Система ремедиации тяжелых металлов

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и представляет собой бактериальную клетку, способную реплицироваться в среде, содержащей по меньшей мере один тяжелый металл, выбранный из ртути, кадмия, цинка и свинца. Указанная бактериальная клетка трансформирована по меньшей мере одним хелатирующим агентом, выбранным из генов mt,β-галактозидазы и ppk. При этом указанные гены не экспрессируются как слитый белок в случае использования нескольких генов одновременно, экспрессируются с сильного промотора и по меньшей мере одного из 5'UTR и 3'UTR. Указанная клетка продуцирует более 4000 полных копий мРНК хелатирующего агента на нг суммарной мРНК. Настоящее изобретение раскрывает способы очистки жидкости от загрязнения тяжелыми металлами с использованием культуры указанных бактериальных клеток либо твёрдого матрикса, содержащего β-галактозидазу, а также наборы для обнаружения загрязнения тяжелыми металлами, содержащие культуру указанных бактериальных клеток. Настоящее изобретение позволяет повысить устойчивость конструируемых бактериальных клеток к высоким концентрациям тяжелых металлов. 5 н. и 17 з.п. ф-лы, 11 ил., 7 пр.

 

Данное изобретение было отчасти выполнено с использованием материалов, разработанных за счет гранта правительства США NSF СВЕТ-0755649, предоставленного Национальным научным фондом. Правительство может обладать определенными правами на данное изобретение.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В отношении данной заявки на патент испрашивается приоритет по предварительной заявке США №61/235624, поданной 20 августа 2009.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к области молекулярной биологии, направленной на создание генетически модифицированных бактерий, устойчивых к тяжелым металлам и способным к их секвестрации и аккумуляции, включая ртуть, свинец и кадмий, для биоремедиации загрязненных жидкостей и твердых веществ.

ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Металлические химические элементы, которые обладают относительно высокой плотностью, часто называют тяжелыми металлами. Тяжелые металлы токсичны даже в низких концентрациях. Токсичные тяжелые металлы включают ртуть, кадмий, свинец, цинк и серебро. Среди этих тяжелых металлов особенно токсичными считают ртуть, свинец и кадмий.

Ртуть вносится в окружающую среду в виде побочного продукта промышленных и природных процессов и может накапливаться в почве и в осадочных отложениях в высоких концентрациях. Patra, M. and Sharma A., Bot. Rev. 66:379-422 (2000). В США электростанции на твердом топливе выбрасывают примерно 48 тонн ртути ежегодно, тогда как в Азии и в Африке электростанции на твердом топливе высвобождают более 1500 тонн в год. Clean Air Mercury Rule. U.S. Environmental Protection Agency ("EPA") 2009, Retrieved February 8, 2009, www.epa.gov/air/mercuryrule/basic.htm. Во всем мире ежегодные выбросы ртути из всех источников оценивают как 4800-8300 тонн. Mercury Human Exposure, EPA 2008, Retrieved February 8, 2009, www.usepa.gov/mercury/exposure.htm.

Соединения ртути являются нейротоксинами и сильными блокаторами транспорта электронов в клетку. Все формы ртути токсичны и представляют риски для здоровья людей и для окружающей среды. Крайне важна разработка недорогой и эффективной системы ремедиации.

Современные стратегии ремедиации, направленные на удаление ртути из окружающей среды, включают промывку сточных труб, химическое восстановление/окисление, земляные работы, вывоз и захоронение вне территории. Эти подходы являются дорогостоящими, разрушительными для окружающей среды и неэффективными. Karenlampi, S. et al., Environ. Pollut. 1007:225-231(2000). Другие способы, такие как витрификация и нанесение защитного бетонного покрытия, делают территорию неиспользуемой и непрактичны при ремедиации больших площадей. Затраты на ремедиацию фунта (0,454 кг) ртути из окружающей среды с помощью современных технологий составляют несколько тысяч долларов. Hussein, H. et al., Env. Sci. Technol. 41:8439-8446 (2007).

Подобно ртути, другие тяжелые металлы, такие как свинец и кадмий, представляют серьезную угрозу для окружающей среды и должны подлежать ремедиации. Свинец является сильным нейротоксином, который может накапливаться в мягких тканях и в костях. В связи с его токсичностью свинец запрещен EPA и другими Агентствами в продуктах потребления, включающих краски, топливо, водопроводные трубы, игрушки и прочее. EPA ограничивает содержание свинца в питьевой воде до менее 0,015 миллионных долей (м.д.). Цинк занимает второе место в списке очередности вредных веществ Закона о всестороннем экологическом реагировании, компенсации и ответственности 2007 г. (Comprehensive Environmental Response Compensation and Liability Act, CERCLA).

Современное широко распространенное применение кадмия во многих областях потребления, в частности в батареях, увеличило загрязнение окружающей среды этим тяжелым металлом. Показано, что кадмий высокотоксичен, вызывает серьезные отравления, разрушение костей, ингибирование клеточных ферментов и разрушение клеточных мембран. Как в случае ртути, современные способы ремедиации или улавливания свинца и кадмия основаны на применении физико-химических способов, включая применение ионообменных смол, осаждение и экстракцию, захоронение, нанесение защитного покрытия на территорию и захоронение вне территории. Kirn, S. et al. J. Biosci. Bioeng. 99: 109-114(2005). Эти способы являются дорогостоящими и/или разрушительными для восстанавливаемой окружающей среды. Необходимы новые технологии, чтобы облегчить ремедиацию загрязненной окружающей среды.

Биоремедиация, использование живых организмов для восстановления загрязненных окружающих сред, может представлять собой потенциально недорогой и благоприятный для окружающей среды подход. Например, бактерии могут разрушать некоторые токсичные соединения до их нетоксичных метаболитов. Однако тяжелые металлические элементы, такие как ртуть, кадмий и свинец, невозможно обезвредить до нетоксичных метаболитов.

Способ биоремедиации ртути посредством испарения ртути основан на экспрессии оперона mer, который управляет транспортом и восстановлением Hg²⁺. Один из генов оперона mer, merA, кодирует редуктазу иона ртути, фермент, который катализирует преобразование Hg²⁺ до Hg⁰. Hg⁰ является летучей, менее реакционной и менее токсичной формой ртути. Jackson, W.J. and Summers, А.О., J.Bacteriol. 151:962-970 (1982). В процессе испарения, однако, элементная ртуть высвобождается в окружающую среду, где она может быть преобразована в более токсичные формы. Другим недостатком способа испарения является то, что он непригоден для обработки воды, поскольку бактерии высвобождают испаряемую элементную ртуть в ту же воду, которая подлежит ремедиации.

Бактерии не имеют эндогенных механизмов, которые обеспечивают высокую устойчивость к ртути, но, в то же время, дают возможность аккумуляции ртути внутри клетки. Генную инженерию использовали для интеграции генов из других организмов с целью повышения устойчивости к ртути и ее аккумуляции. Молекулы, известные как хелаторы или секвестранты, предложены как подходящие удалители тяжелых металлов, которые можно экспрессировать в организмах с целью выделения тяжелых металлов из почвы или воды.

Металлотионеин и полифосфат в бактериальных системах вовлечены в детоксикацию некоторых тяжелых металлов. Эти два агента, экспрессируемые в Е.coli, могут удалять ртуть, кадмий и свинец и, таким образом, защищать бактерии от определенных уровней этих тяжелых металлических элементов. Результаты, однако, к настоящему времени являются разочаровывающими. Бактерии не могут эффективно удалять эти элементы и не выдерживают высокие уровни этих тяжелых металлов. Эти результаты объясняются очевидным недостатком стабильности хелатирующего белкового агента, что приводит к бактериальным системам со слабой толерантностью к тяжелым металлам.

Металлотионеины кодируются генами mt, обнаруженными у млекопитающих, растений и грибов. Sousa, С. et al., J.Bacteriol. 180:2280-2284 (1998). Однако показано, что металлотионеин (MT) нестабилен при экспрессии в бактериях. Berka, Т. et al., J.Bacteriol. 170:21-26 (1988). Поскольку обнаружено, что белок MT нестабилен при экспрессии в бактериях, ген mt был слит со стабилизирующими агентами, такими как глутатион-3-трансфераза (GST), с получением слияний GST-MT. Chen, S. and Wilson D.B., Appl. Env. Microbiol. 63:2442-2445 (1997). Различные конструкции GST-MT включали конструкции дрожжей S.cerevisiae (GST-YMT), человека (GST-HMT) и гороха (GST-PMT). Не было показано, что клетки GST-HMT продуцируют растворимые белки MT, и конструкция не придает какую-либо устойчивость к ртути. Показано, что клетки, экспрессирующие конструкции YMT и РМТ, выдерживают жидкости, содержащие максимум 5 мкМ ртути, - уровень, который почти не является токсичным. Важнее, что клетки, экспрессирующие эти две конструкции, по-видимому, не аккумулировали ртуть или не защищали клетки от ртути, если эти клетки не подвергали дальнейшей модификации с целью экспрессировать гены транспорта ртути оперона тег. Также сделаны различные безуспешные попытки сконструировать множественные копии гена mt N. crassa и другие гены mk человека, направляемые в бактериальную периплазму. Нестабильность и нерастворимость этих белков, однако, продолжала предотвращать их применение в качестве эффективных средств ремедиации. Valls, M. and Lorenzo, V., FEMS Micro. Reviews, 26:327-338 (2002). Хотя эти слитые белки придают некоторую ограниченную толерантность к ртути, этот эффект невозможно четко объяснить белками MT, поскольку партнер слияния GST также известен как связывающий тяжелые металлы, такие как ртуть. Chen, S. and Wilson D.B., Appi. Environ. Microbiol. 63:2442-2445 (1997); Deng, X. and Wilson D.B., Appi. Microbiol. Biotechnol. 56:276-279 (2001); Custodio, H.M., et al., Arch. Environ. Occup.Health 60:17-23 (2005).

Следовательно, сделан вывод, что трансгенные бактерии, модифицированные генами металлотионеина, не обеспечивают адекватную устойчивость в клетках. Beattie, J.H. et al., Toxicol. Lett. 157:69-78 (2005); Odawara, F. et al., J.Biochem. 118:1131-1137 (1995); Park, J.D., et al., Toxicology. 163:93-100 (2001). Приведенные объяснения этой неудачи включают быстрое расщепление малого пептида металлотионеина клеточными протеазами, низким выходом белка и возможным вмешательством окислительно-восстановительных биохимических путей в цитозоле. Sousa, С.et al., J.Bacteriol. 180:2280-2284 (1998); Yang, F. et al., Protein Expr. Purif. 53:186-194 (2007).

Попытки сконструировать бактерии с генами металлотионеина для усиления устойчивости к цинку также оказались неэффективными. Odawara, F. et. al., supra.

Показано, что слитые гены металлотионеина, экспрессируемые в бактериях, обеспечивают, правда, минимальную толерантность к токсичности кадмия вплоть до 50 мг/литр (примерно 150 мкМ). Odawara, F. et al., Id.; Keasling, J.D., and Hupf, G.A. Applied Env. Microbiol. 62:743-746(1996). В этих исследованиях не показано, что бактерии могут хорошо расти при высоких концентрациях кадмия, поскольку после 50 мг/л кадмия трансгенные клетки характеризуются значительным снижением роста по сравнению с трансгенными клетками, растущими в среде без кадмия.

Другие исследования сфокусированы на конструировании гена полифосфаткиназы ("ppk") для экспрессии в бактериях. Фермент ppk ответственен за синтез длинноцепочечных полимеров ортофосфатов, как известно, поглощающих (секвестрирующих) ртуть. Подобно mt, предложены и использованы только слитые конструкции ppk. Например, ген ppk Klebsiella aerogenes слит с генами merT и merP, имеющими происхождение от Pseudomonas. Гены merT и merP способствуют интернализации ртути. Подразумевали, что слияние улучшает стабильность, и компоненты слияния были отчасти выбраны по тем соображением, что интернализация ртути должна быть ограниченной, что также ограничит эффект биоремедиации бактериями, экспрессирующими ген ppk. Pan-Hou, Н. et al., Biol. Pharm. Bull. 24:1423-1426 (2001); Pan-Hou, H. et al., FEMS Microbiol. Lett. 10325:159-164 (2002). Бактерии, экспрессирующие эти конструкции, способны к аккумуляции вплоть до 16 мкМ ртути и 24 мкМ ртутьорганического соединения из растворов. Рост бактерий в присутствии элементной ртути был прекращен при 16 мкМ ртути. Повышенная устойчивость к ртути показана, когда сконструированные бактерии, содержащие эти конструкции, помещали на гранулы альгината. Тем не менее, ремедиация ртути инактивируется, и бактерии теряют жизнеспособность при 40-80 мкМ ртути. Kyono, М. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:274-278 (2003).

Фиторемедиация и микоремедиация (не сконструированные организмы) являются способами, используемыми при попытке биоремедиации свинца посредством аккумуляции свинца в корнях или листьях. Huang, L.Z. et al., Biodegradation 20:651-660 (2009); Vimala, R. and Das, N., J., Hazard. Mat. 168:376-382 (2009). На сегодняшний день эффективной технологии бактериальной ремедиации для свинца не предложено.

Низкий уровень устойчивости сконструированных бактерий к тяжелым металлам, достигнутый вышеупомянутыми системами, препятствует их применению в качестве эффективной системы биоремедиации. Даже в воде с низкими концентрациями ртути эти системы не будут эффективными, поскольку ртуть будет накапливаться в клетке до более высоких концентраций, чем концентрации, переносимые этой системой.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте изобретения предложен вектор для экспрессии гена хелатирования тяжелых металлов в бактерии, содержащий функционально связанные элементы:

каркас вектора,

последовательность транскрипционного конститутивного промотора, имеющую происхождение из пластидного гена 16S rrn,

последовательность трансляционного энхансерного элемента, имеющую происхождение из гена 10 бактериофага Т7,

кодирующую последовательность хелатирующего агента,

где вектор находится в бактерии. В предпочтительном воплощении вектор дополнительно содержит 3'UTR Rho-независимый трансляционный терминатор. Предпочтительно 3'UTR представляет собой транскрипционный терминатор пластидного гена rpsl6 или транскрипционный терминатор rrnB E.coli. Более предпочтительно 3'UTR представляет собой транскрипционный терминатор пластидного гена rpsl6.

В другом воплощении хелатирующий агент кодируется геном mt, ppk или β-галактозидазы (lacZ), и этот ген экспрессируется в бактерии. В соответствии с одним воплощением хелатирующий агент представляет собой полифосфаты, синтезируемые ppk, и бактерия устойчива к концентрации вплоть до примерно 100 мкМ ртути, по меньшей мере примерно 1000 мкМ цинка, по меньшей мере примерно 250 мкМ кадмия или по меньшей мере примерно 3000 мкМ свинца.

Еще в одном другом воплощении ген mt представляет собой ген металлотионеина млекопитающих. Более предпочтительно хелатирующий агент кодируется последовательностью гена mt1 мыши, и бактерия устойчива к концентрации вплоть до примерно 160 мкМ ртути, по меньшей мере примерно 250 мкМ кадмия, 1000 мкМ цинка или 3000 мкМ свинца.

Еще в одном другом воплощении хелатирующий агент кодируется последовательностью гена β-галактозидазы (lacZ), и бактерия устойчива к концентрации вплоть до примерно 140 мкМ ртути и по меньшей мере примерно 250 мкМ кадмия, 1000 мкМ цинка или 3000 мкМ свинца.

Еще в одном другом воплощении каркас вектора представляет собой плазмидный каркас.

В другом аспекте в изобретении предложена бактерия, содержащая трансгенный хелатирующий агент, где бактерия устойчива к концентрации по меньшей мере от примерно 25 мкМ до по меньшей мере примерно 100 мкМ Hg. В предпочтительном воплощении ген хелатирующего агента транскрибируется с сильного промотора, фланкирован выбранным 5'UTR и возможно, 3'UTR, так что гену хелатирующего агента соответствует по меньшей мере от 4000 до 8500 копий стабильных транскриптов на нг суммарной мРНК, более предпочтительно гену хелатирующего агента соответствует от 6000 до 7500 стабильных транскриптов на нг суммарной мРНК. В еще более предпочтительных воплощениях ген хелатирующего агента транскрибируется с последовательности транскрипционного конститутивного промотора, имеющей происхождение из пластидного гена 163 rrn, ген хелатирующего агента фланкирован последовательностью 5'UTR трансляционного энхансерного элемента, имеющей происхождение от гена 10 бактериофага Т7. Еще более предпочтительно ген хелатирующего агента транскрибируется с последовательности транскрипционного конститутивного промотора, имеющей происхождение из пластидного гена 163 rrn, и фланкирован последовательностью 5'UTR трансляционного энхансерного элемента, имеющей происхождение от гена 10 бактериофага Т7 и 3'UTR Rho-независимой трансляционной терминаторной последовательностью пластидного гена rpsl6.

В предпочтительном воплощении кодирующая последовательность хелатирующего агента секвестрации соответствует гену mt1, и бактерия устойчива к концентрации вплоть до примерно 160 мкМ ртути или по меньшей мере примерно 250 мкМ кадмия, 1000 мкМ цинка или 3000 мкМ свинца. В другом предпочтительном воплощении кодирующая последовательность агента секвестрации соответствует гену β-gal (β-галактозидазы/lacZ), и бактерия устойчива к концентрации вплоть до примерно 140 мкМ ртути или по меньшей мере примерно 250 мкМ кадмия, 1000 мкМ цинка или 3000 мкМ свинца. Еще в одном другом предпочтительном воплощении кодирующая последовательность агента секвестрации соответствует гену β-gal, и бактерия устойчива к концентрации вплоть до примерно 140 мкМ ртути или по меньшей мере примерно 1000 мкМ цинка или 3000 мкМ свинца. Еще в одном другом предпочтительном воплощении кодирующая последовательность агента секвестрации соответствует гену ppk, и бактерия устойчива примерно к 250 мкМ кадмия, 1000 мкМ цинка или 3000 мкМ свинца.

В следующем воплощении бактерия содержит последовательности гена mt, ppk или β-gal, которые функционально связаны с трансгенной экспрессионной системой, дополнительно содержащей:

транскрипционный конститутивный промотор, имеющий происхождение из пластидного гена 16S rrn,

трансляционный энхансерный элемент, имеющий происхождение из гена 10 бактериофага Т7, и

Rho-независимую транскрипционную терминаторную последовательность.

Еще в одном следующем воплощении бактерия, находясь в жидкостной окружающей среде, содержащей ртуть, кадмий, цинк или свинец, аккумулирует ртуть, кадмий, цинк или свинец и окрашивается в темный цвет в присутствии ртути.

Еще в одном следующем воплощении бактерия, находясь в жидкостной окружающей среде, содержащей ртуть, кадмий, цинк или свинец, аккумулирует ртуть, кадмий, цинк или свинец, и бактерия образует агрегаты и осадки. В другом следующем воплощении бактерия, находясь в жидкостной окружающей среде, содержащей ртуть, аккумулирует ртуть, и бактерия образует агрегаты и осадки.

В соответствии с одним воплощением бактерия представляет собой Е.coli, Pseudomonas, Cyanobacteria или Bacillus.

В другом воплощении, когда бактерия, содержащая последовательности гена mt, ppk или β-gal, растет на биофильтре, она может удалять тяжелый металл из загрязненной жидкости. С ней также удобно обращаться, например, удалять из жидкости.

В другом отличающемся воплощении способность β-галактозидазы к расщеплению 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (Х-gal) снижается за счет присутствия тяжелого металла пропорционально по отношению к концентрации тяжелого металла.

В другом аспекте в изобретении предложен способ удаления примесей ртути из жидкости, включающий:

добавление бактериальной культуры, экспрессирующей ген mt, ppk или β-галактозидазы, к жидкости, где бактерии в бактериальной культуре устойчивы к концентрации от примерно 25 мкМ Hg до по меньшей мере примерно 100 мкМ Hg, и удаление бактерий из жидкости после периода времени, достаточного, чтобы дать возможность секвестрации ртути.

В соответствии с одним воплощением этого способа бактерию удаляют после того, как она образует комки. В соответствии с предпочтительным воплощением бактерию удаляют путем просеивания, аспирации или удаления бактерий с фильтра.

В соответствии с другим аспектом предложен способ мониторинга уровней ртути, включающий:

добавление бактериальной культуры, экспрессирующей ген β-галактозидазы, к жидкости, где бактерии в бактериальной культуре устойчивы к концентрации от примерно 25 мкМ Hg до по меньшей мере примерно 140 мкМ Hg, и

добавление Х-gal к образцу и тестирование образца на определение активности бактерий по метаболизму 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (Х-gal) с получением синего окрашивания с целью определения концентрации ртути в образце.

В другом воплощении в изобретении предложен способ удаления примесей ртути из жидкости, включающий

помещение жидкости в устройство, содержащее твердый матрикс, где указанный метрике дополнительно содержит β-галактозидазу без клеточного носителя; и

сбор жидкости, которая элюирует из твердого матрикса.

В другом аспекте в изобретении предложен набор для определения загрязнения тяжелыми металлами, содержащий:

контейнер для жидкостей,

бактериальную культуру, экспрессирующую β-галактозидазу, или фермент β-галактозидаза на индикаторной полоске,

Х-gal и

карту, показывающую окрашивание, соответствующее различным концентрациям Hg в жидкости при контакте с бактериальной культурой, экспрессирующей β-галактозидазу, или ферментом β-галактозидазой на индикаторной полоске.

В соответствии с одним воплощением набор дополнительно содержит колориметрический усилитель.

Еще в одном другом аспекте в изобретении предложен набор для определения загрязнения тяжелыми металлами, содержащий:

контейнер для жидкостей,

бактериальную культуру, экспрессирующую β-галактозидазу, ppk или mt1, и

индикаторную полоску, показывающую темное окрашивание, соответствующее окрашиванию бактериальной культуры, экспрессирующей β-галактозидазу, ppk или mt1, когда она растет в присутствии различных концентраций тяжелых металлов в жидкости.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1 проиллюстрирована способность бактерий к росту в присутствии указанных концентраций ртути. Культуры выращивали в ртути в течение 16 часов, после чего измеряли их рост как функцию оптической плотности культур (OD₆₀₀). На фиг.1А представлены нетрансформированные бактерии. На фиг.1В представлены сконструированные бактериальные культуры, содержащие указанную плазмиду, экспрессирующую белок β-gal. На фиг.1C представлены сконструированные бактериальные культуры, содержащие указанную плазмиду, экспрессирующую белок mt1. На фиг.1D представлены сконструированные бактериальные культуры, содержащие указанную плазмиду, экспрессирующую фермент ppk.

На фиг.2 проиллюстрирована способность бактерий к росту в присутствии указанных концентраций ртути. Культуры выращивали в ртути в течение 120 часов, и их рост измеряли как функцию оптической плотности культур (OD₆₀₀). На фиг.2А представлены нетрансформированные бактерии. На фиг.2В представлены сконструированные бактериальные культуры, содержащие указанную плазмиду, экспрессирующую белок β-gal. На фиг.2С представлены сконструированные бактериальные культуры, содержащие указанную плазмиду, экспрессирующую белок mt1. На фиг.2D представлены сконструированные бактериальные культуры, содержащие указанную плазмиду, экспрессирующую фермент ppk.

На фиг.3 проиллюстрирована транскрипционная эффективность конструкций, полученных в соответствии с изобретением. кДНК получали с мРНК для агента секвестрации. Число копий мРНК вычисляли и нормализовали по суммарной выделенной РНК. На фиг.3А приведено сравнение кДНК, продуцированной in vitro с транскрипта мРНК в нетрансформированных бактериях ("wt") и в бактериях, трансформированных генетической конструкцией P16s-g10-mt1-3'UTR. На фиг.3В приведено сравнение кДНК, продуцированной In vitro с транскрипта мРНК в бактериях wt и в бактериях, трансформированных генетической конструкцией P16s-g10-ppk-3'UTR.

Фиг.4 представляет собой графическое изображение аппарата для биоремедиации загрязненных жидкостей в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения.

Фиг.5 представляет собой схематическое изображение бактериальной усиленной экспрессионной кассеты. Сайты рестрикции, относящиеся к этой фигуре, представляют только одно воплощение изобретения. Prrn относится к транскрипционному промотору. В предпочтительном воплощении промотор представляет собой пластидный промотор 16S rrn. 5'UTR (нетранслируемая область) представляет собой трансляционный энхансерный элемент. Предпочтителен 5'UTR из гена 10 бактериофага Т7. Трансген предпочтительно кодирует агент секвестрации. В предпочтительном воплощении агент секвестрации кодируется геном lacZ, mt1 или ppk. 3'UTR относится к транскрипционному терминатору. В предпочтительном воплощении транскрипционный терминатор представляет собой пластидный терминатор rpsl6 или терминатор Е.coil rrnB. В особенно предпочтительном воплощении транскрипционный терминатор представляет собой терминатор rpsl6.

Фиг.6 представляет собой рисунок, изображающий агрегацию бактерий, экспрессирующих гены lacZ и mtl, выращенных при 120 мкМ ртути. Рисунки фиг.6 представляют собой схематические изображения фотографий Polaroid наблюдаемых агрегаций. Осаждение наблюдали в культурах бактерий, сконструированных для экспрессии гена lacZ (фиг.6А) и гена mtl (фиг.6В).

На фиг.7 проиллюстрирована способность бактерий, сконструированных для экспрессии агентов секвестрации, к ремедиации среды, загрязненной ртутью, то есть делать среду безвредной для бактерий, которые не экспрессируют агенты секвестрации ("wt"). На фиг.7А показан рост в течение 24 часов бактерий wt в среде без ртути; в среде, содержащей 120 мкМ ртути; и в обработанной среде. Обработанная среда исходно содержала 120 мкМ ртути и была обработана воздействием в течение 120 часов бактерий, сконструированных в соответствии с изобретением для экспрессии гена lacZ, с последующим удалением бактериальных клеток. На фиг.7В показан рост в течение 24 часов бактерий wt в среде без ртути; в среде, содержащей 120 мкМ ртути; и в обработанной среде. Обработанная среда исходно содержала 120 мкМ ртути и была обработана воздействием в течение 120 часов бактерий, сконструированных в соответствии с изобретением для экспрессии гена mtl, с последующим удалением бактериальных клеток.

На фиг.8 проиллюстрировано использование бактерий, сконструированных в соответствии с изобретением для экспрессии гена lacZ, с целью определения степени загрязнения тяжелыми металлами образца жидкости. Для более простой визуализации были сделаны рисунки для представления данных, полученных при съемке кювет с помощью Polaroid (окрашивание является соответствующим по интенсивности окрашиванию, наблюдаемому на фотографии Polaroid для кювет). Кювета А представляет собой рост в среде, содержащей 0 мкМ ртути; В представляет собой рост в среде, содержащей 5 мкМ ртути; С представляет собой рост в среде, содержащей 10 мкМ ртути; и D представляет собой рост в среде, содержащей 20 мкМ ртути. На панели I показаны значения OD₆₀₀ после 16 часов роста в присутствии указанных уровней ртути. Панель II представляет собой наглядное изображение измерений на панели I. Панель III представляет собой бактерии в соответствующих кюветах панели II, но где добавлено 100 мкг/мл субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (Х-gal) на мл среды. Бактерии утрачивают свою способность к расщеплению Х-gal и к продуцированию типичного синего окрашивания обратно пропорционально уровню экспозиции ртути.

На фиг.9 продемонстрировано снижение активности β-галактозидазы у бактерий, экспрессирующих β-gal в соответствии с изобретением. Фиг.9А представляет собой фотографию роста бактерий в присутствии указанных количеств ртути и 100 мкг/мл Х-gal. Цветные полосы под каждым флаконом культуры приблизительно показывают окрашивание культуры в каждом флаконе и подразумеваются для использования в качестве цветового кода, которым обеспечивается набор для обнаружения. На фиг.9 В изображена пробирка для содержания/выращивания культуры, содержащей бактерии, экспрессирующие β-gal, Х-gal и загрязненные жидкости. Контейнер сопровождается или дополняется цветовой картой, показывающей ожидаемую интенсивность окрашивания бактериальной культуры в присутствии указанных концентраций ртути. Фиг.9С представляет собой схематическое изображение фиг.9В.

На фиг.10 показаны бактериальные биологические анализы, которые демонстрируют способность бактериальных клеточных линий, содержащих экспрессионную кассету pBSK-P16S-g10-lacZ-3'UTR ("lacZ"), pBSK-P16S-g10-mt1-3'UTR ("mt1") и pBSK-P16S-g10-ppk-3'UTR ("ppk"), к выживанию и росту в среде, содержащей указанные концентрации кадмия, свинца и цинка. Нетрансформированный штамм Е.coli JM109 использовали в качестве контроля. Поглощение бактериальной культуры (OD 600 нм) измеряли после 24 ч роста в питательной среде LB с добавлением цинка, кадмия и свинца. На фиг.10А показаны бактериальные клеточные линии, растущие при 1000 мкМ ZnCl₂. На фиг.10 В показаны бактериальные клеточные линии, растущие при 250 мкМ CdCl₂. На фиг.10С показаны бактериальные клоны, растущие при 3000 мкМ ацетата свинца Pb(С₂Н₃О₂)₂·3H₂O.

На фиг.11 показана секвестрация ртути бактериями, экспрессирующими трансгенные гены. Бактерии, трансформированные конструкцией lacZ в соответствии с изобретением, выращивали в течение 120 ч при 37°С в среде, содержащей 120 мкМ ртути. Бактерии выделяли центрифугированием, промывали и ресуспендировали в таком же объеме среды, как объем исходной культуры. Ресуспендированные клетки ("бактерии LacZ") обрабатывали для высвобождения какой-либо ртути и анализировали с помощью атомной абсорбционной спектрометрии. Концентрацию ртути обработанной среды и бактерий, экспрессирующих ген lacZ, вычисляли на основании результатов спектрометрии.

Эксперименты, изображенные на этих фигурах, проводили множество раз. В экспериментах, изображенных на фигурах, показывающих усы диаграммы (фиг.1, 2, 3, 1, 10 и 11), проводили по меньшей мере три повторности, и усы показывают одно стандартное отклонение в пределах результатов.

Если не указано иное, в экспериментах, изображенных на этих фигурах, где измеряли рост бактерий, исходный инокулум ("засев") для каждой культуры представлял собой аликвоту равного размера исходной культуры при 0,01 OD₆₀₀.

В некоторых экспериментах, тестирующих эффективность конструкции lacZ, бактериальные культуры (нетрансформированные и трансформированные) содержали 200 мг/мл ИПТГ (Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид). Однако следует отметить, что в экспериментах, где ген lacZ транскрибируется с конститутивного промотора, не требуется индукция экспрессии ИПТГ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем изобретении предложен безопасный, эффективный и экономичный способ ремедиации тяжелых металлов с использованием хелатирующих агентов/агентов секвестрации. Предпочтительное воплощение сфокусировано на применении бактериальных клеток, экспрессирующих агенты секвестрации.

Эти примерные агенты секвестрации экспрессированы в бактериях, делая бактерию устойчивой к высоким уровням тяжелого металла, в частности, к свинцу, кадмию, цинку и ртути: белки металлотионеин (mt), полифосфаткиназа (ppk) и β-галактозидаза. Неожиданно показано, что гены агентов секвестрации могут экспрессироваться в бактериях таким образом, что продуцируют высокие уровни экспрессии и устойчивости клетки-хозяина к тяжелым металлам. В соответствии с другим предпочтительным воплощением применяют агенты секвестрации на бесклеточной основе.

В системах на основе бактериальных клеток хелатирующий белковый агент экспрессируется, необязательно составляя часть слитого белка. Не требуется одновременная экспрессия генов mer. Для бактерий, экспрессирующих эти гены, не требуется подложка-носитель из альгината или подобных соединений. Сконструированные клетки выдерживают высокие уровни тяжелых металлов. Эти неожиданные наблюдения дали возможность разработки эффективных подходов к биоремедиации на клеточной и белковой основе, как описано в данной заявке.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен вектор для введения и экспрессии гена в бактериальной клетке-хозяине. Этот вектор представляет собой нуклеиново-кислотную структуру, способную к репликации в бактериальной клетке-хозяине. Векторный каркас может включать гены для маркеров трансформации, указывающие на трансформацию бактериальной клетки вектором. Маркером трансформации может быть селективный маркерный ген, используемый для отличия и отбора клеток, в которых присутствует вектор, от нормальных клеток без вектора. Такие маркеры хорошо известны специалистам в данной области техники. Общепринято используемые селективные маркеры включают гены, которые придают устойчивость к специфичным антибиотикам, таким как ампициллин. Некоторые векторные каркасы могут также включать маркерные гены, которые только указывают, какие клетки были трансформированы вектором. Маркеры трансформации хорошо известны специалистам в данной области техники. Общепринято используемым индикаторным маркерным геном является последовательность гена lacZ, кодирующая фермент β-галактозидазу. Другие общепринято используемые маркеры трансформации включают различные гены люциферазы и GFP. Трансформированные бактерии осуществляют ремедиацию жидкостей или твердых поверхностей, на которых они растут. Альтернативно твердые поверхности сначала промывают/выщелачивают от тяжелого металла путем воздействия жидкостей, а затем организм, сконструированный в соответствии с изобретением, удаляет тяжелый металл из жидкости.

Одним из компонентов вектора является сайт клонирования, содержащий множество последовательностей распознавания ферментов рестрикции, где эти маркеры, как и дополнительные желаемые нуклеиново-кислотные последовательности, можно вводить в вектор и путем трансформации в клетку.

Предпочтительным вектором по изобретению является плазмида. Предпочтительной плазмидой является плазмида, сконструированная таким образом, чтобы дать возможность экспрессии трансгенных генетических последовательностей. Большое число векторов известно и охарактеризовано. См., например, базу данных Stanford: http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector pages/plasmid pages/Plasmid.ht ml, посещенную в последний раз 30 июня 2009. Примеры плазмид, которые позволяют относительно легко вводить экспрессионные кассеты, хорошо известны в данной области техники и доступны коммерческим путем. Предпочтительным вектором является pBlueScript®.

В одном конкретном воплощении предложена плазмида для экспрессии хелатирующих агентов в бактериальной клетке. Эта плазмида содержала экспрессионную кассету с геном хелатора и другими элементами, которые дают возможность плазмиде экспрессировать этот ген хелатора в бактериальной клетке до высоких уровней. Другие элементы ("элементы экспрессии генов") включали промоторную последовательность, последовательность трансляционного энхансера и последовательность терминации транскрипции, где все они функционально соединены способом, хорошо известным специалистам в данной области техники. Следует отметить, что ген хелатора может достаточно экспрессироваться до уровней, описанных в данной заявке, даже в отсутствие последовательности терминации транскрипции, хотя желательно присутствие всех трех экспрессионных элементов, выбранных на основании их способности к сильному повышению экспрессии.

Любая эффективная комбинация регуляторных признаков может создать удовлетворительно высокую и стабильную экспрессионную систему. Изобретение предпочтительно осуществляют на практике с сильным транскрипционным промотором. Подразумевают, что плазмида может включать различные типы промоторов, например, конститутивные промоторы, индуцибельные промоторы, клеточно-специфичные или тканеспецифичные промоторы. Подобным образом, возможно, что другие эффективные транскрипционные энхансеры и терминаторы могут в определенных комбинациях продуцировать удовлетворительно высокую и стабильную экспрессию.

В одном предпочтительном воплощении используют конститутивный промотор, имеющий происхождение из последовательности пластидного гена 16S rrn. Sriraman, P. et al., Plant Physiol. 117:1495-1499 (1998) и Yukawa, M. et al., Plant Molecular Biology 23:359-365 (2005). Последовательность промотора 16S rrn была интегрирована в качестве функционального элемента кассеты.

Другим элементом экспрессионной кассеты, предложенным в одном воплощении настоящим изобретением, является последовательность трансляционного энхансера (“5'UTR"). Последовательность трансляционного энхансера усиливает трансляцию последовательности трансгенного белка в плазмиде. Предпочтительным трансляционным энхансером в соответствии с настоящим изобретением был 5' энхансерный элемент гена 10 бактериофага Т7. Olins, P.O. and Rangwala, S.H., J.Biol.Chem. 264:16973-16976 (1989). Последовательность энхансерного элемента, используемая в изобретении, была интегрирована в экспрессионную кассету внутри синтетического 5'-фланкирующего ген олигонуклеотида (праймера) ПЦР, используемого для амплификации генов mtl, ppk и lacZ.

Другой элемент плазмиды, который можно использовать для соответствующих стратегий биоремедиации, состоит из последовательности гена, кодирующей белок, который сам по себе является хелатирующим агентом, или фермент, способный к созданию молекулы секвестрации. Белок-хелатор и/или фермент, способный к созданию молекулы секвестрации, называют в данной заявке "хелатирующим агентом" или "агентом секвестрации" взаимозаменяемо. Иными словами, любой продукт гена, который непосредственно является хелатором, или который создает хелатирующую молекулу или молекулу секвестрации, является хелатирующим агентом в соответствии с изобретением. Примеры некоторых хелатирующих агентов включают ppk, mt1, фитохелатины, глутатион-S-трансферазу и merP.

Одним таким предпочтительным хелатирующим агентом является белок металлотионеин (МТ). Металлотионеины (МТ) представляют собой цистеин-богатые низкомолекулярные металлсвязывающие белки, которые секвестрируют ионы металла в биологически неактивной форме. Hamer, D.Н., Annu. Rev. Biochem. 55:913-51 (1986). Один особенно предпочтительный ген mt имеет происхождение от мыши ("ген mt1") и кодирует белок mt1. Вектор pCMV-SPORT 10, содержащий кДНК mt1 мыши, был получен из Американской коллекции типовых культур (АТСС), клон №MGC47147. См. также Strausberg, R.L. et al., Proc Nati Acad. Sci USA 99:16899-16903 (2002). Ген mt1 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с плазмиды pCMV-SPORT 10, которая содержит кДНК для гена mt1. Последовательность Национального центра биотехнологической информации для кодирующей последовательности mt1, gi №BC036990, использовали для конструирования и разработки праймеров ПЦР амплификации, которые использовали для выделения кодирующей последовательности mt1 с помощью ПЦР для последующего клонирования.

Другой предпочтительной последовательностью гена хелатирующего агента является последовательность ppk, которая кодирует фермент полифосфаткиназу, ответственный за синтез сильно хелатирующих полифосфатов. Неорганические полифосфаты являются отрицательно заряженными длинными линейными полимерными цепями ортофосфатов, связанных высокоэнергетическими фосфоангидридными связями. Kornberg, A., J. Bacteriol. 177:491-496 (1995). Эти полимеры фосфатов могут варьировать по длине и являются повсеместными для всех живых организмов. Фермент полифосфаткиназа, кодируемый геном ppk, осуществляет полимеризацию гамма-фосфатов с АТФ с образованием длинных полифосфатных цепей. Предпочтительный ген ppk имеет происхождение из бактерии, в частности, из Е.coli, и предпочтительным хелатирующим агентом ppk является фермент полифосфаткиназа, экспрессируемый с этого гена, и полифосфатные продукты этого фермента полифосфаткиназы. В предпочтительном воплощении ген ppk амплифицировали с помощью ПЦР из Е.coli К12, используя праймеры ПЦР амплификации, сконструированные из последовательности NCBI NC 000913. (Ген ppk представляет собой 2,07 кб участок от основания 2621066 до 2623132 вышеуказанной последовательности NCBI). Akiyama, M. et al., J.Biol.Chem. 267:22556-22561 (1992) и Blattner, F.R. et al., Science. 277:1453-1474 (1997).

Еще одной другой предпочтительной последовательностью гена хелатирующего агента является последовательность гена lacZ для β-галактозидазы, имеющая происхождение из Е.coli K12. Ген lacZ 3072 п.о. K12 является частью лактозного оперона в Е.coli и экспрессирует фермент β-галактозидазу, который катализирует гидролиз дисахаридов, таких как лактоза. Kalnins, A. et al., ЕМВО 2:593-597 (1983). β-Галактозидаза Е.coli представляет собой 464 кДа тетрамерный белок, который может быть активирован ионами калия и магния в качестве кофакторов. Этот фермент широко использован в молекулярной биологии и генетике благодаря его способности к метаболизму X-Gal, бесцветный модифицированный галактозный сахар, который претерпевает метаболизм с образованием нерастворимого продукта (5-бром-4-хлориндола), который является ярко-синим и может действовать как индикаторный или репортерный маркер. Ген lacZ амплифицировали с помощью ПЦР с геномной ДНК Е.coli K12, используя праймеры ПЦР амплификации, сконструированные из последовательности NCBI NC_000913. (lacZ представляет собой участок 3,08 кб от основания 362455 до 365529). Blattner, F.R. et al., Science. 277:1453-1474 (1997).

Следует отметить, что в отношении секвестрации ртути изобретение в целом относится к секвестрации неорганической ртути и приводит ее примеры, если специально не обсуждается иное. Однако изобретение также дает возможность секвестрации органической ртути, если система также включает функциональную трансгенную лиазу, такую как, например, ген jnerB. Ruiz, О. et al., Plant Physiol. 132:1344-1352(2003); Bizily S., Proc Nati Acad Sci USA 96:6808-6813 (1999).

Другой возможный элемент экспрессионной кассеты, представленный в одном воплощении изобретения, состоит из последовательности терминации транскрипции. В одном предпочтительном воплощении последовательностью терминации транскрипции является последовательность 3'UTR rho-независимого терминатора транскрипции. Примеры предпочтительных последовательностей 3'-UTR включают rpsl6 бактериального и пластидного происхождения. Описание терминаторной последовательности бактериального rrnB приведено в Abe, H. et al., Genes to Cells, 4:87-97 (1999). Особенно предпочтительным терминатором является терминатор rpsl6 пластидного происхождения, описанный Hayes, M.L.,et al., Nucleic Acids Res. 34:3742-3754 (2006) (в других местах данной заявки также называемый rpsT), где "Т" обозначает "концевой". Последовательность терминации транскрипции гена rps16 была интегрирована как часть 3' олигонуклеотида (праймера) для ПЦР амплификации генов mtl, ppk и lacZ.

Удобным подходом к созданию кассет, содержащих эти генетические элементы, является создание синтетических олигонуклеотидов, которые являются праймерами ПЦР для трансгена, где эти два праймера ПЦР содержат 5' контрольные элементы (промотор, энхансер) и 3'-UTR соответственно. Хотя выше в данной заявке авторы изобретения описывают конкретный молекулярный метод (ПЦР, синтетические олигонуклеотиды и т.д.), используемый для получения и подготовки к трансформации конкретных генетических элементов в экспрессионной кассете, специалистам в данной области техники понятно, что альтернативные праймеры, альтернативные схемы и дополнительные методологии доступны для осуществления той же цели создания экспрессионной кассеты и вектора переноса, содержащего эти генетические элементы.

Была сконструирована экспрессионная кассета, содержащая функционально связанные: трансген для экспрессии и контрольные элементы экспрессии гена. Перечисленное выше является предпочтительными элементами: промотор, имеющий происхождение из пластидного гена 163 rrn; 5'UTR, имеющий происхождение из гена 10 бактериофага Т7; и либо последовательность rrnB, либо транскрипционный терминатор rps16 (S'-UTR), предпочтительно rps16. (Отметим, что rps16 и rpsT являются названиями, используемыми взаимозаменяемо для одного и того же 3'-UTR в описании данного патента). Эта кассета содержит неожиданную комбинацию регуляторных элементов для использования в бактериях, которая, как теперь продемонстрировано, как более подробно описано ниже, обеспечивает сильную экспрессию в бактериях. В соответствии с одним воплощением последовательности контроля экспрессии в векторе по изобретению включают сильный промотор и 5'UTR, предпочтительно промоторную последовательность 163 rrn и 5'UTR гена 10 бактериофага Т7. В более предпочтительном воплощении вектор дополнительно содержит S'UTR, предпочтительно rrnB или rps16 3'UTR, еще более предпочтительно rps16 3'UTR. В соответствии с предпочтительными воплощениями бактерии были сконструированы для высокой экспрессии этих трансгенных последовательностей хелатирующих агентов. Полученные в результате бактерии устойчивы к высоким уровням загрязнения тяжелыми металлами.

Как вывод, комбинация предпочтительного промотора, 5'UTR и 3'UTR, описанная в данной заявке, включает предпочтительную экспрессионную систему для высокого уровня экспрессии стабильных транскриптов и продуктов трансляции, является ли экспрессируемый трансген хелатирующим агентом или каким-либо другим генным продуктом.

Способы трансформации для введения векторов в различные клетки и организмы хорошо известны. Например, векторную конструкцию можно вводить методом хлорида кальция/теплового шока (методом химически компетентных клеток), электропорации, посредством плазмидной конъюгации, бомбардировки частицами и т.д.

Вектор трансформируют в организм с целью экспрессии хелатирующего агента. В предпочтительном воплощении вектор трансформируют в организм, который можно использовать для биоремедиации, такой как растение, гриб, водоросль или бактерия.

В особенно предпочтительном воплощении организм представляет собой бактерию. Предпочтительная бактерия является повсеместной в окружающей среде, не требовательной к условиям роста, высокостабильной в естественной окружающей среде бактерией. Особенно предпочтительными бактериями для трансформации экспрессионными кассетами и/или трансгеном(ами), кодирующим агент (ы) секвестрации по изобретению, являются E.coli, Pseudomonas sp (например, Pseudomonas aeuriginosa), Cyanobacteria sp (например, Nostoc commune или Oscillatoria amoena) и Bacillus sp (например. Bacillus cereus).

В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения последовательностью гена хелатирующего агента является lacZ, mk1 или ppk. Было показано, что трансгенные бактерии, экспрессирующие β-галактозидазу, металлотионеин и полифосфаткиназу, способны к удалению тяжелых металлов и ртути из жидкостей. Бактериальные конструкции, описанные выше, показали значительное улучшение устойчивости к ртути и ее аккумуляцию до уровней по меньшей мере в 8 раз выше, чем описанные ранее.

β-Галактозидаза ("β-gal") представляет собой тетрапептидный фермент, требующийся бактериям для метаболизма лактозы. β-gal хорошо известна, поскольку ее белковая последовательность была открыта в 1970. Было неизвестно, что белок β-gal секвестрирует тяжелые металлы или ртуть. Как описано ниже в примерах, теперь показано, что β-gal обладает высоким сродством к ртути и эффективно связывает ртуть при гиперэкспрессии. Было неизвестно, что β-gal может придавать устойчивость бактериям, подвергнутым воздействию больших концентраций ртути. Также β-gal защищает против вредных эффектов высоких концентраций кадмия, цинка и свинца.

Когда экспрессионная кассета β-галактозидазы (pBSK-P16S-g10-Bgal-rpst) была введена в бактерии, наблюдали высокий уровень транскрипции. Кроме того, бактерии становились устойчивыми к высоким концентрациям ртути. Если нетрансформированные бактерии показывали значительное снижение роста при воздействии 5 мкг/мл Hg и совсем не росли при более высоких концентрациях, бактерии, трансформированные плазмидой, экспрессирующей β-gal, устойчивы к каждой из протестированных концентраций 0, 5, 10, 20, 40, 80, 100, 120, 140 и 160 мкМ ртути. Данные, представленные на фиг.1 и 2, показывают, что трансформированные бактерии не только выживают при концентрации ртути вплоть до примерно 140 мкМ, но действительно размножаются при этих уровнях ртути. Другие данные (не показанные на фиг.1 и 2) показали размножение трансформированных бактерий также при 160 мкМ Hg. Бактерии, содержащие плазмиду, легко выдерживают, растут и реплицируются при подобных концентрациях ртути, обнаруживаемых в загрязненной воде и почве.

Подобные эксперименты продемонстрировали, что бактерии при трансформации β-gal в соответствии с изобретением могут выдерживать и реплицироваться в среде, содержащей вплоть до по меньшей мере примерно 250 мкМ кадмия (см. фиг.10). Также бактерии, трансформированные β-gal в соответствии с изобретением, были способны выдерживать и эффективно реплицироваться в среде, содержащей вплоть до по меньшей мере примерно 1000 мкМ цинка. Те же трансгенные бактерии продемонстрировали устойчивость к концентрации вплоть до по меньшей мере примерно 3000 мкМ свинца.

Когда экспрессионная кассета mt1 (pBSK-P16S-g10-mt1-rpst) была введена в бактерии, наблюдали высокий уровень транскрипции. См. фиг.3А. Кроме того, бактерии становились устойчивыми к высоким концентрациям ртути. Бактерии, трансформированные плазмидой, экспрессирующей mt1, были устойчивы к концентрациям ртути 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 и 160 мкМ. Данные, представленные на фиг.1 и 2, показывают, что трансформированные бактерии не только выживают при концентрации ртути вплоть до примерно 160 мкМ, но действительно размножаются при этих уровнях ртути. Следует отметить, что скорость роста бактерий несколько снижена пропорционально уровню ртути. Тем не менее, уровни насыщения бактериального роста достигаются. Бактерии, содержащие плазмиду, легко выдерживают, растут и реплицируются при подобных концентрациях ртути, обнаруживаемых в загрязненной воде и почве.

Подобные эксперименты продемонстрировали, что бактериальный клон, экспрессирующий mt1 в соответствии с изобретением, может выдерживать и реплицироваться в среде, содержащей вплоть до по меньшей мере примерно 250 мкМ кадмия и вплоть до по меньшей мере примерно 1000 мкМ цинка. Бактериальные клоны, экспрессирующие mt1, также обладали устойчивостью к концентрации вплоть до по меньшей мере примерно 3000 мкМ свинца. См. фиг.10.

Подобным образом, когда экспрессионная кассета ppk была введена в бактерии, наблюдали высокий уровень транскрипции. См. фиг.3В. Кроме того, бактерии становились устойчивыми к высоким концентрациям ртути. Бактерии, трансформированные вышеописанной плазмидой, экспрессирующей ppk, были устойчивы к 20, 40, 60, 80 и 100 мкМ ртути. Данные, представленные на фиг.1 и 2, показывают, что трансформированные бактерии не только выживают при концентрации ртути вплоть до примерно 100 мкМ, но действительно размножаются при этих уровнях ртути. Бактерии, содержащие плазмиду, легко выдерживают, растут и реплицируются при подобных концентрациях ртути, обнаруживаемых в загрязненной воде и почве.

Подобные эксперименты продемонстрировали, что бактериальный клон, экспрессирующий ppk может выдерживать и реплицироваться в среде, содержащей вплоть до по меньшей мере примерно 3000 мкМ свинца и 1000 мкМ цинка. Кроме того, трансгенные бактерии выдерживали кадмий вплоть до примерно 250 мкМ. См. фиг.10.

Ясно, что векторы, содержащие пластидный промотор 16S rrn, 5'UTR гена 10 Т7 и rrnB бактериального происхождения или rps16 3'UTR пластидного происхождения, экспрессируют эти проиллюстрированные гены хелаторов при высоком числе копий. Как вывод, их последовательности контроля экспрессии в комбинации можно использовать для экспрессии других генов на высоком уровне при подобных числах копий, как видно для генов хелаторов, или по меньшей мере примерно при 4000; 4500; 5000; 5500; 6000; 6500; 7000; 7500; 8000; 8500 полноразмерных копий на нг суммарной мРНК.

Любая генетическая конструкция в бактериях, которая содержит сильный промотор и/или подходящий 5'UTK и 3'UTR, чтобы вызвать продуцирование по меньшей мере примерно 4000; 4500; 5000; 5500; 6000; 6500; 7000; 7500; 8000; 8500 полноразмерных копий мРНК хелатирующего агента на нг суммарной мРНК в бактериях, обеспечивает эффективную ремедиацию бактериями, содержащими такую конструкцию, жидкостей или твердых веществ, содержащих тяжелые металлы, за счет хелатирования тяжелого металла, при этом являясь устойчивой и размножаясь в окружающей среде, содержащей тяжелый металл. Предпочтительно бактерии экспрессируют примерно от 6000 до 7500 копий хелатирующего агента на нг суммарной мРНК.

Трансгенные бактерии, имеющие плазмиду, содержащую ген β-галактозидазы, можно также эффективно применять в качестве биосенсора для обнаружения ртути, а также загрязнения и разливов ртути и других тяжелых металлов. Расщепление Х-gal высвобождает 5,5'-дибром-4,4'-дихлориндиго, нерастворимое соединение синего цвета. Трансгенные бактерии, экспрессирующие β-галактозидазу, в присутствии соединения X-Gal (и аналогов Х-gal) дает легко различимую темно-синюю цветную реакцию. Однако теперь наблюдали, что интенсивность синего цвета была снижена пропорционально концентрации ртути. См. фиг.8 и фиг.9. Подобным образом, присутствие других тяжелых металлов, например, кадмия, может обладать таким же эффектом прерывания расщепления Х-gal (и аналогов Х-gal) и продуцирования синего соединения. Эти характеристики делают β-gal пригодной в качестве биосенсора in situ или in vitro. Следовательно, экспрессия β-галактозидазы в бактериях защищает бактерии от вредных эффектов ртути, но также снижает способность этого фермента к метаболизму лактозы и аналогов лактозы, таких как X-Gal.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен набор для обнаружения тяжелых металлов. В соответствии с одним воплощением этот набор содержит пробирку или контейнер для жидкостей, бактериальную культуру, экспрессирующую β-галактозидазу, или фермент β-галактозидазу на тестовой полоске, 5-бром-4-хлор-3-индолил-***-D-галактопиранозид (Х-gal) и индикаторную полоску. Индикаторная полоска содержит цветовые маркеры, идентифицирующие степень, до которой β-галактозидаза восстанавливает Х-gal. Каждый маркер может иметь отличающийся оттенок синего цвета, где такой оттенок предопределен воздействием различных концентраций тяжелого металла, например, ртути.

Набор используют для осуществления способа обнаружения ртути или других тяжелых металлов, включая кадмий, свинец и цинк. Этот способ включает стадии помещения тестируемого образца в контейнер для жидкостей. Возможно, в случае, где тестируемый образец является твердым веществом, добавляют жидкость для высвобождения ртути/тяжелого металла из твердого вещества. Добавляют Х-gal. Жидкость приводят в контакт с бактериальной культурой на тестовой полоске, содержащей белок β-gal, в течение предопределенного периода времени. Затем цвет культуры сравнивают с маркерами на индикаторной полоске, чтобы определить, присутствует ли ртуть в жидкости, и в какой концентрации. В некоторых случаях при высокой концентрации тяжелого металла или ртути набор может дать только положительный/отрицательный результат и не показать полный диапазон концентраций.

Альтернативное воплощение вышеописанного набора может дополнительно включать серию стандартов. Эти стандарты могут включать различные стандартные контейнеры с различными концентрациями Hg в растворе. В качестве не ограничивающего примера, контейнеры могут иметь приведенные ниже концентрации Hg; А: 0 мкМ; В: 5 мкМ; С: 10 мкМ и D: 20 мкМ.

Набор можно использовать, как описано ниже. Указанный объем тестируемого вещества и жидкости (если материал является твердым веществом) помещают в тестовую пробирку, объем стандарта Hg в указанных концентрациях помещают в каждую стандартную пробирку А: 0 мкМ; В: 5 мкМ; С: 10 мкМ и D: 20 мкМ. Объем трансгенных бактерий помещают в каждую из тестовых и стандартных пробирок. Х-gal добавляют в каждую пробирку. Культуре дают возможность инкубироваться в течение определенного периода времени. Предпочтительно время инкубации составляет от примерно 1 минуты до 20 минут, более предпочтительно от 5 до 10 минут. По окончании периода инкубации окрашивание в тестовой пробирке сравнивают со стандартными пробирками с целью определения приблизительной концентрации ртути в образце.

Специалисты в данной области техники хорошо понимают, что альтернативные воплощения легко разработать относительно концепции, что ртуть и другие тяжелые металлы прогрессивно снижают способность β-gal к расщеплению Х-gal при корреляции с концентрацией тяжелого металла. В качестве примеров, но не ограничиваясь этими примерами, бактерия предложена не в жидкой форме (например, лиофилизированной), бактерия, содержащая β-gal, представляет собой природный штамм бактерий, инкубация происходит при определенной температуре, например, при 37°С или при комнатной температуре, очищенную β-gal используют вместо бактерий, экспрессирующих ген β-gal, либо экспрессионный вектор β-gal или фермент β-gal в культуральной смеси увеличивает диапазон, где цветовой анализ может коррелировать с концентрациями ртути. Тестируемый образец представляет собой твердое вещество или промывочную жидкость твердого вещества. Подобным образом, возможны альтернативные цветовые анализы и/или использование оптических приборов (например, спектрофотометров, колориметров) для точного измерения изменения цвета. Использование методов, усиливающих цветовой эффект, также известно и возможно. Эти и другие альтернативные схемы хорошо известны специалистам в данной области техники и находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Еще в одном другом аспекте настоящего изобретения сам белок β-галактозидазу, то есть в отсутствие клеточного носителя, можно использовать в качестве хелатирующего агента для тяжелых металлов или ртути как часть системы ликвидации аварийных разливов для применения in situ и in vitro. β-gal имеется в продаже и может быть легко очищена из организмов, экспрессирующих этот фермент, хорошо известными стандартными методами разделения. Выделение больших количеств этого фермента можно облегчить за счет его гиперэкспрессии и коммерческой доступности антител к этому ферменту. Для целей производства экспрессией β-gal в клетках можно управлять/повышать ее путем добавления ИПТГ. Коммерческие поставщики белка β-gal известны, например, Sigma-Aldrich.

Подобным образом, металлотионеин и полифосфатные продукты полифосфаткиназы можно использовать как таковые, то есть в отсутствие клеточного носителя, в качестве хелатирующих агентов для тяжелых металлов, включая цинк, кадмий, свинец или ртуть, в программах работ по ремедиации.

В настоящем изобретении также показано, что сильный промотор и специфичные 5'UTR и 3'UTR или предпочтительно специфичная комбинация последовательностей сильного пластидного промотора, энхансера бактериофага Т7 и эффективного транскрипционного терминатора пластидного происхождения дают возможность экспрессии металлотионеина (гена mt1), полифосфаткиназы (гена ppk) и β-галактозидазы (гена lacZ) в бактериях до уровней, которые дают возможность их применения и коммерциализации в качестве эффективной системы биоремедиации для ртути и других металлов. Вышеописанная плазмида обеспечивает конструкцию усиленной экспрессии гена, способную к продуцированию высокой транскрипции мРНК и трансляции белка этих и других трансгенов.

Бактерии, содержащие агенты секвестрации по изобретению, приобрели свойства, которые делают их идеально подходящими для биоремедиации посредством секвестрации. Во-первых, они были устойчивыми к высоким уровням ртути в течение продолжительных периодов времени. См. фиг.1 и 2. Но они были не только устойчивыми к высоким уровням ртути, но также размножались при этих уровнях. В контролируемых экспериментах нетрансформированные бактерии проявляли сниженный рост в присутствии 5 мкМ ртути и отсутствие роста при 10 мкМ ртути. Напротив, бактерии, трансформированные конструкциями, экспрессирующими гены ppk, показали небольшое снижение или отсутствие снижения роста в среде, содержащей 10 мкМ ртути, и росли при концентрациях вплоть до примерно 100 мкМ ртути. Важно, что размножение бактерий продолжалось со временем. Когда те же конструкции тестировали после 120 ч роста в ртути, конструкция lacZ показала дальнейший рост со временем при концентрации ртути вплоть до примерно 140 мкМ, неотличимый по общему уровню роста от роста нетрансформированных бактерий без ртути. Конструкция mt1 показала дальнейший рост при концентрации ртути вплоть до 160 мкМ (хотя и при несколько сниженной скорости роста), неотличимый по общему уровню роста от роста трансформированных или нетрансформированных бактерий без ртути, и сниженный, но значительный рост в среде, содержащей вплоть до 160 мкМ ртути. Конструкция ppk показала дальнейший рост при концентрации ртути вплоть до 80 мкМ, неотличимый по общему уровню роста от роста трансформированных бактерий без ртути. Конструкция ppk показала небольшое снижение роста при любой концентрации ртути от 0 до 80 мкМ. Возможно, что доступность фосфата оказывает небольшое воздействие на рост бактерий, трансформированных геном ppk.

Успешная ремедиация жидкости была показана в экспериментах, где жидкости, содержащие 120 мкМ ртути, обрабатывали воздействием бактерий, содержащих агенты секвестрации по изобретению. См. фиг.7. После 120 ч обработки среды, содержащей ртуть, воздействием трансгенных бактерий среду очищали от остаточных бактерий (с получением в результате "обработанной среды"). Засев нетрансформированных ("wt") бактерий добавляли в обработанную среду, в свежую среду, содержащую 0 мкМ ртути, и в свежую среду, содержащую 120 мкМ ртути. Бактерии росли одинаково хорошо в обработанной среде и в свежей среде без ртути. Это указывает на то, что обработанная среда имеет концентрации ртути ниже 5 мкМ. Трансгенные бактерии не только росли при этих уровнях ртути, но также секвестрировали и удаляли этот тяжелый металл.

Количественные данные, полученные с помощью анализа атомной абсорбционной спектрометрией, показали эффективность ремедиации трансгенными бактериями. См. фиг.11. Анализ атомной абсорбционной спектрометрией показал очень высокий уровень аккумуляции ртути в трансгенных бактериях Е.coli, которые экспрессировали ген lacZ. LacZ-экспрессирующие клетки Е.coli выращивали в среде LB с 120 мкМ Hg в течение 120 часов при 37°С. Способ подготовки клеток и среды для спектрометрического анализа по существу находится в соответствии со способом Агентства охраны окружающей среды 3010А. Клетки центрифугировали, промывали в свежей среде, ресуспендировали в небольшом объеме среды, разрушали 70% (об/об) азотной кислоты, 30% (об/об) перекиси водорода и концентрированной HCl при 95°С, доводили до объема, равного первоначальному объему, в котором их выращивали, а затем анализировали атомной абсорбционной спектрометрией. Супернатант среды, полученный после центрифугирования бактериальных клеток, также анализировали после подобной обработки. Результаты показали, что трансгенные бактерии были очень эффективными при удалении ртути из среды и аккумуляции ртути в высоких концентрациях внутри бактериальных клеток. Наблюдали, что большая часть токсичной ртути была обнаружена в трансгенных бактериях, тогда как ртуть в среде была удалена до нетоксичных концентраций ниже 5 мкМ. Эти результаты демонстрируют, что трансгенные по lacZ Е.coli обладают способностью к биоремедиации жидкостей, которые в высокой степени загрязнены ртутью, посредством хелатирования при оптимальном росте.

Другое очень полезное свойство было открыто в отношении трансформированных бактерий после воздействия на эти бактерии тяжелых металлов, в частности ртути. Бактерии после достаточной аккумуляции тяжелых металлов, включая ртуть, приобретали более темный оттенок. Кроме того, они склонны к агрегации и образованию плотных комков. Имеется возможность вычерпать такие агрегированные бактерии из контейнера, аспирировать способом, таким как пипетирование жидкости, без необходимости в специализированных фильтрах, на которых бактерии могут расти, или в центрифугировании. Агрегированные бактерии очень легко визуализировать, поскольку они меняют окрашивание на более темный оттенок. См. фиг.6; фиг.8, панель II; и фиг.9, панель А.

Свойства агрегации и потемнения могут, индивидуально или в комбинации, хорошо применятся при биоремедиации. Соответственно, в настоящем изобретении также предложен новый, простой и недорогой механизм для биоремедиации и улавливания тяжелых металлов или ртути из жидкостей.

Один способ, используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает первую стадию помещения загрязненной жидкости в резервуар. На следующей стадии бактерии, содержащие плазмиду, экспрессирующую агенты секвестрации/хелатирующие агенты по настоящему изобретению, добавляют к загрязненной жидкости. Бактериям дают возможность расти и удалять тяжелые металлы из жидкости. Как только бактерии удаляют ртуть и достигают высокой концентрации ртути в клетках, они осаждаются из раствора и образуют тесно связанные агрегаты. Затем эти агрегаты удаляют с помощью просеивающего устройства. Дополнительные трансгенные бактерии добавляют по необходимости.

Во-вторых, темная пигментация полезна для индикации прогрессирования процесса до той точки, где требуется удаление бактерий, или как качественный контроль, что процесс действительно протекает, и можно использовать конкретный уровень потемнения способами, параллельными вышеописанным, для мониторинга ртути системой lacZ для индикации или мониторинга уровней ртути, присутствующей в загрязненной окружающей среде.

В другом воплощении настоящего изобретения бактерии, экспрессирующие хелатирующие агенты в соответствии с изобретением, образуют самоподдерживающуюся биопленку для использования в качестве части систем фильтрации для удаления тяжелых металлов или ртути из жидких и твердых матриксов. В одном предпочтительном воплощении, как описано на фиг.4, предложена система биоремедиации, включающая резервуар 104 для воды; пористый твердый матрикс 108; клеточную биопленку 100 в резервуаре для воды и/или в пористом твердом матриксе, где устойчивые к Hg бактерии, содержащие генетические конструкции по изобретению, образуют биопленку 100; пористый фильтр 112; и выходное отверстие 116 для обработанной воды. Генетически сконструированные бактерии можно выращивать на пористом твердом матриксе 108 с образованием биопленки 100.

Поскольку бактерии в высокой степени устойчивы к ртути и другим тяжелым металлам, они эффективно удаляют ртуть из жидкости, в то же время, аккумулируя ее в высоких концентрациях внутри клеток. Высокая толерантность к ртути также дает возможность бактериальным клеткам делиться и расти, что продлевает полезный срок службы биофильтра. Окрашивание бактерий на фильтре может указывать на их активность биоремедиации и на то, когда желательна замена бактерий.

При одном способе, используемом в соответствии с изобретением, загрязненную воду загружают в резервуар 104 для воды. Воде дают возможность протекать через пористый твердый матрикс 208 и контактировать с клеточной биопленкой 100. Клетки в биопленке секвестрируют примеси тяжелых металлов, таких как ртуть. Чистая вода проходит через пористый фильтр 112, где любое клеточное вещество отделяется от биопленки 100, и удаляются другие примеси. Затем чистая вода высвобождается через выходное отверстие 116 для обработанной воды.

Комбинацию последовательностей, описанную в данной заявке, можно использовать в качестве новой системы биоремедиации в различных системах in vitro, клеточных системах и организмах, включающих бактерии, водоросли, растения, животных и грибы. Клетку или организм можно подвергать генно-инженерному конструированию для экспрессии агентов секвестрации, посредством чего они становятся устойчивыми к тяжелым металлам и очищают загрязняющее вещество из среды посредством хелатирования. Эти организмы можно извлекать, и тяжелый металл или ртуть можно выделять и подвергать рециркуляции для промышленных применений. Систему in vitro, клетку или организм, экспрессирующие или содержащие белки, кодируемые этими последовательностями, можно также использовать как часть биореактора или для ремедиации in situ почвы, воды и осадочных отложений.

В другом воплощении в соответствии с настоящим изобретением предложена бактериальная клетка, содержащая систему хелатирования тяжелых металлов или ртути, описанную выше, и механизм транспорта тяжелых металлов/ртути. В одном неограничивающем примере плазмида в соответствии с изобретением может также содержать последовательность гена merT и гена MerC оперона mer. Затем эту плазмиду можно трансформировать в бактериальную клетку, придавая способность как к транспорту ртути или другого тяжелого металла в цитоплазматическое пространство, так и к последующей секвестрации ртути внутри клетки. Подразумевают, что другие гены оперона mer можно также использовать с целью усиления секвестрации тяжелых металлов внутри клетки и обеспечения устойчивости к ртутьорганическим соединениям, таким как метилртуть, диметилртуть и ацетат фенилртути. Альтернативно другие системы транспорта тяжелых металлов можно использовать в комбинации с агентами секвестрации по изобретению способом, описанным в настоящем изобретении.

Представляется, что можно создавать бактериальные системы или системы других организмов, содержащие более чем один ген, кодирующий агент секвестрации. Этому способствует соображение, что клеточные метаболические эффекты агентов секвестрации (иных, чем агенты секвестрации) различаются, и их активность в качестве агентов секвестрации также различается (например, прямая секвестрация или образование полифосфатных молекул). Следовательно, ожидают, что присутствие более чем одного типа агента секвестрации относительно хорошо переносится клеткой/организмом-хозяином.

ПРИМЕР 1. Агенты секвестрации по изобретению обеспечивают толерантность и дают возможность роста бактерий в присутствии высоких концентраций ртути, кадмия, цинка и свинца.

В одном воплощении настоящего изобретения была сконструирована плазмида, содержащая вектор, продаваемый под торговым названием pBlueScript® (Stratagene), для экспрессии трансгенов на высоком уровне. Экспрессионная кассета в этом векторе включала: промотор пластидного гена 16S rrn; трансляционный энхансерный элемент 5'UTR из гена 10 бактериофага Т7; трансген и Rho-независимый терминатор 3'UTR, как показано на фиг.5. В одном воплощении 3'UTR представлял собой последовательность rps16 хлоропласта. 5'UTR из гена 10 был сконструирован из синтетических олигонуклеотидов. Другие регуляторные последовательности были сконструированы посредством полимеразной цепной реакции. Генетические элементы были сконструированы таким образом, что содержали удобные сайты рестрикции вблизи концов каждого элемента. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Sambrook, J., and Rusell, D., Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab press. Cold Spring Harbor, NY (2001). Были созданы множественные плазмидные конструкции, где трансген кодировал lacZ, mt1 или ppk.

Бактериальные клоны, содержащие эти конструкции, выращивали в течение 16 часов в среде LB, содержащей различные концентрации HgCl₂,, как показано на фиг.1. На фиг.1, фиг.1А представляет нетрансформированный штамм Е.coli JM109, на фиг.1В представлен трансгенный штамм Е.coli, содержащий вектор pBSK-P16S-g10-lacZ-3'UTR, на фиг.1C представлен трансгенный штамм Е. coli, содержащий вектор pBSK-P16S-g10-mt1-3'UTR, и на фиг.1D представлен трансгенный клон Е. coli, несущий вектор pBSK-P16S-g10-ppk-3'UTR. Засев бактериального инокулума добавляли в колбы для бактериальных культур, и колбу инкубировали при встряхивании при 37°С, типичным способом для выращивания бактериальных культур. В конце 16-часового периода инкубации поглощение бактериальной среды измеряли при OD 600 нм.

Почти идентичные конструкции (но без промоторного элемента P16S) были также сконструированы и трансформированы в Е.coli. В этих Р16-минус конструкциях промотор представлял собой промотор вектора lacZ. Сконструированные бактерии, содержащие P16S-минус конструкции, также показали повышенную устойчивость и рост при высоких уровнях ртути. Например, конструкция гена mt1 выживала при концентрации вплоть до примерно 20 мкМ Hg, a конструкция ppk выживала при концентрации вплоть до примерно 40 мкМ Hg. Однако при сравнении ясно, что конструкции, которые включали элемент P16S, были способны выдерживать при значительно более высоких уровнях ртути.

Оказывается, что полифосфаткиназа обеспечивает лучшую устойчивость к Hg, чем металлотионеин, где оба белка экспрессируются на низких уровнях, как в случае векторов pBSK-g10-mt1-rpsT и pBSK-g10-ppk-rpsT. Когда эти белки претерпевают гиперэкспрессию, металлотионеин обеспечивал более высокую защиту против токсических эффектов Hg, чем полифосфаткиназа. Изобретение не ограничено каким-либо механизмом действия специфичных хелатирующих агентов. Тем не менее, различие в устойчивости к ртути у бактерий, экспрессирующих ppk или mt1 на относительно более низких или более высоких уровнях, может объясняться механизмом действия двух белков. В случае металлотионеина, поскольку он непосредственно секвестрирует Hg, более высокие уровни экспрессии соответствуют более высокому уровню устойчивости. Этим он отличается от полифосфаткиназы, которая может продуцировать более высокие уровни полифосфатов даже при более низких концентрациях фермента, поскольку она является ферментом. При более высоких концентрациях фермента приращение в устойчивости к Hg может быть более низким, чем ожидаемое, поскольку доступность субстрата фермента в клетке может быть недостаточной, ограничивая за счет этого его активность. Полифосфаткиназа осуществляет полимеризацию гамма-фосфатов из АТФ с образованием длинных полифосфатных цепей.

Экспериментальные результаты, суммированные на фиг.1, показывают, что Е. coli, не трансформированные хелатирующими агентами ("wt"), могут расти в среде, содержащей вплоть до примерно 5 мкМ Hg, хотя рост снижается при воздействии 5 мкМ ртути. Е.coli, трансформированные указанной плазмидой, показывают рост в течение 16-часового периода при выращивании при концентрациях ртути в диапазоне от 20 мкМ вплоть до примерно: 40 (pkk); 80 (β-gal); 80 (mt1) мкМ ртути. В подобном эксперименте, как показано на фиг.2, трансгенные Е.coli могут продолжать расти даже в присутствии более высоких концентраций ртути, и культуры достигают более высоких плотностей после 120 часов инкубации в среде LB, содержащей различные указанные концентрации Hg, концентрации ртути вплоть до примерно: 100 мкМ для конструкции ppk; 140 мкМ для конструкции β-gal и 160 мкМ для конструкции mt1. Соответственно, бактерии выдерживали, и продолжали расти при этих высоких концентрациях ртути.

ПРИМЕР 2. Конструкции по изобретению (pBSK-P16S-g10-хелатирующий агент-3'UTR) транскрибировали элемент хелатирующего агента на очень высоких уровнях.

мРНК собирали из нетрансформированных бактерий и бактериальных клонов, экспрессирующих mt1 и ppk. Суммарную клеточную мРНК выделяли путем использования мини-набора RNeasy (Qiagen) и протокола, и 1 мл культур бактериальных клонов и нетрансформированного штамма Е.coli JM109 выращивали в среде Лурия-Бертани (LB) в течение 16 часов при 37°С при встряхивании 300 об/мин. Образцы РНК обрабатывали ДНКазой I при концентрации 100 мкг/мл. Образцы нормализовали и подвергали обратной транскрипции путем амплификации со случайными праймерами, используя набор для кДНК AccuScript (Stratagene). кДНК анализировали количественной ПЦР в реальном времени, используя двухступенчатую программу амплификации ПЦР в реальном времени с анализом кривой отжига после амплификации. Геноспецифические стандартные кривые строили для количественного определения с синтетического олигонуклеотида. С помощью ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными к трансгену, получали кДНК в количествах, пропорциональных матрице мРНК. Контрольные эксперименты с использованием в качестве матрицы мРНК из нетрансформированных бактерий показали отсутствие экспрессии трансгена. Число копий мРНК, специфичной к трансгену, вычисляли и нормализовали по суммарной присутствующей мРНК. Как видно на фиг.3, клоны содержали примерно 7000 копий каждого из транскриптов на нг суммарной мРНК. Подобные данные получены с конструкцией, содержащей элемент β-gal. Специалисту в данной области техники понятно, что эти числа указывают на то, что трансгены транскрибируются на очень высоком уровне.

ПРИМЕР 3. Бактерии, содержащие агенты секвестрации по изобретению, образуют агрегаты при аккумуляции ими ртути.

Темное окрашивание, агрегацию и осаждение наблюдали, когда бактерии выращивали в ртути при достаточно высоких концентрациях или при более низких концентрациях в течение достаточной временной протяженности. Например, как показано на фиг.6, образцы pBSK-P16S-g10 (5'UTR)-mt1-3'UTR ("mt1") и pBSK-P16S-g10 (5'UTR)-lacZ-3'UTR ("lacZ") после инкубации в среде LB, содержащей 120 мкМ Hg, образуют агрегаты, которые аккумулируются на дне контейнера. Подобные эффекты также наблюдали с трансгенными бактериями, содержащими гены mt1 или ppk, растущими в присутствии 80 мкМ ртути. Изменения наблюдали примерно после 24 часов, и они возрастали со временем пропорционально аккумуляции. Все три бактериальных клона выращивали при качании (примерно при 280 об/мин) в 15 мл конической пробирке. Агрегация и осаждение происходили во время качания без необходимости в стационарной инкубации. Эти эффекты изменения цвета и осаждения происходят с каждым из тестируемых хелатирующих агентов.

Это обеспечивает визуальный индикатор того, когда бактерии нужно удалить и заменить. Этот эффект упрощает удаление бактерий, которые аккумулировали большие количества ртути, путем их простого отсеивания из жидкости.

Данные эффекты агрегации и осаждения наблюдали в бактериальных клонах pBSK-P16S-g10-mt1-rpsT и pBSK-P16S-g10-ppk-rpsT. Следовательно, это, видимо, не зависит прямо от генотипа, а, вероятнее, зависит от устойчивости к ртути и ее аккумуляции в клетке. Агрегацию и осаждение наблюдали только у бактерий, которые были выращены при концентрациях ртути равных или больших чем 80 мкМ, в течение периода по меньшей мере 24 часа. При более низких концентрациях ртути клетки, вероятно, нужно выдерживать в ртути при низкой концентрации в течение более длительного периода времени. Тем не менее, изменение цвета, агрегация и осаждение происходят также при более низких концентрациях ртути, как только бактерии аккумулировали достаточно ртути.

Трансгенные бактерии, которые аккумулируют ртуть, приобретают темный цвет, что служит показателем высокой концентрации ртути в клетке. Потемнение клеток можно оценивать при 40 мкМ Hg или более. Эффекты агрегации, осаждения и окрашивания являются очень полезными характеристиками для идентификации и выделения бактериальных клеток, как только они аккумулировали высокие концентрации ртути; они могут быть полезными маркерами для определения того, когда клетка готова к отбору из очищаемой окружающей среды, и могут также помочь снизить расходы на применение этих бактериальных систем для биоремедиации ртути. Это сообщение является первым сообщением о морфологических изменениях, запускаемых в бактериальных клетках вследствие аккумуляции ртути в высоких концентрациях.

ПРИМЕР 4. После обработки культуральной среды под воздействием бактерий, содержащих конструкции по изобретению, обработанная культуральная среда является по существу свободной от тяжелых металлов; ртуть была секвестрирована.

Как показано на фиг.7, нетрансформированный штамм Е.coli JM109 культивировали в среде LB без ртути (0 мкМ), в обработанной среде и в среде LB, имеющей концентрацию 120 мкМ HgCl₂.

Обработанная среда представляет собой среду LB, которая первоначально содержала 120 мкМ HgCl₂, и в которой выращивали бактериальный клон либо pBSK-Prrn-5'UTR-lacZ-3'UTR, либо pBSK-Prrn-S'UTR-mt1-S'UTR в течение 120 часов. Бактериальные клетки удаляли из жидкой среды центрифугированием при 13000 об/мин в течение 2 минут, и жидкую среду стерилизовали путем пропускания через фильтр 0,22 мкМ, чтобы удалить какие-либо остаточные трансгенные бактериальные клетки от процесса центрифугирования.

Обработанную среду повторно инокулировали нетрансформированным штаммом Е.coli JM109. В эксперименте, представленном на фиг.7А, обработанная среда представляла собой среду, обработанную бактериями, содержащими конструкцию pBSK-Prrn-5'UTR-lacZ-3'UTR ("lacZ"). В эксперименте, представленном на фиг.7 В, обработанная среда представляла собой среду, обработанную бактериями, содержащими конструкцию pBSK-Prrn-5'UTR-mt1-3'UTR ("mt1"). Нетрансформированным бактериям давали возможность расти в течение 16 часов в соответствующей обработанной среде при 37°С в стандартных условиях для бактериальных культур, а затем измеряли поглощение OD₆₀₀ для культуры. Результаты показали нормальную скорость роста нетрансформированных Е.coli в среде, которая была обработана трансгенными бактериями. В качестве контроля свежую среду, содержащую 120 мкМ Hg, также стерилизовали на фильтре и добавляли бактерии Е.coli JM109. Нетрансформированные бактерии JM109 были неспособны расти в среде, содержащей 120 мкМ HgCl₂. См. фиг.7А и 7В. Это указывает на то, что трансгенные клоны по изобретению можно использовать для восстановительной обработки жидкостей, содержащих очень высокие концентрации ртути. Обработка снижала Hg до нетоксичных уровней (менее чем примерно 5 мкМ) и давала возможность для нормального роста Е.coli JM109.

ПРИМЕР 5. Ртуть секвестрируется внутри бактерий; трансгенные бактерии снижают ртуть до суббактериальной ингибиторной дозы.

Чтобы подтвердить, что β-галактозидаза может действовать как хелатирующий агент, авторы изобретения проводили анализ атомной абсорбционной спектроскопией холодного пара (CVAAS) на бактериальных осадках pBSK-P16S-g10-lacZ-rpsT, полученных из 5 мл культур в среде LB с 120 мкМ Hg после 120 часов. Клетки удаляли из культуры центрифугированием, промывали и ресуспендировали в 1 мл среды LB. Клетки и супернатант подвергали кислотному разрушению индивидуально, следуя способу ЕРА 3010А (ЕРА Method 3010A. Methods for Chemical Analysis of Water and. Wastes; U.S. Environmental Protection Agency: Washington, DC, 1992), доводили до объема 5 мл для сохранения первоначальной доли Hg, а затем анализировали с помощью CVAAS. Результаты показали, что бактериальный клон lacZ был очень эффективен при удалении Hg из среды, аккумулируя концентрацию, равную 116 мкМ Hg (фиг.11). Концентрация, оставшаяся в среде после 120 часов обработки, составляла 2,7 мкМ (фиг.11). Эти результаты подтвердили результаты, которые показали, что нетрансформированные Е.coli росли исключительно хорошо в среде, предварительно обработанной бактериальным клоном pBSK-P16S-g10-lacZ-rpsT. На основании обоих исследований было понятно, что трансгенные бактерии были способны к удалению Hg из жидких культур до уровней ниже 5 мкМ.

ПРИМЕР 6. Биологический анализ β-галактозидазы. Ртуть снижает способность β-gal к расщеплению X-gal.

Как показано на фиг.8, бактериальный клон, содержащий плазмиду pBSK-P16S-g10-lacZ-rps16, выращивали при указанных концентрациях Hg⁺². На панели I показаны измерения бактериального роста (OD_{600 нм}) после 16 часов при концентрациях Hg⁺² в диапазоне от 0 до 20 мкМ Hg⁺². Затем готовили дубликаты кювет для каждых бактерий, выросших при указанной концентрации Hg. См. панели II и III. 100 мкг/мл Х-gal добавляли в кюветы панели III. Снижение в преобразовании X-Gal до синего окрашивания наблюдали пропорционально повышению концентрации ртути вплоть до 20 мкМ Hg⁺². Как наблюдали на панелях I и II, бактериальный рост трансформированного клона не подвергался влиянию возрастающих концентраций ртути в пределах данного диапазона концентраций. Это указывает на то, что снижение синего окрашивания является фактором снижения ферментативной активности β-gal, а не следствием отсутствия бактериального роста.

Для более легкой визуализации на фиг.8 представлены изображения действительных фотографий кювет, содержащих образцы, на панелях II и III. Оттенок на рисунке соответствует оттенку на фотографиях, и представлено относительное потемнение кювет, содержащих бактерии, подвергнутые воздействию различных концентраций Hg. Панель II представляет собой точную графическую передачу фотографии кювет, которая показывает бактериальный рост после 16 часов при 0-20 мкМ Hg⁺². Панель III представляет собой точную графическую передачу фотографии кювет, которая показывает, что возрастающее воздействие и хелатирование Hg⁺² β-галактозидазой снижает способность этого фермента к преобразованию субстрата Х-gal в метаболит синего цвета. А: 0 мкМ; В: 5 мкМ; С: 10 мкМ; D: 20 мкМ. Оттенок для кюветы "D" на панелях II и III визуально идентичен.

На фиг.9, панель А, показаны действительные фотографии подобных экспериментов, где бактериальный клон, экспрессирующий β-gal, выращивали в присутствии 100 мкг/мл Х-gal и указанных концентраций ртути в течение 16 часов при 37°С. Как видно, при росте культуры при 40 мкМ ртути начинается развитие более темного окрашивания. Это потемнение цвета является эффектом аккумуляции в клетке секвестрированной ртути. Окрашенные полоски под каждой пробиркой представляют собой полосы цветового кодирования, разработанные для имитации/улавливания оттенка культуры при воздействии указанных концентраций ртути.

На фиг.9, панель В, показан прототипный набор для обнаружения загрязнения тяжелым металлом. Предложен контейнера в который добавляют тестируемые жидкости, а также концентрированный Х-gal и конструкцию, экспрессирующую β-gal, или очищенную β-gal. Карта цветового кода присоединена к культуральной пробирке или находится в непосредственной близости к ней, что дает возможность визуального сравнения результата теста с цветовой картой. Фиг.9А представляет собой схематическое изображение набора на фиг.9В. После периода инкубации в стандартизованных условиях цвет культуры сравнивают с цветовой картой.

ПРИМЕР 7. Агенты секвестрации обеспечивают устойчивость к цинку, кадмию и свинцу.

Каждую из нетрансформированной культуры Е.coli JM109 ("wt") и бактериальных культур, экспрессирующих гены lacZ, mt1 и ppk, высевали при плотности бактерий 0,01 OD₆₀₀ и выращивали в течение 24 ч в среде LB с добавлением 1000 мкМ ZnCl₂ (фиг.10, панель А); 250 мкМ CdCl₂ (панель В) и 3000 мкМ Pb((С₂Н₃)О)₂·3H₂O (панель С). Как видно на фиг.10, бактерии wt проявляли определенный уровень устойчивости к этим токсинам. Однако трансгенные бактерии были значительно более устойчивыми. Вероятно, что эти бактериальные клоны могли продолжать хорошо расти в присутствии еще более высоких уровней цинка, кадмия и свинца. Ограниченную устойчивость показал только клон, содержащий ppk, против кадмия. Клоны проявляли сниженный, но значительный рост в среде с добавлением свинца. Рост всех трех трансформированных бактерий в цинке и рост клонов mt и β-gal в кадмии был по существу беспрепятственным. В качестве контроля, wt и все три трансформированных бактериальных штамма росли одинаково хорошо в среде без добавления тяжелого металла (данные не представлены).

Вышеописанное изобретение следует читать в сочетании с прилагаемой формулой изобретения и графическими материалами. Описание воплощений и примеров обеспечивает осуществление на практике различных воплощений изобретения, и они не предназначены для ограничения объема изобретения предпочтительным воплощением, но служат в качестве конкретного примера изобретения. Специалистам в данной области техники понятно, что можно легко использовать концепцию и конкретные раскрытые воплощения как основу для модификации или разработки других способов и систем для осуществления таких же целей, как в настоящем изобретении.

Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты, патенты и содержания веб-сайтов, цитируемые в данной заявке, включены в данную заявку посредством ссылки до той степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и конкретно указана как включенная посредством ссылки, и изложены в данной заявке в их полном объеме.

Использование терминов в единственном и множественном числе и подобные цитируемые объекты описания изобретения следует истолковывать как охватывающие и единственное, и множественное число, если иное четко не указано в данной заявке или четко не противоречит контексту.

Указание диапазонов значений в данной заявке предназначено исключительно для того, чтобы служить в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, входящее в этот диапазон, если в данной заявке не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было индивидуально указано в данной заявке. Слово "примерно", когда оно сопровождает числовое значение, следует истолковывать как указывающее на отклонение вплоть до 10% включительно от указанного числового значения. Использование любого и всех примеров или примерных выражений ("например" или "такой как"), приведенное в данной заявке, предназначено исключительно для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничений на объем изобретения, если не заявлено иное. Ни одно выражение в описании не следует истолковывать как указывающее на какой-либо незаявленный элемент как существенный для практики изобретения.

1. Бактериальная клетка, содержащая по меньшей мере один хелатирующий агент, кодируемый трансгеном, выбранным из гена mt млекопитающих, гена β-галактозидазы или гена ppk, причем хелатирующий агент не экспрессируется как слитый белок и хелатирующий агент экспрессируется с сильного промотора и по меньшей мере одного из 5′UTR и 3′UTR, так что бактериальная клетка продуцирует по меньшей мере 4000 полных копий мРНК указанного хелатирующего агента на нг суммарной мРНК, причем бактериальная клетка устойчива к и способна реплицироваться при по меньшей мере одном тяжелом металле в следующих концентрациях, соответственно: от по меньшей мере примерно 25 мкМ до примерно 80 мкМ Hg, концентрациях кадмия вплоть до примерно 250 мкМ, концентрациях цинка вплоть до примерно 1000 мкМ или концентрациях свинца вплоть до примерно 3000 мкМ.

2. Бактериальная клетка по п. 1, выбранная из Е. coli, Pseudomonas, Cyanobacteria и Bacillus.

3. Бактериальная клетка по п. 1, где трансген имеет последовательность, соответствующую гену mt мыши, и бактериальная клетка устойчива к и способна реплицироваться при по меньшей мере примерно 25 мкМ до примерно 100 мкМ Hg, концентрации кадмия вплоть до примерно 250 мкМ, концентрации цинка вплоть до примерно 1000 мкМ или концентрации свинца вплоть до примерно 3000 мкМ.

4. Бактериальная клетка по п. 3, где ген mt является геном mt1.

5. Бактериальная клетка по п. 1, где трансген имеет последовательность, соответствующую гену β-галактозидазы, и где бактериальная клетка устойчива к и способна реплицироваться при по меньшей мере примерно 25 мкМ до примерно 140 мкМ Hg, концентрации кадмия вплоть до примерно 250 мкМ, концентрации цинка вплоть до примерно 1000 мкМ или концентрации свинца вплоть до примерно 3000 мкМ.

6. Бактериальная клетка по п. 1, где трансген имеет последовательность, соответствующую гену ppk, и где бактериальная клетка устойчива к и способна реплицироваться при по меньшей мере примерно 25 мкМ до примерно 80 мкМ Hg, концентрации кадмия вплоть до примерно 250 мкМ, концентрации цинка вплоть до примерно 1000 мкМ или концентрации свинца вплоть до примерно 3000 мкМ.

7. Бактериальная клетка по п. 1, которая, находясь в жидкой окружающей среде, содержащей ртуть, кадмий, цинк или свинец, аккумулирует ртуть, кадмий, цинк или свинец и приобретает темное окрашивание.

8. Бактериальная клетка по п. 1, которая, находясь в жидкой окружающей среде, содержащей ртуть, аккумулирует ртуть и приобретает темное окрашивание.

9. Бактериальная клетка по п. 1, которая, находясь в жидкой окружающей среде, содержащей ртуть, кадмий, цинк или свинец, аккумулирует ртуть, кадмий, цинк или свинец и образует агрегаты и осадки.

10. Бактериальная клетка по п. 5, где способность β-галактозидазы к расщеплению 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (X-gal) или его аналога снижена из-за присутствия тяжелого металла в концентрации от 0 мкМ до примерно 40 мкМ с пропорциональным снижением синего окрашивания.

11. Бактериальная клетка по п. 1, которая не экспрессирует трансгенный mer оперон, кодирующий транспортную функцию.

12. Бактериальная клетка по п. 1, где хелатирующий агент экспрессируется с сильного промотора, 5′UTR и 3′UTR.

13. Бактериальная клетка по п. 1, где промотор представляет собой последовательность конститутивного промотора, имеющего происхождение из пластидного гена 16S rrn, 5′UTR представляет собой последовательность трансляционного энхансерного элемента, имеющего происхождение из гена 10 бактериофага Т7, и 3′UTR представляет собой последовательность Rho-независимого
транскрипционного терминатора, имеющего происхождение из пластидного гена rps16 или гена rrnB Е. coli.

14. Бактериальная клетка по п. 13, где последовательность транскрипционного терминатора имеет происхождение из пластидного гена rps16.

15. Способ очистки жидкости, содержащей ртуть, свинец, цинк и кадмий, от загрязнения ртутью, включающий:
- добавление культуры бактериальных клеток по п. 1 к указанной жидкости и
- удаление бактерий из указанной жидкости после периода времени, достаточного для секвестрации ртути, свинца, цинка и кадмия.

16. Способ по п. 15, где бактерии удаляют после того, как они образуют агрегаты.

17. Способ по п. 16, где агрегаты собирают путем аспирации, просеивания или удаления фильтра из очищаемой от загрязнения жидкости.

18. Способ по п. 15, где бактерии экспрессируют β-галактозидазу, дополнительно включающий, по меньшей мере в один момент времени на протяжении очистки, добавление X-gal по меньшей мере к одному образцу очищаемой жидкости и тестирование этого образца для определения способности бактерий к метаболизму 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (X-gal) с получением синего окрашивания с целью определения концентрации ртути в образце.

19. Способ очистки жидкости от загрязнения ртутью, включающий:
- помещение указанной жидкости в устройство, содержащее твердый матрикс, где указанный матрикс дополнительно содержит β-галактозидазу без клеточного носителя; и
- сбор указанной жидкости после контакта с твердым матриксом.

20. Набор для обнаружения загрязнения ртутью, содержащий:
- культуру бактериальных клеток по п. 5, экспрессирующих β-галактозидазу, или фермент β-галактозидазу на индикаторной полоске, которые выявляют прогрессивное изменение цвета при
воздействии жидких растворов, содержащих ртуть в концентрации от примерно 5 мкМ до примерно 40 мкМ в присутствии X-gal,
- X-gal и
- карту, показывающую окрашивание, соответствующее различным концентрациям ртути в жидкости при контакте с бактериальной культурой, экспрессирующей β-галактозидазу, или с ферментом β-галактозидазой на индикаторной полоске.

21. Набор по п. 20, дополнительно содержащий колориметрический усилитель.

22. Набор для обнаружения загрязнения тяжелым металлом, содержащий:
- контейнер для жидкостей,
- культуру бактериальных клеток по п. 1 и
- индикаторную полоску, показывающую темное окрашивание, соответствующее окрашиванию бактериальной культуры, экспрессирующей β-галактозидазу, ррк или mt1, при росте в присутствии различных концентраций тяжелых металлов от примерно 0 мкМ до 40 мкМ в жидкости,
при этом, когда бактериальную культуру помещают в контейнер, который содержит тестируемую жидкость, она обнаруживает тяжелые металлы в концентрациях от примерно 0 мкМ до 40 мкМ.