Вакцина для защиты птицы от qх-подобного вируса инфекционного бронхита и способ ее использования

Изобретения касаются вакцины и способа ее использования. Охарактеризованная вакцина включает: (i) живой аттенуированный QX-подобный вирус инфекционного бронхита (IB), полученный посредством пассирования на яйцах домашней птицы с развивающимися эмбрионами от 25 до 80 раз) и имеющий белок S1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO. 1; и (ii) фармацевтически приемлемый носитель. Способ защиты птицы от QX-подобного вируса инфекционного бронхита (IB) включает введение описанной вакцины птице в диапазоне от 10³ TCID₅₀ до 10^5,07 TCID₅₀ на указанную птицу. Представленные изобретения пригодны для защиты от инфекционного бронхита, вызванного IB-QX-подобными вирусами. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 18 табл., 9 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ С РОДСТВЕННЫМИ ЗАЯВКАМИ

По данной заявке, согласно 35 S.U.S.C. 119(e), испрашивается приоритет предварительной заявки 61/087228, поданной 8 августа 2008 года, полное описание которой включено в настоящий документ в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области вакцин против инфекционных заболеваний птиц. В частности, изобретение относится к новейшим вакцинам против вируса инфекционного бронхита (IB).

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вирус инфекционного бронхита (IB) является коронавирусом, который вызывает респираторное заболевание у домашних птиц (например, куриц). Симптомы заболевания IB включают, например, дыхательную недостаточность, сниженный вес, сниженную яйценоскость, повышенную частоту образования аномальных яиц и повышенную смертность.

Было идентифицировано некоторое количество различных генотипов и серотипов вирусов IB. Генотипирование вирусов IB обычно проводят путем секвенирования всего или части гена, кодирующего белок S1 (образующего выступы) вируса. Белок S1 представляет собой N-концевой продукт расщепления большего по размеру гликопротеина S, кодируемого геномом вирусов IB. С-концевой продукт расщепления гликопротеина S называют белком S2. Белок S1 отвечает за клеточное прикрепление и является основной антигенной детерминантой вирусов IB. Иллюстративные генотипы (или «штаммы») вируса IB включают 793В, Massachusetts, Italy02, D274, Arkansas, B1648 и D1466. (Смотри, например, Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257).

Новый генотип вируса IB, обозначаемый «QX» (также называемый «QXIBV»), был впервые идентифицирован в Китае в конце 1990-х. (Смотри Liu et al. (2006), Archives of Virology 151:1133-1148). После идентификации исходного генотипа QX многочисленные генотипы вируса IB с высокой степенью схожести/идентичности QX на уровне нуклеотидной последовательности S1 были идентифицированы во всем мире. Эти «IB-QX-подобные» вирусы (как далее определено в настоящем документе) были идентифицированы, например, во Франции, Германии, Нидерландах, Бельгии, Англии, Италии и Польше.

Представляется совершенно очевидным, что IB-QX-подобные вирусы представляют серьезную угрозу для птицеводства. Несмотря на стремительно обнаруживаемую значимость данного типа вируса IB, до настоящего момента никакие вакцины, специфичные к IB-QX-подобным вирусам, не были доступны или описаны в данной области техники. Коммерчески доступные вакцины против IB (живые, аттенуированные штаммы) оказались неэффективными в защите кур от IB-QX-подобных вирусов. Таким образом, в данной области техники существует необходимость в новых вакцинных композициях и способах вакцинации, которые обеспечивают специфическую защиту от IB-QX и IB-QX-подобных вирусов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение выполняет вышеупомянутое требование в данной области техники путем предоставления вирусов IB, которые пригодны, в числе прочего, в качестве антигенных компонентов в вакцинных композициях, которые защищают от инфекции, вызванной IB-QX и IB-QX-подобными вирусами. Изобретение включает живые, аттенуированные варианты IB-QX-подобных вирусов. Такие живые, аттенуированные штаммы могут быть получены, например, путем многократного пассирования IB-QX-подобных вирусов до тех пор, пока не будет получено соответствующее требованиям ослабление вирулентности вирусов. Настоящее изобретение также включает инактивированные варианты IB-QX-подобных вирусов. IB-QX-подобные вирусы для использования в рамках настоящего изобретения могут быть получены, например, из зарегистрированных IB-QX-подобных вирусов, внелабораторных случаев IB-QX-подобной вирусной инфекции или путем создания рекомбинантных вирусов IB, экспрессирующих определенные, заранее заданные сегменты гена, как, например, отдельно взятую последовательность гена S1.

Настоящее изобретение также представляет вакцинные композиции, включающие живые, аттенуированные или убитые штаммы IB-QX-подобных вирусов, а также способы создания живых, аттенуированных и/или убитых штаммов IB-QX-подобных вирусов. Настоящее изобретение также представляет способы вакцинации птицы от инфекционного бронхита путем введения птице вакцинной композиции, включающей живые, аттенуированные или убитые штаммы IB-QX-подобных вирусов. Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из подробного описания изобретения и примеров, излагаемых в данном документе ниже.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет изолированные вирусы IB, полученные из IB-QX-подобных вирусов.

Термин «IB-QX-подобные вирусы» в том смысле, в котором он здесь используется, означает любой вирус с белком S1, кодируемым нуклеотидной последовательностью, которая, как минимум, на 95% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей белок S1 исходного штамма IB-QX. Нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок S1 исходного штамма IB-QX, представлена в виде SEQ ID NO:1 (смотри таблицу 1) и доступна под идентификационным номером AF193423 в NCBI Genbank.

Таблица 1 Нуклеотидная последовательность гена S1 штамма IB-QX

Таким образом, любой вирус с белком S1, кодируемым нуклеотидной последовательностью, которая, как минимум, на 95% идентична SEQ ID NO:1, является «IB-QX-подобным» вирусом, представляющим собой предмет настоящего изобретения. Примеры IB-QX-подобных вирусов изложены в Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257, включая генотипы вируса IB, обозначенные L-1148 (также называемый в Worthington et al. «NL/L-1148/04»), 1449-2 (также называемый в Worthington et al. «NL/L-1449T/04») и Roberton (также называемый в Worthington et al. FR/L-1450T/05). Иллюстративные IB-QX-подобные штаммы, из которых могут быть получены вирусы IB по настоящему изобретению, приведены в таблице 2, ниже.

В целях настоящего изобретения термин IB-QX-подобный вирус включает, в числе прочего, исходный вирус QX IB.

Таблица 2 Иллюстративные IB-QX-подобные вирусы

Помимо сравнительного анализа кодирующих S1 последовательностей другие методы могут быть использованы для идентификации IB-QX-подобных вирусов. Могут быть использованы такие методы, как, например, предварительные методы отбора с целью идентификации кандидатов на роль IB-QX-подобных вирусов из огромного пула вирусных образцов. Если вирус оказывается положительным по признаку IB-QX-подобный с помощью этих предварительных методов отбора, генотип такого вируса может быть затем подтвержден с помощью нуклеотидного секвенирования гена S1 и сравнительного анализа, как описано в настоящем документе. Типичным «предварительным» методом идентификации IB-QX-подобных вирусов (или предполагаемых IB-QX-подобных вирусов) является нейтрализация сыворотки, где антисыворотка от животного, инфицированного IB-QX или IB-QX-подобным вирусом, тестируется на ее способность нейтрализовывать вирус-кандидата. По положительным результатам нейтрализации можно предположить, что вирус-кандидат является IB-QX-подобным вирусом.

Другим иллюстративным, предварительным методом отбора для IB-QX-подобных вирусов является полиморфизм длины фрагментов рестрикции (RFLP). В настоящем документе копию ДНК гена S1 из вируса-кандидата получают методом ОТ-ПЦР. Копию ДНК затем подвергают действию рестриктазы, о которой известно, что она расщепляет ген S1 IB-QX-подобных штаммов в позициях, не расщепляемых в гене S1 штаммов, не являющихся IB-QX-подобными (или наоборот). Различия в расщеплении фрагментов рестрикции могут быть визуализированы путем фракционирования по размеру образованной расщепленной ДНК, например, путем электрофореза в геле.

Изолированные вирусы IB по настоящему изобретению могут быть получены из любых IB-QX-подобных вирусов, упомянутых в настоящем документе, а также из любых других IB-QX-подобных вирусов, которые могут быть выделены в полевых условиях. Дополнительные IB-QX-подобные вирусы могут быть получены методами, известными специалистам в данной области техники. Например, IB-QX-подобные вирусы могут быть получены путем скрининга образцов (например, ротоглоточных мазков), взятых у кур с подозрением на зараженность вирусом IB, или в других случаях с проявлением одного или нескольких симптомов инфекционного бронхита. Выделяют РНК из таких образцов и получают копию ДНК гена S1 или его части методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Затем секвенируют копию ДНК S1, и полученную таким образом нуклеотидную последовательность сравнивают с нуклеотидной последовательностью S1-гена IB QX (SEQ ID NO:1), и определяют процент идентичности между двумя последовательностями.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления настоящее изобретение включает изолированные вирусы IB, полученные из IB-QX-подобного вируса, имеющие белок S1 с такой же аминокислотной последовательностью, как белок S1 IB-QX-подобных вирусов L-1148 (SEQ ID NO:2), 1449-2 (SEQ ID NO:3) или 1449-10 (SEQ ID NO:4). Аминокислотные последовательности белков S1 из этих штаммов показаны в таблице 3:

Изолированные вирусы IB по настоящему изобретению могут также быть получены специалистами в данной области техники, используя рекомбинантные методы или методы «обратной генетики». Например, Casais et al. (2003) J. Virol. 77:9084-9089 описывают конструкцию рекомбинантного вируса IB, экспрессирующего гетерологичный ген белка, образующего выступ на поверхности вируса. (Смотри также Hodgson et al. (2004) J. Virol. 78:13804-13811). Эта система включает использование инфекционного клона вируса IB, т.е. полноразмерную кДНК вируса IB, клонированную в вектор, такой как, например, вектор вируса осповакцины. (Смотри, например, Casais et al. (2001) J. Virol. 75:12359-12369). Начиная с инфекционного клона вируса IB, могут быть сконструированы рекомбинантные вирусы IB, экспрессирующие белок S1 любого другого вируса IB. Таким образом, используя систему Casais et al. или ее разновидности, могут быть легко созданы рекомбинантные вирусы IB, которые экспрессируют белок S1 из любого IB-QX-подобного вируса (т.е. белок S1, кодируемый полинуклеотидной последовательностью, которая, как минимум, на 95% идентична SEQ ID NO:1), тем самым образуя рекомбинантные IB-QX-подобные вирусы. Образованные таким образом рекомбинантные IB-QX-подобные вирусы могут быть использованы в рамках настоящего изобретения так же, как используются естественным образом полученные IB-QX-подобные вирусы (например, полевые изоляты), как подробно описано в настоящем документе.

«Процент идентичности» в том смысле, в котором он здесь используется, означает, что процент нуклеотидов в контрольной нуклеотидной последовательности идентичен нуклеотидам в исследуемой последовательности (или определенной ее части) после совмещения последовательностей и внесения пропусков, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, как, например, получаемого путем использования программы WU-BLAST-2.0a19 (Altschul et al. (1997) J. Mol. Biol. 215:403-410; в дальнейшем в настоящем документе обозначаемой «BLAST») со значениями всех исследуемых параметров, установленных по умолчанию. Значение процента идентичности нуклеотидных последовательностей определяется числом соответствий идентичных нуклеотидов, деленным на длину последовательности, для которой регистрируется процент идентичности.

Несмотря на то, что IB-QX-подобные вирусы известны в данной области техники, вирусы IB, получаемые из IB-QX-подобных вирусов, не были описаны или предложены в данной области техники и, таким образом, являются предметом настоящего изобретения. Термин «полученный из» в том смысле, в котором он здесь используется, в отношении вируса IB, означает, что вирус IB является либо: (1) последовательно пассированным потомком IB-QX-подобного вируса; либо (2) IB-QX-подобным вирусом, который был подвержен условиям, инактивирующим вирус или придающим ему меньшую вирулентность. В связи с этим, вирус, «полученный из» IB-QX-подобного вируса, может быть либо живым/аттенуированным, либо инактивированным/убитым.

Как отмечено выше, вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса, в определенных вариантах осуществления изобретения, является последовательно пассированным потомком IB-QX-подобного вируса. «Последовательно пассированный потомок IB-QX-подобного вируса» определяют в настоящем документе как вирус, получаемый после того, как IB-QX-подобный вирус будет размножен в среде, благоприятной для репликации вируса, удален из указанной среды и затем размножен, как минимум, один дополнительный раз в той же или подобной среде. Каждый цикл размножения и удаления рассматривается как одно «пассирование». Последовательно пассированный потомок IB-QX-подобного вируса предпочтительно является аттенуированным; например, аттенуация является результатом последовательного пассирования.

Иллюстративный метод последовательного пассирования вирусов IB (включая IB-QX-подобные вирусы) заключается в использовании яиц с развивающимися эмбрионами домашней птицы (например, курицы) в качестве среды, благоприятной для репликации вируса. Например, яйца с развивающимися эмбрионами курицы заражают количеством IB-QX-подобного вируса через аллантоисную полость. Зараженные яйца инкубируют, например, при 37°С в течение 24 часов (или при других подходящих условиях инкубации, времени и температурах). Аллантоисная жидкость отбирается из яиц. На этой стадии вирус был пассирован «1Х». Собранной аллантоисной жидкостью из первого пассирования, при подходящем разведении, заражают новые яйца с развивающимися эмбрионами, которые инкубируют, например, при 37°С в течение 24 часов, и аллантоисная жидкость отбирается из этого второго набора яиц. На этой стадии вирус был пассирован «2Х». Непрерывное пассирование таким способом может продолжаться в течение неопределенного времени. Альтернативные среды, благоприятные для репликации вируса, которые можно использовать для пассирования вирусов IB, включают, например, клеточные культуры, такие как клеточные культуры почки курицы или эмбриональные фибробластные культуры курицы.

Несмотря на то, что инкубация при 37°С в течение 24 часов приведена в настоящем документе в качестве иллюстративного этапа инкубации для пассирования вирусов IB, специалист в данной области техники понимает, что другие температуры и/или времена инкубации могут быть использованы. Например, яйца с развивающимися эмбрионами могут быть инкубированы при температурах, находящихся в диапазоне от 20°С до 42°С. Время инкубации для пассирования вируса может находиться в диапазоне от 4 часов до 4 дней и более предпочтительно от 16 до 36 часов.

Образцы вируса могут быть протестированы после каждого пассирования (или после каждого 2-го, 4-го, 5-го, 10-го и т.д. пассирования) на степень вирулентности. Степень вирулентности может быть определена, например, введением пассированного вируса в цыплят и оценкой различных параметров, указывающих на инфекционный бронхит. Типичные параметры включают: (i) цилиарную активность эксплантатов трахеи; (ii) клинические признаки, такие как, например, водянистые экссудаты из глаза или носа, затрудненное дыхание или диарея; (iii) общее анатомо-патологическое исследование, например, верхних дыхательных путей, почек, селезенки и/или кишечника; и (iv) гистологию трахеи, легкого и почки. Типичные измерения каждого из этих параметров представлены в примере 2, ниже. Вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса путем последовательного пассирования, считается «аттенуированным», если один или несколько параметров, указывающих на инфекционный бронхит, снижен, устранен или улучшен относительно соответствующих параметров, наблюдаемых у цыплят, инфицированных исходным (непассированным) IB-QX-подобным вирусом. Сравнительный анализ может быть также проведен у цыплят, инфицированных другими известными вирулентными штаммами вируса IB.

Неограниченный, типичный метод оценки вирулентности последовательно пассированного вируса IB, полученного из IB-QX-подобного вируса, проиллюстрирован в примере 2. Вкратце, цыплят, зараженных последовательно пассированным вирусом IB, полученным из IB-QX-подобного вируса, подвергают балльной оценке, отражающей (i) цилиарную активность эксплантатов трахеи, (ii) клинические признаки и (iii) анатомо-патологическое исследование. Определяют общий балл [(i)+(ii)+(iii)]. Классификация вирулентности составлена следующим образом:

«Невирулентный», если общий балл меньше или равен общему баллу незараженной контрольной группы.

«Слабо выраженная вирулентность», если общий балл больше общего балла незараженной контрольной группы, но меньше или равен общему баллу для группы, зараженной известным слабым штаммом вируса IB (например, POULVAC IB H120 (Massachusetts strain), Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA).

«Умеренно выраженная вирулентность», если общий балл выше общего балла для группы, зараженной известным слабым штаммом вируса IB, но меньше или равен общему баллу для группы, зараженной известным вирулентным штаммом вируса IB (например, исходным IB-QX-подобным штаммом или другим известным вирулентным штаммом, таким как штамм IB-M41).

«Вирулентный», если общий балл равен или выше общего балла для группы, зараженной известным вирулентным штаммом вируса IB.

Вирус IB, классифицируемый как «невирулентный» или «со слабо выраженной вирулентностью» в соответствии с вышеизложенной схемой классификации, пригоден в качестве живого аттенуированного вакцинного штамма. При определенных обстоятельствах вирус IB «умеренно выраженной вирулентности» может быть также пригоден в качестве живого аттенуированного штамма.

Альтернативные методы оценки пригодности последовательно пассированного IB-QX-подобного вируса в качестве вакцинного штамма известны в данной области техники и проиллюстрированы в настоящем документе, например, в примере 3. Как показано в примере 3, балльная оценка ресничек и морфология почек и трахеи используются для определения степени аттенуации после многократного пассирования. Эти параметры могут, в свою очередь, быть использованы для определения, пригоден ли данный штамм (например, в достаточной степени безопасен) для вакцинальных целей.

Как отмечалось выше, другая категория вируса IB, которая «получена из» IB-QX-подобного вируса, представляет собой IB-QX-подобный вирус, который был подвергнут условиям, инактивирующим вирус или придающим ему меньшую вирулентность. В отличие от последовательно пассированных вирусов IB, которые, как правило, живые и аттенуированные, вирусы IB из этой второй категории, как правило, рассматриваются как инактивированные или убитые. Методы инактивации вирусов, включая вирусы IB, известны в данной области техники.

Таким образом, как проиллюстрировано в вышеизложенном материале, вирус IB по настоящему изобретению, который получен из IB-QX-подобного вируса, может быть инактивированным или аттенуированным. Вирусы IB по настоящему изобретению, если они являются инактивированными, могут быть инактивированы путем взаимодействия вирусов с инактивирующим веществом, таким как, например, β-пропиолактон или формалин. Вирусы IB по настоящему изобретению, если они являются аттенуированными, могут быть аттенуированы последовательным пассированием, начиная с исходного пассирования IB-QX-подобного вируса. Вирусы IB могут быть пассированы в любой среде, благоприятной для репликации вируса. Такие среды включают, например, яйца домашней птицы с развивающимися эмбрионами. Яйца домашней птицы с развивающимися эмбрионами включают, например, яйца с развивающимися эмбрионами цыплят, такие как яйца цыплят, свободные от специфического патогена (SPF). Другие пригодные среды включают, например, клеточные культуры.

С целью аттенуации вирусов IB по настоящему изобретению вирусы могут быть пассированы любое число раз. В определенных вариантах осуществления изобретения вирусы пассируют, как минимум, достаточное число раз таким образом, чтобы образующиеся вирусы характеризовались как либо «невирулентные», «со слабо выраженной вирулентностью», либо (при определенных обстоятельствах) «с умеренно выраженной вирулентностью», используя принцип классификации, упоминаемый в настоящем документе. В определенных иллюстративных вариантах осуществления изобретения, вирусы IB по настоящему изобретению пассируют от 5 до 400 раз. Например, вирусы IB могут быть пассированы 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 раз или более, по мере необходимости или желанию.

Вирусы IB по настоящему изобретению предпочтительно являются изолированными. Термин «изолированный» в том смысле, в котором он здесь используется, означает, что вирусы не содержатся в ткани живого животного.

Настоящее изобретение включает несколько неограничивающих демонстрационных примеров изолированных вирусов, вызывающих инфекционный бронхит, полученных из IB-QX-подобных вирусов. Например, IB-QX-подобный вирус L-1148 был пассирован 64 раза на 10-11 дневных яйцах с развивающимися эмбрионами кур, свободных от специфического патогена (SPF). Для 65-го пассажа SPF-яйца были инокулированы 0,2 мл 1000-кратного разведения аллантоисной жидкости, собранной на этапе 64 пассажа. После 24 часов инкубации при 37°С аллантоисная жидкость была собрана в пулы. 65-й пассированный материал обозначен в настоящем документе как L-1148(p65) (смотри пример 3). Стерильные пулы L-1148(p65) были отобраны, объединены, смешаны со стабилизатором, налиты в 3-мл флаконы (1 мл на флакон) и лиофилизированы для получения исходного вакцинного вируса IB QX L1148 MSV65. Были выполнены дополнительные 15 пассажей, в общей сложности 80 пассажей, для получения L-1148(p80) (смотри пример 3). Как и с 65-м пассированным материалом, аллантоисная жидкость, собранная на этапе 80-го пассажа, была собрана в пулы. Стерильные пулы были отобраны, объединены, смешаны со стабилизатором, налиты в 3-мл флаконы (1 мл на флакон) и лиофилизированы для получения исходного вакцинного вируса IB QX L1148A MSV80. IB QX L1148 MSV65 и IB QX L1148A MSV80 были пассированы каждый в отдельности дополнительные пять раз с получением IB QX L1148 MSV65 Х+5 и IB QX L1148A MSV80 Х+5, соответственно.

IB QX L1148 MSV65 был сдан на хранение в Европейскую Коллекцию Клеточных Культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 июня 2009 года от имени Fort Dodge Animal Health и ему был присвоен предварительный идентификационный номер 09061002.

IB QX L1148A MSV80 был сдан на хранение в Европейскую Коллекцию Клеточных Культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 июня 2009 года от имени Fort Dodge Animal Health и ему был присвоен предварительный идентификационный номер 09061004.

IB QX L1148A MSV65 х+5 был сдан на хранение в Европейскую Коллекцию Клеточных Культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 июня 2009 года от имени Fort Dodge Animal Health и ему был присвоен предварительный идентификационный номер 09061003.

IB QX L1148A MSV80 х+5 был сдан на хранение в Европейскую Коллекцию Клеточных Культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 июня 2009 года от имени Fort Dodge Animal Health и ему был присвоен предварительный идентификационный номер 09061001.

Дополнительные неограничивающие примеры вирусов IB, полученных из IB-QX-подобных вирусов, описаны в настоящем документе.

Настоящее изобретение включает вакцинные композиции, включающие: (i) изолированный вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса; и (ii) фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может быть, например, водой, стабилизатором, консервантом, культуральной средой или буфером или любой комбинацией вышеупомянутого. Вакцинные композиции по изобретению могут быть приготовлены в форме суспензии или лиофилизированной форме или, альтернативно, в замороженной форме. В случае замороженной формы глицерин или другие подобные вещества могут быть добавлены для повышения стабильности при замораживании.

Вакцинные композиции по изобретению могут включать адъювант, в частности, если вирус IB, содержащийся в композиции, инактивирован (т.е. убит). Адъювантом может быть акриловый полимер, диметил диоктадецил бромид аммония (DDA) или комбинация акрилового полимера и DDA. Акриловым полимером в том смысле, в котором он здесь используется, является любой полимер или сополимер, который содержит акриловую группу. Иллюстративные акриловые полимеры включают, например, полиакриловую кислоту, метакриловую кислоту, метакрилат, акриламид, акрилат, акрилонитрил и алкиловые эфиры полиакриловой кислоты. Примеры акриловых сополимеров включают, например, поли(акриламид-собутил, метакрилат), акриловую-метакриловую кислоту, акриловую кислоту-акриламид и поли(метакрилат). Примеры коммерчески доступных акриловых полимеров включают карбопол (B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio), Carboset (B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio), Neocryl (Avecia, Inc., Wilmington, Del.) и Eudragit (Rohm Tech, Inc., Malden, Mass.). Особенно предпочтительным акриловым полимером для использования в эмульсиях по настоящему изобретению является карбопол, который также называется водорастворимым полимером акриловой кислоты, сшитым с полиаллилсахарозой. Адъювант может представлять собой водорастворимый или диспергируемый в воде адъювант. Адъювант может представлять собой масляную эмульсию, например, эмульсию типа вода в масле, масло в воде или вода в масле в воде. Эмульсия типа вода в масле может дополнительно включать один или несколько жирорастворимых поверхностно-активных веществ, один или несколько водорастворимых поверхностно-активных веществ, дополнительные адъюванты, дополнительные компоненты водной фазы, стабилизаторы эмульсии или комбинации вышеперечисленного.

Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут включать, помимо вируса IB, полученного из IB-QX-подобного вируса, другие антигенные компоненты. Другие антигенные компоненты, включенные в вакцинные композиции, могут быть получены из инфекционных агентов, например, инфекционных агентов кур. Например, вакцинные композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать, как минимум, один дополнительный живой аттенуированный вирус IB, полученный из вируса, не являющегося IB-QX-подобным. «Вирус, не являющийся IB-QX-подобным» в том смысле, в котором он здесь используется, означает любой вирус IB с белком S1, кодируемым нуклеотидной последовательностью, которая менее чем на 95% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей белок S1 исходного штамма IB-QX. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок S1 исходного штамма IB-QX, представлена в виде SEQ ID NO:1 и доступна в NCBI Genbank под идентификационным номером AF193423. Таким образом, любой вирус с белком S1, кодируемым нуклеотидной последовательностью, которая менее чем на 95% идентична SEQ ID NO:1, представляет собой вирус «не являющийся IB-QX-подобным» в рамках настоящего изобретения. Иллюстративные вирусы, не являющиеся IB-QX-подобными, включают штаммы, такие как Massachusetts, Arkansas, Georgia-98, Italy-02, 793-B, D274, D1466, или штаммы, имеющие генотип S1 любого из вышеуказанных вирусов, не являющихся IB-QX-подобными. Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько коммерчески доступных вакцинных штаммов IB помимо вируса IB, полученного из IB-QX-подобного вируса.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вакцинная композиция может содержать дополнительный антигенный компонент, полученный из инфекционного агента, не являющегося вирусом IB. Например, вакцинные композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать живой аттенуированный или инактивированный птичий вирус, такой как вирус ньюкаслской болезни, вирус болезни Марека, вирус инфекционного бурсита, реовирус, вирус птичьего гриппа, вирус анемии кур или вирус энцефаломиелита птиц.

Настоящее изобретение также включает методы приготовления живых аттенуированных вирусов IB. Живые аттенуированные вирусы, приготовленные по данному аспекту изобретения, пригодны, в числе прочего, для вакцинации кур против вируса IB. Методы по данному аспекту изобретения включают пассирование IB-QX-подобного вируса. Например, IB-QX-подобный вирус может быть пассирован на яйцах домашних птиц с развивающимися эмбрионами (например, яйцах кур с развивающимися эмбрионами) или в клеточной культуре (например, клеточных культурах почки курицы). Число раз, которое должен быть пассирован IB-QX-подобный вирус, чтобы превратить его в аттенуированный, может быть определено, руководствуясь сведениями, излагаемыми в настоящем документе. Например, после пассирования IB-QX-подобного вируса образуемый вирус IB может быть введен курам, и затем проводят оценку кур, например, по цилиарной активности эксплантатов трахеи, клиническим признакам, общему анатомо-патологическому исследованию и/или гистологическим признакам инфекционного бронхита. Пассированный вирус IB, который вызывает облегченные или менее тяжелые симптомы IB по сравнению с исходным IB-QX-подобным вирусом, из которого он был получен, (или по сравнению с другими известными контрольными штаммами, вызывающими IB), считается аттенуированным штаммом в рамках настоящего изобретения. В соответствии с определенными вариантами осуществления методы изобретения включают пассирование IB-QX-подобного вируса до тех пор, пока образующийся вирус не попадет под категорию «невирулентный» или «со слабо выраженной вирулентностью» в соответствии с принципами классификации, изложенными в настоящем документе.

Настоящее изобретение также включает способы вакцинации птицы против инфекционного бронхита. Способы по данному аспекту изобретения включают введение птице вируса IB, полученного из IB-QX-подобного вируса. Способы по данному аспекту изобретения могут включать введение любой вакцинной композиции, включающей любой вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса, как описано в настоящем документе. Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут быть введены любым способом таким образом, чтобы активные или антигенные компоненты моментально или с течением времени провзаимодействовали с мембранами слизистой оболочки дыхательных путей птицы. Таким образом, вакцинные композиции могут быть введены птицам, например, интраназально, перорально и/или внутрь глаза. Вакцинные композиции для введения птицам могут быть составлены, как описано выше, и/или в форме, пригодной для введения с помощью спрея, включая аэрозоль (для интраназального применения), или в питьевой воде (для перорального применения). Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут быть также введены подкожно, внутримышечно или внутрь эмбриона. (Смотри патент США № 7208164). По данному аспекту изобретения вакцинные композиции, включающие вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса, могут быть введены птице в возрасте от 1 дня до 18 недель. В случае введения в эмбрион вакцинная композиция может быть введена, например, во второй половине инкубационного периода. Например, в случае кур, яйца, как правило, инокулируют в период приблизительно от 14 дня до приблизительно 19 дня. Более предпочтительна инокуляция куриных яиц приблизительно на 15-18 день.

Нижеследующие примеры являются иллюстративными, но не исчерпывающими, касательно способа и композиций по настоящему изобретению. Другие подходящие модификации и приспособления множества условий и параметров, обычно встречающихся в молекулярной биологии и химии, которые очевидны специалистам в данной области техники с точки зрения настоящего описания изобретения, находятся в рамках сущности и объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: ИДЕНТИФИКАЦИЯ IB-QX-ПОДОБНЫХ ВИРУСОВ

Этот пример представляет метод идентификации, если вирусом-кандидатом IB является IB-QX-подобный вирус. Вирусы-кандидаты IB могут быть получены из большого разнообразия источников, включая, например, соскобы тканей, полученных от животных, у которых проявляется один или несколько симптомов инфекционного бронхита, или из общедоступного банка-хранилища.

«IB-QX-подобный вирус» в том смысле, в котором он здесь используется, представляет собой вирус, вызывающий инфекционный бронхит, с нуклеотидной последовательностью S1, которая, как минимум, на 95% идентична нуклеотидной последовательности S1 исходно идентифицированного штамма IB-QX. Нуклеотидная последовательность S1 исходного штамма IB-QX представляет собой SEQ ID NO:1 и может быть найдена в NCBI Genbank под идентификационным номером AF193423.

Чтобы выяснить, является ли вирус-кандидат IB-QX-подобным вирусом, выделяют РНК из образца, содержащего вирусные частицы кандидата (например, соскобы тканей), используя стандартные способы выделения РНК. Например, РНК может быть выделена, используя способ с использованием изотиоцианата гуанидиния, фенол-хлороформа. (Chomcznski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156-159; Li et al. (1993), Avian Pathology 22:771-783). Кроме того, несколько наборов для выделения РНК коммерчески доступно и пригодно для этой цели. Затем РНК используют в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для получения амплифицированной копии ДНК целого гена S1 или так называемого «гипервариабельного участка» гена S1. Праймеры, используемые в ОТ-ПЦР, предпочтительно те, которые являются общими для большинства известных штаммов вируса IB. Иллюстративные праймеры наряду с соответствующими способами ОТ-ПЦР, которые могут быть использованы для амплификации гипервариабельного участка гена S1 вирусов-кандидатов IB, опубликованы, например, в Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257 и Jones et al. (2005), Veterinary Record 156:646-647. В статье Worthington et al. вслед за реакцией ОТ выполняют «вложенную» ПЦР с целью получения копии ДНК гипервариабельного участка S1 длиной приблизительно 393 пар оснований. Секвенирование полноразмерной S1 может быть выполнено, используя метод Adzhar et al. (1996), Avian Pathology 25:817-836. Альтернативные праймеры и условия ОТ-ПЦР, пригодные для амплификации гена S1 или его частей, могут быть без труда созданы специалистами в данной области техники, используя общедоступную информацию о последовательностях вирусов IB.

После того как определена нуклеотидная последовательность целого гена S1, или его части (например, гипервариабельного участка), вируса-кандидата IB, данную последовательность сравнивают с последовательностью гена S1 для штамма IB-QX (SEQ ID NO:1) для определения процента идентичности. В случае, если нуклеотидная последовательность гена S1, или его гипервариабельного участка, вируса-кандидата IB, как минимум, на 95% идентична нуклеотидной последовательности гена S1 IB-QX (SEQ ID NO:1), тогда вирус-кандидат IB считают IB-QX-подобным вирусом.

Иллюстративные методы определения, является ли вирус-кандидат IB IB-QX-подобным вирусом, также описаны, например, в статье Gough et al. (2008), Veterinary Record 162:99-100 и статье Domanska-Blicharz et al. (2006), Veterinary Record 158:808, обе из которых полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Пример 2: АТТЕНУАЦИЯ IB-QX-ПОДОБНЫХ ВИРУСОВ

ВВЕДЕНИЕ

Этот пример обобщает эксперименты, в которых IB-QX-подобные вирусы были пассированы многократно на куриные яйца с развивающимися эмбрионами, и аттенуация образующихся вирусов была продемонстрирована на курицах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы, вызывающие инфекционный бронхит

Три штамма IB-QX-подобных вирусов, обозначенные L-1148, 1449-2 и 1449-10, были использованы в данном примере. Все три этих штамма были идентифицированы как IB-QX-подобные путем секвенирования гена S1 и нуклеотидного сравнительного анализа с IB-QX и другими IB-QX-подобными вирусами. (Смотри Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257).

Каждый из штаммов L-1148 и 1449-10 были пассированы 50 раз на куриных яйцах с развивающимися эмбрионами; штамм 1449-2 был пассирован 5 раз на куриных яйцах с развивающимися эмбрионами. Штаммы, полученные в результате этих многократных пассажей, были обозначены L-1148(p50), 1449-10(p50) и 1449-2(p5), соответственно. Таким образом, L-1148(p50) был получен из L-1148; 1449-10(p50) был получен из 1449-10; и 1449-2(p5) был получен из 1449-2.

План исследования

Цыплята были заражены вирусами L-1148(p50), 1449-10(p50) и 1449-2(p5) наряду с известным штаммом IB со слабо выраженной вирулентностью (IB-H120, вакцинный штамм) и вирулентным штаммом IB (IB-M41). Незараженная контрольная группа была также включена в исследование. План исследования сведен в таблицу 4:

Таблица 4 План Исследования
Группа	Количество цыплят	Штамм для заражения
1	10	L-1148(p50)
2	10	1449-10(p50)

3	10	1449-2(p5)
4	10	IB-H120
5	10	IB-M41
Контроль	10	Не зараженный

Животные и уход за ними

Шестьдесят SPF-цыплят были использованы в данном примере. 50 цыплят в возрасте 15 дней были разделены на пять групп (1-5) и содержались в изоляторах. 10 цыплят, используемых в качестве контроля, оставались в своих клетках. Для акклиматизации цыплят, помещенных в изоляторы, оставляли одних на три дня. Пища и вода были доступны без ограничения. Все цыплята проходили обследование на предмет выявления клинических признаков IB на протяжении исследования.

Введение вирусов

Используя 1-мл шприц, 5 цыплят подряд были заражены вирусом IB путем введения 0,1 мл в каждый глаз каждого цыпленка. В случае IB-M41 цыплятам вводили 0,25 мл в глаз. Все цыплята в возрасте 18 дней были заражены вирусом IB в дозе, равной приблизительно 10^6,0 EID₅₀. Исходные вирусные растворы хранили при -70°С и разводили в питательном бульоне до необходимой концентрации до введения.

Незамедлительно после введения вирусов цыплятам образец использованного вируса хранили в стерильном флаконе при -70°С для повторного титрования.

Цилиарная активность эксплантатов трахеи

Через четыре дня после заражения была исследована цилиарная активность эксплантатов трахеи. Потерю сознания у цыплят вызывали газовой смесью из 34% О₂ и 66% СО₂. Когда достигалось состояние полной анестезии, цыплят умерщвляли ингаляцией 100% СО₂. Сразу после умерщвления была удалена трахея (от основания головы до 0,5 см проксимальнее сиринкса). Как только была удалена трахея, ее ополаскивали в PBS при 37°С, используя шприц без иглы, и хранили в PBS, температура которого составляла 37°С, до дальнейшей обработки. Были сделаны поперечные срезы трахеи толщиной 0,6 мм, используя Mcllwain Tissue Chopper (Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd., Surrey, United Kingdom). Поперечные срезы трахеи помещали в чашку Петри с 2 мл PBS, температура которого составляла 37°С, и были исследованы под микроскопом в течение 4 минут. Цилиарная активность 3 срезов верхней части, 4 срезов средней части и 3 срезов нижней части трахеи была исследована при малом увеличении (400х) микроскопа. Цилиарная активность каждого среза трахеи была исследована в течение 20 минут с момента умерщвления птицы.

Цилиарная активность была оценена по балльной шкале от 0 (100 процентов цилиарной активности) до 4 (0 процентов цилиарной активности). Для каждой группы затем было вычислено среднее значение цилиостаза путем деления суммарного количества срезов трахеи, в которых обнаружено прекращение активности, на количество цыплят в группе. Вычисленное среднее значение цилиостаза в группе было сравнено со средним значением цилиостаза в группах, которые были заражены Poulvac IB 120 и IB-M41, и в невакцинированной группе. IB-M41 классифицируют как вирулентный, и вирус IB в Poulvac IB H120 - как со слабо выраженной вирулентностью.

Клинические признаки

Птиц обследовали зоотехники ежедневно на предмет выявления клинических признаков на протяжении всего исследования. Клинические признаки, характерные для инфицированности IB, были оценены в баллах следующим образом:

Наблюдаемый клинический признак	Баллы
Отсутствует	Присутствует
Водянистые экссудаты из глаза или носа	0	2
Затрудненное дыхание	0	4
Диарея	0	1

Общее анатомо-патологическое исследование

Было выполнено вскрытие каждого цыпленка для выявления любой аномалии, которая могла возникнуть в результате инфицирования IB. Отклонения были оценены в баллах следующим образом:

Верхние дыхательные пути: нормальный внешний вид=0; слизь=1; бронхит/трахеит=2.

Почки: нормальный внешний вид=0; отечные или бледные с кристаллами уратов=1.

Селезенка: нормальный внешний вид=0; отечная=1.

Кишечник: нормальный внешний вид=0; аномалии=2.

Гистология трахеи, легкого и почки

Образцы трахеи, легкого и почки были взяты на 4 день после введения вирусов. Все образцы были подвергнуты гистологическому исследованию. Было выполнено иммуногистохимическое окрашивание всех образцов на эпитоп 48.4 IBV (ядерный белок) с целью выявления IBV.

Оценка

Вирулентность вирусов IB в цыплятах SPF была определена по:

цилиарной активности эксплантатов трахеи;

наличию и тяжести клинических признаков; и

отклонениям от нормы, обнаруженным при анатомо-патологическом исследовании.

Вирулентность IBV в цыплятах SPF классифицировали как:

невирулентный, если общий балл группы меньше или равен общему баллу незараженной группы;

слабо выраженная вирулентность, если общий балл группы больше общего балла контрольной группы и меньше или равен общему баллу группы, зараженной Poulvac IB H120;

умеренно выраженная вирулентность, если общий балл группы выше общего балла группы, зараженной Poulvac IB H120, и меньше или равен общему баллу группы, зараженной IB M41;

вирулентный, если общий балл группы равен или выше общего балла группы, зараженной IB-M41.

Тест не считался действительным, если более 10% цыплят умирало по причинам, не связанным с вакцинным вирусом. В данном примере вакцинный вирус считался в достаточной степени безопасным, если:

ни один цыпленок не имел характерные клинические признаки птичьего инфекционного бронхита или не умирал по причинам, связанным с вакцинным вирусом;

средний балл цилиостаза был не более 25; и

при гистологическом исследовании почки выявляли не более чем умеренные участки воспаления.

Вирусы, классифицируемые как имеющие умеренно выраженную вирулентность или вирулентные и которые не отвечают вышеперечисленным требованиям, тем не менее, являются потенциально пригодными для использования в качестве вируса для заражения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Титрование вирусов IB после введения цыплятам

Титры различных вирусов IB после заражения цыплят представлены в таблице 5. Как показано в данной таблице, цыплята были заражены вирусом IB в дозе, превышающей 10^6.0 EID₅₀ во всех случаях.

Таблица 5 Титры IBV после введения цыплятам
		Титр в 10log EID50 на мл или на ампулу
Группа	Вирус	Образец 1	Образец 2	Среднее
1	L-1148(p50)	6,83	6,67	6,75
2	1449-10(p50)	7,00	6,33	6,67
3	1449-2(p5)	6,50	6,67	6,59
4	IB-H120	6,33	6,00	6,17
5	IB-M41	6,50	7,33	6,92

Клинические признаки, цилиарная активность и анатомо-патологическое исследование

Ни один цыпленок не умер во время исследования. Только очень слабые экссудативные окулоназальные выделения (небольшие капли в носовом отверстии) и затрудненное дыхание после манипуляций с цыплятами наблюдали у некоторых цыплят, зараженных IB 1449-10(p50).

Цилиостаза не наблюдали ни у одного контрольного цыпленка, но отчетливо был продемонстрирован у цыплят, зараженных IB-M41. У троих из 10 цыплят, зараженных вирусом Poulvac IB H120, был выявлен полный цилиостаз. Количество срезов трахеи с цилиостазом возрастало, если цыплята были заражены IBV 1148(p50) (6 срезов), IBV 1449-2(p5) (20 срезов) и IBV 1449-10(p50) (41 срез).

Во время анатомо-патологического исследования цыплят было обнаружено, что у цыплят, зараженных IB 1449-2(p5), Poulvac IB H120 или IB-M41, имелся в наличии катаральный экссудат в трахее. У одного цыпленка, зараженного IB 1449-2(p5), была обнаружена отечная бледная почка.

На основании цилиарной активности, клинических признаков и данных патологоанатомического исследования, сведенных в таблицу 6, была проведена классификация IB-QX-подобных вирусов. Штамм L-1148(p50) классифицировали как слабовирулентный, IBV 1449-10(p50) как штамм с умеренно выраженной вирулентностью и IBV 1449-2(p5) как маловирулентный по сравнению с Poulvac IB H120 и IB-M41.

Таблица 6 Классификация вирусов IB после заражения цыплят SPF
Балльная оценка*
Группа	Вирус	Сред ний балл цилиостаза	С(n)	S	P	Суммарный балл (C+S+P)	Классификация
1	L-1148 (p50)	2	24(1)	0	0	24	Слабо выраженная вирулентность
2	1449-10 (p50)	16	164 (4)	24	0	188	Умеренно выраженная вирулентность
3	1449-2 (p5)	8	80(2)	0	5	85	Слабо выраженная вирулентность
4	IB-H120	12	120 (3)	0	1	121	Слабо выраженная вирулентность
5	IB-M41	40	400 (10)	0	4	404	Вирулентный
6	Заражение отсутствует	0	0(0)	0	0	0	Невирулентный
*Балльная оценка была основана на: (С) Цилиарной активности эксплантов трахеи, (n) = количество заболевших цыплят; цыпленок считается заболевшим, когда, как минимум, на двух срезах трахеи наблюдают цилиостаз. (S) Клинические признаки. (P) Анатомо-патологическое исследование.

Гистология трахеи, легких и почек

Никаких отклонений от нормы не было обнаружено в трахеях цыплят, зараженных L-1148(p50), 1449-2(p5) и IB-H120. После заражения 1449-10(p50) был обнаружен очаговый трахеит с некрозом в одной из четырех трахей. Во всех трахеях цыплят, зараженных IB-M41, был выявлен острый трахеит. IBV можно было обнаружить только в трахеях цыплят, инфицированных IB-M41.

Никаких отклонений от нормы не было обнаружено и никакого IBV не было выявлено в легких ни у одного цыпленка.

Гистология почек цыплят, зараженных L-1148(p50) и 1449-10(p50), выявила незначительную инфильтрацию мононуклеарными и плазматическими клетками в некоторых случаях. Тубулярный эпителий не был поражен. Используя иммуногистохимический анализ, не было обнаружено IBV-антигена в эпителиальных клетках образцов почечных канальцев, взятых на 4 день после инфицирования. Не было обнаружено IBV в почках из любой группы после иммуногистохимического окрашивания.

Обсуждение

IBV сначала инфицирует слизистую трахеи и затем реплицируется в эпителии других органов, например, тубулярных эпителиальных клетках почек и эпителии яйцевода. Репликация IBV в эпителиальных клетках может приводить к дегенерации клеток и, как следствие, могут происходить патологические изменения в органах/тканях. Будут ли иметь место клинические признаки, зависит от ряда факторов, таких как вирулентность IBV, инфицируемый орган, наличие вторичной инфекции и общее состояние здоровья цыпленка. Это наглядно видно в трахее цыплят, зараженных IBV, где цилиарная активность ослаблена у всех (IBV-M41), 40% (1449-10(p50)), 20% (1449-2(p5)) и 10% (IBV L-1148(p50)) животных. Катаральный экссудат присутствовал в трахеях цыплят, зараженных IBV 1449-2(p5), Poulvac IB H120 и IB-M41. Только когда цыплят заражали IBV 1449-10(p50), можно было видеть слабо выраженные клинические признаки, которые, по-видимому, были результатом цилиостаза и, как следствие, накопления слизи. Принимая во внимание то, что цыплята были заражены высокими дозами IBV, результаты данного примера являются весьма многообещающими. Отсутствие клинических признаков после заражения цыплят IBV L-1148(p50) и IBV 1449-2(p5), по всей вероятности, отражает тот факт, что клинические признаки, вызванные соответствующими полевыми штаммами, являются слабо выраженными. Наблюдали только слабо выраженные респираторные признаки после заражения SPF-цыплят IBV 1449-10(p50), что говорит об аттенуации данного штамма, поскольку полевой штамм IBV 1449-10 был вирулентным.

Вывод

Как показано в данном примере, IB-QX-подобные вирусы могут быть аттенуированы путем многократного пассирования. Образующиеся аттенуированные штаммы, полученные из IB-QX-подобных вирусов, демонстрируют большие перспективы в качестве новых вакцинных штаммов против инфекционного бронхита. Пассированные вирусы, полученные из IB-QX-подобных вирусов, которые вызывают умеренно выраженное вирулентное действие при введении курицам, пригодны в качестве материала для заражения с целью изучения и дальнейшего развития новых вакцин IB, в частности, вакцин против IB-QX-подобных вирусов.

Пример 3: ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ПАССИРОВАНИЕ И БЕЗОПАСНОСТЬ IB-QX-ПОДОБНОГО ШТАММА L-1148.

Введение

В данном примере штамм L-1148 IB-QX-подобного вируса был пассирован многократно на куриных яйцах с развивающимися эмбрионами. Безопасность вирусов на различных уровнях пассажа была определена с помощью оценки степени цилиостаза и морфологии почки у кур. Как показано ниже, многократное пассирование штамма L-1148 привело к получению аттенуированного штамма, пригодного в качестве вакцины против инфицирования IB-QX-подобными вирусами.

Пассирование L-1148 на куриных яйцах SPF с развивающимися эмбрионами

Для вирусного пассирования были использованы 10-11-дневные яйца кур, свободных от специфического патогена (SPF), с развивающимися эмбрионами. Штамм L-1148 вначале был пассирован семь раз на куриных яйцах SPF. Для первых 5 пассажей заражение проводили неразбавленной аллантоисной жидкостью. Пассажи проводили только с использованием аллантоисных жидкостей из яиц с живыми эмбрионами. Это приводило приблизительно к 50% гибели эмбрионов. Было решено продолжить пассирование с использованием разведенных в 100-раз аллантоисных жидкостей в физиологическом солевом растворе, приводя к меньшей гибели эмбрионов. Продолжали делать пассажи до 73 пассажа. При проведении свыше 73 пассажей становилось понятным, что существует контаминация вирусом ньюкаслской болезни (ND) в штамме IB L-1148. Образцы крови от кур, вакцинированных 50 пассажем штамма IB L-1148, содержали антитела против вируса ND. ОТ-ПЦР анализ образцов 8 пассажа выявил, что штамм IB L-1148 изначально был контаминирован данным вирусом. Было принято решение остановить пассирование и очистить вирусный штамм IB L-1148 от контаминации.

Деконтаминация пассажей L-1148

Образцы были отобраны из 22, 47 и 73 пассажа и были обработаны специфической антисывороткой к ND. Вкратце, образцы аллантоисной жидкости были смешаны с образцами специфической поликлональной антисыворотки к ND в объемном соотношении аллантоисная жидкость:сыворотка, равном 1:2. Смесь инкубировали при 37°С в течение часа с последующей ночной инкубацией при 4°С. После инкубации была приготовлена 10-кратная серия разведений, и 5 яиц на каждое разведение были заражены 0,1 мл каждое. После 2 дней аллантоисные жидкости были отобраны, и образцы из наибольшего разведения, которые все еще были положительными по IB методом ОТ-ПЦР, были собраны. Яйца с мертвыми эмбрионами были исключены. Аллантоисная жидкость снова была обработана антисывороткой к ND, как указано выше, и снова было проведено заражение яиц серией разведений. После инкубации опять же наибольшее разведение, которое все еще было положительным по IB методом ОТ-ПЦР, собирали, делили на части и замораживали, и хранили при -70°С.

Результатом вышеизложенного процесса деконтаминации были очищенные и клонированные 24, 49 и 75 пассажи. Экспериментальная серия на уровне 25 пассажа была создана инокуляцией 10⁷-кратного разведения в яйца, 0,2 мл на яйцо, и сбором после 48-часовой инкубации при 37°С. Аллантоисная жидкость была поделена на небольшие части и хранилась при -70°С. Экспериментальная серия 50 пассажа была создана по той же самой методике. 75 пассаж был пассирован дополнительно до 80 пассажа. Аллантоисные жидкости 80 пассажа были пулированы, разделены на небольшие части и заморожены, и хранились при -70°С.

Оценка безопасности

Безопасность различных уровней пассажа штамма IB L-1148 у кур была протестирована несколько раз. Также включенным в исследование был неаттенуированный IB-QX-подобный штамм 1449-10 наряду с вирулентным штаммом IB-M41, подобным штамму Массачусетс, и вакцинным штаммом Poulvac IB H120 со слабой вирулентностью.

SPF-цыплята в возрасте 1 дня были использованы для каждого теста. Тесты были выполнены в соответствии со стандартными методиками. Вкратце, используя 1-мл шприц, 5 цыплят подряд были заражены вирусом IB путем введения 0,1 мл в каждый глаз каждого цыпленка. В случае IB-M41 цыплятам вводили 0,25 мл в глаз. Лиофилизированный вирус был растворен в воде для инъекций, и дополнительные разведения были приготовлены в питательном бульоне. Затем были проведено наблюдение за птицами на предмет выявления клинических признаков.

Через пять дней после введения вируса была исследована цилиарная активность эксплантатов трахеи у 5 цыплят. Изымали трахеи из умерщвленных цыплят, и были сделаны поперечные срезы трахеи, толщиной 0,6 мм, 3 среза верхней части, 4 среза средней части и 3 среза нижней части трахеи. Поперечные срезы трахеи помещали в чашку Петри, содержащую 2 мл PBS, температура которого составляла 37°С, и были исследованы под микроскопом в течение 4 минут.

Цилиарная активность была оценена микроскопически по балльной шкале от 0 (100 процентов цилиарной активности) до 4 (0 процентов цилиарной активности). Для каждой группы было вычислено среднее значение цилиостаза путем деления суммарного количества срезов трахеи, в которых обнаружено прекращение активности, на количество цыплят в группе.

Образцы трахеи, легкого и почки были взяты у умерщвленных животных. Во всех образцах было проведено гистологическое исследование. Было выполнено иммуногистохимическое окрашивание на эпитоп 48,4 IBV (ядерный белок) с целью выявления вируса IB.

Результаты сведены в таблицу 7.

Таблица 7 Суммарные результаты оценки безопасности, проведенной на различных пассажах L-1148
Исследование	Тестированный вирус	Титр*	Балльнаяоценка ресничек	Почки	Трахея
A	1449-10	5,6	39	Бледные, отечные, тяжелый нефрит	Нормальная
	1449-10	3,0	32	Бледные, отечные, тяжелый нефрит	Нормальная
	IB H120	6,0	18	Нефрит легкой степени	Нормальная
	L-1148(p8)	6,0	39	Бледные, отечные, степень выраженности нефрита от легкой до умеренной	Нормальная
L-1148(p25)	6,0	18	Бледные, отечные, степень выраженности нефрита от	Нормальная
				легкой до умеренной
	L-1148(p40)	6,0	21	Бледные, отечные, нефрит легкой степени	Нормальная
	L-1148(p50)	6,0	31	Бледные, отечные, нефрит легкой степени	Нормальная
IB-M41	3,3	37	Нет изменений	Нормальная
B	IB-M41	3,3	40	Бледные, нефрит легкой степени	Нормальная
	IB H120	6,0	16	Бледные, степень выраженности нефрита от легкой до умеренной	Слизь, трахеит
	L-1148(p25)	6,0	13	Степень выраженности нефрита от легкой до умеренной	Слизь, трахеит
L-1148(p50)	6,0	22	Степень	Трахеит
				выраженности нефрита от легкой до умеренной
L-1148(p80)	6,0	3	Нефрит легкой степени	Нормальная
С	L-1148(p65)	6,0	18	Нет изменений	1х слизь
*Титр выражен в 10log EID50 на дозу

Результаты демонстрируют, что IB-M41 (вирулентный штамм) имел высокую балльную оценку ресничек; максимально возможная балльная оценка составляет 40. Штамм IB 1449-10 также имел высокую балльную оценку ресничек. Вакцинный штамм IB H120 имел низкую балльную оценку, что соответствует нормативным требованиям (например, менее 25). 8 пассаж штамма IB L-1148 имел высокую балльную оценку, равную 39, в исследовании А. Происходило значительное снижение до 18 на 25 уровне пассажа. На 40 и 50 уровнях пассажа происходило увеличение балльной оценки цилиостаза до 31 для р50 в исследовании А. Образцы штамма IB L-1148, протестированные в исследовании А, были все контаминированы вирусом ND. 25 и 50 уровни пассажа были протестированы вновь после очистки от контаминации ND. На этот раз балльные оценки цилиостаза были явно ниже и в диапазоне приемлемых значений для вакцинного штамма. В исследовании В 80 пассаж был также протестирован. Для этого пассажа была обнаружена очень низкая балльная оценка цилиостаза, намного ниже, чем для IB H120. Предположили, что 80 уровень пассажа может быть аттенуированным в большей степени, нежели это необходимо для безопасного вакцинного штамма.

В таблице 7 также показаны результаты исследований почек и трахеи. Степень выраженности нефрита от легкой до умеренной считалась приемлемой при условии, что он был транзиторным. Трахеит считался допустимым при условии, что он был транзиторным, как и в случае слизи в трахее. Результаты демонстрируют, что 8, 25, 40 и 50 пассажи IB L-1148 поражали почки точно так же, как и контрольный вакцинный штамм IB H120, но не в такой тяжелой степени, как штамм IB 1449-10. 80 пассаж также оказывал некоторое воздействие на почки.

После анализа результатов исследований А и В было решено создать экспериментальную серию IB L-1148 на 65 уровне пассажа (т.е. L-1148(p65)) и оценить безопасность образующихся вирусов. Пассажи были выполнены, начиная от 50 пассажа до 64 пассажа, путем заражения каждого яйца 0,1 мл 100-кратных разведений объединенных супернатантов аллантоисных жидкостей из предшествующего пассажа вплоть до 64 уровня пассажа. Была создана большая экспериментальная серия на 65 уровне пассажа в условиях надлежащей медицинской практики. В каждое яйцо было инокулировано 0,2 мл 1000-кратного разведения аллантоисной жидкости из 64 уровня пассажа. После 24-х часовой инкубации при 37°С аллантоисная жидкость была собрана в пулы. Образец был взят из одного из пулов, протитрован и проверен на безопасность. Результаты сведены в таблицу 7 (Исследование С). Результаты показывают, что средняя балльная оценка цилиостаза составляет 18, которая подобна той, что была обнаружена в вышеупомянутом исследовании для IB H120. Нефрита не наблюдали, и некоторое количество слизи было обнаружено в трахее только у одного из 15 цыплят.

Вывод

Этот пример демонстрирует, что безопасные вакцинные штаммы против IB-QX-подобных вирусов могут быть получены многократным пассированием IB-QX-подобного штамма на яйцах курицы с развивающимися эмбрионами. В данном примере результатом пассажа с 25 по 80 уровень были аттенуированные вирусы с профилем безопасности на одном уровне с известной приемлемой вакциной IB.

Пример 4: ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИН, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ IB-QX-ПОДОБНОГО ШТАММА L-1148

В данном примере оценивали эффективность двух вакцинных штаммов, полученных из IB-QX-подобного штамма L-1148. Тестируемыми вакцинными штаммами были L-1148(p65) и L-1148(p80) (смотри пример 3).

Куриц-несушек SPF в возрасте одного дня вакцинировали спреем (0,5 мл на каждую дозу). Через три недели после вакцинации каждую курицу заражали дозой 10^4,0 EID₅₀ штамма IB D388 (вирулентного IB-QX-подобного штамма, выделенного в Нидерландах).

Цилиарная активность эксплантатов трахеи была исследована через 5 дней после заражения. Сразу же после смерти изымали трахею, промывали в и хранили в физиологическом солевом растворе при 37°С до последующей обработки. Небольшие поперечные срезы трахеи были нарезаны вручную. Цилиарная активность 3 срезов верхней части, 4 срезов средней части и 3 срезов нижней части трахеи была исследована с помощью микроскопии с малым увеличением.

Цилиарная активность была оценена в баллах, используя следующие критерии классификации:

Балл	Критерий
0	≥50% срезов трахеи демонстрируют цилиарную активность
1	<50% срезов трахеи демонстрируют цилиарную активность

Для данного конкретного среза цилиарную активность считали нормальной, когда, как минимум, 50% (0 баллов) внутреннего кольца демонстрировали интенсивное движение ресничек. Курица не считалась пораженной заболеванием в случае, если не меньше, чем 9 из 10 колец демонстрировали нормальную цилиарную активность. Испытание считалось недостоверным, если срезы трахеи микроскопически исследовали более 2 часов после взятия образца трахеи.

Результаты суммированы в таблице 8.

Таблица 8 Итоговые результаты по исследованию эффективности
Вакцина	EID50 на каждую дозу	Заражение	N защищенных/N общее
Отсутствует	--	Отсутствует	19/20
Отсутствует	--	Есть	0/20
L-1148(p65)	103,3	Есть	20/20
	103,0	Есть	20/21
	102,7	Есть	20/20
102,4	Есть	0/20
L-1148(p80)	103,3	Есть	17/20

В невакцинированной и незараженной контрольной группе у одной из 20 куриц выявлено уменьшение цилиарной активности без определенных причин. У других куриц движение ресничек было нормальным. В невакцинированной зараженной группе у всех куриц выявлено уменьшение цилиарной активности. В группах, вакцинированных L-1148(p65) и L-1148(p80), защита оказалась лучше предусмотренной органами контроля и регулирования (например, как минимум, 80% защищенных) за исключением таковой в группе, вакцинированной 10^2,4 EID₅₀ L-1148(p65), в которой не наблюдали никакой защиты.

Этот пример демонстрирует эффективность вакцинных штаммов, полученных из IB-QX-подобных штаммов путем последовательного пассирования.

Пример 5: ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ IB-QX-ПОДОБНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ

ВВЕДЕНИЕ

В данном примере безопасность IB-QX-подобного штамма L-1148(p80) (также называемого в настоящем документе как «Исходный Вакцинный Вирус» или «MSV-p80») была исследована у куриц наряду со штаммом L-1148 на 101 уровне пассажа («L-1148(p101)») и штаммом 1449-2 на 18 уровне пассажа («1449-2(p18)»).

250 здоровых куриц породы белый леггорн, разделенных на пять групп по 50 куриц в каждой, были использованы в данном примере в соответствии со схемой исследования, представленной в таблице 9.

Таблица 9 Схема Исследования
№ группы	Количество птиц	Вакцина	Время проведения вакцинации
1	50	MSV-p80	День вылупления из яйца
2	50	MSV-p80	В возрасте 7 дней
3	50	L-1148(p101)	День вылупления из яйца
4	50	1449-2(p18)	День вылупления из яйца
5	50	Контроль - один лишь разбавитель	День вылупления из яйца

Вакцинация была выполнена окулоназальным способом, где каждый цыпленок получал соответствующую вакцину объемом 0,2 мл (0,1 мл в каждый глаз). Все вакцины были введены в дозе 10^5,0 EID₅₀/птица.

Во время исследования за птицами велось наблюдение на предмет выявления клинических симптомов. Регистрировали любой клинический признак или смертность. Птицы, умершие во время исследования, были подвергнуты патологоанатомическому исследованию.

Яйцеводы были исследованы по достижению курицами возраста 11 недель, за исключением молодок 2 группы, которых исследовали в возрасте 12 недель. Молодки были умерщвлены, и целомическая полость была вскрыта, и весь яйцевод был макроскопически исследован с внешней и внутренней стороны (вскрывая его в продольном направлении с помощью ножниц) на наличие кист, стриктур, деформации или аплазии.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Данные по смертности сведены в таблицу 10.

Таблица 10 Данные по смертности
№ группы	Вакцина	Смертность	Процент
1	MSV-p80	2 из 50	4%
2	MSV-p80	1 из 50	2%
3	L-1148(p101)	6 из 50	12%
4	1449-2(p18)	11 из 50	22%
5	Контроль - один лишь разбавитель	0 из 50	0%

Результаты исследования яйцевода сведены в таблицу 11.

Таблица 11 Патологоанатомическое исследование яйцеводов
Группа	Вакцина	Время проведения вакцинации	Кистозно-апластические яйцеводы	процент
1	MSV-p80	День вылупления из яйца	6 из 48	12,5%

2	MSV-p80	В возрасте 7 дней	0 из 49	0%
3	L-1148(p101)	День вылупления из яйца	4 из 43	9,3%
4	1449-2(p18)	День вылупления из яйца	2 из 39	5,1%
5	Контроль - один лишь разбавитель	День вылупления из яйца	0 из 50	0%

В 1 группе 6 из 48 куриц (12,5%) имели кистозные яйцеводы и аплазию верхнего сегмента. Одна курица имела небольшую кисту диаметром 4,4 мм. Она располагалась близко к стенке и не влияла на тубулярную структуру яйцевода.

Во 2 группе все 49 оставшихся в живых куриц имели нормальный яичник и яйцевод. Одна курица имела небольшую кисту размером 2,4×4,1 мм. Она располагалась близко к яичнику, но она не влияла на тубулярную структуру яйцевода.

В 3 группе 4 из 43 (9,3%) куриц имели кистозные яйцеводы и аплазию верхнего сегмента.

В 4 группе 2 из 39 куриц (5,13%) имели кистозные яйцеводы и аплазию верхнего сегмента.

ОБСУЖДЕНИЕ

Относительно низкая смертность и низкая частота образования кистозно-апластических яйцеводов, наблюдаемых у птиц, вакцинированных изучаемыми вакцинами, указывает на то, что эти вакцины в большинстве случаев безопасны. Оказалось, что вакцина MSV-p80, введенная молодкам в возрасте 7 дней, имеет очень хороший профиль безопасности и соответствует требованиям безопасности Европейской фармакопеи.

Пример 6: ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗВРАЩЕНИЯ К ИСХОДНОМУ ВИРУЛЕНТНОМУ СОСТОЯНИЮ

ВВЕДЕНИЕ

Как указано в примере 5, IB-QX-подобный штамм L-1148(p80) был назван исходным вакцинным вирусом или «MSV-p80». В данном примере была исследована склонность MSV-p80 и его производного «MSV+1BP», полученного пассированием в обратном направлении, к возвращению к исходному вирулентному состоянию.

В данном примере были использованы следующие вакцины:

(А) IB-QX MSV-p80 (т.е. L-1148(p80)) в дозе 10^6,0 EID₅₀ на каждую курицу.

(В) Пассированный в обратном направлении IB-QX MSV-p80, полученный после 1 обратного пассажа в курицу («MSV+1BP») в дозе 10^6,0 EID₅₀ на каждую курицу. Методика пассажа в обратном направлении заключается в следующем: (i) 5-14-дневные курицы SPF были вакцинированы 0,1 мл глазных капель, содержащих 10^4,0 EID₅₀ на каждую дозу MSV-p80; (ii) Куриц умерщвляли через четыре дня после вакцинации, и была приготовлена суспензия слизистой трахеи; (iii) Вторая группа из 5-14-дневных куриц SPF была инокулирована трахеальной суспензией. Образцы слизистой трахеи были протестированы на наличие вируса методом ОТ-ПЦР и инокуляцией яиц. При первом обратном пассаже в курицу вирус был обнаружен методом ПЦР и при инокуляции яиц; однако ни одного вируса не было обнаружено при повторном обратном пассаже в курицу. Вирус, полученный из образцов слизистой трахеи при первом пассаже в курицу, был амплифицирован и обозначен MSV+1BP.

Всего 51 курица SPF в возрасте 1 дня была разделена на три группы и вакцинирована в соответствии со схемой исследования, показанной в таблице 12.

Таблица 12 Схема исследования
Группа	Количество кур	Вакцина	Доза	Объем
1	17	MSV-p80	106,0 EID50	0,1 мл
2	17	MSV+1BP	106,0 EID50	0,1 мл
3	6	Невакцинированные контроли	--	--

Вакцинация была проведена окулоназальным способом, где каждой курице вводили соответствующую вакцину объемом 0,1 мл (0,05 мл в каждый глаз).

Цилиарная активность эксплантатов трахеи была исследована на 5, 7 и 10 дни после вакцинации. Курицы были подвергнуты эвтаназии путем ингаляции 100% CO₂. Сразу же после смерти изымали трахею и промывали и хранили в физиологическом солевом растворе при 37°С до последующей обработки. Были сделаны поперечные срезы трахеи толщиной 0,6 мм, используя Mcllwain Tissue Chopper (Mickle Laboratory Engineering Co., Ltd., Surrey, UK). Поперечные срезы трахеи помещали в чашку Петри с 2 мл физиологического солевого раствора при 37°С. Цилиарная активность 3 срезов верхней части, 4 срезов средней части и 3 срезов нижней части трахеи была исследована при малом увеличении микроскопа. Все эксплантаты трахеи были исследованы в течение 2 часов после получения образцов. Активность ресничек была оценена по балльной шкале от 0 до 4, используя следующие определения:

БАЛЛ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

0 $$\begin{array}{cc}& \end{array}$$ Наблюдается активность ресничек во всем срезе трахеи.

1 $$\begin{array}{cc}& \end{array}$$ Наблюдается активность ресничек на более чем 67%, но на менее чем 100% среза трахеи.

2 $$\begin{array}{cc}& \end{array}$$ Наблюдается активность ресничек на 33%-67% трахеи.

3 $$\begin{array}{cc}& \end{array}$$ Наблюдается активность ресничек на менее чем 33%, но на более чем 0% среза трахеи.

4 $$\begin{array}{cc}& \end{array}$$ Не наблюдается активность ресничек на всем протяжении среза трахеи.

Куриц в каждой группе оценивали по (а) цилиарной активности эксплантатов трахеи, (b) общему анатомо-патологическому исследованию, (с) гистологии почек и (d) серологии. Цилиостаз был вычислен путем деления суммы балльных оценок срезов трахеи, на которых было выявлено прекращение активности ресничек, на количество куриц в группе. Для общего анатомо-патологического исследования было выполнено вскрытие каждой курицы с целью выявления какого-либо отклонения от нормы, которое могло быть связано с вакциной. Было выполнено гистологическое исследование фиксированной в формалине ткани почки, и результаты были записаны как: отсутствующий, слабовыраженный, умеренно выраженный или тяжелый нефрит. Для серологического анализа была выполнена нейтрализация сыворотки и твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) на сыворотках, полученных от десяти цыплят в возрасте одного дня.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Клинические признаки.

За время исследования не было выявлено никаких клинических признаков, связанных с MSV-p80 или MSV+1BP. Однако один цыпленок, вакцинированный MSV-p80, умер через 2 дня после вакцинации. При вскрытии были обнаружены трахеит и пневмония. Причина смерти была определена как асфиксия вследствие большого количества слизи в трахее. Инфекционный бронхит не рассматривался как вероятная причина смерти, поскольку ни у одного другого цыпленка не было выявлено каких-либо клинических признаков, и смерть наступила только через 2 дня после вакцинации, временного периода, намного меньшего инкубационного периода (4 дня) для IB.

2. Цилиарная активность.

Балльные оценки цилиостаза на 5, 7 и 10 дни после вакцинации представлены в таблице 13. За исключением 1 образца трахеи одного среза, не наблюдалось прекращение цилиарной активности ни в одном из образцов трахеи, собранных на 5 день после вакцинации. Однако на 7 и 15 дни наблюдали относительно небольшую степень прекращения цилиарной активности в обеих группах. Средняя балльная оценка цилиостаза составила 15 и 10 для MSV-p80 и MSV+1BP, соответственно.

3. Патологоанатомическое исследование и гистология трахеи и почек

Кроме некоторой неспецифической бледности почек не наблюдали никаких макроскопически видимых отклонений от нормы в трахее и почках. (Смотри таблицу 13). При гистопатологическом исследовании образцов почек наблюдали некоторую лимфоцитарную инфильтрацию. По отсутствию других поражений (зернистая дистрофия, вакуолизация и десквамация тубулярного эпителия и отсутствие выраженной гетерофильной инфильтрации) предположили, что наблюдаемая лимфоцитарная инфильтрация, вероятнее всего, была вследствие инициации иммунного ответа.

Таблица 13 Балльные оценки цилиостаза
Вакцина	Балльная оценка цилиостаза дни после вакцинации	Трахея (макроскопия)	Почки
5	7	10	Среднее	Макроскопия	Нефрит
MSV+1BP	0,0	14,8	16,4	10	Нормальная	Нормальные	Отсутствует
MSV-p80	0,2	37,4	8,4	15	Нормальная	Нормальные	Отсутствует
Нет	0,0	0,0	0,2	0	Нормальная	Нормальные	Отсутствует

4. Серология

Никаких антител к вирусу инфекционного бронхита не было выявлено в предварительной сыворотке (данные не показаны).

ОБСУЖДЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Среднее значение балльных оценок цилиостаза для кур, вакцинированных как MSV-p80, так и MSV+1BP, было менее 25, и ни у одной курицы не было выявлено характерных клинических признаков птичьего инфекционного бронхита. Пришли к выводу, что MSV-p80 (т.е. L-1148(p80)) безопасен для дыхательных путей и почек и соответствует стандартным требованиям. Более того, нет никаких факторов, свидетельствующих о повышении вирулентности MSV-p80 после пассажа в обратном направлении в курицах.

Пример 7: ЭФФЕКТИВНОСТЬ И МИНИМАЛЬНАЯ ЗАЩИТНАЯ ДОЗА IB-QX-ПОДОБНЫХ ВАКЦИН

ВВЕДЕНИЕ

В данном примере была определена минимальная защитная доза четырех различных IB-QX-подобных вакцин в курицах, зараженных вирулентным IB-QX-подобным вирусом.

Следующие живые вакцины были использованы в данном примере:

(1) MSV-p80, пассированный дополнительные два раза, упоминаемый в настоящем документе как «MSV-p80 X+2» (который, таким образом, в итоге был пассирован 82 раза);

(2) MSV-p80, пассированный дополнительные пять раз, упоминаемый в настоящем документе как «MSV-p80 X+5» (который в итоге был пассирован 85 раз);

(3) штамм L-1148, пассированный 101 раз, упоминаемый в настоящем документе как L-1148(p101); и

(4) штамм 1449-2, пассированный 19 раз, упоминаемый в настоящем документе как 1449-2(p19).

Всего 208 здоровых SPF-цыплят в возрасте одного дня были использованы в данном исследовании. Цыплят вакцинировали различными дозами вышеуказанных вакцин с помощью крупнодисперсного спрея (используя коммерчески доступное распыляющее устройство для цветов). Через 21 день после вакцинации цыплят заражали 10^4,0 EID₅₀ вирулентного IB-QX-подобного штамма D388 в виде глазных капель (0,05 мл в каждый глаз). Через пять дней после заражения была определена цилиарная активность в эксплантатах трахеи в 20 цыплятах. Осуществляли забор крови в день вакцинации и на 21 день после вакцинации. План исследования сведен в таблицу 14.

Таблица 14 План исследования
Группа	Вакцина	Количество в дозе	Коли- чество	События (день жизни)
1	21	26
1	MSV-p80 X+2	103,0 EID50	22	Вакцинация и серология	Заражение (n=20) и серология	CST и взятие образцов почек и трахеи
2	MSV-p80 X+5	102,7 EID50	22
3	MSV-p80 X+5	103,0 EID50	22
4	MSV-p80 X+5	103,3 EID50	22
5	MSV-p80 X+2	103,3 EID50	22
6	1449-2(p19)	103,3 EID50	22
7	L-1148(p101)	103,3 EID50	22
8	Невакцинированная/ зараженная	Нет данных	22	Серология
9	Невакцинированная/ незараженная	Нет данных	22	Серология	Серология

Цилиарная активность эксплантатов трахеи была исследована у 20 цыплят через 5 дней после заражения. Цыплятам была проведена эвтаназия, и сразу же после смерти трахею извлекали, промывали и хранили в физиологическом солевом растворе при 37°С до последующей обработки. Небольшие поперечные срезы трахеи были нарезаны вручную. Цилиарная активность трех срезов верхней части, четырех срезов средней части и трех срезов нижней части трахеи была исследована микроскопией с малым увеличением. Цилиарная активность была оценена в баллах, используя следующие критерии классификации:

БАЛЛ КРИТЕРИИ

0 $$\begin{array}{cc}& \end{array}$$ Как минимум на 50% среза трахеи наблюдали цилиарную активность.

1 $$\begin{array}{cc}& \end{array}$$ Менее чем на 50% среза трахеи наблюдали цилиарную активность.

Для данного конкретного среза трахеи цилиарную активность считали нормальной, когда, как минимум, на 50% (0 баллов) внутреннего кольца наблюдали интенсивное движение ресничек. Цыпленка считали не затронутым заболеванием, если не менее чем в 9 из 10 колец наблюдали нормальную цилиарную активность. Испытание считалось недостоверным, если срезы трахеи микроскопически исследовали более 2 часов после взятия образца трахеи.

Вскрытие каждого цыпленка было выполнено на 5 день после заражения с целью выявления какого-либо отклонения от нормы в почках, которое могло быть результатом инфекции IBV. Были использованы следующие критерии для балльной оценки макроскопических данных в почках: нормальные=n.a.; отечные, бледные или кристаллы уратов=1.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Клинические признаки после вакцинации

Результаты исследования цилиарной активности и общего анатомо-патологического исследования сведены в таблицу 15.

Таблица 15 Результаты анализа движения ресничек и другие наблюдения
Группа	Вакцина	Количество в дозе	Защищенные/ Общее количество (%)	Другие наблюдения
Почки	Трахея
1	MSV-p80 X+2	103,0 EID50	18/19 (95)	нет	нет
2	MSV-p80 X+5	102,7 EID50	0/20 (0)	нет	нет
3	MSV-p80 X+5	103,0 EID50	17/20 (85)	нет	нет
4	MSV-p80 X+5	103,3 EID50	17/20 (85)	нет	нет
5	MSV-p80 X+2	103,3 EID50	18/20 (90)	нет	нет
6	1449-2(p19)	103,3 EID50	20/20 (100)	1/20*	нет
7	L-1148(p101)	103,3 EID50	13/20 (65)	нет	нет
8	Невакцинированная/ зараженная	N/A	0/20 (0)	нет	нет
9	Невакцинированная/ незараженная	N/A	20/20 (100)	нет	нет
*У одного из цыплят были поражения почек.

Результаты, представленные в таблице 15, показывают, что вакцина MSV-p80 является эффективной при условии использования дозы 10^3,0 EID₅₀. Доза 10^2,7 EID₅₀ не обеспечивала защиту. Было небольшое, незначительное различие в защите, обеспечиваемой MSV-p80 X+2 и MSV-p80 X+5; X+2 обеспечивал несколько лучшую защиту, чем Х+5 в данном исследовании. Штамм L-1148(p101) обеспечивал меньшую защиту, чем пассажи более низкого уровня.

ВЫВОД

Данный пример дополнительно демонстрирует безопасность и эффективность вакцин, полученных из IB-QX MSV-p80.

Пример 8: РАСПРОСТРАНЕНИЕ АТТЕНУИРОВАННОГО IB QX МЕЖДУ КУРИЦАМИ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В ОРГАНИЗМЕ

ВВЕДЕНИЕ

В данном примере проведено исследование распределения аттенуированного IB QX вакцинного штамма IB-QX MSV-p80 в организме и путь передачи IB-QX MSV-p80 невакцинированным курицам.

План исследования

1. Животные

Всего 165 SPF-куриц были разделены на группы, представленные в таблице 16. Куриц содержали в соответствии со стандартными методиками. Еда и вода были предоставлены без ограничений. За всеми курицами вели наблюдение на предмет выявления клинических признаков на протяжении исследования.

Таблица 16 Животные
Группа	Возраст (n)	Описание
1	1 день (55)	Вакцинировали дозой 105,0 EID50 IB-QX MSV-p80 на одну курицу. 30 куриц добавили во 2 группу куриц через три дня после вакцинации
2	7 дней (35)	Невакцинированные курицы
3	14 дней (35)	Невакцинированные курицы (добавлены во вторую группу на 14 день после вакцинации 1 группы).

4	1 день (30)	Невакцинированные курицы (добавлены во 2 группу на 7 день после вакцинации 1 группы).
5	1 день (10)	Использовали для забора крови

2. Методы

2.1 Вакцинация

Одна ампула IB-QX MSV-p80, содержащая 10^8,2 EID₅₀, была разведена в 157,5 мл буфера и использована в течение 2 часов с момента приготовления. 1 группа куриц в возрасте одного дня была вакцинирована 0,1 мл разбавленного вируса в виде глазных капель (10^5,0 EID₅₀ IB-QX MSV-p80 на каждую курицу). После вакцинации образцы используемых вакцин хранили при -50°С. Было выполнено обратное титрование для определения титра вируса в применяемой вакцине. Оказалось, что применяемая вакцина содержит 10^6,07 EID₅₀ IB QX в мл, что соответствует дозе 10^5,07 EID₅₀ на каждую курицу.

2.2 План исследования

Группа 1 куриц была вакцинирована IB-QX MSV-p80. Через три дня после вакцинации 30 вакцинированных куриц из группы 1 были добавлены в изолятор, содержащий 35 невакцинированных куриц из группы 2 того же возраста и происхождения. Через семь дней после вакцинации группа из 30 невакцинированных куриц из группы 4 была добавлена в изолятор. На 14 день после вакцинации 35 невакцинированных куриц из группы 3 того же возраста и происхождения, что и вакцинированные курицы, были добавлены в изолятор. Через равные промежутки времени умерщвляли по 2 курицы из каждой 2-4 группы ингаляцией 100% СО₂, и были забраны образцы из бурсы, двенадцатиперстной кишки, легкого, почки, поджелудочной железы и трахеи для определения наличия IBV.

IBV определяли в образцах органов иммуногистохимическим окрашиванием на эпитоп 48,4 IBV (ядерный белок) фиксированных в формалине образцов. После умерщвления курицы были взяты мазки из клоаки и ротоглотки.

Наличие IB QX в мазках определяли методом ПЦР, используя набор реактивов для SuperScriptTM III одноэтапного кОТ-ПЦР производства Invitrogen. ПЦР-смеси содержали 25 мкл 2х смеси, 18 мкл воды, 1 мкл Taq ДНК-полимеразы platinum, 2 мкл прямого праймера, 2 мкл обратного праймера и 2 мкл матрицы (РНК). Были использованы следующие праймеры:

Общепринятые праймеры к IBV

SX3+A/B прямой 5'-TAATACTGGYAATTTTTCAGATGG-3' (SEQ ID NO:5)

SX4 - обратный 5'-AATACAGATTGCTTACACCACC-3' (SEQ ID NO:6)

Специфичные для IB QX праймеры

Alg-QX-139 прямой 5'-GCTTATGCAGTAGTCAAT-3' (SEQ ID NO:7)

Alg-QX-394 обратный 5'-CACGTGGAATCATGCCTGTTAT-3'(SEQ ID NO:8)

РНК из трахеи использовали в качестве матрицы. Вирус использовали в качестве положительного контроля.

ОТ-ПЦР была проведена в соответствии со следующей программой:

1. 30 мин 50°С

2. 10 мин 95°С

3. 30 сек 95°С

4. 30 сек 50°С

5. 45 сек 72°С, этапы 3-5 выполняют 40 циклов

6. 7 мин 72°С

7. 5 мин 4°С

Продукты ОТ-ПЦР анализировали электрофорезом в агарозном геле.

Осуществляли забор образцов крови у 10 цыплят в возрасте 1 дня и на 21 день исследования у 10 цыплят каждой группы 1, 2, 3 и 4. Образцы крови были собраны путем декапитации цыплят в возрасте 1 дня или путем прокола вены крыла. Титры антител были определены с помощью набора реактивов Flockchek^TM IBV antibody test kit, имеющегося в наличии в IDEXX, США, или набора реактивов Flockscreen^TM IB-HI kit производства X-Ovo, Франция.

3. Результаты

Результаты сведены в таблицу 17.

Таблица 17

	Дни после вакцинации
Группа	Метод	Орган	2	4	7	9	11	14	16	18	21	23
1	Иммуно- гисто- логия	бурса	-	-	-	-	-	-	-
		Двенадцатиперстная кишка	-	-	-	-	-	-	-
		Легкое	-	-	-	-	-	-	-
		Почка	-	-	-	-	-	-	-
		Поджелудоч- ная железа	-	+	-	-	-	-	-
	Трахея	-	+	+	+	+	-	-
ПЦР	Мазок из клоаки	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
		Мазок из гортани	+	+	+	-	+	-	-	-	-	-

	Дни после первого контакта с вакцинированными курицами
Группа	Метод	Орган	1	4	6	8	11	13	15	18	20
2	Иммуно- гисто- логия	бурса	-	-	-	-	-	-	-
		Двенадцатиперстная кишка	-	-	-	-	-	-	-
		Легкое	-	-	-	-	-	-	-
		Почка	-	-	-	-	-	-	-
		Поджелудоч- ная железа	-	-	-	-	+	-	-
	Трахея	-	-	-	+	-	-	-
	ПЦР	Мазок из клоаки	-	-	-	-	+	-	+	-	-
Мазок из гортани	-	+	+	-	-	-	+	-	-

	Дни после первого контакта с вакцинированными курицами
Группа	Метод	Орган	2	4	7	9	11	14
3	Иммуно- гисто- логия	бурса	-
Двенадцатиперстная кишка	-
		Легкое	-
		Почка	-
		Поджелудоч- ная железа	-
	Трахея	-
	ПЦР	Мазок из клоаки	-	-	-	-	-	-
Мазок из гортани	-	+	+	-	+	+

	Дни после первого контакта с вакцинированными курицами
Группа	Метод	Орган	2	4	7	9	11	14
4	Иммуно- гисто- логия	бурса	-	-	-	-
		Двенадцатиперстная кишка	-	-	-	-
		Легкое	-	-	-	-
		Почка	-	-	-	-
		Поджелудоч- ная железа	-	-	-	-
	Трахея	-	-	-	+
ПЦР	Мазок из клоаки	+	-	-	-	-	-
		Мазок из гортани	-	-	-	+	-	+

Никаких респираторных признаков или других клинических признаков, указывающих на IB, не было выявлено за время исследования. Один цыпленок в группе 2 умер вследствие воспаления в желточном мешке. Один цыпленок в группе 1 умер вследствие каннибализма. Для серологических анализов были проведены тесты ингибирования гемагглютинации (HI) с антигеном IB 793B, поскольку антиген IB QX не обеспечивал хорошую гемагглютинацию. Никаких антител IB не было обнаружено ни в одной сыворотке методом HI-теста или методом ELISA.

IHT-окрашивание выявило IB QX в трахеях цыплят с 4-11 день и в поджелудочной железе на 4 день и 11 день после первого контакта с вирусом. IHT-окрашивание не выявило IB QX в бурсе, двенадцатиперстной кишке, легких и почках.

Наличие IB QX было выявлено методом IHT-окрашивания и ПЦР мазков из гортани и клоаки, взятых из всех групп. IB был обнаружен методом ПЦР в мазках клоаки и гортани с 2-15 день после первого контакта с IB QX. Мазки из гортани были положительными на IB QX чаще, нежели мазки из клоаки.

4. Обсуждение

4.1 Диссеминация

Выявление IB QX в трахее было предсказуемым, поскольку верхние дыхательные пути являются основным сайтом репликации IBV. Впоследствии происходит вирусемия, и вирус диссеминирует в другие ткани. Это было продемонстрировано обнаружением IB QX в поджелудочной железе. Несмотря на то, что IBV является, главным образом, эпителиотропным вирусом, IB QX при 80 уровне пассажа не смогли обнаружить в почках или легких, предполагая, что эти органы были очищены от вируса при введенной дозе вакцины, равной 10^5,0 EID₅₀ на каждую курицу. В исследованиях безопасности с использованием IB QX на том же уровне пассажа, при котором были вакцинированы курицы дозой, равной 10^6,0 EID₅₀ IB QX на каждую курицу, вирус был обнаружен в почках и легких в течение 10 дней после вакцинации. В настоящем исследовании IB QX был обнаружен в трахее в течение 11 дней и в гортани в течение 15 дней. По литературным данным выявлен IB, который может быть определен в трахее в течение 5-10 дней после инфицирования во время клинической фазы и в течение периода длительностью до 28 дней после инфицирования в трахее. Несмотря на обнаружение IB QX в поджелудочной железе, не наблюдали никаких отклонений от нормы при общем анатомо-патологическом исследовании.

4.2 Распространение

Распространение IB QX было отчетливо продемонстрировано, ибо наличие IB QX было выявлено во всех невакцинированных группах.

4.3 Безопасность

IB QX при 80 уровне пассажа, применяемый в дозе 10^5,07 EID₅₀ на каждую курицу в виде глазных капель, не вызывал никаких связанных с вакциной клинических признаков после вакцинации. Никаких клинических признаков IB не было обнаружено у невакцинированных куриц, которые были инфицированы IB QX после контакта с вакцинированными курицами.

5. Выводы

После вакцинации размножение вируса IB-QX MSV-p80 происходит в трахее, и IB QX диссеминирует в другие органы. IB-QX MSV-p80 распространяется между курицами, как минимум, единожды. IB-QX MSV-p80 и вакцина, пассируемые между группами, безопасны.

Пример 9: КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНАЦИЯ С ВАКЦИНАМИ IB MM И IB QX

Эффективность комбинированной вакцинации с вакцинами IB MM и IB QX была протестирована на SPF-курицах. Куриц вакцинировали вакциной Poulvac IBMM (Fort Dodge Animal Health) на 0 день и на 14 день живой вакциной IB QX. Вакцинированные курицы были заражены IB штаммом IT02 на 14 день и IB штаммом 793В на 35 день. Результаты вакцинации были определены путем анализа тестов на цилиостаз (CST) срезов трахеи и выявления патологии почек. Вакцинированные курицы были полностью защищены от заражения штаммами IT02 и 793.

Краткое изложение протокола соответствующей вакцинации и результаты представлены в таблице 18.

Таблица 18
	Вакцинация
	1 день	14 день	Заражение	CST	Поражения почек
1	IB MM	IB QX	IB 793B	0	0,8
2	IB MM	IB QX	IB IT 02	0	0,0
3	IB праймер	IB QX	IB 793B	0	0,0
4	Нет	Нет	IB IT 02	19,8	0,0
5	Нет	Нет	IB 793B	29,4	0,8
6	Нет	Нет	Нет	0	0,0
7	IB праймер + IB QX	Нет	IB 793B	2,5	0,8
8	Нет	Нет	IB 793B	0	1,2
9	Нет	Нет	Нет	0	0,0

Хотя вышеизложенное изобретение было описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров для ясности понимания, данное изобретение не ограничивается представленными частными вариантами осуществления изобретения, а предполагает охватывать все изменения и модификации в рамках сущности и объема изобретения, как определено прилагаемыми пунктами формулы изобретения.

Все публикации и патенты, упоминаемые в спецификации, свидетельствуют об уровне компетентности специалистов в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Все публикации и патенты включены в настоящий документ в качестве ссылки так, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были конкретно и индивидуально указаны для включения в качестве ссылки.

1. Вакцинная композиция для защиты птицы от QX-подобного вируса инфекционного бронхита (IB), включающая: (i) живой аттенуированный QX-подобный вирус инфекционного бронхита (IB), имеющий белок S1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO. 1, и полученный посредством пассирования на яйцах домашней птицы с развивающимися эмбрионами от 25 до 80 раз; и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.

2. Вакцинная композиция по п. 1, дополнительно включающая по меньшей мере один адъювант.

3. Вакцинная композиция по п. 1, дополнительно включающая по меньшей мере один дополнительный живой аттенуированный вирус IB.

4. Вакцинная композиция по п. 3, где указанный по меньшей мере один дополнительный живой аттенуированный вирус IB выбран из группы, состоящей из 793В, Massachusetts, ltaly-02, D274, Arkansas, D1466, В1648 и Georgia-98.

5. Вакцинная композиция по п. 1, где указанный вирус представляет собой штамм L-1148.

6. Вакцинная композиция по п. 1, где указанный вирус представляет собой штамм 1449-2 или 1449-10.

7. Вакцинная композиция по п. 1, где белок S1 включает аминокислотную последовательность SEQ NO NO: 2.

8. Вакцинная композиция по п. 1, где белок S1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.

9. Способ защиты птицы от QX-подобного вируса инфекционного бронхита (IB), включающий введение вакцины по любому из пп. 1-8 указанной птице в диапазоне от приблизительно 10³ TCID₅₀ на указанную птицу до приблизительно 10^5,07 TCID₅₀ на указанную птицу.

10. Способ по п. 9, включающий введение приблизительно 10⁵ TCID₅₀ на указанную птицу.

11. Способ по п. 9, где указанная птица является курицей.

12. Способ по п. 9, где указанную вакцину вводят в виде глазных капель или в виде спрея.