Способ лечения рака антагонистом dll4 и химиотерапевтическим средством

Изобретение относится к биохимии. Описано применение выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают дельта-подобный лиганд 4 человека (hDll4), для получения лекарственного средства. При этом лекарственное средство используется при лечении солидной злокачественной опухоли у субъекта в синергетической комбинации с химиотерапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства на основе платины или аналога пиримидина или для замедления или остановки роста солидной опухоли у субъекта в синергетической комбинации с химиотерапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства на основе платины или аналога пиримидина. Антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 22, 24 и 26, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 SEQ ID NO: 30, 32 и 34, соответственно. 11 з.п. ф-лы, 5 ил., 8 табл., 12 пр.

 

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Данное изобретение относится к способам лечения раков или опухолей антагонистом дельта-подобного лиганда 4 (Dll4), в частности, антителами человека или их фрагментами, которые специфически связывают Dll4 человека, в комбинации с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, и к фармацевтическим композициям, содержащим антагонист Dll4 и химиотерапевтическое средство.

Описание связанной области

Dll4 является членом семейства Delta лигандов Notch, который проявляет высоко избирательную экспрессию в эндотелии сосудов (Shutter et al., 2000, Genes Develop. 14:1313-1318). Dll4 является лигандом для рецепторов Notch, Notch 1 и Notch 4. Антагонисты Dll4 можно использовать для ингибирования роста опухоли в различных раках. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот Dll4 человека (hDll4) представлены в SEQ ID №№ 1 и 2, соответственно. Антитела, специфичные к Dll4 человека, и лечение раков/опухолей с использованием антител к Dll4 раскрыты в публикациях международных патентных заявок WO 2007/143689, WO 2008/042236 и WO 2007/070671.

Химиотерапевтические средства широко используют для лечения раков как отдельно, так и в комбинации с хирургическим лечением и/или лучевой терапией. Способы комбинированного лечения с использованием антагониста Dll4 и химиотерапевтических средств раскрыты в публикациях патентных заявок США US 2008/0014196 и US 2008/0107648.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение отличается способом лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту антагониста Dll4 в комбинации с химиотерапевтическим средством, которым лечат рак. Субъекты, подлежащие лечению способом по изобретению, могут включать млекопитающих любых видов, но предпочтительно человека, страдающего раком.

Способы комбинированного лечения по настоящему изобретению в частности можно использовать в Dll4-ассоциированном или Dll4-опосредованном состоянии или заболевании, которое находится под влиянием непосредственной или опосредованной модуляции активности Dll4. Более конкретно поскольку сейчас показано, что Dll4 вовлечен в рост и развитие кровеносных сосудов, ингибирование или уменьшение Dll4-опосредованного роста или развития или созревания кровеносных сосудов с использованием антагонистов Dll4 является эффективным лечением рака/опухоли, которое требует достаточного кровоснабжения для своего роста и выживания. Кроме того, комбинации антагонистов Dll4 с химиотерапевтическими средствами, включая ингибирующие рост средства и другие цитотоксические средства, синергически усиливает их эффекты против рака/опухолей. Рак/опухоли, поддающиеся лечению способами по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, различные солидные злокачественные опухоли, включая рак яичников, рак матки, рак молочной железы, рак легких, рак печени, рак толстой кишки, рак мочевого пузыря, рак почки, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак кости, рак кожи, включая меланому, злокачественную саркому мягких тканей, включая в качестве неограничивающих примеров саркому Юинга, рабдомиосаркому, лейомиосаркому, адипоцитную саркому, синовиальную саркому, злокачественную фиброзную гистиоцитоксантому, эпителиоидную гемангиоэндотелиому, ангиосаркому, фибросаркому и неклассифицированные саркомы, лейкемию, включая миелому, и т.п.

В одном из вариантов осуществления антагонист Dll4 представляет собой антитело к Dll4 или его фрагмент («Dll4 Ab»), который специфически связывает Dll4 с высокой аффинностью и блокирует связывание Dll4 с рецепторами Notch и/или нейтрализует активности Dll4. Антитело может представлять собой поликлональное, моноклональное, химерное, гуманизированное антитело или полностью антитело человека. Предпочтительно антитело полностью представляет собой моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела человека. Фрагмент антитела может представлять собой одноцепочечное антитело, Fab или (Fab')₂.

В другом варианте осуществления Dll4 Ab связывает эпитоп в N-концевом домене (S27-R172), или домен DSL (V173-C217), или N-концевой домен DSL (S27-C217) в Dll4 (SEQ ID № 2). Dll4 Ab, подлежащие использованию в способах по изобретению, способны связывать Dll4 человека с высокой аффинностью и его константа диссоциации (K_D) составляет приблизительно 500 пМ или менее, включая приблизительно 300 пМ или менее и включая приблизительно 200 пМ или менее, как измеряют посредством поверхностного плазменного резонанса. Например, Dll4 Ab имеет вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), которая содержит три CDR тяжелой цепи (H-CDR), и вариабельную область легкой цепи (LCVR), которая содержит три CDR легкой цепи (L-CDR), где три CDR тяжелой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 из аминокислотной последовательности SEQ ID № 20, а три CDR легкой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 из аминокислотной последовательности SEQ ID № 28. В другом варианте осуществления CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи Dll4 Ab содержат аминокислотные последовательности SEQ ID №№ 22, 24 и 26, соответственно. В другом варианте осуществления CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи Dll4 Ab содержат аминокислотные последовательности SEQ ID №№ 30, 32 и 34, соответственно. В еще одном другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, которые содержат SEQ ID № 22, 24 и 26, соответственно, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, которые содержат SEQ ID № 30, 32 и 34, соответственно. В еще одном другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит HCVR, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 20 или 116, или LCVR, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 28 или 118. В еще одном другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит комбинацию HCVR/LCVR из SEQ ID № 20/28 (REGN281) или 116/118 (REGN421).

В другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит комбинацию CDR1/CDR2/CDR3 тяжелой цепи и комбинацию CDR1/CDR2/CDR3 легкой цепи, выбранные из: SEQ ID № 6/8/10 и SEQ ID № 14/16/18, соответственно; SEQ ID № 38/40/42 и SEQ ID № 46/48/50, соответственно; SEQ ID № 54/56/58 и SEQ ID № 62/64/66, соответственно; SEQ ID № 70/72/74 и SEQ ID № 78/80/82, соответственно; SEQ ID № 86/88/90 и SEQ ID № 94/96/98, соответственно; и SEQ ID № 102/104/106 и SEQ ID № 110/112/114, соответственно. В другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит HCVR, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 4, 36, 52, 68, 84 или 100, или LCVR, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 12, 44, 60, 76, 92 или 108. В еще одном другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит комбинацию HCVR/LCVR, выбранную из: SEQ ID № 4/12 (REGN279); SEQ ID № 36/44 (REGN290); SEQ ID № 52/60 (REGN306); SEQ ID № 68/76 (REGN309); SEQ ID № 84/92 (REGN310); и SEQ ID № 100/108 (REGN289).

Нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID №№ 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 и 118, представлены в виде SEQ ID №№ 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 и 117, соответственно.

В одном из вариантов осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой антимитотическое средство, такое как доцетаксел, паклитаксел и т. п.; химиотерапевтическое соединение на основе платины, такое как цисплатин, карбоплатин, ипроплатин, оксалиплатин и т. п.; или другие стандартные цитотоксические средства, такие как 5-фторурацил (5-FU), капецитабин, иринотекан, лейковорин, гемцитабин; ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и/или ангиогенеза, таких как ингибиторы ErbB, ингибиторы RTK класса III, ингибиторы VEGFR и т. п., а антагонист Dll4 представляет собой антитело к Dll4 или его фрагмент, как описано выше.

Во втором аспекте изобретение отличается способом уменьшения, снижения или остановки роста опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту антагониста Dll4 в комбинации с химиотерапевтическим средством, которое рост опухоли уменьшает, снижает или останавливает.

В третьем аспекте изобретение отличается способом снижения количества химиотерапевтического средства или антагониста Dll4, которое необходимо для достижения желаемого терапевтического эффекта, по сравнению с введением каждого средства отдельно, который содержит введение химиотерапевтического средства с антагонистом Dll4. В одном из вариантов осуществления количество химиотерапевтического средства для достижения желаемого терапевтического эффекта, такого как, например, остановка или снижение роста опухоли, составляет по меньшей мере на 10% меньше, по меньшей мере на 20% меньше, по меньшей мере на 30% меньше, по меньшей мере на 40% меньше или по меньшей мере на 50% меньше в присутствие совместно введенного антагониста Dll4, или наоборот. В основном, желательно, чтобы количество химиотерапевтического средства или антагониста Dll4 можно было снизить на приблизительно от 30% приблизительно до 50%. Таким образом, способы по изобретению, в частности, полезны для пациентов с раком, которые имеют низкую переносимость побочных эффектов, вызываемых высокими дозами, необходимыми для лечения отдельно любым средством, за счет способности снизить эффективные дозировки.

В четвертом аспекте изобретение отличается фармацевтической композицией, которая содержит антагонист Dll4, химиотерапевтическое средство и фармацевтически приемлемый носитель. В одном из вариантов осуществления антагонист Dll4 представляет собой Dll4 Ab или его фрагмент, который специфически связывает Dll4 с высокой аффинностью и нейтрализует активности Dll4, а химиотерапевтическое средство представляет собой любое из тех, что описаны в настоящем документе.

В пятом аспекте изобретение отличается набором, содержащим контейнер, содержащий фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, и вкладыш в упаковку с инструкцией по использованию. В одном из вариантов осуществления набор может содержать контейнер, который содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает hDll4, один или несколько дополнительных контейнеров, которые содержат по меньшей мере одно любое химиотерапевтическое средство, выбранное из тех, что описаны в настоящем документе, и вкладыш в упаковку с инструкцией по использованию.

Другие цели и преимущества видны при рассмотрении следующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фиг. 1 представлены эффекты Dll4 Ab в комбинации с цисплатином, оказываемые на рост опухолей VMCub1 человека (карцинома мочевого пузыря), имплантированных мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД), которые экспрессируют гуманизированный белок Dll4 (гуманизированные Dll4 ТКИД мыши) (пример 1). Контрольный Fc человека (♦ и сплошная линия); REGN421 (Dll4 Ab) 2 мг/кг/инъекция (♦ и штриховая линия); цисплатин 0,5 мг/кг/инъекция (□); цисплатин 2 мг/кг/инъекция (■); REGN421 2 мг/кг/инъекция + цисплатин 0,5 мг/кг/инъекция (○); и REGN421 2 мг/кг/инъекция + цисплатин 2 мг/кг/инъекция (●).

На фиг. 2 представлены эффекты Dll4 Ab в комбинации с цисплатином, оказываемые на рост опухолей A549 человека (немелкоклеточный рак легких), имплантированных гуманизированным Dll4 ТКИД мышам (пример 2). Контрольный Fc человека (●); REGN421 6 мг/кг суммарная доза (○); цисплатин 5 мг/кг суммарная доза (Δ); цисплатин 9 мг/кг суммарная доза (▲); REGN421 6 мг/кг + цисплатин 5 мг/кг суммарные дозы (◊); и REGN421 6 мг/кг + цисплатин 9 мг/кг суммарные дозы (♦).

На фиг. 3 представлены эффекты Dll4 Ab в комбинации с 5-FU, оказываемые на рост HCT116 человека (колоректальная карцинома), имплантированной гуманизированным Dll4 ТКИД мышам (пример 5). Контрольный Fc человека (●); REGN421 6 мг/кг суммарная доза (○); 5-FU 45 мг/кг суммарная доза (Δ); 5-FU 75 мг/кг суммарная доза (▲); REGN421 6 мг/кг + 5-FU 45 мг/кг суммарные дозы (◊); и REGN421 6 мг/кг + 5-FU 75 мг/кг суммарные дозы (♦).

На фиг. 4 представлены эффекты Dll4 Ab в комбинации с иринотеканом, оказываемые на рост опухолей HCT116 человека, имплантированных гуманизированным Dll4 ТКИД мышам (пример 6). Контрольный Fc человека (●); REGN421 6 мг/кг суммарная доза (○); иринотекан 22,5 мг/кг суммарная доза (Δ); иринотекан 75 мг/кг суммарная доза (▲); REGN421 6 мг/кг + иринотекан 22,5 мг/кг суммарные дозы (◊); и REGN421 6 мг/кг + иринотекан 75 мг/кг суммарные дозы (♦).

На фиг. 5 представлена средняя (4 мышей/группа) кратность изменения экспрессии гена Hey1 в колоректальных опухолевых клетках человека Colo205, имплантированных гуманизированным Dll4 ТКИД мышам, при однократной дозе REGN421 0,5, 5 или 15 мг/кг по сравнению с hFc 15 мг/кг, измеренная через 5, 10, 24, 72 часа и 7 суток после дозы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Прежде чем перейти к описанию настоящих способов, следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными способами, и что описаны экспериментальные условия, поскольку такие способы и состояния могут варьировать. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология служит цели описания только конкретных вариантов осуществления и не предназначена быть ограничением, поскольку объем настоящего изобретения ограничен только приложенной формулой изобретения.

Как используют в этом описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа до тех пор, пока в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, упоминание о «способе» включает один или несколько способов и/или стадий того типа, который описан в настоящем документе и/или который станет очевидным специалистам в данной области после прочтения этого раскрытия.

Пока не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, в каком их обычно понимает специалист в той области, к которой принадлежит это изобретение. Несмотря на то, что любые способы и вещества, схожие или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, можно использовать при практическом применении или тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и вещества описаны далее.

Определения

«Дельта-подобный лиганд 4», «Dll4», «hDll4» используют взаимозаменяемо в отношении белка, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID № 1, и белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID № 2.

Антагонисты Dll4 включают антитела к Dll4 и их фрагменты, способные блокировать связывание Dll4 с рецептором Notch (таким как Notch1 и Notch4), слитые белки, содержащие внеклеточный домен Dll4, слитый с мультимеризующим компонентом, или их фрагменты (см. например, публикации патентных заявок США №№ 2006/0134121 и 2008/0107648) и пептиды и пептидные антитела (см. например, публикацию патентной заявки США № 2003/0229023).

Если конкретно не указано иное, то термин «антитело», как применяют в настоящем документе, следует понимать охватывающим молекулы антител, содержащие две тяжелые цепи иммуноглобулинов и две легкие цепи иммуноглобулинов (т.е., «целые молекулы антител»), а также их антигенсвязывающие фрагменты. Термины «антигенсвязывающая часть» антитела, «антигенсвязывающий фрагмент» антитела и т. п., как применяют в настоящем документе, включают любые встречающиеся в природе, получаемые ферментативно, синтетически или генетически сконструированные полипептиды или гликопротеины, которые специфически связывают антиген с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела можно получить, например, из целой молекулы антитела, используя любые подходящие стандартные способы, такие как протеолитическое расщепление или рекомбинантные способы генетической инженерии, которые включают манипуляции и экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и необязательно константные домены антитела. Такая ДНК известна и/или ее легко получить, например, из коммерческих источников, библиотек ДНК (включая, например, библиотеки фаг-антитело), или ее можно синтезировать. ДНК можно секвенировать и манипулировать химически или посредством использования способов молекулярной биологии, например, чтобы расположить один или несколько вариабельных и/или константных доменов в подходящей конфигурации, или чтобы ввести кодоны, создать остатки цистеина, модифицировать, добавить или удалить аминокислоты и т.д.

Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: (i) фрагменты Fab; (ii) фрагменты F(ab')₂; (iii) фрагменты Fd; (iv) фрагменты Fv; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) фрагменты dAb; и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела {например, выделенную определяющую комплементарность область (CDR)). Другие сконструированные молекулы, такие как диатела, триатела, тетратела и миниантитела, также входят в выражение «антигенсвязывающий фрагмент», как применяют в настоящем документе.

Антигенсвязывающий фрагмент антитела типично содержит по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или аминокислотный состав и, как правило, содержит по меньшей мере один CDR, который расположен смежно или в рамке считывания с одним или несколькими каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен V_H, связанный с доменом V_L, домены V_H и V_L можно расположить друг относительно друга в любом подходящем порядке. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры V_H-V_H, V_H-V_L или V_L-V_L. Альтернативно антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен V_H или V_L.

В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный с по меньшей мере одним константным доменом. Без ограничения, образцовые конфигурации вариабельных и константных доменов, которые можно найти в антигенсвязывающем фрагменте антитела по настоящему изобретению, включают: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; и (xiv) V_L-C_L. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, включая любые образцовые конфигурации, перечисленные выше, вариабельные и константные домены могут быть или непосредственно связаны друг с другом или могут быть связаны посредством целой шарнирной или линкерной области или ее части. Шарнирная область может состоять из по меньшей мере 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, что ведет к гибкому или полугибкому соединению между смежными вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) согласно любой перечисленной выше конфигурации вариабельных и константных доменов в нековалентном соединении друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами V_H или V_L (например, посредством дисульфидной связи(ей)).

Как и в случае целых молекул антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела типично содержит по меньшей мере два различных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен специфически связывать отдельный антиген или другой эпитоп на том же антигене. Любой формат полиспецифического антитела, включая образцовые форматы биспецифических антител, описанные в настоящем документе, можно адаптировать для использования в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению, используя стандартные способы, доступные в данной области.

Подразумевают, что термин «антитело человека», как применяют в настоящем документе, включает антитела, содержащие вариабельные и константные области, полученные из зародышевых последовательностей иммуноглобулинов человека. mAb человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые зародышевыми последовательностями иммуноглобулинов человека (например, мутации, введенные посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматических мутаций in vivo), например, в CDR, и в частности в CDR3. Однако не подразумевают, что термин «антитело человека», как применяют в настоящем документе, включает mAb, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевых линий млекопитающих других видов (например, мышь), встроены в последовательности FR человека.

Полные антитела человека против Dll4, описанные в настоящем документе, могут содержать одну или несколько замен, инсерций и/или делеций аминокислот в каркасной области и/или CDR вариабельных доменов тяжелых и легких цепей по сравнению с соответствующими зародышевыми последовательностями. Такие мутации можно легко выявить посредством сравнения аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем документе, с зародышевыми последовательностями, доступными, например, в публичных базах данных о последовательностях антител. Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые получают из любой аминокислотной последовательности, описанной в настоящем документе, где одну или несколько аминокислот в одной или нескольких каркасных областях и/или CDR подвергают мутации к первоначальному состоянию, соответствующему зародышевому остатку(ам) или консервативной аминокислотной замене (естественной или не естественной) соответствующего зародышевого остатка(ов) (такие изменения последовательности обозначают в настоящем документе как «зародышевые обратные мутации»). Специалист в данной области, начиная с последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, описанных в настоящем документе, может легко получить множество антител и антигенсвязывающих фрагментов, которые содержат одну или несколько отдельных зародышевых обратных мутаций или их комбинации. В определенных вариантах осуществления все остатки каркаса и/или CDR в доменах V_H и/или V_L подвергают обратной мутации в зародышевую последовательность. В других вариантах осуществления только определенные остатки подвергают обратной мутации в зародышевую последовательность, например, только мутировавшие остатки, найденные в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или только мутировавшие остатки, найденные в CDR1, CDR2 или CDR3. Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию из двух или более зародышевых обратных мутаций в каркасных областях и/или CDR, т.е., где определенные отдельные остатки подвергают обратной мутации в зародышевую последовательность, тогда как сохраняют определенные другие остатки, которые отличаются от зародышевой последовательности. После получения, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько зародышевых обратных мутаций, можно легко тестировать по одному или нескольким желаемым свойствам, таким как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от случая), сниженная иммуногенность и т.д. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные этим основным способом, включены в настоящее изобретение.

Настоящее изобретение также относится к антителам против Dll4, содержащим варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, описанных в настоящем документе, которые содержат одну или несколько консервативных замен. Например, настоящее изобретение относится к антителам против Dll4, которые содержат аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее, 2 или 1 консервативную аминокислотную замену(ы), относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR, и/или CDR, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления CVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 10 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 8 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 6 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 4 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В еще одном другом варианте осуществления HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 2 или 1 консервативной аминокислотной заменой(ами) в ней. В одном из вариантов осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 10 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 8 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 6 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 4 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В еще одном другом варианте осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 2 или 1 консервативной аминокислотной заменой(ами) в ней.

«Нейтрализующее» или «блокирующее» антитело предназначено для обозначения антитела, связывание которого с Dll4 ведет к ингибированию биологической активности Dll4. Это ингибирование биологической активности Dll4 можно оценить посредством измерения одного или нескольких показателей биологической активности Dll4. Эти показатели биологической активности Dll4 можно оценить посредством одного или более из нескольких стандартных анализов in vitro или in vivo, известных в данной области. Например, способность антитела нейтрализовать активность Dll4 оценивают посредством ингибирования связывания Dll4 с рецептором Notch.

Термин «специфически связывает» или ему подобное обозначает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который относительно стабилен при физиологических условиях. Специфическое связывание можно охарактеризовать посредством равновесной константы диссоциации, равной по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ M или менее (например, меньшее значение K_D означает более прочное связывание). Способы определения способности двух молекул специфически связываться, хорошо известны в данной области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазменный резонанс и т.п. Однако, выделенное антитело, которое специфически связывает hDll4, может проявлять перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы Dll4 других видов. Кроме того, мультиспецифические антитела (например, биспецифические), которые связывают hDll4 и один или несколько дополнительных антигенов, тем не менее рассматривают в качестве антител, которые «специфически связывают» hDll4, как применяют в настоящем документе.

Термин «K_D», как применяют в настоящем документе, предназначен для обозначения константы диссоциации для взаимодействия конкретного антитела-антигена.

Термин антитело с «высокой аффинностью» относится к тем антителам, которые связывают Dll4 с K_D менее чем приблизительно 500 пМ, менее чем приблизительно 400 пМ, менее чем приблизительно 300 пМ, или менее чем приблизительно 200 пМ, как измеряют посредством поверхностного плазменного резонанса, например, BIACORE™ или анализ аффинности в растворе ELISA, с использованием, например, мономерного Dll4; или K_D менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 50 пМ, или менее чем приблизительно 20 пМ, как измеряют посредством поверхностного плазменного резонанса, с использованием димерного Dll4.

Термин «поверхностный плазменный резонанс», как применяют в настоящем документе, относится к оптическому феномену, который делает возможным анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени посредством обнаружения изменений в концентрациях белка в матрице биосенсора, например, с использованием системы BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).

Термин «эпитоп» обозначает область антигена, которую связывает антитело. Эпитопы можно определять как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, как правило, представляют собой поднабор структурных эпитопов, и содержат те остатки, которые непосредственно вносят вклад в аффинность взаимодействия. Также эпитопы могут быть конформационными, то есть состоять из нелинейных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могут содержать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления могут обладать конкретными трехмерными структурными характеристиками и/или конкретными зарядовыми характеристиками.

Химиотерапевтические средства представляют собой химические соединения, которые можно использовать в лечении рака и они включают ингибирующие рост средства или другие цитотоксические средства. Примеры химиотерапевтических средств, которые можно использовать в настоящих способах, включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид мехлоретаминоксида, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, роторубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-FU; аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналовые средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; восполнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихин; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазихин; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндесин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; члены семейства таксоида или таксана, такие как паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.), доцетаксел (TAXOTERE®; Aventis Antony, France) и их аналоги; хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин C; митоксантрон; винкристин; винорельбин; навельбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин; ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и/или ангиогенеза, включая сорафениб (NEXAVAR® компании Bayer Pharmaceuticals Corp.), сунитиниб (SUTENT® компании Pfizer), пазопаниб (VOTRIENT™ компании GlaxoSmithKline), тоцераниб (PALLADIA™ компании Pfizer), вендетаниб (ZACTIMA™ компании AstraZeneca), цедираниб (RECENTIN® компании AstraZeneca), регорафениб (BAY 73-4506 компании Bayer), акситиниб (AG013736 компании Pfizer), лестауртиниб (CEP-701 компании Cephalon), эрлотиниб (TARCEVA® компании Genentech), гефинитиб (IRESSA™ компании AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK™ компании Boehringer Ingelheim), лапатиниб (TYKERB® компании GlaxoSmithKline), нератиниб (HKI-272 компании Wyeth/Pfizer), и т. п., и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого указанного выше. Также в это определение входят противогормональные средства, которые действуют на регуляцию или ингибируют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен (FARESTON®); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого указанного выше. Другие стандартные цитотоксичные химические соединения, такие как раскрытые в Wiemann et al., 1985, in Medical Oncology (Calabresi et al., eds.), Chapter 10, McMillan Publishing, также можно применять в способах по настоящему изобретению.

Термин «ингибирующие рост средства» относится к соединению или композиции, которая ингибирует рост клеток, в частности, раковых клеток in vitro или in vivo. Примеры ингибирующих рост средств, включают средства, которые блокируют прохождение клеточного цикла (в месте, отличном от фазы S), такие как средства, которые индуцируют задержку в фазе G1 и задержку в фазе M. Классические блокаторы фазы M включают барвинок (винкристин и винбластин), члены семейства таксана, включая в качестве неограничивающих примеров паклитаксел (TAXOL®), доцетаксел (TAXOTERE®) и их аналоги (например, XRP9881 и XRP6258; см. Ojima et al., Curr Opin Investig Drugs 4:737, 2003), и ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан, топотекан, камптотецин, ламелларин D, доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те средства, которые задерживают фазу G1, также задерживают фазу S, например, ДНК алкилирующие средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-FU и ara-C.

Общее описание

Настоящее изобретение основано на наблюдении того, что совместное введение антагониста Dll4, например, антитела к Dll4 или его фрагмента, который специфически связывает Dll4 и блокирует активности Dll4, с химиотерапевтическим средством, например, цисплатином или доцетакселом, ведет к более сильному ингибированию роста опухоли, чем любое средство отдельно. Описание полного Dll4 Ab человека, включая рекомбинантные Dll4 Ab человека, см. в публикации международной патентной заявки № WO 2008/076379.

Способы получения Dll4 Ab

Способы получения антител известны в данной области. См., например, Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497; Harlow & Lane (1988) Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY). Антитела, которые выделяют из организмов, отличных от человека, таких как мыши, крысы, кролики, коровы, можно сделать более похожими на антитела человека посредством химеризации или гуманизации.

«Гуманизированные» или химерные формы не относящихся к человеку (например, мышиных) антител представляют собой иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальные последовательности, необходимые для связывания антигена, полученные не из иммуноглобулина человека. Они обладают такой же или схожей специфичностью и аффинностью связывания, как у антител мыши или других относящихся к человеку антител, которые предоставляют начальный материал для конструирования химерного или гуманизированного антитела. Химерные антитела представляют собой антитела, гены легких и тяжелых цепей которых сконструированы, типично, посредством генетической инженерии, из сегментов генов иммуноглобулинов, принадлежащих другим видам. Например, вариабельные (V) сегменты генов из моноклонального антитела мыши можно соединить с константными (C) сегментами человека, такими как IgG1 и IgG4. Таким образом, типичное химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из домена V или антиген-связывающего домена из антитела мыши и домена C или эффекторного домена из антитела человека. Гуманизированные антитела содержат каркасные остатки вариабельной области по существу из антитела человека (обозначают как акцепторное антитело) и определяющие комплементарность области (области CDR) по существу из антитела мыши, (обозначают как донорный иммуноглобулин). См., Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:10029-10033 (1989) и публикация международной патентной заявки № WO 90/07861 и патенты США 5693762, 5693761, 5585089, 5530101 и 5225539. Константная область(и), в случае присутствия, также по существу или полностью из иммуноглобулина человека. Вариабельные домены человека обычно выбирают из антител человека, каркасные последовательности которых проявляют высокую степень идентичности последовательности с доменами вариабельных областей мыши, из которых получали CDR. Каркасные вариабельные области тяжелой и легкой цепи можно получать из тех же или других последовательностей антител человека. Последовательности антител человека могут представлять собой последовательности встречающихся в природе антител человека или могут представлять собой консенсусные последовательности нескольких антител человека. См. публикацию международной патентной заявки № WO 92/22653. Определенные аминокислоты из каркасных остатков вариабельной области человека выбирают для замены на основе их возможного влияния на конформацию CDR и/или связывание с антигеном. Исследование такого возможного влияния можно выполнить посредством моделирования, изучения характеристик аминокислот в конкретных положениях или эмпирического наблюдения эффектов замены или мутагенеза конкретных аминокислот. Например, когда между каркасным остатком вариабельной области мыши и выбранным каркасным остатком вариабельной области человека имеет место различие аминокислот, аминокислоту каркаса человека обычно следует заменять на эквивалентную аминокислоту каркаса из антитела мыши, когда обоснованно полагают, что аминокислота: (1) нековалентно связывает непосредственно антиген; (2) расположена смежно с областью CDR; (3) иным образом взаимодействует с областью CDR (например, расположена, приблизительно в 6 Å от области CDR), или (4) участвует в области взаимодействия V_L-V_H. Другими кандидатами для замены являются аминокислоты акцепторного каркаса человека, которые не являются обычными для иммуноглобулина человека в этом положении. Эти аминокислоты можно заменить на аминокислоты из эквивалентного положения донорного антитела мыши или из эквивалентных положений более типичных иммуноглобулинов человека. Другими кандидатами для замены являются аминокислоты акцепторного каркаса человека, которые не являются обычными для иммуноглобулина человека в этом положении. Каркасы вариабельных областей гуманизированных иммуноглобулинов обычно проявляют по меньшей мере 85% идентичность последовательности с каркасной последовательностью вариабельной области человека или консенсусом таких последовательностей.

Способы создания антител человека включают, например, VELOCIMMUNE™ (Regeneron Pharmaceuticals), технологию XENOMOUSE™ (Abgenix), подход «минилокус» и фаговый дисплей. Технология VELOCIMMUNE™ (патент США 6596541) содержит способ создания полного антитела человека с высокой специфичностью к выбранному антигену. Эта технология включает создание трансгенной мыши, которая имеет геном, содержащий вариабельные области тяжелой и легкой цепей человека, функционально связанные с эндогенными локусами константной области мыши так, что мышь продуцирует антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши, в ответ на антигенную стимуляцию. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелых и легких цепей антитела выделяют, и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные области тяжелых и легких цепей человека. Затем ДНК экспрессируют в клетках, способных экспрессировать полное антитело человека. В одном из вариантов осуществления клетки представляют собой клетки CHO.

Технология XENOMOUSE™ (Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21) создает мышь, которая имеет как вариабельные, так и константные области человека из локусов как тяжелых цепей, так и легких цепей. В альтернативном подходе использовали подход «минилокус», в котором экзогенный локус Ig имитируют посредством включения отдельных генов из локуса Ig (см., например, патент США 5545807). ДНК, кодирующую вариабельные области, можно выделить функционально связанной с ДНК, кодирующей константные области тяжелых и легких цепей человека, или без нее.

Альтернативно фаговый дисплей или родственные технологии дисплеев можно использовать для идентификации антител, фрагментов антител, таких как вариабельные домены, и гетеромерных фрагментов Fab, которые специфически связывают Dll4. (см., например, публикацию патентной заявки США № 2003/0229023).

Скрининг и селекцию предпочтительных иммуноглобулинов (антител) можно проводить посредством различных способов, известных в данной области. Начальный скрининг на присутствие моноклональных антител, специфичных к Dll4, можно проводить посредством использования, например, способов на основе ELISA или фагового дисплея. Вторичный скрининг предпочтительно проводят для идентификации и отбора желаемого моноклонального антитела. Вторичный скрининг можно проводить с использованием любого подходящего способа, известного в данной области. Один из предпочтительных способов, называемый «Biosensor Modification-Assisted Profiling» («BiaMAP») описан в публикации патентной заявки США № 2004/101920. BiaMAP делает возможной быструю идентификацию клонов гибридомы, продуцирующих моноклональные антитела с желаемыми характеристиками. Более конкретно, проводят сортировку моноклональных антител в отдельные связанные с эпитопом группы на основе оценки взаимодействий антитело:антиген. Альтернативно конкурентные анализы на основе ELISA, на основе бус или на основе BIACORE® можно использовать для идентификации пар связывания, которые связывают различные эпитопы Dll4 и, таким образом, вероятно, взаимодействуют, чтобы связывать лиганд с высокой аффинностью.

Способы введения

Настоящее изобретение относится к способам лечения, включающим введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антагонист Dll4, такой как Dll4 Ab, и химиотерапевтическое средство, такое как антимитотические средства, например, доцетаксел, паклитаксел и т.п. (таксаны); химиотерапевтические соединения на основе платины, такие как цисплатин, карбоплатин, ипроплатин, оксалиплатин и т. п.; аналог пиримидина, такой как 5-FU, капецитабин (XELODA®, Roche) и т. п.; ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан, топотекан, камптотецин, ламелларин D и т. п.; и/или адъюванты, такие как лейковорин (фолиновая кислота), и т.п. (подробности см. выше в разделе определений).

Антагонист Dll4 и химиотерапевтическое средство можно совместно вводить вместе или раздельно. Когда используют раздельный дозированный состав, антагонист Dll4 и химиотерапевтическое средство можно вводить одновременно или раздельно в чередующиеся моменты времени, т.е. последовательно.

Известны различные системы доставки и для введения фармацевтической композиции по изобретению можно использовать, например, инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы введения в качестве неограничивающих примеров включают внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, внутриглазной, эпидуральный и пероральный пути. Композицию можно вводить посредством любого пути, например, посредством инфузии или инъекции болюса, посредством абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или локальным. Введение может быть резким или длительным (например, ежедневным, еженедельным или ежемесячным и т.д.) или в комбинации с другими средствами. Также можно использовать легочное введение, например, с помощью ингалятора или небулайзера, и состава с аэрозольным средством.

Относительно подкожной доставки, устройство для доставки в форме ручки легко находит применение в доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Такое устройство для доставки в форме ручки может быть повторно используемым или одноразовым. В повторно используемом устройстве для доставки в форме ручки, как правило, используют заменяемый картридж, который содержит фармацевтическую композицию. После введения всей фармацевтической композиции в картридже и опустошения картриджа, пустой картридж можно легко выбросить и заменить на новый картридж, который содержит фармацевтическую композицию. Затем устройство для доставки в форме ручки можно повторно использовать. В одноразовом устройстве для доставки в форме ручки заменяемый картридж отсутствует. Точнее, одноразовое устройство для доставки в форме ручки поступает предварительно заполненным фармацевтической композицией, содержащейся в резервуаре внутри устройства. После опустошения резервуара с фармацевтической композицией, выбрасывают целое устройство.

Многочисленные повторно используемые устройства для доставки в форме ручки имеют применения в подкожной доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В качестве перечисления некоторые примеры, конечно без ограничения, включают AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), ручку HUMALOG MIX 75/25™, ручку HUMALOG™, ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), ручку BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany). Примеры одноразового устройства для доставки в форме ручки, которое имеет применение в подкожной доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают, но конечно без ограничения, ручку SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly).

В другом варианте осуществления активное средство можно доставлять в пузырьке или в липосоме (см. Langer (1990) Science 249:1527-1533). В еще одном другом варианте осуществления активное средство можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением. В одном из вариантов осуществления можно использовать насос (см. Langer (1990) выше). В другом варианте осуществления можно использовать полимерные материалы (см. Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105). В другом варианте осуществления, где активное средство по изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo, чтобы способствовать экспрессии кодируемого ею белка, посредством конструирования ее в виде части подходящего вектора экспрессии нуклеиновой кислоты и введения ее с тем, чтобы она стала внутриклеточной, например, посредством ретровирусного вектора (см., например, патент США 4980286), или посредством прямой инъекции или посредством бомбардировки микрочастицами (например, генная пушка; Biolistic, Dupont), или покрывания липидами или рецепторами клеточной поверхности или трансфицирующими средствами, или посредством введения ее связанной с гомеобокс-подобным пептидом, который, как известно, проникает в ядро (см. например, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), и т.д. Альтернативно нуклеиновую кислоту можно ввести внутрь клетки и встроить в ДНКА клетки-хозяина для экспрессии посредством гомологичной рекомбинации.

В конкретном варианте осуществления может быть желательно, вводить фармацевтические композиции по изобретению локально в область, нуждающуюся в лечении; этого можно достичь, например и не в качестве ограничения, посредством локальной инфузии во время хирургического лечения, местного нанесения, например, посредством инъекции, посредством катетера или посредством имплантата, указанный имплантат выполняют из пористого, не пористого или гелеобразного материала, включая мембраны, такие как сиаластичные мембраны, волокна или коммерческие заменители кожи.

Количество активного средства по изобретению, которое будет эффективным при лечении рака/опухоли, можно определить посредством стандартных клинических способов, основанных на настоящем описании. Кроме того, необязательно можно использовать анализы in vitro, чтобы помочь идентифицировать оптимальные диапазоны доз. Точная доза, используемая в составе, также зависит от пути введения, и тяжести состояния, и ее следует выбирать в соответствии с оценкой практикующего врача и условиями каждого субъекта. Однако подходящие диапазоны доз для внутривенного введения, как правило, составляют приблизительно от 0,2 до 30 мг активного соединения на килограмм массы тела. Подходящие диапазоны доз для интраназального введения, как правило, составляют приблизительно от 0,01 пг/кг массы тела до 1 мг/кг массы тела. Эффективные дозы можно экстраполировать по кривым доза-эффект, полученным из тестовых систем на животных моделях или in vitro.

Для системного введения, терапевтически эффективную дозу можно изначально оценивать по анализам in vitro. Например, дозу можно формулировать в животных моделях для достижения диапазона циркулирующих концентраций, который включает IC₅₀, как определяют в клеточной культуре. Такую информацию можно использовать для более точного определения эффективных доз у человека. Исходные дозы также можно оценивать по данным in vivo, например, по животным моделям, используя способы, которые хорошо известны в данной области. Средний специалист в данной области легко может оптимизировать введение человеку на основе данных о животных.

Доза может варьировать в зависимости от возраста и размеров (например, массы тела или площади поверхности тела) субъекта, подлежащего введению, целевого заболевания, состояний, пути введения и т.п. Для системного введения антагонистов Dll4, в частности, антител к Dll4, типичные диапазоны доз для суточной дозы при внутривенном введении составляют приблизительно от 0,01 приблизительно до 100 мг/кг массы тела, приблизительно от 0,1 приблизительно до 50 мг/кг или приблизительно от 0,2 приблизительно до 10 мг/кг. При подкожном введении можно вводить приблизительно от 10 мг приблизительно до 500 мг, приблизительно от 20 мг приблизительно до 400 мг, приблизительно от 30 мг приблизительно до 300 мг или приблизительно от 50 мг приблизительно до 200 мг антител, при концентрации антител по меньшей мере приблизительно 25 мг/мл, приблизительно 50 мг/мл, приблизительно 75 мг/мл, приблизительно 100 мг/мл, приблизительно 125 мг/мл, приблизительно 150 мг/мл, приблизительно 175 мг/мл, приблизительно 200 мг/мл или приблизительно 250 мг/мл, по меньшей мере от 1 до 5 раз в сутки, от 1 до 5 раз в неделю или от 1 до 5 раз в месяц. Альтернативно антитела можно сначала вводить посредством внутривенной инъекции, за которой следует последующее подкожное введение.

В основном, химиотерапевтические средства используют внутривенно или перорально в диапазоне доз между 50 мг/м² и 5000 мг/м² в неделю, но диапазоны доз варьируют в зависимости от различных факторов, включая субъекта, подлежащего лечению, массу и возраст субъекта, тяжесть заболевания, путь введения, тип используемого химиотерапевтического средства, оценку прописавшего врача и т.п. Терапию можно повторять периодически, пока симптомы поддаются обнаружению, или даже когда они не поддаются обнаружению. Длительность лечения также может варьировать в зависимости от тяжести состояний, которые лечат, а также уровней переносимости субъектами возможных неблагоприятных воздействий, если они имеют место, и может длиться столько, сколько необходимо, или при условии, что польза перевешивает какое-либо неблагоприятное воздействие.

Дозу каждого средства можно дополнительно корректировать в комбинированном лечении, где снижают количество каждого средства, необходимое для достижения желаемого терапевтического эффекта (т.е., чтобы проявить синергический эффект), по сравнению с введением любого средства отдельно (см. ниже примеры 1 и 2).

Химиотерапевтические средства, которые можно использовать в способах комбинированного лечения по изобретению, также включают те, которые используют в хорошо известных схемах химиотерапии. Например, FOLFOX представляет собой схему химиотерапии для лечения рака толстой кишки (CRC) и представляет собой комбинацию 5-FU, фолиновой кислоты и оксалиплатина. FOLFIRI представляет собой другую схему химиотерапии CRC и представляет собой комбинацию 5-FU, фолиновой кислоты и иринотекана. XELOX представляет собой схему химиотерапии CRC второй линии и представляет собой комбинацию капецитабина и оксалиплатина.

Кроме того, терапию с использованием комбинации химиотерапевтического средства и антагониста Dll4 можно предоставлять отдельно или в комбинации с дополнительными лекарственными средствами, такими как другие антиангиогенные средства, например, антагонисты VEGF, включая антитела против VEGF (например, AVASTIN® компании Genentech), связывающие VEGF слитые белки (например, афлиберсепт компании Regeneron Pharmaceuticals) и т. п., и другие терапевтические средства, такие как анальгетики, противовоспалительные средства, включая нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НПВС), такие как ингибиторы ЦОГ-2, и т. п., с тем, чтобы улучшить и/или уменьшить симптомы, сопровождающие основной рак/опухоль.

Повторная химиотерапия

Повторная химиотерапия подает надежды в качестве улучшенного способа применения химиотерапии. Традиционную химиотерапию вводят в однократных дозах или короткими курсами терапии в виде наивысшей возможной дозы, которая не вызывает опасные для жизни уровни токсичности, например, в максимальной переносимой дозе (МПД). Для МПД терапии необходимы длительные перерывы по 2-3 недели между последующими циклами терапии. Несмотря на множество таких химиотерапевтических средств и большое число клинических исследований, предпринятых для их тестирования, прогресс был скромным в отношении выздоровления или значительного продления жизни пациентов с раком (Kerbel et al., 2004, Nature Reviews Cancer 4:423-436).

Повторная химиотерапия относится к частому, даже ежесуточному, введению химиотерапевтического средства в дозах значительно ниже МПД, без длительных перерывов без лекарственного средства. В дополнение к сниженной острой токсичности, эффективность повторной химиотерапии можно повысить при введении в комбинации с конкретными антиангиогенными лекарственными средствами, такими как ингибиторы VEGF (Kerbel et al., 2004, выше).

Таким образом, настоящее изобретение отличается повторной химиотерапией для лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающей введение субъекту антагониста Dll4 в комбинации с химиотерапевтическим средством, которым лечат рак. В конкретном варианте осуществления антагонист Dll4 и химиотерапевтическое средство можно вводить вместе или последовательно в течение относительно короткого периода времени, например, 1-12 недель, с последующим повторным введением химиотерапевтического средства в течение длительного периода времени, например, 6-24 месяцев.

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антагонист Dll4, химиотерапевтическое средство, и фармацевтически приемлемый носитель. Термин «фармацевтически приемлемый» означает подтверждение регулирующего органа федерального или регионального правительства или присутствие в списке в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопеи для использования у животных, и более конкретно, у человека. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или среде, вместе с которыми вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло и т.п. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, гель диоксида кремния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. При желании, композиция также может содержать незначительные количества увлажняющих или эмульгирующих средств или pH буферных средств. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п. Композицию можно сформулировать в виде суппозитория, с использованием традиционных связывающих средств и носителей, таких как триглицериды. Оральный состав может содержать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния фармацевтической чистоты и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences» автором E.W. Martin.

В предпочтительном варианте осуществления композицию формулируют в соответствии с повседневными процедурами в качестве фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения человеку. При необходимости, композиция также может включать в себя растворитель и местный анестетик, такой как лидокаин, чтобы облегчить боль в месте инъекции. Когда композиция подлежит введению посредством инфузии, ее можно распределять с использованием инфузионной бутылки, содержащей стерильную воду или физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. Когда композицию вводят посредством инъекции, можно предоставить ампулу стерильной воды для инъекций или физиологического раствора с тем, чтобы перед введением можно было смешать ингредиенты.

Активные средства по изобретению могут быть составлены в виде нейтральных форм и солей. Фармацевтически приемлемые соли включают те, что образованы со свободными аминогруппами, такими как те, что получены из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислоты и т.д., а также те, что образованы со свободными карбоксильными группами, такими как те, что получены из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.

Композиция, которую можно использовать при практическом применении способов по изобретению, может представлять собой жидкость, содержащую средство по изобретению в растворе, в суспензии или и то и другое. Термин «раствор/суспензия» относится к жидкой композиции, где первая часть активного средства присутствует в растворе, а вторая часть активного средства присутствует в форме частиц, в суспензии в жидкой среде. Жидкая композиция может быть водной, а также включает гелевую и мазевую формы.

Водная суспензия или раствор/суспензия, которые можно использовать для практического применения способов по изобретению, может содержать один или несколько полимеров в качестве суспендирующих средств. Эффективные полимеры включают водорастворимые полимеры, такие как сшитые карбоксилсодержащие полимеры. Водная суспензия или раствор/суспензия по настоящему изобретению предпочтительно является вязкой или мукоадгезивной или даже более предпочтительно и вязкой и мукоадгезивной.

Наборы

Изобретение дополнительно относится к изделию или набору, содержащему упаковочный материал, контейнер и фармацевтическое средство, содержащееся в контейнере, где фармацевтическое средство содержит по меньшей мере один антагонист Dll4, такой как антитело к Dll4, и по меньшей мере одно химиотерапевтическое средство, и где упаковочный материал содержит этикетку или вкладыш в упаковку, который указывает на то, что антагонист Dll4 и химиотерапевтическое средство можно использовать для лечения рака или снижения или остановки роста опухоли. В одном из вариантов осуществления антагонист Dll4 и химиотерапевтическое средство могут содержать в отдельных контейнерах; таким образом, изобретение относится к набору, содержащему контейнер, который содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает hDll4, и один или несколько дополнительных контейнеров, которые содержат по меньшей мере одно химиотерапевтическое средство.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры изложены с тем, чтобы предоставить средним специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как выполнять, и использовать способы и композиции по изобретению, и не предназначены для того, чтобы ограничивать объем того, что авторы изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Приложены усилия к тому, чтобы обеспечить точность в отношении используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иначе, части представляют собой массовые части, температура приведена в градусах Цельсия, давление равно атмосферному или близко к нему, и величины ошибок на фиг. = среднее ± SEM.

Пример 1: Эффект антитела против hDll4 в комбинации с цисплатином

Эффект антитела против Dll4 (REGN421) в комбинации с цисплатином (платинол, цис-диаминдихлорплатина), оказываемый на рост опухоли, оценивали на опухолях, имплантированных мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД), которые экспрессируют гуманизированный белок Dll4 (гуманизированные Dll4 ТКИД мыши). Гуманизированную Dll4 ТКИД мышь создавали посредством замены всего внеклеточного домена гена Dll4 мыши на соответствующую внеклеточную область гена Dll4 человека (7 тысяч оснований) в эмбриональных стволовых клетках (СК). Гомозиготных по hDll4 мышей создавали, и скрещивали до ТКИД фенотипа.

Каждой мыши имплантировали подкожно (sc) 1×10⁶ опухолевых клеток VM-Cub1 человека (клетки карциномы мочевого пузыря) плюс MATRIGEL™ (BD Biosciences, #354234). После того, как у мышей развивались опухоли (размер опухоли 150-200 мм³, приблизительно через 14 суток после имплантации), опухоли измеряли, рандомизировали и лечили с использованием hFc, REGN421, цисплатина или комбинации REGN421 и цисплатина. Всего 45 мышей делили на девять групп (n=5 на когорту). Первую группу лечили подкожно (sc) с использованием hFc в дозе 2 мг/кг; вторую и третью группы лечили sc с использованием REGN421 в дозе 0,5 и 2 мг/кг, соответственно; четвертую и пятую группы лечили интраперитонеально (ip) с использованием цисплатина в дозе 0,5 и 2 мг/кг, соответственно; шестую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 0,5 мг/кг и ip с использованием цисплатина в дозе 0,5 мг/кг; седьмую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 0,5 мг/кг и ip с использованием цисплатина в дозе 2 мг/кг; восьмую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг и ip с использованием цисплатина в дозе 0,5 мг/кг; и девятую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг и ip с использованием цисплатина в дозе 2 мг/кг. REGN421 вводили каждые 3-4 суток, начиная с 14 суток, и мыши получали всего три дозы. Цисплатин вводили каждые 24 часа, начиная с 14 суток; мыши получали всего четыре дозы.

Чтобы оценить эффекты REGN421 и цисплатина в качестве отдельного средства или в комбинированном лечении, регистрировали изменения размеров опухолей. Рост опухоли измеряли за трое суток до начального лечения REGN421, в каждые те сутки, когда лечили REGN421 (сутки 14, 17 и 21) и после этого каждые 3-4 суток до тех пор, пока опухоли не достигали размера ~600 мм³. Размер опухоли in vivo вычисляли, используя формулу (длина×ширина²)/2 (Фиг. 1 и таблица 1).

Таблица 1
ЛЕЧЕНИЕ (МГ/КГ/ДОЗА)	ИРО (%)	ЗРО (сутки)	Подвергнуты эвтаназии (сутки)
hFc	-	-	32
REGN421 (0,5)	-13,7	0	32
REGN421 (2)	83,1	12	44
Цисплатин (0,5)	60,7	13	45
Цисплатин (2)	53,8	9	41
REGN421 (0,5) + цисплатин (0,5)	4,4	2	34

REGN421 (0,5) + цисплатин (2)	-0,8	0	28
REGN421 (2) + цисплатин (0,5)	104,8	49	>81
REGN421 (2) + цисплатин (2)	57,9	7	39

Ингибирование роста опухоли, ИРО, определяли посредством вычисления разницы в размере опухоли для опухоли, подвергавшейся лечению (Л), против контроля с носителем (К) в те сутки, когда когорту подвергали эвтаназии (т.е., на 32 сутки); ИРО = [1-(Л_{конечн.} - Л_{начальн.})/(К_{конечн.} - К_{начальн.})]×100.

Задержку роста опухоли, ЗРО, оценивали как разность в сутках между опухолями, подвергавшимися лечению (Л), против контроля (К), когда каждая когорта достигала точно определенного размера опухоли. Предварительно определяемый размер опухоли для этого эксперимента составлял 600 мм³.

Результаты показывают, что лечение с использованием только REGN421 вызывало 54% уменьшение роста опухоли. Лечение только цисплатином приводило к сниженному росту опухоли (61% снижение для дозы 0,5 мг/кг/инъекция; и 54% снижение для дозы 2 мг/кг/инъекция). Комбинированное лечение вызывало более значительное снижение роста опухоли, чем лечение любым отдельным средством (104% снижение для 0,5 мг/кг/инъекция цисплатина плюс 2 мг/кг/инъекция REGN421; и 58% снижение для 2 мг/кг/инъекция цисплатина плюс 2 мг/кг/инъекция REGN421).

Эти результаты показывают, что лечение опухолей с использованием комбинации блокатора Dll4 вместе с цисплатином, при дозе блокатора Dll4 2 мг/кг/инъекция и цисплатина 0,5 мг/кг/инъекция, может вести к более сильному ингибированию роста опухоли, чем любое отдельное средство.

Пример 2: Эффект антитела против hDll4 в комбинации с цисплатином

Эффект REGN421 в комбинации с цисплатином, оказываемый на рост опухоли, оценивали на опухолях, имплантированных гуманизированным Dll4 ТКИД мышам, как описано выше. Каждой мыши имплантировали подкожно (sc) 5×10⁶ опухолевых клеток A549 человека (немелкоклеточный рак легких или «NSCLC»). После того, как у мышей развивались опухоли (размер опухоли 100-150 мм³, приблизительно 29 суток после имплантации), опухоли измеряли, рандомизировали и лечили с использованием hFc, REGN421, цисплатина или комбинации REGN421 и цисплатина. Всего 36 мышей делили на 6 групп (n=6 на когорту). Первую группу лечили sc с использованием hFc в дозе 2 мг/кг; вторую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг; третью и четвертую группы лечили ip с использованием цисплатина в дозе 2,5 и 4,5 мг/кг, соответственно; пятую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг и ip с использованием цисплатина в дозе 2,5 мг/кг; и шесту группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг и ip с использованием цисплатина в дозе 4,5 мг/кг. REGN421 вводили каждые 3-4 суток, начиная с 29 суток, и мыши получали всего три дозы. Цисплатин вводили каждые 24 часа, начиная с 29 суток, и мыши получали всего две дозы.

Чтобы оценить эффекты REGN421 и цисплатина в качестве отдельного средства или в комбинации, измеряли размер опухоли (объем), начав за трое суток до начального лечения REGN421, в каждые сутки лечения каждым средством (сутки 29, 30, 33, 36) и после этого каждые 3-4 суток до тех пор, пока опухоли не достигали размера ~600 мм³. Размер опухоли in vivo вычисляли с использованием формулы (длина×ширина²)/2. Эффекты, оказываемые на рост опухоли, представлены на фиг. 2 и в таблице 2.

Таблица 2
Лечение (мг/кг общая доза)	ИРО (%) на 57 сутки	ЗРО (сутки)
hFc	-	-
REGN421 2 мг/кг (6)	54	8
Цисплатин 2,5 мг/кг (5)	35	4
Цисплатин 4,5 мг/кг (9)	22	11
REGN421 2 мг/кг (6) + цисплатин 2,5 мг/кг (5)	69	21
REGN421 2 мг/кг (6) + цисплатин 4,5 мг/кг (9)	80	26

Результаты показывают, что лечение с использованием только REGN421 вызывало 54% снижение роста опухоли. Лечение только цисплатином приводило к сниженному росту опухоли (35% снижение для дозы 2,5 мг/кг/инъекция; и 22% снижение для дозы 4,5 мг/кг/инъекция). Комбинированное лечение вызывало более значительное снижение роста опухоли, чем лечение любым отдельным средством (69% снижение для 2,5 мг/кг/инъекция цисплатина плюс 2 мг/кг/инъекция REGN421; и 80% снижение для 4,5 мг/кг/инъекция цисплатина плюс 2 мг/кг/инъекция REGN421). Комбинированное лечение значительно задерживало рост опухоли (21 сутки для 2,5 мг/кг/инъекция цисплатина плюс 2 мг/кг/инъекция REGN421; и 26 суток для 4,5 мг/кг/инъекция цисплатина плюс 2 мг/кг/инъекция REGN421), по сравнению с контролем и любым отдельным средством (p<0,01).

Эти результаты показывают, что лечение опухолей с использованием комбинации блокатора Dll4 вместе с цисплатином, при дозе блокатора Dll4 2 мг/кг/инъекция и цисплатина 2,5-4,5 мг/кг/инъекция, может вести к более сильному ингибированию роста опухоли, чем любое отдельное средство.

Пример 3: Эффект антитела против hDll4 в комбинации с доцетакселом

Эффект антитела против Dll4 в комбинации с доцетакселом (TAXOTERE®), оказываемый на рост опухоли, оценивали на опухолях, имплантированных мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД). Каждой мыши имплантировали подкожно (sc) 1×10⁶ опухолевых клеток C6 крысы (клетки глиобластомы). После того, как развивались опухоли (размер опухоли ~ 100-150 мм³, приблизительно 13 суток после имплантации), мышей лечили с использованием hFc, доцетаксела, антитела к Dll4 или комбинации доцетаксел плюс антитело к Dll4. Поскольку эти мыши экспрессировали Dll4 мыши, использованное в этом эксперименте Dll4 Ab получали самостоятельно, основываясь на опубликованной последовательности (публикация международной патентной заявки WO 2007/143689), и обозначили как REGN 577. REGN 577 связывает Dll4 человека и мыши, но его связывание с Dll1 и JAG1 человека не поддается обнаружению. Всего 30 несущих опухоли самцов мышей рандомизировали в шесть групп (N=5). Первую группу лечили подкожно с использованием hFc (доза 25 мг/кг) и внутривенно (iv) с использованием носителя; вторую группу лечили sc с использованием REGN577 в дозе 5 мг/кг; третью группу лечили iv доцетакселом в дозе 4,5 мг/кг; четвертую группу лечили iv доцетакселом в дозе 6 мг/кг; пятую группу лечили iv доцетакселом в дозе 4,5 мг/кг плюс sc REGN577 в дозе 5 мг/кг; шестую группу лечили iv доцетакселом в дозе 6 мг/кг плюс sc REGN577 в дозе 5 мг/кг. Доцетаксел и/или антитело к Dll4 вводили в те же сутки. Животных лечили 2 раза в неделю, и они получили всего 3 дозы. Начиная с тех суток, когда начали лечение, массу тела и опухоли измеряли дважды в неделю до тех пор, пока мышей не подвергали эвтаназии, когда опухоли достигали размера ~600 мм³. Размер опухоли вычисляли, используя формулу (длина×ширина²)/2.

Контрольные опухоли достигали размера ~600 мм³ и их собирали на 25 сутки. На 25 сутки результаты показывают, что лечение только антителом к Dll4 вызывало умеренное снижение роста опухоли (приблизительно на 44%). Лечение только доцетакселом приводило к сниженному росту опухоли (62% снижение для дозы 4,5 мг/кг; и 70% снижение для дозы 6 мг/кг). Комбинированное лечение вызывало более значительное снижение роста опухоли (75% снижение для 4,5 мг/кг доцетаксела плюс Dll4 Ab; и 81% снижение для 6 мг/кг доцетаксела плюс Dll4 Ab), чем контроль и лечение любым отдельным средством. Определяли ИРО и ЗРО (таблица 3).

Таблица 3
Лечение (мг/кг общая доза)	ИРО (%) на 25 сутки	ЗРО (сутки)
REGN577 5 мг/кг (15)	44	3
Доцетаксел 4,5 мг/кг (13,5)	62	6
Доцетаксел 6 мг/кг (18)	70	7
REGN577 5 мг/кг (15) + доцетаксел 4,5 мг/кг (13,5)	75	10
REGN577 5 мг/кг (15) + доцетаксел 6 мг/кг (18)	81	13

Эти результаты показывают, что лечение опухолей комбинацией блокатора Dll4 вместе с различными дозами доцетаксела может задерживать рост опухоли почти вдвое дольше и вести к более сильному ингибированию роста опухоли, чем любое отдельное средство.

Пример 4: Эффект антитела против hDll4 в комбинации с доцетакселом

Эффект антитела против Dll4 в комбинации с доцетакселом (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), оказываемый на рост опухоли, оценивали на опухолях, имплантированных мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД). Каждой мыши имплантировали «псевдо-ортотопически» (подкожно в молочную железу #3) 5×10⁶ клеток опухоли груди MDA-MB-231 человека с MATRIGEL™ (BD Biosciences партия № 84540). После того, как у мышей развивались опухоли (размер опухоли ~150-200 мм³, приблизительно 45 суток после имплантации), мышей лечили с использованием hFc, доцетаксела, антитела к Dll4 или комбинации доцетаксел плюс антитело к Dll4. Всего 25 несущих опухоли самцов мышей рандомизировали в пять групп (N=5 мышей на группу). Первую группу лечили подкожно с использованием hFc (доза 25 мг/кг) и внутривенно (iv) с использованием носителя; вторую группу лечили sc антителом к Dll4 REGN577 в дозе 5 мг/кг; третью группу лечили iv доцетакселом в дозе 4,5 мг/кг; четвертую группу лечили iv доцетакселом в дозе 6 мг/кг; пятую группу лечили iv доцетакселом в дозе 6 мг/кг плюс sc REGN577 в дозе 5 мг/кг. Доцетаксел и/или антитела к Dll4 вводили в те же сутки. Животных лечили 2 раза в неделю, и они получали всего 3 дозы. Начиная с тех суток, когда начинали лечение, массу тела и опухоли измеряли дважды в неделю до тех пор, пока мышей не подвергали эвтаназии. Мышей подвергали эвтаназии, когда опухоли достигали размера ~600 мм³. Размер опухоли вычисляли, используя формулу (длина×ширина²)/2.

Контрольные опухоли достигали ~600 мм³ и их собирали на 63 сутки. На 63 сутки результаты показывают, что лечение только доцетакселом вызывало умеренное уменьшение роста опухоли (37% снижение для дозы 4,5 мг/кг; и 52% снижение для дозы 6 мг/кг). Лечение только антителом к Dll4 вызывало значительное снижение роста опухоли (приблизительно 85% снижение); при этом комбинированное лечение приводило к регрессии опухоли (105% снижение для 6 мг/кг доцетаксела плюс Dll4 Ab). Определяли ИРО и ЗРО (таблица 4).

Таблица 4
Лечение (мг/кг общая доза)	ИРО (%) на 25 сутки	ЗРО (сутки)
REGN577 5 мг/кг (15)	85	21
Доцетаксел 4,5 мг/кг (13,5)	37	4

Доцетаксел 6 мг/кг (18)	52	4
REGN577 5 мг/кг (15) + доцетаксел 6 мг/кг (18)	105	28

Лечение только доцетакселом приводило к минимальной задержке роста опухоли (4 суток для дозы 4,5 мг/кг; и 4 суток для дозы 6 мг/кг). Опухоли, которые лечили только антителом к Dll4, задерживали рост опухоли на 21 сутки. Комбинированное лечение задерживало рост опухоли дольше по сравнению с контролем и лечением любым отдельным средством (28 суток для 6 мг/кг доцетаксела плюс Dll4 Ab; p<0,5).

Эти результаты показывают, что опухоли MDA-MB-231 умеренно восприимчивы к лечению только доцетакселом, но очень чувствительны к лечению с использованием антитела против Dll4. Комбинация блокатора Dll4 вместе с доцетакселом может дольше задерживать рост опухоли и немного улучшать ингибирование роста опухоли (регрессия опухоли) по сравнению с любым отдельным средством.

Пример 5: Эффект антитела против hDll4 в комбинации с 5-FU

Эффект антитела против Dll4 (REGN421) в комбинации с 5-FU, оказываемый на рост опухоли, оценивали на опухолях, имплантированных гуманизированным Dll4 ТКИД мышам. Каждой мыши имплантировали подкожно (sc) 5×10⁶ опухолевых клеток HCT116 человека (CRC). После того, как у мышей развивались опухоли (размер опухоли ~150 мм³, 22 суток после имплантации), опухоли измеряли и рандомизировали. Затем мышей лечили с использованием hFc, REGN421, 5-FU или комбинации REGN421 и 5-FU. Всего 30 мышей делили на 6 групп (n=5 на когорту). Первую группу лечили sc с использованием hFc в дозе 2 мг/кг; вторую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг; третью и четвертую группы лечили ip с использованием 5-FU в дозе 15 и 25 мг/кг, соответственно; пятую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг и ip с использованием 5-FU в дозе 15 мг/кг; и шестую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг и ip с использованием 5-FU в дозе 25 мг/кг. REGN421 вводили каждые 3-4 суток, начиная с 22 суток, и мыши получали всего три дозы. 5-FU вводили каждые 3-4 суток, начиная с 22 суток, и мыши получали всего три дозы.

Чтобы оценить эффекты REGN421 и 5-FU в качестве отдельных средств или в комбинации, измеряли изменения размера опухоли (объема), начав за трое суток до начального лечения REGN421, и затем в каждые сутки лечения каждым средством (сутки 22, 26, 29) и после этого каждые 3-4 суток до тех пор, пока опухоли не достигали размера ~600 мм³. Размер опухоли in vivo вычисляли, используя формулу (длина×ширина²)/2 (фиг. 3 и таблица 5).

Таблица 5
Лечение (мг/кг общая доза)	ИРО (%) на 39 сутки	ЗРО (сутки)
REGN421 2 мг/кг (6)	36,3	6
5-FU 15 мг/кг (45)	5,6	4
5-FU 25 мг/кг (75)	0	2
REGN421 2 мг/кг (6) + 5-FU 15 мг/кг (45)	66,8	7
REGN421 2 мг/кг (6) + 5-FU 25 мг/кг (75)	63,3	7

Лечение только 5-FU приводило к минимальной задержке роста опухоли (4 суток для суммарной дозы 45 мг/кг; и 2 суток для суммарной дозы 75 мг/кг). Опухоли, которые лечили только антителом к Dll4, задерживало рост опухоли на 6 суток. Комбинированное лечение задерживало рост опухоли дольше по сравнению с контролем (p<0,043).

Пример 6: Эффект антитела против hDll4 в комбинации с иринотеканом

Эффект антитела против Dll4 (REGN421) в комбинации с иринотеканом (гидрохлорид иринотекана), оказываемый на рост опухоли, оценивали на опухолях, имплантированных гуманизированным Dll4 ТКИД мышам.

Каждой мыши имплантировали подкожно (sc) 5×10⁶ опухолевых клеток HCT116 человека. После того, как у мышей развивались опухоли (размер опухоли ~150 мм³, 15 суток после имплантации), опухоли измеряли и рандомизировали. Затем мышей лечили с использованием hFc, REGN421, иринотекана или комбинации REGN421 и иринотекана. Всего 30 мышей делили на 6 групп (n=5 на когорту). Первую группу лечили sc с использованием hFc в дозе 2 мг/кг; вторую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг; третью и четвертую группы лечили ip иринотеканом в дозе 7,5 и 25 мг/кг, соответственно; пятую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг и ip иринотекана в дозе 7,5 мг/кг; и шестую группу лечили sc с использованием REGN421 в дозе 2 мг/кг и ip иринотекана в дозе 25 мг/кг. REGN421 вводили каждые 3-4 суток, начиная с 15 суток, и мыши получали всего три дозы. Иринотекан вводили каждые 3-4 суток, начиная с 15 суток, и мыши получали всего три дозы.

Чтобы оценить эффекты REGN421 и иринотекана в качестве отдельных средств или в комбинированном лечении, измеряли изменения размера опухоли (объема), начиная за трое суток до начального лечения REGN421, и затем в каждые сутки лечения каждым средством (сутки 15, 19, 22) и после этого каждые 3-4 суток до тех пор, пока опухоли не достигали размера ~600 мм³. Размер опухоли in vivo вычисляли, используя формулу (длина×ширина²)/2. Результаты представлены на фиг. 4 и в таблице 6.

Таблица 6
Лечение (мг/кг общая доза)	ИРО (%) на 39 сутки	ЗРО (сутки)
REGN421 2 мг/кг (6)	81,3	9
Иринотекан 7,5 мг/кг (22,5)	71,2	8
Иринотекан 25 мг/кг (75)	100,5	16
REGN421 2 мг/кг (6) + иринотекан 7,5 мг/кг (22,5)	91,5	10
REGN421 2 мг/кг (6) + иринотекан 25 мг/кг (75)	119,6	19

Лечение только иринотеканом приводило к задержке роста опухоли (8 суток для суммарной дозы 22,5 мг/кг; и 16 суток для суммарной дозы 75 мг/кг). Опухоли, которые лечили только антителом к Dll4, задерживали рост опухоли на 9 суток. Комбинированное лечение значительно улучшало эффективность против опухолей, и задерживало рост опухоли дольше по сравнению с лечением любым отдельным средством (19 суток для 75 мг/кг иринотекана плюс Dll4 Ab; p<0,0001).

Пример 7: Эффект антитела против hDll4, оказываемый на экспрессию гена Hey1 в опухоли Colo205

Эффект антитела против hDll4, оказываемый на дифференциальную экспрессию генов в опухолях, исследовали у гуманизированных Dll4 ТКИД мышей, которым имплантировали клетки колоректальной опухоли Colo205 человека. В кратком изложении, самцам и самкам гуманизированных Dll4 ТКИД мышей подкожно имплантировали 2×10⁶ клеток Colo205 на мышь. Когда опухоли достигали ~150 мм³, мышей (4 животных на группу) лечили однократной дозой REGN421, равной 0,5, 5 или 15 мг/кг, или контролем hFc 15 мг/кг. Опухоли иссекали через 5 часов, 10 часов, 24 часа, 72 часа и 7 суток после лечения и хранили в стабилизирующем реактиве RNAlater (Qiagen). РНК опухоли очищали с использованием набора RNEASY® Midi (Qiagen). Ткани гомогенизировали в лизирующем буфере, содержащем β-меркаптоэтанол, в смесительном измельчителе, загружали на колонки и вымывали несвязанные загрязнители. На колонке осуществляли расщепление ДНКазой I и элюировали РНК в воде, не содержащей РНКазу. Цианин 3 (Cy3)-CTP встраивали в амплифицированную кРНК из 500 нг общей РНК с использованием набора для амплификации РНК QUICK AMP™ (Agilent Technologies). Затем меченую Cy3 кРНК из каждого образца гибридизовали со специализированным чипом, покрывающим транскриптомы как мыши, так и человека. Гибридизацию и отмывание чипов осуществляли в соответствии с протоколом производителя, и чипы сканировали на сканере Agilent Microarray. Данные извлекали из изображений сканированных чипов с использованием программного обеспечения Agilent Feature Extraction 9.5.

Для идентификации генов, дифференциально экспрессируемых между контролем и группами лечения, в полном геномном профиле каждого образца находили точку с наименьшим расстоянием до всех точек на чипе. Затем значения экспрессии генов сравнивали между двумя группами с использованием критерия Стьюдента для модели случайной дисперсии (Simon, R.A. et al., 2007, «Analysis of Gene Expression Data Using BRB-Array Tools», Cancer Inform 3:11-7). Выбирают те гены, которые между двумя группами имеют среднее изменение более чем в 1,5 раза и p-значение <0,05, и ранжируют их по убыванию кратности изменения. Также проводят общий тест, в котором этикетки отдельных образцов переставляют вплоть до 1000 раз, и повторяют процесс отбора генов. Так определяют, превышает ли число генов, идентифицированных как дифференциально экспрессируемые между двумя группами, количество, которое можно было бы случайно ожидать.

Hey1 является членом семейства Hey, которое идентифицировано как непосредственные нисходящие мишени активации Notch, и было показано, что ингибирование передачи сигнала по пути Dll4-Notch в опухолях in vivo в исследованиях на мышах приводило к снижению уровней РНК Hey-1 (Noguera-Troise, I et al., 2006, Nature 444(7122):1032-7). Как показано на фиг. 5, анализ уровней мРНК Hey1 в текущем исследовании с использованием микрочипов показал, что уровни мРНК Hey1 были снижены у мышей, которых лечили REGN421, по сравнению с мышами, которых лечили контрольным hFc, начиная с 10 часов после лечения, но были наиболее значительно снижены через 72 часа и 7 суток после лечения. Значительное снижение не наблюдали при дозе 0,5 мг/кг, т.е. при наименьшей дозе REGN421. Эти результаты показывают, что REGN421 эффективно блокировал сигнальный путь Notch и что Hey1 может быть эффективным фармакодинамическим маркером ингибирования передачи сигнала Notch антителом к Dll4.

Пример 8: Предварительное фармакокинетическое исследование в фазе I

Далее изучали REGN421 в первом исследовании у человека. Основная задача исследования состоит в том, чтобы определить рекомендованную дозу REGN421 для дальнейших исследований эффективности. Дополнительные задачи состоят в том, чтобы охарактеризовать профиль безопасности лекарственного средства, его фармакокинетику, иммуногенность и фармакодинамику, а также предварительное подтверждение эффективности. В этом исследовании антитело против hDll4 REGN421 вводят внутривенно каждые 3 недели тем пациентам, у которых рак прогрессирует при стандартной терапии. Дизайн исследования повторяет стандартный способ для эскалации дозы и определения ограничивающей дозу токсичности. В настоящее время 7 пациентов получали лечение 0,25 мг/кг/доза каждые три недели, и 6 пациентов получали лечение 0,50 мг/кг/доза каждые три недели. Для фармакокинетического исследования брали образцы крови перед дозированием, в 0 час, и после дозирования через 1, 2, 4 и 8 часов на 1 сутки, а потом на 2, 3, 4, 8 и 15 сутки 1 цикла; и перед дозированием, в 0 час на 1 сутки во 2 и последующих циклах, и при последующем наблюдении после лечения на 15, 30 и 60 сутки. Уровни REGN421 в плазме/сыворотке в образцах измеряли посредством ELISA с верхним пределом количественного определения 2,5 мкг/мл и нижним пределом количественного определения 0,039 мкг/мл в образце неразбавленной сыворотки. Исследование проводили непрерывно с намерением ввести более высокие дозы, определенные в протоколе как 1, 2, 4 и 7 мг/кг/доза.

Доступные в настоящее время данные, отражающие фармакокинетические параметры в плазме после одной 30-мин. IV инфузии REGN421 в дозе 0,25 мг/кг (7 пациентов) и 0,5 мг/кг (2 пациента), представлены в таблице 7. C_max: максимальная концентрация лекарственного средства в сыворотке; T_last: время, когда концентрация лекарственного средства поддавалась количественному определению в последний раз; C_last: последняя поддающаяся количественному определению концентрация лекарственного средства; AUC_last: площадь под кривой вплоть до последней концентрации лекарственного средства; AUC: общая площадь под кривой (т.е. экспозиция лекарственного средства); t_1/2z: конечный период полувыведения; V_ss: объем распределения в равновесном состоянии; CL: скорость клиренса лекарственного средства. Значения: среднее, (CV%), и [диапазон] (a: медиана [диапазон]).

Таблица 7
Доза (мг/кг)	C max (мкг/кг)	T last a (ч)	C last (мкг/мл)	AUC last (мкг×ч/мл)	AUC (мкг×ч/мл)	T 1/2Z (ч)	V ss (л)	CL (л/ч)
0,25 (n=7)	6,27 (30,5)	170 [72-240]	0,51 (57,7)	452 (56,7)	489 (55,9)	47,1 (33,5)	2,85 (27,3)	0,0473 (39,5)
0,5 (n=2)	9,88 [9,25-10,5]	203 [73-333]	2,24 [0,976-3,51]	759 [479-1040]	963 [684-1240]	92,3 [40,6-144]	3,64 [2,65-4,63]	0,0355 [0,0273-0,0436]

Как показано в таблице 7, пиковые концентрации REGN421 в сыворотке имели средние значения 6,27 мкг/мл при уровне дозы 0,25 мг/кг, и 9,88 мкг/мл при уровне дозы 0,50 мг/кг. Эти значения находятся в диапазоне концентраций REGN421, связанных с противоопухолевой активностью в моделях ксенотрансплантации на животных.

Фармакодинамический эффект REGN421, оказываемый на путь передачи сигнала Dll4-notch, анализировали с использованием технологии микрочипов на образцах сыворотки пациентов, собранных перед, а также через 24 часа после введения REGN421. Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8
Пациент	Доза (мг/кг)	Транскрипт Hey-1 Отношение уровня после лечения к уровню до лечения
1	0,25	0,52
2	0,25	0,85
3	0,25	0,77
4	0,25	0,51
5	0,25	0,61
6	0,25	0,55
7	0,25	0,75
8	0,5	0,68
9	0,5	0,82

Как показано в таблице 8, во всех образцах экспрессия гена Hey-1 после введения REGN421 снижалась по сравнению с образцами, полученными до лечения. Как наблюдали в модели опухолевого ксенотрансплантата на гуманизированных Dll4 ТКИД мышах (см. пример 7, выше), наблюдения показывают, что REGN421 действительно ингибирует биологическую активность Dll4 у человека.

Пример 9: Dll4 Ab в комбинации с гемцитабином для пациентов I фазы

Исследование следует проводить у взрослых пациентов с распространенным или метастатическим раком, который резистентен к стандартной терапии или не имеет одобренных вариантов лечения. Пациенты, у которых диагностировали распространенные солидные злокачественные опухоли по данным патологического, физикального и радиологического исследования, с оценкой общего состояния ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 0-2 (шкала 0-5) и достаточными почечными, печеночными и гематологическими лабораторными параметрами, могут быть допущены к участию в исследовании. Во время исследования пациентам позволено получать параллельную заместительную терапию, такую как гемотрансфузии и анальгетики. Ранее пациенты могли получать химиотерапию или биологическую терапию метастатического заболевания. Пациентов следует определять в когорты непрерывного дозирования в дизайне 3+3. Трех пациентов следует вводить в исследование при одном уровне дозы, и если не возникала ограничивающая дозу токсичность (ОДТ), то должна происходить эскалация дозы до следующего уровня дозы. Если 1 из первых 3 пациентов испытывает ОДТ, то можно ввести 3 дополнительных пациентов при этом уровне дозы. Если 2 из первых 3 пациентов испытывают ОДТ, то тогда этот уровень дозы следует рассматривать в качестве обладающего чрезмерной токсичностью, и 3 дополнительных пациентов следует вводить при предыдущем уровне дозы. Пациенты должны получать в 1 сутки: антитело против Dll4 (например, REGN421 или REGN281) в дозе от 0,25 до 10 мг/кг IV в течение 30 минут плюс IV инфузию гемцитабина 1250 мг/м² в течение 30 минут, и на 8 сутки: IV инфузию гемцитабина 1250 мг/м² в течение 30 минут. Комбинированную схему повторяют каждые 3 недели до тех пор, пока происходит развитие рака или не возникает непереносимая токсичность.

Первичная конечная точка состоит в том, чтобы оценить безопасность, переносимость и ограничивающую дозу токсичность антитела против Dll4 в комбинации с гемцитабином и идентифицировать максимальную переносимую дозу (МПД) антитела против Dll4 в комбинации с гемцитабином у пациентов с распространенными солидными злокачественными опухолями. Вторичные конечные точки включают описание противоопухолевой активности согласно критериям RECIST (Eisenhauer et al., 2009, Eur J Cancer 45:228-247), оценку фармакокинетического (ФК) профиля антитела против Dll4 при введении в комбинации с гемцитабином и определение иммуногенности для антитела против Dll4. Ремиссию заболевания оценивают, используя физикальное исследование, радиологические способы (рентген, компьютерную томографию или магнитно-резонансную томографию). Нежелательные явления оценивают с использованием общих терминологических критериев Национального института рака для нежелательных явлений (CTCAE v. 4.0, которые доступны в рамках программы оценки терапии рака или CTEP на сайте Национального института рака). Образцы сыворотки берут у пациентов для изменения концентраций антитела против Dll4, а также присутствия возможных антител к антителу против Dll4.

Пример 10: Введение Dll4 Ab и FOLFOX пациентам с CRC

В кратком изложении, взрослые пациенты, у которых диагностировали наличие местно распространенного или метастатического рака толстой кишки по данным патологического, физикального и радиологического исследования, с оценкой общего состояния ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 0-2 (шкала 0-5) и достаточными почечными, печеночными и гематологическими лабораторными параметрами, могут быть допущены к участию в исследовании. Во время исследования пациентам позволено получать параллельную заместительную терапию, такую как гемотрансфузии и анальгетики. Ранее пациенты могли не получать химиотерапию (или антиангиогенную терапию или терапию против EGFR) метастатического заболевания; перед такой терапией допускается вспомогательное лечение их заболевания, и оно должно было быть завершено по меньшей мере за 12 месяцев до включения в это исследование. Пациентов случайно в соотношении 1:1 определяют для получения внутривенной химиотерапии по FOLFOX (сутки 1: IV инфузия оксалиплатина 85 мг/м² и IV инфузия лейковорина (фолиновая кислота) 200 мг/м², с последующим IV болюсом 5-FU 400 мг/м², доставленным в течение 2-4 минут, с последующим IV 5-FU 600 мг/м² в виде 22-часовой непрерывной инфузии. Сутки 2: IV инфузия лейковорина 200 мг/м², с последующим IV болюсом 5-FU 400 мг/м², доставленным в течение 2-4 минут, с последующей IV инфузией 5-FU 600 мг/м² в виде 22-часовой непрерывной инфузии) с бевацизумабом (AVASTIN®: гуманизированное моноклональное Ab антитело против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), Genentech) (сутки 1: 10 мг/кг IV) каждые 2 недели, или антителом против Dll4 (REGN421) в дозе от 0,25 до 10 мг/кг IV в 1 сутки, в комбинации с ранее указанным лечением. Лечение повторяют каждые 2 недели, пока происходит развитие рака или не возникает непереносимая токсичность.

Первичная конечная точка представляет собой пропорцию пациентов, которые достигли по меньшей мере частичной ремиссии (снижение на 30% или более суммы диаметров идентифицированных злокачественных повреждений, в соответствии с критериями RECIST (Eisenhauer et al., 2009, выше), и вторичные конечные точки включают время развития опухоли, и общую выживаемость. Ремиссию заболевания оценивают, используя физикальное исследование, радиологические способы (рентген, компьютерную томографию или магнитно-резонансную томографию) и уровень эмбрионального ракового антигена (ЭРА), измеренный в сыворотке. Также оценивают другие клинические параметры, такие как нежелательные явления, с использованием общих терминологических критериев Национального института рака для нежелательных явлений (CTCAE v 4.0, выше). Образцы сыворотки пациентов берут измерения в сыворотке концентрации антитела против Dll4, а также присутствия возможных антител к антителам против Dll4.

Пример 11: II фаза для Dll4 Ab в комбинации с доцетакселом

Исследование проводят у взрослых пациентов с распространенным неоперабельным или метастатическим раком молочной железы. У них могла быть неудачная предшествующая вспомогательная терапия. Пациенты, у которых диагностировали наличие рака молочной железы по данным патологического, физикального и радиологического исследования, с оценкой общего состояния ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 0-2 (по шкале 0-5) и достаточными почечными, печеночными и гематологическими лабораторными параметрами, могут быть допущены к участию в исследовании. Во время исследования пациентам позволено получать параллельную заместительную терапию, такую как гемотрансфузии и анальгетики. Пациенты могли не получать предшествующую химиотерапию или биологическую терапию метастатического заболевания. После успешного прохождения процедур проверки для определения соответствия пациента требованиям, следует лечить непрерывную когорту из вплоть до 100 пациентов. Пациенты должны получать в 1 сутки: антитело против Dll4 (REGN421) IV в дозе 0,25 до 10 мг/кг в течение 30 минут плюс IV инфузию доцетаксела 75 мг/м² в течение 30 минут. Комбинированную схему повторяют каждые 3 недели, пока происходит развитие рака или не возникает непереносимая токсичность.

Первичная конечная точка состоит в том, чтобы оценить эффективность лечения на основе скорости ответа опухоли в соответствии с критериями RECIST (Eisenhauer et al., 2009, Eur J Cancer 45:228-247) и времени для развития заболевания. Вторичные конечные точки включают описание безопасности и фармакокинетического (ФК) профиля антитела против Dll4 при введении в комбинации с доцетакселом, а также определение иммуногенности для антитела против Dll4. Ремиссию заболевания оценивают, используя физикальное исследование, радиологические способы (рентген, компьютерную томографию или магнитно-резонансную томографию). Нежелательные явления оценивают с использованием общих терминологических критериев Национального института рака для нежелательных явлений (CTCAE v. 4.0, которые доступны в рамках программы оценки терапии рака или CTEP на сайте Национального института рака). Образцы сыворотки берут у пациентов для изменения концентраций антитела против Dll4, а также присутствия возможных антител к антителу против Dll4.

Пример 12: Исследование II фазы для Dll4 Ab с цисплатином/гемцитабином

Исследование следует проводить у взрослых пациентов с распространенным неоперабельным или метастатическим раком мочевого пузыря. Пациенты, у которых диагностировали наличие инвазивного рака мочевого пузыря по данным патологического, физикального и радиологического исследования, с оценкой общего состояния ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 0-2 (шкала 0-5) и достаточными почечными, печеночными и гематологическими лабораторными параметрами, могут быть допущены к участию в исследовании. Во время исследования пациентам позволено получать параллельную заместительную терапию, такую как гемотрансфузии и анальгетики. Пациенты могли не получать предшествующую химиотерапию или биологическую терапию метастатического заболевания. После успешного прохождения процедур проверки для определения соответствия пациента требованиям, следует лечить непрерывную когорту из вплоть до 100 пациентов. Пациенты должны получать антитело против Dll4 (REGN421) IV в дозе от 0,25 до 10 мг/кг в течение 30 минут в 1 сутки плюс гемцитабин 1,000 мг/м² в течение от 30 до 60 минут в 1, 8 и 15 сутки плюс цисплатин 70 мг/м² во 2 сутки. Комбинированную схему повторяют каждые 4 недели, пока происходит развитие рака или не возникает непереносимая токсичность.

Первичная конечная точка состоит в том, чтобы оценить эффективность лечения на основе скорости ответа опухоли в соответствии с критериями RECIST (Eisenhauer et al., 2009, Eur J Cancer 45:228-247) и времени для развития заболевания. Вторичные конечные точки должны включать профиль безопасности и описание фармакокинетического (ФК) профиля антитела против Dll4 при введении в комбинации с доцетакселом и определение иммуногенности для антитела против Dll4. Ремиссию заболевания оценивают, используя физикальное исследование, радиологические способы (рентген, компьютерную томографию или магнитно-резонансную томографию). Нежелательные явления оценивают с использованием общих терминологических критериев Национального института рака для нежелательных явлений (CTCAE v. 4.0, которые доступны в рамках программы оценки терапии раков или CTEP на сайте Национального института рака). Образцы сыворотки берут у пациентов для изменения концентраций антитела против Dll4, а также присутствия возможных антител к антителу против Dll4.

1. Применение выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают дельта-подобный лиганд 4 человека (hDll4), для получения лекарственного средства для применения при:
(a) лечении солидной злокачественной опухоли у субъекта в синергетической комбинации с химиотерапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства на основе платины или аналога пиримидина; или
(b) для замедления или остановки роста солидной опухоли у субъекта в синергетической комбинации с химиотерапевтическим средством, выбранным из химиотерапевтического средства на основе платины или аналога пиримидина,
где антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 22, 24 и 26, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую последовательности легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 SEQ ID NO: 30, 32 и 34, соответственно.

2. Применение по п. 1, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность HCVR SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 116 или последовательность LCVR SEQ ID NO: 28 или SEQ ID NO: 118.

3. Применение по п. 1, где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит комбинацию HCVR/LCVR SEQ ID NO: 20/28 или 116/118.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где химиотерапевтическим средством на основе платины является цисплатин, карбоплатин, ипроплатин или оксалиплатин; или их фармацевтически приемлемая соль.

5. Применение по п. 4, где химиотерапевтическим средством на основе платины является цисплатин.

6. Применение по любому из пп. 1-3, где аналогом пиримидина является гемцитабин, 5-FU или капецитабин; или их фармацевтически приемлемая соль.

7. Применение по п. 6, где аналогом пиримидина является 5-FU.

8. Применение по п. 1, где солидную злокачественную опухоль выбирают из рака яичников, рака матки, рака молочной железы, рака легких, рака печени, рака толстой кишки, рака мочевого пузыря, рака почки, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака кости, рака кожи и злокачественной саркомы мягких тканей.

9. Применение по п. 5, где солидная злокачественная опухоль представляет собой рак мочевого пузыря или рак легких.

10. Применение по п. 7, где солидная злокачественная опухоль представляет собой рак толстой кишки.

11. Применение по п. 1, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент и химиотерапевтическое средство предназначены для одновременного или последовательного применения в комбинации.

12. Применение по п. 1, где субъект представляет собой человека.