одного повтора при 40°С представлены ниже.

Активность воды после сушки	0,25	0,26
Потери во время сушки	0,5 log	0,7 log
Потери при хранении	0,4 log	0,7 log

ПРИМЕР 13

Двадцать (20) грамм сухого Lactobacillus rhamnosus GG смешивают со 100 г предварительной смеси белка молочной сыворотки в соответствии с Примером 1. Эту сухую смесь медленно добавляют к 100 г деионизированной воды при 35°С в планетарном смесителе с рубашкой и смешивают в течение 10 минут при 40 об/мин. Гомогенную суспензию однородно распределяют по поддону с загрузочной емкостью 100 г/кв. фут (1076 г/м²) и поддон помещают на полку в лиофильную сушилку (Модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Температуру полки устанавливают на уровне 5°С для охлаждения суспензии. Вакуум применяют до снижения давления до 3 Торр (399,97 Па), после чего температуру полки повышают до 30°С. Через 2 часа давление дополнительно снижают до 150 миллиТорр (20 Па) при поддержании температуры полки на уровне 30°С. Сушку продолжают в течение еще 3 часов, после чего температуру продукта повышают до температуры в пределах 2°С относительно температуры полки. Высушенный продукт затем извлекают из лиофильной сушилки и измеряют активность воды высушенной композиции в этот момент времени при помощи прибора Hygropalm Aw1. Потерю жизнеспособности во время процессов изготовления и сушки измеряют и регистрируют.

Тестирование стабильности при хранении сухой композиции осуществляют в условиях ускоренного хранения 32°С и 20% RH.

Результаты исследования при 30°С и также для одного повтора, но проведенного при 40°С, представлены ниже:

Активность воды после сушки	0,23	0,26
Потери во время сушки	0,6 log	0,7 log
Потери при хранении	0,8 log	0,7 log

ПРИМЕР 14

Десять (10) грамм сухого Lactobacillus acidophilis смешивают с 10 граммами трегалозы и быстро отделяют при смешивании вместе 65,3 г трегалозы, 3 г альгината натрия, 5 г инулина и 16,7 г гидролизата молочной сыворотки в виде сухого порошка, медленно добавляют к 100 г деионизированной воды при 35°С в планетарном смесителе с рубашкой и смешивают в течение 5 минут при 40 об/мин. К этой суспензии добавляют Lactobacillus acidophilis и сухую предварительную смесь трегалозы и смешивание продолжают в течение еще 5 минут при 35°С. Гомогенную суспензию однородно распределяют по поддону с загрузочной емкостью 100 г/кв. фут (1076 г/м²) и поддон помещают на полку в лиофильную сушилку (модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Температуру полки устанавливают на уровне 5°С для охлаждения суспензии. Вакуум применяют до снижения давления до 3 Торр (399,97 Па), после чего температуру полки повышают до 30°С. Через 2 часа давление дополнительно снижают до 150 миллиТорр (20 Па) при поддержании температуры полки на уровне 30°С. Сушку продолжают в течение еще 3 часов, после чего температуру продукта повышают до температуры в пределах 2°С относительно температуры полки. Высушенный продукт извлекают из лиофильной сушилки и измеряют активность воды высушенной композиции в этот момент времени с использованием прибора Hygropalm Aw1. Потерю жизнеспособности во время процессов изготовления и сушки измеряют и регистрируют. Тестирование стабильности при хранении сухой композиции осуществляют в условиях ускоренного хранения 32°С и 20% RH. Результаты исследования, когда сушку поддерживают при 30°С, в сравнении с результатами, когда сушку поддерживают при 50°С, представлены в нижеприведенной таблице.

Активность воды после сушки	0,23	0,26
Потери во время сушки	0,6 log	0,7 log
Потери при хранении	0,8 log	0,9 log

ПРИМЕР 15

Десять (10) грамм сухого Lactobacillus acidophilis смешивают с 10 граммами трегалозы и быстро отделяют при смешивании вместе 65,3 г трегалозы, 3 г альгината натрия, 5 г инулина и 16,7 г гидролизата молочной сыворотки в виде сухого порошка, медленно добавляют к 100 г деионизированной воды при 50°С в планетарном смесителе с рубашкой и смешивают в течение 5 минут при 40 об/мин. Суспензию охлаждают до 4°С. К охлажденной суспензии добавляют Lactobacillus acidophilis и предварительную смесь трегалозы и смешивание продолжают в течение еще 5 минут при 4°С. Гомогенную суспензию однородно распределяют по поддону с загрузочной емкостью 100 г/кв. фут (1076 г/м²) и поддон помещают на полку в лиофильную сушилку (модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Температуру полки устанавливают на уровне 5°С для поддержания температуры охлажденной суспензии. Вакуум применяют до снижения давления до 3 Торр (399,97 Па), после чего температуру полки повышают до 30°С. Через 2 часа давление дополнительно снижают до 150 миллиТорр (20 Па) при поддержании температуры полки на уровне 30°С. Сушку продолжают в течение еще 3 часов, после чего температуру продукта повышают до температуры в пределах 2°С относительно температуры полки. Высушенный продукт извлекают из лиофильной сушилки. Активность воды высушенной композиции в этот момент составляет Aw=0,23, как измерено при помощи прибора Hygropalm Aw1. Потеря жизнеспособности во время процессов изготовления и сушки в общем составляет 0,6 log.

ПРИМЕР 16

Одну сотню (100) грамм соевой предварительной смеси медленно добавляют к 100 г деионизированной воды при 35°С в планетарном смесителе с рубашкой и перемешивают в течение 10 минут при 40 об/мин. Десять (10) грамм сухого Bifidobacterium lactis Bb-12 медленно добавляют при перемешивании при 20 об/мин и суспензию перемешивают в течение еще 5 минут. Гомогенную суспензию однородно распределяют по поддону с загрузочной емкостью 100 г/кв. фут (1076 г/м²) и поддон помещают на полку в лиофильную сушилку (модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Температуру полки устанавливают на уровне 5°С для охлаждения суспензии. Вакуум применяют до снижения давления до 3 Торр (399,97 Па), после чего температуру полки повышают до 30°С. Через 2 часа давление дополнительно снижают до 150 миллиТорр (20 Па) при поддержании температуры полки на уровне 30°С. Сушку продолжают в течение еще 3 часов, после чего температуру продукта повышают до температуры в пределах 2°С относительно температуры полки. Высушенный продукт извлекают из лиофильной сушилки, и активность воды высушенной композиции в этот момент составляет Aw=0,26, как измерено при помощи прибора Hygropalm Aw1. Потеря жизнеспособности во время процессов изготовления и сушки в общем составляет 0,7 log.

Тестирование стабильности при хранении сухой композиции в условиях ускоренного хранения 32°С и 20% RH демонстрирует потерю жизнеспособности стабилизированных пробиотических бактерий в композиции по изобретению всего лишь 0,7 log после четырех недель.

ПРИМЕР 17

Те же самые параметры, как в Примере 1, за исключением того, что смешивание осуществляют в смесителе Росса при 25 дюймах вакуума с получением плотности суспензии 1,2 г/сс. Активность воды высушенной композиции Aw в этот момент равна 0,26, как измерено при помощи прибора Hygropalm Aw1. Потери жизнеспособности во время процессов изготовления и сушки в общем составляют 0,5 log.

Тестирование стабильности при хранении сухой композиции в условиях ускоренного хранения 32°С и 20% RH демонстрирует потерю жизнеспособности стабилизированных пробиотических бактерий в композиции по изобретению всего лишь 0,7 log после четырех недель.

ПРИМЕР 18

Одну сотню (100) грамм свежего жидкого концентрата бактерий LGG (содержащих 10% твердых веществ и оставшуюся часть воды) добавляют к двойному планетарному смесителю с рубашкой и нагревают до 35°С. В него медленно добавляют 100 г предварительной смеси молочной сыворотки (таблица 1). Образующуюся в результате суспензию перемешивают в течение 10 минут при 40 об/мин. Гомогенную суспензию однородно распределяют по поддону с загрузочной емкостью 100 г/кв. фут (1076 г/м²) и поддон помещают на полку в лиофильную сушилку (модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Температуру полки устанавливают на уровне 5°С для охлаждения суспензии. Вакуум применяют до снижения давления до 3 Торр (399,97 Па), после чего температуру полки повышают до 30°С. Через 2 часа давление дополнительно снижают до 150 миллиТорр (20 Па) при поддержании температуры полки на уровне 30°С. Сушку продолжают в течение еще 3 часов, после чего температуру продукта повышают до температуры в пределах 2°С относительно температуры полки. Высушенный продукт извлекают из лиофильной сушилки. Активность воды высушенной композиции Aw в этот момент составляет 0,25, как измерено при помощи прибора Hygropalm Aw1. Потеря жизнеспособности во время процессов изготовления и сушки в общем составляет 0,5 log. Тестирование стабильности при хранении сухой композиции в условиях ускоренного хранения 32°С и 20% RH демонстрирует потерю жизнеспособности стабилизированных пробиотических бактерий в композиции по изобретению всего лишь 0,4 log после четырех недель.

ПРИМЕР 19

Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)

Одну сотню (100) грамм оттаявшего замороженного концентрата и 100 г предварительной смеси белкового гидролизата добавляют в двойной планетарный смеситель с рубашкой (DPM, Ipt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA). Этот способ также может быть осуществлен сначала путем оттаивания замороженного концентрата. Смешивание осуществляют при 40 об/мин и 37°С в течение 10 минут. Гомогенную суспензию измеряют в отношении вязкости (Brookfield viscometer, модель # LVDVE115, Brookfield Engineering Laboratories, Inc.) и затем однородно распределяют по поддону с загрузочной емкостью 100 г/кв. фут (1076 г/м²). Параметры вязкости для диапазонов высокой вязкости составляют: 300 г образца в мерном стакане Pyrex объемом 400 мл, 33-37°С, скорость Spindle #64, 1,0 об/мин, работа без предохранителя. Поддон затем загружали в холодильник при -4°С для охлаждения на 30 мин. После охлаждения начинали сушку с использованием лиофильной сушилки (модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY) с температурой полки, установленной на 30°С, и давлении 2800 мТорр (373,3 Па) в течение по меньшей мере 2,5 часов. Через по меньшей мере 2,5 часа давление снижали до 100 мТорр (13,33 Па) в течение по меньшей мере еще 2,5 часов. Этот эксперимент повторяли с двумя различными партиями ферментата LGG, и он включал промывание одной партии 3% DMV и ресуспендирование деионизированной водой перед добавлением предварительной смеси гидролизата.

Образец	CFU/г конечного продукта	Потери во время сушки	Вязкость суспензии (сП)
LGG Партия #1	2,20×10+10	0,61	410000
LGG Партия #2	7,00×10+10	0,48	Н/Д
Промытая
LGG партия #2	1,38×10+11	0,21	319000

Параметры вязкости для диапазонов средней вязкости: 300 г образца в мерном стакане Pyrex объемом 400 мл, 33-37°С, скорость Spindle #64, 5,0 об/мин, работа без предохранителя.

Образец	CFU/г конечного Продукта	Потери во время сушки	Вязкость суспензии (сП)
LGG Партия #4	1,39×10+11	0,18	58100
Промытая
LGG партия #4	1,31×10+11	0,23	36200

ПРИМЕР 20

Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)

Одну сотню (100) грамм замороженного концентрата оттаивают при 37°С и добавляют в двойной планетарный смеситель с рубашкой (DPM, Ipt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA). В него добавляют 100 г предварительной смеси белкового гидролизата. Также может быть использован оттаявший замороженный концентрат. Смешивание осуществляют при 40 об/мин и 37°С в течение 10 минут и затем суспензию однородно распределяют по поддонам с загрузочной емкостью 100 г/кв фут (1076 г/м²). Поддоны затем загружают в холодильник при -4°С для охлаждения в течение 30 мин. После охлаждения начинают сушку с использованием лиофильной сушилки (модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY) с температурой полки, установленной на 30°С, и давлении 2800 мТорр (373,3 Па) в течение по меньшей мере 2,5 часов. Через по меньшей мере 2,5 часа давление снижают до 100 мТорр (13,33 Па) в течение по меньшей мере еще 2,5 часов. Тот же самый способ применяли для 10 г высушенного (порошкообразного) материала LGG, который смешивали в 100 г белкового гидролизата. Эту сухую смесь затем медленно добавляли к 90 г деионизированной воды в двойном планетарном смесителе с рубашкой.

Образец	Потери во время сушки (log)
Сухой LGG/MM конечный продукт	1,26
Замороженный LGG концентрат/ММ конечный продукт	1,46

ПРИМЕР 21

Стабильный сухой порошок, содержащий фермент:

Сорок (40) грамм протеолитического фермента (Novozymes, Denmark) в форме сухого порошка смешивают с 60 г соевой предварительной смеси (Таблица 1). Эту сухую смесь медленно добавляют к 100 г деионизированной воды при 35°С в планетарном смесителе с рубашкой и смешивают в течение 10 минут при 40 об/мин. Гомогенную суспензию однородно распределяют по поддону с загрузочной емкостью 100 г/кв фут (1076 г/м²) и поддон помещают на полку в лиофильную сушилку (модель 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Температуру полки устанавливают на уровне 5°С для охлаждения суспензии. Вакуум применяют для снижения давления до 3 Торр (399,97 Па), после чего температуру полки повышают до 60°С. Через 1 час давление дополнительно снижают до 150 миллиТорр (20 Па) при поддержании температуры полки на уровне 60°С. Сушку продолжают в течение еще 1 часа, после чего температуру продукта увеличивают до температуры в пределах 2°С относительно температуры полки. Высушенный продукт извлекают из лиофильной сушилки. Для определения загрузки и стабильности при хранении высушенной композиции: сухой образец точно взвешивают (<100 мг) в микроцентрифужной пробирке и добавляют 200 мкг диметилфульфоксида (DMSO). Композицию растворяют в буфере DMSO при встряхивании. К этому образцу добавляют 0,8 мл раствора, содержащего 0,05 н. NaOH, 0,5% SDS и 0.075М лимонной кислоты (тринатриевая соль). Пробирки подвергают ультразвуковой обработке в течение 10 мин при 45°С, а затем кратковременному центрифугированию при 5000 об/мин в течение 10 мин. Аликвоты прозрачного DMSO/NaOH/SDS/цитратного раствора отбирают в лунки микропланшета и анализируют на содержание белка с использованием метода анализа Брэдфорда. Стабильность при хранении стабильной ферментной композиции значительно превосходит стабильность сухого фермента в отсутствие композиции по настоящему изобретению.

Ссылки

Содержание цитированных здесь ссылок включено в данное описание полностью.

6964771. Method for stably incorporating substances within dry, foamed glass matrices. September, 1997. Roser et al.

5766520. Preservation by formulation formation. June, 1998. Bronshtein.

6534087. Process for preparing a pharmaceutical composition. June, 2001. Busson and Schroeder.

6884866. Bulk drying and the effects of inducing bubble nucleation. April, 2005. Bronshtein.

7153472. Preservation and formulation of living cells for storage and delivery in hydrophobic carriers. December, 2006. Bronshtein.

20080229609. Preservation by Vaporization. June, 2005. Bronshtein.

6306345. Industrial scale barrier technology for preservation of sensitive biological materials at ambient temperatures. October, 2001. Bronshtein et al.

Morgan, C.A., Herman, N., White, P.A., Vesey, G. 2006. Preservation of micro-organisms by drying; a review. J.Microbiol. Methods. 66(2): 183-93.

Capela, P., Hay, T.K.C, & Shah, N.P. 2006. Effect of cryoprotectants, prebiotics and microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze-dried yoghurt. Food Research International, 39(3) 203-211.

Annear, 1962. The Preservation of Leptospires by Drying From the Liquid State, J.Gen. Microbiol, 27:341-343.

1. Стабильная сухая композиция, содержащая (1) биоактивный микроорганизм или материал, (2) по меньшей мере два стабилизирующих агента и (3) по меньшей мере два защитных агента;
где биоактивный микроорганизм или материал выбран из клетки, микроба, вируса, культуры, пробиотика, дрожжей, водорослей, белка, рекомбинантного белка, фермента, пептида, гормона, вакцины, лекарственного средства, витамина, минерального вещества, микробиоцида, фунгицида, гербицида, инсектицида или спермицида;
где по меньшей мере два стабилизирующих агента включают альгинат натрия и инулин;
где по меньшей мере два защитных агента включают дисахарид и белковый гидролизат; и
где биоактивный организм или материал заключен в аморфную стекловидную матрицу.

2. Композиция по п.1, где стабилизаторы присутствуют в количестве, находящемся в диапазоне от приблизительно 1 мас.% до приблизительно 20 мас.%.

3. Композиция по п.1, где защитные агенты легко растворимы в растворе и не загустевают или не полимеризуются при контакте с водой.

4. Композиция по п.1, где белковый гидролизат представляет собой гидролизат белка, выбранного из группы, состоящей из человеческого и бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, желатина, иммуноглобулинов, выделенного соевого белка, пшеничного белка, сухого обезжиренного молока, казеината, белка молочной сыворотки и горохового белка.

5. Композиция по п.1, где белковый гидролизат представляет собой гидролизат белка, выбранного из группы, состоящей из человеческого и бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, желатина, иммуноглобулинов, пшеничного белка, сухого обезжиренного молока, казеината, белка молочной сыворотки и горохового белка.

6. Композиция по п.1, где белковый гидролизат представляет собой гидролизат белка, выбранного из группы, состоящей из казеината и горохового белка.

7. Композиция по п.4, где защитные агенты присутствуют в количестве, находящемся в диапазоне от приблизительно 1 мас.% до приблизительно 80 мас.%.

8. Композиция по п.1, где общее количество защитных агентов составляет от 20 до 70 мас.%.

9. Стабильная сухая композиция по п.1, где биоактивный организм или материал включает пробиотические бактерии и где композиция претерпевает потерю активности не более 1 log CFU/г после 60 суток при 40°C и относительной влажности 33%.

10. Способ изготовления стабильной сухой композиции по п.1, при котором: (1) биоактивный микроорганизм или материал, по меньшей мере два стабилизирующих агента и по меньшей мере два защитных агента объединяют в водном растворителе; (2) охлаждают смесь со стадии (1) до температуры выше ее температуры замерзания; (3) осуществляют первичную сушку охлажденной смеси путем выпаривания в вакууме при температуре выше ее температуры замерзания; (4) осуществляют вторичную сушку смеси при температуре 20°C или выше в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды Aw в смеси до 0,3 или менее;
причем во время способа используемые температуры являются такими, чтобы в сухой стабильной композиции биоактивный микроорганизм или материал был заключен в аморфную стекловидную матрицу.

11. Способ по п.10, где смесь охлаждают перед проведением сушки до температуры выше ее температуры замерзания.

12. Способ по п.10, где сушку смеси осуществляют путем выпаривания.

13. Способ по п.10, где температура смеси во время стадии первичной сушки выше ее температуры замерзания.

14. Способ по п.10, где стадию вторичной сушки начинают, когда температура смеси повышается по меньшей мере на 10°C выше ее исходной температуры сушки.

15. Способ по п.10, где интенсивность испарения остаточного растворителя во время стадии вторичной сушки увеличивают путем повышения температуры и/или вакуумметрического давления.

16. Способ по п.10, где смесь сушат в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды Aw в композиции до 0,3 или менее.

17. Способ по п.10, где высушенную смесь нарезают, дробят, измельчают или растирают в свободнотекучий порошок.

18. Способ по п.17, где размер частиц высушенной смеси составляет менее чем приблизительно 1000 мкм.

19. Способ по п.10, дополнительно включающий введение композиции млекопитающему в виде восстановленного раствора или в виде измельченного порошка и в качестве пищевого или кормового продукта.

20. Способ по п.10, где защитные агенты растворены в водном растворе, и вязкость раствора составляет от приблизительно 10000 сантипуаз (10 Па·с) до приблизительно 450000 сантипуаз (450 Па·с); первичную сушку осуществляют в вакууме в диапазоне от приблизительно 1 Торр (133,32 Па) до 5 Торр (666,61 Па); и вторичную сушку осуществляют при вакуумметрическом давлении менее 1 Торр.

21. Способ по п.20, где защитные агенты не загустевают или не полимеризуются при контакте с водой.

22. Способ по п.20, где белковый гидролизат представляет собой гидролизат белка, выбранного из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, желатина, иммуноглобулинов, выделенного соевого белка, пшеничного белка, сухого обезжиренного молока, казеината, белка молочной сыворотки и горохового белка.

23. Способ по п.20, где белковый гидролизат представляет собой гидролизат белка, выбранного из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, желатина, иммуноглобулинов, пшеничного белка, сухого обезжиренного молока, казеината, белка молочной сыворотки и горохового белка.

24. Способ по п.20, где белковый гидролизат представляет собой гидролизат белка, выбранного из группы, состоящей из казеината и горохового белка.

25. Способ по п.20, где биоактивный микроорганизм или материал добавляют к водному раствору после растворения защитных агентов.

26. Композиция для изготовления стабильной сухой композиции по п.1, содержащая (1) биоактивный микроорганизм или материал, (2) по меньшей мере два стабилизирующих агента и (3) по меньшей мере два защитных агента в водном растворе, где защитные агенты растворены в растворе, и где композиция имеет вязкость от приблизительно 10000 сантипуаз (10 Па·с) до приблизительно 450000 сантипуаз (450 Па·с);
где биоактивный микроорганизм или материал выбран из клетки, микроба, вируса, культуры, пробиотика, дрожжей, водорослей, белка, рекомбинантного белка, фермента, пептида, гормона, вакцины, лекарственного средства, витамина, минерального вещества, микробиоцида, фунгицида, гербицида, инсектицида или спермицида;
где по меньшей мере два стабилизирующих агента включают альгинат натрия и инулин;
где по меньшей мере два защитных агента включают дисахарид и белковый гидролизат.

27. Композиция по п.26, где содержание твердых веществ в водном растворе варьирует в диапазоне от приблизительно 30 мас.% до приблизительно 70 мас.%.

28. Композиция по п.26, где защитные агенты не загустевают или не полимеризуются при контакте с водой.

29. Композиция по п.26, где белковый гидролизат представляет собой гидролизат белка, выбранного из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, желатина, иммуноглобулинов, выделенного соевого белка, пшеничного белка, сухого обезжиренного молока, казеината, белка молочной сыворотки и горохового белка.

30. Композиция по п.26, где белковый гидролизат представляет собой гидролизат белка, выбранного из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, желатина, иммуноглобулинов, пшеничного белка, сухого обезжиренного молока, казеината, белка молочной сыворотки и горохового белка.

31. Композиция по п.26, где белковый гидролизат представляет собой гидролизат белка, выбранного из группы, состоящей из казеината и горохового белка.

32. Способ кормления животного биоактивным микроорганизмом или материалом, включающий введение композиции по любому из пп. 1-9, где биоактивный организм или материал не представляет собой гербицид.

33. Стабильная сухая композиция, изготовленная способом по п.10.