Способы выявления препаратов и аутоантител против tnf

Авторы патента:

ОРМУНД Линда (US)

СИНГХ Шарат (US)

ВАН Шуй Лун (US)

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2571489:

НЕСТЕК С.А. (CH)

Группа изобретений относится к способам детектирования и измерения наличия или уровня лекарственных препаратов против TNFα и аутоантител в образцах и включает сравнение количества меченого комплекса и количества свободного меченого TNFα или лекарственного средства против TNFα со стандартной кривой. Группа изобретений применяется для оптимизации лечения и мониторинга пациентов, получающих лекарственные препараты против TNFα, для выявления наличия или уровня аутоантител (например, НАСА и/или НАНА) против препарата. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 25 ил., 5 табл., 12 пр.

Настоящая заявка претендует на приоритет от Предварительной заявки на патент США No. 61/255,048, поданной 26 октября 2009 г., Предварительной заявки на патент США No. 61/262,877, поданной 19 ноября 2009 г., Предварительной заявки на патент США No. 61/324,635, поданной 15 апреля 2010 г., Предварительной заявки на патент США No. 61/345,567, поданной 17 мая 2010 г.. редварительной заявки на патент США No. 61/351,269, поданной 3 июня 2010 г., Предварительной заявки на патент США No. 61/389,672, поданной 4 октября 2010 г., и Предварительной заявки на патент США No. 61/393,581, поданной 15 октября 2010 г., содержание которых включено путем ссылки во всей полноте на все случаи.

Уровень техники

Аутоиммунные заболевания представляют значительную и широко распространенную медицинскую проблему. Например, аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит (RA), затрагивающий более двух миллионов людей в США. RA вызывает хроническое воспаление суставов и обычно является прогрессирующим заболеванием, которое может вызвать разрушение суставов и функциональную нетрудоспособность. Причина ревматоидного артрита неизвестна, хотя генетическая предрасположенность, инфекционные агенты и факторы окружающей среды - все были вовлечены в этиологию заболевания. При активном RA симптомы могут включать усталость, отсутствие аппетита, небольшую лихорадку, боль в мышцах и суставах и тугоподвижность. Также во время вспышек болезни суставы часто краснеют, набухают, становятся болезненными вследствие воспаления синовиальной оболочки. Более того, поскольку RA является системным заболеванием, воспаление может задевать не только суставы, но и другие органы и участки тела, включая железы глаз и рта, выстилку легких, перикард и кровеносные сосуды.

Традиционные способы лечения RA и других воспалительных заболеваний включают быстродействующие препараты первого ряда и действующие медленнее препараты второго ряда. Препараты первого ряда уменьшают боль и воспаление. Примерами таких препаратов первого ряда являются аспирин, напроксен, ибупрофен, этодолак и другие нестероидные противовоспалительные средства (NSAIDs), а также кортикостероиды, принимаемые внутрь или в виде инъекций непосредственно в ткани и суставы. Препараты второго ряда способствуют ослаблению болезни и предотвращают прогрессирующее разрушение суставов, их также называют модифицирующими противоревматическими препаратами или DMARDs. Примерами препаратов второго ряда являются золото, гидрохлорохин, азулфидин и такие иммуносупрессорные средства, как метотрексат, азатиоприн, циклофосфамид, хлорамбуцил и циклоспорин. Однако многие из этих препаратов могут иметь вредные побочные эффекты. Поэтому ведутся поиски других способов лечения ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний.

Фактор некроза опухолей альфа (TNF-α) - это цитокин, вырабатываемый различными типами клеток, включая моноциты и макрофаги, который изначально был идентифицирован по его способности индуцировать некроз определенных опухолей у мышей. Впоследствии было показано, что фактор, именуемый кахектином и связанный с кахексией (истощением), идентичен TNF-α. TNF-α вовлекается в патофизиологию целого ряда других заболеваний человека, включая шок, сепсис, инфекции, аутоиммунные заболевания, RA, болезнь Крона, отторжение трансплантатов и реакцию "трансплантат против хозяина".

Вследствие пагубной роли TNF-α человека (hTNF-α) в ряде заболеваний человека разрабатывались стратегии лечения, призванные ингибировать или противодействовать активности hTNF-α. В частности, велись поиски антител, связывающих и нейтрализи-рующих hTNF-α в качестве средства ингибирования активности hTNF-α. Первыми из таких антител были моноклональные антитела (mAbs) мыши, секретируемые гибридомами, полученными из лимфоцитов мышей, иммунизированных hTNF-α (например, см. U.S. Pat. No. 5,231,024 to Moeller et al.). Хотя эти мышиные антитела против hTNF-α часто проявляли высокое сродство к hTNF-α и были способны нейтрализовать активность hTNF-α, их применение in vivo было ограничено из-за проблем, связанных с введением мышиных антител людям, таких как короткое время полужизни в сыворотке, неспособность запускать некоторые эффекторные функции человека и индуцирование нежелательной иммунной реакции против мышиных антител у человека (реакция "человека против антител мыши" (НАМА)).

Совсем недавно стали применять биологические подходы к лечению таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит.Например, для лечения ревматоидного артрита были одобрены FDA четыре ингибитора TNFα: REMICADE™ (инфликсимаб) - химерное mAb против TNFα, ENBREL™ (этанерцепт) - слитый белок TNFR-Fc Ig, HUMIRA™ (адалимумаб) - человеческое mAb против TNFα и CIMZIA® (цертолизумаб-пегол) - ПЭГилированный Fab-фрагмент.CIMZIA® также применяется для лечения болезни Крона (CD) в умеренной и тяжелой форме. Хотя такие биологические способы лечения оказались успешными при лечении ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний типа CD, однако не все субъекты, подвергавшиеся лечению, реагировали или хорошо реагировали на такое лечение. Более того, применение ингибиторов TNFα может индуцировать иммунную реакцию на лекарство и приводить к образованию аутоантител, таких как человеческие против химерных антител (НАСА), человеческие против гуманизированных антител (НАНА) и человеческие против антител мыши (НАМА). Такие иммунные реакции типа НАСА, НАЛА или НАМА могут быть связаны с реакциями гиперчувствительности и тяжелыми изменениями фармакокинетики и биораспределения иммунотерапевтического ингибитора TNFα, которые препятствуют дальнейшему лечению этим препаратом. Таким образом, в данной области существует потребность в методах детектирования наличия биопрепаратов против TNFα и/или аутоантител к ним в образцах пациентов для мониторинга терапии ингибиторами TNFα и принятия решений по лечению. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность, а также обеспечивает и другие преимущества.

Сущность изобретения

TNFα вовлечен в воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, вирусные, бактериальные и паразитические инфекции, раковые заболевания и/или нейродегенеративные заболевания и является полезной мишенью для специфической биологической терапии при таких заболеваниях, как ревматоидный артрит и болезнь Крона. Ингибиторы TNFα, как-то антитела против TNFα, представляют собой важный класс терапевтических средств. Нужны методы детектирования наличия биопрепаратов против TNFα и/или аутоантител к ним.

Поэтому в одном воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ детектирования наличия или уровня препарата против TNFα в образце, который включает:

(a) контактирование меченого TNFα с образцом, содержащим или предположительно содержащим препарат против TNFα, с образованием меченого комплекса (т.е. иммунокомплекса или конъюгата) с препаратом против TNFα (при этом меченый TNFα и препарат против TNFα не связаны ковалентно друг с другом);

(b) подвергание меченого комплекса эксклюзионной хроматографии для отделения меченого комплекса (например, от свободного меченого TNFα); и

таким образом детектируется наличие или уровень препарата против TNFα. В определенных случаях способы применимы для измерения уровня REMICADE™ (инфликсимаба), ENBREL™ (этанерцепта), HUMIRA™ (адалимумаба) и CIMZIA® (цертолизумаба-пегола) в образце, например, от субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα.

В другом воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ детектирования наличия или уровня аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает:

(a) контактирование меченого препарата против TNFα с образцом, содержащим или предположительно содержащим аутоантитела к препарату против TNFα, с образованием меченого комплекса (т.е. иммунокомплекса или конъюгата) с аутоантителом (при этом меченый препарат против TNFα и аутоантитело не связаны ковалентно друг с другом);

(b) подвергание меченого комплекса эксклюзионной хроматографии для отделения меченого комплекса (например, от свободного меченого препарата против TNFα); и

В определенных случаях способы применимы для измерения уровня аутоантител, включая, без ограничения, человеческие против химерных антител (НАСА), человеческие против гуманизированных антител (НАНА) и человеческие против антител мыши (НАМА) в образце, например, от субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα.

В следующем воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ детектирования наличия или уровня аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает:

(a) контактирование меченого препарата против TNFα и меченого TNFα с образцом, содержащим или предположительно содержащим аутоантитела к препарату против TNFα, с образованием первого меченого комплекса (т.е. иммунокомплекса или конъюгата) между меченым препаратом против TNFα, меченым TNFα и аутоантителом (при этом компоненты первого меченого комплекса не связаны ковалентно друг с другом) и второго меченого комплекса (т.е. иммунокомплекса или конъюгата) между меченым препаратом против TNFα и аутоантителом (при этом компоненты второго меченого комплекса не связаны ковалентно друг с другом), причем меченый препарат против TNFα и меченый TNFα содержат разные метки;

(b) подвергание первого меченого комплекса и второго меченого комплекса эксклюзионной хроматографии для отделения первого меченого комплекса и второго меченого комплекса (например, друг от друга и от свободного меченого TNFα и свободного меченого препарата против TNFα); и

(с) детектирование первого меченого комплекса и второго меченого комплекса, таким образом детектируя наличие или уровень не-нейтрализующей формы аутоантител (при этом аутоантитело не мешает связыванию между препаратом против TNFα и TNFα), если присутствует и первый меченый комплекс, и второй меченый комплекс, и детектируется наличие или уровень нейтрализующей формы аутоантител (при этом аутоантитело мешает связыванию между препаратом против TNFα и TNFα), если присутствует только второй меченый комплекс.

В родственном воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ детектирования наличия или уровня аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает;

(a) контактирование меченого препарата против TNFα с образцом, содержащим или предположительно содержащим аутоантитела к препарату против TNFα, с образованием первого меченого комплекса (т.е. иммунокомплекса или конъюгата) между меченым препаратом против TNFα и аутоантителом (при этом меченый препарат против TNFα и аутоантитело не связаны ковалентно друг с другом);

(b) подвергание первого меченого комплекса первой эксклюзионной хромато-графии для отделения первого меченого комплекса (например, от свободного меченого препарата против TNFα);

(d) контактирование меченого TNFα с первым меченым комплексом с образованием второго меченого комплекса (т.е. иммунокомплекса или конъюгата) между меченым препаратом против TNFα и меченым TNFα (при этом меченый препарат против TNFα и меченый TNFα не связаны ковалентно друг с другом), причем меченый препарат против TNFα и меченый TNFα содержат разные метки;

(e) подвергание второго меченого комплекса второй эксклюзионной хромато-графии для отделения второго меченого комплекса (например, от свободного меченого TNFα); и

(f) детектирование второго меченого комплекса, таким образом детектируя наличие или уровень нейтрализующей формы аутоантител (при этом аутоантитело мешает связыванию между препаратом против TNFα и TNFα).

'TNFα.

В следующем воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ определения эффективного количества препарата против TNFα у субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα, который включает:

(a) измерение уровня препарата против TNFα в первом образце от субъекта, включающее:

(i) контактирование первого образца с некоторым количеством меченого TNFα с образованием первого комплекса, содержащего меченый TNFα и препарат против TNFα; и

(ii) детектирование первого комплекса методом эксклюзионной хроматографии, таким образом измеряя уровень препарата против TNFα;

(b) измерение уровня аутоантител к препарату против TNFα во втором образце от субъекта, включающее:

(i) контактирование второго образца с некоторым количеством меченого препарата против TNFα с образованием второго комплекса, содержащего меченый препарат против TNFα и аутоантитело; и

(ii) детектирование второго комплекса методом эксклюзионной хроматографии, таким образом измеряя уровень аутоантител;

(c) вычитание уровня аутоантител, измеренного на стадии (b), из уровня препарата против TNFα, измеренного на стадии (а), таким образом определяя эффективное количество препарата против TNFα.

(a) определение эффективного количества препарата против TNFα в соответствии со способом настоящего изобретения;

(b) сравнение эффективного количества препарата против TNFα с уровнем препарата против TNFα; и

(c) определение последующей дозы препарата против TNFα для субъекта, исходя из сравнения на стадии (b), таким образом оптимизируя терапевтическое количество препарата против TNFα.

В следующем воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ оптимизации лечения и/или снижения токсичности препарата против TNFα у субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα, который включает:

(a) измерение уровня препарата против TNFα в первом образце от субъекта;

(b) измерение уровня аутоантител к препарату против TNFα во втором образце от субъекта; и

(c) определение последующего курса лечения для субъекта, исходя из уровня препарата против TNFα и уровня аутоантител, таким образом оптимизируется лечение и/или снижается токсичность препарата против TNFα.

В следующем воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ определения наличия или уровня препарата против TNFα относительно внутреннего контроля в образце, содержащем или предположительно содержащем препарат против TNFα, который включает:

(a) контактирование некоторого количества меченого TNFα и некоторого количества внутреннего контроля с образцом с образованием комплекса меченого TNFα и препарата против TNFα;

(b) детектирование меченого TNFα и меченого внутреннего контроля методом эксклюзионной хроматографии;

(c) интегрирование площади под кривой для пика меченого TNFα на графике интенсивности сигнала в зависимости от времени элюирования при эксклюзионной хроматографии;

(d) интегрирование площади под кривой для пика меченого внутреннего контроля на графике интенсивности сигнала в зависимости от времени элюирования при эксклюзионной хроматографии;

(e) определение первого соотношения путем деления количества меченого TNFα на количество меченого внутреннего контроля;

(f) определение второго соотношения путем деления результата интегрирования из стадии (с) на результат интегрирования из стадии (d); и

(g) сравнение первого соотношения, определенного на стадии (е), со вторым соотношением, определенным на стадии (f), при этом определяется наличие или уровень препарата против TNFα относительно внутреннего контроля.

В следующем воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ оптимизации терапевтического количества препарата против TNFα у субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα, который включает: определение последующей дозы препарата против TNFα для субъекта, исходя из сравнения соотношения меченого TNFα к меченому внутреннему контролю на стадии (е) предыдущего параграфа с соотношением меченого TNFα к меченому внутреннему контролю на стадии (f) предыдущего параграфа, таким образом оптимизируется терапевтическое количество препарата против TNFα.

В некоторых воплощениях настоящим изобретением предусмотрен способ определения наличия или уровня аутоантител к препарату против TNFα относительно внутреннего контроля в образце, содержащем или предположительно содержащем аутоантитела, который включает:

(a) контактирование некоторого количества меченого препарата против TNFα и некоторого количества внутреннего контроля с образцом с образованием комплекса меченого препарата против TNFα и аутоантитела;

(b) детектирование меченого препарата против TNFα и меченого внутреннего контроля методом эксклюзионной хроматографии;

(c) интегрирование площади под кривой для пика меченого препарата против TNFα на графике интенсивности сигнала в зависимости от времени элюирования при эксклюзионной хроматографии;

(e) определение первого соотношения путем деления количества меченого препарата против TNFα на количество меченого внутреннего контроля;

(g) сравнение первого соотношения, определенного на стадии (е), со вторым соотношением, определенным на стадии (f), таким образом определяя наличие или уровень аутоантител относительно внутреннего контроля.

В следующем воплощении настоящим изобретением предусмотрен набор для измерения наличия или уровня препарата против TNFα и наличия или уровня аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает:

(a) первый измерительный субстрат, содержащий некоторое количество меченого TNFα;

(b) второй измерительный субстрат, содержащий некоторое количество меченого препарата против TNFα;

(c) необязательно третий измерительный субстрат, содержащий некоторое количество меченого TNFα и некоторое количество меченого внутреннего контроля;

(d) необязательно четвертый измерительный субстрат, содержащий некоторое количество меченого препарата против TNFα и некоторое количество меченого внутреннего контроля;

(e) необязательно средство для экстрагирования образца от субъекта; и

(f) необязательно брошюру с инструкциями по применению набора. Другие цели, особенности и преимущества настоящего изобретения станут понятными специалистам из следующего подробного описания и фигур.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлено типичное воплощение способов определения по настоящему изобретению, в котором для детектирования связывания между TNFα-Alexa₆₄₇ и HUMIRA™ применяется метод эксклюзионной хроматографии HPLC.

На фиг.2 представлены графики "доза-ответ" для связывания HUMIRA™ с TNFα-Alexa₆₄₇.

На фиг.3 представлен текущий способ на основе ELISA для измерения уровня НАСА, известный как мостиковый метод (bridging assay).

На фиг.4 представлена типичная схема способов детектирования аутоантител по настоящему изобретению для измерения концентраций НАСА/НАНА, вырабатываемых против REMICADE™.

На фиг.5 представлен анализ типа "доза-ответ" для связывания антитела против IgG человека с REMICADE™-Alexa₆₄₇.

На фиг.6 представлен второй анализ типа "доза-ответ" для связывания антитела против IgG человека с REMICADE™-Alexa₆₄₇.

На фиг.7 представлены графики "доза-ответ" для связывания антитела против IgG человека с REMICADE™-Alexa₆₄₇.

На фиг.8 представлено образование иммунокомплекса REMICADE™-Alexa₆₄₇ в нормальной сыворотке человека и НАСА-положительной сыворотке.

На фиг.10 представлена сводка и сравнение текущих способов измерения концентрации НАСА в сыворотке с новым способом определения НАСА по настоящему изобретению.

На фиг.11 представлены профили SE-HPLC меченого флуорофором (Fl) IFX при инкубации с нормальной (NHS) или НАСА-положительной (HPS) сывороткой. Добавление в инкубационную смесь возрастающих количеств НАСА-положительной сыворотки вызывало дозозависимое смещение пика IFX-F1 в область элюатов с более высокой молекулярной массой С1 и С2.

На фиг.12 представлены графики "доза-ответ" для связанного и свободного IFX-F1, составленные в присутствии возрастающих разведении НАСА-положительной сыворотки определенный анализом изменения подвижности. (А) Возрастающие разведения НАСА-положительной сыворотки инкубировали с 37,5 нг IFX-F1. Чем большее разведение (меньше НАСА), тем больше свободного IFX-F1 обнаруживается при анализе методом SE-HPLC. (В) Возрастающие разведения НАСА-положительной сыворотки инкубировали с 37,5 нг IFX-F1. Чем большее разведение (меньше НАСА), тем меньше связанного с НАСА IFX-F1 обнаруживается при анализе методом SE-HPLC.

На фиг.13 представлены профили SE-HPLC TNFα-F1 при инкубации с нормальной (NHS) сывороткой или сывороткой с добавлением IFX. Добавление в инкубационную смесь возрастающих количеств сыворотки с добавлением IFX вызывало дозозависимое смещение пика флуоресцентного TNFα в область элюатов с более высокой молекулярной массой.

На фиг.14 представлены графики "доза-ответ" для связанного и свободного TNFα, составленные в присутствии возрастающих разведении сыворотки с добавлением IFX определенный анализом изменения подвижности. Повышение концентрации IFX, добавленного в инкубационную смесь, вызывает снижение содержания свободного TNFα и повышение содержания связанного TNFα.

На фиг.15 представлено измерение относительного уровня НАСА и концентрации IFX в анализе изменения подвижности у больных IBD, получавших IFX в различные моменты времени.

На фиг.16 представлено лечение пациентов - измерение уровня НАСА и концентрации IFX в сыворотке больных IBD, получавших IFX в различные моменты времени.

На фиг.17 представлены типичные воплощения методов определения по настоящему изобретению для детектирования присутствия (А) не-нейтрализующих или (В) нейтрализующих аутоантител типа НАСА.

На фиг.18 представлено альтернативное воплощение методов определения по настоящему изобретению для детектирования присутствия нейтрализующих аутоантител типа НАСА.

На фиг.19 представлены профили изменения подвижности F1-меченого ADL при инкубации с нормальной сывороткой человека (NHS) в присутствии различного количества антител против IgG человека. Добавление в инкубационную смесь возрастающих количеств антител против IgG человека вызывало дозозависимое смещение пика F1-ADL (FA) в область элюатов с более высокой молекулярной массой С1 и С2, тогда как пик внутреннего контроля (1C) не изменялся.

На фиг.20 представлен график влияния антител против IgG человека на изменение подвижности (сдвиг) свободного F1-ADL. Возрастающие количества антител против IgG человека инкубировали с 37,5 нг F1-ADL и внутренним контролем. Чем больше антител добавляли в реакционную смесь, тем больше снижалось соотношение между свободным F1-ADL и внутренним контролем.

На фиг.21 представлены профили изменения подвижности F1-меченого TNF-α при инкубации с нормальной сывороткой человека (NHS) в присутствии различного количества ADL. Ех=494 нм, Ет=519 нм. Добавление в инкубационную смесь возрастающих количеств ADL вызывало дозозависимое смещение пика свободного TNF-F1 (FT) в область элюатовх с более высокой молекулярной массой, тогда как пик внутреннего контроля (1C) не изменялся.

На фиг.22 представлен график влияния ADL на изменение подвижности свободного TNF-α-F1. Возрастающие количества ADL инкубировали со 100 нг TNF-α-F1 и внутренним контролем. Чем больше ADL добавляли в реакционную смесь, тем больше снижалось соотношение между свободным TNF-α-F1 и внутренним контролем.

На фиг.23 представлены профили изменения подвижности F1-меченого REMICADE (IFX) при инкубации с нормальной сывороткой (NHS) или объединенной сывороткой НАСА-положительных пациентов.

На фиг.24 представлены профили изменения подвижности F1-меченого HLJMIRA (ADL) при инкубации с нормальной сывороткой (NHS) или антителом мыши против IgGI человека.

На фиг.25 представлены профили изменения подвижности F1-меченого HUMIRA (ADL) при инкубации с нормальной сывороткой (NHS) или объединенной сывороткой НАНА-положительных пациентов.

Раскрытие сущности изобретения

I. Введение

Настоящее изобретение частично основывается на открытии того, что гомогенный анализ изменения (сдвига) подвижности методом эксклюзионной хроматографии особенно предпочтителен для измерения присутствия или уровня ингибиторов TNFα, а также аутоантител (например, НАСА, НАНА и др.), вырабатываемых против них. В частности, настоящим изобретением предусмотрены способы определения типа "смешать и измерить", которые не требуют никаких стадий отмывания. При этом образовавшие комплекс и некомплексированные белковые препараты легко отделяются друг от друга. Кроме того, при использовании способов настоящего изобретения сводятся к минимуму любые возможные помехи со стороны свободного препарата. Напротив, типичный метод ELISA для измерения уровня НАСА или НАНА не может выполняться, пока ингибитор TNFα не будет удален из организма, что может занять до 3 месяцев. Более того, настоящее изобретение в общем приложимо к широкому спектру белковых препаратов наряду с антителами против TNFα. Способы настоящего изобретения также дают преимущество в том, что они не требуют прикрепления антигенов к твердой поверхности, устраняют неспецифическое связывание посторонних IgG, детектируют антитела со слабым сродством и проявляют повышенную чувствительность и специфичность перед доступными в настоящее время методами детектирования типа ферментного иммуноанализа.

Важность измерения концентрации биопрепаратов против TNFα в сыворотке, равно как и других иммунотерапевтических препаратов иллюстрируется тем, что FDA требует проводить фармакокинетические исследования и исследования на толерантность (например, иммунный ответ) во время клинических испытаний. Настоящее изобретение также находит применение при мониторинге пациентов, принимающих эти лекарства, чтобы удостовериться, что они получают правильную дозу, что препарат не выводится из организма слишком быстро и что они не развивается иммунный ответ против препарата. Более того, настоящее изобретение применимо для назначения перехода на другие лекарства вследствие несостоятельности первоначального препарата.

II. Определения

В настоящем изобретении следующие термины имеют приданные им значения, если не указано иначе.

Термины "препарат против TNF-α" или "ингибитор TNF-α" в настоящем изобретении охватывают вещества, включая белки, антитела, фрагменты антител, слитые белки (например, слитые белки Ig или слитые белки Fc), мультивалентные связывающие белки (например, DVD-Ig), небольшие молекулы-антагонисты TNF-α и подобные им природные или искусственные молекулы и/или их рекомбинантные и/или сконструированные формы, которые, прямо или косвенно, ингибируют активность TNF-α, как-то ингибируют взаимодействие TNF-α с рецептором TNF-α на клеточной поверхности, ингибируют вырабатывание белка TNF-α, ингибируют экспрессию гена TNF-α, ингибируют секрецию TNF-α из клеток, ингибируют сигналирование через рецептор TNF-α или любые другим образом приводят к снижению активности TNF-α у субъекта. Термин "препарат против TNF-α" или "ингибитор TNF-α" предпочтительно включает вещества, которые ухудшают активность TNF-α. Примеры ингибиторов TNF-α включают этанерцепт (ENBREL™, Amgen), инфликсимаб (REMICADE™, Johnson and Johnson), моноклональное антитело человека против TNF адалимумаб (D2E7/HUMIRA™, Abbott Laboratories), цертолизумаб-пегол (CIMZIA®, UCB, Inc.), CDP 571 (Celltech) и CDP 870 (Celltech), а также другие соединения, ингибирующие активность TNF-α таким образом, что при введении субъекту, страдающему или подвергающемуся риску возникновения заболевания, при котором активность TNF-α вредна (например, RA), происходит лечение заболевания.

Термин "прогнозирование восприимчивости к ингибитору TNF-α" в настоящем изобретении обозначает способность оценить вероятность того, что лечение субъекта ингибитором TNF-α будет или не будет эффективным (например, принесет ощутимую пользу) для субъекта. В частности, такая способность оценить вероятность того, что лечение будет или не будет эффективным, как правило, применяется после того, как лечение началось и показатель эффективности (например, показатель ощутимой пользы) наблюдался у субъекта. Особенно предпочтительными ингибиторами TNF-α являются биологические препараты, одобренные FDA для применения на людях при лечении вызванных TNF-α заболеваний, таких, например, как ревматоидный артрит или воспалительный колит (IBD), и к таким препаратам относятся адалимумаб (HUMIRA™), инфликсимаб (REMICADE™), этанерсепт (ENBREL™) и цертолизумаб-пегол (CIMZIA®, UCB, Inc.).

Термин "эксклюзионная хроматография" (SEC) служит для обозначения метода хроматографии, при котором молекулы в растворе разделяются на основе их размера и/или гидродинамического объема. Он применяется к большим молекулам или макро-молекулярным комплексам типа белков и их конъюгатов. Как правило, если для пропускания образца через колонку используется водный раствор, то метод называется гель-фильтрационная хроматография.

Термины "комплекс", "иммунокомплекс", "конъюгат" и "иммуноконъюгат" охватывают, без ограничения, TNF-α, связанный (например, нековалентно) с препаратом против TNF-α, препарат против TNF-α, связанный (например, нековалентно) с аутоантителом к препарату против TNF-α, и препарат против TNF-α, связанный (например, нековалентно) и с TNF-α, и с аутоантителом к препарату против TNF-α.

В настоящем изобретении то, что определяется термином "меченые", включает любые частицы, молекулы, белки, ферменты, антитела, фрагменты антител, цитокины и им подобные, конъюгированные с другой молекулой или химической частицей, которая поддается детектированию. Химические вещества, пригодные в качестве метки для меченых частиц, включают, без ограничения, флуоресцентные красители, например, красители Alexa Fluor® типа Alexa Fluor® 647, квантовые точки, оптические красители, люминесцентные красители и радионуклиды, например, I.

Термин "эффективное количество" включает дозу лекарства, способную оказать терапевтический эффект у нуждающегося в этом субъекта, а также биодоступное количество субстанции. Термин "биодоступный" означает ту долю введенной дозы лекарства, которая доступна для терапевтической активности. Например, эффективным количеством препарата, применимого для лечения тех заболеваний, в патофизиологию которых вовлечен TNF-α, например, без ограничения, шока, сепсиса, инфекций, ауто-иммунных заболеваний, RA, болезни Крона, отторжения трансплантатов и реакции "трансплантат против хозяина", может быть такое количество, которое способно предотвращать или ослаблять один или несколько симптомов, связанных с ними.

Выражение "площадь под кривой" является математическим термином, который применяется для описания интегрирования части двухмерного графика. Например, на графике интенсивности сигнала в зависимости от времени выхода из колонки при эксклюзионной хроматографии различные пики на графике соответствуют определенным молекулам. Интегрирование этих пиков охватывает площадь, ограниченную минимальным значением на оси у, например, основанием двухмерного графика, и самим двухмерным графиком. Интегрирование пика равным образом описывается вычислительной формулой: площадь под кривой $= \int_{a}^{b} f (x) d x$ , где f(x) - функция, описывающая двухмерный график, а переменные "а" и "b" означают границы интегрируемого пика на оси х.

Выражение "детектирование флуоресцентной метки" включает средство детектирования флуоресцентной метки. Средства детектирования включают, без ограничения, спектрометры, флуориметры, фотометры, детектирующие устройства, обычно встроенные в прибор для хроматографии, в том числе эксклюзионной или высокоэффективной жидкостной хроматографии, к примеру, установку Agilent-1200 HPLC System.

Скобки "[]" указывают на то, что выражение в скобках относится к концентрации.

Выражение "оптимизация терапии" включает оптимизацию дозы (например, эффективного количества или уровня) и/или типа индивидуальной терапии. Например, оптимизация дозы препарата против TNF-α включает увеличение или уменьшение количества препарата против TNF-α, впоследствии вводимого пациенту. В некоторых случаях оптимизация типа препарата против TNF-α включает замену одного вводимого препарата против TNF-α на другой препарат (например, другой препарат против TNF-α).

В некоторых других случаях оптимизация терапии включает совместное введение дозы препарата против TNF-α (например, в большей, меньшей или той же самой дозе, что и предыдущая доза) в комбинации с иммуносупрессорным препаратом.

Термин "совместное введение" означает введение более чем одного активного агента с тем, что продолжительность физиологического эффекта одного активного агента накладывается на физиологический эффект второго активного агента.

Термин "субъект", "пациент" или "индивид" обычно относится к людям, но также и к другим животным, включая, например, других приматов, грызунов, собак, кошек, лошадей, овец, свиней и др.

Термин "курс лечения" включает любые терапевтические подходы, предпринимаемые для ослабления или предотвращения одного или нескольких симптомов, связанных с вызванным TNF-α заболеванием. Термин охватывает назначение любого соединения, препарата, процедуры и/или режима, полезных для улучшения здоровья индивида с вызванным TNF-α заболеванием, и включает любые описанные здесь терапевтические средства. Специалистам должно быть известно, что можно изменить сам курс лечения или дозу при текущем курсе лечения (например, увеличить или уменьшить), исходя из присутствия или уровня концентрации препарата против TNF-α и/или аутоантител к препарату против TNF-α.

Термин "иммунодепрессивный препарат" или "иммунодепрессивное средство" охватывает любые субстанции, способные давать иммунодепрессивный эффект, например, предотвращение или уменьшение иммунного ответа, как-то при облучении или введении таких лекарств, как антиметаболиты, антилимфоцитарная сыворотка, антитела и т.д. Примеры подходящих иммунодепрессивных препаратов включают, без ограничения, тиопуриновые препараты типа азатиоприна (AZA) и его метаболитов, антиметаболиты типа метотрексата (МТХ); сиролимус (рапамицин); темсиролимус; эверолимус; такролимус (FK-506); FK-778; антилимфоцитарные глобулиновые антитела, антитимо-цитарные глобулиновые антитела, антитела против CD3, антитела против CD4 и конъюгаты типа антитело-токсин; циклоспорин; микофенолат; мизорибин монофосфат; скопарон; глатирамер ацетат; их метаболиты; их фармацевтически приемлемые соли; их производные; их пролекарственные формы; и их комбинации.

Термин "тиопуриновый препарат" охватывает азатиоприн (AZA), 6-меркаптопурин (6-МР) и любые их метаболиты, обладающие терапевтической эффективностью, в том числе 6-тиогуанин (6-TG), 6-метилмеркаптопурин-рибозид, 6-тиоинозиновые нуклеотиды (например, 6-тиоинозин монофосфат, 6-тиоинозин дифосфат, 6-тиоинозин трифосфат), 6-тиогуаниновые нуклеотиды (например, 6-тиогуанозин монофосфат, 6-тиогуанозин дифосфат, 6-тиогуанозин трифосфат), 6-тиоксантозиновые нуклеотиды (например, 6-тиоксантозин монофосфат, 6-тиоксантозин дифосфат, 6-тиоксантозин трифосфат), их производные, их аналоги и их комбинации.

Термин "образец" охватывает любые биологические образцы, взятые у субъекта. Подходящими для применения в настоящем изобретении образцами являются, без ограничения, цельная кровь, плазма, сыворотка, слюна, моча, кал, слезы и другие жидкости организма, образцы тканей (например, биоптаты) и их клеточные экстракты (например, экстракт эритроцитов). В предпочтительном воплощении образец представлен образцом сыворотки. Специалистам должно быть известно, что образцы, как-то образцы сыворотки, можно разводить перед анализом. В некоторых случаях термин "образец" включает, без ограничения, кровь, ткань организма, сыворотку крови, лимфу, ткань лимфатических узлов, ткань селезенки, костный мозг или обогащенную иммуноглобулином фракцию из одной или нескольких этих тканей. В некоторых других случаях термин "образец" включает сыворотку крови или обогащенную иммуноглобулином фракцию, полученную из сыворотки крови или самой крови. В некоторых случаях термин "образец" включает жидкость организма.

III. Описание воплощений

Стадии способов настоящего изобретения необязательно проводятся в том порядке, в котором они представлены. Рядовым специалистам должно быть понятно, что рамки настоящего изобретения охватывают и другой порядок стадий способов настоящего изобретения.

В одном воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ детектирования наличия или уровня препарата против TNF-α в образце, который включает:

(a) контактирование меченого TNFα с образцом, содержащим или предположительно содержащим препарат против TNFα, с образованием меченого комплекса с препаратом против TNFα;

(b) подвергание меченого комплекса эксклюзионной хроматографии для отделения меченого комплекса; и

В определенных случаях способы особенно применимы для следующих антител против TNFα: REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб) и CIMZIA® (цертолизумаб-пегол).

Фактор некроза опухолей альфа (TNFα) - это цитокин, участвующий в системном воспалении, который является представителем группы цитокинов, стимулирующих реакции острой фазы. Главная роль TNFα состоит в регулировании иммунных клеток. TNFα также способен индуцировать апоптотическую гибель клеток, вызывать воспаление и ингибировать онкогенез и вирусную репликацию. TNF в основном образуется в виде трансмембранного белка II типа длиной в 212 аминокислот, скомпонованного в виде стабильных гомотримеров.

Термин "TNF-α" в настоящем изобретении служит для обозначения цитокина человека, существующего в виде секретируемой формы в 17 кД и мембраносвязанной формы в 26 кД, биологически активная форма которого состоит из тримера связанных нековалентно молекул в 17 кД. Структура TNF-α описана более подробно, к примеру, в Jones et а1. (1989) Nature, 338:225-228. Термин TNF-α охватывает TNF-α человека, реком-бинантный TNF-α человека (rhTNF-α) или белок, по меньшей мере на 80% идентичный TNF-α человека. TNFα человека состоит из цитоплазматического домена из 35 аминокислот (а.к.), трансмембранного сегмента из 21 а.к. и внеклеточного домена (ECD) из 177 а.к. (Pennica D. et al. (1984) Nature 312:724). В пределах ECD аминокислотная последовательность TNFα на 97% идентична TNFα макаки резус и на 71-92% TNFα быка, собаки, хлопковой крысы, лошади, кошки, мыши, свиньи и крысы. TNFα можно получить стандартными методами рекомбинантной экспрессии или приобрести коммерческим путем (R & D Systems, кат.№210-ТА, Minneapolis, Minn.).

В некоторых воплощениях "TNF-α" является "антигеном", то есть молекулой или частью молекулы, способной связываться антителом против TNF-α. TNF-α может иметь один или более одного эпитопа. В некоторых случаях TNF-α будет реагировать, очень избирательным образом, с антителом против TNF-α. Предпочтительные антигены, с которыми связываются антитела, фрагменты и участки антител против TNF настоящего изобретения, включают по меньшей мере 5 аминокислот SEQ ID NO. 1. В некоторых случаях TNF-α имеет достаточную длину, чтобы содержать эпитоп TNF-α, способный связываться с антителами против TNF-α, их фрагментами и участками.

В некоторых воплощениях длина TNF-α, содержащего эпитоп достаточной длины для связывания с антителом против TNF-α, его фрагментами и участками, составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220 аминокислот. В одном воплощении используется TNF-α, который включает остатки 77-233 SEQ ID NO 1.

В некоторых случаях по меньшей мере одна аминокислота в растворимой части TNF-α подвергается мечению, а именно, из остатков 77-233 SEQ ID NO 1. В некоторых случаях применяется аминореактивное производное флуорофора. В большинстве случаев аминореактивная группа представлена ацетилирующим реагентом, образующим карбоксамиды, сульфонамиды или тиомочевину при реакции с аминами. Практически все белки содержат остатки лизина, а большинство содержит свободные амины на N-конце, которые могут использоваться в качестве точки для присоединения метки. В предпочтительном воплощении метится остаток 77, причем используется TNF-α, включающий остатки 77-233 SEQ ID NO 1. В других воплощениях метятся многие первичные амины, а TNF-α метится неоднократно.

В некоторых случаях часть TNF-α не подвергается мечению, а именно те части, которые распознаются антителами, их фрагментами и участками. Иными словами, некоторые части антигенов TNF-α составляют топографический или трехмерный эпитоп TNF, который распознается и/или связывается с активностью против TNF, антителами или их фрагментами и вариабельными участками. Эти части предпочтительно свободны для связывания и поэтому не подвергаются мечению. Они включат остатки 136-157 и 164-185 SEQ ID NO:1:

Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile; и

Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly.

TNFα или препарат против TNFα лекарство может быть помечен целым рядом детектируемых групп. Предпочтительно TNFα или препарат против TNFα метится флуорофором или флуоресцентным красителем. Типичными флуорофорами, пригодными для применения в настоящем изобретении, являются флуорофоры, перечисленные в каталоге Molecular Probes, включенном в виде ссылки (см. R. Haugland, The Handbook - А Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th Edition, Molecular Probes, Inc. (2005)). Такими типичными флуорофорами являются, без ограничения, красители Alexa Fluor®, как-то Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750 и/или Alexa Fluor® 790, a также и другие флуорофоры, такие, к примеру, как дансилхлорид (DNS-C1), 5-(йодацетамидо)флуоресцеин (5-IAF), флуоресцеин-5-изотиоцианат (FITC), тетраметил-родамин-5- и 6-изотиоцианат (TRITC), 6-акрилоил-2-диметиламинонафталин (акрилодан), 7-нитробензо-2-окса-1,3-диазол-4-илхлорид (NBD-C1), этидийбромид, люцифер желтый, 5-карбоксиродамин-бО гидрохлорид, лиссамин-родамин В сульфонилхлорид, Texas Red™ сульфонилхлорид, BODIPY™, нафталаминсульфоновые кислоты (например, 1-анилино- нафталин-8-сульфоновая кислота (ANS), 6-(иара-толуидинил)нафталин-2-сульфоновая кислота (TNS) и др.), антроил-жирная кислота, DPH, паринаровая кислота, TMA-DPH, флуоренил-жирная кислота, флуоресцеин-фосфатидилэтаноламин, Texas Red-фосфатидил-этаноламин, пиренил-фосфатидилхолин, флуоренил-фосфатидилхолин, мероцианин 540, 1-(3-сульфонатопропил)-4-[β-[2[(ди-н-бутиламино)-6-нафтил]винил]пиридиний бетаин (нафтилстирил), 3,3'-дипропилтиадикарбоцианин (ди-S-С₃-(5)), 4-(и-дипентил-аминостирил)-1-метилпиридиний (ди-5-ASP), Су-3-йодацетамид, Су-5-N-гидрокси-сукцинимид, Су-7-изотиоцианат, родамин 800, IR-125, тиазолоранж, азур В, нильский голубой, Al-фталоцианин, оксаксин-1,4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), Hoechst 33342, ТОТО, акридиноранж, этидий гомодимер, К-(этоксикарбонилметил)-6-метоксихинолин (MQAE), Fura-2, Calcium Green, карбокси-ЗНАРР-б, ВАРТА, кумарин, фитофлуоры, Coronene, комплексы металл-лиганд, IRDye® 700DX, IRDye® 700, IRDye 800RS, IRDye® 800CW, IRDye® 800, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY676, DY680, DY682, DY780 и их смеси. Дополнительными подходящими флуорофорами являются кофакторы ферментов, лантаниды, зеленый флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок и их мутанты и производные. В одном воплощении изобретения второй член специфической связывающей пары содержит прикрепленную к нему детектируемую группу.

Как правило, флуоресцентная группа представлена флуорофором, выбранным из категории красителей, включающих полиметины, фталоцианины, цианины, ксантины, флуорены, родамины, кумарины, флуоресцеины и BODIPY™.

В одном воплощении флуоресцентная группа представлена ближним инфракрасным (NIR) флуорофором, излучающим в диапазоне от 650 до 900 нм. Применение технологии ближней инфракрасной флуоресценции предпочтительно в биологических способах измерения, так как она в значительной степени исключает или снижает фон от аутофлуоресценции биосубстратов. Другим преимуществом технологии ближней ИК флуоресценции является то, что рассеянный свет от источника возбуждения значительно снижается, поскольку интенсивность рассеяния обратно пропорциональна четвертой степени длины волны. Низкая фоновая флуоресценция и низкое рассеивание приводят к высокому отношению сигнал-шум, что необходимо для высокочувствительного детектирования. Более того, окно оптической прозрачности в ближней ИК области (от 650 нм до 900 нм) в биологических тканях делает флуоресценцию БИК ценной технологией для методов интраскопии in vivo и субклеточного детектирования, требующих прохождения света через биологические компоненты. В некоторых аспектах этого воплощения флуоресцентная группа предпочтительно выбирается из группы, состоящей из IRDye® 700DX, IRDye® 700, IRDye® 800RS, IRDye® 800CW, IRDye® 800, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, Alexa Fluor® 790, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY676, DY680, DY682 и DY780. В некоторых воплощениях ближняя инфракрасная группа представлена IRDye® 800CW, IRDye® 800, IRDye® 700DX, IRDye® 700 или Dynomic DY676.

Флуоресцентное мечение осуществляется с помощью химически реакционного производного флуорофора. Распространенные реакционные группы включают аминоре-активные производные изотиоцианата, как-то FITC и TRITC (производные флуоресцеина и родамина), аминореактивные сукцинимидиловые эфиры, как-то NHS-флуоресцеин и реагирующие с сульфгидрилами активированные малеимидом флуорофоры типа флуоресцеин-5-малеимида, многие из которых коммерчески доступны. При реакции любого из этих реакционных красителей с TNFα или препаратом против TNFα образуется стабильная ковалентная связь между флуорофором и TNFα или препаратом против TNFα.

В некоторых случаях после реакции флуоресцентного мечения зачастую нужно удалить все непрореагировавшие флуорофоры из меченой молекулы-мишени. Часто это осуществляется методом эксклюзионной хроматографии, воспользовавшись различиями по размеру между флуорофором и меченым белком.

Реакционные флуоресцентные красители доступны из многих источников. Их можно получить с различными реакционными группами для присоединения к различным функциональным группам в молекуле мишени. Они также доступны в наборах для мечения, содержащих все компоненты для выполнения реакции введения метки. В одном предпочтительном аспекте применяется С2-малеимид Alexa Fluor 647 фирмы Invitrogen (кат.№А-20347).

Специфическое иммунологическое связывание антитела против TNFα с TNFα или антитела против препарата (ADA) с препаратом против TNFα можно детектировать прямо или косвенно. Прямые метки включают флуоресцентные или люминесцентные теги, металлы, красители, радионуклиды и др., присоединенные к антителу. В некоторых случаях для определения уровня концентрации антител против TNFα или ADA в образце, соответственно, может применяться TNFα или антитело против TNFα, меченное йодом-125 (I). В других случаях для чувствительного нерадиоактивного детектирования уровня концентрации антител против TNFα или ADA в образце, соответственно, подходит специфичный к антителам против TNFα или ADA хемилюминесцентный метод с использованием хемилюминесцентного TNFα или антитела против TNFα. В определенных случаях для определения уровня концентрации антител против TNFα или ADA в образце, соответственно, также подходит TNFα или антитело против TNFα, меченное флуоро-хромом. Примеры флуорохромов включают, без ограничения, красители Alexa Fluor, DAPI, флуоресцеин, Hoechst 33258, R-фикоцианин, B-фикоэритрин, R-фикоэритрин, родамин, техасский красный и лиссамин. Вторичные антитела, соединенные с флуоро-хромами, можно приобрести коммерческим путем, например, козий F(ab')₂ против конъюгата IgG человека с FITC фирмы Tago Immunologicals (Burlingame, CA).

Непрямые метки включают различные ферменты, хорошо известные в данной области, как-то пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза (АР), р-галактозидаза, уреаза и др. Детектирующая система с пероксидазой хрена может применяться, к примеру, с хромогенным субстратом тетраметилбензидином (ТМВ), который дает растворимый продукт в присутствии перекиси водорода, детектируемый при 450 нм. Детектирующая система со щелочной фосфатазой может применяться, к примеру, с хромогенным субстратом и-нитрофенил фосфатом, который дает растворимый продукт, хорошо детектируемый при 405 нм. Аналогичным образом детектирующая система с β-галактозидазой может применяться вместе с хромогенным субстратом о-нитрофенил-β-D-галактопиранозидом (ONPG), который дает растворимый продукт, детектируемый при 410 нм. Детектирующая система с уреазой может применяться вместе с таким субстратом, как мочевина-бромокрезол пурпурный (Sigma Immunochemicals; St. Louis, МО). Применимые вторичные антитела, соединенные с ферментом, можно приобрести из ряда коммерческих источников, например, козий F(ab')₂ против конъюгата IgG человека со щелочной фосфатазой можно приобрести у фирмы Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA).

Сигнал от прямой или непрямой метки можно анализировать, к примеру, при помощи спектрофотометра для детектирования окраски хромогенного субстрата; радиационного счетчика для детектирования радиации типа гамма-счетчика для определения ¹²⁵I; или флуориметра для детектирования флуоресценции в присутствии света определенной длины волны. Для детектирования связанных с ферментом антител можно провести количественный анализ количества антитела против TNFα или уровня ADA при помощи спектрофотометра типа ЕМАХ Microplate Reader (Molecular Devices; Menlo Park, CA) в соответствии с инструкциями производителя. При желании, способы определения по настоящему изобретению можно автоматизировать или роботизировать, при этом можно одновременно детектировать сигналы от нескольких образцов.

В некоторых воплощениях применяется эксклюзионная хроматография. Лежащий в основе SEC принцип состоит в том, что частицы различных размеров будут проходить (фильтроваться) через неподвижную фазу с различной скоростью. Это приводит к разделению раствора частиц по размеру. При условии, что все частицы наносятся одновременно или почти одновременно, частицы одного размера будут элюироваться вместе. Каждая эксклюзионная колонка имеет свой диапазон молекулярных масс, которые можно разделить. Предел исключения задает молекулярную массу на верхнем конце этого диапазона и находится там, где молекулы слишком большие и не могут застревать в неподвижной фазе. Предел проникновения задает молекулярную массу на нижнем конце диапазона разделения и находится там, где молекулы достаточно малого размера могут полностью проникать в поры неподвижной фазы, а все молекулы с меньшей молекулярной массой столь малы, что они элюируются как одна полоса.

В некоторых аспектах элюент собирают в постоянных объемах или фракциях. Чем более близки частицы по размеру, тем вероятнее они попадут в одну и ту же фракцию и не будут детектироваться по отдельности. Предпочтительно собранные фракции проверяют спектроскопическими методами для определения концентрации элюируемых частиц. Как правило, спектроскопические методы определения, применимые в настоящем изобретении, включают, без ограничения, флуориметрию, показатель преломления (RI) и ультрафиолет (UV). В некоторых случаях объем элюирования уменьшается с почти линейной зависимостью от логарифма молекулярного гидродинамического объема (т.е. более тяжелые частицы выходят первыми).

В некоторых аспектах способы применимы при детектировании количества препаратов против TNFα, таких, например, как антитела, включая REMICADE™ (инфликсимаб) - химерное mAb противТКРа, ENBREL™ (этанерцепт) - слитый белок TNFR-FcIg, HUMIRA™ (адалимумаб) - человеческое mAb против TNFα и CIMZIA® (цертолизумаб-пегол) - ПЭГилированный Fab-фрагмент.

В некоторых случаях после выявления препарата против TNFα (например, антитела против TNFα) проводится измерение препарата против TNFα по стандартной кривой.

(a) контактирование меченого препарата против TNFα с образованием меченого комплекса с аутоантителом;

(b) подвергание меченого комплекса эксклюзионной хроматографии для отделения меченого комплекса; и

В определенных случаях аутоантитела включают человеческие против химерных антител (НАСА), человеческие против гуманизированных антител (НАНА) и человеческие против антител мыши (НАМА).

(a) контактирование меченого препарата против TNFα и меченого TNFα с образцом, содержащим или предположительно содержащим аутоантитела к препарату против TNFα, с образованием первого меченого комплекса между меченым препаратом против TNFα, меченым TNFα и аутоантителом и второго меченого комплекса между меченым препаратом против TNFα и аутоантителом, причем меченый препарат против TNFα и меченый TNFα содержат разные метки;

(c) детектирование первого меченого комплекса и второго меченого комплекса, при этом детектируется не-нейтрализующая форма аутоантител, если присутствует и первый меченый комплекс, и второй меченый комплекс, и детектируется нейтрализующая форма аутоантител, если присутствует только второй меченый комплекс.

В родственном воплощении настоящим изобретением предусмотрен способ детектирования наличия или уровня аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает:

(b) подвергание первого меченого комплекса первой эксклюзионной хроматографии для отделения первого меченого комплекса;

(d) контактирование меченого TNFα с первым меченым комплексом с образованием второго меченого комплекса между меченым препаратом против TNFα и меченым TNFα, причем меченый препарат против TNFα и меченый TNFα содержат разные метки;

(e) подвергание второго меченого комплекса второй эксклюзионной хроматографии для отделения второго меченого комплекса; и

(f) детектирование второго меченого комплекса, при этом детектируется наличие или уровень нейтрализующей формы аутоантитела.

В других воплощениях описанные здесь способы определения могут применяться для предсказания реакции на ингибиторы TNFα, в особенности на антитела против TNFα, у субъекта с аутоиммунным заболеванием (например, ревматоидным артритом, болезнью Крона и т.п.). В этом способе путем определения у субъекта правильной или терапевтической дозы антитела против TNFα, например, уровня терапевтической концентрации, можно предсказать, будет ли индивид реагировать на лечение.

В следующем воплощении настоящим изобретением предусмотрены способы мониторинга аутоиммунного заболевания у субъекта с аутоиммунным заболеванием, при этом способ включает определение у субъекта правильной или терапевтической дозы антитела против TNFα, например, уровня терапевтической концентрации, в зависимости от времени. Таким образом можно предсказать, будет ли индивид реагировать на лечение в данный промежуток времени.

(a) измерение уровня препарата против TNFα в первом образце от субъекта, включающее:

(ii) детектирование первого комплекса методом эксклюзионной хроматографии, таким образом, измеряя уровень препарата против TNFα;

(b) измерение уровня аутоантител к препарату против TNFα во втором образце от субъекта, включающее:

(ii) детектирование второго комплекса методом эксклюзионной хроматографии, таким образом, измеряя уровень аутоантител;

(c) вычитание уровня аутоантител, измеренного на стадии (b), из уровня препарата против TNFα, измеренного на стадии (а), таким образом, определяя эффективное количество препарата против TNFα.

В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что детектирование на стадии (a)(ii) включает:

(1) интегрирование площади под кривой для пика меченого TNFα на первом графике интенсивности сигнала в зависимости от времени элюирования при эксклюзионной хроматографии;

(2) интегрирование площади под кривой для пика первого комплекса на первом графике;

(3) определение соотношения путем деления результата интегрирования из стадии

(2) на результат интегрирования из стадии (1); и

(4) умножение количества меченого TNFα на соотношение из стадии (3). В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что детектирование на стадии (b)(ii) включает:

(1) интегрирование площади под кривой для пика меченого препарата против TNFα на втором графике интенсивности сигнала в зависимости от времени элюирования при эксклюзионной хроматографии;

(2) интегрирование площади под кривой для пика второго комплекса на втором графике;

(3) определение соотношения путем деления результата интегрирования из стадии (2) на результат интегрирования из стадии (1); и

(4) умножение количества меченого препарата против TNFα на соотношение из стадии (3).

В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что и первый, и второй образец являются образцами сыворотки. В другом родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что и первый, и второй образец берут у субъекта во время лечения препаратом против TNFα. В следующем родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что детектирование на стадии (a)(ii) и/или стадии (b)(ii) включает детектирование флуоресцентной метки.

(b) сравнение эффективного количества препарата против TNFα с уровнем препарата против TNFα; и

(с) определение последующей дозы препарата против TNFα для субъекта, исходя из сравнения на стадии (b), таким образом, оптимизируя терапевтическое количество препарата против TNFα.

В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено повышение последующей дозы препарата против TNFα, если эффективное количество препарата против TNFα меньше, чем уровень препарата против TNFα. В родственном воплощении настоящим изобретением предусмотрено, что последующая доза препарата против TNFα повышается таким образом, чтобы эффективное количество препарата против TNFα было примерно равным уровню препарата против TNFα.

В некоторых других воплощениях настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что препарат против TNFα выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA® (пертолизумаб-пегол) и их комбинаций.

В некоторых воплощениях препаратом против TNFα является инфликсимаб (REMICADE™). В некоторых других воплощениях препаратом против TNFα является адалимумаб (HUMERA™). В других воплощениях препаратом против TNFα является этанерцепт (ENBREL™). В некоторых других воплощениях препаратом против TNFα является CIMZIA® (цертолизумаб-пегол). В других воплощениях меченый TNFα представляет собой меченый флуорофором TNFα. В некоторых других воплощениях детектируемый препарат против TNFα определяется количественно. В других воплощениях меченый комплекс элюируется первым, а за ним следует свободный меченый TNFα. В некоторых других воплощениях меченый комплекс элюируется первым, а за ним следует свободное меченое антитело против TNFα. В некоторых воплощениях эксклюзионная хроматография представлена высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографией (SE-HPLC). В некоторых других воплощениях аутоантитела выбираются из числа человеческих против антител мыши (НАМА), человеческих против химерных антител (НАСА), человеческих против гуманизированных антител (НАНА) и их комбинаций. В некоторых воплощениях детектируемые аутоантитела определяются количественно.

(a) измерение уровня препарата против TNFα в первом образце от субъекта;

(b) измерение уровня аутоантител к препарату против TNFα во втором образце от субъекта; и

(с) определение последующего курса лечения для субъекта, исходя из уровня препарата против TNFα и уровня аутоантител, таким образом, оптимизируя лечение и/или снижая токсичность препарата против TNFα.

В родственном воплощении последующий курс лечения включает введение иммунодепрессивного средства вместе с препаратом против TNFα, если уровень препарата против TNFα высокий, а уровень аутоантител - низкий. В другом родственном воплощении последующий курс лечения включает повышение уровня препарата против TNFα и совместное введение иммунодепрессивного средства, если уровень препарата против TNFα средний, а уровень аутоантител - низкий. В другом родственном воплощении последующий курс лечения включает введение другого препарата против TNFα, если уровень препарата против TNFα средний и уровень аутоантител средний. В следующем родственном воплощении последующий курс лечения включает введение другого препарата против TNFα, если уровень препарата против TNFα низкий, а уровень аутоантител - высокий. В другом родственном воплощении вместо инфликсимаба (REMICADE™) вводится адалимумаб (HUMIRA™).

В некоторых воплощениях выражение "высокий уровень препарата против TNFα" означает уровень препарата от 10 до 100 нг/10 мкл, от 10 до 70 нг/10 мкл или от 10 до 50 нг/10 мкл. В других воплощениях выражение "высокий уровень препарата против TNFα" означает уровень препарата больше, чем 10,20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нг/10 мкл.

В некоторых воплощениях выражение "средний уровень препарата против TNFα” означает уровень препарата от 5,0 до 50 нг/10 мкл, от 5,0 до 30 нг/10 мкл, от 5,0 до 20 нг/10 мкл или от 5,0 до 10 нг/10 мкл. В других воплощениях выражение "средний уровень препарата против TNFα" означает уровень препарата в 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нг/10 мкл.

В некоторых воплощениях выражение "низкий уровень препарата против TNFα" означает уровень препарата от 0 до 10 нг/10 мкл, от 0 до 8 нг/10 мкл или от 0 до 5 нг/10 мкл. В других воплощениях выражение "низкий уровень препарата против TNFα" означает уровень препарата меньше, чем 10, 9,0, 8,0, 7,0, 6,0, 5,0, 4,0, 3,0, 2,0, 1,0 или 0,5 нг/10 мкл.

Акроним "ADA" означает "антитела против препарата".

В некоторых воплощениях выражение "высокий уровень антител против препарата" означает уровень антител против препарата от 3,0 до 100 нг/10 мкл, от 3,0 до 50 нг/10 мкл, от 10 до 100 нг/10 мкл, от 10 до 50 нг/10 мкл или от 20 до 50 нг/10 мкл. В некоторых других воплощениях выражение "высокий уровень антител против препарата" означает уровень антител больше, чем 10,20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нг/10 мкл.

В некоторых воплощениях выражение "средний уровень антител против препарата" означает уровень антител против препарата от 0,5 до 20 нг/10 мкл, от 0,5 до 10 нг/10 мкл, от 2,0 до 20 нг/10 мкл, от 2,0 до 10 нг/10 мкл, от 2,0 до 5,0 нг/10 мкл или от 2,0

до 5,0 нг/10 мкл.

В некоторых воплощениях выражение "низкий уровень антител против препарата" означает уровень антител против препарата от 0,0 до 5,0 нг/10 мкл, от 0,1 до 5,0 нг/10 мкл, от 0,0 до 2,0 нг/10 мкл, от 0,1 до 2,0 нг/10 мкл или от 0,5 до 2,0 нг/10 мкл. В других воплощениях выражение "низкий уровень антител против препарата" означает уровень антител меньше, чем 5,0, 4,0, 3,0,2,0, 1,0 или 0,5 нг/10 мкл.

В некоторых воплощениях способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что препарат против TNFα измеряется способом, включающим:

(ii) детектирование первого комплекса методом эксклюзионной хроматографии, таким образом измеряя уровень препарата против TNFα.

В некоторых воплощениях способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что аутоантитела измеряется способом, включающим:

(ii) детектирование второго комплекса методом эксклюзионной хроматографии, таким образом измеряя уровень аутоантител.

В родственном воплощении способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что препарат против TNFα выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA® (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций. В родственном воплощении способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что препаратом против TNFα является инфликсимаб (REMICADE™). В некоторых других воплощениях препаратом против TNFα является адалимумаб (HUMIRA™). В некоторых других воплощениях препаратом против TNFα является этанерцепт (ENBREL™). В другом родственном воплощении способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что препаратом против TNFα является CIMZIA® (цертолизумаб-пегол). В другом родственном воплощении способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что измеряемый препарат против TNFα определяется количественно. В другом родственном воплощении способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что и первый, и второй образец представлены сывороткой. В другом родственном воплощении способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что и первый, и второй образец берут у субъекта во время лечения препаратом против TNFα. В другом родственном воплощении способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что аутоантитело выбирается из числа человеческих против антител мыши (НАМА), человеческих против химерных антител (НАСА), человеческих против гуманизированных антител (НАНА) и их комбинаций. В другом родственном воплощении способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают, что детектируемые аутоантитела определяются количественно.

В некоторых воплощениях настоящим изобретением предусмотрен способ определения наличия или уровня препарата против TNFα относительно внутреннего контроля в образце, содержащем или предположительно содержащем препарат против TNFα, который включает:

(b) детектирование меченого TNFα и меченого внутреннего контроля методом эксклюзионной хроматографии;

(g) сравнение первого соотношения, определенного на стадии (е), со вторым соотношением, определенным на стадии (f), таким образом определяется наличие или уровень препарата против TNFα относительно внутреннего контроля.

В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что первое соотношение, определенное на стадии (е), составляет от 80:1 до 100:1. В другом родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что первое соотношение, определенное на стадии (е), составляет около 100:1. В родственном воплощении настоящим изобретением также предусмотрено, что меченый внутренний контроль представлен Biocytin-Alexa 488. В некоторых воплощениях количество меченого внутреннего контроля (например, Biocytin-Alexa 488) составляет от 1 до 25 нг на 100 мкл анализируемого образца. В некоторых других воплощениях количество меченого внутреннего контроля (например, Biocytin-Alexa 488) составляет от 5 до 25 нг на 100 мкл, от 5 до 20 нг на 100 мкл, от 1 до 20 нг на 100 мкл, от 1 до 10 нг на 100 мкл или от 1 до 5 нг на 100 мкл анализируемого образца. В следующих воплощениях количество меченого внутреннего контроля (например, Biocytin-Alexa 488) составляет 1, 5,10, 15,20 или 25 нг на 100 мкл анализируемого образца.

В некоторых воплощениях настоящим изобретением предусмотрен способ оптимизации терапевтического количества препарата против TNFα у субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα, который включает: определение последующей дозы препарата против TNFα для субъекта, исходя из сравнения первого и второго соотношений в соответствии со способами настоящего изобретения, при этом оптимизируется терапевтическое количество препарата против TNFα. В родственном воплощении настоящим изобретением также предусмотрено, что способ дополнительно включает:

повышение последующей дозы препарата против TNFα, если первое соотношение составляет около 100:1, а второе соотношение меньше чем 95:1, при этом оптимизируется терапевтическое количество препарата против TNFα. В другом родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что препарат против TNFα выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA® (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций. В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что препаратом против TNFα является инфликсимаб (REMICADE™). В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что препаратом против TNFα является адалимумаб (HUMIRA™). В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что препаратом против TNFα является этанерцепт (ENBREL™). В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что препаратом против TNFα является CIMZIA® (цертолизумаб-пегол). В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что меченый TNFα представляет собой меченый флуорофором TNFα. В родственном воплощении настоящим изобретением также предусмотрено, что детектируемый препарат против TNFα определяется количественно. В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что меченый комплекс элюируется первым, а за ним следует свободный меченый TNFα. В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что образец представлен сывороткой. В родственном воплощении настоящим изобретением также предусмотрено, что образец берут у субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα. В родственном воплощении настоящим изобретением дополнительно предусмотрено, что эксклюзионная хроматография представлена высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографией (SE-HPLC).

В родственном воплощении первое соотношение, определенное на стадии (е), составляет от 80:1 до 100:1. В другом родственном воплощении первое соотношение, определенное на стадии (е), составляет около 100:1. В родственном воплощении меченый внутренний контроль представлен Biocytin-Alexa 488. В некоторых воплощениях количество меченого внутреннего контроля (например, Biocytin-Alexa 488) составляет от 50 до 200 пг на 100 мкл анализируемого образца. В некоторых других воплощениях количество меченого внутреннего контроля (например, Biocytin-Alexa 488) составляет от 100 до 200 пг на 100 мкл, от 150 до 200 пг на 100 мкл, от 50 до 150 пг на 100 мкл или от 50 до 100 пг на 100 мкл анализируемого образца. В следующих воплощениях количество меченого внутреннего контроля (например, Biocytin-Alexa 488) составляет 50, 75, 100, 125, 150,175 или 200 пг на 100 мкл анализируемого образца.

В родственном воплощении препарат против TNFα выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA® (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций. В родственном воплощении препаратом против TNFα является инфликсимаб (REMICADE™). В родственном воплощении препаратом против TNFα является адалимумаб (HUMIRA™). В родственном воплощении препаратом против TNFα является этанерцепт (ENBREL™). В родственном воплощении препаратом против TNFα является CIMZIA (цертолизумаб-пегол). В родственном воплощении детектируемый препарат против TNFα определяется количественно. В родственном воплощении меченый комплекс элюируется первым, а за ним следует свободное меченое антитело против TNFα. В родственном воплощении образец представлен сывороткой. В родственном воплощении образец берут у субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα. В родственном воплощении эксклюзионная хроматография представлена высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографией (SE-HPLC). В родственном воплощении аутоантитела выбираются из группы, состоящей из человеческих против антител мыши (НАМА), человеческих против химерных антител (НАСА), человеческих против гуманизированных антител (НАНА) и их комбинаций. В родственном воплощении детектируемые аутоантитела определяются количественно.

В родственном воплощении способы настоящего изобретения дополнительно предусматривают определение последующего курса лечения. Последующий курс лечения включает введение иммунодепрессивного средства вместе с препаратом против TNFα, если уровень препарата против TNFα высокий, а уровень аутоантител - низкий. В другом родственном воплощении последующий курс лечения включает повышение уровня препарата против TNFα и совместное введение иммунодепрессивного средства, если уровень препарата против TNFα средний, а уровень аутоантител - низкий. В другом родственном воплощении последующий курс лечения включает введение другого препарата против TNFα, если уровень препарата против TNFα средний и уровень аутоантител средний. В следующем родственном воплощении последующий курс лечения включает введение другого препарата против TNFα, если уровень препарата против TNFα низкий, а уровень аутоантител - высокий. В другом родственном воплощении вместо инфликсимаба (REMICADE™) вводится адалимумаб (HUMIRA™).

В некоторых воплощениях настоящим изобретением предусмотрен набор для измерения наличия или уровня препарата против TNFα и наличия или уровня аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает:

(a) первый измерительный субстрат, содержащий некоторое количество меченого TNFα;

(b) второй измерительный субстрат, содержащий некоторое количество меченого препарата против TNFα;

(e) необязательно средство для экстрагирования образца от субъекта; и

(f) необязательно брошюру с инструкциями по применению набора. В родственном воплощении субстрат включает какой-либо материал, на который можно наносить химикаты настоящего изобретения и который включает, без ограничения, нитроцеллюлозу, силикагель, субстраты для тонкослойной хроматографии, деревянные палочки, целлюлозу, хлопок, полиэтилен, их комбинации и др. В другом родственном воплощении химикаты настоящего изобретения могут наноситься на вышеприведенные материалы в виде упорядоченного множества или матрицы.

В родственном воплощении набор дополнительно включает средство для детектирования меченого TNFα, меченого препарата против TNFα и/или меченого внутреннего контроля. В родственном воплощении набор дополнительно включает средство для детектирования, включая, без ограничения, детектирование флуоресцентной метки, детектирование УФ излучения или обработку йодом. В родственном воплощении набор дополнительно включает прибор для эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC). В родственном воплощении первый, второй, третий и четвертый измерительный субстрат выбираются из нитроцеллюлозы, силикагеля и среды для эксклюзионной хроматографии. В родственном воплощении препарат против TNFα выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA® (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций. В родственном воплощении меченый TNFα представляет собой меченый флуорофором TNFα. В родственном воплощении образец представлен сывороткой. В родственном воплощении образец берут у субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα. В родственном воплощении аутоантитела выбираются из группы, состоящей из человеческих против антител мыши (НАМА), человеческих против химерных антител (НАСА), человеческих против гуманизированных антител (НАНА) и их комбинаций.

IV. Физиологические диапазоны и уровни препаратов, относящихся к настоящему изобретению

Терапевтически эффективный уровень REMICADE™ у пациентов, получающих REMICADE™, находится в пределах от 1 до 10 мг REMICADE™ на кг веса тела пациента. В некоторых воплощениях терапевтически эффективный уровень REMICADE™ находится в пределах от 3 до 8 мг REMICADE™ на кг веса тела пациента. В некоторых воплощениях терапевтически эффективный уровень REMICADE™ составляет около 5 мг REMICADE™ на кг веса тела пациента.

Типичная доза REMICADE™ (инфликсимаб) находится в пределах от 0,05 мкг до 80 мкг на мл. В некоторых воплощениях доза REMICADE™ находится в пределах от 0,05 мкг до 50 мкг на мл. В некоторых других воплощениях доза REMICADE™ составляет от 0,05 мкг до 30 мкг на мл. В некоторых воплощениях доза REMICADE™ составляет около 30 мкг на мл. В некоторых других воплощениях доза REMICADE™ составляет около 50 мкг на мл.

Терапевтически эффективный уровень HUMIRA™ у пациентов, получающих HUMIRA™, находится в пределах от 0,1 до 10 мг HUMIRA™ на кг веса тела пациента. В некоторых воплощениях терапевтически эффективный уровень HUMIRA™ находится в пределах от 0,1 до 8 мг HUMIRA™ на кг веса тела пациента. В некоторых других воплощениях терапевтически эффективный уровень HUMIRA™ составляет около 1 мг HUMIRA™ на кг веса тела пациента. В некоторых воплощениях терапевтически эффективный уровень HUMIRA™ составляет около 0,8 мг HUMIRA™ на кг веса тела пациента.

Типичная доза HUMIRA™ находится в пределах от 0,05 мкг до 150 мкг на мл. В некоторых воплощениях доза HUMIRA™ находится в пределах от 0,05 мкг до 100 мкг на мл. В некоторых других воплощениях доза HUMIRA™ составляет от 0,05 мкг до 50 мкг на мл. В некоторых воплощениях доза HUMIRA™ составляет около 30 мкг на мл. В некоторых воплощениях доза HUMIRA™ составляет около 32 мкг на мл. В некоторых других воплощениях доза HUMIRA™ составляет около 50 мкг на мл.

V. Типичные заболевания и терапевтические антитела для их лечения В некоторых воплощениях настоящего изобретения могут применяться терапевтические моноклональные антитела. В табл.1 представлен типичный список терапевтических моноклональных антител, которые либо уже утверждены, либо находятся в разработке. Исчерпывающий список лекарств на основе моноклональных антител, находящихся на клинических испытаниях, и утвержденных препаратов, приведен в Отчете PhRMA за 2006 г., озаглавленном '418 Biotechnology Medicines in Testing Promise to Bolster the Arsenal Against Disease'.

Особенно предпочтительными терапевтическими антителами являются, без ограничения, моноклональные антитела против TNFα, такие, например, как (1) Remicade™ (инфликсимаб) - химерное моноклональное антитело мыши-человека против TNFα типа IgGl-каппа, (2) Enbrel™ (этанерцепт) - слитый белок рецептора-2 TNF человека и IgGI человека и (3) Humira™ (адалимумаб) - полностью человеческое моноклональное антитело против TNFα типа IgGl-каппа. Еще две конструкции антител против TNFα оказались перспективными в клинических испытаниях фазы III на пациентах с такими же заболеваниями: (4) Cimzia™ CDP870 (цертолизумаб-пегол) -ПЭГилированный Fab-фрагмент гуманизированного моноклонального антитела против TNFα и (5) CNTO 148 (голимлумаб) - полностью человеческое моноклональное антитело против TNFα типа IgGl-каппа.

Предпочтительным классом терапевтических антител являются одноцепочечные моноклональные антитела против TNFα, применяемые при лечении разнообразных аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, подростковый идиопатический артрит, анкилозирующий спондилит (болезнь Бехтерева), воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона и язвенный колит), тяжелый псориаз, хронический увеит, тяжелый саркоидоз и грануломатоз Вегенера.

Наряду с применимостью при определении биодоступности/концентрации антител против TNFα, настоящее изобретение также подходит для применения при определении биодоступности/концентрации любых применяемых терапевтических антител внутри организма, например, для терапевтических или диагностических целей. В приведенной ниже табл.1 также представлен список медицинских показателей, коррелирующих с различными терапевтическими моноклональными антителами, применяемыми in vivo.

В других воплощениях способы настоящего изобретения подходят для применения при определении наличия или уровня концентрации аутоантител к терапевтическим антителам.

Таким образом, настоящее изобретение может применяться в способах оптимизации терапии, если лечение (или диагностика) включает введение субъекту терапевтических антител. Способы могут применяться для оптимизации лечения (или диагностики) одного или нескольких приведенных здесь заболеваний, включая одно или несколько из следующих:

инфекционные заболевания, как-то респираторно-синцитиальный вирус (RSV), HIV, сибирская язва, кандидоз, стафилококковые инфекции, гепатит С;

аутоиммунные заболевания, как-то ревматоидный артрит, болезнь Крона, В-клеточная неходжкинская лимфома, рассеянный склероз, SLE, анкилозирующий спондилит, волчанка, псориатический артрит, эритема;

воспалительные заболевания, как-то ревматоидный артрит (RA), подростковый идиопатический артрит, анкилозирующий спондилит (болезнь Бехтерева), воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона и язвенный колит), тяжелый псориаз, хронический увеит, саркоидоз, грануломатоз Вегенера и другие заболевания с воспалением в качестве главного признака;

заболевания крови, как-то сепсис, септический шок, пароксизмальная ночная гемоглобинурия и гемолитический уремический синдром;

рак, как-то колоректальный рак, неходжкинская лимфома, В-клеточная хроническая лимфоцитарная лейкемия, анапластическая крупноклеточная лимфома, плоскоклеточный рак головы и шеи, суперэкспрессирующий HER2 метастатический рак молочной железы, острая миелоидная лейкемия, рак простаты (например, аденокарцинома), мелкоклеточный рак легких, рак щитовидной железы, злокачественная меланома, твердые опухоли, рак молочной железы, ранняя стадия НЕК2-положительного рака молочной железы, неплоскоклеточный рак легких (NSCLC), AML, волосковоклеточная лейкемия, нейробластома, рак почек, рак мозга, миелома, множественная миелома, метастазы в костях, рак поджелудочной железы, SCLC, NSCLC, рак головы и шеи, гематологические и твердые опухоли, запущенные твердые опухоли, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, кожная Т-клеточная лимфома, некожная Т-клеточная лимфома, CLL, рак яичников, простаты, почечноклеточный рак, опухоли, экспрессирующие мезотелин, глиобластома, метастатический рак поджелудочной железы, гематологические злокачественности, кожная анапластическая крупноклеточная лимфома, AML, миелодиспластические синдромы;

сердечно-сосудистые заболевания, как-то атеросклероз, острый инфаркт миокарда, сердечно-легочный шунт, стенокардия;

метаболические заболевания, как-то диабет типа сахарного диабета I типа;

заболевания пищеварительной системы, как-то болезнь Крона, болезнь С.difficile, язвенный колит;

глазные заболевания, как-то увеит;

генетические заболевания, как-то пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH);

неврологические заболевания, как-то боли при остеоартрите и болезнь Альцгеймера;

заболевания дыхательных путей, как-то респираторные заболевания, астма,

хронические застойные легочные заболевания (COPD), носовой полипоз, педиатрическая астма;

кожные заболевания, как-то псориаз, в том числе хронический умеренный и тяжелый чешуйчатый псориаз;

отторжение трансплантатов, как-то острое отторжение почечных трансплантатов,

против отторжения трансплантатов сердца и печени, профилактика отторжения почечных трансплантатов, профилактика острого отторжения почечных трансплантатов;

другие заболевания, как-то диагностика аппендицита, воспаление почек, постклимактерический остеопороз (поражение костей), гиперэозинофильный синдром, эозинофильный эзофагит и аллергия на арахис.

В одном воплощении заболевание выбирается из одной или нескольких вышеприведенных групп конкретных заболеваний.

Таблица 1.
Терапевтические и диагностические моноклональные антитела
Название препарата	Фирма	Назначение/показание
Инфекционные заболевания
Synagis® (паливизумаб)	Medlmmune	профилактика респира-торно-синцитиального вируса (RSV)
МАЬ против HIV-1	Polymun Scientific Vienna, Austria	лечение ВИЧ-инфекции
MAb CCR5	Human Genome Sciences Rockville, MD	ВИЧ-инфекция
Cytolin® (mAb против CD8)	CytoDyn Santa Fe, NM	ВИЧ-инфекция
NM01	SRD Pharmaceuticals Los Angeles, CA	ВИЧ-инфекция
PRO 140	Progenies Pharmaceuticals Tarrytown, NY	ВИЧ-инфекция
TNX	Tanox MAb	ВИЧ-инфекция II фазы
ABthrax™ (раксибакумаб)	Human Genome Sciences	сибирская язва
Anthim™ (ETI-204) (орфанный препарат)	Elusys Therapeutics	сибирская язва
MAb против hsp90	NeuTec Pharma	Кандидоз
MAb против staph	Medlmmune	профилактика стафилококковых инфекций
Aurexis (тефибазумаб)	Inhibitex	профилактика и лечение бактеремии S. aureus
Бавитуксимаб	Peregrine Pharmaceuticals	лечение гепатита С
MDX-1303	Medarex PharmAthene	сибирская язва
Название препарата	Фирма	Назначение/показание
Numax™ (мотавизумаб)	Medlmmune	RSV
Tarvacin™ (бавитуксимаб)	Peregrine Pharmaceuticals	гепатит С
XTL 6865	XTL Biopharmaceuticals	гепатит С
Аутоиммунные заболевания
Humira® (адалимумаб)	Abbott Laboratories	ревматоидныи артрит
Remicade™(инфликсимаб)	Centocor	болезнь Крона, ревматоидныи артрит
Rituxan® (ритиксимаб)	Genentech Biogen Idee	В-клеточная неходжкин-ская лимфома, рецидивы после лечения ритуксаном; ревматоидныи артрит
Tysarbi® (натализумаб)	Biogen Idee	множественный склероз
ART 874	Abbott Laboratories	множественный склероз
Actemra	Roche	ревматоидныи артрит
AME527	Applied Molecular	ревматоидныи артрит
AMG108	Amgen	ревматоидныи артрит
AMG714	Amgen	ревматоидныи артрит
MAb против CD 16	MacroGenics	иммунологическая тромбоцитопения
CNTO 1275	Centocor Horham, PA	множественный склероз
Даклизумаб (mAb против CD25)	PDL BioPharma Fremont, CA; Biogen Idee Cambridge, MA	множественный склероз (также см. респираторные)
AMG162 (деносумаб)	Amgen Thousand Oaks, CA	ревматоидныи артрит
ETI-201	Elusys Therapeutics Pine Brook, NJ	SLE
Голимумаб	Centocor Horsham, PA	ревматоидныи артрит
HuMax-CD20 (офатумумаб)	Genmab Princeton, NJ	ревматоидныи артрит
Humira® (адалимумаб)	Abbott Laboratories	анкилозирующий спондилит; детский ревматоидныи артрит
HuZAF™ (фонтолизумаб)	PDL BioPharma Fremont, CA; Biogen Idee Cambridge, MA	ревматоидныи артрит
IMMU-106 (hCD20)	Immunomedics Morris Plains, NJ	аутоиммунные заболевания
LymphoStat-B™ (белимумаб)	Human Genome Sciences Rockville, MD	ревматоидныи артрит, SLE

Название препарата	Фирма	Назначение/показание
MEDI-545 (MDX-1103)	Medarex Princeton, NJ; Medlmmune Gaithersburg, MD	Волчанка
MLN 1202	Millennium Pharmaceuticals Cambridge, MA	множественный склероз
R1594 (окрелизумаб) (2-й против CD20)	Genentech South San Francisco, CA; Biogen Idee Cambridge, MA; Roche Nutley, NJ	ревматоидныи артрит
ОКТ3-gamma-l	Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development Raritan, NJ	псориатическии артрит
Rituxan® (ритуксимаб)	Genentech South San Francisco, CA; Biogen Idee Cambridge, MA	ревматоидныи артрит (неподдающийся лечению DMARD), волчанка, первичный прогрессирующий множественный склероз, SLE (также см. рак), ремиттирующий множественный склероз
TRX1 (анти-С04)	TolerRx Cambridge, MA	кожная красная волчанка
Заболевания крови
ReoPro®	Centocor	против тромбоцитов: предотвращает тромбы
Абциксимаб	Eli Lilly	(РТСА), стенокардия (РТСА)
Уртоксазумаб	Teijin Pharma	гемолитическая уремия
Афелимомаб	Abbot Laboratories	сепсис, септический шок
Экулизумаб	Alexion Pharmaceuticals	пароксизмальная ночная гемоглобинурия
Раковые заболевания
Avastin™ (бевацизумаб)	Genentech	метастатический колоректальный рак
Веххаг® (тоситумомаб, ¹³¹I-тоситумомаб)	GlaxoSmithKline	неходжкинская лимфома
Campath® (алемтузумаб)	Berlex Laboratories Genzyme	В-клеточная хроническая лимфоцитарная лейкемия
Erbitux™ (цетуксимаб)	Bristol-Myers Squibb Medarex	колоректальный рак, плоскоклеточный рак головы и шеи
Herceptm® (трастузумаб)	Genentech	лечение суперэкспрес-сирующего HER2 метастатического рака молочной железы

Название препарата	Фирма	Назначение/показание
Mylotarg™ (гемтузумаб, озогамицин)	Wyeth	острая миелоидная лейкемия
OncoScint® CR/OV (сатумомаб, пендетид)	CYTOGEN	Выявление, определение стадии и мониторинг колоректального рака
ProstaScint® (капромаб, пентетат)®	CYTOGEN	выявление и мониторинг аденокарциномы простаты
Rituxan (ритиксимаб)	Genentech Biogen Idee	В-клеточная неходжкин-ская лимфома, рецидивы после лечения ритуксаном
Verluma® (нолетумомаб)	DuPont Pharmaceuticals	выявление мелкоклеточного рака легких
Zevalin™ (ибритумомаб, тиуксетан)	IDFC Pharmaceuticals	неходжкинская лимфома
1311huA33	Life Science Pharmaceuticals Greenwich, CT	колоректальный рак
1D09C3	GPC Biotech Waltham, MA	рефрактерная В-клеточная лимфома
AGS PSCA MAb	Agensys, Santa Monica, CA; Merck, Whitehouse Station, NJ	рак простаты
AMG102	Amgen, Thousand Oaks, CA	Рак
AMG479	Amgen, Thousand Oaks, CA	Рак
AMG623	Amgen Thousand Oaks, CA	В-клеточная хроническая лимфоцитарная лейкемия (CLL) (также см. аутоиммунные)
AMG655	Amgen, Thousand Oaks, CA	Рак
AMG706	Amgen Thousand Oaks, CA	устойчивый к иматинибу GIST, запущенный рак щитовидной железы
AMG706	Amgen Thousand Oaks, CA	устойчивый к иматинибу GIST, запущенный рак щитовидной железы
MAb анти-СВ23	Biogen Idee Cambridge, MA	CLL
MAb анти-С080	Biogen Idee Cambridge, MA	неходжкинская В-клеточная лимфома
антиидиотипическая противораковая вакцина	Viventia Biotech Toronto, Ontario	злокачественная меланома
MAb против лимфотоксина бета-рецепторов	Biogen Idee Cambridge, MA	твердые опухоли
MAb против РЕМ	Somanta Pharmaceuticals Irvine, CA	Рак
против иммунотоксина Tac(Fv)-PE38	National Cancer Institute Bethesda, MD	лейкемия, лимфома

Название препарата	Фирма	Назначение/показание
Avastin® (бевацизумаб)	Genentech South San Francisco, CA	рецидивы метастатического колоректального рака, первичный рак молочной железы, неплоскоклеточный рак легких (NSCLC)
AVE 9633 (нагруженное майтансином mAb против CD33)	Sanofi Aventis Bridgewater, NJ	AML
Бавитуксимаб	Peregrine Pharmaceuticals Tustin, CA	твердые опухоли (также см. инфекционные)
CAT 3888	Cambridge Antibody Technology	волосатоклеточная лейкемия
Химерные mAb	National Cancer Institute	нейробластома
CNTO 328	Centocor	рак почек
Cotara™	Peregrine Pharmaceuticals	рак мозга
Биватузумаб	Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Ridgefield, CT	Рак
CP-751,871 CS 1008	Pfizer Daiichi Sankyo Pharma Development Parsippany, NJ	множественная миелома
BrevaRex™ иммунотерапия на основе антител	ViRexx Edmonton, Alberta	рак молочной железы, множественная миелома
Деносумаб	Amgen	остеопороз при гормональной абляционной терапии рака молочной железы или простаты, увеличение срока жизни без костных метастазов (также см. аутоиммунные, другие)
Экромексимаб	Kyowa Hakko USA	злокачественная меланома
EMD 273063	EMD Lexigen	твердые опухоли, злокачественная меланома, нейробластома, SCLC
Эрбитукс™	Bristol Myers Squibb	рак головы/шеи, поджелудочной железы, NSCLC, колоректальный рак
GMK	Progenies Pharmaceuticals	профилактика рецидива после хирургического удаления первичной меланомы у пациентов с высоким риском
Campath® (алемтузумаб)	National Cancer Institute Bethesda, MD; Berlex Laboratories Montville, NJ	лейкемия, лимфома

Название препарата	Фирма	Назначение/показание
Herceptin® (трастузумаб)	Genentech South San Francisco, CA	ранняя стадия HER2-положительного рака молочной железы, метастатический HER2-положительный рак молочной железы - в комбинации с Taxotere®
HGS-ETR1	Human Genome Sciences Rockville, MD	гематологические и твердые опухоли
HGS ETR2 (мапатумумаб)	Human Genome Sciences Rockville, MD	гематологические и твердые опухоли
HGS-TR2J	Human Genome Sciences Rockville, MD	запущенные твердые опухоли
HuC242-DM4	ImmunoGen Cambridge, MA	колоректальный рак, желудочно-кишечный рак, NSCLC, рак поджелудочной железы
HuMax-CD4 (занолимумаб)	Genmab Princeton, NJ; Serono Rockland, MA	кожная Т-клеточная лимфома, некожная Т-клеточная лимфома
HuMax CD20 (офатумумаб)	Genmab Princeton, NJ	CLL, неходжкинская лимфома (также см. аутоиммунные)
HuMax-EGFr	Genmab Princeton, NJ	рак головы и шеи
huN901-DMl	ImmunoGen Cambridge, MA	SCLC, множественная миелома
MDX (ипилимумаб)	Bristol-Myers Squibb Medarex, Princeton	монотерапия меланомы, лейкемия, лимфома, рак яичников, простаты, почечно-клеточный рак, меланома (МСХ-010+/-DTIC), второй ряд при метастатической меланоме (MDX-010 disomotide/ overmotide MDX-13 79)
КонъюгатМ195-висмут213	Actinium Pharmaceuticals Florham Park, NJ	AML
M200 (волоциксимаб)	PDL BioPharma, Fremont, CA Biogen Idee, Cambridge, MA	запущенные твердые опухоли
MAbHeFi-1	National Cancer Institute Bethesda, MD	лимфома, неходжкинская лимфома
MDX-060 (иратумумаб)	Medarex Princeton, NJ	Болезнь Ходжкина, анапластическая крупноклеточная лимфома
MDX-070	Medarex, Princeton, NJ	рак простаты
MDX-214	Medarex, Princeton, NJ	ECFR-экспрессирующие виды рака

Название препарата	Фирма	Назначение/показание
MEDI-507 сиплизумаб MEDI-522	Medlmmune Gaithersburg, MD; National Cancer Institute Bethesda, MD; Medlmmune Gaithersburg, MD	Т-клеточная лимфома, меланома, рак простаты, твердые опухоли
MORAb 003	Morphotek Exton, PA	рак яичников
MORAb 009	Morphotek Exton, PA	мезотелин-экспрессирующие опухоли
Нейрадиаб	Bradmer Pharmaceuticals Louisville, KY	глиобластома
Нимотузумаб (орфанный препарат) Окрелизумаб (2-й анти-СВ20) (R1594)	YM Biosciences Mississauga, Ontario; Genentech South San Francisco, CA; Biogen Idee, Cambridge, MA; Roche, Nutley, NJ	метастатический рак поджелудочной железы, NSCLC, гематологические злокачественности (также см. аутоиммунные)
Omnitarg™ (пертузумаб)	Genentech South San Francisco, CA	рак яичников
OvaRex® (ореговомаб)	ViRexx MAb Edmonton, Alberta	рак яичников
РАМ 4	Merck Whitehouse Station, NJ	рак поджелудочной железы
Панитумумаб (rIIuMAb EGFr)	Abgenix	колоректальный рак
Proleukin® PSMA	Chiron, Emeryville, CA; Progenies Pharmaceuticals Tarrytown, NY	неходжкинская лимфома, рак простаты
R1550RadioTheraCIM	Roche, Nutley, NJ YM BioSciences Mississauga, Ontario	метастатический рак молочной железы глиома
RAV12	Raven Biotechnologies South San Francisco, CA	Рак
Renearex® G250	Wilex Miulich, Germany	рак почек
Rituxan® (ритуксимаб)	Genentech South San Francisco, CA Biogen Idee Cambridge, MA	вводное лечение хронической неходж-кинской лимфомы (также см. аутоиммунные) рефракторная CLL
SGN30 (орфанный препарат)	Seattle Genetics Bothell, WA	кожная анапластическая крупноклеточная лимфома, системная анапластическая крупноклеточная лимфома, болезнь Ходжкина
SGN-33 (линтузумаб) SGN-40	Seattle Genetics Bothell, WA	AML, миелодисплас-тические синдромы, CLL, множественная миелома, неходжкинская лимфома

Название препарата	Фирма	Назначение/показание
Сибротуртунаб	Life Science Pharmaceuticals Greenwich, CT	колоректальный рак, рак головы и шеи, рак легких
Tarvacin™ (бавитуксимаб)	Peregrine Pharmaceuticals Tustin, CA	твердые опухоли (также см. инфекционные)
Тицилимумаб	Pfizer New York, NY	метастатическая меланома, рак простаты
TNX-650 Zevalin™ ибритумомаб. тиуксетан	Tanox, Houston, TX National Cancer Institute Bethesda, MD Biogen	болезнь Ходжкина, лейкемия, лимфома, неходжкинская лимфома
Сердечно-сосудистые заболевания
MLN 1202	Millennium Pharmaceuticals Cambridge, MA	атеросклероз (также см. аутоиммунные)
Пекселизумаб	Alexion Pharmaceuticals Cheshire, CT; Procter & Gamble Pharmaceuticals, Mason, OH	острый инфаркт миокарда, сердечно-легочный шунт
Диабет и родственные ему заболевания
МАЬ анти-СВЗ	MacroGenics, Rockville, MD	сахарный диабет 1-го типа
ОКТ3-гамма-1	Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development	сахарный диабет 1-го типа
TRX4 (анти-СВЗ)	TolerRx Cambridge, MA	сахарный диабет 1-го типа
Заболевания пищеварительной системы
Remicade™ (инфликсимаб)	Centocor	болезнь Крона
АВТ874	Abbott Laboratories Abbott Park, IL	болезнь Крона (также см. аутоиммунные)
CNTO 1275	Centocor Horsham, PA	болезнь Крона, фаза II (также см. аутоиммунные, кожные)
Humira® (адалимумаб) MDX-066 (CDA-1)	Abbott Laboratories Abbott Park, IL; Medarex Princeton, NJ	болезнь Крона, фаза III (также см. аутоиммунные, кожные) болезнь С.difficile
MDX-1100	Millennium Pharmaceuticals Cambridge, MA	язвенный колит
Nuvion® (висилизумаб)	PDT BioPharma Fremont, CA	рефракторный к стероидам язвенный колит, болезнь Крона
Tysarbi® (натализумаб)	Biogen Idee Cambridge, MA	болезнь Крона
Глазные заболевания
Голимумаб	Centocor Horsham, PA	увеит (также см. аутоиммунные)
Генетические заболевания

Название препарата	Фирма	Назначение/показание
Soliris™ (экулизумаб) (орфанный препарат)	Alexion Pharmaceuticals Cheshire, CT	пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH)
Неврологические заболевания
RN624	Rinat Neuroscience South San Francisco, CA	боли при остеоартрите
RN1219	Rinat Neuroscience South San Francisco, CA	болезнь Альцгеймера
Респираторные заболевания
ABN912	Novartis Pharmaceuticals East Hanover, NJ	астма, хронические застойные легочные заболевания (COPD)
ABX-IL8	Amgen Thousand Oaks, CA	COPD
AMG317	Amgen Thousand Oaks, CA	Астма
Даклизумаб (mAb анти-СБ25)	Protein Design Labs Fremont, CA; Roche, Nutley, NJ	астма (также см. аутоиммунные)
MEDI-528 (mAb анти-ТЬ-9)	Medlmmune Gaithersburg, MD	Астма
Меполизумаб (mAb анти-ТЬ5)	G 1 axoSmithKline Philadelphia, PA Rsch. Triangle Park, NC	астма и носовой полипоз (также см. другие)
TNX-832	Tanox Houston, TX	респираторные заболевания
Xolair® омализумаб	Genentech South San Francisco, CA; Novartis Pharmaceuticals	педиатрическая астма (также см. другие)
Кожные заболевания
Raptiva® эфализумаб CNT01275	Genentech XOMA Centocor	хронический умеренный и тяжелый чешуйчатый псориаз псориаз (также см. аутоиммунные, пищеварительные)
Humira® (адалимумаб)	Abbott Laboratories	псориаз (также см. аутоиммунные, пищеварительные)
TRX4	TolerRx	псориаз (также см. диабет)
Трансплантация
Orthoclone OKT® 3 (муромонаб-СОЗ)	Ortho Biotech	острое отторжение почечных трансплантатов, против отторжения трансплантатов сердца и печени
Simulect® басиликсимаб	Novartis Pharmaceuticals	профилактика отторжения почечных трансплантатов

Название препарата	Фирма	Назначение/показание
Zenapax® даклизумаб ОКТЗ -гамма-1	Roche Protein Design Labs Johnson & Johnson	профилактика острого отторжения почечных трансплантатов, против отторжения почечных трансплантатов (также см. аутоиммунные, диабет)
Другие
NeutroSpec™ технеций 99 т фанолесомаб	Palatin Technologies	диагностика аппендицита
CR 0002	CuraGen	воспаление почек
Деносумаб (AMG 162)	Amgen	постклимактерический остеопороз (также см. аутоиммунные и раковые)
Меполизумаб (тАЬ анти-1b5)	GlaxoSmithKline	гиперэозинофильный синдром, эозинофильный эзофагит (также см. респираторные)
Xolair® (омализумаб)	Genentech Tanox	аллергия на арахис (также см. респираторные)

VI. Лечение и терапевтический мониторинг

После постановки диагноза или прогноза для субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα, или предсказания вероятной реакции на препарат против TNFα у индивида с диагнозом заболевания, в патофизиологии которого играет роль TNFα, в том числе шока, сепсиса, инфекций, аутоиммунных заболеваний, RA, болезни Крона, отторжения трансплантата и реакции "трансплантат против хозяина", в соответствии с описанными здесь способами, настоящее изобретение может дополнительно включать рекомендацию курса лечения на основании диагноза, прогноза или предсказания. В некоторых случаях настоящее изобретение может также включать назначение индивиду терапевтически эффективного количества препарата против TNFα, применимого для лечения одного или нескольких симптомов, связанных с тем заболеванием, в патофизиологии которого играет роль TNFα. Для лечебного применения препарат против TNFα может вводиться сам по себе или в комбинации с одним или несколькими другими препаратами против TNFα и/или одним или несколькими препаратами, уменьшающими побочные эффекты, связанные с препаратом против TNFα (например, иммунодепрессивными средствами). Примеры препаратов против TNFα уже описаны здесь и включают, без ограничения, REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA® (цертолизумаб-пегол), биологические препараты, традиционные лекарства и их комбинации. При этом настоящее изобретение преимущественно позволяет клиницистам практиковать "индивидуализированное лечение", направляя решения по лечению и способствуя выбору и оптимизации терапии для препаратов против TNFα так, чтобы правильное лекарство досталось нужному пациенту в правильное время.

Препараты против TNFα можно вводить с подходящим фармацевтическим эксципиентом по необходимости и любым общепринятым способом введения. Так, введение может осуществляться, к примеру, внутривенно, топически, подкожно, чрескожно, трансдермально, внутримышечно, перорально, буккально, подъязычно, гингивально, интрапалатально, внутрисуставно, парентерально, внутриартериольно, интрадермально, интравентрикулярно, интракраниально, внутрибрюшинно, интралези-онально, интраназально, ректально, вагинально или путем ингаляции. "Совместное введение" означает, что препарат против TNFα вводится одновременно, непосредственно до или сразу после введения второго препарата (например, другого препарата против TNFα или препарата, применяемого для снижения побочных эффектов препарата против TNFα).

Терапевтически эффективное количество препарата против TNFα можно вводить неоднократно, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и больше раз, или же доза может вводиться непрерывным вливанием. Доза может Иметь вид твердого, полутвердого вещества, лиофилизированного порошка или в жидком виде, как-то, к примеру, таблетки, пилюли, гранулы, капсулы, порошки, растворы, суспензии, эмульсии, свечи, удержи-вающиее клизмы, кремы, мази, лосьоны, гели, аэрозоли, пены и т.п., предпочтительно в виде стандартных дозовых форм, пригодных для простого введения точных доз.

В настоящем изобретении термин "стандартная дозовая форма" охватывает физически дискретные единицы, применимые как единичные дозы для людей и других млекопитающих, причем каждая единица содержит заданное количество препарата против TNFα, рассчитанное на получение желательного начала действия, толерантности и/или терапевтических эффектов вместе с подходящим фармацевтическим эксципиентом (например, ампулой). Кроме того, можно приготовить более концентрированные формы, из которых затем можно получить более разбавленные дозовые единицы. При этом более концентрированные дозовые формы должны содержать существенно большее количества препарата против TNFα, например, по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз или больше.

Способы приготовления таких дозовых форм известны специалистам (например, см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)). Дозовые формы обычно включают традиционный фармацевтический носитель или эксципиент и могут дополнительно содержать другие лекарственные средства, носители, адъюванты, разбавители, усилители проникновения в ткани, солюбилизаторы и др. Подходящие эксципиенты могут быть подобраны к определенной дозовой форме и способу применения хорошо известными методами (например, см. Remington's Pharmaceutical Sciences, supra).

Примерами подходящих эксципиентов являются, без ограничения, лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, поливинил-пирролидон, целлюлоза, вода, физраствор, сироп, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и полиакрилаты типа карбополов, например, Carbopol 941, Carbopol 980, Carbopol 981 и т.п.Дозовые формы могут дополнительно включать смазывающие вещества, как-то тальк, стеарат магния и вазелиновое масло; смачивающие вещества; эмульгирующие вещества; суспендирующие вещества; консерванты, как-то метил-, этил- и пропилгидроксибензоаты (т.е. парабены); рН-регулирующие вещества, как-то неорганические и органические кислоты и основания; подсластители; и арома-тизаторы. Дозовые формы также могут включать биоразрушимые полимерные шарики, декстран и аддукты циклодекстрина.

При пероральном введении терапевтически эффективная доза может иметь вид таблеток, капсул, эмульсий, суспензий, растворов, сиропов, аэрозолей, леденцов, порошков и форм с замедленным высвобождением. Подходящими эксципиентами для перорального введения являются фармацевтического уровня маннитол, лактоза, крахмал, стеарат магния, натриевый сахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, желатин, сахароза, карбонат магния и др.

В некоторых воплощениях терапевтически эффективная доза имеет вид пилюль, таблеток или капсул, поэтому дозовая форма может содержать, наряду с препаратом против TNFα, любое из следующего: разбавитель, как-то лактоза, сахароза, двухзаме-щенный фосфат кальция и др.; разрыхлитель, как-то крахмал или его производные;

смазывающее вещество, как-то стеарат магния и др.; и связывающее вещество, как-то крахмал, гуммиарабик, поливинилпирролидон, желатин, целлюлоза и ее производные. Препарат против TNFα также может быть составлен в виде свечей и заключен, к примеру, в носитель из полиэтиленгликоля (ПЭГ).

Жидкие дозовые формы могут быть приготовлены растворением или дисперги-рованием препарата против TNFα и необязательно одного или нескольких фармацевтически приемлемых адъювантов в носителе, таком, к примеру, как водный солевой раствор (например, 0,9% масс.хлорида натрия), водный раствор декстрозы, глицерин, этанол и др. с образованием раствора или суспензии, например, для перорального, топического или внутривенного введения. Препарат против TNFα также может быть составлен в виде удерживающей клизмы.

При топическом введении терапевтически эффективная доза может иметь вид эмульсий, лосьонов, гелей, пены, кремов, желе, растворов, суспензий, мазей и транс-дермальных пластырей. При введении путем ингаляции препарат против TNFα может вводиться в виде сухого порошка или в жидком виде через распылитель. При парентеральном введении терапевтически эффективная доза может иметь вид стерильных растворов для инъекций и стерильных расфасованных порошков. Предпочтительно растворы для инъекций составляются при рН от 4,5 до 7,5.

Терапевтически эффективная доза также может быть представлена в лиофилизованном виде. Такие дозовые формы могут включать буфер, например, бикарбонат, для реконструкции перед введением, или же буфер может входить в лиофилизованную дозовую форму для реконструкции, например, с водой. Лиофилизованная дозовая форма может дополнительно включать подходящее сосудосуживающее средство, например, адреналин. Лиофилизованная дозовая форма может быть представлена в шприце, необязательно в упаковке с буфером для реконструкции с тем, чтобы реконструированную дозовую форму можно было немедленно ввести субъекту.

При терапевтическом применении для лечении заболеваний, в патофизиологии которых играет роль TNFα, препарат против TNFα может вводиться в первоначальной дозе от 0,001 мг/кг до 1000 мг/кг в сутки. Диапазон суточных доз, которые могут применяться, составляет от 0,01 мг/кг до 500 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 200 мг/кг, от 1 мг/кг до 100 мг/кг или от 10 мг/кг до 50 мг/кг. Дозировка, однако, может варьировать в зависимости от индивидуальных требований, тяжести заболевания или симптомов и применяемого препарата против TNFα. Например, дозировка может определяться опытным путем с учетом типа и тяжести заболевания и/или симптомов в соответствии с описанными здесь способами. Вводимая индивиду доза, в контексте настоящего изобретения, должна быть достаточной для того, чтобы вызвать положительный терапевтический ответ у индивида со временем. Величина дозы также может определяться наличием, природой и продолжительностью неблагоприятных побочных эффектов, сопровождающих введение данного препарата против TNFα у индивида. Определение правильной дозировки для конкретной ситуации входит в компетенцию врача. Обычно лечение начинают с малых доз, которые меньше оптимальной дозы препарата против TNFα. Затем дозировку увеличивают небольшими шагами до достижения оптимального эффекта при данных обстоятельствах. Для удобства общую суточную дозу можно разделить и вводить порциями в течения суток, если нужно.

В настоящем изобретении термин "препарат против TNFα" охватывает все фармацевтически приемлемые формы препарата, применимые для лечения одного или нескольких симптомов, связанных с заболеваниями, в патофизиологии которых играет роль TNF-α. Например, препараты против TNFα могут иметь вид рацемической или изомерной смеси, твердого комплекса, связанного с ионообменной смолой, и т.п.Кроме того, препараты против TNFα могут быть в сольватированном виде. Термин также включает все фармацевтически приемлемые соли, производные и аналоги описанных препаратов против TNFα, а также их комбинации. Например, фармацевтически приемлемые соли препаратов против TNFα включают, без ограничения, формы солей тартрата, сукцината, битартрата, дигидрохлорида, салицилата, гемисукцината, цитрата, малеата, гидрохлорида, карбамата, сульфата, нитрата и бензоата, а также их комбинации. Любые формы препаратов против TNFα подходят для применения в способах настоящего изобретения, например, фармацевтически приемлемые соли препаратов против TNFα, свободные основания препаратов против TNFα или их смеси. Примеры подходящих препаратов против TNFα включают, без ограничения, биологические препараты, традиционные лекарства и их комбинации.

Терапевтические средства включают, например, антитела против цитокинов и хемокинов, как-то антитела к а-фактору некроза опухолей (TNFα). Неограничивающие примеры антител против TNFα включают: химерные моноклональные антитела типа инфликсимаб (Remicade^ (Centocor, Inc.; Horsham, PA), которое является химерным моноклональным антителом типа IgGI против TNFα; гуманизированные моноклональные антитела типа CDP571 и ПЭГилированного CDP870; полностью человеческие моноклональные антитела типа адалимумаб (Humira®) (Abbott Laboratories; Abbott Park, IL); слитые белки р75 типа этанерцепт (Enbrel®) (Amgen; Thousand Oaks, CA; Wyeth Pharmaceuticals Inc.; Collegeville, PA), небольшие молекулы (например, ингибиторы МАР-киназы); и их комбинации. См. Ghosh, Novartis Found. Symp., 263:193-205 (2004).

Другие биологические средства включают, например, антитела против клеточной адгезии типа натализумаб (Tysabri®) (Elan Pharmaceuticals, Inc.; Dublin, Ireland; Biogen Idee; Cambridge, MA), которое является гуманизированным моноклональным антителом против молекулы клеточной адгезии - а4-интегрина, и MLN-02 (Millennium Pharmaceuticals; Cambridge, MA), которое является гуманизированным моноклональным антителом типа IgGI против а4р7-интегрина; анти-Т-клеточные средства; антитела против CD3 типа висилизумаб (Nuvion®) (PDL BioPharma; Incline Village, NV), которое является гуманизированным моноклональным антителом типа IgG2M3 против CD3; антитела против CD4 типа приликсимаб (сМ-Т412) (Centocor, Inc.; Horsham, PA), которое является химерным моноклинальным антителом против CD4; антитела против α-рецептора IL-2 (CD25) типа даклизумаб (Zenapax®) (PDL BioPharma; Incline Village, NV; Roche; Nutley, NJ), которое является гуманизированным моноклональным антителом типа IgGI против CD25, и басиликсимаб (Simulect®) (Novartis; Basel, Швейцария), которое является химерным моноклональным антителом типа IgGI против CD25; и их комбинации.

Для оценки эффективности определенного терапевтического режима можно проверять индивида через периодические промежутки времени после получения диагностической, прогностической и/или предиктивной информации из образцов от пациента. Например, может изменяться наличие или уровень концентрации терапевтических антител и/или аутоантител против терапевтических антител, исходя из терапевтического эффекта при лечении терапевтическим антителом. В некоторых воплощениях пациента можно проверять для оценки реакции и понимания эффектов определенных лекарств или лечения с индивидуальным подходом. Кроме того, пациенты могут не реагировать на лекарство, но уровень антител может изменяться, свидетельствуя о том, что эти пациенты принадлежат к особой популяции (не поддающихся), которых можно определить по уровню антител у них. Этим пациентам можно прервать текущий курс лечения и назначить альтернативное лечение.

Индивида также можно проверять через периодические промежутки времени для оценки концентрации или уровня различных антител. Уровень антител в различные моменты времени, а также скорость изменения уровня антител со временем имеет значение. В некоторых случаях скорость возрастания одного или нескольких антител (например, антител к антителам против TNFα) у индивида выше порогового уровня указывает на то, что у индивида значительно повышен риск возникновения осложнений или риск побочных эффектов. Информация, полученная при серийном тестировании в виде скорости изменений маркера (т.е. изменения уровня антител за определенное время), может быть связана с тяжестью заболевания, риском осложнений заболевания и/или риском побочных эффектов.

Способы настоящего изобретения также предусматривают идентификацию первичных невосприимчивых или слабо восприимчивых пациентов, например, при лечении терапевтическим моноклональным антителом. Эти первичные невосприимчивые или слабо восприимчивые пациенты, к примеру, могут обладать врожденным или приобретенным иммунитетом к терапевтическому средству. Если терапевтическое средство является диагностическим антителом, то идентификация невосприимчивых или слабо восприимчивых пациентов может способствовать выбору подходящего терапевтического средства для каждого индивидуального пациента.

Способы изобретения могут применяться, к примеру, для идентификации пациентов с вторичной невосприимчивостью. Вторичная невосприимчивость может быть бессимптомной, т.е. единственным симптомом является то, что лечение становится менее эффективным или даже не эффективным. В некоторых случаях способы настоящего изобретения применимы для идентификации вторичной невосприимчивости еще до того, как пациент или медицинский работник заметит, что лечение стало менее эффективным. Для того чтобы обеспечить правильную концентрацию in vivo, может применяться более высокая дозировка при лечении или может быть выбрано альтернативное лечение либо то и другое. Возникновение вторичной невосприимчивости может быть особенно катастрофичным, если терапевтическое средство является диагностическим средством. Радиоактивно меченые моноклональные антитела обычно применяются при мониторинге таких заболеваний, как рак и некоторые инфекционные болезни, когда важно определить величину и/или локализацию заболевания/возбудителя, например, при установлении наличия и/или уровня вторичных метастазов. Если возникновение невосприимчивости (первичной либо вторичной) останется незамеченным, то пациент получит "добро", т.е. ложно отрицательный результат, который может привести к прекращению лечения, а позднее к рецидиву заболевания, часто в более тяжелой и возможно неизлечимой форме.

Следующая категория невосприимчивости - это возникновение (например, вторичное) невосприимчивости, связанной с неблагоприятными побочными эффектами. Развитие иммунного ответа хозяина у субъекта может сопровождаться вредными или неприятными побочными эффектами. Они могут быть вызваны возникновением антител, распознающих человеческие или гуманизированные терапевтические средства, но не способных отличить их от других иммуноглобулинов хозяина. Поэтому способы настоящего изобретения подходят для идентификации субъектов, обладающих врожденным или приобретенным иммунитетом к терапевтическому средству, которые, к примеру, могут быть подвержены неблагоприятным побочным эффектам, связанным с невосприимчивостью.

Способы настоящего изобретения подходят для выбора и выполнения режимов лечения, включающих введение моноклональных терапевтических средств пациентам. Соответственно, описанные здесь способы определения концентрации или биодоступности терапевтических антител могут быть включены в способ лечения заболевания или нарушения. При мониторинге иммунологического статуса пациента способами настоящего изобретения во время курса лечения можно настроить выбор и/или применение терапевтического средства на обеспечение максимальной терапевтической пользы пациенту и в то же время обеспечить рентабельное применение дорогостоящих терапевтических средств.

Способы настоящего изобретения могут применяться для определения того, нужно ли изменить пациенту режим дозировки терапевтического средства (например, терапевтического антитела) или назначить альтернативную фармакотерапию.

Способы настоящего изобретения могут дополнительно включать периодическую оценку концентрации в сыворотке или биодоступности терапевтического средства (например, терапевтического антитела) у пациента.

Способы настоящего изобретения также предусматривают определение того, возник ли у субъекта иммунитет к терапевтическому средству типа терапевтического

антитела.

Настоящим изобретением также предусмотрен способ определения того, что невосприимчивость к лечению у пациента обусловлена образованием иммуноглобулинов пациента против терапевтического антитела, такого, например, как антитело против TNFα.

Настоящим изобретением также предусмотрен способ выбора надлежащего препарата для лечения пациентов, страдающих таким заболеванием, которое излечимо с помощью терапевтического антитела.

Настоящим изобретением также предусмотрен прогностический способ для определения вероятности того, что у пациента возникнет вторичная невосприимчивость к терапевтическому антителу.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение будет описано более подробно на конкретных примерах. Следующие примеры приводятся для раскрытия изобретения, но никоим образом не для его ограничения. Специалисты смогут легко распознать целый ряд некритических параметров, которые можно изменять или модифицировать, получая практически те же результаты.

Пример 1. Новый анализ изменения подвижности для измерения уровня биопрепаратов против TNFα

В этом примере приведен новый гомогенный способ измерения концентрации препарата против TNFα в образцах от пациентов (например, сыворотке) с использованием эксклюзионной хроматографии для детектирования связывания препарата против TNFα с флуоресцентно меченым TNFα. Этот способ выгоден, так как в нем не нужны стадии отмывания, применяются флуорофоры, позволяющие детектировать в видимой области спектра и/или по флуоресценции, что уменьшает фон и помехи со стороны сыворотки, повышается способность детектировать препараты против TNFα у пациентов с низким титром благодаря высокой чувствительности детектирования флуоресцентной метки, и он проводится как реакция в жидкой фазе, тем самым уменьшается возможность любых изменений эпитопа при прикреплении к твердой поверхности типа планшета для ELISA.

В одном типичном воплощении TNFα метят флуорофором (например, А1ехаб47), при этом флуорофор можно детектировать и в видимой области спектра, и по флуоресценции. Меченый TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции с тем, чтобы он связался с препаратом против TNFα, присутствующим в сыворотке. Меченый TNFα также можно инкубировать с известными количествами препарата против TNFα в жидкофазной реакции для получения стандартной кривой. После инкубации образцы наносят прямо на колонку для эксклюзионной хроматографии. Связывание препарата против TNFα с меченым TNFα приводит к смещению пика влево по сравнению с самим меченым TNFα. Концентрацию препарата против TNFα, присутствующего в образце сыворотки, можно затем сравнить со стандартной кривой и контролями.

На фиг.1 представлен пример способа настоящего изобретения, при этом для детектирования связывания между TNFα-Alexa₆₄₇ и HUMIRA™ (адалимумаб) применяется метод эксклюзионной HPLC. Как видно из фиг.1, связывание HUMIRA™ с TNFα-А1ехаб47 приводит к смещению пика TNFα-Alexa₆₄₇ влево.

На фиг.2 представлены кривые "доза-ответ" для связывания HUMIRA™ с TNFα-Alexa₆₄₇. В частности, из фиг.2А видно, что HUMIRA™ дозозависимым образом усиливает сдвиг TNFα-Alexa₆₄₇ при анализе методом эксклюзионной хроматографии. Из фиг.2 В видно, что присутствие 1% сыворотки человека не оказывает значительного влияния на изменение подвижности TNFα-Alexa₆₄₇ при анализе методом эксклюзионной хроматографии. Из фиг.2С видно, что присутствие объединенной RF-положительной сыворотки не оказывает значительного влияния на изменение подвижности TNFα-Alexa₆₄₇ при анализе методом эксклюзионной хроматографии.

Этот пример демонстрирует применимость настоящего изобретения при мониторинге пациентов, получающих препарат против TNFα типа HUMIRA™, так как оно (1) помогает определить подходящую дозировку препарата; (2) дает оценку фармакокинетики препарата, например, чтобы установить, не выводится ли лекарство из организма слишком быстро; и (3) способствует принятию решений по лечению, например, не стоит ли перейти с текущего препарата против TNFα на другой ингибитор TNFα или на другой тип терапии.

Пример 2. Новый анализ изменения подвижности для измерения уровня НАСА и НАНА

В этом примере приведен новый гомогенный способ измерения концентрации аутоантител (например, НАСА и/или НАНА) в образцах от пациентов (например, сыворотке) с использованием эксклюзионной хроматографии для детектирования связывания этих аутоантител с флуоресцентно меченым TNFα. Этот способ выгоден, так как в нем не нужны стадии отмывания, при которых удаляются НАСА и НАНА с низким сродством, применяются флуорофоры, позволяющие детектировать в видимой области спектра и/или по флуоресценции, что уменьшает фон и помехи со стороны сыворотки, повышается способность детектировать НАСА и НАНА у пациентов с низким титром благодаря высокой чувствительности детектирования флуоресцентной метки, и он проводится как реакция в жидкой фазе, тем самым уменьшается возможность любых изменений эпитопа при прикреплении к твердой поверхности типа планшета для ELISA.

Клиническая применимость измерения аутоантител (например, НАСА, НАНА и т.п.), вырабатываемых против ингибиторов TNFα, иллюстрируется тем, что НАСА выявлялись у 53%, 21% и 7% больных ревматоидным артритом, получавших 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг инфликсимаба. При комбинировании инфликсимаба с метотрексатом частота антител снижалась до 15%, 7% и 0%, что свидетельствует о том, что сопутствующая иммунодепрессивная терапия эффективно снижает реакцию на препарат, но также указывает на то, что высокая доза препарата против TNFα может привести к толерантности. При болезни Крона сообщалось о значительно большей частоте; после пятого вливания у 61% больных были НАСА. Клиническая реакция сокращалась при наличии НАСА. См. Rutgeerts, N. Engl. J. Med., 348:601-608 (2003). Ретроспективное исследование инфликсимаба и уровня НАСА при измерении в течение 3-летнего периода с 2005 до 2008 г.у 155 пациентов показало, что НАСА выявляются у 22,6% (п=35) пациентов с хроническим воспалением кишечника. См. Afif et а1., "Clinical utility of measuring infliximab and human anti-chimeric antibody levels in patients with inflammatory bowel disease"; paper presented at Digestive Disease Week; May 30-June 3, 2009, Chicago, IL. Авторы пришли к выводу, что изменение лечения на основании одних лишь клинических симптомов может привести к несоответствующему лечению.

Гомогенный анализ изменения подвижности имеет преимущества перед текущими методами типа мостикового метода, приведенного на фиг.3 для измерения концентраций аутоантител (например, НАСА и/или НАНА) в образцах пациентов, потому что способ изобретения способен измерять концентрацию аутоантител типа НАСА без неспецифического связывания и помех со стороны твердой фазы на планшетах для ELISA, без помех со стороны препарата против TNFα (например, в мостиковом методе измерения НАСА должны проводиться при минимальном уровне препарата против TNFα) и без какой-либо зависимости от мультивалентности антител (например, антитела типа IgG4 не выявляются мостиковым методом, так как антитела типа IgG4 биспецифичны и не могут перекрестие связываться с одним и тем же антигеном). Итак, настоящее изобретение имеет следующие преимущества перед современными методами: не требуется фиксирование антигенов на твердой поверхности (избегается денатурация); устраняется эффект IgG4; преодолевается проблема минимального уровня терапевтических антител; детектируются антитела со слабым сродством; устраняется неспецифическое связывание посторонних IgGs; и повышается чувствительность и специфичность детектирования.

В одном типичном примере препарат против TNFα (например, REMICADE™) метится флуорофором (например, А1ехаб47), при этом флуорофор можно детектировать и в видимой области спектра, и по флуоресценции. Меченый препарат против TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции с тем, чтобы он связался с НАСА и НАНА, присутствующими в сыворотке. Меченый препарат против TNFα также можно инкубировать с известными количествами антител против IgG в жидкофазной реакции для получения стандартной кривой. После инкубации образцы наносят прямо на колонку для эксклюзионной хроматографии. Связывание аутоантител с меченым препаратом против TNFα приводит к смещению пика влево по сравнению с самим меченым препаратом. Концентрацию НАСА и НАНА, присутствующих в образце сыворотки, можно затем сравнить со стандартной кривой и контролями. На фиг.4 приведена типичная схема метода определения аутоантител по настоящему изобретению для измерения концентраций НАСА/НАНА, вырабатываемых против REMICADE™. В определенных случаях высокий уровень НАСА/НАНА указывает на то, что из текущей терапии с помощью REMICADE™ следует перейти на другой препарат против TNFα типа HUMIRA™.

Принцип этого метода основывается на изменении подвижности комплекса связанного с антителом меченного А1ехаб47 REMICADE™ по сравнению со свободным меченным А1ехаб47 REMICADE™ при эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) вследствие повышения молекулярной массы комплекса.

Хроматографию в этом примере проводили на установке Agilent-1200 HPLC System, используя колонку Bio-Sep 300х7,8 мм SEC-3000 (Phenomenex) с диапазоном фракционирования молекулярных масс 5 000-700 ООО и подвижной фазой из 1 xPBS, pH 7,4, при скорости потока 0,5 мл/мин с УФ-детектированием при 650 нм. Перед Agilent-1200 HPLC System с колонкой Bio-Sep 300х7,8 мм SEC-3000 находилась аналитическая предколонка Bio-Sep 75х7,8 мм SEC-3000. При каждом анализе на колонку наносили образец объемом 100 мкл.

Комплекс связанного с антителом меченного А1ехаб47 REMICADE™ образуется при инкубации известного количества антител и меченного А1ехаб47 REMICADE™ в элюирующем буфере IxPBS, pH 7,3, при комнатной температуре в течение 1 часа перед анализом методом SE-HPLC.

На фиг.5 представлен анализ "доза-ответ" связывания антитела против IgG человека с REMICADE™-Alexa₆₄₇ при детектировании методом эксклюзионной хроматографии по настоящему изобретению. Связывание антитела против IgG с REMICADE™-Alexa₆₄₇ вызывало сдвиг пика REMICADE™-Alexa₆₄₇ влево. На фиг.6 представлен второй анализ "доза-ответ" связывания антитела против IgG человека с REMICADE™-Alexa₆₄₇ при детектировании методом эксклюзионной хроматографии по настоящему изобретению. Более высокие дозы антитела против IgG вызывали дозоза-висимое увеличение образования комплексов aH™-IgG/REMICADE™-Alexa₆₄₇, о чем свидетельствует сдвиг пика REMICADE™-Alexa₆₄₇ влево. На фиг.7 представлены кривые "доза-ответ" для связывания антитела против IgG с REMICADE™-Alexa₆₄₇.

На фиг.8 представлено образование иммунокомплекса REMICADE™-Alexa₆₄₇ в нормальной сыворотке человека и в НАСА-положительной сыворотке при детектировании методом эксклюзионной хроматографии по настоящему изобретению при введении 100 мкл образца. Как видно из фиг.8, связывание НАСА, присутствующих в образце от пациента, с REMICADE™-Alexa₆₄₇ приводило к сдвигу пика REMICADE™-А1ехаб47 влево. Таким образом, метод эксклюзионной хроматографии по настоящему изобретению особенно выгоден, так как им можно измерять НАСА в присутствии REMICADE™, его можно применять в то время, когда пациент проходит курс лечения, в нем измеряется и слабое, и сильное связывание НАСА, он является методом типа "смешать и измерить" и его можно распространить на другие подходы, в которых применяется меченый REMICADE™ для уравновешения с НАСА и REMICADE™.

На фиг.9 представлена сводка по измерению НАСА в образцах сыворотки от 20 пациентов, которые проводились мостиковым методом или же анализом изменения подвижности по настоящему изобретению. Это сравнительное исследование показало, что настоящий метод обладает большей чувствительностью по сравнению с текущими методами, так как 3 образца, отрицательные по НАСА при измерении мостиковым методом, в действительности оказались положительными по НАСА при измерении анализом изменения подвижности по настоящему изобретению (см. пациенты № SK 07070305, SK 07070595 и SK 07110035).

Таким образом, этот пример свидетельствует о применимости настоящего изобретения при мониторинге пациентов, получающих препарат против TNFα (например, REMICADE™), для детектирования наличия или уровня аутоантител (например, НАСА и/или НАНА) против препарата, поскольку такие иммунные ответы могут быть связаны с реакциями гиперчувствительности и сильными изменениями фармакокинетики и биораспределения препарата против TNFα, что не позволяет продолжать лечение этим препаратом.

В заключение, примеры 1 и 2 свидетельствуют, что TNFα и антитела против TNFα можно эффективно пометить А1ехаб47. При инкубации комплекса меченый TNFα-Alexa₆₄₇ с антителами против TNFα время удержания комплекса меченый TNFα/препарат против TNFα смещалось, а количество препарата против TNFα, вызывающего смещение, можно количественно оценить методом HPLC. Более того, при инкубации меченого препарата против TNFα с антителом против IgG человека время удержания комплекса меченый препарат против TNFα/антитело против IgG смещалось, а количество антитела против IgG, вызывающего это смещение, можно количественно оценить методом HPLC. Кроме того, низкое содержание сыворотки в системе определения, как оказалось, почти не влияет на анализ методом HPLC. Наконец, можно составить стандартную кривую для препарата против TNFα и определения НАСА/НАНА и использовать ее для количественного определения уровня препарата против TNFα НАСА/НАНА в сыворотке от пациентов. Преимущественно, настоящим изобретением в некоторых аспектах предусмотрен анализ изменения подвижности, как-то гомогенный метод типа "смешать и измерить", разработанный для измерения и препарата, и антител против препарата. Были составлены стандартные кривые для биопрепаратов против TNFα - REMICADE™ и HUMIRA, а также для антител НАСА против REMICADE™. В формате анализа изменения подвижности, в отличие от ELISA, не нужно фиксировать антигены на твердой поверхности и на него не влияет неспецифическое связывание посторонних IgGs. Этот формат определения является простым, но очень чувствительным, и может применяться для детектирования всех биологических препаратов против TNFα (например, Remicade, Humira, Enbrel и Cimzia), а также нейтрализующих антител (против REMICADE™) в сыворотке пациентов.

Пример 3. Измерение уровня антител человека против химерных антител (НАСА) и инфликсимаба (IFX) в сыворотке пациентов новым анализом изменения подвижности

Резюме

Введение. Инфликсимаб (IFX) - это химерное терапевтическое антитело против TNFα, в отношении которого было показано, что оно эффективно при лечении таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит (RA) и хроническое воспаление кишечника (IBD). Однако антитела против IFX обнаруживались у некоторых пациентов, получавших IFX, при детектировании антител человека против химерных антител (НАСА), которые могут снижать эффективность препарата или оказывать вредное действие. Мониторинг уровней НАСА и IFX у индивидуальных пациентов помогает оптимизировать дозировку и лечение с помощью IFX. Текущие способы детектирования НАСА основываются на твердофазных методах, которые имеют ограничения в том, что присутствие IFX в кровотоке может маскировать наличие НАСА, поэтому измерения можно проводить только через 8 недель после приема дозы IFX. Более того, эта задержка по времени еще больше ограничивает определение вследствие быстрого выведения высокомолекулярных иммунных комплексов из кровотока. Чтобы преодолеть эти недостатки, мы разработали и проверили новый способ измерения уровня IFX и НАСА в сыворотке пациентов, получавших IFX.

Методы. Для измерения уровня НАСА и IFX в сыворотке пациентов, получавших IFX, разработали новый нерадиоактивный, жидкофазный анализ изменения подвижности при эксклюзионной (SE)-HPLC. Можно разделить иммунокомплекс (например, TNFo/IFX или IFX/HACA), свободный TNFα или IFX и рассчитать соотношение связанный/свободный с высокой чувствительностью. Концентрации IFX или НАСА в сыворотке определяли по стандартным кривым, составленным при инкубации с различными концентрациями IFX или объединенной НАСА-положительной сыворотки. С помощью этого нового метода измеряли уровень IFX и НАСА в сыворотке, взятой у больных IBD, получавших IFX, у которых произошли рецидивы, и сравнивали с результатами, полученными традиционным "мостиковым" методом (Bridge) ELISA.

Результаты. Составляли кривые "доза-ответ" новым методом определения с высокой чувствительностью. Продемонстрировано детектирование НАСА в присутствии избытка IFX. Из 117 образцов сыворотки от пациентов, получавших IFX, в 65 образцах уровень IFX оказался выше предела обнаружения, а среднее значение составило 11,0±6,9 мг/мл. По уровню НАСА 33 образца (28,2%) оказались положительными, тогда как методом Bridge ELISA детектировалось только 24 положительных образца. Мы также идентифицировали 9 ложно-отрицательных и 9 ложно-положительных результатов из образцов, определяемых методом Bridge ELISA. Уровень НАСА оказался повышенным у 11 пациентов во время курса лечения IFX, тогда как уровень IFX оказался значительно пониженным.

Заключение. Разработан новый, нерадиоактивный, жидкофазный анализ изменения подвижности для измерения уровня IFX и НАСА в сыворотке пациентов, получавших IFX. Метод обладает высокой чувствительностью и точностью, а полученные результаты воспроизводимы. Этот новый способ определения может применяться с выгодой для измерения уровня НАСА и IFX у пациентов во время лечения.

Введение

Фактор некроза опухолей альфа (TNFα) играет ключевую роль в патогенезе таких аутоиммунных заболеваний, как болезнь Крона (CD) и ревматоидный артрит (RA). Хорошо известно, что блокирование TNFα терапевтическими антителами, такими как инфликсимаб (химерное моноклональное антитело человека-мыши типа IgGlK) или адалимумаб (полностью человеческое моноклональное антитело) снижают активность заболевания при CD и RA. Однако около 30-40% пациентов невосприимчивы к лечению антителами против TNFα, а некоторым пациентам требуются более высокие дозы или повышение частоты дозирования вследствие недостаточной восприимчивости. Различия по биодоступности и фармакокинетике лекарств у индивидуальных пациентов могут вносить вклад в несостоятельность лечения. Иммуногенность препаратов, вследствие которой у пациентов возникают НАСА/НАНА, может приводить к целому ряду отрицательных реакций, от мягкого аллергического ответа до анафилактического шока. Эти проблемы сейчас признаны многими исследователями, агентствами по контролю за лекарствами, страховыми медицинскими компаниями и производителями лекарств. Более того, многие пациенты со вторичной невосприимчивостью к одному препарату против TNFα выигрывают от перехода на другие препараты против TNFα, что свидетельствует о роли нейтрализующих антител, направленных конкретно против белка, используемого для лечения (Radstake et al., Ann. Rheum. Dis., 68(11): 1739-45 (2009). Поэтому оправдан мониторинг пациентов на уровень препарата и НАСА/НАНА с тем, чтобы введение препарата было приспособлено к индивидуальному пациенту, а продолжительное лечение осуществлялось эффективно и экономично совсем или почти без риска для пациентов (Bendtzen et al., Scand. J. GastroenteroL, 44(7):774-81 (2009).

Для оценки уровня препаратов и НАСА/НАНА в кровотоке применялось несколько методов ферментного иммуноанализа. На фиг.10 представлена сводка по существующим методам измерения НАСА в сравнении с новым методом определения НАСА по настоящему изобретению. Одно из ограничений существующих методик состоит в том, что уровень антител трудно измерить, когда в кровотоке имеется заметное количество лекарства. В отличие от существующих твердофазных методов детектирования НАСА, в которых измерения можно проводить только через 8 недель после принятия дозы IFX, Новый нерадиоактивный, жидкофазный метод эксклюзионной (SE)-HPLC по настоящему изобретению способен измерять уровни НАСА и IFX в сыворотке от пациентов во время лечения с помощью IFX.

Имеются следующие обоснования для измерения концентраций биологических препаратов против TNFα и антител к биологическим препаратам против TNFα в сыворотке пациентов: (1) для фармакокинетических исследований при клинических испытаниях; (2) при клинических испытаниях FDA может потребовать проводить мониторинг иммунного ответа пациентов на биологический препарат; (3) чтобы отслеживать реакцию пациента на биологический препарат путем измерения НАСА или НАЛА для регулирования дозировки препарата для каждого пациента; и (4) в качестве руководства для перехода на другой биологический препарат, если не срабатывает первоначальный препарат.

Методы

Анализ методом SE-HPLC уровня инфликсимаба (IFX) в сыворотке пациентов. Рекомбинантный TNFα человека метили флуорофором ("F1", к примеру, Alexa Fluor® 488) в соответствии с инструкциями производителя. Меченый TNFα инкубировали с различными количествами IFX или сыворотки пациента 1 час при комнатной температуре. Образцы объемом 100 мкл анализировали методом эксклюзионной хроматографии на установке для HPLC. Для мониторинга свободного TNFα-F1 и связанного иммуноком-плекса TNFα-F1 по времени удержания использовали флуоресцентное детектирование (FLD). Уровень IFX в сыворотке рассчитывали по стандартной кривой.

Анализ методом SE-HPLC уровня НАСА в сыворотке пациентов. Очищенный IFX метили F1. Меченый IFX инкубировали с различными разведениями объединенной НАСА-положительной сыворотки или с разведенной сывороткой пациента 1 час при комнатной температуре. Образцы объемом 100 мкл анализировали методом эксклюзионной хроматографии на установке для HPLC. Для мониторинга свободного TNFα-F1 и связанного иммунокомплекса TNFα-F1 по времени удержания использовали FLD. Для определения уровня НАСА измеряли соотношение связанного и свободного IFX- F1.

Методика определения изменения подвижности для измерения НАСА в сыворотке.

Принцип этого определения основывается на изменении подвижности комплекса связанного с НАСА F1-меченого инфликсимаба (IFX) по сравнению со свободным F1-меченым IFX методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) вследствие повышения молекулярной массы комплекса. Хроматографию проводили на установке Agilent-1200 HPLC System, используя колонку Bio-Sep 300х7,8 мм SEC-3000 (Phenomenex) с диапазоном фракционирования молекулярных масс 5 000-700000 и подвижной фазой из ixpbs, рН 7,3, при скорости потока 0,5 мл/мин с УФ-детектированием при 650 нм. Перед Agilent-1200 HPLC System с колонкой Bio-Sep 300×7,8 мм SEC-3000 находилась аналитическая предколонка Bio-Sep 75х7,8 мм SEC- 3000. При каждом анализе на колонку наносили образец объемом 100 мкл. Комплекс связанного с НАСА F1-меченого IFX образуется при инкубировании сыворотки от получавших IFX пациентов с F1-меченым IFX в элюирующем буфере IxPBS, pH 7,3, при комнатной температуре в течение 1 часа перед анализом методом SE-HPLC.

Результаты

На фиг.11 представлено отделение комплекса связанного с НАСА IFX-F1 от свободного IFX-F1 вследствие изменения подвижности высокомолекулярного комплекса. Как видно из частей end, время удержания пика флуоресценции смещается с 21,8 мин до 15,5-19,0 мин. Чем больше НАСА в реакционной смеси, тем меньше свободного IFX-F1 остается на хроматограмме и тем больше образуется иммунокомплекса. На фиг.12 представлены кривые "доза-ответ" для сдвига пика флуоресценции, вызванного добавлением НАСА. Используя НАСА положительный образец, мы смогли детектировать сдвиг пика при разведении сыворотки 1:1000.

На фиг.13 представлено отделение комплекса связанного с IFX TNFα-F1 от свободного TNFα-F1 вследствие изменения подвижности высокомолекулярного комплекса. Как видно из частей end, время удержания пика флуоресценции смещается с 24 мин до 13-19,5 мин. Чем больше IFX в реакционной смеси, тем меньше свободного TNFα-F1 остается на хроматограмме и тем больше образуется иммунокомплекса. На фиг.14 представлены кривые "доза-ответ" для сдвига пика TNFα-F1, вызванного добавлением IFX. Исходя из добавленного количества IFX, предел обнаружения IFX Составляет 10 нг/мл сыворотки.

Новый анализ изменения подвижности по настоящему изобретению проверяли тестированием образцов сыворотки от НАСА-положительных и отрицательных пациентов при измерении "мостиковым" методом (табл.2). Используя этот метод измерения, мы проанализировали образцы сыворотки от 50 здоровых субъектов и 117 больных IBD, получавших IFX. Во всех образцах 50 здоровых субъектов уровень IFX был ниже предела обнаружения, тогда как в образцах 65 больных средняя концентрация IFX составила 11,0 мкг/мл. В табл.3 представлены уровни НАСА в сыворотке здоровых контролей и больных IBD, получавших IFX, при измерении "мостиковым" методом и анализом изменения подвижности. "Мостиковым" методом выявляется меньше НАСА-положительных больных, чем анализом изменения подвижности, и больше ложно-отрицательных, а также больше ложно-положительных.

Таблица 2. Корреляция относительных уровней НАСА в сыворотке от сильно положительных и отрицательных пациентов при определении "мостиковым" методом и методом SE-HPLC

	"Мостиковым" методом	Анализ изменения подвижности посредством HPLC	Корреляция
Положительные	82	81	99%
Отрицательные	12	12	100%

Таблица 3. Анализ образцов пациентов на уровень НАСА в сыворотке "мостиковым" методом (отсечение 1,69 мкг/мл) и анализом изменения подвижности посредством HPLC (отсечение 0,19 по соотношению связанного и свободного IFX)

	Субъекты (n)	НАСА-положит.	"Мостиковым" методом
мостиковым методом	методом HPLC	ложно-отриц.	ложно-полож.
Здоровый контроль	50	н/п	0	н/п	н/п
Больные, получавшие IFX	117	24 (20,5%)	33 (28,2%)	9 (высокий IFX)	9

Ложно-отрицательные результаты вызваны тем, что сыворотка пациентов содержит высокий уровень IFX, который мешает определению НАСА Мостиковым методом, но не влияет на метод SE-HPLC. Ложно-положительные результаты вызваны тем, что сыворотка пациентов содержит высокий уровень неспецифических веществ, которые мешают определению Мостиковым методом.

На фиг.15 представлено соотношение между уровнем НАСА и концентрацией IFX у больных IBD во время курса лечения IFX. НАСА выявляются уже при V 10 (30 недель) и продолжают возрастать у некоторых пациентов во время лечения IFX. На фиг.16 показано, что НАСА можно детектировать в присутствии IFX методом настоящего изобретения. Повышение уровня НАСА в сыворотке связано с уменьшением детектируемого уровня IFX (например, уменьшением биодоступности). Таким образом, раннее выявление НАСА во время лечения IFX может направить врача и/или пациента на переход на другой препарат против TNFα или увеличение дозы IFX.

Заключение

Биологические препараты против TNFα можно легко пометить флурофором ("F1") и использовать анализ изменения подвижности для измерения НАСА/НАНА в формате гомогенного определения без фиксирования антигенов на твердой поверхности и многократного отмывания и инкубирования, как в типичном методе ELISA. Инкубация F1-меченого IFX с НАСА-положительной сывороткой приводит к образованию иммунного комплекса, который при SE-HPLC элюируется в другом положении, чем свободный F1-меченый IFX, при этом можно определить количество НАСА. Присутствие других компонентов сыворотки почти не оказывает влияния на анализ изменения подвижности.

На определение в формате изменения в подвижности, в отличие от ELISA, не влияет неспецифическое связывание посторонних IgG и при этом детектируется изотип IgG4. Образцы здоровой сыворотки не вызывают изменения в подвижности F1-меченого IPX, а у 28,2% больных, получавших IFX, методом настоящего изобретения обнаружены НАСА. Таким образом, описанный здесь формат определения очень чувствителен и может применяться для детектирования всех биологических препаратов (например, Remicade, Humira, Enbrel и Cimzia), а также антител к ним (например, против Remicade, против Humira, против Enbrel и против Cimzia) в сыворотке пациентов. Отметим, что поскольку НАСА можно детектировать в присутствии IFX анализом изменения подвижности по изобретению, то раннее выявление НАСА во время лечения IFX может направить врача и/или пациента на переход на другой препарат против TNFα или увеличение последующей дозы IFX.

Мы разработали новый нерадиоактивный, жидкофазный метод SE-HPLC для измерения уровня IFX и НАСА в образцах сыворотки, полученных от пациентов, получающих IFX. Новый метод обладает высокой чувствительностью и точностью, а результаты хорошо воспроизводятся, что делает его пригодным для регулярного тестирования большого количества образцов сыворотки человека. Новый формат определения, в отличие от ELISA, устраняет фиксирование антигенов на твердой поверхности и на него не влияет неспецифическое связывание посторонних IgG. Эти преимущества описанного здесь формат определения уменьшают количество ложно-отрицательных и ложно-положительных результатов тестирования. По преимуществу, формат определения по настоящему изобретению является очень чувствительным и может применяться для детектирования всех биологических препаратов, а также антител к ним, присутствующих в сыворотке, во время лечения пациента.

Пример 4. Различение между нейтрализующими и не-нейтрализующими антителами человека против химерных антител (НАСА) в сыворотке пациентов новым анализом изменения подвижности

В этом примере приведены новые гомогенные способы измерения концентрации аутоантител (например, НАСА) в образцах - (например, сыворотке) от пациентов и определения того, являются они нейтрализующими или не-нейтрализующими аутоантителами, с использованием эксклюзионной хроматографии для детектирования связывания этих аутоантител с флуоресцентно меченым препаратом против TNFα в присутствии флуоресцентно меченого TNFα. Этот способ выгоден, так как в нем не нужны стадии отмывания, при которых удаляются НАСА с низким сродством, применяются особые флуорофоры, позволяющие детектировать в видимой области спектра и/или по флуоресценции, что уменьшает фон и помехи со стороны сыворотки, повышается способность детектировать нейтрализующие и не-нейтрализующие НАСА у пациентов с низким титром благодаря высокой чувствительности детектирования флуоресцентной метки и он проводится как реакция в жидкой фазе, тем самым уменьшается возможность любых изменений эпитопа при прикреплении к твердой поверхности типа планшета для ELISA.

В одном типичном воплощении препарат против TNFα (например, REMICADE™) метится флуорофором "F1" (см., например, фиг.17А), причем флуорофор может детектироваться в видимой области спектра и/или по флуоресценции. Аналогичным образом TNFα метится флуорофором "F2" (см., например, фиг.17А), причем флуорофор может детектироваться в видимой области спектра и/или по флуоресценции, а "F1" и "F2" являются различными флуорофорами. Меченый препарат против TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции и туда же добавляют меченый TNFα с тем, чтобы образовались комплексы (т.е. иммунокомплексы) между меченым препаратом против TNFα, меченым TNFα и/или НАСА, присутствующими в сыворотке. После инкубации образцы наносят прямо на эксклюзионную колонку. Связывание и аутоантитела (например, НАСА), и меченого TNFα с меченым препаратом против TNFα приводит к сдвигу пика влево (например, "Иммунокомплекс 1" на фиг.17А) по сравнению с двойным комплексом между аутоантителом и меченым препаратом против TNFα (например, "Иммунокомплекс 2" на фиг.17А), самим меченым препаратом или самим меченым TNFα. Присутствие этого тройного комплекса аутоантитела (например, НАСА), меченого TNFα и меченого препарата против TNFα указывает на то, что аутоантитело, присутствующее в образце сыворотки, является не-нейтрализующей формой аутоантител (например, НАСА), так что оно не мешает связыванию между препаратом против TNFα и TNFα. В одном определенном воплощении, представленном на фиг.17А, если в сыворотке присутствует не-нейтрализующее аутоантитело, то будет наблюдаться изменения в подвижности и для F1-REMICADE™, и для F2-TNFα, приводя к увеличению пиков иммунокомплекса 1 и иммунокомплекса 2 и к уменьшению пиков свободного F1-REMICADE™ и свободного F2-TNFα. Однако присутствие двойного комплекса между аутоантителом (например, НАСА) и меченым препаратом против TNFα (например, "Иммунокомплекс 2" на фиг.17В) в отсутствие тройного комплекса аутоантитела (например, НАСА), меченого TNFα и меченого препарата против TNFα указывает на то, что аутоантитело, присутствующее в образце сыворотки, является нейтрализующей формой аутоантител (например, НАСА), так что оно мешает связыванию между препаратом против TNFα и TNFα. В одном определенном воплощении, представленном на фиг.17В, если в сыворотке присутствует нейтрализующее НАСА, то будет наблюдаться изменение подвижности для F1-REMICADE™, что приводит к увеличению пика иммунокомплекса 2 и к уменьшению пика F1-REMICADE™ без изменения пика свободного F2-TNFα. В некоторых случаях присутствие нейтрализующих НАСА указывает на то, что следует перейти с текущего лечения REMICADE™ на другой препарат против TNFα типа HUMIRA™.

В альтернативном воплощении меченый препарат против TNFα сначала инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции с тем, чтобы образовались комплексы (т.е. иммунокомплексы) между меченым препаратом против TNFα и НАСА, присутствующими в сыворотке. После инкубации образцы наносят прямо на первую эксклюзионную колонку. Связывание аутоантител (например, НАСА) с меченым препаратом против TNFα приводит к смещению пика (например, "Иммунокомплекс 2" на фиг.18) влево по сравнению с самим меченым препаратом. Затем в реакционную смесь добавляют меченый TNFα, чтобы определить, может ли он вытеснять, т.е. конкурировать с аутоантителом (например, НАСА) за связывание с меченым препаратом против TNFα, при этом образуются комплексы (т.е. иммунокомплексы) между меченым препаратом против TNFα и меченым TNFα. После инкубации образцы наносят прямо на вторую эксклюзионную колонку. Связывание меченого препарата против TNFα с меченым TNFα приводит к сдвигу пика (например, "Иммунокомплекс 3" на фиг.18) влево по сравнению с самим меченым TNFα. Нарушение связывания между аутоантителом (например, НАСА) и меченым препаратом против TNFα при добавлении меченого TNFα указывает на то, что аутоантитело, присутствующее в сыворотке, является нейтрализующей формой аутоантител (например, НАСА), так что аутоантитело мешает связыванию между препаратом против TNFα и TNFα. В некоторых случаях присутствие нейтрализующих НАСА указывает на то, что следует перейти с текущего лечения REMICADE™ на другой препарат против TNFα типа HUMIRA™.

Пример 5. Анализ антител человека против лекарств (ADA) к адалимумабу в сыворотке пациентов новым гомогенным анализом изменения подвижности

Введение и цель. Моноклональные антитела против TNF-α типа инфликсимаб (IFX), адалимумаб (HUMIRA™) и цертолизумаб оказались эффективными при лечении хронического воспаления кишечника (IBD) и других воспалительных заболеваний. Антитела против лекарств (ADA) могут снижать эффективность лекарств и/или вызывать неблагоприятные эффекты. Однако ADAs были обнаружены не только у пациентов, принимавших химерное антитело инфилксимаб, но также у пациентов, принимавших гуманизированное антитело адалимумаб. Мониторинг уровней ADA и лекарств у индивидуальных пациентов может способствовать оптимизации лечения и дозировки для пациентов. Мы разработали нерадиоактивный жидкофазный гомогенный анализ изменения подвижности для точного измерения в сыворотке пациентов как НАСА (человеческих против химерных антител), так и IFX. Этот метод измерения преодолевает главное ограничение существующих твердофазных методов детектирования НАСА, а именно: неспособность точно детектировать НАСА в присутствии IFX в кровотоке. В настоящем исследовании испытывали этот новый метод измерения уровней ADA и лекарств в сыворотке у пациентов, получавших гуманизированное лекарственное антитело - адалимумаб.

Методы. Анализ изменения подвижности основывается на смещении времени удержания свободного антигена по сравнению с иммунокомплексом антиген-антитело при эксклюзионной хроматографии. Меченый флуорофором адалимумаб или TNF-α и внутренний контроль смешивали с образцами сыворотки для измерения изменения подвижности свободного адалимумаба и TNF-α в присутствии ADA или препарата. Изменение соотношения свободного адалимумаба или TNF-α к внутреннему контролю является показателем образования иммунокомплекса. Концентрации ADA или адалимумаба в сыворотке определяли по стандартным кривым, составленным при инкубации с различными концентрациями антител против IgG человека или очищенного адалимумаба. Используя анализ изменения подвижности, измеряли уровни адалимумаба и ADA в сыворотке больных IBD, получавших адалимумаб и потерявших восприимчивость к нему.

Результаты. Составляли кривые "доза-ответ" по антителам против IgG человека для измерения изменения подвижности меченого адалимумаба. Предел обнаружения данного метода составил 1 нг антител против IgG человека. Сыворотки от 50 здоровых контролей протестировали на ADA, и во всех образцах уровень ADA был ниже предела обнаружения (т.е. не было изменения в подвижности у свободного меченого адалимумаба). Детектирование ADA также проявлялось в присутствии добавленного извне адалимумаба. Для измерения концентрации препарата у пациентов, получавших адалимумаб, строили стандартную кривую при различных количествах адалимумаба на изменение подвижности меченого TNF-α, и предел обнаружения адалимумаба составил 10 нг.

Выводы. Нерадиоактивный жидкофазный гомогенный анализ изменения подвижности по настоящему изобретению применяли для измерения уровней ADA и адалимумаба в сыворотке пациентов, получавших адалимумаб. Метод оказался воспроизводимым с высокой чувствительностью и точностью и может применяться для определения уровней ADA в образцах сыворотки пациентов, получающих адалимумаб.

Пример 6. Анализ антител против лекарств (ADA) к адалимумабу в сыворотке пациентов новым собственным анализом изменения подвижности

Резюме

Введение. Препараты против TNFα типа инфликсимаб (IFX) и адалимумаб (ADL)

оказались эффективными при лечении хронического воспаления кишечника (IBD). Однако возникновение ADA у больных, получающих лечение, может снижать эффективность лекарств и/или вызывать неблагоприятные эффекты. Действительно, ADAs были обнаружены не только у пациентов, получавших IFX, но также у пациентов, получавших ADL. Мониторинг уровней ADA и лекарств у индивидуальных пациентов может способствовать оптимизации лечения и дозировки для пациентов. Мы разработали собственный анализ изменения подвижности для точного измерения в сыворотке пациентов как НАСА (человеческих против химерных антител), так и IFX. Этот метод преодолевает главное ограничение существующих твердофазных методов детектирования НАСА, а именно: неспособность точно детектировать НАСА в присутствии IFX в кровотоке. В настоящем исследовании испытывали этот новый метод измерения уровней ADA и лекарств в сыворотке у пациентов, получавших полностью человеческое лекарственное антитело - ADL.

Методы. Анализ изменения подвижности основывается на смещении времени удержания иммунокомплекса антиген-антитело свободного антигена по сравнению со свободным антигеном при эксклюзионной хроматографии. Меченый флуорофором ADL или TNF-α и внутренний контроль смешивали с образцами сыворотки для измерения изменения подвижности свободного ADL и TNF-α в присутствии ADA или препарата. Изменение соотношения свободного ADL или TNF-α к внутреннему контролю является показателем образования иммунокомплекса. Концентрации ADA или ADL в сыворотке определяли по стандартным кривым, составленным при инкубации с различными концентрациями антител против IgG человека или очищенного ADL. Используя этот метод, измеряли уровни ADL и ADA в сыворотке, полученной от больных IBD, получавших ADL.

Результаты. Составляли кривые "доза-ответ" по антителам против IgG человека для измерения изменения подвижности меченого ADL. Предел обнаружения данного метода составил 10 нг антител против IgG человека. Сыворотки от 100 здоровых контролей протестировали на ADA, и во всех образцах уровень ADA был ниже предела обнаружения (не было изменения подвижности у свободного меченого ADA). Детектирование ADA проявлялось у пяти из 114 образцов больных IBD, получавших ADL. Для измерения концентрации препарата у пациентов, получавших ADL, строили стандартную кривую при различных количествах ADL на изменение подвижности меченого TNF-α с пределом обнаружения в 10 нг.

Выводы. Мы применили свой собственный нерадиоактивный жидкофазный гомогенный анализ изменения подвижности для измерения уровней ADA и ADL в сыворотке пациентов, получавших ADL. Метод оказался воспроизводимым с высокой чувствительностью и точностью и может применяться для определения уровней ADA в образцах сыворотки пациентов, получающих ADL.

Введение

Биопрепараты α-фактора некроза опухолей (TNFα) типа инфликсимаб (IFX), этанерцепт, адалимумаб (ADL) и цертолизумаб-пегол, как оказалось, снижают активность ряда иммунологических заболеваний, включая болезнь Крона (CD) и ревматоидный артрит (RA). Однако некоторые пациенты не поддаются терапии против TNF-α, тогда как другим нужны более высокие или более частые дозировки вследствие недостаточной восприимчивости или развития реакции на введение.

Иммуногенность терапевтических антител, которая вызывает появление у пациентов антител против лекарств, может способствовать несостоятельности лечения и реакции на введение. Химерные антитела, подобные IFX, могут обладать большей способностью индуцировать образование антител, чем полностью гуманизированные антитела типа ADL. Распространенность антител к IFX (HACA) у больных RA колеблется от 12% до 44% и она обратно пропорциональна уровню IFX в сыворотке пациентов и реакции на лечение. Хотя предполагается, что полностью гуманизированный ADL будет менее иммуногенным, чем мышиные или химерные антитела, однако в нескольких исследованиях сообщалось о появлении антител человека против гуманизированных антител (НАНА), причем распространенность появления антител составляет от 1% до 87% у больных RA и CD (Aikawa et al. Immunogenicity of anti-TNF-αlpha agents in autoimmune diseases. Clin. Rev. Allergy Immunol., 38(2-3):82-9 (2010).

Многие пациенты со вторичной невосприимчивостью к одному препарату против TNFα могут выиграть от перехода на другой препарат против TNFα или повышения дозы и/или частоты дозирования. Поэтому оправдан мониторинг пациентов на уровень препарата и антител против препарата (ADA) с тем, чтобы введение препарата было приспособлено к индивидуальному пациенту. Такой подход позволяет регулировать дозировку, если нужно, или прекращать прием лекарства, если имеются ADA (Bendtzen et а1. Individual medicine in inflammatory bowel disease: monitoring bioavailability, pharmacokinetics and immunogenicity of anti-tumour necrosis factor-alpha antibodies. Scand. J. GastroenteroL, 44(7):774-81 (2009); Afif et al. Clinical utility of measuring infliximab and human anti-chimeric antibody concentrations in patients with inflammatory bowel disease. Am. J. Gastroenterol., 105(5): 1133-9 (2010)).

Для измерения НАСА и НАНА был разработан целый ряд методов. Одно из ограничений существующих методик состоит в том, что уровень ADA невозможно надежно измерить, если в кровотоке будет высокий уровень лекарства.

Мы разработали собственный нерадиоактивный жидкофазный анализ изменения подвижности для измерения уровней ADA и ADL в сыворотке пациентов, получающих ADL, на который не влияет присутствие лекарства в сыворотке.

Методы

Меченый флуорофором (F1) ADL инкубировали с сывороткой пациентов для образования иммунокомплекса. В каждую пробу включали F1-меченый небольшой пептид в качестве внутреннего контроля. При составлении стандартной кривой для определения уровня ADA в сыворотке использовали различные количества антител против IgG человека. Свободный F1-меченый ADL отделяли от связанного с антителом комплекса по молекулярной массе методом эксклюзионной хроматографии. Для экстраполяции концентрации НАНА из стандартной кривой использовали соотношение свободного F1-меченого ADL к внутреннему контролю для каждого образца. Аналогичная методика использовалась для измерения уровня ADL в образцах сыворотки пациентов с F1-меченым TNF-α.

Результаты

На фиг.19 представлено отделение комплекса связанного с антителом против IgG человека F1-ADL от свободного F1-ADL вследствие изменения подвижности высокомолекулярного комплекса. Как видно из частей c-h, время удержания пика флуоресценции смещается с 10,1 мин до 7,3-9,5 мин. Чем больше антител против IgG человека добавлено в реакционную смесь, тем меньше свободного ADL остается на хроматограмме и тем больше образуется иммунокомплекса (h-c). Время удержания для внутреннего контроля составляло 13,5 мин.

На фиг.20 представлена кривая "доза-ответ" для сдвига пика флуоресценции, вызванного добавлением антител против IgG человека. Повышение концентрации антител против IgG человека вызывает уменьшение отношения свободного ADL к внутреннему контролю вследствие образования иммунокомплекса. Чувствительность метода для антител против IgG человека составляет 10 нг/мл. Внутренний контроль "F1-BioCyt" соответствует конъюгату Alexa Fluor® 488-биоцитин (BioCyt), в котором зеленый флуоресцентный флуорофор Alexa Fluor® 488 конъюгирован с биотином и фиксируемым альдегидом первичным амином (лизина) (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA).

На фиг.21 представлено отделение комплекса связанного с ADL TNF-α-F1 от свободного TNF-α-F1 вследствие изменения подвижности высокомолекулярного комплекса. Как видно из частей с и], время удержания пика флуоресценции смещается с 11,9 мин до 6,5-10,5 мин. Чем больше добавлено ADL в реакционную смесь, тем меньший пик свободного TNF-α-F1 остается на хроматограмме и тем больше образуется иммуно-

комплекса.

На фиг.22 представлены кривые "доза-ответ" для сдвига пика TNF-α-F1, вызванного добавлением ADL. Исходя из добавленного ADL, предел обнаружения ADL в сыворотке составляет 10 нг/мл.

В табл.4 представлен анализ образцов сыворотки от 100 здоровых субъектов и 114 больных IBD, получавших ADL, на уровни ADA и ADL анализом изменения подвижности по настоящему изобретению. Во всех образцах от 100 здоровых субъектов уровень ADA был ниже предела обнаружения (нет изменения подвижности у свободного F1-ADL), тогда как в 5 из 114 образцов больных концентрация ADA составляла от 0,012 до >20 мкг/мл. Средний уровень ADL в образцах сыворотки от 100 здоровых субъектов составлял 0,76±1,0 мкг/мл (размах от 0 до 9,4 мкг/мл). Средний уровень ADL в образцах сыворотки от 114 больных, получавших ADL, составлял 10,8±17,8 мкг/мл (размах от 0 до 139 мкг/мл). В 4 из пяти ADA-положительных образцов ADL не обнаруживался.

Таблица 4.
Уровни ADA и ADL в сыворотке пациентов при измерении анализом изменения подвижности
	Субъекты (n)	Пол(м/ж)	Возраст (лет) (среднее)	ADA-полож.	Уровень ADL(мкг/мл)
Здоровый контроль	100	38/62	18-62(37,1)	0	0,76±1,00
Больные IBD, получавшие ADL	114	51/63	20-69 (39,9)	5 (4,3%)	10,80±17,80

В табл.5 представлен дальнейший анализ образцов сыворотки от 100 здоровых субъектов и 114 больных IBD, получавших ADL. В частности, в 4 из 42 образцов больных с 0-4 мкг/мл ADL средняя концентрация ADA составляла от 0,012 до >20 мкг/мл. В 4 из четырех ADA-положительных образцов ADL не обнаруживался. При детектировании ADA 114 больных IBD, получавших ADL, разделили на две категории: 0-4 мкг/мл ADL и >4 мкг/мл ADL. Пациентов с уровнем ADL более 4 мкг/мл можно тестировать при большем количестве ADL-F1, учитывая конкуренцию циркулирующего ADL с ADL-F1.

Таблица 5.
Уровни ADA и ADL в сыворотке пациентов при измерении анализом изменения подвижности
	Субъекты (п)	Пол(м/ж)	Возраст (среднее)	Уровень ADL (мкг/мл)	ADA-ПОЛОЖИТ.
Здоровый контроль	100	38/62	18-62(37,1)	0,76±1,00	0
Больные IBD, получавшие ADL	114	51/63	20-69 (39,9)	10,80±17,80	ADL 0-4мкг/мл: 4 из 42 (9,52%)

Заключение

Для измерения НАСА/IFX использовали анализ изменения подвижности в формате гомогенного определения без фиксирования антигенов на твердой поверхности и без многократного отмывания и инкубирования, как в типичном методе ELISA. Этот метод может применяться для измерения ADA и препаратов против TNFα. Чувствительность метода (в диапазоне мкг/мл) при измерении ADA и ADL в сыворотке пациентов выше по сравнению с методами ELISA (в диапазоне мг/мл). Образцы сыворотки здорового контроля не вызывали изменения подвижности F1-меченого ADL, а у 4,3% пациентов, получавших ADL, этим методом были обнаружены ADA. В частности, при таком определении ADA обнаруживались у 9,52% пациентов с 0,4 мкг/мл ADL. Будет проведена дальнейшая оценка нормальных образцов и образцов пациентов с более высокими концентрациями ADL-F1. Хотя образцы сыворотки здорового контроля вызывали изменение подвижности F1-меченого TNF-α, что могло быть вызвано присутствием растворимого свободного рецептора TNF-α, однако среднее значение ADL у пациентов, получавших ADL, было значительно выше (10,8 против 0,76 мкг/мл). Раннее выявление ADA и мониторинг уровня препарата ADL во время лечения пациента ADL позволит врачам оптимизировать дозировку ADL или перейти на другой препарат против TNFα, если нужно, и тем самым оптимизировать процесс лечения заболеваний пациентов.

Пример 7. Определение уровня/концентрации REMICADE™ и антител человека против препарата

В этом примере описан способ определения уровня препаратов против TNFα например, REMICADE™ (инфликсимаб) в образцах сыворотки, а также определения уровня антител человека против препарата, например, антител человека против химерных антител (НАСА) к REMICADE™ (инфликсимаб).

Стадия 1. Определение уровня/концентрации REMICADE™ (инфликсимаб) в образцах

В одном типичном воплощении TNFα метят флуорофором (например, Аlеха₆₄₇), причем флуорофор можно детектировать в видимой области спектра и/или по флуоресценции. Меченый TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции, чтобы связался присутствующий в сыворотке препарат против TNFα. Меченый TNFα также можно инкубировать с известными количествами препарата против TNFα в жидкофазной реакции, чтобы составить стандартную кривую. После инкубации образцы наносят прямо на эксклюзионную колонку. Связывание препарата против TNFα с меченым TNFα приводит к сдвигу пика влево по сравнению с самим меченым TNFα. Концентрацию препарата против TNFα в образце сыворотки можно затем сравнить со стандартной кривой и с контролями.

Определение уровня REMICADE™ (инфликсимаб) в сыворотке пациентов методом SE-HPLC. Рекомбинантный TNFα человека метили флуорофором Alexa Fluor® 488 согласно инструкциям производителя. Меченый TNFα инкубировали с различными количествами REMICADE™ или сыворотки пациента в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы объемом 100 мкл анализировали методом эксклюзионной хроматографии на установке для HPLC. Для мониторинга свободного меченого TNFα и связанного с иммунокомплексом меченого TNFα по времени удержания использовали детектирование флуоресцентной метки. Уровень REMICADE™ в сыворотке рассчитывали по стандартной кривой.

Следующие уравнения имеют отношение к этому определению:

уравнение I: меченый TNFα+REMICADE™→(меченый-TNFα·REMICADE™)_{комплекс}

уравнение II: [REMICADE™]_{в отсут.меченого} TNFα=[( меченый-TNFα·REMICADE™)_{комплекс}

уравнение III: [REMICADE меченый-TNFα·REMICADE™)_{комплекс}/[меченый-TNFα]×[меченый-TNFα].

На стадии 1 известное количество меченого TNFα приводится в контакт с содержащим REMICADE™ образцом сыворотки. Меченый TNFα и REMICADE™ образуют комплекс (меченый-TNFα·REMICADE™), см. уравнение I. Поскольку почти весь REMICADE™ образует комплекс с меченым TNFα, концентрация REMICADE™ перед добавлением меченого TNFα равна измеренной концентрации комплекса меченый-TNFα·REMICADE™, см. уравнение П. Уровень концентрации REMICADE™ вычисляют умножением отношения [(меченый-TNFα*REMICADE™)_{комплекс}]/[меченый-ТNFα] на [меченый-TNFα], см. уравнение III. Отношение [(меченый-TNFα*REMICADE™)_{комплекс}]/ [меченый-TNFα] получают интегрированием площади под кривой для пика комплекса (меченый-TNFα-REMICADE™) на графике интенсивности сигнала в зависимости от времени элюирования при эксклюзионной HPLC и делением этого числа на результат интегрирования площади под кривой для пика меченого TNFα на графике. Концентрация [меченый-TNFα] известна а priori.

Стадия 2. Определение уровня антител человека против химерных антител (НАСА)

В одном типичном воплощении препарат против TNFα, например, REMICADE™, метят флуорофором (например, Аlеха₆₄₇), причем флуорофор можно детектировать в видимой области спектра и/или по флуоресценции. Меченый препарат против TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции, чтобы связались присутствующие в сыворотке НАСА. Меченый препарат против TNFα также можно инкубировать с известными количествами антител против IgG или объединенной положительной сыворотки пациентов в жидкофазной реакции, чтобы составить стандартную кривую. После инкубации образцы наносят прямо на эксклюзионную колонку. Связывание аутоантител с меченым препаратом против TNFα приводит к сдвигу пика влево по сравнению с самим меченым препаратом. Концентрацию НАСА в образце сыворотки можно затем сравнить со стандартной кривой и с контролями.

Определение уровня НАСА в сыворотке пациентов методом SE-HPLC. Очищенный REMICADE™ метили флуорофором. Меченый REMICADE™ инкубировали с различными разведениями объединенной НАСА-положительной сыворотки или разведенной сыворотки пациентов в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы объемом 100 мкл анализировали методом эксклюзионной хроматографии на установке для HPLC. Для мониторинга свободного меченого REMICADE™ и связанного с иммунокомплексом меченого REMICADE™ по времени удержания использовали детектирование флуорес-центной метки. Для определения уровня НАСА использовали соотношение связанного и свободного меченого REMICADE™, как описано ниже.

Методика определения изменения подвижности для измерения НАСА в сыворотке. Принцип этого определения основывается на изменении подвижности комплекса антитела против лекарства, например, НАСА, с А1ехаб47-меченым REMICADE™ по сравнению со свободным А1ехаб47-меченым REMICADE™ методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) вследствие повышения молекулярной массы комплекса. Хроматографию проводили на установке Agilent-1200 HPLC System, используя колонку Bio-Sep 300×7,8 мм SEC-3000 (Phenomenex) с диапазоном фракционирования молекулярных масс 5 000-700000 и подвижной фазой из IxPBS, pH 7,3, при скорости потока 0,5-1,0 мл/мин с детектированием флуоресцентной метки, например, УФ-детекти-рованием при 650 нм. Перед Agilent-1200 HPLC System с колонкой Bio-Sep 300×7,8 мм SEC-3000 находилась аналитическая предколонка Bio-Sep 75×7,8 мм SEC-3000. При каждом анализе на колонку наносили образец объемом 100 мкл. Комплекс между НАСА и меченым REMICADE™ образуется при инкубировании сыворотки от получавших REMICADE™ пациентов с меченым REMICADE™ в элюирующем буфере 1×PBS, pH 7,3, при комнатной температуре в течение 1 часа перед анализом методом SE-HPLC. Следующие уравнения имеют отношение к этому определению:

уравнение IV: REMICADE™+меченый-REMICADE™+НАСА→( REMICADE™·НАСА)_{комплекс}+(меченый-REMICADE™·НАСА)_{комплекс}

уравнение V: [REMICADE™]/[REMICADE™·НАСА_{комплекс}]-[меченый-REMICADE™]/[меченый-REMICADE™·НАСАкомплекс]

уравнение VI: [НАСА]=[REMICADE™·НАСА_{комплекс}]+[меченый-REMICADE™·НАСА_{комплекс}]

уравнение VII: [REMICADE™·НАСА_{комплеке}]=[REMICADE™]×[меченый- REMICADE™·НАСА_{комплекс}]/[меченый-REMICADE™]

уравнение VIII: [меченый-REMICADE™·НАСА_{комплекс}]=[меченый-REMICADE™]×[меченый-REMICADE™·НАСА_{комплекс}]/[меченый-REMICADE™]

уравнение IX: [REMICADE™]_{эффективное-количество}=[REMICADE™]-[НАСА]

Определение уровня/концентрации антител человека к препарату против TNFα. например, НАСА. В образец сыворотки добавляют меченый REMICADE™ известной концентрации. НАСА образуют комплекс либо с REMICADE™, либо с меченым REMICADE™, см. уравнение IV. Концентрация [REMICADE™] определяется на вышеприведенной стадии 1. Отношение [меченый-REMICADE™·НАСА_{комплекс}] к [меченый-REMICADE™] получается интегрированием площади под кривой для комплекса меченый-REMICADE™·HACA и делением этого числа на результат интегрирования площади под кривой для свободного меченого REMICADE™. Отношение [REMICADE™] к [REMICADE™·НАСА_{комплекс}] равно отношению [меченый-REMICADE™] к [меченый-REMICADE™·НАСА_{комплекс}], см. уравнение V. Поскольку НАСА уравновешиваются и образуют комплекс и с REMICADE™, и с меченым REMICADE™, то общее количество НАСА равняется сумме количества комплекса REMICADE™*HACA и комплекса меченый- REMICADE™·НАСА, см. уравнение VI. Поскольку отношение [REMICADE™] к [REMICADE™·НАСА_{комплекс}] равно отношению [меченый-REMICADE™] к [меченый-REMICADE™·НАСА_{комплекс}], то концентрации [REMICADE™·НАСА_{комплекс}] и [меченый-REMICADE™·НАСАкомплекс], соответственно, определяются умножением отношения [меченный-REMICADE™·НАСА_{комплекс}] на концентрацию/количество REMICADE™, определенные на стадии 1, и на концентрацию/количество меченого REMICADE™, известные а priori, см. уравнения VII и VIII. Следовательно, общее количество НАСА равняется сумме (1) [REMICADE™] из стадии 1, умноженной на отношение [меченый-REMICADE™·НАСА_{комплекс}]/[меченый-РЕМ1САДЕ™], и (2) [меченый-REMICADE™], известной a priori, умноженной на отношение [меченый- REMICADE™·НАСА_{комплекс}]/[меченый-REMICADE™].

Определение эффективной концентрации/уровня REMICADE™. Поскольку НАСА образуют комплекс с REMICADE™, то эффективное количество наличного REMICADE™ в образце сыворотки составляет количество REMICADE™, измеренное на стадии 1, минус количество НАСА, измеренное на стадии 2, см. уравнение IX.

Типичные вычисления. У пациента JAG на момент VI 0 [REMICADE™] составляла 7,5 мкг/мл, см. фиг.16 с.Этот результат был получен при прохождении стадии 1 с помощью уравнений I-III. 7,5 мкг/мл равняется 30 нг/4 мкл. Поскольку при измерении на стадии 2 использовалось 4 мкл образца, то в анализируемом образце было в общей сложности 30,0 нг REMICADE™. Отношение [меченый-REMICADE™·HACA_{комплекс}]/[меченый-REMICADE™] у пациента JAG на момент VI 0 составляло 0,25, см. фиг.16b. Добавленный в образец [меченый-REMICADE™] составлял 37,5 нг/100мкл. Поскольку при измерении на стадии 2 использовали 100 мкл меченого REMICADE™, то в анализируемом образце было в общей сложности 37,5 нг меченого REMICADE™. По уравнению VII общее количество комплекса REMICADE™·HACA составило 30 нг, умноженные на 0,25, что равняется 7,5 нг комплекса REMICADE™-HACA. По уравнению VIII общее количество комплекса REMICADE™·НАСА_{комплекс} составило 37,5 нг, умноженные на 0,25, что равняется 9,4 нг комплекса меченый-REMICADE™·HACA. По уравнению VI общее количество НАСА равняется сумме 9,4 нг и 7,5 нг, что равно 16,9 нг НАСА. Эти 16,9 нг НАСА находились в 4 мкл образца. Концентрация [НАСА] составляла 16,9 нг/4 мкл, что равно 4,23 мкг/мл. По уравнению DC эффективное количество REMICADE™ равняется 7,5 мкг/мл REMICADE™ при определении на стадии 1 минус 4,23 мкг/мл НАСА при определении на стадии 2. При таком типичном вычислении эффективная концентрация [REMICADE™] составила 3,27 мкг/мл.

Пример 8. Определение уровня/концентрации HUMIRA™ и антител человека против препарата

В этом примере описан способ определения уровня HUMIRA™ в образцах сыворотки, а также определения уровня антител человека против человеческих антител (НАНА).

Стадия 1. Определение уровня/концентрации HUMIRA™ в образцах

В одном типичном воплощении TNFα метят флуорофором (например, А1ехаб47), причем флуорофор можно детектировать в видимой области спектра и/или по флуоресценции. Меченый TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции, чтобы связался присутствующий в сыворотке препарат против TNFα. Меченый TNFα также можно инкубировать с известными количествами препарата против TNFα в жидкофазной реакции, чтобы составить стандартную кривую. После инкубации образцы наносят прямо на эксклюзионную колонку. Связывание препарата против TNFα с меченым TNFα приводит к сдвигу пика влево по сравнению с самим меченым TNFα. Концентрацию препарата против TNFα в образце сыворотки можно затем сравнить со стандартной кривой и с контролями.

Определение уровня HUMIRA™ в сыворотке пациентов методом SE-HPLC. Рекомбинантный TNFα человека метили флуорофором Alexa Fluor® 488 согласно инструкциям производителя. Меченый TNFα инкубировали с различными количествами HUMIRA™ или сыворотки пациента в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы объемом 100 мкл анализировали методом эксклюзионной хроматографии на установке для HPLC. Для мониторинга свободного меченого TNFα и связанного с иммунокомплексом меченого TNFα по времени удержания использовали детектирование флуоресцентной метки. Уровень HUMIRA™ в сыворотке рассчитывали по стандартной кривой.

Следующие уравнения имеют отношение к этому определению:

уравнение X: меченый TNFα+HUMIRA™→(меченый-ТNFα·НUМIRA™)_{комплекс}

уравнение XI: HUMIRA™→[(меченый-ТNFα·НUМIRA™)_{комплекс}]

уравнение XII: [HUMIRA™]=[(HUMIRA™→(меченый-ТNFα·НUМIRA™)_{комплекс}]/[[меченый-TNFα]×[меченый-TNFα].

На стадии 1 известное количество меченого TNFα приводится в контакт с содержащим HUMIRA™ образцом сыворотки. Меченый TNFα и HUMIRA™ образуют комплекс (меченый-TNFα·HUMIRA™), см. уравнение X. Поскольку почти весь HUMIRA™ образует комплекс с меченым TNFα, концентрация HUMIRA™ перед добавлением меченого TNFα равна измеренной концентрации комплекса меченый-TNFα-HUMIRA™, см. уравнение XI. Концентрацию HUMIRA™ вычисляют умножением отношения [(меченый-ТNFα·НUМIRA™)_{комплекс}]/[меченый-TNFα] на [меченый-TNFα], см. уравнение XII. Отношение [(меченый-ТNFα·НUМIRA™)комплекс]/[меченый-ТNFα] получают интегрированием площади под кривой для меченого TNFα и площади под кривой для комплекса (меченый-TNFα-HUMIRA™) и делением результата интегрирования для комплекса (меченый-TNFα-HUMIRA™) на результат интегрирования для меченого TNFα. Концентрация [меченый-TNFα] известна а priori.

Стадия 2. Определение уровня антител человека против человеческих антител, например, НАНА

В одном типичном воплощении препарат против TNFα, например, HUMIRA™, метят флуорофором (например, Аlеха₆₄₇), причем флуорофор можно детектировать в видимой области спектра и/или по флуоресценции. Меченый препарат против TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции, чтобы связались присутствующие в сыворотке НАНА. Меченый препарат против TNFα также можно инкубировать с известными количествами антител против IgG или объединенной положительной сыворотки пациентов в жидкофазной реакции, чтобы составить стандартную кривую. После инкубации образцы наносят прямо на эксклюзионную колонку. Связывание аутоантител с меченым препаратом против TNFα приводит к сдвигу пика влево по сравнению с самим меченым препаратом. Концентрацию НАНА в образце сыворотки можно затем сравнить со стандартной кривой и с контролями.

Определение уровня НАНА в сыворотке пациентов методом SE-HPLC. Очищенный HUMIRA™ метили флуорофором. Меченый HUMIRA™ инкубировали с различными разведениями объединенной НАНА-положительной сыворотки или разведенной сыворотки пациентов в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы объемом 100 мкл анализировали методом эксклюзионной хроматографии на установке для HPLC. Для мониторинга свободного меченого HUMIRA™ и связанного с иммунокомплексом меченого HUMIRA™ по времени удержания использовали детектирование флуорес-центной метки. Для определения уровня НАНА использовали соотношение связанного и свободного меченого HUMIRA™, как описано ниже.

Методика определения изменения подвижности для измерения НАНА в сыворотке. Принцип этого определения основывается на изменении подвижности комплекса антитела, например, НАНА, с А1ехаб47-меченым HUMIRA™ по сравнению со свободным А1ехаб47-меченым HUMIRA™ методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) вследствие повышения молекулярной массы комплекса. Хроматографию проводили на установке Agilent-1200 HPLC System, используя колонку Bio-Sep 300х7,8 мм SEC-3000 (Phenomenex) с диапазоном фракционирования молекулярных масс 5 000-700000 и подвижной фазой из 1×PBS, pH 7,3, при скорости потока 0,5-1,0 мл/мин с детектированием флуоресцентной метки, например, УФ-детектированием при 650 нм. Перед Agilent-1200 HPLC System с колонкой Bio-Sep 300×7,8 мм SEC-3000 находилась аналитическая предколонка Bio-Sep 75×7,8 мм SEC-3000. При каждом анализе на колонку наносили образец объемом 100 мкл. Комплекс между НАНА и меченым HUMIRA™ образуется при инкубировании сыворотки от получавших HUMIRA™ пациентов с меченым HUMIRA™ в элюирующем буфере IxpBS, pH 7,3, при комнатной температуре в течение 1 часа перед анализом методом SE-HPLC.

Следующие уравнения имеют отношение к этому определению:

уравнение XIII: HUMIRA™+меченый-HUMIRA™+НАНА→ (НUМIRA™·НАНА)_{комплекс}+(меченый-НUМIRA™·НАНА)_{комплекс}

уравнение XIV: [НUМIRA™]/[НUМIRA™·НАНА_{комплекс}]=[меченый-HUMIRA™]/[меченый-НUМIRA™-НАНА_{комплекс}]

уравнение XV: [НАHА]=[НUМIRA™·НАНА_{комплекс}]+[меченый-НUМIRA™·НАНА_{комплекс}

уравнение XVI: [НUМIRA™·НАНА_{комплекс}]=[HUMIRA™]×[меченый-НUМIRA™·НАНА_{комплекс}]/[меченый-НUМIRA™]

уравнение XVII: [меченый-НUМIRA™·НАНА_{комплекс}]=[меченый-HUMIRA™]×[меченый-НUМIRA™·НАНА_{комплекс}]/[меченый-НUМIRA™]

уравнение XVIII: [НUМIRA™]_{эффективное-количество}=[HUMIRA™]-[НАНА]

Вычисления для стадии 2. В образец сыворотки добавляют меченый HUMIRA™ известной концентрации. НАНА образуют комплекс либо с HUMIRA™, либо с меченым HUMIRA™, см. уравнение XIII. Концентрация [HUMIRA™] определяется на вышеприведенной стадии 1. Отношение [меченый-НиМ1РА™·НАНА_{комплекс}] к [меченый-HUMIRA™] получается интегрированием площади под кривой для комплекса меченый-HUMIRA™·HAHA и площади под кривой для меченого HUMIRA™ и делением результата интегрирования для комплекса меченый-НЦМ1РА™·НАНА на результат интегрирования для меченого HUMIRA™. Отношение [HUMIRA™] к [НиМ1РА™·НАНА_{комплекс}] равно отношению [меченый-HUMIRA™] к [меченый-НиМ1РА™·НАНА_{комплекс}]; ^см- уравнение XIV. Поскольку НАНА уравновешиваются и образуют комплекс и с HUMIRA™, и с меченым HUMIRA™, то общее количество НАНА равняется сумме количества комплекса HUMIRA™·НАНА и комплекса меченый-HUMIRA™·НАНА, см. уравнение XV. Поскольку отношение [HUMIRA™] к [HUMIRA™·НАНА_{комплекс}] равно отношению [меченый-HUMIRA™] к [меченый-HUMIRA™·НАНА_{комплекс}], то концентрации [НЦМ1РА™·НАНА_{комплекс}] и [меченый-НиМ1РА™·НАНА_{комплекс}], соответственно, определяются умножением отношения [меченый- HUMIRA™·НАНА_{комплекс}]/[меченый-НЦМ1РА™] на концентрацию [HUMIRA™], определенную на стадии 1, и концентрацию [меченый-HUMIRA™], известную a priori, см. уравнения XVI и XVII. Поскольку НАНА образуют комплекс с HUMIRA™, то эффективное количество наличного HUMIRA™ в образце сыворотки составляет количество HUMIRA™, измеренное на стадии 1, минус количество НАНА, измеренное на стадии 2, см. уравнение XVIII.

Типичные вычисления. У пациента SL 03246013 концентрация [HUMIRA™] составляла 16,9 мкг/мл, см. фиг.25. Этот результат был получен при прохождении стадии 1 с помощью уравнений Х-ХII. 16,9 мкг/мл равняется 67,6 нг/4 мкл. Поскольку при измерении на стадии 2 использовалось 4 мкл образца, то в анализируемом образце было в общей сложности 67,6 нг HUMIRA™. Отношение [меченый-HUMIRA™·НАНА_{комплекс}]/ [меченый-HUMIRA™] у пациента SL03246013 составляло 0,055, см. фиг.25. Добавленный в образец [меченый-HUMIRA™] составлял 37,5 нг/ЮОмкл. Поскольку при измерении на стадии 2 использовали 100 мкл меченого HUMIRA™, то в анализируемом образце было в общей сложности 37,5 нг меченого HUMIRA™. По уравнению XVI общее количество комплекса HUMIRA™·НАНА составило 67,6 нг, умноженные на 0,055, что равняется 3,71 нг комплекса HUMIRA™·HAHA. По уравнению XVII общее количество комплекса меченый-НЦМ1РА™·НАНА составило 37,5 нг, умноженные на 0,055, что равняется 2,06 нг комплекса меченый-НЦМ1КА™·НАНА. По уравнению XV общее количество НАНА равняется сумме 3,71 нг и 2,06 нг, что равно 5,77 нг НАНА. Эти 5,77 нг НАНА находились в 4 мкл образца. Концентрация [НАНА] составляла 5,77 нг/4 мкл, что равно 1,44 мкг/мл. По уравнению XVIII эффективное количество HUMIRA™ равняется 16,9 мкг/мл HUMIRA™ при определении на стадии 1 минус 1,44 мкг/мл НАНА при определении на стадии 2. При таком типичном вычислении эффективная концентрация [HUMIRA™] составила 15,46 мкг/мл.

Пример 9. Определение количества комплекса НАСА или НАНА с REMICADE™ или меченым REMICADE™, HUMIRA™ или меченым HUMIRA™

В этом примере описан способ определения количества комплекса НАСА или НАНА с REMICADE™ или меченым REMICADE™, HUMIRA™ или меченым HUMIRA™ относительно внутреннего стандарта.

При использовании внутреннего контроля, например, Biocytin-Alexa 488, можно идентифицировать и должным образом проанализировать артефакты от сыворотки и вариации от одного эксперимента к другому. Количество внутреннего контроля, например, Biocytin-Alexa 488, составляет от 50 до 200 пг на подлежащих анализу 100 мкл.

Меченый флуорофором (Fl) HUMIRA™ инкубировали с сывороткой пациентов для образования иммунокомплекса. В качестве внутреннего контроля в каждую реакцию включали F1-меченый небольшой пептид, например, Biocytin-Alexa 488. В одном случае для составления стандартной кривой для определения уровня НАНА в сыворотке использовали различные количества антител против IgG человека. В другом случае для составления стандартной кривой для определения уровня НАНА в сыворотке использовали оттитрованную объединенную положительную сыворотку пациентов, которую калибровали по очищенным НАНА. В еще одном случае для получения стандартной кривой для определения уровня НАНА в сыворотке применяли способ, описанный в примере 7. Свободный меченый HUMIRA отделяли от связанного с антителом комплекса по молекулярной массе методом эксклюзионной хроматографии. Для экстраполяции концентрации НАНА по стандартной кривой использовали соотношение свободного меченого HUMIRA к внутреннему контролю для каждого образца. Аналогичная методика применялась для измерения уровня HUMIRA в образцах сыворотки пациентов с меченым TNF-α.

Исходное соотношение меченого препарата, т.е. меченого REMICADE™ или меченого HUMIRA к внутреннему контролю равнялось 100. Как видно из фиг.23 и 24, когда соотношение меченого препарата к внутреннему контролю падает ниже 95, меченый препарат считается комплексированным со связывающим соединением против препарата, например, НАСА или НАНА. Соотношение [меченый препарат] / [внутренний контроль] получали интегрированием площади под кривой для меченого препарата и для внутреннего контроля и последующим делением результата интегрирования для меченого препарата на результат интегрирования для внутреннего контроля.

Пример 10. Определение соотношения между комплексированными препаратами против TNFα и некомплексированными препаратами против TNFα

Соотношение между комплексированным препаратом против TNFα и некомплек-сированным препаратом против TNFα получали интегрированием площади под кривой для комплексированного препарата против TNFα и некомплексированного препарата против TNFα и последующим делением результата интегрирования для комплексированного препарата против TNFα на результат интегрирования для некомплексированного препарата против TNFα.

В одном воплощении некомплексированный препарат против TNFα представлен REMICADE™ на уровне от 0 нг до 100 нг в образце. Количество меченого REMICADE™ составляет около 37,5 нг.

Соотношение меченого препарата против TNFα, например, REMICADE™ или HUMIRA™ к меченому внутреннему контролю получали интегрированием площади под кривой для меченого препарата против TNFα и меченого внутреннего контроля и последующим делением результата интегрирования для меченого препарата против TNFα на результат интегрирования для меченого внутреннего контроля.

Соотношение [(меченый-препарат-против-ТNFα·аутоантитело)_{комплекс}]/[внутренний контроль] получали интегрированием площади под кривой для пика комплекса (меченый- препарат-против-ТNFα-аутоантитело) на графике интенсивности сигнала в зависимости от времени элюирования при эксклюзионной HPLC и делением этого числа на результат интегрирования площади под кривой для пика внутреннего контроля на графике. В некоторых воплощениях меченым препаратом против TNFα является меченый REMICADE™. В некоторых других воплощениях меченым препаратом против TNFα является меченый HUMIRA™.

Пример 11. Определение соотношения между свободным и комплектированным меченым TNFα

В этом примере описан способ определения количества комплекса меченого TNFα с REMICADE™ или HUMIRA™ относительно внутреннего стандарта.

При использовании внутреннего контроля, например, Biocytin-Alexa 488, можно идентифицировать и должным образом проанализировать артефакты от сыворотки и вариации от одного эксперимента к другому. Количество внутреннего контроля, например, Biocytin-Alexa 488, составляет от 1 до 25 нг на подлежащих анализу 100 мкл.

В одном воплощении уровень некомплексированного меченого TNFα составляет от 50 нг до 150 нг в образце. В некоторых случаях количество меченого TNFα составляет около 100,0 нг.

Меченый флуорофором (F1) TNFα инкубировали с сывороткой пациентов для образования иммунокомплекса. В качестве внутреннего контроля в каждую реакцию включали F1-меченый небольшой пептид, например, Biocytin-Alexa 488. Стандартную кривую составляли добавлением известных концентраций очищенного препарата против TNFα, а затем по кривой экстраполировали концентрации в единицах мкг/мл.

Исходное соотношение меченого TNFα к внутреннему контролю равнялось 100. Когда соотношение меченого препарата к внутреннему контролю падает ниже 95, меченый TNFα считается комплексированным с препаратом против TNFα, например, REMICADE™ или HUMIRA™. Соотношение [меченый TNFα]/[внутренний контроль] получали интегрированием площади под кривой для меченого TNFα и для внутреннего контроля и последующим делением результата интегрирования для меченого TNFα на результат интегрирования для внутреннего контроля.

Пример 12. Оптимизация лечения препаратом против TNFα измерением уровня препарата против TNFα и/или антител против препарата (ADA)

В этом примере описаны способы оптимизации лечения препаратом против TNFα, снижения токсичности, связанной с лечением препаратом против TNFα, и/или мониторинга эффективности терапевтического лечения препаратом против TNFα путем измерения количества (например, уровня концентрации) препарата против TNFα (например, уровня свободных терапевтических антител против TNFα) и/или антител против препарата (ADA) (например, уровня аутоантител к препарату против TNFα) в образцах от субъектов, получающих лечение препаратом против TNFα. Соответственно, изложенные в данном примере способы дают информацию, полезную для принятия решений по лечению, например, решения о том, когда или как регулировать или модифицировать (например, повысить или понизить) последующую дозировку препарата против TNFα, когда или как комбинировать препарат против TNFα (например, при повышенной, пониженной или такой же дозировке) с одним или несколькими иммунодепрессивными средствами, такими как метотрексат (МТХ) или азатиоприн, и/или когда или как изменить текущий курс терапии (например, перейти на другой препарат против TNFα).

Исключительно в целях иллюстрации, следующие сценарии дают представление о том, как способы настоящего изобретения по преимуществу обеспечивают оптимизацию терапии и минимизацию или снижение токсичности (например, побочных эффектов), исходя из уровня препарата против TNFα (например, уровня свободных терапевтических антител против TNFα) и/или ADA (например, уровня аутоантител к препарату против TNFα) в образце от субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα. Уровни препарата против TNFα и ADA можно измерить с помощью новых описанных здесь способов.

Сценарий №1. Высокий уровень препарата против TNFα при низком уровне антител против препарата (ADA)

Уровень препарата =10-50 нг/10 мкл; уровень ADA=0,1-2 нг/10 мкл. Образцы пациентов с таким профилем включают образцы пациентов ВАВ и JAA на момент 10-го посещения ("V10"). См. фиг.16b.

Пациентам, получающим лечение препаратом против TNFα и имеющим данный профиль, следует назначать иммунодепрессивные препараты типа азатиоприна (AZA) вместе с препаратом против TNFα (например, инфликсимабом).

Сценарий №2. Средний уровень препарата против TNFα при низком уровне ADA

Уровень препарата=5-20 нг/10 мкл; уровень ADA=0,1-2 нг/10 мкл. Образцы пациентов с таким профилем включают образцы от пациентов DGO, JAG и JJH на момент V10. См. фиг.16b.

Пациентам, получающим лечение препаратом против TNFα и имеющим данный профиль, следует назначать иммунодепрессивные препараты типа азатиоприна (AZA) вместе с более высокой дозой препарата против TNFα (например, инфликсимаба). Специалистам в данной области должны быть известны подходящие более высокие или более низкие дозы, на которые следует перевести текущий курс лечения с тем, чтобы оптимизировать лекарственную терапию, например, последующая доза должна быть по меньшей мере в 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100 раз выше или ниже, чем текущая доза.

Сценарий №3. Средний уровень препарата против TNFα при среднем уровне ADA

Уровень препарата=5-20 нг/10 мкл; уровень ADA=0,5-10 нг/10 мкл. Образцы пациентов с таким профилем включают образцы пациента JMM на момент 10-го посещения ("V10") и пациента J-L на момент 14-го посещения ("V14"). См. фиг.16b.

Пациентам, получающим лечение препаратом против TNFα и имеющим данный профиль, следует назначать другой препарат.В качестве неограничивающего примера:

пациентов на лечении инфликсимабом (IFX) со средним уровнем IFX и ADA (т.е. НАСА) следует перевести на лечение адалимумабом (HUMIRA™).

Сценарий №4. Низкий уровень препарата против TNFα при высоком уровне ADA

Уровень препарата=0-5 нг/10 мкл; уровень ADA=3,0-50 нг/10 мкл. Образцы пациентов с таким профилем включают образцы всех пациентов на момент V14 на фиг.16b.

Пациентам, получающим лечение препаратом против TNFα и имеющим данный профиль, следует назначать другой препарат. В качестве неограничивающего примера: пациентов на лечении инфликсимабом (IFX) с низким уровнем IFX при высоком уровне ADA (т.е. НАСА) следует перевести на лечение адалимумабом (HUMIRA™).

Хотя вышеприведенное изобретение было описано весьма подробно на иллюстрациях и примерах в целях ясности и понимания, специалистам должно быть понятно, что можно производить определенные изменения и модификации в рамках прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, все приведенные здесь ссылки включены путем ссылки во всей полноте в такой же степени, как если бы каждая отдельная ссылка была отдельно включена путем ссылки.

1. Способ определения наличия или уровня лекарственного средства против TNFα в образце, который включает:
(a) контактирование меченого TNFα с образцом, содержащим лекарственное средство против TNFα, с образованием меченого комплекса с лекарственным средством против TNFα;
(b) подвергание меченого комплекса эксклюзионной хроматографии для отделения меченого комплекса от свободного меченого TNFα и для определения количества меченого комплекса и количества свободного меченого TNFα; и
(c) сравнение количества меченого комплекса и количества свободного меченого TNFα, определенных на стадии (b), со стандартной кривой для известных количеств лекарственного средства против TNFα, таким образом определяя наличие или уровень лекарственного средства против TNFα.

2. Способ по п.1, в котором стандартную кривую получают при инкубировании меченого TNFα с известными количествами лекарственного средства против TNFα.

3. Способ по п.1, в котором образец представлен сывороткой.

4. Способ по п.1, в котором лекарственное средство против TNFα выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA® (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций.

5. Способ по п.1, в котором эксклюзионная хроматография представлена эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографией (SE-HPLC).

6. Способ по п.1, в котором меченый TNFα представляет собой меченный флуорофором TNFα.

7. Способ по п.6, в котором флуорофор представляет собой краситель Alexa Fluor®.

8. Способ по п.1, в котором меченый комплекс элюируется первым, а за ним следует свободный меченый TNFα.

9. Способ по п.1, в котором образец берут у субъекта, получающего лечение лекарственным средством против TNFα.

10. Способ определения наличия или уровня аутоантител к лекарственному средству против TNFα в образце, который включает:
(a) контактирование меченого лекарственного средства против TNFα с образцом с образованием меченого комплекса с аутоантителом;
(b) подвергание меченого комплекса эксклюзионной хроматографии для отделения меченого комплекса от свободного меченого лекарственного средства против TNFα и для определения количества меченого комплекса и количества свободного меченого лекарственного средства против TNFα и
(с) сравнение количества меченого комплекса и количества свободного меченого лекарственного средства против TNFα, определенных на стадии (b), со стандартной кривой для известных количеств аутоантител, таким образом определяя наличие или уровень аутоантител.

11. Способ по п.10, в котором стандартную кривую получают при инкубировании меченого лекарственного средства против TNFα с сывороткой, содержащей аутоантитела.

12. Способ по п.10, в котором образец представлен сывороткой.

13. Способ по п.10, в котором лекарственное средство против TNFα выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA® (пертолизумаб-пегол) и их комбинаций.

14. Способ по п.10, в котором аутоантитела выбираются из группы, состоящей из человеческих против антител мыши (НАМА), человеческих против химерных антител (НАСА), человеческих против гуманизированных антител (НАНА) и их комбинаций

15. Способ по п.10, в котором эксклюзионная хроматография представлена эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографией (SE-HPLC).

16. Способ по п.10, в котором меченое лекарственное средство против TNFα представляет собой меченное флуорофором лекарственное средство против TNFα.

17. Способ по п.16, в котором флуорофор представляет собой краситель Alexa Fluor®.

18. Способ по п.10, в котором меченый комплекс элюируется первым, а за ним следует свободное меченое лекарственное средство против TNFα.

19. Способ по п.10, в котором образец берут у субъекта, получающего лечение лекарственным средством против TNFα.

20. Способ по п.10, в котором определяется соотношение свободного меченого лекарственного средства против TNFα к внутреннему контролю, которое используется для определения уровня аутоантител на основе стандартной кривой.

Изобретение относится к медицине, конкретно к психиатрии, и может быть использовано для лабораторной диагностики шизотипического расстройства. Сущность изобретения заключается в определении количества глутамата в сыворотке крови больных эндогенными психозами.

Способ прогнозирования полиорганных нарушений с целью определения оптимального времени проведения остеосинтеза при сочетанной и множественной травме у детей // 2569727

Изобретение относится к медицине, а именно к детской травматологии, и может быть использовано для лечения переломов у детей с политравмой. Для определения оптимального времени проведения остеосинтеза в первые часы после травмы в сыворотке крови определяют концентрации маркеров белка S100 и цистатина С: исходные концентрации белка S100 312,2-587,8 нг/л и цистатина С 832,8-1062 нг/мл с последующим двукратным и более увеличением их в течение 1-4 суток расценивают как проявления тяжелых нарушений метаболизма мозга и почек, оптимизируют общее лечение, проводят отсроченный остеосинтез не ранее 5-7 суток; исходные концентрации белка S100 103,8-292,0 нг/л и цистатина С 541-967 нг/мл с последующим увеличением их менее чем в два раза или снижением в 1-е и последующие сутки расценивают как нарушения метаболизма мозга и почек обратимого функционального характера и оптимальным временем для остеосинтеза считают 1-4 сутки с момента травмы.

Способ диагностики и прогнозирования исхода сепсиса // 2568870

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования исхода сепсиса, включающий определение абсолютного количества эозинофилов (КЭ), отличающийся тем, что КЭ определяют также в динамике на 3-5-е сутки пребывания в отделении реанимации и интенсивной терапии, и если в динамике на 3-5-е сутки КЭ увеличивается в два и более раза по сравнению с 1-2-ми сутками, то прогнозируют благоприятный исход с уже установленным диагнозом сепсис, если существенно не изменяется, то прогнозируют летальный исход у пациентов с сепсисом, при этом заключают, что риск развития летального исхода у пациентов с сепсисом при КЭ менее 120 кл./мкл увеличивается на 62,5% по сравнению с септическими пациентами, которые имеют КЭ более 120 кл./мкл.

Способ определения показаний к трансфузии корректоров плазменно-коагуляционного гемостаза в кардиохирургии // 2568581

Изобретение относится к области медицины, в частности к анестезиологии и реаниматологии, и может быть использовано для определения показаний к трансфузии корректоров плазменно-коагуляционного гемостаза в кардиохирургии.

Способ оценки угрозы развития плода вследствие обострения цитомегаловирусной инфекции на первом триместре гестации, вызывающей снижение синтеза дегидроэпиандростеронсульфата и эстриола // 2567039

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам диагностики, и может быть использовано для оценки угрозы развития плода при обострении цитомегаловирусной инфекции на первом триместре гестации.

Способ дифференциальной диагностики железодефицитной анемии и анемии хронических заболеваний // 2566282

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике. Изобретение представляет способ дифференциальной диагностики железодефицитной анемии и анемии хронических заболеваний, включающий исследование сыворотки крови с помощью иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что определяют уровень гепсидина-25 и при увеличении его значения более 11,8 нг/мл диагностируют анемию хронических заболеваний, а при снижении его значения менее 4,33 нг/мл диагностируют железодефицитную анемию. Изобретение обеспечивает повышение точности и достоверности диагностики анемии хронических заболеваний за счет определения гепсидина-25, являющегося биоактивной частью прогепсидина.

Способ прогнозирования общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом в стадии а // 2565453

Изобретение относится к медицине, в частности к онкогематологии. Предложен способ прогнозирования общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом в стадии A, включающий определение в момент постановки диагноза показателя соотношения абсолютного содержания NK-клеток к абсолютному содержанию клеток ХЛЛ, где при значении показателя соотношения NK-клетки/клетки ХЛЛ равном 0,07 и более прогнозируют благоприятный (выживаемость 5 лет и более), а при значении показателя менее 0,07 - неблагоприятный прогноз жизни больного (выживаемость менее 5 лет).

Способ определения степени эндогенной интоксикации у водолазов // 2565395

Изобретение относится к области медицины, в частности к области морской медицины, может быть использовано в практике водолазной медицины для определения степени эндогенной интоксикации у водолазов.

Способ скрининга агента, пригодного для лечения синдрома сухого глаза и/или поражения роговицы и конъюнктивы, фармацевтическая композиция, полученная с помощью этого способа // 2564912

Изобретение относится к области фармацевтики и представляет собой способ скрининга агента, пригодного для лечения синдрома сухого глаза и/или поражения роговицы и конъюнктивы при синдроме сухого глаза 3-й и более степени, который включает приготовление кроличьей модели поражения роговицы и конъюнктивы путем абразии эпителия роговицы и конъюнктивы инстилляцией раствора n-гептанола в глаз кролика; и введение испытуемого агента в глаз кролика модели и оценку эффекта восстановления ткани роговицы под действием испытуемого агента, в котором наносимый объем раствора n-гептанола составляет всего от 0,03 до 0,05 мл, который капают 2-4 раза, и в котором кролика заставляют моргать 2-4 раза, в котором стадия приготовления дополнительно включает принуждение кролика к закрытию глаза на период от около 1 до около 3 минут после инстилляции раствора n-гептанола в глаз.

Способ качественного определения адаптационной способности к мостовидным конструкциям ортопедических протезов по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента с новообразованиями челюстно-лицевой области // 2564126

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ качественного определения адаптационной способности к мостовидным конструкциям ортопедических протезов по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента с новообразованиями челюстно-лицевой области, причем, если определяют содержание в ротовой жидкости тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (ТИМП 1) в количестве 118,9-145,7 нг/мл и тканевого ингибитора металлопротеиназы 2 (ТИМП 2) в количестве 42,4-56,9 нг/мл, то диагностируют низкую адаптационную способность пациента с новообразованиями челюстно-лицевой области к мостовидным конструкциям ортопедических протезов, а если определяют содержание в ротовой жидкости пациента ТИМП 1 в количестве 68,2-77,4 нг/мл и ТИМП 2 в количестве 21,9-37,7 нг/мл, то диагностируют полную функциональную адаптацию пациента с новообразованиями челюстно-лицевой области к мостовидным конструкциям ортопедических протезов.

Способ диагностики нарушений минерального обмена у работников химического комплекса // 2571508

Изобретение относится к медицине, а именно к медицине труда и описывает способ диагностики нарушений минерального обмена у работников химического комплекса. Способ характеризуется тем, что в сыворотке крови определяют содержание натрия, калия, кальция, магния, фосфора, рассчитывают показатель нарушения минерального обмена как отношение суммы показателей концентрации макроэлементов к количеству исследуемых макроэлементов. При значении показателя нарушения минерального обмена менее 28,446 или более 33,144 диагностируют нарушение минерального обмена. Предложенный способ позволяет с повышенной точностью и достоверностью диагностировать нарушения минерального обмена у работников химического комплекса при массовых обследованиях. Изобретение может использоваться в медицинских учреждениях для диагностики нарушений минерального обмена в случае, если работники химического комплекса предъявляют соответствующие жалобы, для дифференциальной диагностики с другими патологиями. 3 пр.

Способ оценки здоровья морских двустворчатых моллюсков и состояния среды их обитания // 2571817

Изобретение относится к экологии, охране окружающей среды, иммунологии и физиологии, и может быть использовано для оценки здоровья морских двустворчатых моллюсков, подверженных и не подверженных стрессу, и состояния среды их обитания. Для этого у двустворчатых моллюсков берут гемолимфу, разделяют ее на плазму и гемоциты, определяя их фагоцитарную активность. Дополнительно в качестве биомаркеров определяют гемолитическую активность плазмы и концентрацию общего белка в ней. Способ позволяет оценить состояние здоровья морских двустворчатых моллюсков и среды их обитания на основе биоиндикации клеточных и гуморальных факторов гемолимфы моллюсков при упрощении и уменьшении трудоемкости способа. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 пр.

Способ анализа и прогноза развития эпидемической ситуации, вызываемой социально-значимыми воздушно-капельными инфекциями // 2572227

Изобретение относится к области медицины, в частности к эпидемиологии, и предназначено для оценки риска возникновения эпидемической ситуации, вызываемой воздушно-капельной инфекцией. Осуществляют еженедельный отбор проб в границах рассматриваемой территории, определяют количество (К) больных, в отобранных пробах определяют концентрацию (Спроб) РНК вирусных антигенов и инфекционный титр (ИТпроб) вирусного материала и вычисляют среднюю скорость v ¯ t развития эпидемической ситуации по формулам. При удовлетворении условий: Спроб превышает нижнее пороговое значение, а ИТпроб превышает фоновое значение, переходят на ежедневный отбор проб, и при одновременном росте абсолютных величин К, Спроб и ИТпроб риск возникновения эпидемической ситуации оценивают как высокий. Изобретение обеспечивает повышение достоверности в оценке эпидемической ситуации, обусловленной вирусными инфекциями. 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 2 пр.

Способ ранней диагностики эндогенной интоксикации // 2572719

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ ранней диагностики эндогенной интоксикации путем расчета раннего интегрального индекса интоксикации (РИИ), отличающийся тем, что РИИ для мужчин рассчитывается по формуле: а РИИ для женщин рассчитывается по формуле: где Гомоцист. - уровень гомоцистеина в сыворотке крови, мкмоль/л; Цист. С - уровень цистатина С в сыворотке крови, мг/л; вчСРБ - уровень вчСРБ в сыворотке крови, мг/л; причем увеличение РИИ в 2-5 раз и более по сравнению с практически здоровыми людьми свидетельствует о развитии СЭИ. Изобретение обеспечивает увеличение точности диагностики и позволяет ускорить постановку диагноза. 5 табл., 2 пр.

Способ определения биологических резервов адаптации организма к физической нагрузке // 2574901

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии и к спортивной медицине, и может применяться для индивидуализированного определения биологических резервов адаптации организма к физической нагрузке. Сущность способа: в процессе кардиореспираторного теста с анализом газового состава венозной крови выявляют индивидуально для каждого исследуемого четыре физиологических этапа в ответ на физическую нагрузку возрастающей мощности таким образом, чтобы исследуемый достигал максимальной нагрузки не более чем за 15 минут. Первый этап - лактатный, выявляют в момент резкого увеличения уровня содержания лактата крови; второй этап приспособления к физической нагрузке (pH-порог), выявляют в момент снижения рН венозной крови; третий этап, определяющий точку респираторной компенсации, определяют в момент усиления вентиляции, отражающийся возрастанием выделения углекислоты; и четвертый этап - аэробный лимит, соответствующий моменту «апогея» аэробного метаболизма, при котором дальнейшее увеличение образования энергии аэробным путем невозможно. Способ обеспечивает повышение эффективности режима физической реабилитации, а также расширение функциональных возможностей его за счет составления индивидуальных протоколов выполнения нагрузки с постепенно возрастающей мощностью нагрузки не только пациентам с сердечно-сосудистой патологией, но и профессиональным спортсменам и здоровым нетренированным лицам. 5 ил., 2 пр.

Способ неинвазивной диагностики хронического гастродуоденита у детей // 2574914

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики хронического гастродуоденита у детей. Определяют уровень катионного антимикробного пептида β-2-дефензина в кале методом иммуноферментного анализа. При достижении концентрации катионного антимикробного пептида β-2-дефензина в интервале величин от 31,2 нг/г до 87 нг/г диагностируют наличие активного хронического гастродуоденита. При достижении концентрации катионного антимикробного пептида β-2-дефензина равной или более 87 нг/г диагностируют наличие хронического гастродуоденита высокой степени активности. Способ позволяет проводить скрининговые исследования и дифференциальную диагностику тяжести поражения слизистой оболочки желудка при хроническом гастродуодените у детей. 1 табл., 2 пр.

Портативный медицинский прибор для измерения уровня глюкозы в крови (варианты) // 2575322

Изобретение относится к медицинской технике. Портативный медицинский прибор для измерения уровня глюкозы в крови содержит корпус с кассетоприемником, помещаемую в кассетоприемник сменную кассету с тест-лентой и привод, включающий в себя электрический двигатель и передаточный механизм, предназначенный для поворачивания катушки кассеты с тест-лентой таким образом, чтобы тест-лента кассеты наматывалась на катушку с возможностью последовательного использования расположенных на тест-ленте тест-элементов. Передаточный механизм включает в себя червячную передачу и многоступенчатую понижающую передачу. Червяк в червячной передаче находится в зацеплении с червячным колесом. Цилиндрические зубчатые колеса многоступенчатой понижающей передачи расположены между червячным колесом и выходным зубчатым колесом, напрямую соединяемым с катушкой. Каждое из цилиндрических зубчатых колес имеет десять зубьев. Червяк установлен непосредственно на валу электрического двигателя. Цилиндрические зубчатые колеса имеют отличное от линейного взаимное расположение, при котором центры цилиндрических зубчатых колес располагаются в углах треугольника или четырехугольника. Ось вращения вала электрического двигателя расположена косо или перпендикулярно по отношению к осям вращения цилиндрических зубчатых колес. Достигается уменьшение размера передаточного механизма и создаваемого им во время работы шума с одновременным обеспечением достаточного для поворачивания катушки вращающего момента. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

Способ выявления риска расстройства щитовидной железы // 2575560

Изобретение касается способа выявления пациента с риском развития расстройства щитовидной железы в результате лечения в режиме, который истощает лимфоциты. Способ включает определение до лечения наличия антител, направленных против пероксидазы щитовидной железы или микросом щитовидной железы, у пациента. При наличии у пациента данных антител устанавливают, что пациент обладает повышенным риском развития расстройства щитовидной железы. Также изобретение касается способа лечения пациента, страдающего от иммуноопосредованных заболеваний, агентом который истощает лимфоциты, где этот способ включает: (1) идентификацию, имеет ли пациент риск развития расстройства щитовидной железы при лечении, посредством обнаружения антител, направленных против пероксидазы щитовидной железы или микросом щитовидной железы в биологическом образце, полученном от пациента до лечения, агентом, который истощает лимфоциты, где этот пациент находится в группе риска в отношении развития заболевания щитовидной железы, если биологический образец оказывается положительным по указанным антителам; (2) (i) введение агента пациенту, если пациент не имеет риска развития расстройства щитовидной железы после лечения; или (ii) введение агента пациенту, если пациент имеет риск развития расстройства щитовидной железы после лечения, и мониторинг увеличения риска развития щитовидной железы. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.

Способ культивирования одиночной в-клетки // 2575569

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способу культивирования одиночной В-клетки, которая получена из популяции В-клеток экспериментального животного. Для этого проводят совместное культивирование каждой В-клетки с мышиными EL-4 В5 клетками в качестве фидерных клеток и выбор В-клеточного клона, секретирующего антитело, с последующим совместным культивированием в присутствии питательной среды, содержащей ИЛ-1β, ФНОά, ИЛ-10 и один или более компонентов, выбранных из ИЛ-21, клеток золотистого стафилококка штамма Cowans (SAC), B-клеточного фактора активации из семейства фактора некроза опухоли (BAFF), ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6. Таким образом производят выбор В-клетки, пролиферирующей и секретирующей IgG. Также с посмощью поверхностных маркеров могут быть получены меченые IgG+CD19+-, IgG+CD38+-, IgG+CD268+-, IgG-CD138+-, CD27+CD138+- и CD3-CD27+-B-клетки. Группа изобретений позволяет получить индуцированные В-клетки, продуцирующие антитела, и определить специфичность их связывания. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 13 табл., 22 пр.

Способ диагностики возможности заражения новорожденных вирусными гепатитами в и с у беременных женщин, больных этой инфекцией или носителей вирусов // 2575577

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики возможности заражения новорожденных вирусными гепатитами В и С у беременных женщин, больных этой инфекцией или носителей вирусов. Сущность способа состоит в том, что в родах одновременно забирают кровь роженицы из периферической вены, пуповинную кровь, околоплодные воды и грудное молоко, а также кусочек плаценты, в которых методом ПЦР определяют наличие РНК вируса гепатита С или ДНК вируса гепатита В. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность диагностики возможности заражения новорожденных вирусными гепатитами В и С. 2 пр.