Противоопухолевое средство
Владельцы патента RU 2569729:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" (ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина") (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения Российской академии наук (ИОС УрО РАН) (RU)
Изобретение относится к фармацевтике, в частности к противоопухолевому средству, содержащему Nδ-нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин, поливинилпирролидон низкомолекулярный Mm=7000-11000 и кислоту хлористоводородную. Осуществление изобретения позволяет получить противоопухолевое средство из класса НАМ, удобное в употреблении, обладающее хорошей растворимостью, стабильностью при хранении и обладающее высоким цитостатическим эффектом. 3 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным средствам, обладающим противоопухолевым действием, и может найти применение при лечении злокачественных опухолей.
Известны лекарственные средства для лечения злокачественных опухолей из ряда нитрозоалкилмочевины (НАМ), которые широко применяются в современной онкологии [Полозкова С.А., Орел Н.Ф., Маркович А.А., Кузьминов А.Е., Горбунова В.А. / Злокачественные опухоли. №1 - 2013 (5) С. 47-55].
Так, при лечении опухолей центральной нервной системы (ЦНС) широко применяются препараты, относящиеся к алкилирующим агентам, - это НАМ, а также ее производные: ломустин, кармустин, нидран, мюстафоран [Дементьева Н.П., Корман Д.Б. / Вопросы онкологии. 2001. Т. 47. №6. С. 3-11], [Горбунова В.А., Орел Н.Ф. / Эффективная фармакотерапия. 2010. №2. С. 30-33].
Направленность действия препаратов данной группы объясняется не только способностью присоединяться ко многим веществам путем реакции алкилирования, но прежде всего способностью НАМ и ее производных проникать через гематоэнцефалический барьер [Перетолчина Н.М., Герасимова Г.К., Белоусова А.К. и др. / В кн. "Экспериментальная онкология на рубеже веков" // Ред. М.И. Давыдов, А.Ю. Барышников. - М.: Издательская группа РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2003. С. 147-160].
Отличительной чертой производных НАМ от других алкилирующих агентов является отсутствие перекрестной устойчивости по отношению к другим препаратам этой же группы, а также липофильность и миелосупрессивное действие. Препараты НАМ широко используются в клинической практике. Они обладают высокой терапевтической активностью, широким спектром противоопухолевого действия и применяются в комбинированной терапии опухолей (диссеминированной меланомы, мелкоклеточной карциномы легких, опухолей мозга и лимфом) [Горбунова В.А., Орел Н.Ф., Егоров Г.Н. Этюды химиотерапии. Юбилейный сборник, посвященный 40-летию отделения химиотерапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН / Под редакцией проф. В.А. Горбуновой. - Москва. - 2000. - С. 22-47].
Известно производное НАМ: лизомустин в виде «Лизомустина лиофилизата для приготовления раствора для инфузий 100 мг» [Краснов В.П., Авдюкова Н.В., Клочкова Т.И. и др. / Аналитика и контроль. 2001. Т.5. №2. С. 168-170], [Перетолчина Н.М., Клочкова Т.И., Михайлова Л.М. и др. / Практическое пособие для онкологов и врачей. 2000. С. 22].
Недостатки лизомустина:
1. Выраженная токсичность.
2. Высокая доза вводимого препарата.
3. Низкий спектр терапевтического действия.
Известно средство - Nδ-нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин - производное НАМ (Патент РФ №2503657), обладающее противоопухолевым действием.
Данное средство принято в качестве прототипа.
Недостатки прототипа:
1. Плохая растворимость.
2. Невозможность автоматического дозирования.
3. Нестабильность растворов.
Задачей настоящего изобретения является создание нового отечественного противоопухолевого средства из класса НАМ, удобного в употреблении, обладающего хорошей растворимостью, стабильного при хранении и обладающего высоким цитостатическим эффектом.
Технический результат:
1. Хорошая растворимость.
2. Стабильность при хранении.
3) Расширение спектра отечественных противоопухолевых препаратов из класса НАМ.
Поставленная задача достигается тем, что создано новое противоопухолевое средство, содержащее:
Nδ-Нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин; поливинилпирролидон низкомолекулярный Mm=7000-11000 (ПВП) и кислоту хлористоводородную при следующем соотношении компонентов (мг):
| Nδ-Нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин | 112,5-137,5 |
| ПВП | 270,0-330,0 |
| Кислота хлористоводородная | 14,4-17,6 |
Пример 1
| Nδ-Нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин | 112,5 |
| ПВП | 270,0 |
| Кислота хлористоводородная | 14,4 |
Пример 2
| Nδ-Нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин | 125,0 |
| ПВП | 300,0 |
| Кислота хлористоводородная | 16,0 |
Пример 3
| Nδ-Нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин | 137,5 |
| ПВП | 330,0 |
| Кислота хлористоводородная | 17,6 |
Способ получения заявляемого средства
Nδ-Нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин растворяли в 0,1 М кислоте хлористоводородной, добавляли ПВП (6%), проводили стерилизующую фильтрацию, разливали по 5,0 мл во флаконы вместимостью 20 мл, подвергали сублимации: кассеты с флаконами помещали в камеру сублимационной установки на предварительно охлажденные полки для замораживания и последующей лиофилизации. Температура полки при загрузке не превышала (-40) - (-45)°С.
При достижении температуры (-40) - (-45)°С продукт выдерживали в течение 3 часов.
Повышение температуры полок до -20°С проводили после включения и выравнивания вакуума со скоростью 2°С в час и далее до +20°С со скоростью 5°С в час. Температура препарата при досушивании не превышала +20°С. Продолжительность досушивания составила 3 часа.
Общее время сушки препарата составило 27,5-28 часов.
По окончании процесса сушки вакуум в сублимационной камере гасили чистым профильтрованным стерильным воздухом, пропущенным через патрон с безводным силикагелем и стерильным воздушным фильтром с размером пор 0,22 мкм.
Сравнение цитотоксического действия заявляемого средства и прототипа
Исследование in vitro проводили на клеточных линиях диссеминированной меланомы человека Mel Kor и Mel Z, аденокарциномы молочной железы MCF-7; карциномы легкого А549; карциномы толстой кишки НСТ-116; нейробластомы человека SH-SY5Y; Т-клеточного лимфобластного лейкоза Jurkat.
Клеточные линии культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10мМ HEPES (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 40 нг/мл гентамицина (ICN, США), 0,1% 1000х раствора аминокислот и 0,1% 1000х раствора витаминов (ПанЭко, Россия), при t°=37°С в атмосфере 5% СO2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для открепления адгезионных клеточных культур от пластика использовали раствор Версена. Клетки отмывали жидкостью чистой бессывороточной среды RPMI-1640 и пересаживали в 96-луночные плоскодонные планшеты по 4 тыс. клеток в 180 мкл полной среды RPMI-1640 на лунку. Суспензионную клеточную культуру Jurkat снимали без использования раствора Версена и сажали в плоскодонные планшеты в количестве 25 тыс. клеток на лунку в 180 мкл полной среды RPMI-1640.
Через сутки в лунки с клетками добавляли по 20 мкл заявляемого средства и прототипа в различных концентрациях. Планшеты с клетками помещали в инкубатор при t°=37°С 5% СО2. В качестве контроля использовали лунки с клетками, в которые добавляли 20 мкл среды.
Через 24, 48 или 72 ч в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ[3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5 дифенилтетразолий бромид] (маточный раствор 5 мг/мл) и инкубировали 4 ч при t°=37 °С в 5% СО2-инкубаторе.
После образования формазана планшеты с клетками центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли. Осадок растворяли, добавляя в лунки по 200 мкл диметисульфоксида. Планшеты помещали на 5-7 минут в термостат при t°=37°С, затем - в шейкер. Интенсивность окрашивания среды измеряли на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «АИФР-01 Униплан» (ЗАО «Пикон») при λ=530 нм. Величина поглощения была прямо пропорциональна числу живых клеток.
Выживаемость клеток рассчитывалась по формуле:
Все эксперименты повторяли не менее трех раз.
Цитотоксическую активность оценивали по ИК50-концентрации, при которой происходит подавление роста 50% клеток.
Изобретение иллюстрируется таблицами 1-3, где приводятся результаты сравнения цитотоксического и противоопухолевого действия заявляемого средства и прототипа на используемые в исследовании клеточные линии и модели опухолей животных.
На линии клеток Mel Коr максимальный цитотоксический эффект наблюдался для заявляемого средства и прототипа при 72 ч инкубации с самой высокой дозой 1×10-3 М при 10% выживших клеток. ИК50 для прототипа при инкубации в течение 24 ч и 48 ч в исследуемых концентрациях не найдена, при инкубации в течение 72 ч она составила 5х10-4 М. При инкубации в течение 72 ч она составила 1х10-4 М (табл.1).
На клеточной линии Mel Z максимальный цитотоксический эффект наблюдался для заявляемого средства и прототипа при 72 ч инкубации с самой высокой исследованной дозой 5×10-3 М и составил 10% выживших клеток. ИК50 - для прототипа при инкубации в течение 24 ч и 48 ч в исследуемых концентрациях не найдена, при инкубации в течение 72 ч она составила 5×10-4 М. ИК50 для заявляемого средства при инкубации 24 ч составила 5×10-4 М, при инкубации 48 ч - 2,5×10-4 М, при инкубации в течение 72 ч- 1×10-4 M (табл. 1).
При 72 ч инкубации ИК50 для заявленного средства на клеточной линии MCF-7 составила 5×10-4 М, на клеточной линии А549 - 7×10-4 М, на клеточной линии НСТ-116 - 5×10-4 М, на клеточной линии SH-SY5Y - 1×10-4 М и на клеточной линии Jurkat - 4×10-4 М. Тогда как для прототипа на всех клеточных линиях ИК50 была более высокой: на MCF-7 - 7×10-4 М, на А549 - 7×10-3 М, на НСТ-116 и Jurkat - 9×10-4 М и на SH-SY5Y - 5×10-4 М (табл. 1).
Показано, что заявляемое средство в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций по сравнению с прототипом оказывает более выраженное цитотоксическое действие на клетки диссеминированной меланомы человека, аденокарциномы молочной железы человека, карциномы легкого человека, карциномы толстой кишки человека, нейробластомы человека и Т-клеточного лимфобластного лейкоза человека.
Сравнение противоопухолевого действия заявляемого средства и прототипа in vivo
Исследование противоопухолевой активности заявляемого средства и прототипа проводили при внутривенном введении стандартным животным: самкам мышей гибридов BDF1 (С57l/6j×DBA/2) массой 18-20 грамма, полученным из питомника ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» в соответствии с этическими аспектами проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. Все мыши были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества о состоянии здоровья. мышей содержали в специальных просторных клетках по 5 особей при температуре воздуха 20-23°С и относительной влажности 60-65% в условиях естественного освещения и принудительной вентиляции на подстилке из древесных стружек, стерилизованных в сухожаровом шкафу. Для кормления животных использовали стандартный промышленный и сертифицированный брикетированный корм для грызунов с установленным сроком годности. Кормление проводили в одно и то же время.
Для оценки противоопухолевой активности в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» использовали лимфолейкозы Р-388 и L-1210 мышей и рак шейки матки РШМ-5. Лечение лейкозов начинали через 24 часа, а рака шейки матки через 48 часов после перевивки.
Группы формировались с учетом получения статистически достоверных результатов: контрольная группа состояла из 12 мышей, опытные группы - из 8 или 9 животных.
Критериями оценки противоопухолевого эффекта служили: торможение роста опухоли (ТРО,%), увеличение продолжительности жизни (УПЖ,%) опытных мышей по сравнению с контрольными и излечение.
После однократного внутривенного введения заявляемого средства на модели лимфолейкоза мышей Р-388 в диапазоне доз от 50 мг/кг до 125 мг показана зависимость терапевтического эффекта от дозы. При введении заявляемого средства в дозе 50 мг/кг у мышей с лимфолейкозом Р-388 УПЖ составляло 90%, в дозе 100 мг/кг - 178% и излечение в 22% случаев, в дозе 125 мг/кг - 174% и излечение в 33% случаев. Прототип был эффективен в более высокой дозе - 150 мг/кг, УПЖ составило 178% и излечение 44% случаев (табл.2).
После однократного внутривенного введения заявляемого средства в диапазоне доз от 50 мг/кг до 125 мг/кг на модели лимфолейкоза L-1210 также выявлено, что терапевтический эффект увеличивался при возрастании дозы, в дозе 100 мг/кг УПЖ составило 244%, а излечение 50% случаев, в дозе 125 мг/кг УПЖ составило 346% и излечение в 67% случаев. Тогда как применение прототипа в более высокой дозе 150 мг/кг вызывало УПЖ 196% и излечение в 67% случаев (табл. 2).
Показано, что заявляемое средство в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций по сравнению с прототипом оказывает более выраженное противоопухолевое действие на перевиваемые опухоли животных - лимфолейкоз Р-388 и L-1210 и рак шейки матки РШМ-5.
Противоопухолевое средство, содержащее Nδ-нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин, отличающееся тем, что оно содержит поливинилпирролидон низкомолекулярный Мm=7000-11000 (ПВП) и кислоту хлористоводородную при следующих соотношениях компонентов (мг):
| Nδ-Нитрозо-Nδ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин | 112,5-137,5 |
| ПВП | 270,0-330,0 |
| Кислота хлористоводородная | 14,4-17,6 |
