Получение (3as, 7ar)-гексагидроизобензофуран-1(3н)-она путем каталитического биологического расщепления диметилциклогексан-1,2-дикарбоксилата

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1(3Н)-она. Гидролизуют цис-диметилциклогексан-1,2-дикарбоксилат в присутствии фермента, полученного из немлекопитающих и имеющего последовательность SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 3, с получением (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты. Далее проводят восстановительную циклизацию (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты в присутствии C₁-C₆-алкилхлорформиата с последующим восстановлением боргидридом с получением (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1(3Н)-она. Изобретение позволяет получать целевой продукт с величиной энантиомерного избытка более 95%. 6 з.п. ф-лы, 3 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу получения (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1(3Н)-она 1, промежуточного продукта синтеза хлоргидрата (2S,3aR,7aS)-бензилоктагидро-1Н-индол-2-карбоксилата.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В известном способе синтеза используется эстераза печени свиньи. Было бы желательно заменить эстеразу печени свиньи, используемую согласно этому способу, ферментом, полученным из немлекопитающих. Кроме того, (1R,2S)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновая кислота 4, получаемая при таком биологическом расщеплении эстеразы печени свиньи, имеет величину е.е. всего 80%, что означает, что для получения материала с величиной е.е. >98% требуется обогащение соли. Альтернативный фермент, который бы обеспечивал продукт с более высоким е.е., тем самым устранив необходимость в стадии обогащения соли в ходе процесса, был бы более простым и снизил бы производственные затраты. К тому же использование иммобилизованного фермента облегчило бы регенерацию биокатализатора.

В различных патентных документах и журнальных статьях раскрыты способы получения оптически обогащенной 2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты. Катализируемое эстеразой печени свиньи биологическое расщепление диметилциклогексан-1,2-дикарбоксилата 2 описано в следующих работах: в патенте US 4879392; F.Brion et al., "Stereoselective Synthesis of a trans-Octahydroindole Derivative, Precursor of Trandolapril, an Inhibitor of Angiotensin Converting Enzyme (Стереоселективный синтез производного транс-октагидроиндола, предшественника трандолаприла, ингибитора ангиотензинпревращающего фермента)," Tetrahedron Letters, Vol.33, No. 34, p.4889-4892, 1992; R.M. Borzilleri et al., "Total Synthesis of the Unusual Marine Alkaloid (-)-Papuamine Utilizing a Novel Imino Ene Reaction (Общий синтез нетипичного морского алкалоида (-)-папуамина с использованием новой имино-еновой реакции)," Journal of the American Chemical Society, Vol.117, p.10905-10913, 1995.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы синтеза (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1-(3Н)-она формулы 1. Согласно одному из аспектов, настоящее изобретение обеспечивает способы получения (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты 3, интермедиата синтеза продукта 1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой перечень последовательностей для трех ферментов, идентифицированных как эстераза Chirotech Esterase K, эстераза Chirotech Esterase N и липаза Candida Antarctica Lipase.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы синтеза (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты 3, включающие ферментативный гидролиз цис-диметилциклогексан-1,2-дикарбоксилата 2.

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы получения (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1-(3Н)-она 1, включающие восстановительную циклизацию 3.

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы, в которых при ферментативном гидролизе используют композицию иммобилизованного фермента.

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы, в которых используют композицию иммобилизованного фермента, имеющую матрицу, поперечно сшитую, например, с помощью обработки глутаральдегидом.

Аспекты настоящего изобретения обеспечивают способы, согласно которым при ферментативном гидролизе используют фермент, такой как, не ограничиваясь этим, любая из липаз Chirotech Esterase K или Chirotech Esterase N (их последовательности, а также последовательность используемого нативного фермента CAL-B представлены на Фиг.1), Novozym™ 435, NZL-107 LYO и 42044 от компании Novozymes A/S, ICR-110 CALB от компании Codexis, CV-CALB и CALB-Y от компании Chiralvision и серинэстераза кутиназа. Могут быть использованы также смеси ферментов. Ферменты используют в любых физических формах, как, например, в виде их растворов и в виде их дисперсий в смолах, иммобилизующих ферменты.

К полезным ферментам относятся ферменты, получаемые из бактерии Candida antarctica, включая описанные в следующих работах: J. Uppenberg et al., "The Sequence, Crystal Structure Determination and Refinement of Two Crystal Forms of Lipase В from Candida Antarctica (Последовательность, определение кристаллической структуры и очистка двух кристаллических форм липазы В из бактерии Candida Antarctica)," Structure, Vol.2 (4), p.293-308, 1994; и J. Uppenberg et al., "Crystallographic and Molecular-Modeling Studies of Lipase В from Candida Antarctica Reveal a Stereospecifity Pocket for Secondary Alcohols (Кристаллографические исследования и молекулярное моделирование липазы В из бактерии Candida Antarctica, проявляющей карман стереоспецифичности для вторичных спиртов"), Biochemistry, Vol.34 (51), р.16838-16851, 1995.

Варианты осуществления настоящего изобретения представляют способы, в соответствии с которыми при ферментативном гидролизе используют фермент Novozym™ 435.

Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы, при которых концентрация субстрата составляет приблизительно 10-200 г/л.

Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы, при которых концентрация субстрата составляет по меньшей мере приблизительно 75 г/л.

Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы, при которых ферментная нагрузка составляет приблизительно от 1% до 20% относительно массы субстрата.

Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы, при которых ферментная нагрузка составляет менее чем приблизительно 10% относительно массы субстрата.

Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы, при которых температура ферментативного гидролиза лежит в диапазоне приблизительно от 10°С до 50°С.

Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы, при которых температура ферментативного гидролиза составляет приблизительно 40°С.

Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы, при которых величина рН ферментативного гидролиза лежит в диапазоне приблизительно от 6 до 9.

Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы, при которых величина рН ферментативного гидролиза лежит в диапазоне приблизительно от 7 до 8.

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы, при которых гидролизный фермент добавляют непосредственно в реакционную емкость, извлекают с помощью фильтрации после завершения биологического расщепления, затем промывают свежим буферным раствором и добавляют в свежую порцию субстрата/буфера.

Согласно вариантам осуществления изобретения свежий буферный раствор является фосфатным буфером.

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы, при которых гидролизный фермент находится внутри колоночного реактора, раствор, к котором происходит биологическое расщепление, непрерывно циркулирует через колонну, после завершения биологического расщепления колонну промывают свежим буферным раствором и следующая порция субстрата/буфера может циркулировать через колонну.

Согласно вариантам осуществления, свежий буферный раствор является фосфатным буфером.

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы, при которых при восстановительной циклизации (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты (3) используют C₁-C₆-алкилхлорформиат с последующим восстановлением боргидридом.

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы, при которых C₁-C₆-алкилхлорформиат представляет собой этилхлорформиат.

Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способы, при которых боргидрид является боргидридом натрия.

Фермент Novozym™ 435 используют в данном описании в качестве примера для описания процесса ферментативного гидролиза. Этот продукт представляет собой иммобилизованную гранулированную липазу В из бактерии Candida antarctica, имеющую полимерную матрицу из макропористой акриловой смолы. Novozym 435 является ферментом немлекопитающих и может давать продукты с величиной е.е. 98%, тем самым устраняя необходимость в стадии обогащения соли в ходе процесса. Этот источник ферментов при проведении экспериментов регенерируют по меньшей мере восемь раз.

Согласно вариантам осуществления данного изобретения, (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1-(3Н)-он (1) получают сначала обработкой (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты (3) этилхлорформиатом с образованием промежуточного смешанного ангидрида с последующим восстановлением боргидридом натрия с образованием соответствующего сложного оксиэфира, который циклизуется in situ с образованием требуемого цис-лактонового продукта.

Катализируемое ферментом Novozym™ 435 биологическое расщепление диметилциклогексан-1,2-дикарбоксилата (2) продуцирует (1S,2R)-, а не (1R,2S)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновую кислоту. Однако восстановление кислотного, а не эфирного фрагмента на следующей стадии синтеза приводит к образованию цис-лактона с такой же стереохимией, как у лактона, получаемого при использовании эстеразы печени свиньи. Более того, биологическое расщепление приводит к образованию продукта со значительно более высоким значением е.е., чем известно в данной области техники (98% против 80%). Novozym™ 435 представляет собой иммобилизованный ферментный препарат, что позволяет регенерировать биокатализатор. Фермент немлекопитающего поддается регенерации и обеспечивает продукт с более высоким е.е. Это устраняет необходимость в проведении стадии обогащения соли для улучшения величины е.е. продукта.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

По отношению к соединениям настоящего изобретения используют следующие определения, за исключением случаев, когда контекст предполагает иное. Как правило, количество атомов углерода, присутствующих в определенной группе, обозначают "C_x-C_y", где x и y означают нижние и верхние пределы, соответственно. Например, группа, обозначенная как "C₁-C₆", содержит от 1 до 6 атомов углерода. Количество атомов углерода при использовании в данном контексте относится к основной углеродной цепи и к боковым углеродным цепям, но не включает атомы углерода заместителей, таких как алкоксильные заместители и тому подобное.

"Алкил" относится к углеводородной цепи, которая может быть прямой или разветвленной цепью, содержащей определенное количество атомов углерода. В отсутствии какого-либо числового обозначения "алкил" представляет собой цепь, прямую или разветвленную, содержащую от 1 до 6 (включительно) атомов углерода в ней. Примеры C₁-C₆-алкильных групп включают, не ограничиваясь этим, метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил, неопентил и изогексил.

"C₁-C₆-алкилхлорформиат" относится к соединению формулы R-O-C(O)-Cl, где R представляет собой C₁-C₆-алкильную группу.

"Боргидрид" является восстанавливающим агентом, который будет восстанавливать кислоту в присутствии эфира. Примеры этого включают, не ограничиваясь этим, боргидрид натрия, боргидрид цинка, диборан, ВН₃/ТГФ и 9-BBN (9-борбицикло[3.3.1]нонан).

Термин "е.е." означает энантиомерный избыток вещества, определяемый как абсолютная разность между мольными долями каждого энантиомера и выражаемый в процентах.

Материал, имеющийся в продаже как Celite™, представляет собой диатомовую землю, подвергнутую термо-щелочной обработке. Celite™ является зарегистрированным товарным знаком компании World Minerals Inc. ГХ означает газовую хроматографию. ЯМР - ядерная магнитно-резонансная спектроскопия. МТБЭ означает метил-трет-бутиловый эфир или 2-метокси-2-метилпропан. Novozym™ NZL-107 LYO представляет собой липазу грибного происхождения. Novozym™ 435 - иммобилизованная форма липазы В из бактерии Candida antarctica. Novozym™ является зарегистрированным товарным знаком компании Novozymes A/S, Novo Industri A/S Bagsvaerd DK-2880 Denmark. ЭПС означает эстеразу печени свиньи. Эстераза Chirotech Esterase K 310-903 катализирует стереоселективный гидролиз эфиров, особенно карбоксилатных эфиров. Эстераза Chirotech Esterase K 310-903 представляет собой рекомбинантный фермент, первоначально выделенный из грибов Ophiostoma. Эстераза Chirotech Esterase N 310-902 катализирует стереоселективный гидролиз эфиров, особенно карбоксилатных эфиров, и представляет собой рекомбинантный фермент, первоначально выделенный из грибов Ophiostoma.

Некоторые аспекты способа в соответствии с настоящей заявкой будут более подробно разъяснены со ссылкой на следующие Примеры 1 и 2, представленные исключительно в иллюстративных целях и не предназначенные для какого-либо ограничения объема изобретения.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Получение (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты (3)

В колбу емкостью 100 мл с рубашкой помещали диметилциклогексан-1,2-дикарбоксилат (2, 4 г, 20 ммоль) и 39 мл 0,1М буферного раствора фосфата калия, рН 8. Смесь непрерывно перемешивали при температуре 40°С и добавляли Novozym™ 435 (320 мг). Перемешивание продолжали при температуре 40°С в течение 43 часов, после чего величину рН доводили до 8 добавлением 2М раствора NaOH. Образец реакционной массы анализировали с помощью ГХ для подтверждения того, что остается менее 5% исходного вещества. Реакционную смесь фильтровали для удаления фермента и фильтрат экстрагировали толуолом (20 мл) для удаления всех остатков исходного вещества. Величину рН водной фазы доводили до 3,5 с помощью 2М раствора HCl и затем экстрагировали 2×50 мл МТБЭ. Объединенные экстракты сушили над сульфатом магния и концентрировали при пониженном давлении с получением 3,2 г (86%) (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты (3) в виде бесцветного масла с величиной е.е.=98%. Выделенный фермент промывали свежим буферным раствором для повторного использования со второй порцией субстрат/буфер.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆): 12,17 (ушир.с.; 1Н), 3,57 (с; 3Н), 2,82-2,72 (м; 2Н), 1,97-1,79 (м; 2Н), 1,79-1,59 (м; 2Н), 1,48-1,26 (м; 4Н); ¹³С-ЯМР (ДМСО-d6): 174,61, 173,62, 51,16, 41,63, 25,96, 25,60, 23,34, 23,17.

Условия ГХ: колонка Chirasil Dex-CB 25 м×0,25 мм; газ-носитель - гелий, 20 psi; программа печи - поддерживали температуру 140°С в течение 30 минут, затем повышали со скоростью 5°С/минуту до 200°С и поддерживали в течение 5 минут (время прогона - приблизительно 47 минут); температура детектора и инжектора - 200°С; время удерживания - 36,99 минут для 2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты (1S,2R) и 37,28 минут для 2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты (1R,2S).

Пример 2

Получение (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1-(3Н)-она (1).

В реакционную колбу емкостью 25 мл с рубашкой, охлажденную до температуры ниже 0°С, помещали раствор (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты (3, 880 мг, 4,72 ммоль) и триэтиламина 659 мкл, 4,72 ммоль) в ТГФ (6,6 мл). Раствор этилхлорформиата (512 мкл, 4,72 ммоль) в 1,2 мл ТГФ медленно прибавляли в течение нескольких минут и полученную смесь перемешивали в течение 30 минут. Выпавший осадок соли хлоргидрата триэтиламина отделяли фильтрацией и фильтрат по каплям добавляли в суспензию боргидрида натрия в 4,6 мл воды при температуре 12°С. По окончании прибавления реакционную массу перемешивали при температуре 20°С в течение еще 3,5 часов. Затем реакционную массу охлаждали до температуры ниже 10°С, подкисляли до величины рН 4 2М раствором HCl и экстрагировали 2×15 мл дихлорметана. Объединенные органические экстракты сушили над сульфатом магния, отгоняли растворитель при пониженном давлении и получали 450 мг бесцветного масла. Продукт очищали молекулярной перегонкой и получали 170 мг бесцветного масла с величиной е.е.=98% и [α]D²⁰=39,3° (с 1, метанол).

Сравнительный пример

Получение (1R,2S)-2-(метоксикарбонил)-циклогексанкарбоновой кислоты

В колбу емкостью 2 л с рубашкой, выдержанную при температуре 30°С, помещали диметилциклогексан-1,2-дикарбоксилат (2, 84,6 г, 0,42 моль) и 900 мл 0,1М буферного раствора фосфата калия, рН 8. Смесь непрерывно перемешивали при температуре 30°С и добавляли ЭПС (600 мг, 10200 единиц). Смесь перемешивали в течение 91 часа, после чего величину рН доводили до 8 добавлением 5М раствора NaOH. Аликвотную пробу смеси анализировали методом ГХ, чтобы убедиться, что остаточное содержание исходного материала составляет менее 5%. Затем реакционную массу фильтровали через слой Celite™ и фильтрат экстрагировали 250 мл МТБЭ для удаления остатков исходного вещества. После этого водную фазу подкисляли до величины рН 4 концентрированной HCl и экстрагировали 3×500 мл МТБЭ. Объединенные экстракты сушили над сульфатом магния и отгоняли растворитель при пониженном давлении, в результате получали 69,28 г (выход 88%) (1R,2S)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты (4) в виде бесцветного масла с величиной е.е.=79%.

Хотя проиллюстрированы и описаны частные варианты осуществления настоящего изобретения, специалисту в данной области техники будет очевидно, что возможны различные изменения и модификации без отклонения от объема и сущности раскрытия. Таким образом, оно предназначено для охвата в прилагаемой формуле изобретения всех таких изменений и модификаций, входящих в рамки этого раскрытия.

1. Способ получения (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1(3Н)-она, включающий:
(а) гидролиз цис-диметилциклогексан-1,2-дикарбоксилата в присутствии фермента, который имеет последовательность SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 3, с получением (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты; и
(б) проведение восстановительной циклизации (1S,2R)-2-(метоксикарбонил)циклогексанкарбоновой кислоты.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент находится в иммобилизованной форме.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что при восстановительной циклизации используют C₁-C₆-алкилхлорформиат с последующим восстановлением боргидридом.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что C₁-C₆-алкилхлорформиат представляет собой этилхлорформиат.

5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что боргидрид является боргидридом натрия.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1(3Н)-он получают с величиной е.е. по меньшей мере 95%.

7. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что (3aS,7aR)-гексагидроизобензофуран-1(3Н)-он получают с величиной е.е. по меньшей мере 98%.