Варианты натрийуретического пептида с-типа

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению натрийуретического пептида C-типа (CNP), и может быть использовано в медицине. Получают пептид структуры PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37), который используют для лечения дегенеративных костных патологий, отвечающих на CNP. Изобретение позволяет увеличить по сравнению с нативным CNP время полужизни в плазме за счет пониженной способности связываться с эндопептидазой и пониженной аффинности к рецептору NPR-C при сохранении функциональности CNP. 7 н. и 10 з.п. ф-лы, 83 ил., 17 табл., 19 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США № 61/254563, поданной 23 октября 2009 г., и предварительной заявки на выдачу патента США № 61/180112, поданной 20 мая 2009 г., содержание каждой предварительной заявки включено в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Область изобретения, в общем, относится к вариантам натрийуретического пептида C-типа (CNP), композициям, содержащим варианты CNP, способам получения вариантов CNP и способам применения вариантов CNP для лечения расстройств, отвечающих на CNP, включая без ограничения связанные с костями расстройства, такие как скелетные дисплазии (например, ахондроплазия), и расстройства гладкой мускулатуры сосудов.

Уровень техники

Семейство натрийуретических пептидов состоит из трех структурно родственных пептидов: атриального натрийуретического пептида (ANP) (Genbank, номер доступа NP_006163 для белка-предшественника ANP, NPPA), мозгового натрийуретического пептида (BNP) (GenBank, номер доступа NP_002512 для белка-предшественника BNP, NPPB) и натрийуретического пептида C-типа (CNP) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870 (1990) (GenBank, номер доступа NP_077720 для белка-предшественника CNP, NPPC) (J. Hypertens., 10: 907-912 (1992)). Такие небольшие одноцепочечные пептиды (ANP, BNP, CNP) имеют структуру петли из 17 аминокислот (Levin et al., N. Engl. J. Med., 339: 863-870 (1998)) и играют важные роли во многих биологических процессах. ANP и BNP связываются и активируют рецептор A натрийуретического пептида (NPR-A), также называемый гуанилилциклазой A (GC-A), приводя к более высоким уровням внутриклеточного циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Подобным образом, CNP взаимодействует с NPR-B (GC-B), стимулируя образование цГМФ (J. Hypertens., 10: 1111-1114 (1992)). Третий тип рецептора, NPR-C, связывает каждый из натрийуретических пептидов с высокой аффинностью и функционирует, главным образом, улавливая пептиды из внеклеточного компартмента и откладывая пептиды в лизосомах, где они разрушаются (Science, 238: 675-678 (1987)). ANP и BNP, в основном, продуцируются в мышечных клетках сердца и, как полагают, играют важные роли в гомеостазе сердца и сосудов (Science, 252: 120-123 (1991)). CNP экспрессируется более широко, включая экспрессию в центральной нервной системе, половых путях, костях и эндотелии кровеносных сосудов (Hypertension, 49: 419-426 (2007)).

У человека CNP вначале продуцируется геном предшественника натрийуретического пептида C (NPPC) в виде одноцепочечного, состоящего из 126 аминокислот препрополипептида (Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870 (1990)). Удаление сигнального пептида дает про-CNP, и затем расщепление эндопротеазой фурином приводит к образованию активного 53-аминокислотного пептида (CNP-53), который секретируется и снова расщепляется неизвестным ферментом с образованием зрелого 22-аминокислотного пептида (CNP-22) (Wu, J. Biol. Chem. 278: 25847-852 (2003)). CNP-53 и CNP-22 отличаются по своему распределению, при этом CNP-53 преобладает в тканях, тогда как CNP-22, главным образом, встречается в плазме и спинномозговой жидкости (J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res., 26: 269-297 (2006)). Преобладающая форма CNP в хряще неизвестна. Оба пептида CNP-53 и CNP-22 сходным образом связываются с NPR-B. Кроме того, они оба индуцируют продуцирование цГМФ зависимым от дозы и сходным образом (VT Yeung, Peptides, 17: 101-106 (1996)).

Природный ген и полипептид CNP были описаны ранее. В патенте США № 5352770 описан выделенный и очищенный CNP-22 из головного мозга свиньи, идентичный по последовательности CNP человека, и его применение для лечения сердечно-сосудистых расстройств. В патенте США № 6034231 описан ген и полипептид про-CNP человека (126 аминокислот) и ген и полипептид CNP-53 человека.

Клиренс CNP из внеклеточного пространства происходит благодаря действию связанной с мембраной нейтральной эндопептидазы (NEP), которая быстро разрушает CNP (Biochem. J., 291 (Pt 1): 83-88 (1993)), и благодаря NPR-C, который связывается с CNP и способствует его отложению в лизосомах, где CNP разрушается. Показано, что CNP у здорового человека имеет время полужизни in vivo 2,6 минуты (J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). Низкая концентрация CNP в плазме (J. Bone Moner. Res., 19 (Suppl.1)S20 (2004)) и его коэкспрессия с NPR-B в ряде тканей свидетельствуют, что CNP, главным образом, функционирует посредством аутокринного/паракринного механизма.

Как указано выше, CNP связывается и активирует рецептор натрийуретического пептида B (NPR-B), также называемый гуанилилциклазой B (GC-B), приводя к более высоким внутриклеточным уровням циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Осуществляемая ниже передача сигналов, опосредованная образованием цГМФ, влияет на множество разнообразных биологических процессов, которые включают эндохондральное окостенение. Соответственно, повышенные или пониженные уровни любого из компонентов такого пути могут приводить к аномальному росту костей. Например, результатом нокаута либо CNP, либо NPR-B в мышиных моделях является появление у животных карликового фенотипа с более короткими костями и позвонками. Идентифицированы мутации в NPR-B человека, которые блокируют правильную передачу сигнала CNP и приводят к карликовости (Olney, et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 91(4): 1229-1232 (2006); Bartels, et al., Am. J. Hum. Genet. 75: 27-34 (2004)). Напротив, у мышей, сконструированных так, чтобы они продуцировали повышенные уровни CNP, обнаружены удлиненные кости и позвонки.

Ахондроплазия является результатом аутосомно-доминантной мутации в гене рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR-3), которая вызывает аномалии образования хряща. FGFR-3 в норме оказывает негативное регуляторное влияние на рост хондроцитов и, следовательно, рост костей. При ахондроплазии мутантная форма FGFR-3 является конститутивно активной, что приводит к сильно укороченным костям. И пролиферация, и дифференцировка хондроцитов, по-видимому, нарушаются, что приводит к заметно к укороченному хрящу ростовой пластинки (P. Krejci et al., J. Cell Sci. 118: 5089-5100 (2005)). Эндохондральное окостенение представляет собой процесс, который управляет продольным ростом длинных костей. Существует четыре зоны ростовой пластинки - резервная зона, зона пролиферации, зона гипертрофии и зона кальцификации. В ростовой пластинке NPR-B экспрессируется пролиферативными клетками, тогда как NPR-C экспрессируется гипертрофическими клетками (Yamashite et al., J. Biochem. 127: 177-179 (2000)). При нормальном росте эндохондральной кости хондроциты организуются в колонки и пролиферируют в зоне пролиферации ростовой пластинки. Такие колонки у пациентов с ахондроплазией дезорганизованы. Кроме того, зоной гипертрофии является зона, в которой клетки становятся крупными и в конечном итоге подвергаются апоптозу (лизируются), приводя к инвазии остеоцитов и минерализации. Гипертрофические хондроциты и общий размер зоны у пациентов с ахондроплазией намного меньше, чем у здоровых людей. CNP является агонистом NPR-B, позитивного регулятора хондроцитов и роста костей. Происходящая ниже передача сигналов CNP/NPR-B ингибирует путь FGFR-3 на уровне активируемой митогенами протеинкиназы (MAP K). Ингибирование на уровне MAP K стимулирует пролиферацию и дифференцировку хондроцитов в зонах пролиферации и гипертрофии ростовой пластинки, приводя к росту костей.

У человека активирующие мутации FGFR-3 являются основной причиной наследственной карликовости. Мыши, имеющие активированный FGFR-3, служат в качестве модели ахондроплазии, наиболее распространенной формой скелетных дисплазий, и сверхэкспрессия CNP спасает таких животных от карликовости. Соответственно, CNP и функциональные варианты CNP являются потенциальными терапевтическими средствами для лечения различных скелетных дисплазий.

Терапевтическое применение CNP в настоящее время ограничено его коротким временем полужизни в плазме, которое, как было показано, составляет 2,6 минуты in vivo у человека (J Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). Для того чтобы увеличить концентрацию CNP до уровней выше естественных (примерно 5 пМ), обычно встречающихся в плазме человека, во всех исследованиях на человеке и животных была необходима непрерывная инфузия с использованием системно вводимого CNP. Вариант CNP, имеющий более длительное время полужизни в сыворотке in vivo и проявляющий сходную или повышенную активность по сравнению с CNP дикого типа, важен для разработки методики долговременной терапии. Два механизма, благодаря которым время полужизни CNP снижается в плазме человека, обусловлены разрушением нейтральной эндопептидазой (NEP) и клиренсом за счет рецептора натрийуретического пептида C (NPR-C) (Growth Horm. and IGF Res., 16: S6-S14 (2006)). По имеющимся сведениям модификации пептидов могут повышать резистентность к расщеплению эндопептидазами и экзопептидазами (Amino Acids, 30: 351-367 (2006); Curr. Opin. Biotech., 17: 638-642 (2006)).

Была проведена оценка биологических активностей различных аналогов и производных CNP. Сообщается, что благодаря использованию замены остатком S-метил-Cys остатков Cys₆ и Cys₂₂ показано, что циклизация пептида посредством дисульфидной связи Cys6-Cys22 является важной для активности CNP в стимуляции образования цГМФ (Biochem. Biophys. Res. Comm., 183: 964-969 (1992), также благодаря использованию сканирования аланином идентифицированы аминокислоты, важные для функциональности CNP). Значимое дополнительное усиление активности, как сообщается, достигают в результате совместного присутствия аминокислот Leu₉, Lys₁₀ и Leu₁₁. В патенте США № 5434133 описаны аналоги CNP, включая CNP-22 с заменами в положениях аминокислот 6, 7, 9, 11 или 22, при этом аминокислота выбрана из Cys или Pmp (пентацикломеркаптопропионовой кислоты) в положении 6, Phe, 4-хлор-Phe, 4-фтор-Phe, 4-нитро-Phe или Cha (3-циклогексил-Ala) в положении 7, Gly, Val, Aib или tLeu в положении 9, Leu или Ile в положении 11, и Cys или Pmp в положении 22.

В публикации патента США № 2004/0138134 (в настоящее время патент США 7276481) описаны варианты CNP, содержащие аминокислоты Cys₆-Cys₂₂ CNP-22 («CNP-17»), которые включают по меньшей мере одну замену другой природной аминокислоты в положении 9, 10, 11, 16, 17, 19 или 20, варианты CNP с инсерциями и делециями, такими как добавление остатка His в описанный основной сайт расщепления NEP, между Cys₆ и Phe₇, и способы применения таких вариантов для увеличения размера ростовой пластинки кости в аномальной кости и элонгации аномальной кости. Однако в случае таких варрантов не было получено значимого увеличения активности, которую измеряли по продукции цГМФ, и активность была снижена почти у всех вариантов при исследовании основанным на клетках способом in vitro (пример 7). Кроме того, не было представлено вспомогательных данных, таких как, например, данные о стабильности in vitro или определении in vivo улучшенных фармакокинетических (ФК) свойств, подтверждающих заявленную резистентность к NEP и резистентность к NPR-C аналогов CNP. В патенте США № 6743425 описаны вещества для лечения ахондроплазии, которые активируют NPR-B/GC-B и представляют собой пептиды или низкомолекулярные соединения, включая натрийуретические пептиды C-типа CNP-22 и CNP-53. В публикации PCT № WO 94/20534 описана химера CNP-22 и состоящего из 5 аминокислот C-конца ANP, называемого пептидом васонатрином (VNP), небольшое количество аминокислотных замен и циклические химерные пептиды, которые являются результатом образования дисульфидной или двойной связи.

Способы увеличения времени полужизни других представителей семейства натрийуретических пептидов включают уменьшение аффинности ANP по отношению к NPR-C (патент США № 5846932), использование пентапептидных антагонистов NPR-C (WO 00/61631) и совместное введение ингибиторов NEP, таких как тиорфан и кандоксатрил (Clin. Exp. Pharma. Physiol., 25: 986-991 (1997), Hyperten., 30: 184-190 (1997)). В WO 2004/047871 описаны конъюгаты BNP и вариантов BNP с остатками полиалкиленгликоля, остатками сахаров, остатками полисорбатов, поликатионными остатками и другими гидрофильными полимерными остатками, которые, как сообщается, имеют повышенное время полужизни в кровообращении и применимы для лечения острой застойной сердечной недостаточности.

Однако нет опубликованных сообщений об успешной методике, делающей CNP резистентным к NEP при сохранении его функциональности.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к вариантам натрийуретического пептида C-типа (CNP), которые применимы для лечения связанных с костями расстройств (например, ахондроплазии) и расстройств гладкой мускулатуры сосудов. Изобретение охватывает варианты CNP, имеющие увеличенное время полужизни в сыворотке, например, в результате пониженной способности связываться с нейтральной эндопептидазой (NEP), более высокой резистентности к протеолизу ферментом NEP и/или пониженной аффинности к рецептору натрийуретического пептида C (NPR-C), способствующего клиренсу, при сохранении функциональности CNP.

Последовательность CNP-22 дикого типа человека (называемого в настоящем описании «hCNP22», «wtCNP22» или «CNP22») указана ниже:

(N-конец) Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂ (SEQ ID NO: 1).

Положения 6-22 CNP22 образуют циклический домен посредством дисульфидной связи между Cys6 и Cys22. Показано, что 17-аминокислотная циклическая структура важна для связывания CNP с NPR-B (Schiller, Biochem. Biophys. Res. Commun., 138: 880-886 (1986)). Аминокислотную последовательность положений 6-22 CNP22 в настоящем описании называют «CNP17» (SEQ ID NO: 2).

CNP чувствителен к расщеплению NEP в нескольких участках: Cys6-Phe7, Gly8-Leu9, Lys10-Leu11, Arg13-Ile14, Ser16-Met17 и Gly19-Leu20. В одном варианте изобретение охватывает вариант CNP, который (1) модифицирован для увеличения его общего размера или молекулярной массы, например, до диапазона примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 4 кДа, 4,2 кДа, 4,4 кДа, 4,6 кДа, 4,8 кДа, 5 кДа, 5,2 кДа, 5,4 кДа, 5,6 кДа, 5,8 кДа, 6 кДа, 6,2 кДа, 6,4 кДа или до примерно 7 кДа, 7,2 кДа или примерно 8,2 кДа, и/или (2) модифицирован в некоторых положениях аминокислот, чтобы уменьшить его чувствительность к расщеплению NEP в 1, 2, 3, 4, 5 или всех 6 участках, перечисленных выше. Размер или молекулярная масса варианта CNP могут быть увеличены разными способами, например, посредством конъюгации дополнительных аминокислот и/или других видов химических (например, природных или синтетических полимерных) групп с пептидной последовательностью, например, на N-конце, C-конце и/или боковой цепи (цепях), и/или с использованием природных аминокислот, неприродных аминокислот и/или пептидомиметиков с более объемными боковыми цепями. Вариант CNP необязательно дополнительно конъюгирован с другими функциональными или структурными компонентами. Необязательно в сочетании с любым из описанных в настоящей публикации вариантов может быть введена мутация (мутации) (например, замена(ны), добавление(ия) и/или делеция(ии)) в определенном положении (положениях) CNP22, чтобы уменьшить аффинность вариантов CNP к NPR-C. Могут быть осуществлены дополнительные модификации, не влияющие на резистентность к NEP или активность CNP, например, консервативные замены или другие модификации, известные в данной области.

В одном варианте осуществления изобретения вариант CNP представлен общей формулой: (X)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(Z) (SEQ ID NO: 5), при этом:

вариант CNP содержит одну или несколько модифицированных аминокислот, что может приводить к модифицированным пептидным связям (например, посредством использования изостер пептидной связи) в положении, соответствующем одному или нескольким из следующих остатков CNP: Gly1, Lys4, Gly5, Cys6, Phe7, Gly8, Leu9, Lys10, Leu11, Ile14, Gly15, Ser16, Met17, Gly19, Leu20 и Gly21; и

(x) и (z) независимо могут отсутствовать или могут представлять собой аминокислотную последовательность, полученную из натрийуретического полипептида (например, NPPC, ANP, BNP) или ненатрийуретического полипептида (например, сывороточного альбумина человека (HSA), IgG, и т.д.).

В одном варианте осуществления изобретения вариант CNP содержит: (1) модификацию в положении аминокислоты, соответствующем одному из положений 6, 7 или 8 (Cys6, Phe7 или Gly8) CNP22, (2) необязательно делецию, добавление и/или замену любой или всех аминокислот в положениях 1-5 (Gly1, Leu2, Ser3, Lys4 и Gly5) и (3) необязательно до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных модификаций (делеций, добавлений и/или замен) в положениях, соответствующих положениям 6-22, из которых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 могут быть консервативными заменами или другими заменами, описанными в настоящей публикации, или известные в данной области.

Понятно, что указание конкретного положения аминокислоты номером (например, положение 7 CNP22) относится к соответствующему положению аминокислоты в любом варианте CNP, даже если номер положения в данном варианте CNP был изменен вследствие предшествующих инсерций или делеций. Например, указание «положение 7» или «Phe7» может означать соответствующее положение 2 для варианта CNP, в котором первые пять аминокислот были делетированы. Подобным образом указание «положение 7» может означать соответствующее положение 8 для варианта CNP, в котором одна аминокислота была добавлена к N-концу.

В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящей публикации, вариант CNP может быть циклизован посредством ковалентной связи между положениями, соответствующими положениям 6 и 22 CNP22. Предполагается, что ковалентная связь образована с использованием любых способов, известных в данной области. В другом варианте осуществления изобретения вариант CNP может быть циклизован посредством ковалентной связи, образованной между аминокислотой на N-конце или около N-конца и аминокислотой на C-конце или около C-конца (называемых для такой цели «концевыми» аминокислотами) пептида. В одном варианте ковалентная связь образована между боковыми цепями двух концевых аминокислот или аминокислот в положениях, соответствующих положениям 6 и 22 в CNP22. В другом варианте ковалентная связь образована между боковой цепью одной концевой аминокислоты и концевой группой другой концевой аминокислоты, или между концевыми группами каждой из концевых аминокислот. Например, возможны связи голова-хвост, боковая цепь-боковая цепь, боковая цепь-голова или боковая цепь-хвост в случае ковалентной связи, образованной между концевыми аминокислотами или между аминокислотами в положениях, соответствующих положениям 6 и 22 в CNP22.

В одном варианте осуществления изобретения предлагается вариант CNP, обладающий пониженной аффинностью к NEP и/или более высокой резистентностью к расщеплению под действием NEP и/или увеличенным временем полужизни в сыворотке in vivo, с сохранением при этом функциональности CNP (например, стимуляции продукции цГМФ). NEP предпочтительно узнает субстраты с молекулярной массой меньше чем примерно 3 кДа вследствие ограниченного размера полости ее активного центра (Oefner, J. Mol. Biol., 296: 341-349 (2000)). В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP модифицируют, чтобы увеличить их общую молекулярную массу до диапазона примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 4, 4,6, 5, 5,2, 5,8, 6, 6,4 или 7 кДа, например, добавлением примерно от 0,6 до примерно 5 кДа аминокислот, гидрофильных или водорастворимых полимеров, гидрофобных кислот (включая жирные кислоты) и/или углеводов. В конкретных иллюстративных вариантах осуществления изобретения варианты CNP имеют молекулярную массу примерно от 2,6 кДа до примерно 7 кДа, или примерно от 2,8 кДа до 6 кДа, или примерно от 2,8 кДа до примерно 5,8 кДа. В некоторых вариантах добавляют по меньшей мере примерно 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6 или 1,8 кДа, или вплоть до 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 или 5 кДа, чтобы увеличить общую молекулярную массу варианта CNP, например, до диапазона примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 4 кДа, 4,2 кДа, 4,4 кДа, 4,6 кДа, 4,8 кДа, 5 кДа, 5,2 кДа, 5,4 кДа, 5,6 кДа, 5,8 кДа, 6 кДа, 6,2 кДа, 7,2 кДа, 8,2 кДа или выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие варианты CNP содержат аминокислотную последовательность по меньшей мере примерно на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичную или гомологичную аминокислотам 6-22 CNP22. В других вариантах осуществления изобретения такие варианты CNP содержат замену, инсерцию или делецию 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот с использованием другой природной или неприродной аминокислоты или пептидомиметика. Хотя предполагаются и консервативные, и неконсервативные замены или инсерции в любом положении, введение модификаций может начинаться, например, консервативными заменами в областях, которые, как было выявлено в известном уровне техники, вовлечены в активность CNP или связывание NPR-B, хотя могут быть осуществлены неконсервативные замены в таких областях, в которых, как было показано ранее, допускается модификация.

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP включают CNP, имеющий интактную циклизованную часть между Cys6 и Cys22, и N-концевые и/или C-концевые хвосты, которые содержат примерно 1-40, 1-20, 5-40, 5-35, 10-35, 15-35, 5-31, 10-31 или 15-31 аминокислоту и являются фрагментами, полученными из CNP-полипептида и/или другого полипептида, отличного от CNP. В одном варианте осуществления изобретения такие варианты CNP имеют молекулярную массу в диапазоне примерно от 2,8 кДа до примерно 4, 4,6, 5, 5,2, 5,8, 6, 6,4 или 7 кДа. Неограничивающими примерами таких вариантов CNP являются CNP22 дикого типа или CNP22 с одной или несколькими аминокислотными заменами (например, заменой K4R), имеющий N-концевое и/или C-концевое удлинение, полученное из последовательностей предшественника натрийуретического пептида (например, ANP, BNP или CNP) человека или другого вида, вариант предшественника натрийуретического пептида C (NPPC) с аминокислотными заменами, добавлениями и/или делециями (например, варианты CNP могут представлять собой укорочения CNP-53, которые приводят к получению пептидов с молекулярной массой примерно от 2,8 кДа до 5,8 кДа), или другие полипептиды, отличные от CNP, такие как, например, сывороточный альбумин или белок IgG (например, варианты CNP могут представлять собой химеры CNP, содержащие фрагменты сывороточного альбумина или IgG человека или другого вида).

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP, имеющие общую массу, характеризуемую диапазонами, в общем описанными в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, предназначенные для повышения резистентности к разрушению под действием NEP, представлены общей формулой:

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(b)₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-(h)₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 6), где:

(x) означает синтетическую или природную полимерную группу или их сочетание, при этом неограничивающим примером синтетической полимерной группы является полиэтиленгликоль (ПЭГ, также называемый полиэтиленоксидом (ПЭО)), и неограничивающим примером природной полимерной группы является аминокислотная последовательность, содержащая от 1 до 35 аминокислот и полученная из NPPC или его вариантов с заменами и/или делециями, ANP, BNP или других отличных от CNP (поли)пептидов, таких как, например, сывороточный альбумин, IgG, богатые гистидином гликопротеиды, фибронектин, фибриноген, полипептиды, содержащие цинковые пальцы, остеокрин или фактор роста фибробластов 2 (FGF2);

(z) может отсутствовать или может представлять собой синтетическую или природную полимерную группу или их сочетание, при этом неограничивающим примером синтетической полимерной группы является ПЭГ, и неограничивающим примером природной полимерной группы является аминокислотная последовательность, полученная из натрийуретического полипептида (например, NPPC, CNP, ANP или BNP) или другого, отличного от натрийуретического полипептида (например, сывороточного альбумина или IgG); и

(b) и (h), каждый независимо, может означать Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или любой природной или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, которые не имеют реакционно-способного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Glu или Ser. В одном варианте (b) означает Arg. В другом варианте для повышенной резистентности к NEP (b) не является Gly. В еще одном варианте (h) не является Arg.

Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей, полученных из NPPC или его вариантов включают:

Arg,

Glu-Arg,

Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 7),

Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 8),

Gly-Ala-Asn-Pro-Arg (SEQ ID NO: 9),

Gly-Ala-Asn-Gln-Gln (SEQ ID NO: 10),

Gly-Ala-Asn-Ser-Ser (SEQ ID NO: 11),

Gly-Ala-Asn-Arg-Gln (SEQ ID NO: 12),

Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID NO: 13),

Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID NO: 14),

Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO: 15),

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala (SEQ ID NO: 16),

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg (SEQ ID NO: 17),

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO: 18),

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 19),

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 20)

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 21) и

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 22).

Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей, полученных из других полипептидов, отличных от CNP, таких как, например, ANP, BNP, сывороточный альбумин и IgG, включают:

Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser (SEQ ID NO: 23);

Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 24);

Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 25);

Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 26);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 27);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His (SEQ ID NO: 28);

Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg (SEQ ID NO: 29);

Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr (SEQ ID NO: 30);

Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln (SEQ ID NO: 31) и

Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 32).

В одном варианте N-конец и/или C-конец CNP22 или его варианта независимо могут быть конъюгированы с аминокислотным удлинением, содержащим 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот. В одном варианте аминокислотное удлинение получено из NPPC, CNP53, ANP или BNP. В конкретном варианте аминокислотное удлинение представляет собой Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 33). В родственном варианте такое 15-аминокислотное удлинение добавлено к N-концу с получением варианта CNP формулы Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(b)₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-(h)₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 34).

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP включают wtCNP22 или его вариант (например, вариант, имеющий добавление(ия), делецию(ии) и/или замену(ны), такую как, например, замену K4R) (SEQ ID NO: 35), конъюгированный на N-конце и/или C-конце с гидрофильным полимером (например, ПЭГ), чтобы увеличить общий молекулярный размер до диапазона примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 4, 5, 6 или 7 кДа. Такие варианты CNP необязательно дополнительно конъюгированы на N-конце и/или C-конце с полимерной группой, содержащей, например, аминокислоты, углеводы, гидрофобные кислоты и/или фосфолипиды, неограничивающим примером которых является N-концевое аминокислотной удлинение, содержащее от 1 до 35 или от 5 до 31 аминокислоты. В одном варианте гидрофильный полимерный (например, ПЭГ) остаток размером по меньшей мере примерно 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6 или 1,8 кДа, или вплоть до 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 или 5 кДа добавляют к N-концу и/или C-концу wtCNP22 или его варианта.

Как показано в настоящем описании, конъюгирование гидрофильного или водорастворимого полимера ПЭГ (или ПЭО) с молекулярной массой примерно 0,6 кДа или больше с CNP22 или его вариантами, как правило, заметно повышает резистентность к расщеплению NEP. Однако добавление ПЭГ, даже с такой небольшой молекулярной массой как 0,6 кДа, к wtCNP22 может уменьшать функциональность CNP (например, стимуляцию передачи сигнала цГМФ), а добавление ПЭГ с молекулярной массой больше чем примерно 2 или 3 кДа к CNP22 или его вариантам может уменьшать функциональную активность CNP зависимым от размера образом. Но функциональность CNP (по меньшей мере, сравнимая с функциональностью wtCNP22) сохраняется, когда полимер ПЭГ (или ПЭО) с молекулярной массой примерно от 0,6 кДа до примерно 1,2 кДа, или потенциально примерно до 2 кДа конъюгируют с вариантом CNP, имеющим N-концевое аминокислотное удлинение, в котором по меньшей мере одна относительно крупная аминокислота, которая потенциально может быть положительно заряженной в физиологических условиях (например, аргинин) непосредственно предшествует положению, соответствующему Gly1 в CNP22, например, GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38), ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), R-CNP22 (SEQ ID NO: 40) и R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41).

Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения пегилированные варианты CNP содержат на N-конце CNP22 или его варианта (например, варианта, имеющего замену K4R) аминокислотное удлинение, содержащее по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, при этом полимер ПЭГ конъюгирован с N-концом удлиненного аминокислотами варианта CNP с получением общей массы, в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, для повышенной резистентности к расщеплению NEP. В одном варианте для получения повышенной функциональности CNP такие пегилированные, содержащие аминокислотное удлинение варианты CNP содержат по меньшей мере одну относительно крупную природную или неприродную аминокислоту, которая потенциально может быть положительно заряженной в физиологических условиях, непосредственно предшествующую положению, соответствующему Gly1 в CNP22. В конкретном варианте пегилированные, содержащие аминокислотные удлинения варианты CNP содержат по меньшей мере один остаток аргинина, который непосредственно предшествует положению, соответствующему Gly1 в CNP22.

В дополнение к вариантам CNP, конъюгированным на N-конце и/или C-конце с гидрофильным или водорастворимым полимером, таким как, например, ПЭГ (или ПЭО), изобретение охватывает варианты CNP, конъюгированные с таким полимером на внутреннем участке. Для краткости в настоящем описании ПЭГ (или ПЭО) будет использован в качестве типичного примера гидрофильного или водорастворимого полимера. Возможны различные участки пегилирования варианта CNP, включая без ограничения: (1) пегилирование только на N-конце; (2) пегилирование только на C-конце; (3) пегилирование только на внутреннем участке (например, Lys4); (4) пегилирование на обоих концах: на N-конце и C-конце; (5) пегилирование на N-конце и внутреннем участке и (6) пегилирование на C-конце и внутреннем участке. Для повышенной резистентности к расщеплению под действием NEP и сохранения функциональности CNP в некоторых вариантах общая масса пегилированных вариантов CNP находится в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, в диапазоне примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 4, 5, 6 или 7 кДа. В конкретном варианте CNP17, CNP22, CNP37 (которые определены ниже) или их варианты (включая варианты, имеющие добавления, замены и/или делеции аминокислот) пегилированы только на N-конце. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP пегилированы только на внутреннем участке (например, Lys4). В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP пегилированы на N-конце и внутреннем участке (например, Lys4). В еще одном варианте для лучшей функциональности варианты CNP не пегилированы на участке (например, Lys10) в циклическом домене (соответствующем Cys6-Cys22 в CNP22). Чтобы предотвратить пегилирование на внутреннем участке, Lys4 и/или Lys10 могут быть заменены природной или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не содержит реакционно-способной первичной аминогруппы, такой как, например, Gly, Ser, Arg, Asn, Gln, Asp, Glu или цитруллин (Cit). В конкретном варианте Lys4 и/или Lys10 заменены на Arg. В другом варианте Lys10 не заменен на Arg.

В описании предлагается применение гидрофильных или водорастворимых полимеров (например, молекул ПЭГ), которые могут варьировать по своему типу (например, гомополимер или сополимер; случайный, чередующийся или блок-сополимер; линейный или разветвленный; монодисперсный или полидисперсный), связи (например, гидролизуемая или стабильная связь, такая как, например, амидная, иминная, аминальная, алкиленовая или сложноэфирная связь), участку конъюгирования (например, на N-конце и/или C-конце, предпочтительно не в одном из остатков в циклизованной области CNP (соответствующей остаткам 6-22 CNP22)) и длине (например, примерно от 0,2, 0,4 или 0,6 кДа до примерно 2, 3, 4 или 5 кДа). Гидрофильный или водорастворимый полимер может быть конъюгирован с пептидом CNP с использованием химического способа, основанного на N-гидроксисукцинимиде (NHS) или альдегиде, или другого химического способа, который известен в данной области. Такие варианты CNP могут быть созданы с использованием, например, wtCNP-22 (2,2 кДа); CNP-17, сохраняющий только циклизованную область (остатки 6-22) wtCNP22, варианты CNP, имеющие аминокислотное удлинение на N-конце и/или C-конце CNP22, или варианты с аминокислотными заменами, добавлениями и/или делециями, например, GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), R-CNP22 (SEQ ID NO: 40), R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38) и ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39). В одном варианте осуществления изобретения варианты ПЭГ-CNP, имеющие общую массу в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, содержат монодисперсную линейную группу ПЭГ (или ПЭО), конъюгированную на N-конце и/или C-конце с использованием основанной на NHS или альдегиде химии, или разветвленную на два плеча или три плеча группу ПЭГ, конъюгированную на N-конце и/или C-конце с использованием основанной на NHS химии. Изобретение дополнительно предполагает отрицательно заряженные варианты ПЭГ-CNP, предназначенные для пониженного почечного клиренса, включая без ограничения карбоксилированные, сульфатированные и фосфорилированные соединения.

В родственном варианте осуществления изобретения предлагаются конъюгаты ПЭГ-CNP, содержащие основанный на NHS или альдегиде ПЭГ формулы (CH₂CH₂O)_n, где n означает целое число от 12 до 50, и полимер ПЭГ имеет молекулярную массу вплоть до примерно 2,5 кДа. В конкретном варианте n равно 12 или 24. В одном варианте концевая гидроксильная группа полимера ПЭГ блокирована химически неактивной группой. В конкретном варианте блокирующей группой является алкильная группа, например, низшая алкильная группа, такая как метил.

В дополнительном варианте полимеры ПЭГ или их производные имеют среднечисловую молекулярную массу полимера в диапазоне примерно от 0,4 кДа до примерно 2,5 кДа или примерно от 0,6 кДа до примерно 1,5 кДа.

В следующем варианте пептид wtCNP или пептид варианта CNP конъюгирован с компонентом, включая, например, бисфосфонаты, углеводы, гидрофобные кислоты (включая жирные кислоты) или аминокислотные последовательности. Такие аминокислотные последовательности включают, например, поли-Asp или поли-Glu, применимые для целенаправленного воздействия на кости/хрящи, или могут быть получены из белков костей с известными направляющими к костям доменами или их производных, такие как, например, слитые белки или пептидные последовательности остеопонтина, остеокальцина, сиалопротеина и т.д. В описанных в настоящей публикации вариантах, в которых CNP22 или его вариант связан с направляющим к кости или хрящу остатком, такой остаток предназначен для стимуляции поступления модифицированного пептида CNP к хондроцитам ростовых пластинок кости, где пептид может связывать и активировать NPR-B на хондроцитах.

В другом варианте осуществления изобретения предлагаются варианты CNP с пептидной связью, которая менее чувствительна к расщеплению пептидазами, включая NEP. Изобретение охватывает вариант CNP, содержащий по меньшей мере один модифицированный остаток на участке расщепления эндопептидазой. В одном варианте пептидная связь Cys6-Phe7 (-C(=O)-NH-) на участке расщепления NEP в CNP может быть заменена любой из следующих изостер пептидной связи:

-CH₂-NH-,

-C(=O)-N(R)-, где амидная группа алкилирована любой из следующих групп R: метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, циклопропилом, н-бутилом, изобутилом, втор-бутилом или трет-бутилом,

-C(=O)-NH-CH₂-,

-CH₂-S-,

-CH₂-S(O)_n-, где n равно 1 или 2,

-CH₂-CH₂-,

-CH=CH-,

-C(=O)-CH₂-,

-CH(CN)-NH-,

-CH(OH)-CH₂-,

-O-C(=O)-NH- и

-NHC(=O)NH-.

В другом варианте Phe7 заменен энантиомером D-Phe. В еще одном варианте D-энантиомеры введены в одно или несколько, вплоть до всех 22 положений в wtCNP-22. В следующем варианте Phe7 заменен бета-аминокислотой, такой как 3-амино-2-фенилпропионовая кислота, которая увеличивает длину остова, при этом уменьшая длину боковой цепи. В еще одном варианте изобретение охватывает аналоги Cys в положении Cys6, включая без ограничения гомоцистеин, пеницилламин, 2-меркаптопропионовую кислоту и 3-меркаптопропионовую кислоту.

Даже в присутствии NEP-резистентной связи между Cys6 и Phe7 другие пептидные связи могут быть гидролизованы NEP, включая Gly8-Leu9, Lys10-Leu11, Arg13-Ile14, Ser16-Met17 и Gly19-Leu20. Соответственно, изобретение охватывает аналоги CNP, содержащие изостеры пептидной связи во многих положениях в остове аналогов CNP. В одном варианте аналоги или варианты CNP содержат модификации в более чем одном участке расщепления пептидазой. В следующем варианте осуществления изобретения такой вариант содержит CNP с заменами остатков аминокислот, важных для связывания с активным участком NEP, тем самым повышая резистентность к расщеплению под действием NEP. Один или несколько NEP-связывающих остатков, включая без ограничения Gly8, Gly15, Ser18, Gly19 и/или Gly21, заменяют природными или неприродными аминокислотными остатками большего размера, чтобы уменьшить аффинность к активному участку NEP. В еще одном варианте один или несколько гидрофобных остатков, важных для узнавания NEP, включая без ограничения Phe7, Leu9, Leu11, Ile14, Met17 и Leu20, заменяют природными или неприродными аминокислотами и/или пептидомиметиками, которые уменьшают связывание NEP. В еще одном варианте от одной до пяти первых пяти аминокислот CNP можно делетировать или заменить любыми другими природными аминокислотами или неприродными аминокислотами или пептидомиметиками, или одна или несколько природных или неприродных аминокислот или пептидомиметиков могут быть добавлены в любое одно или все пять первых положений CNP.

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют общую массу в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, для повышенной резистентности к NEP и представлены формулой:

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(a)₄-Gly₅-(b)₆-(c)₇-(d)₈-(e)₉-(f)₁₀-(g)₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-(h)₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-(i)₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-(j)₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 46), где:

(x) может отсутствовать или может быть выбран из группы, состоящей из синтетических соединений, мишенью которых являются кости, таких как, например, бисфосфонаты; аминокислотных последовательностей, применимых для целенаправленного воздействия на кости и хрящи, таких как, например, поли-Asp и поли-Glu; аминокислотных последовательностей, полученных из белков костей с известными направляющими к костям доменами, таких как, например, слитые белки или пептидные последовательности остеопонтина, остеокальцина, сиалопротеина, и т.д.; полимерных или неполимерных молекул, которые уменьшают почечный клиренс, таких как, например, заряженные молекулы ПЭГ; и удлинений, содержащих, например, полимеры (например, ПЭГ), углеводы, гидрофобные кислоты (включая жирные кислоты) и/или аминокислоты, и при этом такие аминокислотные удлинения могут содержать, например, от 1 до 31 или от 1 до 35, или от 5 до 35, или от 10 до 35, или от 15 до 35 аминокислотных остатков, и могут быть получены из NPPC, ANP, BNP, других (поли)пептидов, отличных от CNP, таких как, например, сывороточный альбумин или IgG, или варианты указанных выше полипептидов, имеющие замены, добавления и/или делеции или их сочетания;

(z) может отсутствовать или может быть выбран из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, применимых для целенаправленного воздействия на кости или хрящи, таких как, например, поли-Asp и поли-Glu, аминокислотных последовательностей из направляющих к костям доменов белков костей, таких как, например, остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин, и аминокислотных последовательностей, полученных из других (поли)пептидов, отличных от CNP, таких как, например, ANP или BNP;

(a) может означать Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной, или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (a) означает Arg;

(b) выбран из группы, состоящей из Cys и изостер пептидной связи между Cys6 и Phe7, таких как, например, Cys-CH₂-NH;

(c) выбран из группы, состоящей из L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты; N-алкилированных производных Phe, где N-алкильной группой является метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил; и аналогов Phe, при этом одно или несколько орто-, мета- и/или пара-положений бензольного цикла аналога Phe замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, цианогруппы, неразветвленного или разветвленного C_1-6-алкила, неразветвленной или разветвленной C_1-6-алкоксигруппы, неразветвленного или разветвленного галоген-C_1-6-алкила, C_3-10-циклоалкила, гетероциклила, C_6-14-арила и гетероарила (примеры включают без ограничения тирозин, 3-хлорфенилаланин, 2,3-хлорфенилаланин, 3-хлор-5-фторфенилаланин, 2-хлор-6-фтор-3-метилфенилаланин), или при этом бензольный цикл аналога Phe может быть заменен другой арильной группой (неограничивающие примеры включают 1- и 2-нафтилаланин) или гетероарильной группой (неограничивающие примеры включают пиридилаланин, тиенилаланин и фурилаланин);

(d) выбран из группы, состоящей из Gly, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Thr, Ser, Val и Asn;

(e) выбран из группы, состоящей из Leu, Ser, Thr и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(f) может означать Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (f) не является Arg;

(g) выбран из группы, состоящей из Leu и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(h) выбран из группы, состоящей из Ile, tBu-Gly и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Ile;

(i) выбран из группы, состоящей из Met, Val, Asn, бета-Cl-Ala, 2-аминомасляной кислоты (Abu) и 2-аминоизомасляной кислоты (Aib); и

(j) выбран из группы, состоящей из Leu, норлейцина (Nle), гомолейцина (Hleu), Val, трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu.

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP содержит модификацию в одном или нескольких положениях 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19 и/или 20, и необязательно могут иметь модификации в любом из других положений, описанных в настоящей публикации.

В вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящей публикации, в которых CNP22 или его варианты могут быть связаны с гидрофобной кислотой, пептиды CNP могут быть связаны с одной или несколькими гидрофобными кислотами. Неограничивающие примеры гидрофобных кислот включают насыщенные или ненасыщенные C₅-C₁₂-карбоновые кислоты с неразветвленной цепью или разветвленной цепью (например, пентановую кислоту, гептановую кислоту и т.д.) и природные жирные кислоты. Гидрофобные кислоты могут быть связаны с N-концом, C-концом и/или боковой цепью одного или нескольких аминокислотных остатков. В одном варианте гидрофобные кислоты конъюгированы с N-концом. В одном варианте конъюгирование CNP22 или его варианта с гидрофобной кислотой предназначено, наряду с прочим, для стимуляции неспецифичного взаимодействия между модифицированным пептидом CNP и сывороточным альбумином, с увеличением в результате этого размера пептида CNP и защитой его от расщепления протеазами, такими как, например, NEP. Предполагается, что взаимодействие между конъюгированным с гидрофобной кислотой пептидом CNP и альбумином не является слишком сильным, так что модифицированный пептид CNP может диффундировать через хрящ, достигать хондроцитов ростовой пластинки кости и связывать и активировать NPR-B.

В следующем варианте осуществления изобретения предлагаются варианты CNP, которые in vitro или in vivo стимулируют продукцию цГМФ на уровне, составляющем по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% или 150% от уровня цГМФ, продуцируемого при такой же концентрации wtCNP22 (например, 1 мкМ), содержат по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту в положении (b)₆, (c)₇ и/или (d)₈ и представлены общей формулой:

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(a)₄-Gly₅-(b)₆-(c)₇-(d)₈-(e)₉-(f)₁₀-(g)₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-(h)₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-(i)₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-(j)₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 47), где:

(x) может отсутствовать или может представлять собой пептидную последовательность, содержащую от одной до пяти аминокислот, которые получены из натрийуретического полипептида (например, NPPC, CNP, ANP или BNP) или ненатрийуретического полипептида, которые описаны в настоящей публикации (например, HSA, IgG, направляющий к кости белок и т.д.);

(z) может отсутствовать или может быть выбран из группы, состоящей из синтетических соединений, мишенью которых являются кости, таких как, например, бисфосфонаты; аминокислотных последовательностей, применимых для целенаправленного воздействия на кости/хрящи, таких как, например, поли-Asp и поли-Glu; белков костей с направляющими к костям доменами и их производных, таких как слитые белки или пептидные последовательности остеопонтина, остеокальцина и сиалопротеина; молекул, которые снижают почечный клиренс, таких как, например, заряженные ПЭГ; и молекул, которые повышают резистентность CNP к опосредованному NEP расщеплению, которые описаны в настоящей публикации;

(a) может означать Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной, или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, которые не имеют химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (a) означает Arg;

(b) может быть Cys или дезкарбоксицистеином, или пептидная связь (b)₆-(c)₇ (-C(=O)-NH-) может быть заменена любой одной из следующих изостер пептидной связи:

-CH₂-NH-,

-C(=O)-N(R)-, где амидная группа алкилирована любой из следующих R-групп: метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, циклопропилом, н-бутилом, изобутилом, втор-бутилом или трет-бутилом,

-C(=O)-NH-CH₂-,

-CH₂-S-,

-CH₂-S(O)_n-, где n равно 1 или 2,

-CH₂-CH₂-,

-CH=CH-,

-C(=O)-CH₂-,

-CH(CN)-NH-,

-CH(OH)-CH₂-,

-O-C(=O)-NH-, или

-NHC(=O)NH-;

(c) выбран из группы, состоящей из L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты; изостер пептидной связи Phe, таких как N-алкилированные производные Phe, в которых N-алкильная группа выбрана из группы, состоящей из метила, этила, н-пропила, изопропила, циклопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила; и аналогов Phe, при этом одно или несколько орто-, мета- и/или пара-положений бензольного цикла аналога Phe замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, цианогруппы, неразветвленного или разветвленного C_1-6-алкила, неразветвленной или разветвленной C₁-₆-алкоксигруппы, неразветвленного или разветвленного галоген-C₁-₆-алкила, C_3-10-циклоалкила, C₆-C₁₄-арила, гетероциклила и гетероарила (примеры включают, но без ограничения, тирозин, 3-хлорфенилаланин, 2,3-хлорфенилаланин, 3-хлор-5-фторфенилаланин, 2-хлор-6-фтор-3-метилфенилаланин), или при этом бензольный цикл аналога Phe может быть заменен другой арильной группой (неограничивающие примеры включают 1- и 2-нафтилаланин) или гетероарильной группой (неограничивающие примеры включают пиридилаланин, тиенилаланин и фурилаланин);

(d) выбран из группы, состоящей из Gly, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Val, Ser, Thr и Asn;

(e) выбран из группы, состоящей из Leu, Ser, Thr и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(f) означает любую природную или неприродную аминокислоту или пептидомиметик, которые не имеют химически активной первичной аминогруппы в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (f) не является Arg;

(g) выбран из группы, состоящей из Leu и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(h) выбран из группы, состоящей из Ile, tBu-Gly и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Ile;

(i) выбран из группы, состоящей из Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, 2-аминомасляной кислоты (Abu) и 2-аминоизомасляной кислоты (Aib); и

(j) выбран из группы, состоящей из Leu, норлейцина (Nle), гомолейцина (Hleu), Val, трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg, и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu.

В следующем варианте осуществления изобретения предлагаются варианты CNP, которые in vitro или in vivo стимулируют продукцию цГМФ на уровне, составляющем по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% или 150% от уровня цГМФ, продуцируемого при такой же концентрации wtCNP22 (например, 1 мкМ), имеют общую массу в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, для повышенной резистентности к расщеплению под действием NEP и представлены общей формулой:

(x)-(y)-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-(h)₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 48), где:

(x) означает синтетическую или природную полимерную группу или их сочетание, при этом неограничивающим примером синтетической полимерной группы является полиэтиленгликоль (ПЭГ), и неограничивающим примером природной полимерной группы является аминокислотная последовательность, содержащая от 1 до 35 аминокислот и полученная из NPPC или его вариантов с заменами и/или делециями, ANP, BNP или других отличных от CNP (поли)пептидов, таких как, например, сывороточный альбумин, IgG, богатые гистидином гликопротеиды, фибронектин, фибриноген, полипептиды, содержащие цинковые пальцы, остеокрин или FGF2;

(y) может отсутствовать или представлять собой одну или несколько аминокислот из Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅ (соответствующих положениям 1-5 в CNP22) (SEQ ID NO: 1) и/или замены в одном или нескольких таких положениях с использованием природных или неприродных аминокислот (например, замена K4R);

(h) может означать Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной, или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (h) не является Arg; и

(z) может отсутствовать или может быть синтетической или природной полимерной группой или их сочетанием, при этом неограничивающим примером синтетической полимерной группы является ПЭГ, и неограничивающим примером природной полимерной группы является аминокислотная последовательность, полученная из натрийуретического полипептида (например, NPPC, CNP, ANP или BNP) или ненатрийуретического полипептида (например, сывороточного альбумина или IgG).

В одном варианте (x), (y) и (z) вместе содержат примерно от 10 до примерно 40 или примерно от 15 до примерно 35 аминокислот. В другом варианте (x) означает аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 40 аминокислот или от 1 до 20 аминокислот.

Кроме того, предлагаются варианты CNP, которые in vitro или in vivo стимулируют продукцию цГМФ на уровне, составляющем по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% или 150% от уровня цГМФ, продуцируемого при такой же концентрации wtCNP22 (например, 1 мкМ) и содержат последовательность:

(y)-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂ (SEQ ID NO: 138), где:

(y) содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅ (SEQ ID NO: 1), и/или замены в одном или нескольких из таких положений с использованием природных или неприродных аминокислот (например, замену K4R) и дополнительно содержит гидрофильный или водорастворимый полимер с молекулярной массой примерно от 0,6 кДа до примерно 5 кДа. В одном варианте гидрофильный или водорастворимый полимер конъюгирован с N-концом такого удлиненного аминокислотами варианта CNP. В конкретном варианте гидрофильным или водорастворимым полимером является ПЭГ (или ПЭО).

В еще одном варианте изобретение относится к вариантам CNP, которые in vitro или in vivo стимулируют продукцию цГМФ на уровне, составляющем по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% или 150% от уровня цГМФ, продуцируемого при такой же концентрации wtCNP22 (например, 1 мкМ), при этом варианты CNP содержат N-концевое и/или C-концевое пептидное удлинение, содержащее от 1 до 15 аминокислот, и конъюгированы с гидрофильным или водорастворимым полимером. В одном варианте пептидное удлинение содержит от 5 до 10 аминокислот. В конкретном варианте пептидное удлинение содержит 5 аминокислот. В другом конкретном варианте гидрофильным или водорастворимым полимером является ПЭГ (или ПЭО).

В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP согласно изобретению in vitro или in vivo стимулируют продукцию цГМФ на уровне, составляющем по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% или 150% от уровня цГМФ, продуцируемого при такой же концентрации wtCNP22 (например, 1 мкМ), и содержат по меньшей мере 15-аминокислотный фрагмент, полученный из предшественника натрийуретического пептида C (NPPC), при этом фрагмент по меньшей мере на 70% гомологичен последовательности из NPPC дикого типа, содержащей такое же количество аминокислотных остатков.

В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют общую массу в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа для повышенной резистентности к NEP и представлены формулой:

(x)-(b)₆-(c)₇-(d)₈-(e)₉-(f)₁₀-(g)₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-(h)₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-(i)₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-(j)₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 49), где:

(x) может отсутствовать (т.е. N-концы с -NH₂-группой) или может быть выбран из группы, состоящей из последовательности длиной 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот из пептида Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅ (SEQ ID NO: 1); аминокислотных последовательностей, применимых для целенаправленного воздействия на кости/хрящи, таких как, например, поли-Asp и поли-Glu; направляющих к костям доменов из белков костей, таких как, например, остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин; молекул, которые снижают почечный клиренс, таких как гидрофильные или водорастворимые полимеры, включая без ограничения заряженные молекулы ПЭГ; и остатков, содержащих ПЭГ, углеводы, гидрофобные кислоты, аминокислоты или их сочетания, при этом такие остатки могут представлять собой аминокислотные удлинения, включая без ограничения аминокислотные последовательности, полученные из NPPC или (поли)пептидов, отличных от CNP, таких как, например, BNP, ANP, сывороточный альбумин или IgG;

(z) может отсутствовать или может быть выбран из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, применимых для целенаправленного воздействия на кости/хрящи, таких как, например поли-Asp или поли-Glu; аминокислотных последовательностей, полученных из направляющих к костям белков, таких как, например, остеопонтин, остеокальцин или сиалопротеин; и аминокислотных последовательностей, полученных из NPPC или (поли)пептидов, отличных от CNP, которые описаны в настоящей публикации;

(b) выбран из группы, состоящей из Cys и изостер пептидной связи между Cys6 и Phe7, таких как, например, Cys-CH₂-NH;

(c) выбран из группы, состоящей из L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты; N-алкилированных производных Phe, при этом N-алкильной группой является метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил; и аналогов Phe, при этом одно или несколько орто-, мета- и/или пара-положений в бензольном цикле аналога Phe замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, цианогруппы, неразветвленного или разветвленного C_1-6-алкила, неразветвленной или разветвленной C_1-6-алкоксигруппы, неразветвленного или разветвленного галоген-C_1-6-алкила, C_3-10-циклоалкила, C_6-14-арила, гетероциклила и гетероарила (примеры включают, но без ограничения, тирозин, 3-хлорфенилаланин, 2,3-хлорфенилаланин, 3-хлор-5-фторфенилаланин, 2-хлор-6-фтор-3-метилфенилаланин), или при этом бензольное кольцо аналога Phe может быть заменено другой арильной группой (неограничивающие примеры включают 1- и 2-нафтилаланин) или гетероарильной группой (неограничивающие примеры включают пиридилаланин, тиенилаланин и фурилаланин);

(d) выбран из группы, состоящей из Gly, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Val, Ser, Thr и Asn;

(e) выбран из группы, состоящей из Leu, Ser, Thr, и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(f) может означать Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (f) не является Arg;

(g) выбран из группы, состоящей из Leu и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(h) выбран из группы, состоящей из Ile, tBu-Gly и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Ile;

(i) выбран из группы, состоящей из Met, Val, Asn, бета-Cl-Ala, 2-аминомасляной кислоты (Abu) и 2-аминоизомасляной кислоты (Aib); и

(j) выбран из группы, состоящей из Leu, норлейцина (Nle), гомолейцина (Hleu), Val, трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu.

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют общую массу в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа для повышенной резистентности к NEP и представлены формулой:

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(a)₄-Gly₅-(b)₆-(c)₇-(d)₈-(e)₉-(f)₁₀-(g)₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-(h)₁₄-(i)₁₅-Ser₁₆-(j)₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-(k)₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 50), где:

(x) и (z) независимо могут отсутствовать или могут быть выбраны из группы, состоящей из синтетических соединений, мишенью которых являются кости, таких как, например, бисфосфонаты; аминокислотных последовательностей, применимых для целенаправленного воздействия на кости/хрящи, таких как, например, поли-Asp или поли-Glu; аминокислотных последовательностей, полученных из направляющих к костям доменов белков костей и их производных, таких как, например, слитые белки или пептидные последовательности остеопонтина, остеокальцина, сиалопротеина, и т.д.; остатков, которые уменьшают почечный клиренс, включая без ограничения гидрофильные или водорастворимые полимеры, такие как, например, заряженные молекулы ПЭГ; и остатков, содержащих, например, гидрофильные полимеры (например, ПЭГ), углеводы, гидрофобные кислоты и/или аминокислоты;

(a) может означать Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной, или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (a) является Arg;

(b) выбран из группы, состоящей из Cys и изостер пептидной связи между Cys6 и Phe7, таких как, например, Cys-CH₂-NH;

(c) выбран из группы, состоящей из L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты; N-алкилированных производных Phe, при этом N-алкильной группой является метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил; и аналогов Phe, при этом одно или несколько орто-, мета- и/или пара-положений бензольного цикла аналога Phe замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, цианогруппы, неразветвленного или разветвленного C_1-6-алкила, неразветвленной или разветвленной C_1-6-алкоксигруппы, неразветвленного или разветвленного галоген-C_1-6-алкила, C_3-10-циклоалкила, C_6-14-арила, гетероциклила и гетероарила (примеры включают, но без ограничения, тирозин, 3-хлорфенилаланин, 2,3-хлорфенилаланин, 3-хлор-5-фторфенилаланин, 2-хлор-6-фтор-3-метилфенилаланин), или при этом бензольный цикл аналога Phe может быть заменен другой арильной группой (неограничивающие примеры включают 1- и 2-нафтилаланин) или гетероарильной группой (неограничивающие примеры включают пиридилаланин, тиенилаланин и фурилаланин);

(d) выбран из группы, состоящей из Gly, трет-бутил-Gly, Thr, Ser, Val и Asn;

(e) выбран из группы, состоящей из Leu, Ser, Thr и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(f) может означать Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной, или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (f) не является Arg;

(g) выбран из группы, состоящей из Leu, Asn и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(h) выбран из группы, состоящей из Ile, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Asn и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Ile;

(i) выбран из группы, состоящей из Gly, Arg, Ser и Asn;

(j) выбран из группы, состоящей из Met, Val, Asn, бета-Cl-Ala, 2-аминомасляной кислоты (Abu) и 2-аминоизомасляной кислоты (Aib); и

(k) выбран из группы, состоящей из Leu, норлейцина (Nle), гомолейцина (Hleu), Val, трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Arg, Thr, Ser и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu.

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP могут иметь аминокислотную замену(ны) в одном или нескольких из любых положений 1-22 в CNP22. В одном варианте Gly1 заменен на Arg или Glu. В другом варианте Lys4 заменен на Arg. В еще одном варианте Gly5 заменен на Arg, Gln или Ser. В еще одном варианте Gly15 заменен на Ser, Asn, Arg или Cit. В следующем варианте Gly19 заменен на Ser, Arg или Asn. В еще одном варианте Gly21 заменен на Ser, Thr или Arg.

В одном варианте осуществления изобретения вариант CNP выбран из группы, состоящей из GLSKGC(CH₂NH)FGLKLDRIGSMSGLGC (образованный с использованием дезкарбокси-Cys) (SEQ ID NO: 56), GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 57), GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 136), GLSKGCF-(tBuG)-LKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 58), GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 137) и GLSKGC-[NHCH₂CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC (образованный с использованием 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты) (SEQ ID NO: 59). В следующем варианте существует дисульфидная связь между Cys6, дезкарбокси-Cys или другим содержащим сульфгидрильную группу аналогом цистеина в положении Cys6 и Cys22 любого вариант CNP, описанного в настоящей публикации.

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP содержат аминокислотное удлинение на N-конце и/или C-конце CNP22 или CNP17, включая без ограничения:

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 4);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37, аналог BL) (SEQ ID NO: 60);

AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CA) (SEQ ID NO: 61);

AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CB) (SEQ ID NO: 62);

DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CC) (SEQ ID NO: 63);

RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 40);

ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 38);

GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 64);

GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 65);

GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 66);

GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 67);

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 144)

(иногда называемый «CNP27-HSA» или «HAS-CNP27» в примерах и на фигурах);

SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (аналог CD) (SEQ ID NO: 68) (CNP17, имеющий N-концевой и C-концевой хвосты, полученные из BNP).

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют замену K4R в положении 4 CNP22. Неограничивающие примеры вариантов CNP(K4R) включают:

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог AY) ((SEQ ID NO: 36);

GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CI) (SEQ ID NO: 37);

RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог AZ) (SEQ ID NO: 41);

ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог BA) (SEQ ID NO: 39);

GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CH) (SEQ ID NO: 69); и

GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CG) (SEQ ID NO: 70).

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP, имеющие остаток ПЭГ (или ПЭО) и аминокислотное удлинение на N-конце, содержат аргинин в положении, непосредственно предшествующем положению, соответствующему Gly1 в CNP22. Такие пегилированные варианты CNP предназначены для повышенной резистентности к расщеплению под действием NEP, пониженного связывания с сывороточным альбумином и повышенной функциональной активности CNP (например, активации передачи сигнала цГМФ). Неограничивающие примеры таких пегилированных вариантов CNP включают ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), ПЭО24-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 65), ПЭО12-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 65), ПЭО24-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), ПЭО12-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), ПЭО24-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 37), ПЭО12-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 66), ПЭО24-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 64), ПЭО12-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 64), ПЭО24-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), ПЭО12-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), ПЭО24-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38), ПЭО12-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38), ПЭО24-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), ПЭО12-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), ПЭО24-R-CNP22 (SEQ ID NO: 40), и ПЭО12-R-CNP22 (SEQ ID NO: 40), где ПЭО24 означает монодисперсный полимер ПЭГ 1,2 кДа, и ПЭО12 означает монодисперсный полимер ПЭГ 0,6 кДа. В одном варианте полимер ПЭГ (или ПЭО) связан с N-концом вариантов CNP.

Дополнительные варианты CNP включают, но без ограничения, производные CNP37, имеющие мутацию(ии) в сайте расщепления фурином (подчеркнут), предназначенные для повышения резистентности in vivo к протеазе фурину, и/или имеющие глицин (подчеркнут), предшествующий глутамину, предназначенный для предотвращения образования пироглутамата, включая без ограничения:

GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CS) (SEQ ID NO: 71);

GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CT) (SEQ ID NO: 72);

GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CU) (SEQ ID NO: 73);

GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CW) (SEQ ID NO: 74);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP37, аналог DB) (SEQ ID NO: 75);

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145).

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP представляют собой химеры, содержащие CNP22 и N-концевой пептидный фрагмент, включая без ограничения:

GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CQ) (химера фрагмент богатого гистидином гликопротеида (HRGP)-CNP22) (SEQ ID NO: 76);

GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CR) (химера фрагмент HRGP-CNP22) (SEQ ID NO: 77);

GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CX) (химера фрагмент HRGP-CNP22) (SEQ ID NO: 78);

GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CF) (химера фрагмент IgG₁(Fc)-CNP22) (SEQ ID NO: 79);

GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CY) (химера фрагмент сывороточного альбумина человека (HSA)-CNP22) (SEQ ID NO: 80);

GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CE) (химера фрагмент HSA-CNP22) (SEQ ID NO: 81);

FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CZ) (химера фрагмент «ингибитора NRP C» остеокрина-CNP22) (SEQ ID NO: 82); и

GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог DA) (химера «гепаринсвязывающего домена» FGF2-CNP22) (SEQ ID NO: 83).

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP представляют собой химеры, содержащие N-концевой пептидный фрагмент и CNP22, в котором Lys4 в CNP22 заменен аргинином («CNP22(K4R)»), включая без ограничения:

GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CK) (химера фрагмент IgG₁(F_c)-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 84);

GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CL) (химера фрагмент HSA-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 85;

GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CM) (химера фрагмент фибронектина-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 86);

GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CN) (химера фрагмент фибронектина-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 87);

GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CO) (химера фрагмент фибронектина-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 88); и

GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CP) (химера фрагмент цинкового пальца-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 89).

В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP представляют собой химеры или слитые белки, содержащие пептид CNP или его вариант и отщепляемый пептид или белок или пептидную метку. Примеры отщепляемых белков или пептидов включают без ограничения гистидиновые (например, гекса-His) метки; TAF12: фактор транскрипции человека TAF12; KSI: изомеразу кетостероидов; MBP: связывающий мальтозу белок; β-Gal: β-галактозидазу; GST: глутатион-S-трансферазу; Trx: тиоредоксин; CBD: хитин-связывающий домен; BMPM: мутацию BMP-2, SUMO, CAT, TrpE, стафилококковый белок A, стрептококковые белки, связывающий крахмал, связывающий целлюлозу домен эндоглюканазы A, связывающий целлюлозу домен экзоглюканазы Cex, биотин-связывающий домен, recA, Flag, c-Myc, поли(His), поли(Arg), поли(Asp), поли(Gln), поли(Phe), поли(Cys), зеленый флуоресцирующий белок, красный флуоресцирующий белок, желтый флуоресцирующий белок, синий флуоресцирующий белок, биотин авидин, стрептавидин, эпитопы антител и их фрагменты.

В еще одном варианте осуществления изобретения вариант CNP может быть мономером или димером. В родственном варианте мономеры димерных вариантов CNP могут быть связаны N-концом с N- концом через линкер или без линкера, N-концом с C-концом через линкер или без линкера, или C-концом с C-концом через линкер или без линкера.

Химеры, содержащие фрагмент IgG и CNP22 или его вариант, предназначены, наряду с прочим, для повышенной резистентности к разрушению под действием NEP и пониженного связывания с сывороточным альбумином. Химеры CNP, содержащие поверхностный фрагмент HSA, предназначены, наряду с прочим, для пониженной иммуногенности и пониженного связывания с сывороточным альбумином. Химеры HRGP-CNP22 и HRGP-CNP22(K4R), содержащие катионную богатую гистидином нелизиновую, неаргининовую последовательность на N-конце, предназначены, наряду с прочим, для повышенной стабильности к протеазам. Химеры, содержащие фрагмент остеокрина, предназначены для высвобождения при расщеплении протеазой (например, фурином) фрагмента остеокрина в ростовых пластинках кости, при этом фрагмент может ингибировать клиренс-рецептор NPR-C. Что касается химер, содержащих гепарин-связывающий фрагмент FGF2, то связывание гепарина с фрагментом предназначено для защиты химер от разрушения, что обеспечивает более длительное время полужизни в сыворотке. Химеры, содержащие фрагмент фибронектина, фибриногена или цинкового пальца, предназначены для пониженного связывания с сывороточным альбумином, наряду с другими полезными признаками.

Не имея намерения быть связанными с теорией, предполагают, что вариант CNP с молекулярной массой примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, который имеет повышенную резистентность к расщеплению под действием NEP и имеет сходную или повышенную функциональность (например, связывание с NPR-B и стимуляцию передачи сигнала цГМФ) по сравнению с wtCNP22, может быть более эффективным, если он тесно не связан с белками плазмы, такими как сывороточный альбумин. Вариант CNP, который тесно не связан с белками плазмы (например, сывороточным альбумином), может более эффективно диффундировать через хрящ, достигая хондроцитов ростовых пластинок кости, и связываться и активировать NPR-B для передачи сигнала цГМФ. В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP, предназначенные для пониженного связывания с белками плазмы (например, с сывороточным альбумином), представляют собой химеры, содержащие CNP22 или его вариант и пептидный фрагмент из IgG. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP, предназначенные для пониженного связывания с белками плазмы, представляют собой химеры, содержащие CNP22 или CNP22(K4R) и фрагмент из полипептида (например, IgG, HSA, фибронектина, фибриногена, содержащего цинковые пальцы полипептида и т.д.). В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP, предназначенные для пониженного связывания с белками плазмы, содержат CNP22 или его вариант, конъюгированный с гидрофильным или водорастворимым полимером. В одном варианте гидрофильным или водорастворимым полимером является ПЭГ (или ПЭО). В другом варианте гидрофильный или водорастворимый полимер (например, ПЭГ) функционализируют одной или несколькими функциональными группами, которые придают отрицательный заряд полимеру в физиологических условиях, такими как карбоксильная, сульфатная или фосфатная группы или их сочетание.

В любом из вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящей публикации, варианты CNP могут обладать по существу такой же или лучшей биологической активностью, чем CNP22 дикого типа. Например, варианты CNP могут сохранять по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше активности CNP22 дикого типа, или могут обладать большей активностью, чем CNP22, например, в отношении к взаимодействию с NPR-B (GC-B), стимулируя образование цГМФ. Альтернативно или дополнительно варианты CNP могут сохранять по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше активности CNP22 дикого типа или могут обладать большей активностью, чем CNP22 в отношении регуляции роста эндохондральных костей и активности хондроцитов, включая без ограничения пролиферацию хондроцитов, дифференцировку хондроцитов, ингибирование пути передачи сигнала активируемой митогенами протеинкиназы (MAP)/киназы MEK (Raf-1) и стимуляцию эндохондральной оссификации. В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящей публикации, варианты CNP могут содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше идентична или гомологична аминокислотам 6-22 или 1-22 CNP22 дикого типа.

В следующем варианте изобретение относится к вариантам CNP22, обладающим меньшей аффинностью к клиренс-рецептору NPR-C при сохранении способности связывать и активировать NPR-B. Настоящее изобретение охватывает варианты, которые были созданы или могут быть созданы, исходя из основанной на гомологии структурной модели комплекса NPR-B/CNP, как описано в подробном описании. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют замену(ны) в одном или нескольких Gly-сайтах в положениях 1, 5, 8, 15, 19 и 21, чтобы уменьшить конформационную гибкость, которая может увеличивать специфичность их связывания с NPR-B по сравнению с NPR-C. Варианты CNP, обладающие потенциально пониженной аффинностью к NPR-C, включают, но без ограничения, варианты, имеющие одну или несколько из следующих замен: G1R, G1E, G5R, G5Q, G5S, F7Y, G8T, G8S, G8V, G8N, L9S, L9T, K10Cit, K10Q, K10S, I14N, G15R, G15S, G15N, G15Cit, S16Q, M17V, M17N, G19S, G19R, G19N, L20V, L20R, L20T, L20S, G21S, G21T и G21R.

В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют модификацию и/или замену в одном или нескольких положениях 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 19, 20 и 21 и могут необязательно иметь модификации и/или замены в любом другом положении, описанном в настоящей публикации. В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP необязательно могут иметь конъюгацию(ии) или удлинение(ия), например, на N- и/или C-конце, чтобы облегчить целенаправленное воздействие на кости/хрящи, уменьшить почечный клиренс и/или повысить резистентность к расщеплению под действием NEP. Такие конъюгация(ии) или удлинение(ия) могут содержать молекулы или последовательности, образованные или полученные, например, из поли-Asp, поли-Glu, направляющих к костям и хрящу пептидов, остеопонтина, остеокальцина, сиалопротеина, ПЭГ, углеводов, гидрофобных кислот, NPPC или (поли)пептидов, отличных от CNP, или их сочетаний.

В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP получают способами стандартного твердофазного синтеза пептидов с использованием природной или неприродной аминокислоты (аминокислот) или пептидомиметика(ов), используемых в соответствующих случаях для замещения и/или добавления. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP получают способами синтеза рекомбинантов, например, посредством слитых белков, содержащих метку или белок-носитель, при этом использование метки или белка-носителя, например, облегчает выявление, выделение и/или очистку слитого белка, и избирательное химическое или протеолитическое отщепление метки или белка-носителя от слитого белка дает целевой вариант CNP. В следующем варианте пегилирование вариантов CNP происходит после или является частью химического или биологического синтеза, при этом реакцию конъюгации осуществляют с использованием основанных на NHS- или альдегиде химических способов или других химических способов, известных в данной области. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP содержат дисульфидную связь. В родственном варианте дисульфидная связь образует циклический пептид. В конкретном варианте дисульфидная связь образована между остатками цистеина в положениях, соответствующих положениям 6 и 22 в CNP22.

Кроме того, предполагается, что варианты CNP могут быть конъюгированы с гидрофобным полимерным или неполимерным остатком, таким как, например, гептановая кислота, пентановая кислота или жирные кислоты. Гидрофобный остаток может быть конъюгирован с боковой цепью аминокислотного остатка, включая без ограничения лизин, серин, цистеин или треонин, или может быть связан с N-концом и/или C-концом варианта CNP.

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP, которые описаны в настоящем описании, имеют значение pI в диапазоне примерно от 8 до примерно 10,5 или примерно от 8,5 до примерно 10.

В следующем варианте осуществления изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая вариант CNP, необязательно другое биологически активное средство и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель. В некоторых вариантах композиции представляют собой стерильные фармацевтические композиции, подходящие для парентеральной инъекции. В некоторых вариантах композиции содержат по существу очищенный вариант CNP, например, по меньшей мере, очищенный примерно на 90% или 95%. В некоторых вариантах композиции содержат менее чем примерно 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0,5% примесей, таких как другие белки человека, белки свиней или CNP53 или их фрагменты (отличные от требуемого варианта CNP). В некоторых вариантах стерильную композицию вводят субъекту для лечения или профилактики любого из отвечающих на CNP состояний или расстройств, описанных в настоящей публикации.

Варианты CNP согласно изобретению преимущественно сохраняют активность CNP и имеют увеличенное время полужизни в сыворотке. Сохранение активности CNP может быть показано, например, в виде сохранения требуемого биологического эффекта in vivo или сохранения по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или по меньшей мере примерно 100% активности CNP22 в стимуляции цГМФ в такой же концентрации (например, 1 мкм пептида CNP или больше чем ED80). В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP проявляют по меньшей мере примерно 1,5-кратное, 2-кратное, 3-кратное, 4-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 15-кратное, 20-кратное, 25-кратное, 30-кратное, 35-кратное или 40-кратное увеличение времени полужизни в сыворотке по сравнению с CNP22.

В родственном варианте осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, обладают повышенной резистентностью к NEP и имеют увеличенное время полужизни по сравнению с CNP22 дикого типа. В одном варианте время полужизни вариантов CNP увеличено примерно на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или примерно 100% по сравнению с CNP22 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, увеличивают продукцию цГМФ in vitro, увеличивают продукцию цГМФ in vivo, увеличивают in vivo уровень одного или нескольких биомаркеров, ассоциированных с образованием или ростом хряща или кости, увеличивают резистентность к расщеплению NEP in vitro, увеличивают время полужизни в плазме или сыворотке in vivo, увеличивают биодоступность in vivo или увеличивают длину конкретных костей in vivo, или вызывают сочетание таких увеличивающих эффектов, примерно 1,5-кратное, примерно 2-кратное, примерно 2,5-кратное, примерно 3-кратное, примерно 3,5-кратное, примерно 4-кратное, примерно 4,5-кратное, или примерно 5-кратное или большее по сравнению с CNP22 дикого типа.

В еще одном варианте изобретение относится к способам лечения состояний или расстройств, отвечающих на CNP, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества варианта CNP или композиции, содержащей вариант CNP, субъекту, нуждающемуся в таком введении. В одном варианте расстройствами, отвечающими на CNP, являются расстройства роста костей, включая без ограничения скелетные дисплазии и наследственные аномалии развития скелета, такие как расстройства, ассоциированные с мутациями рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR-3). В конкретном варианте расстройством, ассоциированным с мутацией(ями) FGFR-3, является ахондроплазия. В другом варианте расстройствами, отвечающими на CNP, являются расстройства, ассоциированные с клетками и тканями гладкой мускулатуры сосудов. В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP применимы для увеличения размера ростовой пластинки кости (например, кости конечности). В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP применимы для удлинения кости или увеличения роста трубчатых костей. В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP применимы для усиления образования матрикса, пролиферации и дифференцировки хондроцитов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, вводят в дозе в диапазоне примерно от 5 или 10 нмоль/кг до примерно 300 нмоль/кг, или примерно от 20 нмоль/кг до примерно 200 нмоль/кг. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP вводят в дозе примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 или 2000 нмоль/кг или другой дозе, подходящей по мнению лечащего врача. В других вариантах осуществления изобретения варианты CNP вводят в дозе примерно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 или 800 мкг/кг, или примерно 1 мг/кг, 1,25 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг или другой дозе, подходящей по мнению лечащего врача. Дозы вариантов CNP, описанных в настоящей публикации, можно вводить согласно частоте дозирования/частоте введения, описанной в настоящей публикации, включая без ограничения ежедневное введение, введение 2 или 3 раза в неделю, еженедельно, каждые 2 недели, каждые 3 недели, ежемесячно, и т.д.

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP вводят в виде однократного лечения или в виде множественных доз. Множественные дозы можно вводить ежедневно или в виде нескольких доз на протяжении курса лечения. В некоторых вариантах предполагается, что вариант CNP вводят в виде однократной дозы или множественных доз ежедневно, через день, каждые 3 дня, 2 раза в неделю, 3 раза в неделю, еженедельно, раз в две недели, каждые 3 недели, ежемесячно, каждые 6 недель, каждые 2 месяца, каждые 3 месяца или с использованием подходящей по мнению лечащего врача схемы.

В некоторых вариантах введение варианта CNP корректируют так, чтобы обеспечить периоды роста (например, хондрогенеза) с последующим периодом регенерации (например, остеогенеза). Например, вариант CNP можно вводить подкожно, внутривенно или другим путем ежедневно или несколько раз в неделю в течение определенного периода времени с последующим периодом без лечения, затем цикл повторяют. В некоторых вариантах начальный период лечения (например, введение варианта CNP ежедневно или несколько раз в неделю) продолжается в течение 3 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель или 12 недель. В родственном варианте период без лечения длится в течение 3 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель или 4 недель. В некоторых вариантах используют следующую схему дозирования варианта CNP: ежедневно в течение 3 дней с последующими 3 днями без введения; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 1 недели с последующими 3 днями или 1 неделей без введения; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 2 недель с последующей 1 или 2 неделями без введения; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 3 недель с последующими 1, 2 или 3 неделями без лечения; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель с последующими 1, 2, 3 или 4 неделями без лечения.

В дополнительных вариантах изобретение относится к способу лечения отвечающего на CNP состояния или расстройства, включающему в себя введение субъекту пептида или варианта CNP и наблюдение за уровнем по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера у субъекта (например, в биологическом образце, полученном от субъекта), при этом повышение или понижение уровня ассоциированного с костями или хрящами биомаркера свидетельствует о терапевтическом влиянии пептида или варианта на субъекта. В некоторых вариантах, когда уровень биомаркера возрастает ассоциированно с образованием или ростом кости или хряща, повышение уровня такого биомаркера свидетельствует о терапевтическом влиянии пептида или варианта CNP на субъекта. В других вариантах, когда уровень биомаркера снижается ассоциированно с образованием или ростом кости или хряща, снижение уровня такого биомаркера свидетельствует о терапевтическом влиянии пептида или варианта CNP на субъекта.

В следующих вариантах терапевтический способ дополнительно включает в себя корректировку количества (или дозы) или частоты введения пептида или варианта CNP, при этом:

(i) количество (или дозу) или частоту введения пептида или варианта CNP увеличивают, если уровень по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера ниже целевого уровня, когда уровень биомаркера увеличивается ассоциировано с образованием или ростом кости или хряща; или

(ii) количество (или дозу) или частоту введения пептида или варианта CNP снижают, если уровень по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера выше целевого уровня, когда уровень биомаркера увеличивается ассоциированно с образованием или ростом кости или хряща; или

(iii) количество (или дозу) или частоту введения пептида или варианта CNP увеличивают, если уровень по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера выше целевого уровня, когда уровень биомаркера снижается ассоциировано с образованием или ростом кости или хряща; или

(iv) количество (или дозу) или частоту введения пептида или варианта CNP снижают, если уровень по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера ниже целевого уровня, когда уровень биомаркера снижается ассоциировано с образованием или ростом кости или хряща.

Предполагается, что целевой уровень биомаркера относится к уровню или диапазону уровней биомаркера, который ассоциирован с терапевтическим эффектом у субъекта и/или полезным эффектом в отношении облегчения или ослабления симптомов расстройства или состояния. В некоторых вариантах уровень биомаркера выше или ниже целевого уровня может быть вредным для субъекта.

В других вариантах изобретение относится к способу оценки влияния введения пептида или варианта CNP на образование или рост кости или хряща. В одном варианте способ относится к оценке или измерению уровня по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера у субъекта, которому был введен пептид или вариант CNP, чтобы оценить влияние пептида или варианта CNP на образование и рост кости и хряща in vivo. В родственном варианте увеличение уровня по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера может указывать, что введение пептида или варианта CNP оказывает положительное влияние на образование или рост кости или хряща и является лечением, применимым в случае скелетных дисплазий и других связанных с костями или хрящами заболеваний или расстройств, ассоциированных с пониженной активностью CNP. Примеры ассоциированных с костями или хрящами биомаркеров включают, но без ограничения, CNP (например, эндогенный уровень CNP-22 или CNP-53), цГМФ, остеокальцин, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), пропептиды проколлагена типа I (PINP) и их фрагменты, коллаген типа I и его фрагменты, пропептиды коллагена типа II и его фрагменты, коллаген типа II и его фрагменты, аггрекан-хондроитинсульфат и щелочную фосфатазу.

В следующих вариантах изобретение относится к способу оценки влияния пептида или варианта CNP на уровень по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера у субъекта, включающему в себя оценку или измерение уровня ассоциированного с костями или хрящами биомаркера в биологическом образце, полученном от субъекта, которому был введен пептид или вариант CNP. В некоторых вариантах способ дополнительно включает в себя введение пептида или варианта CNP субъекту перед оценкой или измерением уровня ассоциированного с костями или хрящами биомаркера.

В некоторых вариантах по меньшей мере один ассоциированный с костями или хрящами биомаркер выбран из группы, состоящей из CNP (например, эндогенный уровень CNP-22 или CNP-53), цГМФ, пропептидов коллагена типа II и их фрагментов, коллагена типа II и его фрагментов, остеокальцина, ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), пропептидов проколлагена типа I (PINP) и его фрагментов, коллагена типа I и его фрагментов, аггрекана-хондроитинсульфата и щелочной фосфатазы.

В некоторых вариантах способов (например, терапевтических, диагностических и аналитических способов), связанных с ассоциированными с костями или хрящами биомаркерами, пептидом или вариантом CNP является CNP-22, CNP-53 или любой из пептидов и вариантов CNP, описанных в настоящей публикации. В некоторых вариантах таких способов пептид или вариант CNP не является CNP-22 или CNP-53.

В других вариантах изобретение относится к основанному на рекомбинации способу получения варианта CNP, включающему в себя культивирование в среде клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий пептидный вариант CNP, связанный с полинуклеотидом, кодирующим отщепляемый пептид или белок, в условиях, которые приводят к экспрессии слитого полипептида, кодируемого полинуклеотидами. В родственном варианте клетку-хозяина трансформируют экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий пептидный вариант CNP, связанный с полинуклеотидом, кодирующим отщепляемый пептид или белок.

В одном варианте вектором является плазмида. В еще одном варианте плазмида выбрана из группы, состоящей из pET-21a, pJexpress, pET-31b, pET-15b, pET-32a, pET-41a, pMAL, pQE-30, pET-SUMO, pET-22b и pTYB11.

В некоторых вариантах отщепляемый пептид или белок содержит полипептид, который выбран из группы, состоящей из гистидиновой метки, фактора транскрипции TAF12 человека, изомеразы кетостероидов, связывающего мальтозу белка, β-галактозидазы, глутатион-S-трансферазы, тиоредоксина, связывающего хитин домена и мутации BMP-2 или их фрагментов.

В родственном варианте отщепляемый пептид или белок отщепляется расщепляющим агентом. В некоторых вариантах расщепляющий агент выбран из группы, состоящей из муравьиной кислоты, бромистого циана (CNBr), гидроксиламина, самоотщепляемого белка, фактора Xa, энтерокиназы, ProTEV и протеазы SUMO. Дополнительные иллюстративные расщепляющие агенты включают, но без ограничения, палладий, клострипаин, тромбин, химотрипсин, трипсин, трипсиноподобные протеазы, карбоксипептидазу, энтеропептидазу, протеазу Kex 2, протеазу Omp T, субтилизин, протеазу V8, протеазу ВИЧ, протеазу риновирусов, протеазу фурилизина, протеазы IgA, протеазу Pace человека, коллагеназу, протеазу Nia, протеазу 2Apro вируса полиомиелита, протеазу 3C вируса полиомиелита, гененазу, фурин, эластазу, протеиназу K, пепсин, реннин (химозин), аспарагиновые протеазы микроорганизмов, папаин, кальпаин, хемопапаин, фицин (фикаин), бромелаин (бромелазу), катепсин B, каспазы, термолизин, эндопротеазу Arg-C, эндопротеазу Glu-C, эндопротеазу Lys-C, калликреин и плазмин.

В некоторых вариантах слитый полипептид экспрессируется в виде растворимого белка или в виде тельца включения. В родственном варианте изобретение относится к выделению экспрессированного слитого полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды. В следующем варианте изолированный слитый полипептид подвергают контакту с расщепляющим агентом, который описан в настоящей публикации.

В одном варианте изобретение относится к бактериальной клетке-хозяину, содержащей экспрессирующий вектор, при этом указанный вектор содержит полинуклеотид, кодирующий пептид варианта CNP, связанный с полинуклеотидом, кодирующим отщепляемый пептид или белок. В некоторых вариантах отщепляемый пептид или белок выбран из группы, состоящей из гистидиновой метки, фактора транскрипции TAF12 человека, изомеразы кетостероидов, связывающего мальтозу белка, β-галактозидазы, глутатион-S-трансферазы, тиоредоксина, связывающего хитин домена и мутации BMP-2 или их фрагментов.

В другом варианте клеткой-хозяином является бактерия, такая как E. coli. В родственном варианте клетка E. coli выбрана из группы, состоящей из BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pGro7, ArcticExpress(DE3), C41 [также называемой C41(DE3)], C43 [также называемой C43(DE3)], Origami B(DE3), Origami B(DE3)pLysS, KRX и Tuner(DE3). В еще одном варианте клетка-хозяин содержит вектор, который описан выше. В некоторых вариантах клетку-хозяина трансформируют вектором перед культивированием клеток.

В некоторых вариантах предполагается, что клетку-хозяина культивируют в среде в условиях, подходящих для экспрессии слитого полипептида, кодируемого полинуклеотидами. В одном варианте слитый полипептид экспрессируется в виде растворимого белка или в виде тельца включения. В родственном варианте экспрессированный слитый полипептид выделяют из клетки-хозяина или культуральной среды. В еще одном варианте выделенный слитый полипептид подвергают контакту с расщепляющим агентом, который описан в настоящей публикации.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 показана экспрессия слитых белков CNP в E. coli (фиг. 1A: окраска Кумасси синим, фиг. 1B: Вестерн-блот). M: белковый маркер; T: суммарные клеточные лизаты; S: растворимые надосадки; P: 2 мкг CNP22; KSI: экспрессия слитого белка KSI-CNP(M/N) (нерастворимого); N: неиндуцированные суммарные лизаты со слитым белком KSI-CNP; KSI': экспрессия слитого белка KSI-P-CNP (нерастворимого); Trx: экспрессия слитого белка Trx-P-CNP (растворимого); MBP: экспрессия слитого белка MBP-P-CNP (растворимого); TAF: экспрессия слитого белка TAF-P-CNP (нерастворимого) (BL21); TAF': экспрессия слитого белка TAF-P-CNP (нерастворимого) BL21(DE3), где CNP представляет собой Gly-CNP37.

На фигуре 2 показано расщепление муравьиной кислотой телец включения TAF-CNP. M: белковый маркер; 1: положительный контроль Gly-CNP37; 2: нерасщепленные тельца включения TAF-CNP; 3: расщепленные 2% муравьиной кислотой тельца включения TAF-CNP, где CNP представляет собой Gly-CNP37.

На фигурах 3A-E изображена экспрессия слитых белков CNP в E. coli. M: белковый маркер; Tu: суммарные лизаты неиндуцированных клеток; Su: неиндуцированные растворимые надосадки; T: суммарные лизаты индуцированных клеток; S: растворимые надосадки; C1: CNP22; C: Gly-wtCNP37 («CNP38»); P: нерастворимые осадки. A: KSI: экспрессия слитого белка KSI-CNP38(M/N) (нерастворимого); KSI': экспрессия слитого белка KSI-Pro-CNP38 (Pro-Gly-wtCNP37 назван «Pro-CNP38») (нерастворимого); Trx: экспрессия слияния Trx-Pro-CNP38 (растворимого); MBP: экспрессия слитого белка MBP-Pro-CNP38 (растворимого); TAF: экспрессия слитого белка TAF-Pro-CNP38 (нерастворимого) из клеток BL21; TAF': экспрессия слитого белка TAF-Pro-CNP38 (нерастворимого) из клеток BL21(DE3). B: экспрессия слитых белков TAF-Pro-CNP37 и BMP-Pro-CNP37. C: экспрессия слитого белка BMP-Pro-CNP38 и белка BMP. D: Экспрессия слитого белка TAF-Pro-HSA-CNP («Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 188) назван «Pro-HSA-CNP»). E: Экспрессия слитого белка TAF-Pro-CNP38 и белка TAF.

На фигурах 4A-C изображено расщепление муравьиной кислотой телец включения TAF-Pro-CNP38. A: расщепление 50% муравьиной кислотой телец включения TAF-Pro-CNP38. M: белковый маркер; U: нерасщепленные тельца включения TAF-Pro-CNP38; 25°C, 37°C, 42°C, 55°C: тельца включения TAF-Pro-CNP38 расщепляли в 50% муравьиной кислоте при 25°C, 37°C, 42°C или 55°C в течение 24 часов. 37°C-S и 55°C-S: растворимые надосадки после реакций расщепления при 37°C и 55°C, нейтрализованные 10н. NaOH и центрифугированные при 14000 об/мин в течение 15 минут. B: Расщепление 10% и 2% муравьиной кислотой телец включения TAF-Pro-CNP38. M: белковый маркер; U: нерасщепленные тельца включения TAF-Pro-CNP38; C: расщепленный муравьиной кислотой TAF-Pro-CNP38; S: растворимый надосадок после центрифугирования при 14000 об/мин в течение 5 минут без нейтрализации; P: нерастворимый осадок после центрифугирования при 14000 об/мин в течение 5 минут без нейтрализации. C: ЖХ/МС-анализ расщепленных 2% и 10% муравьиной кислотой продуктов из телец включения TAF-Pro-CNP38.

На фигурах 5A-C изображено расщепление муравьиной кислотой телец включения TAF-Pro-CNP38 при разных температурах и разном времени расщепления муравьиной кислотой. M: белковый маркер; C: положительный контроль Gly-wtCNP37 («CNP38»); U: нерасщепленные тельца включения TAF-Pro-CNP38. A: расщепленный 2% муравьиной кислотой TAF-Pro-CNP38 при 42°C, 55°C или 70°C в течение 6, 24 или 48 часов. B: расщепленный 2% муравьиной кислотой TAF-Pro-CNP38 при 55°C, 60°C, 65°C или 70°C в течение 17 или 24 часов. C: ЖХ/МС-анализ расщепленных 2% муравьиной кислотой продуктов из телец включения TAF-Pro-CNP38.

На фигуре 6 показан SDS-ПААГ (окраска Кумасси синим) для экспрессии слитого белка TAF-CNP34. M: белковый маркер; C: контроль [Gly-CNP37 («CNP38»)]; T: суммарные клеточные лизаты; S: надосадок; TI: суммарные лизаты индуцированных клеток; SI: индуцированный надосадок.

На фигуре 7 показан SDS-ПААГ (окраска Кумасси синим) для экспрессии слитых белков TAF-NL-(C/A и 6D/6E)-Pro-CNP38, TAF(C/A и 10D/10E)-Pro-CNP38, и TAF-Pro-CNP53, где «Pro-CNP38» означает Pro-Gly-CNP37. M: белковый маркер; C: контроль [Gly-CNP37 («CNP38»)]; T: суммарные клеточные лизаты; TI: суммарные лизаты индуцированных клеток; S: надосадок; SI: индуцированный надосадок.

На фигуре 8 показан SDS-ПААГ (окраска Кумасси синим) продуктов расщепления муравьиной кислотой слитых белков TAF-CNP34 и TAF-Pro-CNP53. M: белковый маркер; P: положительный контроль [Gly-CNP37 («CNP38»)]; U: нерасщепленный; C: расщепленный; CS: расщепленный надосадок; CP: расщепленный осадок.

На фигуре 9 представлена ЖХ/МС-хроматограмма, показывающая пик CNP-34 после расщепления муравьиной кислотой TAF-CNP34.

На фигуре 10 представлена ЖХ/МС-хроматограмма, показывающая пик Pro-CNP53 после расщепления муравьиной кислотой TAF-Pro-CNP53.

На фигуре 11 показан SDS-ПААГ (окраска Кумасси синим) для экспрессии слитых белков TAF(C/A и 4D/4E)-Pro-CNP38 и TAF(4D/4E)-Pro-CNP38, где «Pro-CNP38» означает Pro-Gly-CNP37. M: белковый маркер; C: контроль [Gly-CNP37 («CNP38»)]; T: суммарные клеточные лизаты; TI: суммарные лизаты индуцированных клеток; S: надосадок; SI: индуцированный надосадок.

На фигуре 12 показан SDS-ПААГ (окраска Кумасси синим) продуктов расщепления муравьиной кислотой слитых белков TAF(4D/4E)-Pro-CNP38 и TAF(C/A и 4D/4E)-Pro-CNP38, где «Pro-CNP38» означает Pro-Gly-CNP37. M: белковый маркер; P: положительный контроль [Gly-CNP37 («CNP38»)]; U: нерасщепленный; C: расщепленный; CS: расщепленный надосадок; CP: расщепленный осадок.

На фигуре 13 показан SDS-ПААГ (окраска Кумасси синим) продуктов расщепления муравьиной кислотой слитых белков TAF-NL-(C/A и 6D/6E)-Pro-CNP38 и TAF(C/A и 10D/10E)-Pro-CNP38, где «Pro-CNP38» означает Pro-Gly-CNP37. M: белковый маркер; P: положительный контроль [Gly-CNP37 («CNP38»)]; U: нерасщепленный; C: расщепленный; CS: расщепленный надосадок; CP: расщепленный осадок.

На фигуре 14 показан Вестерн-блот с использованием анти-CNP-антитела для слитого белка TAF-Pro-CNP38, полученного при ферментации в объеме 10 л клеток BL21(DE3), при этом клетки индуцировали при OD₆₀₀=64 и в точке 17 часов, и «Pro-CNP38» означает Pro-Gly-CNP37.

На фигуре 15 показан SDS-ПААГ (окраска Кумасси синим) фракций элюата с катионообменной колонки с SP-сефарозой после хроматографии неочищенного продукта Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38»). A: тельца включения (IB) TAF-Pro-CNP38 в воде; B: IB в формиате; C: IB в формиате, нейтрализованные; D: нейтрализованный осадок; E: нейтрализованный надосадок; F: загрузка TMAE Hi-CAP; G: проходящий поток через TMAE Hi-CAP/загрузка на SP-сефарозу; H: проходящий поток через SP-сефарозу; фракции элюата с SP-сефарозы 1-47: 10 мкл/дорожку.

На фигуре 16 показана степень резистентности N-концевых пегилированных конъюгатов CNP22 к нейтральной эндопептидазе (NEP) in vitro.

На фигуре 17 показана степень резистентности к NEP вариантов CNP, имеющих аминокислотное удлинение на N-конце [«CNP27» означает GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36)].

На фигуре 18 показана степень резистентности к NEP пегилированного на N-конце CNP17 и GANRR-CNP22(K4R) («CNP27») (SEQ ID NO: 36).

На фигуре 19 показана степень резистентности к NEP wtCNP22 и вариантов CNP Gly-CNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (на фигурах «CNP27-HSA») (SEQ ID NO: 144) и ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (на фигурах «CNP27-ПЭО12») (SEQ ID NO: 36).

На фигуре 20 показана способность вариантов CNP, имеющих N-концевое аминокислотное удлинение, стимулировать продукцию цГМФ в клетках NIH3T3 in vitro. Результаты представлены относительно уровня цГМФ, продуцируемого в присутствии 1 мкМ CNP22. «CNP27» означает GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).

На фигуре 21 показана способность пегилированного на N-конце CNP17 и GANRR-CNP22(K4R) («CNP27») (SEQ ID NO: 36) стимулировать продукцию цГМФ в клетках NIH3T3.

На фигуре 22 показано влияние N-концевого пегилирования CNP22 на продукцию цГМФ.

На фигуре 23 показана продукция цГМФ, индуцированная wtCNP22 и вариантами CNP Gly-CNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 («CNP27-HSA») (SEQ ID NO: 144), wtCNP29 и ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО12») (SEQ ID NO: 36) в клетках NIH3T3.

На фигурах 24A и B показано, что CNP-22 и Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») стимулировали продукцию цГМФ посредством NPR-B со сходными кривыми зависимости «доза-ответ» и в намного большей степени, чем стимуляция посредством NPR-A, и проявляли сходный профиль избирательности в отношении NPR-B по сравнению с NPR-C в анализах конкуренции передачи сигнала in vitro.

На фигуре 25 показано, что воздействие CNP22 на клетки хондросаркомы крыс в течение 1 часа один раз в день или в течение 2 часов один раз в день по существу одинаково эффективно реверсировало индуцированную FGF2 задержку роста хондроцитов, как и в случае непрерывного воздействия CNP22.

На фигурах 26A и B показаны результаты исследования зависимости «доза-ответ» в случае воздействия CNP22 на клетки хондросаркомы крыс (RCS), подвергнутые задержке под влиянием FGF2.

На фигурах 27A-D показано, что добавление CNP22 к клеткам RCS, задержанным под влиянием FGF2, увеличивает синтез матрикса и частично ингибирует FGF2, что оценивали по включению ³⁵S-сульфата и ³H-Pro в матрикс или убыванию из матрикса. Панели A и C: синтез; B и D: распад; A и B, измерение ³⁵S; C и D, измерение ³H. Статистически значимые различия выделены (ANOVA; *p<0,05, **p<0,01).

На фигурах 28A-C показаны уровни продукции аггрекана и фибронектина (мРНК, панели A и C; и белок, панель B) в клетках RCS, культивируемых с FGF2 и CNP22.

На фигуре 29 показана эффективность CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (на фигурах «CNP27-ПЭО24») (SEQ ID NO: 36) в стимулировании продольного роста бедренной кости в модели органов мышей дикого типа ex vivo.

На фигуре 30 показан продольный рост большеберцовой кости мышей дикого типа 2-3-дневного возраста, которых обрабатывали CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) каждые два дня. Результаты нормализованы по отношению к измерениям до обработки (0 день). Данные представлены в виде средних ± SEM (n=8).

На фигуре 31 показан продольный рост большеберцовых костей у мышей с ахондроплазией FGFR3^ach 2-3-дневного возраста, которых обрабатывали CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) каждые два дня. Результаты нормализованы по отношению к измерениям до обработки (0 день). Данные представлены в виде средних ± SEM (n=7-8).

На фигуре 32 показан продольный рост бедренных костей у мышей дикого типа 2-3-дневного возраста, которых обрабатывали CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) каждые два дня. Результаты нормализованы по отношению к измерениям до обработки (0 день). Данные представлены в виде средних ± SEM (n=8).

На фигуре 33 показан продольный рост бедренных костей мышей FGFR3^ach 2-3-дневного возраста, которых обрабатывали CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) каждые два дня. Результаты нормализованы по отношению к измерениям до обработки (0 день). Данные представлены в виде средних ± SEM (n=3-7).

На фигурах 34A-I изображено биораспределение CNP37 в бедренных костях мышей FGFR3^ach, которых обрабатывали ex vivo каждые два дня. Панели A-C иллюстрируют распределение в дистальной части бедренных костей, панели D-F иллюстрируют распределение в артикулярных хондроцитах, и панели G-I иллюстрируют распределение в гипертрофических хондроцитах.

На фигурах 35A-C изображена клеточность пролиферирующих колонок в ростовых пластинках после обработки бедренных костей мышей дикого типа и мышей FGFR3^ach с использованием CNP22 или CNP37 каждые два дня в течение 8 дней. (A) без обработки, (B) количество клеток на колонку после обработки, (C) морфологические исследования после обработки. Панели на фиг. 35C(i)-C(vi) соответствуют порядку образцов, указанных на фиг. 35B. Данные представлены в виде средних ± SEM (n=4-8).

На фигуре 36A-C изображена гипертрофия хондроцитов после обработки ex vivo бедренных костей мышей дикого типа и мышей FGFR3^ach с использованием CNP22 или CNP37 каждые два дня в течение 8 дней. (A) без обработки, (B) размер клеток после обработки, (C) морфологические исследования после обработки. Панели на фиг. 36C(i)-C(vi) соответствуют порядку образцов, указанному на фиг. 36B. Данные представлены в виде средних ± SEM (n=4-9).

На фигурах 37A-I изображено биораспределение CNP37 в большеберцовых костях мышей FGFR3^ach, обработанных in vivo. Панели A-C показывают распределение в дистальной части бедренных костей, панели D-F иллюстрируют распределение в артикулярных хондроцитах, и панели G-I иллюстрируют распределение в гипертрофических хондроцитах.

Фигуры 38A-C иллюстрируют влияние CNP37 in vivo на ростовую пластинку большеберцовой кости у мышей FGFR3^ach: (A) общая толщина ростовых пластинок, (B) толщина зоны пролиферации и (C) толщина зоны гипертрофии. Данные представлены в виде средних ± SEM (n=7-15).

На фигуре 39 показаны уровни цГМФ в кондиционированной среде бедренных костей мышей дикого типа, обработанных ex vivo CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО24») (SEQ ID NO: 36) (p<0,01).

На фигуре 40 показаны уровни цГМФ в кондиционированной среде бедренных костей мышей FGFR3^ach, обработанных ex vivo CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) (p<0,01).

На фигуре 41 изображены уровни цГМФ в кондиционированной среде большеберцовых костей мышей дикого типа, обработанных ex vivo CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) (p<0,01).

На фигуре 42 показаны уровни цГМФ в кондиционированной среде большеберцовых костей мышей FGFR3^ach, обработанных ex vivo CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) (p<0,01).

Фигура 43 демонстрирует, что воздействие ex vivo на бедренные кости мышей дикого типа и мышей FGFR3^ach пептидами CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) повышало уровни расщепленного коллагена типа II в кондиционированной среде (p<0,05).

На фигуре 44 изображена гипертрофическая область бедренных костей, выделенных из мышей дикого типа и мышей FGFR3^Y367C (мышиная модель тяжелой ахондроплазии) и обработанных ex vivo наполнителем или 1 мкМ Pro-Gly-CNP37 («ProCNP38») в течение 6 дней, при этом показано, что обработка Pro-Gly-CNP37 приводила к увеличению роста кости и экспансии в ростовой пластинке.

На фигуре 45 показано, что CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), введенный внутривенно (в/в) крысам, имеет более длительное время полужизни и намного большую биодоступность в плазме, чем CNP22.

Фигура 46 иллюстрирует, что ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), введенный подкожно (п/к) крысам, также имеет намного более длительное время полужизни и намного большую биодоступность в плазме, чем CNP22.

Фигура 47 демонстрирует, что внутривенно введенные CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) стимулируют намного более высокие уровни продукции цГМФ у крыс, чем CNP22.

На фигуре 48 показано, что подкожно введенные ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) и в меньшей степени CNP37 значительно более эффективны в стимуляции продукции цГМФ у крыс, чем CNP22.

На фигуре 49 показаны измерения массы тела у мышей дикого типа, обработанных Gly-CNP37 или ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).

На фигуре 50 показаны измерения длины хвоста у мышей дикого типа, обработанных Gly-CNP37 или ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).

Фигура 51 иллюстрирует влияние обработки мышей FGFR3^ach пептидами CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) на длину тела (p=0,02, односторонний t-критерий, неодинаковая дисперсия).

На фигуре 52 показано влияние CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) на длину хвоста у мышей FGFR3^ach.

На фигурах 53A и B показано влияние CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) на длину дистальных длинных костей (A, локтевая кость; B, большеберцовая кость) у мышей FGFR3^ach (p<0,01, односторонний t-критерий, неодинаковая дисперсия).

На фигурах 54A и B показано влияние CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) на длину проксимальных костей (A, плечевая кость; B, бедренная кость) у мышей FGFR3^ach (p<0,01, односторонний t-критерий, неодинаковая дисперсия).

Фигура 55 иллюстрирует, что введение CNP37 корректирует ризомелию (диспропорцию длины проксимальных частей конечностей), как было определено по отношению бедренная кость/большеберцовая кость, наблюдаемому у мышей FGFR3^ach (p<0,01, односторонний t-критерий, неодинаковая дисперсия).

На фигуре 56 показано влияние CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) на длину головы у мышей FGFR3^ach (p<0,01 односторонний t-критерий, неодинаковая дисперсия).

На фигуре 57 показано, что обработка мышей FGFR3^ach пептидом CNP37 увеличивает размер наружного слухового прохода (EAM) (P=0,03, односторонний t-критерий, неодинаковая дисперсия).

На фигуре 58 показано влияние CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) на длину позвоночника у мышей с ахондроплазией, выраженное в виде удлинения тел позвонков (например, поясничного позвонка 5).

На фигуре 59 показано, что обработка мышей FGFR3^ach пептидами CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) приводит к повышенным уровням цГМФ в плазме через 15 минут после введения дозы.

Фигура 60 иллюстрирует уровни в сыворотке расщепленного коллагена типа II у мышей FGFR3^ach, которых в течение 5 недель обрабатывали CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).

На фигуре 61 показаны уровни остеокальцина в сыворотке мышей FGFR3^ach, которых в течение 5 недель обрабатывали CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).

На фигуре 62 показаны уровни цГМФ в плазме через 15 минут после введения дозы у мышей дикого типа, которых обрабатывали Gly-CNP37 или ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) (p<0,05).

На фигуре 63 показаны уровни расщепленного коллагена типа II в сыворотке мышей дикого типа, которых обрабатывали в течение 5 недель Gly-CNP37 или ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).

На фигурах 64-66 показаны уровни цГМФ, расщепленного коллагена типа II и щелочной фосфатазы после введения наполнителя или 20 нмоль/кг или 70 нмоль/кг Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») мышам дикого типа.

На фигурах 67 и 68 показаны уровни расщепленного коллагена типа II и общей щелочной фосфатазы после введения наполнителя или Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») с использованием разных схем дозирования.

Фигура 69 иллюстрирует относительное увеличение длины тела у животных, обработанных Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») и наполнителем в двух отдельных исследованиях (S1 и S2) на 37 день по сравнению с 1 днем.

На фигурах 70A и B показаны изменения минеральной плотности костей (A) и содержания минералов в костях (B) после введения Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38»).

На фигуре 71 показаны уровни цГМФ в плазме через 15 минут после последней подкожной дозы варианта CNP, день 36, при этом на фигурах 71-73 Gly-wtCNP37 обозначен «CNP38», Pro-Gly-wtCNP37 обозначен «Pro-CNP38», и GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 144) обозначен «HSA-CNP27».

На фигуре 72 показаны уровни расщепленного коллагена типа II в сыворотке мышей, обработанных Gly-CNP37, Pro-Gly-CNP37 или GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO: 144).

На фигуре 73 показаны уровни щелочной фосфатазы в сыворотке мышей, обработанных Gly-CNP37, Pro-Gly-CNP37 или GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO: 144).

На фигурах 74A и B изображена десенсибилизация цГМФ-ответа после острой (A) или хронической (B) обработки с использованием 1 мкМ Gly-CNP37.

Фигура 75A демонстрирует, что ежедневная обработка мышей дикого типа 200 нмоль/кг Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») в течение 8 дней не приводит к десенсибилизации цГМФ-ответа. На фигуре 75B показано, что обработка мышей 200 нмоль/кг Pro-Gly-CNP37 один раз в сутки в течение двух следующих друг за другом дней усиливала цГМФ-ответ.

На фигурах 76A-D показано, что обработка мышей дикого типа 200 нмоль/кг Gly-CNP37 стимулировала секрецию цГМФ в дистальной части бедренных костей (хрящ и кость) (A), кортикальном слое бедренной кости (кость) (B), ушной раковине (хрящ) (C) и почке (D). На фигурах 76E-H показано, что в тканях печени (E), сердца (F), легкого (G) и головного мозга (H) не наблюдается поддающейся оценке секреции цГМФ в ответ на Gly-CNP37 по сравнению с контрольным наполнителем в исследованных временных точках.

На фигурах 77-82 показаны результаты проводимого в настоящее время исследования на здоровых макаках-крабоедах молодого возраста, которым подкожно ежедневно инъецировали наполнитель или 10 или 36 мкг/кг Pro-Gly-CNP37. Обе дозы Pro-Gly-CNP37 увеличивали ширину ростовой пластинки (фигура 77), увеличивали длину правой и левой большеберцовых костей (фигуры 78A и B), увеличивали длину задней конечности (фигура 79), увеличивали длину передней конечности (фигура 80), увеличивали длину тела (фигура 81) и увеличивали уровень щелочной фосфатазы в сыворотке (фигура 82).

На фигуре 83 показан наблюдаемый график константы скорости распада (K_obs) в зависимости от pH при pH 3-8 и при 5°C, 25°C и 40°C для препаратов Gly-CNP37.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новым вариантам CNP, имеющим пониженную аффинность к NEP и/или NPR-C и пониженную чувствительность к расщеплению под действием NEP и/или клиренсу посредством NPR-C, к фармацевтическим композициям, содержащим такие варианты CNP, и способам применения таких вариантов CNP для лечения расстройств, отвечающих на CNP, включая без ограничения связанные с костями расстройства, такие как ахондроплазия, и расстройства, ассоциированные с клетками и тканями гладкой мускулатуры сосудов.

A. Определения

Если не оговорено особо, следующие термины, используемые в настоящей публикации, включая описание и формулу изобретения, имеют определения, приведенные ниже.

В используемом в описании и прилагаемой формуле изобретения смысле формы единственного числа включают формы и множественного и единственного числа, если контекст ясно не диктует иное.

Термин «примерно» или «приблизительно» означает допустимую погрешность для конкретного значения, которое определяет специалист в данной области, которое зависит, отчасти, от того как значение измеряют или определяют. В некоторых вариантах термин «примерно» или «приблизительно» означает в пределах 1, 2, 3 или 4 стандартных отклонений. В некоторых вариантах термин «примерно» или «приблизительно» означает в пределах 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,05% от данного значения или диапазона. Во всех случаях когда термин «примерно» или «приблизительно» предшествует первому числовому значению ряда, состоящего из двух или более числовых значений, следует понимать, что термин «примерно» или «приблизительно» применимы к каждому из числовых значений данного ряда.

Термины «температура окружающей среды» и «комнатная температура» используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и термины относятся к температуре окружающей среды (например, комнаты, в которой проводят реакцию, или композиции, которую подвергают хранению). В некоторых вариантах температура окружающей среды или комнатная температура находится в диапазоне примерно от 15°C до примерно 28°C или примерно от 15°C до примерно 25°C, или примерно от 20°C до примерно 28°C, или примерно от 20°C до примерно 25°C, или примерно от 22°C до примерно 28°C, или примерно от 22°C до примерно 25°C. В других вариантах температура окружающей среды или комнатная температура составляет примерно 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C или 28°C.

Определения стандартных химических терминов можно найти в справочниках, включая Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3^rd Edition, Vol. A and B (Plenum Press, New York 1992). При практическом осуществлении настоящего изобретения, если не указано иное, можно использовать некоторые обычные способы химии органического синтеза, масс-спектрометрии, препаративной и аналитической хроматографии, химии белков, биохимии, технологии рекомбинантной ДНК и фармакологии, известные специалистам в данной области. См., например, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4th Edition, 2004); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990).

Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, цитированные в настоящем описании выше или далее, включены в виде ссылки в полном объеме.

В тексте использованы следующие сокращенные обозначения аминокислот:

Аланин: Ala (A)	Аргинин: Arg (R)
Аспарагин: Asn (N)	Аспарагиновая кислота: Asp (D)
Цистеин: Cys (C)	Глутамин: Gln (Q)
Глутаминовая кислота: Glu (E)	Глицин: Gly (G)
Гистидин: His (H)	Изолейцин: Ile (I)
Лейцин: Leu (L)	Лизин: Lys (K)
Метионин: Met (M)	Фенилаланин: Phe (F)
Пролин: Pro (P)	Серин: Ser (S)
Треонин: Thr (T)	Триптофан: Trp (W)
Тирозин: Tyr (Y)	Валин: Val (V)

«Полипептид» и «белок» относится к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков, родственных встречающихся в природе структурных вариантов и их синтетических не встречающихся в природе аналогов, связанных пептидными связями или изостерами пептидных связей. Синтетические полипептиды могут быть синтезированы, например, с использованием автоматизированного синтезатора полипептидов. Термины «полипептид» и «белок» не ограничены минимальной длиной продукта. Термин «белок» обычно относится к крупным полипептидам. Термин «пептид» обычно относится к коротким полипептидам. Таким образом, пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и тому подобные включены в определение. И полноразмерные белки, и их фрагменты входят в настоящее определение. Термины «полипептид» и «белок» также включают постэкспрессионные модификации полипептида или белка, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и тому подобное. Кроме того, в целях настоящего описания «полипептид» может включать «модификации», такие как делеции, добавления, замены (которые могут быть консервативными по природе или могут включать замены любой из 20 аминокислот, которые обычно присутствуют в белках человека, или любыми другими встречающимися в природе или не встречающимися в природе или атипичными аминокислотами) и химические модификации (например, добавление или замену пептидомиметиками) в нативной последовательности. Такие модификации могут быть преднамеренными, как случае сайт-специфичного мутагенеза или химической модификации аминокислот, чтобы удалить или связать химические остатки, или могут быть случайными, такими как модификации в результате мутаций, возникающих у хозяев, которые продуцируют белки, или в результате ошибок вследствие ПЦР-амплификации.

В настоящем описании используют обычную запись для иллюстрации полипептидных последовательностей: левый конец полипептидной последовательности является амино-концом; правый конец полипептидной последовательности является карбоксильным концом.

«Консервативная замена» относится к замене аминокислоты в полипептиде функционально, структурно или химически сходной природной или неприродной аминокислотой. В одном варианте аминокислоты в следующих группах, каждая из которых содержит природные аминокислоты, являются консервативными заменами друг для друга:

(1) аланин (A), серин (S), треонин (T);

(2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

(3) аспарагин (N), глутамин (Q);

(4) аргинин (R), лизин (K);

(5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V) и

(6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

В другом варианте аминокислоты в следующих группах, каждая из которых содержит природные аминокислоты, являются консервативными заменами друг для друга:

(1) глицин (G), аланин (A);

(2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

(3) аспарагин (N), глутамин (Q);

(4) аргинин (R), лизин (K);

(5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V), аланин (A);

(6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W) и

(7) серин (S), треонин (T), цистеин (C).

В следующем варианте аминокислоты сгруппированы, как указано ниже.

(1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию остова: Gly, Pro; и

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe, His.

В одном варианте пептиды или полипептиды, описанные в настоящей публикации, получены основанными на рекомбинации способами с использованием полинуклеотида, кодирующего вариант CNP. Таким образом, изобретение охватывает полинуклеотиды, кодирующие любой из вариантов CNP, описанных в настоящей публикации, клетки-хозяева или векторы, содержащие такие полинуклеотиды, необязательно связанные с последовательностями регуляции экспрессии, и способы применения таких полинуклеотидов, векторов или клеток-хозяев для получения вариантов CNP согласно изобретению. Варианты CNP, экспрессируемые такими полинуклеотидами, могут быть получены способами, включающими в себя выращивание клеток-хозяев в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант CNP, и выделение продукта экспрессии из клеток-хозяев или культуральной среды. Реальные продукты экспрессии могут немного отличаться от кодируемого белкового продукта в зависимости от посттрансляционного процессинга.

«Полинуклеотид» относится к полимеру, состоящему из нуклеотидных единиц. Полинуклеотиды включают встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, такие как дезоксирибонуклеиновая кислота («ДНК») и рибонуклеиновая кислота («РНК»), а также аналоги нуклеиновых кислот. Термин «нуклеиновая кислота» обычно относится к крупном полинуклеотидам. Термин «олигонуклеотид» обычно относится к коротким полинуклеотидам, имеющим обычно не более чем примерно 50 нуклеотидов. Следует понимать, что когда нуклеотидная последовательность представлена последовательностью ДНК (т.е. A, T, G, C), нуклеотидная последовательность также охватывает последовательность РНК (т.е. A, U, G, C), в которой «U» заменяет «T». «кДНК» относится к ДНК, которая комплементарна или идентична мРНК, либо в однонитевой, либо в двунитевой форме.

«Последовательность регуляции экспрессии» относится к нуклеотидной последовательности, которая регулирует экспрессию оперативно связанной с ней нуклеотидной последовательности. «Оперативно связанная» относится к функциональной взаимосвязи между двумя частями, при которой активность одной части (например, способность регулировать транскрипцию) приводит к действию другой части (например, транскрипции последовательности). Последовательности регуляции экспрессии могут включать, например, без ограничения последовательности промоторов (например, индуцируемые или конститутивные), энхансеры, терминаторы транскрипции, стартовый кодон (т.е. ATG), сигналы сплайсинга интронов и стоп-кодоны.

«Рекомбинантный полинуклеотид» относится к полинуклеотиду, имеющему последовательности, которые в природе вместе не связаны. Амплифицированный или собранный рекомбинантный полинуклеотид может быть введен в подходящий вектор и вектор может быть использован для трансформации подходящей клетки-хозяина. Клетку-хозяина, которая содержит рекомбинантный полинуклеотид, называют «рекомбинантной клеткой-хозяином». Затем ген экспрессируют в рекомбинантной клетке-хозяине, получая, например, «рекомбинантный полипептид». Рекомбинантный полинуклеотид также может выполнять не кодирующую функцию (например, промотор, начало репликации, сайт связывания рибосомы и т.д.).

«Химера» в используемом в настоящем описании смысле относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему по меньшей мере две гетерологичных полинуклеотидных или полипептидных последовательности (т.е. полученных из разных источников или не ассоциированных друг с другом в виде встречающейся в природе последовательности), которые прямо или опосредованно соединены или связаны вместе с использованием способов, широко известных в данной области, например, посредством экспрессии рекомбинантов или химического поперечного сшивания. В одном варианте гетерологичная последовательность может содержать белок или пептид, прямо или опосредованно связанный с пептидом или вариантом CNP, включая белки или пептиды, которые можно отщепить от пептида или варианта CNP. В родственном варианте осуществления изобретения варианты CNP представляют собой химеры, которые описаны в настоящей публикации.

В некоторых вариантах химеры включают слитые белки CNP, содержащие отщепляемый белок-носитель или пептидную метку. Термин «отщепляемый белок-носитель» или «отщепляемая пептидная метка» относится к пептидной или полипептидной последовательности, которая может быть слита, прямо или опосредованно через линкер, с гетерологичной полипептидной последовательностью и может быть отделена от гетерологичной последовательности с использованием средства, которое отщепляет или отделяет отщепляемый пептид или полипептид от гетерологичного полипептида или белка. В некоторых вариантах отщепляемый белок-носитель или пептидная метка улучшает образование, очистку и/или выявление слитого белка или гетерологичного полипептида. Примеры отщепляемых белков-носителей и пептидных меток включают, но без ограничения, фактор транскрипции TAF12 человека (TAF12), изомеразу кетостероидов (KSI), связывающий мальтозу белок (MBP), β-галактозидазу (β-Gal), глутатион-S-трансферазу (GST), тиоредоксин (Trx), хитин-связывающий домен (CBD), мутацию BMP-2 (BMPM), SUMO, CAT, TrpE, стафилококковый белок A, стрептококковые белки, связывающий крахмал белок, связывающий целлюлозу домен эндоглюканазы A, связывающий целлюлозу домен экзоглюканазы Cex, биотин-связывающий домен, recA, Flag, c-Myc, поли(His), поли(Arg), поли(Asp), поли(Gln), поли(Phe), поли(Cys), зеленый флуоресцирующий белок, красный флуоресцирующий белок, желтый флуоресцирующий белок, синий флуоресцирующий белок, биотин, авидин, стрептавидин, эпитопы антител и их фрагменты.

«Расщепляющим агентом» является агент, который применим для отщепления или отделения, например, отщепляемого пептида или полипептида от гетерологичного полипептида или белка. Примеры расщепляющих агентов включают, но без ограничения, палладий, бромистый циан (CNBr), муравьиную кислоту, гидроксиламин, клострипаин, тромбин, химотрипсин, трипсин, трипсиноподобные протеазы, карбоксипептидазу, энтерокиназу (энтеропептидазу), протеазу Kex 2, протеазу Omp T, протеазу фактора Xa, субтилизин, proTEV, протеазу SUMO, протеазу V8, протеазу ВИЧ, протеазу риновируса, протеазу фурилизина, протеазы IgA, протеазу Pace человека, коллагеназу, протеазу Nia, протеазу 2Apro вируса полиомиелита, протеазу 3C вируса полиомиелита, гененазу, фурин, эластазу, протеиназу K, пепсин, реннин (химозин), аспарагиновые протеазы микроорганизмов, папаин, кальпаин, хемопапаин, фицин (фикаин), бромелаин (бромелазу), катепсин B, каспазы, термолизин, эндопротеазу Arg-C, эндопротеазу Glu-C, эндопротеазу Lys-C, калликреин и плазмин.

Термины «идентичный» и «идентичность» в процентах в контексте двух или более полинуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют конкретное процентное содержание нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, судя по измерению с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или на основании визуального просмотра.

Фраза «по существу гомологичный» или «по существу идентичный» в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов, в общем, относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые имеют по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 98% идентичность нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, судя по измерению с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или на основании визуального просмотра. В некоторых вариантах значительная гомология или идентичность существует на протяжении областей последовательностей, которые имеют длину по меньшей мере примерно 25, 50, 100 или 150 остатков. В другом варианте последовательности являются по существу гомологичными или идентичными на протяжении всей длины любого одного или обоих сравниваемых биополимеров.

В случае сравнения последовательностей обычно одна последовательность действует как эталонная последовательность, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости устанавливают координаты подпоследовательностей и устанавливают параметры программы алгоритма для последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет идентичность последовательностей в процентах для тестируемой последовательности(ей) по сравнению с эталонной последовательностью на основании установленных параметров программы.

Может быть проведено оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения, например, с использованием алгоритма локальной гомологии Смита и Ватермана (Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981)), алгоритма выравнивания в отношении гомологии Нидлемана и Вунша (J. Mol. Biol., 48: 443 (1970)), в результате поиска сходства способом Пирсона и Липмана (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988)), с использованием компьютеризованных воплощений таких алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете компьютерных программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или посредством визуального просмотра. Одним из примеров применимого алгоритма является PILEUP, в котором используется упрощение способа прогрессивного выравнивания Фенга и Дулиттла (J. Mol. Evol., 35: 351-360 (1987)) и который сходен со способом, описанным Хиггинсом и Шарпом (CABIOS, 5: 151-153 (1989)). Другим алгоритмом, применимым для осуществления множественных выравниваний последовательностей, является Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Примером алгоритма, который является подходящим для определения идентичности последовательности в процентах и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915 (1989); Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5787 (1993)). Компьютерная программа для осуществления BLAST-анализов общедоступны из Национального центра биотехнологической информации.

Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот или полипептиды по существу гомологичны или идентичны, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, иммунологически перекрестно реагирует с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид обычно по существу идентичен второму полипептиду, например, когда два полипептида отличаются только консервативными заменами. Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот по существу идентичны, является то, что две молекулы гибридизуются друг с другом в жестких условиях, как описано в настоящей публикации.

«По существу очищенный» или «изолированный» означает, что целевой вид является преобладающим среди присутствующих видов (т.е. на молярной основе более распространенным, чем любой другой отдельный вид макромолекулы в композиции), и по существу чистая фракция представляет собой композицию, в которой целевой вид составляет по меньшей мере примерно 50% (на молярной основе) всех присутствующих видов макромолекул. В одном варианте по существу чистая композиция означает, что представляющий интерес вид составляет по меньшей мере примерно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более из общего количества видов макромолекул, присутствующих в композиции, на молярной основе или на основе массы. Целевой вид очищен по существу до гомогенности (примесные виды не могут быть выявлены в композиции обычными способами регистрации), если композиция состоит в основном из одного вида макромолекул. Виды молекул растворителя, малые молекулы (<500 дальтон), стабилизаторы (например, БСА) и виды ионов элементов не считаются видами макромолекул в целях данного определения. В одном варианте соединения согласно изобретению по существу очищены или выделены. В другом варианте соединения согласно изобретению являются по существу очищенными или изолированными по отношению к исходным макромолекулярным материалам, используемым для их получения. В еще одном варианте фармацевтические композиции согласно изобретению содержат по существу очищенный или изолированный вариант CNP в смеси с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, носителями или разбавителями и необязательно с другим биологически активным средством.

«Встречающийся в природе» в применении к объекту относится к тому факту, что объект можно найти в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы) и которая не была специально модифицирована человеком в лаборатории, является встречающейся в природе. В одном варианте «встречающееся в природе» вещество имеет человеческую природу.

Термин «дикий тип» (wt) является термином, относящимся к природной форме, включая последовательность полинуклеотида, полипептида или белка данного вида. Форма дикого типа отличается от мутантной формы полинуклеотида, полипептида или белка, возникающей в результате генетической мутации(ий).

В одном варианте первый полипептид, который является «аналогом» или «вариантом» или «производным» второго полипептида, представляет собой полипептид, имеющий по меньшей мере примерно 50%, 60% или 70% гомологию последовательностей, но менее чем 100% гомологию последовательностей со вторым полипептидом. Такие аналоги, варианты или производные могут состоять из не встречающихся в природе аминокислотных остатков, включая без ограничения гомоаргинин, орнитин, пеницилламин и норвалин, а также из встречающихся в природе аминокислотных остатков. Такие аналоги, варианты или производные также могут состоять из одного или множества D-аминокислотных остатков и также могут содержать пептидомиметики или изостеры пептидной связи, такие как непептидные связи между двумя или большим количеством аминокислотных остатков или остатков пептидомиметиков. В другом варианте первый полипептид является «аналогом», «вариантом» или «производным» второго полипептида, если первый полипептид не является известным продуктом второго полипептида или не является известным предшественником второго полипептида, даже если первый полипептид имеет 100% гомологию последовательности со вторым полипептидом или имеет последовательность дикого типа.

В одном варианте термин «полученный из» в используемом в настоящем описании смысле относится к полипептидной или пептидной последовательности, которая основана на полипептидной или пептидной последовательности дикого типа или встречающийся в природе и может иметь одну или несколько делеций, добавлений и/или замен природными аминокислотами, неприродными аминокислотами или пептидомиметиками. В одном варианте последовательность производного имеет по меньшей мере примерно 40%, 50%, 60% или 70%, но менее чем 100% сходство последовательности с последовательностью дикого типа или встречающейся в природе последовательностью. В другом варианте производное может представлять собой фрагмент полипептида, при этом фрагмент в основном гомологичен (например, по меньшей мере примерно на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% гомологичен) полипептиду дикого типа на протяжении участка длиной по меньшей мере примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот. В еще одном варианте полипептид «получен из» полипептида дикого типа, если он имеет остаток (например, полимер, такой как, например, ПЭГ), связанный с ним прямо или опосредованно, который не присутствует на полипептиде дикого типа, даже если оба полипептида имеют 100% гомологию по своим аминокислотным последовательностям.

В используемом в настоящем описании смысле «полученный из NPPC» полипептид относится к полипептиду, полученному из полипептида предшественника натрийуретического пептида C (NPPC), который представляет собой одноцепочечный 126-аминокислотный препрополипептид и который при расщеплении в конечном итоге дает wtCNP22. Удаление сигнального пептида из NPPC дает про-CNP, и дальнейшее расщепление эндопротеазой фурином приводит к образованию активного 53-аминокислотного пептида (CNP-53), который секретируется и снова расщепляется неизвестным ферментом с образованием зрелого 22-аминокислотного пептида (CNP или CNP-22). Следовательно, CNP22 сам по себе является «полученным из NPPC» полипептидом в силу его образования из NPPC. В одном варианте полученный из NPPC полипептид по меньшей мере примерно на 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% гомологичен NPPC дикого типа на протяжении одинакового количества аминокислотных остатков. Кроме того, предполагается, что полученный из NPPC пептид может содержать примерно от 1 до примерно 53, или от 1 до 37, или от 1 до 35, или от 1 до 31, или от 1 до 27, или от 1 до 22, или от 10 до 35, или примерно от 15 до примерно 37 остатков полипептида NPPC. В одном варианте полученный из NPPC пептид может содержать последовательность из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 или 53 аминокислот, полученных из полипептида NPPC.

Термин «эффективное количество» означает дозу, достаточную для получения требуемого результата в отношении состояния здоровья, патологии или заболевания у субъекта или в целях диагностики. Требуемый результат может включать субъективное или объективное улучшение дозы у реципиента. «Терапевтически эффективное количество» относится к такому количества средства, которое эффективно для получения предполагаемого полезного влияния на здоровье. Подходящее «эффективное» количество в любом отдельном случае может быть определено специалистом в данной области с использованием обычного экспериментирования. Будет понятно, что конкретный уровень дозы и частота дозирования для любого конкретного пациента будут варьировать и будут зависеть от множества факторов, включая активность конкретного используемого соединения, биодоступность, метаболическую стабильность, скорость экскреции и продолжительность действия такого соединения; способ и время введения соединения; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и питание пациента; и тяжесть конкретного состояния.

«Лечение» относится к профилактическому лечению или терапевтическому лечению или диагностическому лечению. В некоторых вариантах «лечение» относится к введению субъекту соединения или композиции для терапевтических, профилактических или диагностических целей.

«Профилактическое» лечение означает лечение, проводимое субъекту, у которого не проявляются признаки заболевания или проявляются только ранние признаки заболевания, в целях снижения риска развития патологии. Соединения или композиции согласно изобретению могут быть введены в виде профилактического лечения, чтобы уменьшить вероятность развития патологии или минимизировать тяжесть патологии, если она развивается.

«Терапевтическое» лечение представляет собой лечение, проводимое субъекту, у которого проявляются признаки или симптомы патологии, в целях снижения или исключения таких признаков или симптомов. Признаки или симптомы могут быть биохимическими, клеточными, гистологическими, функциональными или физическими, субъективными или объективными. Соединения согласно изобретению также могут быть введены в качестве терапевтического лечения или для диагностики.

«Диагностика» означает выявление наличия, степени и/или природы патологического состояния. Способы диагностики отличаются по своей специфичности и избирательности. Хотя конкретный способ диагностики может не давать определенного диагноза состояния, он достаточен, если способ дает положительный показатель, который способствует диагностике.

«Ассоциированный с костями или хрящами биомаркер» или «ассоциированный с костями или хрящами маркер» относится к фактору роста, ферменту, белку или другому регистрируемому биологическому веществу или остатку, уровень которого повышается или снижается в ассоциации, например, с обменом в хряще, образованием хряща, ростом хряща, резорбцией кости, образованием кости, ростом кости или их сочетанием. Такие биомаркеры могут быть измерены до, во время и/или после введения варианта CNP, как описано в настоящей публикации. Примеры ассоциированных с костями или хрящами биомаркеров включают, но без ограничения, CNP, цГМФ, пропептиды коллагена типа II и его фрагменты, коллаген типа II и его фрагменты, пропептиды коллагена типа I и его фрагменты, коллаген типа I и его фрагменты, остеокальцин, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), аггрекан-хондроитинсульфат и щелочную фосфатазу. Ассоциированные с хрящами и костями биомаркеры могут быть измерены в любом подходящем биологическом образце, включая без ограничения ткани, кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, синовиальную жидкость и мочу. В некоторых вариантах биомаркеры измеряют в крови, плазме или сыворотке животных, подвергаемых исследованиям эффективности/фармакодинамики in vivo, и/или в кондиционированной среде в исследованиях ex vivo.

В некоторых вариантах измеряют уровень по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера, и количество или частоту введения варианта CNP, вводимого субъекту, можно корректировать в соответствии с измеряемым уровнем биомаркера. В некоторых вариантах уровень биомаркера «ниже целевого уровня» или «выше целевого уровня». Целевой уровень биомаркера представляет собой уровень или диапазон уровней биомаркера, при которых наблюдают терапевтический эффект у субъекта, получающего вариант CNP. В некоторых вариантах целевой уровень биомаркера для субъекта, имеющего отвечающее на CNP расстройство или состояние, представляет собой уровень или диапазон уровней биомаркера, наблюдаемых у нормального, не пораженного заболеванием субъекта. В других вариантах, чтобы показать терапевтический эффект, целевой уровень биомаркера не должен быть эквивалентным уровню или диапазону уровней биомаркера, наблюдаемых у здорового субъекта, но может составлять, например, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% или 5% от «нормального» уровня или диапазона уровней биомаркера, наблюдаемых у не пораженного заболеванием субъекта.

Например, если уровень биомаркера увеличивается ассоциированно с образованием или ростом кости или хряща, целевой уровень биомаркера, свидетельствующий о терапевтическом эффекте, может быть выше, чем уровень биомаркера у пациентов, страдающих от отвечающего на CNP расстройства, которым был введен вариант CNP, и необязательно может быть ниже, чем «нормальный» уровень (уровни), примерно равным «нормальному» уровню (уровням) или выше «нормального» уровня (уровней) биомаркера у субъектов, не страдающих от такого расстройства. В одном варианте, если уровень биомаркера ниже целевого уровня, то это свидетельствует о неадекватном терапевтическом эффекте, и может требоваться увеличение количества или частоты введения варианта CNP, который вводили. В родственном варианте, если уровень биомаркера выше целевого уровня, то это свидетельствует о том, что было введено большее количество варианта CNP, чем необходимо, и может требоваться уменьшение количества или частоты введения вариант CNP, который вводили.

В качестве другого примера, если уровень биомаркера снижается в ассоциации с образованием или ростом кости или хряща, то целевой уровень биомаркера, свидетельствующий о терапевтическом эффекте, может быть ниже, чем уровень биомаркера у пациентов, страдающих от отвечающего на CNP расстройства, которым не был введен вариант CNP, и необязательно может быть выше чем «нормальный» уровень (уровни), примерно равным «нормальному» уровню (уровням) или ниже «нормального» уровня (уровней) биомаркера у субъектов, не страдающих от такого расстройства. В таком случае можно использовать корректировки, противоположные описанным выше корректировкам количества и частоты введения варианта CNP.

«Фармацевтическая композиция» относится к композиции, подходящей для фармацевтического применения у данного животного, включая человека и млекопитающих. Фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество варианта CNP, необязательно другое биологически активное средство и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель. В одном варианте фармацевтическая композиция охватывает композицию, содержащую активный ингредиент(ты) и инертный ингредиент(ты), который входит в состав носителя, а также любой продукт, который прямо или опосредованно является результатом сочетания, комплексообразования или агрегации любых двух или большего количества ингредиентов или результатом диссоциации одного или нескольких ингредиентов или результатом других типов реакций или взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению охватывают любую композицию, полученную смешиванием соединения согласно изобретению и фармацевтически приемлемого эксципиента, носителя или разбавителя.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к любым стандартным фармацевтическим носителям, буферам и тому подобному, таким как раствор фосфатно-солевого буфера, 5% водный раствор декстрозы и эмульсии (например, эмульсии масло/вода или вода/масло). Неограничивающие примеры эксципиентов включают адъюванты, связывающие средства, наполнители, разбавители, дезинтегрирующие средства, эмульгаторы, увлажнители, смазывающие средства, скользящие вещества, подсластители, корригенты и красители. Подходящие фармацевтические носители, эксципиенты и разбавители описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 19^th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Предпочтительные фармацевтические носители зависят от предполагаемого способа введения активного средства. Типичные способы введения включают энтеральное (например, пероральное) или парентеральное (например, подкожная, внутримышечная, внутривенная или внутрибрюшинная инъекция; или местное, трансдермальное или трансмукозальное введение).

«Фармацевтически приемлемой солью» является соль, которая может быть превращена в соединение для фармацевтического применения, включая без ограничения соли металлов (например, натрия, калия, магния, кальция и т.д.) и соли аммония или органических аминов.

«Фармацевтически приемлемый» или «фармакологически приемлемый» означает вещество, которое не является нежелательным с биологической или иной точки зрения, т.е. вещество может быть введено субъекту и при этом не вызывать каких-либо нежелательных биологических эффектов или не взаимодействовать разрушающим образом с какими-либо компонентами композиции, в которой оно находится, или с какими-либо компонентами, присутствующими на теле или в организме субъекта.

Термин «стандартная дозированная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных доз для человека и животных, при этом каждая единица содержит предварительно определяемое количество соединения согласно изобретению, вычисляемое как количество, достаточное для получения требуемого эффекта, необязательно в ассоциации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем, носителем или наполнителем. Характеристики новых стандартных дозированных форм согласно изобретению зависят от конкретного используемого соединения и достигаемого эффекта и фармакодинамических параметров каждого соединения в организме хозяина.

«Физиологические условия» относятся к условиям в организме животного (например, человека). Физиологические условия включают, но без ограничения, температуру тела и водную среду с определенной физиологической ионной силой, pH и ферментами. Физиологические условия также охватывают условия в организме конкретного субъекта, которые отличаются от «нормальных» условий, имеющихся у большинства субъектов, например, которые отличают от нормальной температуры тела человека, составляющей приблизительно 37°C, или отличаются от нормального pH крови человека, составляющего приблизительно 7,4.

«Физиологический pH» или «pH в физиологическом диапазоне» означает pH в диапазоне приблизительно от 7,0 до 8,0 включительно, чаще всего в диапазоне приблизительно от 7,2 до 7,6 включительно.

В используемом в настоящем описании смысле термин «субъект» охватывает млекопитающих и животных, отличных от млекопитающих. Примеры млекопитающих включают, но без ограничения, любого представителя класса млекопитающих: человека, отличных от человека приматов, таких как шимпанзе и другие человекообразные обезьяны и другие виды обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы, свиньи; домашних животных, таких как кролики, собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки, и тому подобные. Примеры отличных от млекопитающих животных включают, но без ограничения, птиц, рыб и тому подобных. Термин не указывает конкретный возраст или пол.

Термины «полиэтиленгликоль», «ПЭГ», «полиэтиленоксид» и «ПЭО» используют в настоящем описании взаимозаменяемо, если не указано иное. Пептид CNP (CNP22 или его вариант), конъюгированный через аминогруппу с полимером «ПЭОn» с определенным числом n, в общем имеет формулу: CH₃-[-O-CH₂CH₂-]_n-C(=O)-NHR, где n означает число единиц этиленоксида, и R означает остальную часть пептида. Полимер «ПЭОn» необязательно может иметь группу алкилена, (CH₂)_m, где m означает целое число от 1 до 5, между атомом углерода карбонила и повторяющимися единицами этиленоксида. Такой полимер «ПЭОn» (например, ПЭО12 или ПЭО24) является монодисперсным, т.е. представляет собой один дискретный полимер с конкретной молекулярной массой. Подобным образом, пептид CNP, конъюгированный через аминогруппу с полимером «ПЭГnK» с определенным числом nK, в общем, имеет формулу: CH₃-[-O-CH₂CH₂-]p-C(=O)-NHR, где p означает целое число больше 1. Полимер «ПЭГnK» также необязательно может иметь группу алкилена, (CH₂)_m, где m означает целое число от 1 до 5, между атомом углерода карбонила и повторяющимися единицами этиленоксида. Однако такой полимер «ПЭГnK» (например, ПЭГ1К, ПЭГ2К, ПЭГ5К или ПЭГ20К) является полидисперсным, т.е. содержит смесь полимеров, имеющих распределение по молекулярным массам, где число nK означает среднечисловую молекулярную массу полимера (M_n) в килодальтонах. Например, «ПЭГ2К», конъюгированный с пептидом CNP, означает полидисперсный полимер ПЭГ, имеющий среднечисловую молекулярную массу примерно 2 кДа.

В том случае, когда указан диапазон масс полимера (например, ПЭГ) (например, в единицах кДа), диапазон относится к диапазону среднечисловых молекулярных масс полимеров, а не к диапазону молекулярных масс множества полимеров в полидисперсной смеси, если специально не указано иное.

Термин «галоген», «галоид» относится к фтору, хлору, брому и/или йоду.

Термин «алкил» относится к неразветвленному или разветвленному насыщенному моновалентному углеводородному радикалу, при этом алкил необязательно может быть замещен одним или несколькими заместителями Q, которые описаны в настоящей публикации. В некоторых вариантах алкил представляет собой неразветвленный насыщенный моновалентный углеводородный радикал, который имеет от 1 до 20 (C_1-20), от 1 до 15 (C_1-15), от 1 до 12 (C_1-12), от 1 до 10 (C_1-10) или от 1 до 6 (C_1-6) атомов углерода, или разветвленный насыщенный моновалентный углеводородный радикал, имеющий от 3 до 20 (C_3-20), от 3 до 15 (C_3-15), от 3 до 12 (C_3-12), от 3 до 10 (C_3-10) или от 3 до 6 (C_3-6) атомов углерода. В используемом в настоящем описании смысле неразветвленные C_1-6 и разветвленные C_3-6-алкильные группы также называют «низшим алкилом». Примеры алкильных групп включают, но без ограничения, метил, этил, пропил (включая все изомерные формы, включая н-пропил и изопропил), бутил (включая все изомерные формы, включая н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил), пентил (включая все изомерные формы), и гексил (включая все изомерные формы). Например, C_1-6-алкил относится к неразветвленному насыщенному моновалентному углеводородному радикалу, имеющему от 1 до 6 атомов углерода, или разветвленному насыщенному моновалентному углеводородному радикалу, имеющему от 3 до 6 атомов углерода.

Термин «алкоксигруппа» относится к -O-алкильной группе. В некоторых вариантах алкоксигруппа необязательно может быть замещена одним или несколькими заместителями Q, которые описаны в настоящей публикации.

Термин «галогеналкил» относится к алкильной группе, которая замещена одним или несколькими атомами галогена. В некоторых вариантах галогеналкильная группа замещена одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью атомами галогена. В некоторых вариантах галогеналкильная группа необязательно может быть замещена одним или несколькими дополнительными заместителями Q, которые описаны в настоящей публикации.

Термин «циклоалкил» относится к циклическому насыщенному связанному мостиком и/или не связанному мостиком моновалентному углеводородному радикалу, который необязательно может быть замещен одним или несколькими заместителями Q, которые описаны в настоящей публикации. В некоторых вариантах циклоалкил имеет от 3 до 20 (C_3-20), от 3 до 15 (C_3-15), от 3 до 12 (C_3-12), от 3 до 10 (C_3-10) или от 3 до 7 (C_3-7) атомов углерода. Примеры циклоалкильных групп включают, но без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, декалинил и адамантил.

Термин «гетероциклил» или «гетероциклический» относится к моноциклической неароматической кольцевой системе или полициклической кольцевой системе, которая содержит по меньшей мере один неароматический цикл, при этом один или несколько атомов неароматического цикла являются гетероатомами, независимо выбранными из O, S или N, а остальные атомы неароматического цикла являются атомами углерода. В некоторых вариантах гетероциклил или гетероциклическая группа имеет от 3 до 20, от 3 до 15, от 3 до 10, от 3 до 8, от 4 до 7 или от 5 до 6 атомов в цикле. В некоторых вариантах гетероциклил представляет собой моноциклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, которая может включать конденсированную или связанную мостиком кольцевую систему и в которой атомы азота или серы необязательно могут быть окислены, атомы азота необязательно могут быть кватернизованы, и некоторые циклы могут быть частично или полностью насыщенными или ароматическими. Гетероциклил может быть связан с основной структурой по любому гетероатому или атому углерода, что приводит к созданию стабильного соединения. Примеры гетероциклических групп включают, но без ограничения, акридинил, азепинил, бензимидазолил, бензиндолил, бензоизоксазолил, бензизоксазинил, бензодиоксанил, бензодиоксолил, бензофуранонил, бензофуранил, бензонафтофуранил, бензопиранонил, бензопиранил, бензотетрагидрофуранил, бензотетрагидротиенил, бензотиадиазолил, бензотиазолил, бензотиофенил, бензотриазолил, бензотиопиранил, бензоксазинил, бензоксазолил, бензотиазолил, β-карболинил, карбазолил, хроманил, хромонил, циннолинил, кумаринил, декагидроизохинолинил, дибензофуранил, дигидробензизотиазинил, дигидробензизоксазинил, дигидрофурил, дигидропиранил, диоксоланил, дигидропиразинил, дигидропиридинил, дигидропиразолил, дигидропиримидинил, дигидропирролил, диоксоланил, 1,4-дитианил, фуранонил, фуранил, имидазолидинил, имидазолинил, имидазолил, имидазопиридинил, имидазотиазолил, индазолил, индолинил, индолизинил, индолил, изобензотетрагидрофуранил, изобензотетрагидротиенил, изобензотиенил, изохроманил, изокумаринил, изоиндолинил, изоиндолил, изохинолинил, изотиазолидинил, изотиазолил, изоксазолидинил, изоксазолил, морфолинил, нафтиридинил, октагидроиндолил, октагидроизоиндолил, оксадиазолил, оксазолидинонил, оксазолидинил, оксазолопиридинил, оксазолил, оксиранил, перимидинил, фенантридинил, фенатролинил, фенарсазинил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил, фталазинил, пиперазинил, пиперидинил, 4-пиперидонил, птеридинил, пуринил, пиразинил, пиразолидинил, пиразолил, пиридазинил, пиридинил, пиридопиридинил, пиримидинил, пирролидинил, пирролинил, пирролил, хиназолинил, хинолинил, хиноксалинил, хинуклидинил, тетрагидрофурил, тетрагидрофуранил, тетрагидроизохинолинил, тетрагидропиранил, тетрагидротиенил, тетразолил, тиадиазолопиримидинил, тиадиазолил, тиаморфолинил, тиазолидинил, тиазолил, тиенил, триазинил, триазолил и 1,3,5-тритианил. В некоторых вариантах гетероциклическая группа необязательно может быть замещена одним или несколькими заместителями Q, которые описаны в настоящей публикации.

Термин «арил» относится к моноциклической ароматической группе или полициклической моновалентной ароматической группе, которая содержит по меньшей мере один ароматический углеводородный цикл. В некоторых вариантах арил имеет от 6 до 20 (C_6-20), от 6 до 15 (C_6-15) или от 6 до 10 (C_6-10) атомов в цикле. Примеры арильных групп включают, но без ограничения, фенил, нафтил, флуоренил, азуленил, антрил, фенантрил, пиренил, бифенил и терфенил. Арил также относится к бициклическим или трициклическим углеродным циклам, в которых по меньшей мере один из циклов является ароматическим, а другие могут быть насыщенными, частично ненасыщенный или ароматическими, например, дигидронафтил, инденил, инданил и тетрагидронафтил (тетралинил). В некоторых вариантах арильная группа необязательно может быть замещена одним или несколькими заместителями Q, которые описаны в настоящей публикации.

Термин «гетероарил» относится к моноциклической ароматической группе или полициклической ароматической группе, которая содержит по меньшей мере один ароматический цикл, при этом по меньшей мере один ароматический цикл содержит один или несколько гетероатомов, независимо выбранных из O, S и N. Каждый цикл гетероарильной группы может содержать один или два атома O, один или два атома S и/или от одного до четырех атомов N, при условии, что общее количество гетероатомов в каждом цикле равно четырем или меньше, и каждый цикл содержит по меньшей мере один атом углерода. Гетероарил может быть связан с основной структурой по любому гетероатому или атому углерода, что приводит к созданию стабильного соединения. В некоторых вариантах гетероарил имеет от 5 до 20, от 5 до 15 или от 5 до 10 атомов в цикле. Примеры моноциклических гетероарильных групп включают, но без ограничения, пирролил, пиразолил, пиразолинил, имидазолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, тиадиазолил, изотиазолил, фуранил, тиенил, оксадиазолил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил и триазинил. Примеры бициклических гетероарильных групп включают, но без ограничения, индолил, бензотиазолил, бензоксазолил, бензотиенил, хинолинил, тетрагидроизохинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензопиранил, индолизинил, бензофуранил, изобензофуранил, хромонил, кумаринил, циннолинил, хиноксалинил, индазолил, пуринил, пирролопиридинил, фуропиридинил, тиенопиридинил, дигидроизоиндолил и тетрагидрохинолинил. Примеры трициклических гетероарильных групп включают, но без ограничения, карбазолил, бензиндолил, фенантроллинил, акридинил, фенантридинил и ксантенил. В некоторых вариантах гетероарильная группа необязательно может быть замещена одним или несколькими заместителями Q, которые описаны в настоящей публикации.

Подразумевается, что термин «необязательно замещенный» означает, что группа, включая алкил, алкоксигруппу, галогеналкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил, может быть замещена одним или несколькими заместителями Q (в одном варианте одним, двумя, тремя или четырьмя заместителями Q), где каждый Q независимо выбран из группы, состоящей из цианогруппы, галогена, оксогруппы, нитрогруппы, C_1-6-алкила, C_1-6-алкоксигруппы, галоген-C_1-6-алкила, C_3-7-циклоалкила, гетероциклила, C_6-14-арила, гетероарила, -C(O)R^e, -C(O)OR^e, -C(O)NR^fR^g, -C(NR^e)NR^fR^g, -OR^e, -OC(O)R^e, -OC(O)OR^e, -OC(O)NR^fR^g, -OC(=NR^e)NR^fR^g, -OS(O)R^e, -OS(O)₂R^e, -OS(O)NR^fR^g, -OS(O)₂NR^fR^g, -NR^fR^g, -NR^eC(O)R^f, -NR^eC(O)OR^f, -NR^eC(O)NR^fR^g, -NR^eC(=NR^h)NR^fR^g, -NR^eS(O)R^f, -NR^eS(O)₂R^f, -NR^eS(O)NR^fR^g, -NR^eS(O)₂NR^fR^g, -SR^e, -S(O)R^e, -S(O)₂R^e и -S(O)₂NR^fR^g, где каждый R^e, R^f, R^g и R^h независимо означает водород, C_1-6-алкил, C_3-7-циклоалкил, гетероциклил, C_6-14-арил или гетероарил; или R^f и R^g вместе с атомом N, с которым они связаны, образуют гетероциклил.

B. Варианты CNP

Применение CNP22 в качестве терапевтического средства ограничено его коротким временем полужизни в плазме (J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). В плазме человека концентрация CNP22 обычно составляет менее пяти пикомоль. У человека CNP22 разрушается и выводится из кровообращения посредством NEP и NPR-C (Growth Hormone and IGF Res., 16: S6-S14). Во всех исследованиях на человеке и животных с применением системно вводимого CNP22 использовали непрерывную инфузию, чтобы повысить концентрацию CNP22 у субъектов. Пептид CNP, имеющий более длительное время полужизни и, по меньшей мере, сходный уровень функциональности, может быть полезным для основанной на CNP методике терапии. Варианты CNP также раскрыты в родственной международной заявке № PCT/US08/84270, специально включенной в настоящее описание в виде ссылки.

Настоящее изобретение относится к вариантам CNP, которые имеют пониженную аффинность к NEP и/или NPR-C и пониженную чувствительность к расщеплению под действием NEP и/или пониженный клиренс посредством NPR-C, но которые имеют по существу сходную или повышенную функциональность, чем CNP22 дикого типа. Пониженная чувствительность вариантов CNP к расщеплению под действием NEP и/или клиренсу посредством NPR-C, может увеличивать время полужизни вариантов в плазме или сыворотке, тем самым увеличивая вероятность того, что варианты достигнут при распределении тканей и сайтов-мишеней и окажут требуемые фармакологические эффекты. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, имеют пониженную чувствительность к расщеплению под действием NEP и/или клиренсу посредством NPR-C in vitro или in vivo, по меньшей мере примерно в 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, или 5 раз по сравнению с wtCNP22, и имеют увеличенное время полужизни в плазме или сыворотке in vivo, по меньшей мере примерно в 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза или 5 раз по сравнению с wtCNP22, при этом сохраняя по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% функциональности wtCNP22 или имея по меньшей мере примерно в 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза или 5 раз большую функциональность, чем wtCNP22. Функциональность CNP можно оценить, например, по уровню одного или нескольких биомаркеров (например, цГМФ), ассоциированных с образованием или ростом хрящей или костей, в исследовании in vitro или in vivo, по длине конкретных костей в исследовании ex vivo или in vivo, и т.д.

Природные субстраты NEP являются низкомолекулярными, и натрийуретические пептиды (примерно от 2,2 до примерно 3,2 кДа) являются самыми крупными из природных субстратов. Согласно рентгеновскому кристаллографическому анализу активный участок NEP глубоко погружен внутрь центральной полости, эффективно ограничивая размер субстратных молекул до размера не более чем примерно 3 кДа (Oefner et al., J. Mol. Biol., 296: 341-349 (2000)). На основании исследований передачи сигнала NPR-B варианты CNP-22, такие как CNP-17 (сохраняющий только циклический домен CNP22, Cys6-Cys22) и CNP-53 (CNP-22 с 31-аминокислотным удлинением на N-конце), все еще могут связывать и активировать NPR-B подобно wtCNP-22 массой 2,2 кДа. Соответственно, изобретение охватывает варианты CNP, конъюгированные с природным (например, пептидом) и/или синтетическим (например, ПЭГ) полимером на N-конце и/или C-конце CNP22 или его вариантов, которые проявляют повышенную резистентность к NEP, но сохраняют способность связывать и активировать рецептор передачи сигнала NPR-B.

В одном варианте изобретение охватывает варианты CNP, представленные общей формулой:

(x)-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO:139), или

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO:140), где:

(x) и (z), каждый независимо, означают природный полимер (например, пептидную последовательность, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту) и/или синтетический полимер (например, ПЭГ), который описан в настоящей публикации, так что общая масса варианта CNP находится в диапазонах, в общем описанных в настоящей публикации, например, в диапазоне примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа. В одном варианте остатки от Cys6 до Cys22 образуют циклическую часть. В одном варианте (x) и/или (z) содержат аминокислотное удлинение, полученное из полипептида NPPC или из полипептида, отличного от CNP (например, ANP, BNP, IgG, и т.д.), при этом удлинение содержит от 1 до 40, от 1 до 35, от 1 до 31, от 5 до 35, от 5 до 31 или от 5 до 15 аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP содержат одну или несколько модификаций и/или замен другой природной аминокислотой, неприродной аминокислотой, пептидомиметиком, и/или изостер пептидной связи в одном или нескольких из следующих положений CNP22: Gly1, Lys4, Gly5, Cys6, Phe7, Gly8, Leu9, Lys10, Leu11, Ile14, Gly15, Ser16, Met17, Gly19, Leu20 и Gly21.

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP, имеющие общую массу в диапазонах, в общем описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, предназначенные для повышенной резистентности к расщеплению NEP, представлены общей формулой:

(x)-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-(h)₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 141), или

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(b)₄-Gly₅-Cys₆-Phe₇-Gly₈-Leu₉-(h)₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 6), где:

(x) означает синтетическую или природную полимерную группу или их сочетание, при этом неограничивающим примером синтетической полимерной группы является ПЭГ (или ПЭО), и неограничивающим примером природной полимерной группы является аминокислотная последовательность, содержащая от 1 до 35 аминокислот и полученная из NPPC или его вариантов с заменами и/или делециями, ANP, BNP или других (поли)пептидов, отличных от CNP, таких как, например, сывороточный альбумин, IgG, богатые гистидином гликопротеиды, фибронектин, фибриноген, пептиды, содержащие цинковые пальцы, остеокрин или фактор роста фибробластов 2 (FGF2);

(z) может отсутствовать или может представлять собой синтетическую или природную полимерную группу или их сочетание, при этом неограничивающим примером синтетической полимерной группы является ПЭГ, и неограничивающим примером природной полимерной группы является аминокислотная последовательность, полученная из натрийуретического полипептида (например, NPPC, CNP, ANP или BNP) или ненатрийуретического полипептида (например, сывороточного альбумина или IgG); и

(b) и (h) независимо могут представлять собой Lys дикого типа в данном положении или могут быть заменены с использованием консервативной аминокислотной замены или любой природной или неприродной аминокислоты или пептидомиметика, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Glu или Ser. В одном варианте (b) означает Arg. В другом варианте для повышенной резистентности к NEP (b) не является Gly. В еще одном варианте (h) не является Arg.

Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей, полученных из NPPC или его вариантов, включают:

Arg,

Glu-Arg,

Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 7),

Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 8),

Gly-Ala-Asn-Pro-Arg (SEQ ID NO: 9),

Gly-Ala-Asn-Gln-Gln (SEQ ID NO: 10),

Gly-Ala-Asn-Ser-Ser (SEQ ID NO: 11),

Gly-Ala-Asn-Arg-Gln (SEQ ID NO: 12),

Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID NO: 13),

Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID NO: 14),

Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO: 15),

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala (SEQ ID NO: 16),

Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg (SEQ ID NO: 17),

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO: 18),

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO:19),

Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO:20),

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 21) и

Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 22).

Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей, полученных из полипептидов, отличных от CNP, таких как, например, ANP, BNP, сывороточный альбумин и IgG, включают:

Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser (SEQ ID NO: 23);

Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 24);

Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 25);

Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 26);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 27);

Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His (SEQ ID NO: 28);

Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg (SEQ ID NO: 29);

Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr (SEQ ID NO: 30);

Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln (SEQ ID NO: 31);

Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 32).

В одном варианте N-концевая группа (x) и/или C-концевая группа (z) любого из вариантов CNP, имеющих группу (x) и/или (z), которые описаны в настоящей публикации, независимо содержат аминокислотную последовательность, которая содержит небольшое количество, если вообще содержит, кислых природных или неприродных аминокислот (например, Asp или Glu). В другом варианте (x) и/или (z) обогащены основными природными или неприродными аминокислотами (например, Lys, Arg или His), для поддержания щелочного значения pI, сходного с pI CNP22 (pI 8,9). В одном варианте осуществления изобретения pI вариантов CNP находится в диапазоне примерно от 8 до примерно 10,5, так чтобы варианты CNP могли быстрее диффундировать через внеклеточный матрикс, окружающий хондроциты ростовых пластинок кости. В наиболее узких вариантах pI вариантов CNP составляет примерно от 8,5 до примерно 10,5, или примерно от 8,5 до примерно 10, или примерно от 9 до примерно 10.

В еще одном варианте (x) и/или (z) обогащены полярными природными или неприродными аминокислотами, предназначенными для повышенной растворимости в воде. В еще одном варианте (x) и/или (z) содержат небольшое количество, если вообще содержат, гидрофобных природных или неприродных аминокислот (например, Ala, Val, Leu, Ile или Met).

В следующем варианте N-конец вариантов CNP заканчивается по меньшей мере одним остатком глицина, предназначенным для получения увеличенного времени полужизни в сыворотке. В родственном варианте для предотвращения образования пироглутамина N-конец вариантов CNP заканчивается остатком глицина, если в других случаях он заканчивается глутамином. В одном варианте группа (x) содержит аминокислотное удлинение, N-конец которого заканчивается по меньшей мере одним остатком глицина. В другом варианте (x) и/или (z) не содержат двух соседних основных природных или неприродных аминокислот (например, Lys-Lys или Arg-Arg), для того, чтобы уменьшить чувствительность к расщеплению протеазой фурином. В одном варианте (x) не содержит двух соседних основных аминокислот, непосредственно предшествующих положению, соответствующему Gly1 в CNP22.

В еще одном варианте группа (x) и/или группа (z) вариантов CNP содержит аминокислотную последовательность, полученную из NPPC (например, полученную из CNP53). В одном варианте (x) содержит аминокислотную последовательность, полученную из N-концевого хвоста ANP или BNP. В другом варианте (z) содержит аминокислотную последовательность, полученную из C-концевого хвоста ANP или BNP. В следующем варианте (x) и/или (z) содержат аминокислотную последовательность, полученную из ненатрийуретического полипептида, такого как, например, IgG, сывороточный альбумин человека (HSA), богатые гистидином гликопротеиды, фибронектин, фибриноген, полипептиды, содержащие цинковые пальцы, FGF-2 и белки, мишенью которых являются кости (например, остеокрин, остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин).

В любом варианте, описанном в настоящей публикации, в котором CNP22 или его вариант могут иметь N-концевую группу (x) и/или C-концевую группу (z), (x) и/или (z) независимо могут содержать аминокислотную последовательность, полученную из функционального домена костного морфогенетического белка (BMP). N-концевое и/или C-концевое аминокислотное удлинение, полученное из функционального домена BMP, может повышать резистентность к NEP и, следовательно, время полужизни в сыворотке варианта CNP благодаря увеличению общей массы варианта CNP до диапазонов, в общем описанных в настоящей публикации, например, диапазона примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа. Кроме того, так как некоторые BMP являются факторами роста и цитокинами, которые индуцируют образование кости и хряща, то фрагмент, полученный из функционального домена BMP, может стимулировать рост хондроцитов, хряща или кости посредством механизма, отличного от активации гуанилилциклазной функции NPR-B циклическим доменом CNP22 или его вариантом. Неограничивающими примерами BMP, которые стимулируют образование и развитие кости, образование и развитие хряща и/или дифференцировку остеобластов, включают BMP1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 и BMP8a. В одном варианте N-конец и/или C-конец CNP22 или его варианта независимо конъюгированы с аминокислотной последовательностью, полученной из последних 140 аминокислот в C-концевой части BMP1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 или BMP8a.

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP содержат аминокислотное удлинение на N-конце и/или C-конце CNP22 или CNP17, включая без ограничения:

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 4);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37, аналог BL) (SEQ ID NO: 60);

AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CA) (SEQ ID NO: 61);

AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CB) (SEQ ID NO: 62);

DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CC) (SEQ ID NO: 63);

RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 40);

ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 38);

GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 64);

GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 65);

GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 66);

GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 67);

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 144); и SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (аналог CD) (CNP17, имеющий N-концевой и C-концевой хвосты, полученные из BNP) (SEQ ID NO: 68).

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют замену K4R в положении 4 CNP22. Неограничивающими примерами вариантов CNP(K4R) являются:

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог AY) (SEQ ID NO: 36);

GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CI) (SEQ ID NO: 37);

RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог AZ) (SEQ ID NO: 41);

ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог BA) (SEQ ID NO: 39);

GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CH) (SEQ ID NO: 69); и

GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CG) (SEQ ID NO: 70).

В следующих вариантах осуществления изобретения варианты CNP являются химерами, содержащими CNP22 или его вариант, имеющий добавление(ия), делецию(ии) и/или замену(ны) аминокислот, и пептидный фрагмент, полученный из другого полипептида или белка, отличного от CNP, или целый полипептид или белок, отличный от CNP на N-конце пептида CNP, при этом CNP22 или его вариант необязательно может иметь N-концевое аминокислотное удлинение из одного или нескольких аминокислотных остатков. В некоторых вариантах химеры CNP содержат CNP22 или его вариант, который имеет N-концевое аминокислотное удлинение из одного или нескольких аминокислотных остатков. В некоторых вариантах химеры CNP содержат остатки лизин-лизин (KK) или остатки GANKK, непосредственно предшествующие первому положению CNP22 (Gly в случае CNP22) или его варианта. В других вариантах химеры CNP содержат один или два остатка, отличных от остатков лизина-лизина, непосредственно предшествующих первому положению CNP22 или его варианта. Неограничивающими примерами остатков, которые могут непосредственно предшествовать первому положению CNP22 или его варианта, являются KP, PK, PR, PQ, QK, QQ, RR, SS, GANKP (SEQ ID NO: 200), GANPK (SEQ ID NO: 201), GANPR (SEQ ID NO: 9), GANPQ (SEQ ID NO: 202), GANQK (SEQ ID NO: 203), GANQQ (SEQ ID NO: 10), GANRR (SEQ ID NO: 8) и GANSS (SEQ ID NO: 11).

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP представляют собой химеры, содержащие CNP22 и N-концевой пептидный фрагмент, включая без ограничения:

GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CQ) (химера фрагмент богатого гистидином гликопротеида (HRGP)-CNP22) (SEQ ID NO: 76);

GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CR) (химера фрагмент HRGP-CNP22) (SEQ ID NO: 77);

GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CX) (химера HRGP фрагмент-CNP22) (SEQ ID NO: 78);

GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CF) (химера фрагмент IgG₁(F_c)-CNP22) (SEQ ID NO: 79);

GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CY) (химера фрагмент сывороточного альбумина человека (HSA)-CNP22) (SEQ ID NO: 80);

GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CE) (химера фрагмент HSA-CNP22) (SEQ ID NO: 81);

FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CZ) (химера фрагмент «ингибитора NRP C» остеокрина-CNP22) (SEQ ID NO: 82); и

GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог DA) (химера фрагмент «гепарин-связывающего домена» FGF2-CNP22) (SEQ ID NO: 83).

В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP являются химерами, содержащими N-концевой пептидный фрагмент и CNP22, в котором Lys4 в CNP22 заменен аргинином («CNP22(K4R)»), включая без ограничения:

GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CK) (химера фрагмент IgG₁(F_c)-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 84);

GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CL) (химера фрагмент HSA-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 85);

GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CM) (химера фрагмент фибронектина-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 86);

GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CN) (химера фрагмент фибриногена-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 87);

GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CO) (химера фрагмент фибриногена-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 88); и

GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CP) (химера фрагмент цинкового пальца-CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 89).

Химеры, содержащие IgG и CNP22 или его вариант, предназначены, наряду с прочим, для повышенной резистентности к разрушению под действием NEP и пониженному связыванию с сывороточным альбумином. Химеры CNP, содержащие поверхностный фрагмент HSA, предназначены, наряду с прочим, для пониженной иммуногенности и пониженного связывания с сывороточным альбумином. Химеры HRGP-CNP22 и HRGP-CNP22(K4R), содержащие катионную, богатую гистидином нелизиновую неаргининовую последовательность на N-конце, предназначены, наряду с прочим, для повышенной стабильности к протеазам. Химеры, содержащие фрагмент остеокрина, предназначены для высвобождения при расщеплении протеазой (например, фурином) фрагмента остеокрина в ростовых пластинках кости, при этом фрагмент может ингибировать клиренс-рецептор NPR-C. Что касается химер, содержащих гепарин-связывающий фрагмент FGF2, то связывание гепарина с фрагментом предназначено для защиты химер от разрушения, что обеспечивает более длительное время полужизни в сыворотке. Химеры, содержащие фрагмент фибронектина, фибриногена или цинкового пальца, предназначены для пониженного связывания с сывороточным альбумином, наряду с другими полезными признаками.

Не имея намерения быть связанными с теорией, предполагают, что вариант CNP с молекулярной массой примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, который имеет повышенную резистентность к расщеплению под действием NEP и имеет сходную или повышенную функциональность (например, связывание с NPR-B и стимуляцию передачи сигнала цГМФ) по сравнению с wtCNP22, может быть более эффективным, если он тесно не связан с белками плазмы, такими как сывороточный альбумин. Вариант CNP, который тесно не связан с белками плазмы (например, сывороточным альбумином), может более эффективно диффундировать через хрящ, достигая хондроцитов ростовых пластинок кости, и связываться и активировать NPR-B для передачи сигнала цГМФ. В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP, предназначенные для пониженного связывания с белками плазмы (например, с сывороточным альбумином), представляют собой химеры, содержащие CNP22 или его вариант и пептидный фрагмент из IgG. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP, предназначенные для пониженного связывания с белками плазмы, представляют собой химеры, содержащие CNP22 или CNP22(K4R) и фрагмент из полипептида (например, IgG, HSA, фибронектина, фибриногена, содержащего цинковые пальцы полипептида и т.д.). В еще одном варианте осуществления изобретения варианты CNP, предназначенные для пониженного связывания с белками плазмы, содержат CNP22 или его вариант, конъюгированный с гидрофильным или водорастворимым полимером. В одном варианте гидрофильным или водорастворимым полимером является ПЭГ (или ПЭО). В другом варианте гидрофильный или водорастворимый полимер (например, ПЭГ) функционализируют одной или несколькими функциональными группами, которые придают отрицательный заряд полимеру в физиологических условиях, такими как карбоксильная, сульфатная или фосфатная группы или их сочетание.

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP согласно изобретению включают укороченные пептиды CNP в диапазоне от CNP-17 человека (hCNP-17) до CNP-53 человека (hCNP-53), имеющие аминокислотные последовательности дикого типа, полученные из hCNP-53. Такие укороченные пептиды CNP включают:

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 4);

LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-52) (SEQ ID NO: 146);

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-51) (SEQ ID NO: 147);

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-50) (SEQ ID NO: 148);

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-49) (SEQ ID NO: 149);

TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-48) (SEQ ID NO: 150);

KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-47) (SEQ ID NO: 151);

SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-46) (SEQ ID NO: 152);

RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-45) (SEQ ID NO: 153);

AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-44) (SEQ ID NO: 154);

AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-43) (SEQ ID NO: 155);

WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-42) (SEQ ID NO: 156);

ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 157);

RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-40) (SEQ ID NO: 158);

LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 159);

LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 160);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37) (SEQ ID NO: 60);

EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-36) (SEQ ID NO: 161);

HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-35) (SEQ ID NO: 162);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-34) (SEQ ID NO: 163);

NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-33) (SEQ ID NO: 164);

ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-32) (SEQ ID NO: 165);

RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-31) (SEQ ID NO: 166);

KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-30) (SEQ ID NO: 167);

YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-29) (SEQ ID NO: 168);

KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-28) (SEQ ID NO: 169);

GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-27) (SEQ ID NO: 170);

ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-26) (SEQ ID NO: 171);

NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-25) (SEQ ID NO: 172);

KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-24) (SEQ ID NO: 173);

KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-23) (SEQ ID NO: 174);

GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 1);

LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-21) (SEQ ID NO: 175);

SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-20) (SEQ ID NO: 176);

KGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-19) (SEQ ID NO: 177);

GCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-18) (SEQ ID NO: 178); и

CFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-17) (SEQ ID NO: 2).

В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP не включают CNP-17, CNP-22 или CNP-53.

В другом варианте укороченные пептиды CNP в диапазоне от hCNP-17 до hCNP-53 могут содержать добавление(ия), делецию(ии) и/или замену(ны) аминокислот природной или неприродной аминокислотой(ами) или пептидомиметиком(ами) (например, изостером(ами) пептидной связи), которые описаны в настоящей публикации, в любом одном или нескольких положениях аминокислот в конкретных укороченных пептидах CNP. В еще одном варианте укороченные пептиды CNP, имеющие последовательности дикого типа или добавление(ия), делецию(ии) и/или замену(ны) аминокислот, могут быть конъюгированы на N-конце, C-конце и/или внутреннем участке(ах) с любым из компонентов, описанных в настоящей публикации, включая без ограничения направляющие к костям или хрящам компоненты (например, бисфосфонаты, направляющие к костям или хрящам пептидные последовательности (например, поли-Asp, поли-Glu), пептидные последовательности, полученные из направляющих к костям доменов костных белков (например, остеопонтина, остеокальцина, сиалопротеина)), пептидные последовательности, полученные из функциональных доменов костных морфогенетических белков (например, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7, BMP8a), пептидные последовательности, полученные натрийуретических полипептидов (например, NPPC, ANP, BNP), пептидные последовательности, полученные из полипептидов ненатрийуретического происхождения (например, сывороточного альбумина, IgG, богатых гистидином гликопротеидов, фибронектина, фибриногена, полипептидов, содержащих цинковые пальцы, FGF-2, остеокрина), компоненты, которые уменьшают почечный клиренс (например, отрицательно заряженные остатки ПЭГ), гидрофильные полимеры (например, ПЭГ), углеводы (например, углеводы, узнаваемые рецепторами на поверхности клеток в ростовых пластинках кости), гидрофобные кислоты (например, C₅-C₁₂-карбоновые кислоты, природные жирные кислоты), фосфолипиды и их сочетания. В одном варианте укороченные пептиды CNP, имеющие последовательности дикого типа или добавление(ия), делецию(ии) и/или замену(ны) аминокислот и необязательно конъюгированные с одним или несколькими компонентами на N-конце, C-конце и/или внутреннем участке(ах), имеют общую массу в диапазонах, в общем описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа.

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP являются производными CNP37, которые представляют собой QEHPNARKYKGANKK-CNP22 (SEQ ID NO: 60). Варианты CNP37 могут содержать добавление(ия), делецию(ии) и/или замену(ны) аминокислот природной или неприродной аминокислотой(ами) или пептидомиметиком(ами) (например, изостером(ами) пептидной связи) в любом одном или нескольких из 37 положений в CNP37. Неограничивающие примеры замен, которые могут быть осуществлены в CNP37, включают K4R, G5S, G5R, G8S, K10R, G15S, S16Q, M17N, G19R и их сочетания (на основе нумерации CNP22). В одном варианте производные CNP37 содержат замену Met17 на природную (например, аспарагин) или неприродную аминокислоту или пептидомиметик, отчасти предназначенные для того, чтобы избежать окисления атома серы метионина. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP37 содержат замену(ны) Lys8, Lys10, Lys14 и/или Lys15 (на основе нумерации с N-конца CNP37) на неосновную природную или неприродную аминокислоту(ты) или пептидомиметик(ки), отчасти предназначенные для уменьшения связывания альбумина.

Дополнительно или альтернативно добавлению(иям), делеции(иям) и/или замене(нам) аминокислот производные CNP37 могут быть конъюгированы на N-конце, C-конце и/или внутреннем участке с любым из компонентов, описанных в настоящей публикации, включая без ограничения направляющие к костям или хрящам компоненты (например, направляющие к костям пептидные домены), компоненты, которые уменьшают почечный клиренс (например, отрицательно заряженные остатки ПЭГ), гидрофильные полимеры (например, ПЭГ), аминокислотные последовательности, содержащие одну или несколько аминокислот (например, фрагмент «ингибитора NPR-C» остеокрина), углеводы (например, углеводы, узнаваемые рецепторами на поверхности клеток в ростовых пластинках кости), гидрофобные кислоты (например, C₅-C₁₂-карбоновые кислоты и природные жирные кислоты) и их сочетания.

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP представляет собой модифицированные пептиды CNP37, имеющие мутацию(ии)/замену(ны) в сайте расщепления фурином (подчеркнут), предназначенные для повышения резистентности in vivo к протеазе фурину, и/или содержащие глицин (подчеркнут) на N-конце, предназначенный для повышения стабильности в плазме и предотвращения образования пироглутамина. Такие варианты CNP37 включают, но без ограничения:

GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CS) (SEQ ID NO: 71);

GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CT) (SEQ ID NO: 72);

GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CU) (SEQ ID NO: 73);

GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CW) (SEQ ID NO: 74);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP37, аналог DB) (SEQ ID NO: 75); и

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145).

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP согласно изобретению включают пептиды CNP и их варианты, которые могут быть получены способом слиянии белков, описанным в настоящей публикации. Неограничивающими примерами вариантов CNP, которые могут быть получены способом слияния белков, описанным в настоящей публикации, с использованием химического или протеолитического расщепления или саморасщепления белков, являются:

GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-wtCNP53) (SEQ ID NO: 179);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 75);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (wtCNP37) (SEQ ID NO: 60);

GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (фрагмент HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 144);

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 36);

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP53(M48N)] (SEQ ID NO: 180);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP37(M32N)] (SEQ ID NO: 181);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP37(M32N)] (SEQ ID NO: 182);

GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP27(M22N)] (SEQ ID NO: 183);

GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 184);

PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-wtCNP53) (SEQ ID NO: 185);

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 145);

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-wtCNP37) (SEQ ID NO: 186);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (wtCNP34) (SEQ ID NO: 187);

P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 188);

PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Pro-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 189);

MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-wtCNP53) (SEQ ID NO: 190);

MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 191);

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-wtCNP37) (SEQ ID NO: 192);

M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 193);

MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Met-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 194).

Другие варианты CNP, включающие укороченные пептиды CNP в диапазоне от hCNP-17 до hCNP-53 и имеющие последовательности дикого типа или добавление(ия), делецию(ии) и/или замену(ны) аминокислот, также могут быть получены способом слияние белков, описанным в настоящей публикации, при условии, что предполагаемый сайт химического или протеолитического расщепления слитого белка не присутствует в аминокислотной последовательности самого целевого варианта CNP. В качестве неограничивающего примера способ слияния белков, описанный в настоящей публикации, может быть применен для получения укороченного wtCNP34 с использованием расщепления муравьиной кислотой.

В дополнительных вариантах в случае любого из пептидов CNP и вариантов CNP, описанных в настоящей публикации, которые имеют остаток(ки) аспарагина (Asn/N) и/или остаток(ки) глутамина (Gln/Q), независимо от того, имеют ли они последовательность дикого типа или последовательность из неприродных аминокислот, любой остаток(ки) Asn и/или любой остаток(ки) Gln независимо может быть заменен любыми другими природными или неприродными аминокислотами, включая консервативные замены, такие как Asn на Gln. Такая замена(ны) отчасти предназначена для того, чтобы минимизировать или избежать возможного дезамидирования аспарагина и/или глутамина. Неограничивающими примерами пептидов и вариантов CNP, в которых любой остаток(ки) Asn и/или любой остаток(ки) Gln независимо могут быть заменены любыми другими природными или неприродными аминокислотами, включая консервативные замены, такие как Asn на Gln, являются wtCNP34, wtCNP37, Gly-wtCNP37, Pro-wtCNP37, Pro-Gly-wtCNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 144), Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 188), ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) и ПЭО24-GANRR- CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36). В некоторых вариантах остаток аспарагина пептидов CNP и вариантов CNP, описанных в настоящей публикации, не заменен глутамином, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой. В некоторых вариантах остаток глутамина пептидов CNP и вариантов CNP, описанных в настоящей публикации, не заменен аспарагином, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой. В качестве неограничивающего примера остатки аспарагина 7 и/или 15 в Pro-Gly-wtCNP37 (PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 145) независимо могут быть заменены любыми другими природными или неприродными аминокислотами, включая глутамин, чтобы избежать возможного дезамидирования остатка(ков) аспарагина до аспарагиновой кислоты или изоаспарагиновой кислоты. В некоторых вариантах остатки аспарагина 7 и/или 15 в Pro-Gly-wtCNP37 не заменены глутамином, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой.

Однако следует понимать, что настоящее изобретение охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько вплоть до всех остатков, чувствительных к дезамидированию или подобной дезамидированию реакции (например, изомеризации), могут быть превращены в другой остаток(ки) посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции в любой степени вплоть до 100% превращения на подвергаемый превращению остаток. В некоторых вариантах изобретение охватывает варианты CNP, в которых:

(1) любой один или несколько, вплоть до всех, остатков аспарагина (Asn/N) могут быть превращены в аспарагиновую кислоту или аспартат и/или в изоаспарагиновую кислоту или изоаспартат посредством дезамидирования примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток; или

(2) любой один или несколько, вплоть до всех, остатков глутамина (Gln/Q) могут быть превращены в глутаминовую кислоту или глутамат и/или в изоглутаминовую кислоту или изоглутамат посредством дезамидирования примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток; или

(3) любой один или несколько, вплоть до всех, остатков аспарагиновой кислоты или аспартата (Asp/D) могут быть превращены в изоаспарагиновую кислоту или изоаспартат посредством подобной дезамидированию реакции (также называемой изомеризацией) примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток; или

(4) любой один или несколько, вплоть до всех, остатков глутаминовой кислоты или глутамата (Glu/E) могут быть превращены в изоглутаминовую кислоту или изоглутамат посредством подобной дезамидированию реакции (также называемой изомеризацией) примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток; или

(5) сочетание указанного выше.

В качестве неограничивающего примера изобретение охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех, остатков аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты Pro-Gly-wtCNP37 [PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 145) могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) глутаминовую кислоту/глутамат и/или изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, (3) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат и/или (4) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток, как описано выше.

В качестве следующего примера изобретение охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина и/или аспарагиновой кислоты в Pro-Gly-wtCNP37 [PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 145) могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат и/или (2) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.

В качестве другого примера настоящее изобретение охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты в Gly-wtCNP37 [GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 75)] могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) глутаминовую кислоту/глутамат и/или изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, (3) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, и/или (4) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.

В еще одном примере изобретение охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты в wtCNP37 [QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 60)] могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) глутаминовую кислоту/глутамат и/или изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, (3) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат и/или (4) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.

В качестве следующего примера настоящее изобретение охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты в химере HSA-wtCNP27, GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 144), могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат и/или (3) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.

В еще одном примере изобретение охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты в химере Pro-HSA-wtCNP27, PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 188) могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат и/или (3) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции примерно до 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков метионина (Met/M) могут быть окислены до любой химически возможной окисленной формы (например, сульфоксида и/или сульфона) вплоть до примерно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на окисленный остаток.

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP содержат CNP22 или его варианты, конъюгированные на N-конце и/или C-конце с компонентом(ами), который облегчает транслокацию вариантов через клеточную мембрану или клеточный барьер. В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP конъюгированы на N-конце и/или C-конце с пептидной последовательностью(ями), которая облегчает транспорт вариантов через клеточную мембрану или клеточный барьер, включая транспорт посредством активных переносчиков пептидов.

В следующем варианте N-конец и/или C-конец CNP22 или его варианта конъюгированы с химическими остатками, такими как, например, природные и/или синтетические полимеры, чтобы увеличить общую массу модифицированного пептида CNP до диапазонов, в общем описанных в настоящей публикации, например, до диапазона примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа. В одном варианте химическими остатками являются биосовместимые гидрофильные или водорастворимые природные (например, пептиды, углеводы) или синтетические (например, ПЭГ (или ПЭО)) полимеры.

В конкретном варианте N-конец и/или C-конец CNP22 или его варианта конъюгированы с полимерами ПЭГ (или ПЭО) с получением общей массы в диапазонах, в общем описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа. Пегилирование CNP22 или его варианта предназначено, наряду с прочим, для уменьшения иммуногенности и увеличения времени полужизни за счет снижения почечного клиренса и повышения резистентности к протеазам. Остаток ПЭГ может быть связан с N- и/или C-концом CNP22 или любого варианта, описанного в настоящей публикации, включая без ограничения CNP-17 (циклизованная Cys6-Cys22-часть CNP22), CNP37 и варианты CNP17, CNP22 или CNP37, имеющие N- и/или C-концевое аминокислотное удлинение(ия), аминокислотную замену(ны) и/или аминокислотную делецию(ии). В одном варианте остатки Lys4 и/или Lys10 в CNP17, CNP22 или CNP37 или их вариантах заменены природной или неприродной аминокислотой (например, Arg, Gly, Ser, Gln, Glu или Cit) или пептидомиметиком, который не содержит химически активного первичного амина в боковой цепи, чтобы препятствовать любому возможному пегилированию таких остатков лизина. В одном варианте остатки Lys4 и/или Lys10 пептидов CNP заменены на Arg. В другом варианте остаток Lys10 не заменен на Arg.

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP (включая CNP22 и его варианты), имеющие остаток ПЭГ (или ПЭО) и аминокислотное удлинение на N-конце, содержат аргинин в положении, непосредственно предшествующем положению Gly1 в CNP22. Такие пегилированные варианты CNP предназначены для повышения резистентности к расщеплению под действием NEP, для пониженного связывания с сывороточным альбумином и повышенной функциональной активности CNP (например, активации передачи сигнала цГМФ). Неограничивающими примерами пегилированных вариантов CNP являются ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), ПЭО24-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 36), ПЭО12-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 36), ПЭО24-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), ПЭО12-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), ПЭО24-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 37), ПЭО12-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 37), ПЭО24-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 64), ПЭО12-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 64), ПЭО24-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), ПЭО12-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), ПЭО24-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 39), ПЭО12-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 39), ПЭО24-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), ПЭО12-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), ПЭО24-R-CNP22 (SEQ ID NO: 41) и ПЭО12-R-CNP22 (SEQ ID NO: 41), где ПЭО24 означает монодисперсный полимер ПЭГ 1,2 кДа, и ПЭО12 означает монодисперсный полимер ПЭГ 0,6 кДа. В одном варианте полимер ПЭГ (или ПЭО) конъюгирован с N-концом вариантов CNP.

Изобретение охватывает применение гидрофильных или водорастворимых полимеров (например, ПЭГ), которые могут варьировать по типу (например, гомополимер или сополимер; случайный, чередующийся или блок-сополимер; линейный или разветвленный; монодисперсный или полидисперсный), связи (например, гидролизуемая или стабильная связь, такая как, например, амидная, иминная, аминальная, алкиленовая или сложноэфирная связь), участку конъюгирования (например, на N-конце и/или C-конце, предпочтительно не в одном из остатков в циклизованной области CNP (соответствующей остаткам 6-22 в CNP22)) и длине (например, примерно от 0,2, 0,4 или 0,6 кДа до примерно 2, 3, 4 или 5 кДа). Гидрофильный или водорастворимый полимер может быть конъюгирован с пептидом CNP с использованием химического способа, основанного на N-гидроксисукцинимиде (NHS) или альдегиде, или другого химического способа, который известен в данной области. Такие варианты CNP могут быть созданы с использованием, например, wtCNP-22 (2,2 кДа); CNP-17, сохраняющий только циклизованную область (остатки 6-22) wtCNP22, варианты CNP, имеющие аминокислотное удлинение на N-конце и/или C-конце CNP22 или CNP17, или варианты, имеющие аминокислотные замены, добавления и/или делеции, такие как, например, GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), R-CNP22 (SEQ ID NO: 40), R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38) и ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39). В одном варианте осуществления изобретения варианты ПЭГ-CNP, имеющие общую массу в диапазонах, в общем, описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, содержат монодисперсный линейный остаток ПЭГ (или ПЭО), конъюгированный на N-конце и/или C-конце с использованием основанной на NHS или альдегиде химии, или разветвленный на два плеча или три плеча остаток ПЭГ, конъюгированный на N-конце и/или C-конце с использованием основанной на NHS химии. Изобретение также охватывает отрицательно заряженные варианты ПЭГ-CNP, предназначенные для пониженного почечного клиренса, включая без ограничения карбоксилированные, сульфатированные и фосфорилированные соединения (Caliceti, Adv. Drug Deliv. Rev., 55: 1261-77 (2003); Perlman, J. Clin. Endo. Metab., 88: 3227-35 (2003); Pitkin, Антиmicrob. Ag. Chemo., 29: 440-444 (1986); Vehaskari, Kidney Int'l, 22: 127-135 (1982)). В одном варианте остаток ПЭГ (или ПЭО) содержит карбоксильную группу(пы), сульфатную группу(пы) и/или фосфатную группу(пы).

В другом варианте остатки ПЭГ (или ПЭО), конъюгированные с N-концом, C-концом и/или внутренним участком(ами) вариантов CNP, описанных в настоящей публикации, содержат одну или несколько функциональных групп, которые положительно заряжены в физиологических условиях. Такие остатки ПЭГ предназначены, наряду с прочим, для улучшения распределения таких пегилированных вариантов CNP в хрящевых тканях. В одном варианте такие остатки ПЭГ содержат одну или несколько первичных, вторичных или третичных аминогрупп, групп четвертичного аммония и/или других аминосодержащих групп (например, мочевины).

В одном варианте изобретение охватывает CNP22 или его варианты, конъюгированные с использованием основанной на NHS- или альдегиде химии с ПЭГ (или ПЭО) формулы (CH₂CH₂O)_n, где n означает целое число примерно от 6 до примерно 100, и полимер ПЭГ имеет массу примерно от 0,3 кДа до примерно 5 кДа. В другом варианте n означает целое число примерно от 12 до примерно 50, и полимер ПЭГ имеет массу примерно от 0,6 кДа до примерно 2,5 кДа. В еще одном варианте n составляет примерно от 12 до примерно 24, и полимер ПЭГ имеет массу примерно от 0,6 кДа до примерно 1,2 кДа. В еще одном варианте концевая гидроксильная группа полимера ПЭГ блокирована химически неактивной группой. В конкретном варианте блокирующей концы группой является алкильная группа, например, группа низшего алкила, такая как метил.

В следующем варианте изобретение относится к вариантам CNP, имеющим одну или несколько пептидных связей или изостер пептидной связи, которые обладают пониженной чувствительностью к расщеплению пептидазами, включая нейтральную эндопептидазу (NEP). NEP является связанной с мембраной зависимой от цинка эндопептидазой, которая расщепляет пептидную связь субстрата на аминоконце крупных гидрофобных остатков. Таким образом, модификация пептидной связи на участке расщепления NEP с получением неприродной пептидной или непептидной связи может предотвращать или уменьшать эффективность расщепления NEP.

Сообщается, что в случае ANP и CNP расщепление под действием NEP сначала происходит по связи Cys6-Phe7 в циклизованной области, затем в других местах в остальной части структур. В случае BNP, как сообщается, расщепление сначала происходит на N-конце пептида, затем в циклической структуре. Хотя первичным сайтом расщепления NEP в CNP, как сообщается, является связь Cys6-Phe7, при воздействии на wtCNP22 расщепляющей NEP в течение 2,5 минут in vitro неожиданно гидролизуются все возможные сайты, при этом немного более лабильными являются пептидные связи Cys6-Phe7 и Gly8-Leu9, как описано в примере 2.

Субстратную специфичность NEP, главным образом, определяют по двум связывающим субстрат подучастками S1' и S2' (Oefner et al., J. Mol. Biol. 296: 341-349 (2000)). Участок S1' является акцептором крупного гидрофобного остатка P1', N-концевая пептидная связь которого подвергается гидролизу (например, Phe, Leu, Ile и Met). Участок S2' обычно предпочитает меньший по размеру остаток, называемый P2' (например, Gly или Ser). Согласно сообщениям в случае CNP остаток Phe7 является предпочтительным остатком P1' для участка S1 NEP, тогда как Gly8 является предпочтительным остатком P2' для участка S2'. Так как оба указанных подучастка вместе могут вмещать боковые цепи только определенного общего размера то любое увеличение общего размера остатков P1'-P2' CNP вероятно может нарушать связывания NEP. Например, добавление атома хлора в положении 3 ароматического цикла Phe7 P1' (т.е. 3-Cl-Phe7) вероятно может модифицировать (например, дестабилизировать) взаимодействия между CNP и сайтами расщепления NEP, например, на подучастке S1'. Добавление трет-бутильной группы к меньшему остатку P2' Gly8 (т.е. tBu-Gly8) вероятно может нарушать взаимодействие между CNP и подучастком S2'.

Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения варианты CNP согласно изобретению включают CNP, имеющий увеличение размера остатков P1'-P2', таких как Phe7-Gly8, чтобы помещать узнавания субстрата в активном участке, тем самым снизив чувствительность к расщеплению NEP. Природными аминокислотами, неприродными аминокислотами и/или остатками пептидомиметиков заменяют один или несколько крупных гидрофобных остатков P1', включая без ограничения Phe7, Leu9, Leu11, Ile14, Met17 и Leu20, и/или один или несколько меньших по размеру остатков P2', включая без ограничения Cys6, Gly8, Gly15, Ser16 и Gly19.

Изобретение охватывает варианты CNP, содержащие по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту и/или по меньшей мере одну модифицированную пептидную связь, по меньшей мере у одного остатка, вовлеченного в узнавание субстрата и/или расщепление под действием NEP, при этом модифицированные аминокислоты и модифицированные пептидные связи могут представлять собой природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, пептидомиметики и/или изостеры пептидной связи. В одном варианте модифицирован участок расщепления под действием NEP в CNP между Cys6 и Phe7. В родственном варианте пептидная связь (-C(=O)-NH-) между Cys6 и Phe7 заменена одним из следующих изостер пептидной связи:

-CH₂-NH-,

-C(=O)-N(R)-, где амидная группа алкилирована любой из следующих R-групп: метилом, этилом, н-пропилом, изопропилом, циклопропилом, н-бутилом, изобутилом, втор-бутилом или трет-бутилом,

-C(=O)-NH-CH₂-,

-CH₂-S-,

-CH₂-S(O)_n-, где n равно 1 или 2,

-CH₂-CH₂-,

-CH=CH-,

-C(=O)-CH₂-,

-CH(CN)-NH-,

-CH(OH)-CH₂-,

-O-C(=O)-NH- или

-NHC(=O)NH-.

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP представлены формулой:

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-Lys₄-Gly₅-(b)₆-(c)₇-(d)₈-Leu₉-Lys₁₀-Leu₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-Ile₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-Met₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-Leu₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 90), где:

(x) и (z) независимо могут отсутствовать или могут быть выбраны из группы, состоящей из синтетических направляющих к костям соединений, таких как, например, бисфосфонаты; аминокислотных последовательностей, применимых для целенаправленного воздействия на кости или хрящи, таких как, например, поли-Asp или поли-Glu; аминокислотных последовательностей, полученных из направляющих к костям доменов белков костей, таких как, остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин (Wang et al., Adv. Drug Delivery Rev., 57: 1049-76 (2005)); полимерных и неполимерных молекул, которые уменьшают почечный клиренс, таких как, например, отрицательно заряженные ПЭГ; и природных полимеров (например, полимеров, содержащих аминокислоты, жирные кислоты и/или углеводы) и синтетических полимеров (например, ПЭГ), которые повышают резистентность варианта CNP к разрушению под действием NEP благодаря увеличению общей массы варианта CNP до диапазонов, в общем описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа;

(b) и (c) могут представлять собой Cys6 и Phe7 дикого типа, другую природную аминокислоту или неприродную аминокислоту, или могут содержать изостер пептидной связи, которые описаны в настоящей публикации, чтобы повысить резистентность к расщеплению NEP; и

(d) может представлять собой Gly8 дикого типа или может быть более крупной природной или неприродной (например, t-Bu-Gly) аминокислотой или пептидомиметиком, чтобы уменьшить связывание с NEP.

В одном варианте осуществления изобретения такие варианты CNP содержат по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту в положении (b), (c) и/или (d).

Другие пептидные связи в CNP могут быть расщеплены даже если CNP22 или его вариант имеет NEP-резистентную пептидную связь или изостер пептидной связи в Cys6-Phe7, включая связи Gly8-Leu9, Lys10-Leu11, Arg13-Ile14, Ser16-Met17 и Gly19-Leu20. Таким образом, изобретение охватывает варианты CNP, имеющие изостер(ры) пептидной связи в одном или нескольких других участках расщепления NEP в дополнение к связи Cys6-Phe7, при этом изостеры пептидной связи включают связи, описанные в настоящей публикации.

В другом варианте изобретение охватывает варианты CNP, имеющие аналог цистеина в положении Cys6 и/или Cys22, включая без ограничения гомоцистеин, пеницилламин, 2-меркаптопропионовую кислоту и 3-меркаптопропионовую кислоту. В одном варианте осуществления изобретения такие варианты CNP имеют циклический домен, образованный дисульфидной связью между Cys6 дикого типа или аналогом и Cys22 или аналогом.

В еще одном варианте один или несколько остатков CNP22 или его варианта, вплоть до всех остатков, заменены D-аминокислотой. Замена L-аминокислоты D-аминокислотой по существу перемещает боковую цепь примерно на 120 градусов от ее исходного положения, тем самым нарушая связывание пептида CNP с NEP. В конкретном варианте L-Phe в положении Phe7 заменяют его D-энантиомером, D-Phe.

В еще одном варианте бета-аминокислотой, такой как, например, 3-амино-2-фенилпропионовая кислота (или 2-фенил-бета-аланин), заменяют альфа-аминокислоту Phe7 дикого типа. Использование бета-аминокислоты эффективно увеличивает длину пептидного остова на одну единицу метилена. Резистентность к протеазам может быть результатом изменения конформации субстрата или увеличения расстояния между боковыми цепями аминокислот.

Неограничивающие примеры вариантов CNP22, имеющих неприродную альфа-аминокислоту, бета-аминокислоту или изостер пептидной связи, включают:

GLSKGC(CH₂NH)FGLKLDRIGSMSGLGC (аналог A) (SEQ ID NO: 56),

GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (аналог B) (SEQ ID NO: 57),

GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (аналог E) (SEQ ID NO: 136),

GLSKGCF-(tBu-Gly)-LKLDRIGSMSGLGC (аналог F) (SEQ ID NO: 58),

GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (аналог G) (SEQ ID NO: 137) и

GLSKGC-[NHCH₂CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC (аналог H, образованный с использованием 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты) (SEQ ID NO: 59).

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют общую массу в диапазонах, в общем описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, предназначенную для повышенной резистентности к расщеплению под действием NEP, и представлены формулой:

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(a)₄-Gly₅-(b)₆-(c)₇-(d)₈-(e)₉-(f)₁₀-(g)₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-(h)₁₄-Gly₁₅-Ser₁₆-(i)₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-(j)₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 46), где:

(x) и (z) независимо могут отсутствовать или могут быть выбраны из группы, состоящей из синтетических направляющих к костям соединений, таких как, например, бисфосфонаты; аминокислотных последовательностей, применимых для целенаправленного воздействия на кости и хрящи, таких как, например, поли-Asp и поли-Glu; аминокислотных последовательностей, полученных из направляющих к костям доменов костных белков, таких как, например, остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин; полимерных и неполимерных остатков, которые уменьшают почечный клиренс, таких как, например, отрицательно заряженные ПЭГ; полимеров, содержащих, например, аминокислоты, гидрофобные кислоты, и/или углеводы; и синтетических гидрофильных полимеров, таких как, например, ПЭГ;

(a) может представлять собой Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной, или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (a) означает Arg;

(b) выбран из группы, состоящей из Cys и изостер пептидной связи между Cys6 и Phe7, таких как, например, Cys-CH₂-NH;

(c) выбран из группы, состоящей из L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты; N-алкилированных производных Phe, при этом N-алкильной группой является метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил; и аналогов Phe, в которых одно или несколько орто-, мета- и/или пара-положений бензольного цикла аналога Phe замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, цианогруппы, неразветвленного или разветвленного C_1-6-алкила, неразветвленной или разветвленной C_1-6-алкоксигруппы, неразветвленного или разветвленного галоген-C_1-6-алкила, C_3-10-циклоалкила, гетероциклила, C_6-14-арила и гетероарила (примеры включают, но без ограничения, тирозин, 3-хлорфенилаланин, 2,3-хлорфенилаланин, 3-хлор-5-фторфенилаланин, 2-хлор-6-фтор-3-метилфенилаланин), или в которых бензольный цикл аналога Phe может быть заменен другой арильной группой (неограничивающие примеры включают 1- и 2-нафтилаланин) или гетероарильной группой (неограничивающие примеры включают пиридилаланин, тиенилаланин и фурилаланин);

(d) выбран из группы, состоящей из Gly, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Thr, Ser, Val и Asn;

(e) выбран из группы, состоящей из Leu, Ser, Thr и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(f) может представлять собой Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной, или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (f) не является Arg;

(g) выбран из группы, состоящей из Leu и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(h) выбран из группы, состоящей из Ile, tBu-Gly и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Ile;

(i) выбран из группы, состоящей из Met, Val, Asn, бета-Cl-Ala, 2-аминомасляной кислоты (Abu) и 2-аминоизомасляной кислоты (Aib); и

(j) выбран из группы, состоящей из Leu, норлейцина (Nle), гомолейцина (Hleu), Val, трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu.

В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют общую массу в диапазонах, в общем описанных в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, предназначенную для повышенной резистентности к расщеплению NEP, и представлены формулой:

(x)-Gly₁-Leu₂-Ser₃-(a)₄-Gly₅-(b)₆-(c)₇-(d)₈-(e)₉-(f)₁₀-(g)₁₁-Asp₁₂-Arg₁₃-(h)₁₄-(i)₁₅-Ser₁₆-(j)₁₇-Ser₁₈-Gly₁₉-(k)₂₀-Gly₂₁-Cys₂₂-(z) (SEQ ID NO: 143), где:

(x) и (z) независимо могут отсутствовать или могут быть выбраны из группы, состоящей из синтетических направляющих к костям соединений, таких как, например, бисфосфонаты; аминокислотных последовательностей, применимых для целенаправленного воздействия на кости и хрящи, таких как, например, поли-Asp и поли-Glu; аминокислотных последовательностей, полученных из направляющих к костям доменов костных белков и их производных, таких как, например, слитые белки или пептидные последовательности остеопонтина, остеокальцина, сиалопротеина и т.д.; остатков, которые уменьшают почечный клиренс, включая без ограничения гидрофильные или водрастворимые полимеры, такие как, например, заряженные молекулы ПЭГ; и остатков, содержащих, например, ПЭГ, аминокислоты, углеводы и/или гидрофобные кислоты;

(a) может представлять собой Lys дикого типа в данном положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной, или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не имеет химически активного первичного амина в боковой цепи, включая без ограничения Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, при этом в одном варианте (a) означает Arg;

(b) выбран из группы, состоящей из Cys и изостер пептидной связи между Cys6 и Phe7, таких как, например, Cys-CH₂-NH;

(c) выбран из группы, состоящей из L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты; N-алкилированных производных Phe, при этом N-алкильной группой является метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил; и аналогов Phe, при этом одно или несколько орто-, мета- и/или пара-положений бензольного цикла аналога Phe замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, цианогруппы, неразветвленного или разветвленного C_1-6-алкила, неразветвленной или разветвленной C_1-6-алкоксигруппы, неразветвленного или разветвленного галоген-C_1-6-алкила, C_3-10-циклоалкила, C_6-14-арила, гетероциклила и гетероарила (примеры включают, но без ограничения, тирозин, 3-хлорфенилаланин, 2,3-хлорфенилаланин, 3-хлор-5-фторфенилаланин, 2-хлор-6-фтор-3-метилфенилаланин), или при этом бензольный цикл аналога Phe заменен другой арильной группой (неограничивающие примеры включают 1- и 2-нафтилаланин) или гетероарильной группой (неограничивающие примеры включают пиридилаланин, тиенилаланин и фурилаланин);

(d) выбран из группы, состоящей из Gly, трет-бутил-Gly, Thr, Ser, Val и Asn;

(e) выбран из группы, состоящей из Leu, Ser, Thr и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(f) выбран из группы, состоящей из Lys, Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцина, цитруллина (Cit), Gln и Ser;

(g) выбран из группы, состоящей из Leu, Asn и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu;

(h) выбран из группы, состоящей из Ile, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Asn и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-IIe;

(i) выбран из группы, состоящей из Gly, Arg, Ser и Asn;

(j) выбран из группы, состоящей из Met, Val, Asn, бета-Cl-Ala, 2-аминомасляной кислоты (Abu) и 2-аминоизомасляной кислоты (Aib); и

(k) выбран из группы, состоящей из Leu, норлейцина (Nle), гомолейцина (Hleu), Val, трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Arg, Thr, Ser и изостер пептидной связи, таких как, например, N-Me-Leu.

Для улучшения доставки вариантов CNP в места-мишени в случае связанных с костями расстройств (например, скелетных дисплазий) варианты CNP могут быть связаны (например, на N-конце и/или C-конце) с направляющими к костям или хрящам компонентами. Неограничивающие примеры направляющих к костям или хрящам компонентов включают бисфосфонаты; гидроксиапатит; глюкозамин; коллаген (например, коллаген типа X); поли-Asp; поли-Glu и аминокислотные последовательности, полученные из направляющих к костям доменов костных белков, таких как, например, остеокрин, остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин.

Кроме меньшей чувствительности к расщеплению NEP варианты CNP потенциально имеют пониженную аффинность к клиренс-рецептору NPR-C, при этом сохраняя функциональность CNP. Помимо NEP-опосредованного расщепления на время полужизни CNP22 влияет клиренс-рецептор, NPR-C, который имеет 58% гомологию последовательности с внеклеточным связывающим пептиды доменом NPR-B. CNP22 прочно связывается не только с NPR-B (аффинность 7-30 пМ), но также с NPR-C (11-140 пМ) (Bennett, B.D. et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-67 (1991); Koller K.J. and Goeddel, D.V., Circulation, 86: 1081-88 (1992); Suga, S. et al., Endocrinology, 130: 229-39 (1992)). Несмотря на то, что еще не было сообщений о кристаллической структуре NPR-B, гомология последовательностей, а также сходство между кристаллическими структурами NPR-C и NPR-A (He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)) свидетельствуют, что NPR-B вероятно имеет сходную общую структурную укладку.

Поэтому была построена модель гомологии NPR-B на основе базирующегося на структуре выравнивания последовательностей и кристаллографических структур следующих родственных систем: CNP, связанный с NPR-C, ANP, связанный с NPR-A, и ANP, связанный с NPR-C (He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)). На основании наблюдений о том, что рецептор, по-видимому, определяет конформацию связанного пептида, и что NPR-B больше всего похож на NPR-A с точки зрения первичной структуры и функциональных свойств модель гомологии NPR-B/CNP была построена с использованием в качестве модели кристаллической структуры NPR-A/ANP. Опубликованные сигнальные данные о вариантах CNP (патент США № 5434133 и заявка на выдачу патента США № 2004/0138134 A1) и функциональных вариантах ANP, которые больше не связываются с NPR-C (Cunningham, EMBO 13(11) 2508-15, 1994), использовали для корректировки и интерпретации модели NPR-B/CNP.

Настоящее изобретение охватывает варианты CNP, сконструированные для повышенной избирательности NPR-B на основе основанной на гомологии структурной модели комплекса NPR-B/CNP. Сочетая экспериментальные и компьютерные структурные данные о натрийуретических пептидах, связанных с разными рецепторами, и опубликованные функциональные данные, создали варианты CNP, которые продолжают связываться с NPR-B, но потенциально могут иметь пониженную аффинность к клиренс-рецептору NPR-C. Например, NPR-C имеет уникальную инсерцию в структуре петли на участке связывания пептида, помещающую остатки петли ближе к таким остаткам пептида, как CNP Gly8 (или ANP Gly9), по сравнению с соответствующими остатками петли в NPR-A и NPR-B. Более ранние исследования показали, что мутация G9T в ANP вносит вклад в уменьшение аффинности к NPR-C, тем самым повышая избирательность к NPR-A (Cunningham, EMBO J., 13(11): 2508-15 (1994)). Соответственно, создавали такие варианты CNP, чтобы заменить соответствующий остаток Gly8 более крупным остатком (Ser, Val, Thr или Asn), чтобы нарушить связывание CNP с NPR-C, не оказывая влияния на его связывание с NPR-B. Кроме того, одну или несколько мутаций вводили на C-конце CNP, охватывающем Gly15-Gly21, который предположительно взаимодействует со специфичными для рецептора остатками на основании подробных структурных анализов комплексов рецептор/пептид. Например, мутация G19R в CNP22 не приводит к значимой потере активности в передачи сигнала NPR-B. Однако такая мутация не может быть смоделирована в доступной кристаллической структуре NPR-C/CNP без изменения конформаций соседних остатков. Такие наблюдения свидетельствуют, что мутация G19R может избирательно нарушать связывание CNP с конкретным рецептором, таким как NPR-C.

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют замену(ны) в одном или нескольких Gly-сайтах в положениях 1, 5, 8, 15, 19 и 21, чтобы уменьшить конформационную гибкость и таким образом увеличить специфичность к рецептору. Сравнительные анализы кристаллических структур ANP, связанного с NPR-C и NPR-A (Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279: 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361: 698-714 (2006)) свидетельствуют, что конформационная гибкость ANP может играть важную роль в определении рецепторной избирательности.

В одном варианте осуществления изобретения функциональные варианты CNP с потенциально пониженной аффинностью к NPR-C имеют одну или несколько из следующих аминокислотных замен: G1R, G1E, G5R, G5Q, G5S, F7Y, G8T, G8S, G8V, G8N, L9S, L9T, K10Cit, K10Q, K10S, I14N, G15R, G15S, G15N, G15Cit, S16Q, M17V, M17N, G19S, G19R, G19N, L20V, L20R, L20T, L20S, G21S, G21T и G21R. В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP имеют многоточечные замены в положениях 1, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 19, 20 и/или 21, и необязательно могут иметь модификации в любом другом положении в пептидной последовательности варианта.

В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, могут быть конъюгированы с остатками до достижения общей массы, характеризуемой диапазонами, в общем описанными в настоящей публикации, например, примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, на N-конце, C-конце и/или внутреннем участке, чтобы облегчить целенаправленное воздействие на кости/хрящи, уменьшить связывание NPR-C и почечный клиренс, повысить резистентность к расщеплению под действием NEP и/или повысить функциональность CNP. В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP не конъюгированы с полимерным остатком на участке в циклической области (соответствующей Cys6-Cys22 в CNP22). Неограничивающими примерами полимерных или неполимерных остатков, которые могут быть конъюгированы с вариантами CNP, являются синтетические направляющие к костям соединения, такие как, например, бисфосфонаты; пептидные последовательности, мишенью которых являются кости/хрящи, такие как, например, поли-Asp и поли-Glu; пептидные последовательности, полученные из направляющих к костям доменов костных белков, таких как, например, остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин; пептидные последовательности, полученные из функциональных доменов костных морфогенетических белков, таких как, например, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 и BMP8a; пептидные последовательности, полученные из полипептидов натрийуретического происхождения, таких как, например, NPPC, ANP и BNP; другие природные полимерные или неполимерные остатки, такие как, например, углеводы, жирные кислоты и фосфолипиды; биосовместимые синтетические гидрофильные полимеры, такие как, например, ПЭГ (или ПЭО); гидрофобные полимерные или неполимерные остатки, такие как, например, гептановая кислота и пентановая кислота; и их сочетания.

Варианты CNP, описанные в настоящей публикации, могут обладать по существу сходной или улучшенной функциональной активностью по сравнению с CNP22, например, в отношении стимуляции продукции и передачи сигнала цГМФ. В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP стимулируют in vitro или in vivo продукцию цГМФ на уровне, составляющем по меньшей мере примерно 50% от уровня цГМФ, продуцируемого при такой же концентрации wtCNP22 (например, 1 мкМ). В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP сохраняют по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% цГМФ-стимулирующей активности CNP22 дикого типа in vitro или in vivo. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP обладают повышенной цГМФ-стимулирующей активностью по сравнению с CNP22. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP стимулируют продукцию цГМФ in vitro или in vivo на уровне, составляющем по меньшей мере примерно 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% или больше от уровня цГМФ, продуцируемого при такой же концентрации wtCNP22 (например, 1 мкМ).

Необязательно из настоящего изобретения исключены любые натрийуретические (например, CNP) пептиды, фрагменты и варианты, специально описанные, и любые натрийуретические (например, CNP) пептиды, фрагменты и варианты, фактически полученные в любой из предшествующих публикаций, упоминаемых в настоящем описании, включая без ограничения U.S. 5434133, U.S. 6034231, U.S. 6020168, U.S. 6743425, U.S. 7276481, WO 94/20534, WO 02/047871, WO 2005/098490, WO 2004/047871, EP 0497368, EP 0466174, и Furuya et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 183: 964-969 (1992)). Все указанные документы включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

В одном варианте из настоящего описания необязательно исключены все известные CNP-53 дикого типа, CNP-22 дикого типа, CNP-17 дикого типа, BNP дикого типа и ANP дикого типа человеческой природы и происходящие из животных, отличных от человека. Например, в одном варианте из описания необязательно исключены CNP-17 человека, CNP-22 человека, CNP-22 кур (соответствующий hCNP-22(Leu9Val)), CNP-22 форели и угря (соответствующий hCNP-22(Leu2Trp, Ser3Asn, Lys4Arg)), CNP22-I лягушки (соответствующий hCNP-22(Leu2Tyr, Lys4Arg, Leu9Val, Ser16Ala, Met17Phe)), CNP22-II лягушки (соответствующий hCNP-22(Leu2Thr, Ser16Ala)), CNP-53 человека и CNP-53 свиньи и крысы (соответствующие hCNP-53(Gln17His, Ala28Gly)). В другом варианте из описания необязательно исключены фрагменты NPPC, proCNP и CNP-53, которые получены протеолитическим расщеплением in vivo у человека и животных, отличных от человека. В еще одном варианте из описания необязательно исключены следующие укороченные фрагменты CNP-53 человека дикого типа: CNP-50, CNP-46, CNP-44, CNP-39, CNP-30, CNP-29, CNP-28, CNP-27 и CNP-26.

В следующем варианте из настоящего описания необязательно исключены пептиды CNP и их фрагменты, которые выделены или которые пытались найти у видов акул Triakis scyllia и Scyliorhinus canicula (см., например, M. Takano et al., Zool. Sci., 11: 451-454(1994)), включая:

RLLKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 204);

LKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 205);

KDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 206); и

GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 207).

В другом варианте из описания необязательно исключены пептиды CNP и их фрагменты, которые выделены или которые пытались найти у вида акул Lamna ditropis (см., например, M. Takano et al, Zool. Sci., 11: 451-454(1994)), включая:

RLLKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 208);

LKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 209);

KDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 210);

FKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-29) (SEQ ID NO: 211); и

GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 212).

В еще одном варианте необязательно исключены из описания пептиды CNP и их фрагменты, выделенные из вида акул Squalus acanthias (см., например, M. Takano et al., Zool. Sci., 11: 451-454(1994)), включая:

RLLQDLSNNPLRFKGRSKKGPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 213) и

GPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 214).

В следующем варианте из настоящего описания исключены пептиды CNP, выделенные из оризии и рыбы-фугу, названные «CNP-1», «CNP-2», «CNP-3» и «CNP-4» в публикации K. Inoue et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 100(17): 10079-10084 (2003):

GWNRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-1 оризии и рыбы фугу) (SEQ ID NO: 215);

PMVAGGGCFGMKMDRIGSISGLGC (CNP-2 оризии) (SEQ ID NO: 216);

GRSSMVGGRGCFGMKIDRIGSISGLGC (CNP-2 рыбы фугу) (SEQ ID NO: 217);

GGMRSCFGVRLERIGSFSGLGC (CNP-3 оризии) (SEQ ID NO: 218);

GGLRSCFGVRLARIGSFSGLGC (CNP-3 рыбы фугу) (SEQ ID NO: 219);

GGSTSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (CNP-4 оризии) (SEQ ID NO: 220) и

GGSSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (CNP-4 рыбы фугу) (SEQ ID NO: 221).

В еще одном варианте из описания необязательно исключен CNP-39, выделенный из яда утконоса, и его фрагмент, названные «ovCNP-39» и «ovCNP-39(18-39)» в публикации G. de Plater et al., Toxicon., 36(6): 847-857 (1998):

LLHDHPNPRKYKPANKKGLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC (ovCNP-39) (SEQ ID NO: 222); и

GLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC (ovCNP-39(18-39)) (SEQ ID NO: 223).

В другом варианте из настоящего описания необязательно исключены следующие пептиды, которые специально описаны в US 2007/0197434:

Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys (SEQ ID NO: 224);

Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys (SEQ ID NO: 225);

Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Ala-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys (SEQ ID NO: 226);

Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys (SEQ ID NO: 227);

Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 228); и

Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 229).

В еще одном варианте из описания необязательно исключены пептиды с последовательностью SEQ ID NO: 10, в общем раскрытые в US 2007/0197434, при этом такие пептиды являются вариантами CNP-17, имеющими некоторую замену(ны) природными аминокислотами в положении(ях) 4, 5, 6, 11, 12, 14 и/или 15. В еще одном варианте из описания необязательно исключены пептиды, соответствующие hCNP-53(Ser47Ala), hCNP-53(Met48Gln), hCNP-53(Met48Ala) и hCNP-53(C-term.)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr.

В одном варианте из настоящего описания необязательно исключены пептиды с последовательностями SEQ ID NO: 1-4 и 6-71, которые специально раскрыты в US 7276481. В другом варианте из описания необязательно исключены пептиды с последовательностью SEQ ID NO: 5, в общем раскрытые в US 7276481, при этом такие пептиды являются вариантами CNP17, имеющими по меньшей мере одну замену природной аминокислотой в положении Leu9, Lys10, Leu11, Ser16, Met17, Gly19 и/или Leu20. В еще одном варианте осуществления изобретения необязательно исключены варианты CNP17, в которых CNP17 или его варианты содержат N-Me-Phe7 или N-Me-Phe7 и N-Me-Leu11. В следующем варианте из описания необязательно исключены варианты CNP17 с последовательностью SEQ ID NO: 5, которые раскрыты в US 7276481, которые слиты или конъюгированы с гормоном роста (GH), инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF-1) или гормоном щитовидной железы (TH). В еще одном варианте необязательно исключены варианты CNP22, в которых CNP22 слит с GH, IGF-1 или TH или связан с GH, IGF-1 или TH посредством линкера (например, пептидного линкера). В еще одном варианте необязательно исключены варианты CNP17, в которых CNP17 или его варианты конъюгированы с биотином или флуоресцеином на N-конце или C-конце.

В следующем варианте из настоящего описания необязательно исключены пептиды, названные соединениями № 1-27, и последовательности SEQ ID NO: 1-17, 22-24, 30, 31 и 40-42, которые специально раскрыты в US 5434133. В другом варианте из описания необязательно исключены пептиды SEQ ID NO: 18-21 и 25-29, в общем раскрытые в US 5434133. В еще одном варианте из описания необязательно исключены пептиды с последовательностями SEQ ID NO: 1-4 и 9, которые специально раскрыты в WO 94/20534.

Однако в некоторых вариантах изобретение все еще охватывает способы применения натрийуретических (например, CNP) пептидов, фрагментов и вариантов, необязательно исключенных из настоящего описания, а также фармацевтические композиции (включая стерильные фармацевтические композиции), содержащие такие натрийуретические (например, CNP) пептиды, фрагменты и варианты.

C. Синтез и очистка вариантов CNP

В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, получают посредством экспрессии рекомбинантов, используя некоторые методики, известные в данной области. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, D. N. Glover, Ed. (1985); and Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, получают способом рекомбинации, который включает в себя культивирование в среде клетки-хозяина, содержащей первый полинуклеотид, кодирующий полипептид варианта CNP, связанный со вторым полинуклеотидом, кодирующим отщепляемый пептид или белок, в условиях, которые приводят к экспрессии слитого полипептида, кодируемого полинуклеотидами, при этом слитый полипептид содержит полипептид варианта CNP, непосредственно связанный с отщепляемым пептидом или белком или связанный опосредованно через линкер. В некоторых вариантах клетку-хозяина трансформируют экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий полипептид варианта CNP, связанный с полинуклеотидом, кодирующим отщепляемый пептид или белок. В некоторых вариантах слитый полипептид экспрессируется в виде растворимого белка или в виде тельца включения. Экспрессируемый слитый полипептид может быть выделен из клетки-хозяина или культуральной среды, и выделенный слитый полипептид может быть подвергнут контакту с расщепляющим агентом для высвобождения варианта CNP.

Клетками-хозяевами, используемыми для получения CNP, могут быть бактериальные, дрожжевые клетки, клетки насекомых, клетки позвоночных, отличных от млекопитающих, или клетки млекопитающих. Бактериальные клетки включают без ограничения линии клеток и штаммы E. coli. Неограничивающими примерами линий клеток и штаммов E. coli являются BL21, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pGro7, ArcticExpress(DE3), C41 [также называемые C41(DE3)], C43 [также называемые C43(DE3)], Origami B(DE3), Origami B(DE3)pLysS, KRX и Tuner(DE3). В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP и слитые белки CNP получают, используя клетки BL21(DE3). Клетки млекопитающих включают, но без ограничения, клетки хомячков, обезьян, шимпанзе, собак, кошек, коров, свиней, мышей, крыс, кроликов, овец и человека. Клетки-хозяева могут представлять собой иммортализованные клетки (линию клеток) или неиммортализованные (первичные или вторичные) клетки и могут относиться к любому из широкого множества типов клеток, таких как, без ограничения, фибробласты, кератиноциты, эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки млекопитающих, эпителиальные клетки кишечника), клетки яичника (например, клетки яичника китайского хомячка или клетки CHO), эндотелиальные клетки, глиальные клетки, нервные клетки, форменные элементы крови (например, лимфоциты, клетки костного мозга), хондроциты и другие полученные из костей клетки и предшественники таких типов соматических клеток. Клетки-хозяева, содержащие ДНК или РНК варианта CNP, культивируют в условиях, подходящих для роста клеток, экспрессии ДНК или РНК и идентификации/отбора клеток, экспрессирующих вариант CNP.

В некоторых вариантах клетки-хозяева выращивают или культивируют в течение определенного периода времени при температуре примерно от 10°C до примерно 40°C, или примерно от 20°C до примерно 40°C, или примерно от 30°C до примерно 40°C. В некоторых вариантах клетки-хозяева выращивают или культивируют в течение определенного периода времени примерно при 20°C, 22°C, 25°C, 28°C, 30°C, 35°C или 37°C. В некоторых вариантах клетки-хозяева выращивают или культивируют в течение определенного периода времени примерно при 35°C или 37°C.

Рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие полипептиды вариантов CNP (включая слитые белки CNP), экспрессируются с экспрессирующего вектора, включающего в себя рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности регуляции экспрессии, оперативно связанные с нуклеотидной последовательностью, которую необходимо экспрессировать. Экспрессирующий вектор содержит цис-действующие элементы достаточные для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут быть обеспечены клеткой-хозяином или системой экспрессии in vitro. Экспрессирующие векторы включают все экспрессирующие векторы, известные в данной области, включая без ограничения космиды, плазмиды (например, изолированные или находящиеся в липосомах) и вирусы, которые включают в себя рекомбинантный полинуклеотид. Экспрессирующий вектор встраивают в подходящую клетку-хозяина посредством трансформации или трансфекции для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид (см., например, Sambrook с соавторами (выше)).

Неограничивающими примерами экспрессирующих векторов, предусмотренных для получения вариантов CNP, включая расщепляемые слитые белки CNP, являются pJexpress, pJexpress401, pJexpress404, pET-15b, pET-21a, pET-22b, pET-31b, pET-32a, pET-41a, pMAL, pMAL-c2X, pQE-30, pET-SUMO и pTYB11. Экспрессия конкретных конструкций может приводить к созданию растворимых вариантов CNP (включая слитые белки CNP) или нерастворимых вариантов CNP (включая слитые белки CNP) в форме телец включения.

В некоторых вариантах экспрессию полинуклеотида(ов), кодирующего вариант CNP или слитый белок CNP, усиливают, используя индуцируемый изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) вектор. В некоторых вариантах клетки-хозяева выращивают или культивируют в течение определенного периода времени при температуре примерно от 10°C до примерно 40°C, или примерно от 20°C до примерно 40°C, или примерно от 30°C до примерно 40°C в присутствии IPTG. В некоторых вариантах клетки-хозяева выращивают или культивируют в течение определенного периода времени примерно при 20°C, 22°C, 25°C, 28°C, 30°C, 35°C или 37°C в присутствии IPTG. В некоторых вариантах клетки-хозяева выращивают или культивируют в течение определенного периода времени примерно при 35°C или 37°C в присутствии 1 мМ IPTG.

В следующих вариантах клетки-хозяева культивируют с IPTG в концентрации примерно от 0,4 мМ до примерно 2 мМ, или примерно от 0,4 мМ до примерно 1,5 мМ, или примерно от 0,4 мМ до примерно 1 мМ. В некоторых вариантах используют IPTG в концентрации примерно 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2 мМ. В одном варианте концентрация IPTG составляет примерно 1 мМ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, рекомбинантно экспрессируют в виде слитых белков, содержащих полипептид варианта CNP и отщепляемый белок-носитель или отщепляемую метку (например, пептидную метку), при этом слитый белок содержит полипептид варианта CNP, непосредственно связанный с отщепляемым белком-носителем или меткой или связан с ними опосредованно через линкер. Использование белка-носителя или метки облегчает, например, выявление, выделение и/или очистку слитого белка. Отщепляемые белки-носители и метки включают, но без ограничения, гистидиновые (например, гекса-His) метки; фактор транскрипции TAF12 человека (TAF12), фрагменты TAF12, домен укладки гистонов TAF12, мутанты TAF12 и их фрагменты, TAF12(C/A), TAF12(D/E), TAF12(4D/4E), TAF12(6D/6E), TAF 12(10D/10E), TAF12(C/A и D/E), TAF12(C/A и 4D/4E), TAF12(C/A и 6D/6E), TAF12(C/A и 10D/10E); изомеразу кетостероидов (KSI); связывающий мальтозу белок (MBP); β-галактозидазу (β-Gal); глутатион-S-трансферазу (GST); тиоредоксин (Trx); связывающий хитин домен (CBD); BMP-2, мутанты BMP-2, BMP-2(C/A); SUMO; и их мутанты и фрагменты.

Экспрессирующая конструкция может экспрессировать слитый белок, содержащий вариант CNP и белок-носитель или метку. Метка может представлять собой аминокислотную последовательность, которая придает полезное свойство слитому белку. В одном варианте меткой является домен, связывающий лиганд, который может быть использован для очистки слитого белка при помещении слитого белка в среду для разделения, содержащую лиганд. Например, слитый белок, содержащий домен глутатион-S-трансферазы (GST), может быть нанесен на хроматографическую колонку, содержащую связанную с глутатионом среду для разделения. В качестве другого примера слитый белок, содержащий связывающий мальтозу белок (MBP) в качестве метки, может быть внесен в среду для разделения, содержащую мальтозу. В качестве следующего примера слитый белок, содержащий полигистидиновую метку, может быть нанесен на колонку с никелем, при этом хелатирование полигистидиновой метки с никелевой колонкой способствует очистке слитого белка. В другом варианте меткой является лиганд. Например, слитый белок может содержать глутатитон в качестве метки, и может быть нанесен на хроматографическую колонку, содержащую связанную с глутатион-S-трансферазой среду для разделения. Неограничивающими примерами белков-носителей и меток для применения в слитых белках являются фактор транскрипции TAF12 человека (TAF12), изомераза кетостероидов (KSI), связывающий мальтозу белок (MBP), β-галактозидаза (β-Gal), глутатион-S-трансфераза (GST), тиоредоксин (Trx), хитин-связывающий домен (CBD), мутация BMP-2 (BMPM), SUMO, CAT, TrpE, стафилококковый белок A, стрептококковые белки, белок, связывающий крахмал, связывающий целлюлозу домен эндоглюканазы A, связывающий целлюлозу домен экзоглюканазы Cex, биотин-связывающий домен, recA, Flag, поли(His), поли(Arg), поли(Asp), поли(Gln), поли(Phe), поли(Cys), зеленый флуоресцирующий белок, красный флуоресцирующий белок, желтый флуоресцирующий белок, синий флуоресцирующий белок, биотин, авидин, стрептавидин, эпитопы антител и их мутанты и фрагменты.

Для создания целевого варианта CNP белок-носитель или метка могут быть отщеплены от слитого белка способами химического расщепления, расщепления протеазами или саморасщепления белка. Типичные химические и протеолитические расщепляющие агенты (сайты расщепления указаны в скобках) включают, но без ограничения, муравьиную кислоту (Asp-Pro), бромистый циан (CNBr) (Met-X), гидроксиламин (Asn-Gly), фактор Xa (IEGR-X) (SEQ ID NO: 230), энтерокиназу (DDDDK-X) (SEQ ID NO: 231), ProTEV (EXXYXQ-G) (SEQ ID NO: 232) и протеазу SUMO. Из-за природы конкретных видов химического расщепления расщепление с использованием муравьиной кислоты может приводить к образованию Pro-CNP, CNBr может давать CNP, имеющий замену Met на Asn, и гидроксиламин может приводить к образованию Gly-CNP. Альтернативно можно избежать химического расщепления или расщепления протеазами при использовании особых конструкций (например, pET-21a-CNP), которые экспрессируют варианты CNP не в виде слитых белков. Экспрессия pET-21a-CNP может давать Met-CNP, или некоторые слитые белки (например, белки, содержащие интеин-CBD) могут подвергаться саморасщеплению с образованием CNP.

В следующих вариантах слитый белок содержит отщепляемый пептидный линкер между вариантом CNP и белком-носителем или меткой (например, пептидной меткой). В некоторых вариантах отщепляемый пептидный линкер выбран из группы, состоящей из Asp-Pro, Asn-Gly, Met-X, Val-Asp-Asp-Arg (SEQ ID NO: 233), Gly-Ser-Asp-Arg (SEQ ID NO: 234), Ile-Thr-Asp-Arg (SEQ ID NO: 235), Pro-Gly-Asp-Arg (SEQ ID NO: 236), Ile-Glu-Gly-Arg-X (SEQ ID NO: 230), Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X (SEQ ID NO: 231), Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly (SEQ ID NO: 232), Ala-Phe-Leu-Gly-Pro-Gly-Asp-Arg (SEQ ID NO: 237) и MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTGDDDDKHMD (линкер pET-15b) (SEQ ID NO: 95), где X означает аминокислоту. В некоторых вариантах отщепляемый пептидный линкер отщепляется расщепляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из палладия, бромистого циана (CNBr), муравьиной кислоты, гидроксиламина, клострипаина, тромбина, химотрипсина, трипсина, трипсиноподобных протеаз, карбоксипептидазы, энтерокиназы (энтеропептидазы), протеазы Kex 2, протеазы Omp T, протеазы фактора Xa, субтилизина, proTEV, протеазы SUMO, протеазы V8, протеазы ВИЧ, протеазы риновируса, протеазы фурилизина, протеазы IgA, протеазы Pace человека, коллагеназы, протеазы Nia, протеазы 2Apro вируса полиомиелита, протеазы 3C вируса полиомиелита, гененазы, фурина, эластазы, протеиназы K, пепсина, реннина (химозина), аспарагиновой протеазы микроорганизмов, папаина, кальпаина, хемопапаина, фицина (фикаина), бромелаина (бромелазы), катепсина B, каспаз, термолизина, эндопротеазы Arg-C, эндопротеазы Glu-C, эндопротеазы Lys-C, калликреина и плазмина.

В некоторых вариантах отщепляемый белок-носитель, метку (например, пептидную метку) или пептидный линкер отщепляют, используя муравьиную кислоту, для высвобождения варианта CNP из слитого белка. В некоторых вариантах используют муравьиную кислоту в концентрации примерно от 1% до примерно 20%, или примерно от 1% до примерно 15%, или примерно от 2% до примерно 15%, или примерно от 1% до примерно 10%, или примерно от 2% до примерно 10%, или примерно от 1% до примерно 5%, или примерно от 2% до примерно 5%. В некоторых вариантах используют муравьиную кислоту в концентрации примерно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% или 15%. В некоторых вариантах концентрация муравьиной кислоты составляет примерно 2%, 5% или 10%.

В следующих вариантах расщепление слитого белка CNP в присутствии муравьиной кислоты проводят при температуре примерно от 20°C до примерно 80°C, или примерно от 30°C до примерно 75°C, или примерно от 40°C до примерно 75°C, или примерно от 50°C до примерно 75°C, или примерно от 50°C до примерно 70°C, или примерно от 55°C до примерно 70°C, или примерно от 50°C до примерно 60°C. В некоторых варианта расщепление в присутствии муравьиной кислоты проводят примерно при 20°C, 22°C, 25°C, 30°C, 35°C, 37°C, 40°C, 42°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C или 80°C. В некоторых вариантах расщепление в присутствии муравьиной кислоты проводят примерно при 50°C, 55°C, 60°C, 65°C или 70°C. В некоторых вариантах расщепление в присутствии муравьиной кислоты проводят примерно при 55°C или 70°C.

В дополнительных вариантах расщепление слитого белка CNP в присутствии муравьиной кислоты осуществляют в течение определенного периода времени примерно от 3 часов до примерно 48 часов, или примерно от 5 часов до примерно 48 часов, или примерно от 5 часов до примерно 36 часов, или примерно от 5 часов до примерно 24 часов, или примерно от 5 часов до примерно 18 часов, или примерно от 20 часов до примерно 24 часов, или примерно от 6 часов до примерно 10 часов. В некоторых вариантах расщепление в присутствии муравьиной кислоты осуществляют в течение примерно 5 часов, 6 часов, 12 часов, 15 часов, 18 часов, 20 часов или 24 часов.

В некоторых вариантах расщепление слитого белка CNP проводят в присутствии примерно 2%, 5% или 10% муравьиной кислоты примерно при 55°C в течение примерно от 20 часов до примерно 36 часов, или примерно при 60°C в течение примерно от 15 часов до примерно 24 часов, или примерно при 65°C в течение примерно от 10 часов до примерно 21 часов, или примерно при 70°C в течение примерно от 6 часов до примерно 18 часов. В некоторых вариантах расщепление слитого белка CNP проводят в присутствии примерно 2% муравьиной кислоты примерно при 55°C в течение примерно от 20 часов до примерно 24 или 36 часов, или примерно при 60°C в течение примерно от 15 часов до примерно 24 часов, или примерно при 65°C в течение примерно от 10 часов до примерно 18 часов, или примерно при 70°C в течение примерно от 6 часов до примерно 10 часов.

Настоящее изобретение относится к умеренным условиям для расщепления слитых белков CNP с использованием муравьиной кислотой, чтобы сделать возможными высокие выходы вариантов CNP. Условия, описанные в настоящей публикации, для расщепления слитых белков с использованием муравьиной кислоты также подходят для расщепления слитых белков, содержащих полипептиды или белки, отличные от CNP, при этом слитые белки содержат пептидную связь Asp-Pro.

В следующих вариантах растворимые слитые белки CNP или тельца включения слитых белков CNP обрабатывают буфером и/или детергентом перед химическим расщеплением (например, с использованием муравьиной кислоты) или протеолитическим расщеплением слитого белка CNP. Неограничивающими примерами буферов являются B-PER II; разбавленный B-PER II (например, разбавление 1/20); B-PER; B-PER-фосфатный буфер; буферы, содержащие трис (например, 25 мМ трис, pH 7,5); буферы, содержащие трис и NaCl (например, 25 мМ трис, 150 мМ NaCl, pH 7,9); и PBS. В одном варианте буфером является B-PER II. Неограничивающими примерами детергентов являются октилсахароза, тритон X-100, твин-20, NP-40 и CA-630. Детергент может быть в буфере (например, 1% детергент в 25 мМ трис-буфере, pH 7,5). В некоторых вариантах детергентом является тритон X-100 или CA-630.

Следует понимать, что любой из способов и условий, описанных выше, можно использовать в сочетании с любыми другими способами и условиями, описанными выше, для создания варианта CNP, раскрытого в настоящем описании.

В других вариантах осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, синтезируют, используя синтезатор пептидов, и очищали согласно способам, известным в данной области, например, согласно способам, описанным в Atherton and Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach, IRL Press (Oxford, England (1989)).

Пептиды могут быть синтезированы на основе, например, следующей пептидной последовательности CNP:

G¹LS(K или R)GC⁶F⁷G⁸L(K или R или Nle или 6-OH-Nle)LDRIGSMSGLGC²².

Примеры вариантов CNP включают, но без ограничения:

аналог A (GLSKGC(CH₂NH)FGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 56) получали превращением «-C=O»-группы остова C⁶ в группу «-CH₂»;

аналог B (GLSKGC(N-Me-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 57) получали превращением группы «-NH» остова F⁷ в группу «-N-CH₃»;

аналог E (GLSKGC(D-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 136) получали, используя D-Phe в положении F⁷;

аналог F (GLSKGCF(tBu-Gly)LKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 58) получали, используя трет-бутил-Gly в G⁸;

аналог G (GLSKGC(3-Cl-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 137) получали добавлением атома хлора в мета-положении фенильного цикла F⁷ (сходные варианты могут быть созданы в результате осуществления орто-, мета- и/или пара-замещений в фенильном цикле Phe⁷ с использованием Cl, F, Br, OH и/или CH₃); и

аналог H (GLSKGC[NHCH₂CH(Ph)CO]GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 59) получали, используя (±)-3-(амино)-2-фенилпропионовую кислоту в положении F⁷.

Примеры вариантов CNP, имеющих, например, аминокислотные удлинения, замены природными или неприродными аминокислотами или изостерами пептидной связи и/или конъюгации с полимерами или гидрофобными остатками, включают без ограничения:

Аналог J	C6-CH2-NH, N-Me-L9, N-Me-L20 (SEQ ID NO: 91)
Аналог K	N-Me-L9, N-Me-L20 (SEQ ID NO: 92)
Аналог L	N-Me-L9, N-Me-L11, N-Me-L20 (SEQ ID NO: 93)
Аналог M	N-Me-L9, N-Me-L11 (SEQ ID NO: 94)
Аналог Z	K4R, F7Y (SEQ ID NO: 95)
Аналог AA	K4R, G8V (SEQ ID NO: 96)
Аналог AB	K4R, G8S (SEQ ID NO: 97)
Аналог AC	K4R, G8T (SEQ ID NO: 98)
Аналог AD	K4R, L9T (SEQ ID NO: 99)
Аналог AE	K4R, G15R (SEQ ID NO: 100)
Аналог AF	K4R, G15Cit (SEQ ID NO: 101)
Аналог AG	K4R, M17V (SEQ ID NO: 102)
Аналог AH	K4R (SEQ ID NO: 35)
Аналог AJ	K4R, L20V (SEQ ID NO: 103)
Аналог AK	K4R, L20t-Bu-Ala (SEQ ID NO: 104)
Аналог AT	G1E, K4E (SEQ ID NO: 105)
Аналог AV	G1E, K4E - пентановая кислота (связанная с N-концом) (SEQ ID NO: 106)
Аналог AW	G1E, K4E - гептановая кислота (связанная с N-концом) (SEQ ID NO: 107)
Аналог AX	CNP17 (delta N-term) (SEQ ID NO: 2)
Аналог AY	GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36)
Аналог AZ	R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41)

Аналог BB	G1E - гептановая кислота (связанная с N-концом) (SEQ ID NO: 108)
Аналог BC	G1E - пентановая кислота (связанная с N-концом) (SEQ ID NO: 109)
Аналог BF	K4R, K10Cit (SEQ ID NO: 110)
Аналог BG	K4R, K10Q (SEQ ID NO: 111)
Аналог BH	K4R, K10R (SEQ ID NO: 112)
Аналог BJ	K4R, G15N (SEQ ID NO: 113)
Аналог BK	K4R, G15S (SEQ ID NO: 114)
Аналог BL	CNP-37 (SEQ ID NO: 60)
	CNP-53 (SEQ ID NO: 4)
Аналог CA	AAWARLLQEHPNA-CNP22 (SEQ ID NO: 61)
Аналог CB	AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (SEQ ID NO: 62)
Аналог CC	DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (SEQ ID NO: 63)
Аналог CD	SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (N- и C-концевые хвосты BNP) (SEQ ID NO: 68)
Аналог CE	GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (HSA-CNP22) (SEQ ID NO: 81)
Аналог CF	GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (SEQ ID NO: 79)
	ПЭГ(24K)-CNP22
	ПЭГ(20K)-CNP22
	ПЭГ(5K)-CNP22
	ПЭГ(2K)-CNP22
	ПЭГ(2K)-CNP17
	ПЭГ(1K)-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36)
	ПЭГ(1K)-CNP22

	ПЭО4-(ПЭО12)3(разветвленный)-CNP22
	ПЭО12-CNP22
	ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36)
	ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36); и

SEQ ID NO: 1-6 и 34-144 и их варианты, которые содержат до 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных модификаций.

В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP циклизуют посредством образования дисульфидной связи между Cys⁶ и Cys²². Cys⁶ может быть аналогом цистеина, таким как, например, гомоцистеин или пеницилламин. В следующем варианте осуществления изобретения варианты CNP могут быть циклизованы ковалентной связью, образованной по типу голова-хвост, боковая цепь-боковая цепь, боковая цепь-голова или боковая цепь-хвост. В одном варианте ковалентная связь образована между аминокислотой на N-конце или около N-конца и аминокислотой на C-конце или около C-конца пептида (называемых в данном контексте «концевыми» аминокислотами). В другом варианте ковалентная связь образована между боковыми цепями двух концевых аминокислот. В еще одном варианте ковалентная связь образована между боковой цепью одной концевой аминокислоты и концевой группой другой концевой аминокислоты, или между концевыми группами каждой из концевых аминокислот.

Циклизация «голова к хвосту» концевого амина с концевой карбоксильной группой может быть осуществлена с использованием ряда способов, например, с использованием сложного п-нитрофенилового эфира, сложного 2,4,5-трихлорфенилового эфира, сложного пентафторфенилового эфира, азидного способа, способа на основе смешанных ангидридов, HATU, карбодиимида (например, DIC, EDC или DCC) с таким катализатором, как HOBt, HONSu или HOAt или циклизации на смоле.

Кроме того, циклическая структура может быть образована посредством мостиковой группы с привлечением боковых цепей аминокислотных остатков варианта CNP и/или концевых аминокислотных остатков. Мостиковая группа представляет собой химический остаток, который обеспечивает возможность циклизации двух частей пептида. Неограничивающими примерами мостиковых групп являются амиды, простые тиоэфиры, сложные тиоэфиры, дисульфиды, мочевины, карбаматы, сульфонамиды и тому подобные. В данной области известно множество способов для включения единиц, имеющих такие мостиковые группы. Например, лактамовый мостик (т.е. циклический амид) может быть образован между N-концевой аминогруппой или аминогруппой в боковой цепи и C-концевой группой карбоновой кислоты или карбоксильной группой в боковой цепи, например, боковой цепи лизина или орнитина и боковой цепи глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты. Сложный тиоэфир может быть образован между C-концевой карбоксильной группой или карбоксильной группой в боковой цепи и тиольной группой в боковой цепи цистеина или аналога цистеина.

Альтернативно поперечная сшивка может быть образована включением остатка лантионина (тиодиаланина), чтобы связать остатки аланина, которые ковалентно связываются друг с другом простой тиоэфирной связью. В другом способе поперечно сшивающий агент, такой как дикарбоновая кислота (например, субериновая кислота (октандикарбоновая кислота)), может связывать функциональные группы боковых цепей аминокислот, таких как свободные амино-, гидроксильные и тиоловые группы.

Также может быть использована катализируемая ферментами циклизация. Например, сообщалось, что тиоэстеразный домен тироцидинсинтетазы может быть использован для циклизации предшественника сложного тиоэфира, мутант субтилизина может быть использован для циклизации сложных эфиров гликолят-фенилаланиламидов пептида, и лигаза антитела 16G3 может быть использована для циклизации сложного п-нитрофенилового эфира. Обзор циклизации пептидов см. в публикации Davies, J. Peptide Sci., 9: 471-501 (2003), включенной в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

В некоторых вариантах конечный циклизованный продукт имеет чистоту по меньшей мере примерно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере примерно 99%.

D. Химически модифицированные варианты CNP

Химическая модификация CNP22 или его вариантов потенциально может влиять на предпочтительные свойства модифицированных пептидов CNP, таких как повышенная стабильность и время полужизни и пониженная иммуногенность (общее обсуждение химической модификации терапевтических белков см. в публикации Pharmazie, 57(1): 5-29 (2002)). Например, присоединение природных или синтетических, полимерных или неполимерных остатков (например, ПЭГ) к пептидам CNP, чтобы увеличить общую массу пептидов CNP до диапазонов, в общем описанных в настоящей публикации, например, диапазона примерно от 2,6 или 2,8 кДа до примерно 6 или 7 кДа, может уменьшить чувствительность модифицированных пептидов к расщеплению in vivo экзопептидазами и/или эндопептидазами (например, NEP). В дополнение к пегилированию, способы гликозилирования и другой химической дериватизации, например, модификации фосфорилированием, амидированием, карбоксилированием, ацетилированием, метилированием и созданием кислотно-аддитивных солей, амидов, сложных эфиров и N-ацильных производных также могут маскировать потенциально иммуногенные области и/или протеолитически чувствительные области (Science, 303: 480-482 (2004)).

Примеры химических модификаций включают без ограничения способ добавления полимера согласно Bednarsaki и способ поперечного сшивания согласно Altus Corporation для повышения стабильности и устойчивости к протеазам и снижения иммуногенности. Bednarsaki показал, что добавление полимера может повышать термостабильность белка (J. Am. Chem. Soc, 114(1): 378-380 (1992)), и в Altus Corporation показано, что поперечно сшивание глутаровым альдегидом может повышать стабильность фермента.

Химическая модификация полипептидов может быть осуществлена неспецифичным образом (что приводит к получению смесей дериватизованных видов) или сайт-специфичным образом (например, на основе дериватизации, направленной на реактивность макромолекулы дикого типа, и/или сайт-специфичной модификации с использованием сочетания сайт-направленного мутагенеза и химической модификации) или альтернативно с использованием способа лигирования экспрессированных белков (Curr. Opin. Biotechnol., 13(4): 297-303 (2002)).

Пегилированные варианты CNP

В одном варианте для повышенной стабильности (например, резистентности к разрушению под действием NEP) CNP22 или его варианты (включая варианты, имеющие добавления, замены и/или делеции аминокислот) конъюгируют с гидрофильными природными или синтетическими полимерами, чтобы увеличить общую массу модифицированных пептидов CNP до диапазона примерно от 2,6 кДа или 2,8 кДа до примерно 4, 5, 6, 7 кДа или больше. В некоторых вариантах добавляемые гидрофильные полимеры имеют общую массу примерно 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 или примерно 5 кДа.

В одном варианте гидрофильные полимеры являются водорастворимыми, так что конъюгированные с ними пептиды CNP не выпадают в осадок в водной (например, физиологической) среде. Кроме того, гидрофильные полимеры являются биосовместимыми, т.е. не вызывают повреждения, токсичности или иммунологической реакции in vivo.

Гидрофильные полимеры могут быть разветвленными или неразветвленными. В одном варианте гидрофильные полимеры являются неразветвленными.

Возможны различные участки конъюгации CNP22 или его вариантов с гидрофильным полимером, включая без ограничения: (1) только на N-конце; (2) только на C-конце; (3) только на внутреннем участке (например, Lys4); (4) на обоих концах: N-конце и C-конце; (5) на N-конце и внутреннем участке; и (6) на C-конце и на внутреннем участке. В одном варианте CNP22 или его варианты конъюгированы с гидрофильным полимером только на N-конце. В другом варианте конъюгацию осуществляют только на внутреннем участке (например, Lys4). В еще одном варианте конъюгацию осуществляют на N-конце и внутреннем участке (например, Lys4). В еще одном варианте для улучшения функциональности пептиды CNP не конъюгированы с гидрофильным полимером на участке (например, Lys10) в циклическом домене (соответствующем Cys6-Cys22 в CNP22). Если конъюгация с гидрофильным полимером основана на образовании связи с химически активной первичной аминогруппой на пептиде CNP, то конъюгация на внутреннем участке (например, Lys4 и/или Lys10) может быть предотвращена заменой Lys4 и/или Lys10 природной или неприродной аминокислотой или пептидомиметиком, который не содержит химически активной первичной аминогруппы в боковой цепи, такими как, например, Gly, Ser, Arg, Asn, Gln, Asp, Glu или цитруллин (Cit). В конкретном варианте Lys4 и/или Lys10 заменяют на Arg. В другом варианте Lys10 не заменяют на Arg.

Неограничивающими примерами гидрофильных полимеров являются полимеры, образованные из несущих карбоновую кислоту мономеров (например, метакриловой кислоты (MA) и акриловой кислоты (AA)), поливиниловые спирты, полимеры, образованные из несущих гидроксил мономеров (например, гидроксиэтилметакрилата (HEMA), гидроксипропилметакрилата (HPMA), гидроксипропилметакриламида и 3-триметилсилилпропилметакрилата (TMSPMA)), полиалкиленоксиды, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поли(этиленгликоль) (ПЭГ), поли(пропиленгликоль), моно-C₁-C₁₀-алкокси-ПЭГ (например, монометокси-ПЭГ), трезилмонометокси-ПЭГ, арилокси-ПЭГ, ПЭГ-акрилат (ПЭГА), ПЭГ-метакрилат, ПЭГ-пропиональдегид, бис-сукцинимидилкарбонат ПЭГ, сополимеры 2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина (MPC) и N-винилпирролидона (VP), гидроксифункциональный поли(N-винилпирролидон) (PVP), SIS-ПЭГ (SIS означает блок-сополимер полистирол-полиизобутилен-полистирол), полистирол-ПЭГ, полиизобутилен-ПЭГ, PCL-ПЭГ (PCL означает поликапролактон), PLA-ПЭГ (PLA означает полимолочную кислоту), РММА-ПЭГ (РММА означает поли(метилметакрилат)), PDMS-ПЭГ (PDMS означает полидиметилоксанон), PVDF-ПЭГ (PVDF означает поливинилиденфторид), поверхностно-активные вещества PLURONIC^TM (сополимер полипропиленоксид-полиэтиленгликоль), поли(тетраметиленгликоль), поли(L-лизин-g-этиленгликоль) (PLL-g-ПЭГ), поли(L-лизин-g-гиалуроновая кислота) (PLL-g-HA), поли(L-лизин-g-фосфорилхолин) (PLL-g-PC), поли(L-лизин-g-винилпирролидон) (PLL-g-PVP), поли(этилимин-g-этиленгликоль) (PEI-g-ПЭГ), поли(этилимин-g-гиалуроновая кислота) (PEI-g-HA), поли(этилимин-g-фосфорилхолин) (PEI-g-PC), поли(этилимин-g-винилпирролидон) (PEI-g-PVP), сополимер PLL-HA, сополимер PLL-PC, сополимер PLL-PVP, сополимер PEI-ПЭГ, сополимер PEI-HA, сополимер PEI-PC, сополимер PEI-PVP, целлюлоза и ее производные (например, гидроксиэтилцеллюлоза), декстран, декстрины, гиалуроновая кислота и ее производные (например, гиалуронат натрия), эластин, хитозан, акрилсульфат, акрилсульфонат, акрилсульфамат, метакрилсульфат, метакрилсульфонат, метакрилсульфамат, их полимеры и сополимеры, и полимеры и сополимеры их сочетаний.

В конкретном варианте гидрофильным полимером является поли(этиленгликоль) (ПЭГ), также называемый полиэтиленоксидом) (ПЭО). В используемом в настоящем описании смысле термин «ПЭГ» или «ПЭО» охватывает все формы ПЭГ, разветвленные и неразветвленные, которые могут быть использованы для дериватизации полипептидов, включая без ограничения моно-(C₁-C₁₀)-алкокси-ПЭГ и арилокси-ПЭГ.

В одном варианте конъюгаты ПЭГ-CNP содержат полимер ПЭГ (или ПЭО) формулы (CH₂CH₂O)_n, где n означает целое число примерно от 6 до примерно 100, и полимер ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 0,3 кДа до примерно 5 кДа. В другом варианте n означает целое число примерно от 12 до примерно 50, и полимер ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 0,6 кДа до примерно 2,5 кДа. В еще одном варианте n примерно составляет от 12 до примерно 24, и полимер ПЭГ имеет массу примерно от 0,6 кДа до примерно 1,2 кДа. В следующем варианте концевая гидроксильная группа полимера ПЭГ блокирована химически неактивной группой. В конкретном варианте блокирующей группой на конце является алкильная группа, например, низшая алкильная группа, такая как метил, так что полимер ПЭГ заканчивается алкоксигруппой. В одном варианте полимер ПЭГ не является разветвленным. В другом варианте CNP22 или его варианты конъюгированы с полимером ПЭГ только на N-конце.

ПЭГ и ПЭО потенциально включают молекулы с распределением по молекулярным массам, т.е. потенциально они являются полидисперсными, в зависимости от способа, которым они получены. Распределение по размеру/массе полимерного препарата можно охарактеризовать статистически с использованием среднемассовой молекулярной массы (Mw) и среднечисловой молекулярной массы (Mn), отношение которых называют индексом полидисперсности (Mw/Mn). Mw и Mn можно измерить с использованием масс-спектроскопии. Варианты ПЭГ-CNP, конъюгированные с остатком ПЭГ больше 1,5 кДа, могут иметь диапазон молекулярных масс вследствие полидисперсной природы исходной молекулы ПЭГ. Например, в случае mПЭГ2K (Sunbright ME-020HS, NOF Co.) молекулярные массы молекул ПЭГ распределены в диапазоне примерно от 1,5 кДа до примерно 3 кДа с индексом полидисперсности 1,036. Напротив, ПЭГ, конъюгированные с CNP22 или его вариантами с использованием реагентов MS(ПЭГ)_n (n=4, 8, 12 или 24, называемых, например, «ПЭО12» или «ПЭО24») из Pierce Biotechnology (Rockford, Illinois), являются монодисперсными, имеющими дискретную длину цепи и определенную молекулярную массу.

Способы создания полипептидов, содержащих остаток ПЭГ, известны в данной области (см., например, патент США 5824784). Способы получения пегилированных пептидов CNP обычно включают в себя стадии (a) взаимодействия CNP22 или его варианта с реагентом для пегилирования в условиях, подходящих для связывания ПЭГ с пептидом CNP (например, на N-конце), и (b) получения продукта(ов) реакции. Вследствие пегилирования пептида CNP существенно может изменяться его связывание с NPR-B, в зависимости от размера остатка ПЭГ и положения пегилирования можно использовать разные виды ПЭГ и условия реакции пегилирования. Химические способы, которые можно использовать для пегилирования пептида CNP, включают ацилирование химически активного первичного амина(ов) пептида с использованием сложного NHS-эфира метокси-ПЭГ (O-[(N-сукцинимидилоксикарбонил)метил]-O'-метилполиэтиленгликоля). Ацилирование метокси-ПЭГ-NHS или метокси-ПЭГ-SPA приводит к образованию амидной связи, которая устраняет любой заряд исходного первичного амина. ПЭГ-пептиды CNP, обозначаемые символами «ПЭО12» или «ПЭО24», а также ПЭГ-пептиды CNP, обозначаемые символом «ПЭГ1К», «ПЭГ2К», «ПЭГ5К» или «ПЭГ20К» пегилируют посредством взаимодействия первичной аминогруппы в пептиде с активированным сложным NHS-эфиром блокированном на метокси-конце ПЭГ-реагентом. ПЭГ-варианты CNP также могут быть получены другими способами, например, посредством восстановительного аминирования, в которое вовлечены первичная аминогруппа в пептиде и ПЭГ-альдегид, такой как, например, ПЭГ-пропионовый альдегид или его моно-C₁-C₁₀-алкокси- или арилокси-производные (см. патент США 5252714).

В отличие от синтеза белка в рибосомах синтез синтетического пептида происходит от C-конца к N-концу. Соответственно, использование Boc-ПЭГ (содержащего трет-бутилоксикарбонил (Boc)) является одним из способов связывания ПЭГ с C-концом пептида (R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85(14): 2149-2154 (1963)). Альтернативно можно использовать химию на основе Fmoc (флуоренилметоксикарбонила) (E. Atherton and R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach, IRL Press (Oxford, England (1989)).

Настоящие способы получения ПЭГ-вариантов CNP позволяют получать по существу гомогенную смесь конъюгатов полимер-белок. После очистки препараты дискретных ПЭГ-CNP становятся достаточно очищенными для тестирования in vitro и in vivo биологических свойств. Как показано в настоящем описании, некоторые ПЭГ-варианты CNP проявляют пониженную чувствительность к расщеплению NEP и в значительной степени сходную или улучшенную функциональность (например, стимуляцию продукции цГМФ).

Как описано в настоящей публикации, реакции пегилирования CNP22 или его вариантов с использованием подходящих соотношений реагент для пегилирования/пептид CNP и условий реакции, дает производные ПЭГ-CNP. Природа и степень пегилирования могут быть определены с использованием, например, анализов ПААГ и ВЭЖХ. В некоторых вариантах по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% CNP22 или его вариантов монопегилированы на N-конце. Чтобы оптимизировать полезное влияние пегилирования на биологические свойства пептида CNP, длину полимера, конформацию (например, разветвленный или неразветвленный) и/или функционализацию (например, добавление отрицательно заряженных групп) остатка ПЭГ можно варьировать. Пегилированные варианты CNP подвергают тестированию в отношении резистентности к NEP, фармакокинетики и биологической активности (например, способности связываться с NPR-B и стимулировать образование цГМФ). Пегилированные варианты CNP, которые проявляют повышенную резистентность к NEP и активность, составляющую по меньшей мере примерно 50% от активности в стимуляции цГМФ пептида CNP22, могут быть дополнительно тестированы, например, in vitro в модели ахондроплазии на основе клеток хондросаркомы крыс и in vivo в мышиной модели ахондроплазии у животных.

E. Способы применения вариантов CNP, фармацевтических композиций вариантов CNP и путей введения

Способы применения вариантов CNP

Связанные с костями расстройства

Факторы роста фибробластов (FGF) играют важные роли в образовании кости, и мутации в генах рецепторов FGF (FGFR 1, 2 и 3) приводят к возникновению множества наследуемых пороков развития скелета (Curr. Biol., 5: 500-507 (1995)). В частности, активирующие мутации в FGFR-3 ответственны за расстройства длинных костей, включая ахондроплазию, наиболее распространенную форму наследственной карликовости у человека (Nature, 371: 252-254 (1994); Cell, 78: 335-342 (1994)), менее тяжелое расстройство гипохондроплазию (Ann. N.Y. Acad. Sci., 785: 182-187 (1996)), и более тяжелую и неонатальную летальную танатоформную дисплазию (TD) типов I и II (Hum. Mol. Genet., 5: 509-512 (1996); Nat. Genet., 9: 321-328 (1995)). В мышиных моделях, сверхэкспрессирующих FGF-2 и как следствие активирующих FGFR-3, обнаружены укороченные длинные кости и макроцефалия (Mol. Biol. Cell, 6: 1861-73 (1995)). В соответствии с такой моделью у мышей с дефицитом FGFR-3 показан заметный чрезмерный рост скелета с более широкими ростовыми пластинками (Nature Genet., 12: 390-397 (1996)).

Дополнительные эксперименты с использованием CNP, NPR-B и NPR-C свидетельствуют о связи между пептидным лигандом, соответствующими рецепторами и ростом костей. Активация NPR-B повышенными концентрациями в плазме CNP у трансгенных мышей вызывает чрезмерный рост скелета (Nat. Med., 10: 80-86 (2004)), гистологически сходный с ростом хряща ростовых пластинок у нокаутированных по FGFR-3 мышей (Nat. Genet., 4: 390-397 (1996)). У мышей, нокаутированных по NPR-C, NPR-C-опосредованный клиренс CNP должен быть исключен; в соответствии с таким предположением у нокаутированных животных наблюдали вытянутые длинные кости и удлиненные позвонки с кифозом (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7403-08 (1999)). Наоборот, мыши с нокаутом по CNP имели задержку роста с более короткими длинными костями и позвонками, т.е. фенотип, гистологически сходный с фенотипом при ахондроплазии, и имели повышенную смертность в результате аномалии прикуса и рестрикцию легких в результате малого размера грудной клетки (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 4016-4021 (2001)). В соответствии с предполагаемой ролью CNP в качестве активатора NPR-B мыши, нокаутированные по NPR-B, имели такой же фенотип с задержкой роста скелета и повышенную смертность как и у нокаутированных по CNP мышей (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 101: 17300-05 (2004)). Кроме того, в мышиной модели ахондроплазии с активированным FGFR-3 в хряще, целевая сверхэкспрессия CNP в хондроцитах препятствует карликовости (Yasoda et al., Nat. Med., 10: 80-86 (2004)). Кроме того, было показано, что CNP играет роль в регуляции роста эндохондральной кости и активности хондроцитов, включая без ограничения пролиферацию и дифференцировку хондроцитов, в ингибировании пути передачи сигнала активируемой митогенами протеинкиназы (MAP)/киназы MEK (Raf-1) и стимуляции эндохондрального окостенения (Yasoda et al., Nat. Med., 10: 80-86 (2004)). Полученные результаты свидетельствуют, что активация системы CNP/NPR-B является возможной терапевтической методикой лечения ахондроплазии у человека.

Благодаря стимуляции образования матрикса, пролиферации и дифференцировки хондроцитов и усиления роста длинных костей варианты CNP согласно изобретению применимы для лечения млекопитающих, включая человека, страдающих от связанного с костями расстройства, такого как дисплазия скелета. Неограничивающие примеры отвечающих на CNP связанных с костями расстройств и дисплазий скелета включают ахондроплазию, гипохондроплазию, низкорослость, карликовость, остеохондродисплазии, танатофорную дисплазию, несовершенный остеогенез, ахондрогенез, точечную эпифизарную дисплазию, гомозиготную ахондроплазию, точечную эпифизарную дисплазию, кампомелическую дисплазию, наследственную летальную гипофосфатазию, перинатально-летальный тип несовершенного остеогенеза, синдромы коротких ребер-полидактилии, гипохондроплазию, ризомелический тип точечной эпифизарной дисплазии, метафизарную остеодисплазию Янсена, врожденную спондилоэпифизарную дисплазию, ателостеогенез, диастрофическую дисплазию, врожденное укорочение бедра, мезомелическую дисплазию Лангера, мезомелическую дисплазию Нивергельта, синдром Робиноу, синдром Рейнхардта, акродизостоз, периферический дизостоз, дисплазию Книста, фиброхондрогенез, синдром Робертса, акромезомелическую дисплазию, микромелию, синдром Моркио, синдром Книста, метатрофную дисплазию и спондилоэпиметафизарную дисплазию. Кроме того, варианты CNP применимы в качестве дополнения или альтернативы гормона роста для лечения идиопатической низкорослости и других дисплазий скелета.

Кроме того, варианты CNP применимы для лечения других связанных с костями состояний и расстройств, таких как рахит, гипофосфатемический рахит [включая X-сцепленный гипофосфатемический рахит (также называемый резистентным к витамину D рахитом) и аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит] и остеомаляцию [включая индуцированную опухолью остеомаляцию (также называемую онкогенной остеомаляцией или онкогенной гипофосфатемической остеомаляцией)].

Варианты CNP согласно изобретению также можно применять для лечения остеоартрита. Остеоартрит является дегенеративным заболеванием суставного хряща и часто возникает в старости. В остеоартрит вовлечена деструкция хряща и изменение пролиферации в кости и хряще в результате дегенерации компонентов суставов, при этом изменение приводит к вторичному артриту (например, синовиту). При остеоартрите уменьшено количество белков внеклеточного матрикса, которые являются функциональной единицей хряща, и снижается количество хондроцитов (Arth. Rheum. 46(8): 1986-1996 (2002)). Благодаря стимуляции образования матрикса, роста и дифференцировки хондроцитов варианты CNP применимы для противодействия нежелательным эффектам FGF-2 и усиления синтеза матрикса у субъектов, страдающих от артрита, включая остеоартрит, таким образом позволяя лечить артрит, включая остеоартрит.

Расстройства гладкой мускулатуры сосудов

CNP и другие вазоактивные пептиды (включая ANP, BNP и уродилатин) обладают сосудорасширяющими и мочегонными свойствами и играют важную роль в гомеостазе сердца и сосудов (J. Cardiovasc. Pharmacol., 117: 1600-06 (1998); Kidney Int., 49: 1732-37 (1996); Am. J. Physiol., 275: H1826-1833 (1998)). CNP широко распространен в сердечно-сосудистой системе, в особенно высокой концентрации в эндотелиальных клетках сосудов (J. Cardiovasc. Pharmacol., 117: 1600-06 (1998)). CNP является сильным релаксантом гладкой мускулатуры сосудов, особенно в коронарном кровообращении (Biochem. Biophys. Res. Commun., 205: 765-771 (1994)), и является ингибитором пролиферации гладкомышечных клеток (Biochem. Biophys. Res. Commun., 177: 927- 931 (1991)). Хотя сосудорасширяющее действие CNP является менее сильным чем у ANP (примерно 1:100) (Hypertens. Res., 21: 7-13 (1998); Am. J. Physiol., 275: L645-L652 (1998)), уровень мРНК CNP увеличивается в ответ на гемодинамический удар (FEBS Lett., 373: 108-110 (1995)), и уровни CNP в плазме возрастают при воспалительных сердечно-сосудистых патологиях (Biochem. Biophys. Res. Commun., 198: 1177-1182 (1994)). Показано, что CNP подавляет воспаление посредством ингибирования инфильтрации макрофагов в поврежденные сонные артерии кроликов (Circ. Res., 91: 1063-1069 (2002)) и непосредственно ингибирует пролиферацию фибробластов сердца посредством NPR-B/цГМФ-зависимого пути (Endocrinology, 144: 2279-2284 (2003)).

Действия CNP на сердечно-сосудистую систему опосредованы активацией подтипов NPR: NPR-B и NPR-C (Endocrinology, 130: 229-239 (1992)), при этом на долю последнего приходится 95% NPR, экспрессированных in vivo (Science, 293: 1657-1662 (2001)). Путь CNP/NPR-B приводит к повышению уровня цГМФ, хорошо установленного вторичного мессенджера в сердечно-сосудистой системе. 37-аминокислотная часть C-конца NPR-C имеет консенсусную последовательность, которая взаимодействует с гетеротримерным G-белком G₁ (J. Biol. Chem., 274: 17587-17592 (1999)), который, как было показано, регулирует активность аденилатциклазы и фосфолипазы C (J. Biol. Chem., 276: 22064-70 (2001); Am. J. Physiol., 278: G974-980 (2000); J. Biol. Chem., 271: 19324-19329 (1996)). CNP опосредует гиперполяризацию и релаксацию гладкой мускулатуры посредством активации NPR-C и открытие регулируемых G-белком K⁺-каналов внутреннего выпрямления (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 1426-1431 (2003)). Подобным образом, CNP оказывает важное антипролиферативное действие на фибробласты сердца и посредством взаимодействия с NPR-C регулирует локальный кровоток и системное кровяное давление благодаря гиперполяризации гладкомышечных клеток (R. Rose и W. Giles, J. Physiol. 586: 353-366 (2008)).

Благодаря связыванию с NPR-B на гладкомышечных клетках сосудов CNP22 стимулирует продукцию цГМФ, который действует в качестве внутриклеточного вторичного мессенджера, вызывая в конечном счете релаксацию кровеносных сосудов. На основе гипотензивных действий CNP варианты CNP согласно изобретению применимы для лечения гипертензии, застойной сердечной недостаточности, сердечного отека, почечного отека, отека печени, острой и хронической почечной недостаточности и т.д. Кроме того, активация передачи сигнала цГМФ подавляет рост гладкомышечных клеток сосудов. Соответственно, варианты CNP согласно изобретению можно применять для лечения состояний или заболеваний, вызванных аномальным ростом гладкомышечных клеток сосудов, включая без ограничения рестеноз и артериосклероз.

Исследования, описанные выше, свидетельствуют, что CNP может быть возможным кандидатом в качестве терапевтического средства для релаксации и ремоделирования гладкой мускулатуры сосудов. Фармакологические эффекты CNP в отношении некоторых расстройств были отнесены отчасти к вазопротекторным действиям, а не к сосудорасширяющей активности (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 170: 1204-1211 (2004)). Следовательно, варианты CNP согласно настоящему изобретению применимы для лечения состояний, например, расстройств гладкой мускулатуры сосудов, при которых CNP может оказывать вазопротекторное действие, включая без ограничения индукцию релаксации гладкой мускулатуры и ингибирование инфильтрации макрофагов в ткань сердца. В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP применяют для лечения сердечной недостаточности, включая без ограничения острую декомпенсированную сердечную недостаточность и острую застойную сердечную недостаточность. В другом варианте осуществления изобретения варианты CNP применяют для лечения астмы, кардиомиопатии и рестеноза коронарных артерий (за счет увеличения релаксации гладкомышечных клеток и снижения пролиферации гладкомышечных клеток).

Фармацевтические композиции вариантов CNP

В дополнительных вариантах изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим вариант CNP и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов, носителей и/или разбавителей. В некоторых вариантах композиции дополнительно содержат одно или несколько других биологически активных средств (например, ингибиторы протеаз, рецепторные тирозинкиназы и/или клиренс-рецептор NPR-C).

В некоторых вариантах композиции содержат требуемый вариант CNP, очищенный по меньшей мере примерно на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В некоторых вариантах композиции содержат менее чем примерно 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0,5% макромолекулярных примесей, таких как другие белки млекопитающих (например, человека) и другие варианты CNP.

Неограничивающими примерами эксципиентов, носителей и разбавителей являются наполнители, жидкости, буферы, средства для изотоничности, добавки, стабилизаторы, консерванты, солюбилизаторы, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы, увлажнители, адъюванты и т.д. Композиции могут содержать жидкости (например, воду, этанол); разбавители с различным буферным содержимым (например, трис-HCl, фосфатные, ацетатные буферы, цитратные буферы), pH и ионной силой; детергенты и солюбилизирующие средства (например, полисорбат 20, полисорбат 80); антиоксиданты (например, метионин, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия); консерванты (например, тимеросол, бензиловый спирт, м-крезол); и вещества-наполнители (например, лактозу, маннит, сахарозу). Использование эксципиентов, разбавителей и носителей в препарате фармацевтической композиции известно в данной области; см., например, публикацию Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, p. 1435-1712, Mack Publishing Co. (Easton, Pennsylvania (1990)), которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

Например, носители включают без ограничения разбавители, наполнители и адъюванты, а также имплантируемые носители и инертные нетоксичные твердые или жидкие наполнители и инкапсулирующие материалы, которые не взаимодействуют с активным ингредиентом(ами). Неограничивающими примерами носителей являются фосфатно-солевой буфер, физиологический раствор соли, вода и эмульсии (например, эмульсии масло/вода). Носителем может быть растворитель или диспергирующая среда, содержащая, например, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и тому подобные), растительное масло и их смеси.

В некоторых вариантах композиции являются жидкими препаратами. В некоторых вариантах препараты содержат вариант CNP в диапазоне концентраций примерно от 0,1 мг/мл до примерно 20 мг/мл, или примерно от 0,5 мг/мл до примерно 20 мг/мл, или примерно от 1 мг/мл до примерно 20 мг/мл, или примерно от 0,1 мг/мл до примерно 10 мг/мл, или примерно от 0,5 мг/мл до примерно 10 мг/мл, или примерно от 1 мг/мл до примерно 10 мг/мл.

В следующих вариантах композиции содержат раствор буфера или буферное средство, чтобы поддерживать pH CNP-содержащего раствора или суспензии в требуемом диапазоне. Неограничивающие примеры буферных растворов включают фосфатно-солевой буфер, забуференный трисом раствор соли и забуференный раствор соли Хенкса. Буферные средства включают без ограничения ацетат натрия, фосфат натрия и цитрат натрия. Также могут быть использованы смеси буферных средств. В некоторых вариантах буферным средством является уксусная кислота/ацетат или лимонная кислота/цитрат. Количество буферного средства, подходящее для композиции, зависит отчасти от конкретного используемого буфера и требуемого pH раствора или суспензии. Например, ацетат является более эффективным pH-буфером при pH 5, чем pH 6, так что можно использовать меньше ацетата в растворе при pH 5, чем при pH 6. В некоторых вариантах буферное средство имеет концентрацию примерно 10 мМ ± 5 мМ. В некоторых вариантах pH композиции составляет примерно от pH 3 до примерно pH 7,5, или примерно от pH 3,5 до примерно pH 7, или примерно от pH 3,5 до примерно pH 6,5, или примерно от pH 4 до примерно pH 6, или примерно от pH 4 до примерно pH 5, или примерно pH 5,0±1,0.

В других вариантах композиции содержат средство для корректировки изотоничности, чтобы сделать раствор или суспензию изотоничной и более подходящей для инъекции. Неограничивающими примерами средств для изотоничности являются NaCl, декстроза, глюкоза, глицерин, сорбит, ксилит и этанол. В некоторых вариантах средством для изотоничности является NaCl. В некоторых вариантах NaCl присутствует в концентрации примерно 160±20 мМ или примерно 140 мМ ± 20 мМ, или примерно 120±20 мМ, или примерно 100 мМ ± 20 мМ, или примерно 80 мМ ± 20 мМ, или примерно 60 мМ ± 20 мМ.

В следующих вариантах композиции содержат консервант. Консерванты включают, но без ограничения, м-крезол и бензиловый спирт. В некоторых вариантах консервант присутствует в концентрации примерно 0,4% ± 0,2%, или примерно 1% ± 0,5%, или примерно 1,5% ± 0,5%, или примерно 2,0% ± 0,5%.

В следующих вариантах композиции содержат антиадсорбент (например, чтобы уменьшить адсорбцию варианта CNP на стекле или пластике). Антиадсорбенты включают без ограничения бензиловый спирт, полисорбат 20 и полисорбат 80. В некоторых вариантах антиадсорбент присутствует в концентрации примерно от 0,001% до примерно 0,5%, или примерно от 0,01% до примерно 0,5%, или примерно от 0,1% до примерно 1%, или примерно от 0,5% до примерно 1%, или примерно от 0,5% до примерно 1,5%, или примерно от 0,5% до примерно 2%, или примерно от 1% до примерно 2%.

В дополнительных вариантах композиции содержат стабилизатор. Неограничивающими примерами стабилизаторов являются глицерин, глицерол, тиоглицерин, метионин и аскорбиновая кислота и ее соли. В некоторых вариантах, когда стабилизатором является тиоглицерин или аскорбиновая кислота или ее соль, стабилизатор присутствует в концентрации примерно от 0,1% до примерно 1%. В других вариантах, когда стабилизатором является метионин, стабилизатор присутствует в концентрации примерно от 0,01% до примерно 0,5%, или примерно от 0,01% до примерно 0,2%. В следующих вариантах, когда стабилизатором является глицерин, стабилизатор присутствует в концентрации примерно от 5% до примерно 100% (неразбавленный).

В следующих вариантах композиции содержат антиоксидант. Примеры антиоксидантов включают без ограничения метионин и аскорбиновую кислоту. В некоторых вариантах молярное отношение антиоксиданта к варианту CNP составляет примерно от 0,1:1 до примерно 15:1, или примерно от 1:1 до примерно 15:1, или примерно от 0,5:1 до примерно 10:1, или примерно от 1:1 до примерно 10:1 или примерно от 3:1 до примерно 10:1.

Фармацевтически приемлемые соли могут быть использованы в композициях, включая без ограничения соли неорганических кислот (например, гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат), соли органических кислот (например, ацетат, пропионат, малонат, бензоат, мезилат, тозилат) и соли аминов (например, изопропиламин, триметиламин, дициклогексиламин, диэтаноламин). Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых солей приведено в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania (1990)).

Фармацевтические композиции можно вводить в различных формах, таких как таблетки, капсулы, гранулы, порошки, растворы, суспензии, эмульсии, мази и трансдермальные пластыри. Формы дозирования композиций могут быть подобраны для требуемого способа введения композиций. Для перорального введения композиции могут принимать, например, форму таблетки или капсулы (включая мягкие желатиновые капсулы), или могут быть, например, в виде водного или неводного раствора, суспензии или сиропа. Таблетки и капсулы для перорального введения могут включать в себя один или несколько обычно используемых эксципиентов, разбавителей и носителей, таких как маннит, лактоза, глюкоза, сахароза, крахмал, кукурузный крахмал, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, карбонат магния и глиданты (например, стеарат магния, стеарилфумарат натрия). При необходимости к твердым или жидким препаратам могут быть добавлены корригенты, красители и/или подсластители. Другие необязательные ингредиенты для пероральных препаратов включают без ограничения консерванты, суспендирующие средства и загустители. Пероральные препараты также могут иметь кишечно-растворимое покрытие, чтобы защитить вариант CNP от кислой среды в желудке. Способы приготовления твердых и жидких форм дозирования известны или будут очевидны для специалистов в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, выше).

Препараты для парентерального введения могут быть приготовлены, например, в виде жидких растворов или суспензий, в виде твердых форм, подходящих для растворения или получения суспензии в жидкой среде перед инъекцией, или в виде эмульсий. Например, стерильные инъекционные растворы и суспензии могут быть приготовлены согласно способам, известным в данной области, с использованием подходящих разбавителей, носителей, растворителей (например, забуференного водного раствора, раствора Рингера, изотоничного раствора хлорида натрия), диспергирующих средств, увлажнителей, эмульгаторов, суспендирующих средств и тому подобных. Кроме того, можно использовать стерильные нелетучие масла, сложные жирные эфиры, полиолы и/или другие неактивные ингредиенты. В качестве дополнительных примеров препараты для парентерального введения включают водные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают препарат изотоничным крови предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие средства и загустители.

Композиции, содержащие вариант CNP, также могут представлять собой лиофилизованные препараты. В некоторых вариантах лиофилизованные препараты содержат буфер и наполнитель и необязательно антиоксидант. Примеры буферов включают без ограничения ацетатные буферы и цитратные буферы. Примеры наполнителей включают без ограничения маннит, сахарозу, декстран, лактозу, трегалозу и повидон (PVP K24). В некоторых вариантах маннит присутствует в количестве примерно от 3% до примерно 10%, или примерно от 4% до примерно 8%, или примерно от 4% до примерно 6%. В некоторых вариантах сахароза присутствует в количестве примерно от 6% до примерно 20%, или примерно от 6% до примерно 15%, или примерно от 8% до примерно 12%. Примеры антиоксидантов включают, но без ограничения, метионин и аскорбиновую кислоту.

Изобретение также относится к наборам, содержащим, например, бутылочки, флаконы, ампулы, пробирки, картриджи и/или шприцы, которые содержат жидкий (например, стерильный инъекционный) препарат или твердый (например, лиофилизованный) препарат. Наборы также могут содержать фармацевтически приемлемые наполнители или носители (например, растворители, растворы и/или буферы) для перерастворения твердого (например, лиофилизованного) препарата с получением раствора или суспензии для введения (например, посредством инъекции), включая без ограничения перерастворение лиофилизованного препарата в шприце для инъекции или для разбавления концентрата до более низкой концентрации. Кроме того, инъекционные растворы и суспензии для немедленного применения могут быть приготовлены, например, из стерильного порошка, гранул или таблеток, содержащих CNP-содержащую композицию. Наборы также могут включать дозирующие устройства, такие как аэрозольные или инъекционные дозирующие устройства, ручки-инжекторы, автоинжекторы, безыгольные инжекторы, шприцы и/или иглы.

В качестве неограничивающего примера набор моет включать в себя шприцы, имеющие одну камеру или двойные камеры. В случае однокамерных шприцов одна камера может содержать жидкий препарат CNP, готовый для инъекции, или твердый (например, лиофилизованный) препарат CNP или жидкий препарат варианта CNP в относительно небольшом количестве подходящей системы растворителей (например, в глицерине), который может быть перерастворен с получением раствора или суспензии для инъекции. В случае двухкамерных шприцов одна камера может содержать фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель (например, систему растворителей, раствор или буфер), а другая камера может содержать твердый (например, лиофилизованный) препарат CNP или жидкий препарат варианта CNP в относительно небольшом количестве подходящей системы растворителей (например, в глицерине), которые могут быть восстановлены до раствора или суспензии для инъекции с использованием наполнителя или носителя из первой камеры.

В качестве следующего примера набор может содержать один или несколько ручек-инжекторов или автоинжекторных устройств и двухкамерных картриджей. Одна камера картриджа может содержать фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель (например, систему растворителей, раствор или буфер), а другая камера может содержать твердый (например, лиофилизованный) препарат CNP или жидкий препарат варианта CNP в относительно небольшом количестве подходящей системы растворителей (например, глицерина), которые могут быть восстановлены до получения раствора или суспензии для инъекции с использованием наполнителя или носителя из первой камеры. Картридж может содержать определенное количество варианта CNP, которое является достаточным для дозирования в течение требуемого периода времени (например, 1 дня, 2 дней, 3 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, и т.д.). Ручка-инжектор или автоинжектор могут быть настроены для введения требуемого количества препарата CNP из картриджа.

Кроме того, фармацевтические композиции, содержащие вариант CNP, могут быть приготовлены в виде системы медленного высвобождения, контролируемого высвобождения или длительного высвобождения для поддержания относительно постоянного уровня дозы в течение требуемого периода времени, такого как 1 неделя, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца или 3 месяца. Препараты медленного высвобождения, контролируемого высвобождения и длительного высвобождения могут быть приготовлены с использованием, например, биоразрушаемых полимерных систем {которые могут включать в себя, например, гидрофильные полимеры [например, полилактид, полигликолид, поли(лактид-гликолид)]}, и могут принимать форму, например, микрочастиц, микросфер или липосом, которые известны в данной области.

Дозы и частота дозирования

В используемом в настоящем описании смысле термин «терапевтически эффективное количество» активного средства (например, варианта CNP) относится к количеству, которое приносит терапевтическую пользу пациенту. Количество может варьировать от пациенту к пациенту и может зависеть от ряда факторов, включая общее физическое состояние пациента. Терапевтически эффективное количество варианта CNP легко может определить специалист в данной области, используя общедоступные материалы и способы. Например, количество варианта CNP, используемого для терапии, должно обеспечивать подходящую скорость роста на основе карт физического развития для детей в возрасте 0-17 лет с ахондроплазией (214 женщин и 189 мужчин), в которых перечислены рост для конкретного возраста, окружность головы и сегментарный рост (Horton WA et al., Standard growth curves for achondroplasia, J. Pediatr., 93: 435-8 (1978)). Карты CDC можно использовать для оценки массы для данного возраста и массы для данного роста или BMI для возраста. Также могут быть измерены вторичные последствия, течение которых является более хроническим по своей природе.

С учетом более длительного времени полужизни в сыворотке чем у CNP22 дикого типа варианты CNP потенциально можно вводить менее часто, чем CNP22. Частота дозирования для конкретного индивидуума может варьировать, в зависимости от различных факторов, включая расстройство, подвергаемое лечению, и состояние и ответ организма индивидуума на терапию. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию, содержащую вариант CNP, вводят субъекту примерно один раз в день, один раз в два дня, один раз в три дня или один раз в неделю. В одном варианте для лечения связанных с костями расстройств (например, дисплазий скелета, включая ахондроплазию) пациентам вводят ежедневную или еженедельную дозу варианта CNP вплоть до достижения взрослого состояния и/или во взрослом состоянии.

Варианты CNP, описанные в настоящей публикации, можно вводить пациентам в терапевтически эффективных дозах для лечения, ослабления или предотвращения связанных с костями расстройств (например, дисплазий скелета, включая ахондроплазию) и состояний (например, расстройств гладкой мускулатуры сосудов), при которых CNP может обеспечивать вазопротекторный эффект. Безопасность и терапевтическая эффективность вариантов CNP может быть определена стандартными фармакологическими способами в культурах клеток или на экспериментальных животных, такими как, например, определение LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Отношение между дозами токсического и терапевтического эффектов представляет собой терапевтический индекс, и такой индекс может быть выражен в виде отношения LD₅₀/ED₅₀. Обычно предпочтительны активные агенты, имеющие высокий терапевтический индекс.

Данные, полученные в анализах на культурах клеток и в исследованиях на животных, можно использовать для определения диапазона доз, применимых для человека. Обычно дозы лежат в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают ED₅₀ с небольшой или минимальной токсичностью. Доза может варьировать в таком диапазоне, в зависимости от применяемой формы дозирования и используемого пути введения. Терапевтически эффективная доза может быть определена на основании анализов в культурах клеток и исследований на животных.

В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP, описанные в настоящей публикации, вводят в дозе в диапазоне примерно от 5 или 10 нмоль/кг до примерно 300 нмоль/кг, или примерно от 20 нмоль/кг до примерно 200 нмоль/кг. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP вводят в дозе примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 или 2000 нмоль/кг или другой дозе, которая является подходящей по мнению лечащего врача. В других вариантах осуществления изобретения варианты CNP вводят в дозе примерно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мкг/кг или примерно 1, 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг/кг или другой дозе, которая является подходящей по мнению лечащего врача. Дозы вариантов CNP, описанных в настоящей публикации, можно вводить в соответствии с частотой дозирования/частотой введения, описанной в настоящей публикации, включая без ограничения введении ежедневно, 2 или 3 раза в неделю, еженедельно, каждые 2 недели, каждые 3 недели, ежемесячно и т.д.

Частоту дозирования/введения варианта CNP для конкретного субъекта может варьировать, в зависимости от различных факторов, включая расстройство, подвергаемое лечению, и состояние и ответ субъекта на терапию. Вариант CNP можно вводить в виде однократной дозы или в виде множества доз на введение. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант CNP вводят в виде одной дозы или множества доз ежедневно, через день, каждые 3 дня, 2 раза в неделю, 3 раза в неделю, еженедельно, раз в две недели, каждые 3 недели, ежемесячно, каждые 6 недель, каждые 2 месяца, каждые 3 месяца или как считает нужным лечащий врач.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант CNP вводят так, чтобы обеспечить периоды роста (например, хондрогенез) с последующим восстановительным периодом (например, остеогенезом). Например, вариант CNP можно вводить внутривенно, подкожно или другим способом ежедневно или несколько раз в неделю в течение определенного периода времени с последующим периодом без лечения, затем цикл повторяют. В некоторых вариантах начальный период лечения (например, введение варианта CNP ежедневно или несколько раз в неделю) составляет 3 дня, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель или 12 недель. В родственном варианте период без лечения продолжается 3 дня, 1 неделю, 2 недели, 3 недели или 4 недель. В некоторых вариантах схема дозирования варианта CNP представляет собой следующую схему: ежедневно в течение 3 дней с последующими 3 днями без лечения; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 1 недели с последующими 3 днями или 1 неделей без лечения; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 2 недель с последующими 1 или 2 неделями без лечения; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 3 недель с последующими 1, 2 или 3 неделями без лечения; или ежедневно или несколько раз в неделю в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель с последующими 1, 2, 3 или 4 неделями без лечения.

Способы введения

Варианты CNP или содержащие их фармацевтические композиции можно вводить субъектам различными путями, такими как, например, путем инъекции подкожно, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутримышечно, интрадермально или интратекально. В одном варианте осуществления изобретения варианты CNP вводят посредством одной подкожной, внутривенной, внутриартериальной, внутрибрюшинной, внутримышечной, интрадермальной или интратекальной инъекции один раз в день.

Варианты CNP также можно вводить путем непосредственной инъекции в место или рядом с местом, пораженным заболеванием. Кроме того, варианты CNP можно вводить путем имплантации депо в целевое место действия (например, аномальную или дисплазированную кость). Альтернативно, варианты CNP можно вводить подъязычно (например, в виде подъязычной таблетки) или путем ингаляции в легкие (например, с помощью ингалятора или аэрозольного спрея), посредством доставки в носовую полость (например, интраназальный спрей), посредством доставки в глаз (например, глазные капли) или посредством трансдермальной доставки (например, с помощью пластыря на кожу). Варианты CNP также можно вводить перорально в форме микросфер, микрокапсул, липосом (незаряженных или заряженных (например, катионных)), полимерных микрочастиц (например, полиамидов, полилактида, полигликолида, поли(лактида-гликолида)), микроэмульсий и тому подобного.

Следующим способом введения является введение осмотическим насосом (например, насосом Alzet) или мини-насосом (например, осмотическим мини-наносом Alzet), который обеспечивает возможность контролируемой, непрерывной и/или медленной доставки варианта CNP или содержащей CNP фармацевтической композиции в течение предварительно определяемого периода. Осмотический насос или мини-насос может быть имплантирован подкожно или рядом с целевым местом (например, длинные кости конечностей, эпифизы и т.д.).

Как поясняется выше, варианты CNP можно применять для лечения состояний или заболеваний, вызванных аномальным ростом гладкомышечных клеток сосудов, включая без ограничения рестеноз и артериосклероз. В случае местной доставки варианта CNP в пораженный заболеванием сосуд в организме (например, кровеносный сосуд), вариант CNP может быть доставлен с помощью медицинского устройства (например, стента), имплантируемого в пораженное заболеванием место. В одном варианте осуществления изобретения вариант CNP погружен в полимерный матрикс или полимерное покрытие, находящееся поверх стента. В другом варианте осуществления изобретения вариант CNP находится в емкостях или каналах, образованных в корпусе стента и покрытых пористой полимерной мембраной или слоем, через который вариант CNP может диффундировать. Полимерный матрикс, покрытие, мембрана или слой могут содержать по меньшей мере один биоразрушаемый (например, гидрофильный) полимер, который известен в данной области. В следующем варианте осуществления изобретения вариант CNP может находиться в микросферах в корпусе стента. Вариант CNP может быть доставлен из стента посредством высвобождения в виде выброса, импульсного высвобождения, контролируемого высвобождения или длительного высвобождения или с использованием их сочетания. Например, стент может местно доставлять вариант CNP в требуемое место в виде высвобождения выбросом с последующим длительным высвобождением. Длительное высвобождение может продолжаться в течение периода времени вплоть до примерно 2 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 6 месяцев или 1 года.

Специалисту в данной области будет понятно, что варианты CNP или их композиции также могут быть введены другими способами. Определение наиболее эффективного способа введения вариантов CNP или их композиций находится в компетенции специалиста в данной области.

Варианты CNP можно вводить в виде фармацевтических препаратов, подходящих, например, для перорального (включая буккальное и подъязычное), ректального, назального, местного, легочного, вагинального или парентерального (включая внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, подкожное и внутривенное) введение, или в форме, подходящей для введения путем ингаляции или инсуффляции. В зависимости от предполагаемого способа введения фармацевтические препараты могут быть в виде твердых, полутвердых или жидких форм дозирования, таких как таблетки, суппозитории, пилюли, капсулы, порошки, жидкости, суспензии, эмульсии, кремы, мази, примочки и тому подобное. Препараты могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, подходящей для однократного введения точной дозы. Препараты содержат эффективное количество варианта CNP, и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов, носителей и/или разбавителей, и необязательно одно или несколько других биологически активных средств.

Комбинированная терапия

В одном варианте осуществления изобретения вариант CNP можно применять в сочетании с одним или несколькими другими активными средствами, применимыми для лечения, ослабления или предотвращения отвечающих на CNP состояний или расстройств, таких как, например, связанные с костями расстройства (например, дисплазии скелета) и расстройства гладкой мускулатуры сосудов. Другое активное средство (средства) может усиливать эффекты варианта CNP и/или оказывать другие фармакологические эффекты в дополнение к эффектам варианта CNP. Неограничивающими примерами активных средств, которые можно применять в сочетании с вариантами CNP, описанными в настоящей публикации, являются другие натрийуретические пептиды (например, BNP) и ингибиторы (например, антагонисты) пептидаз и протеаз (например, NEP и фурина), NPR-C и тирозинкиназ (например, FGFR-3). Благодаря предотвращению расщепления под действием NEP варианта CNP ингибитор NEP может продлевать время полужизни варианта. Примеры ингибиторов NEP включают без ограничения тиорфан и кандоксатрил. Совместное применение ингибитора NPR-C также может продлевать время полужизни варианта CNP посредством ингибирования клиренса варианта рецептором NPR-C. Неограничивающим примером ингибитора NPR-C является фрагмент FGIPMDRIGRNPR (SEQ ID NO: 82), который может быть подвергнут высвобождению в месте-мишени (например, ростовой пластинке кости) при протеолитическом расщеплении химеры FGIPMDRIGRNPR-CNP22 (аналог CZ) (SEQ ID NO: 82) или сходных химер, содержащих варианты CNP22 (например, содержащих аминокислотную замену(на), добавление(ия) и/или делецию(ии) по сравнению с CNP22). Совместное применение ингибитора тирозинкиназ может обострять эффекты CNP-терапии посредством ингибирования тирозинкиназного рецептора FGFR-3, негативного регулятора роста хондроцитов и кости. Неограничивающими примерами ингибиторов тирозинкиназ являются ингибиторы, раскрытые в U.S. 6329375 и 6344459.

Чтобы достичь соответствующего терапевтического результата при комбинированной терапии обычно можно вводить субъекту композицию CNP и другое терапевтическое средство (средства) в общем количестве, эффективном для получения требуемого терапевтического результата (например, восстановленного роста костей). Такой способ может включать в себя введение композиции CNP и другого терапевтического средства (средств) одновременно. Одновременное введение можно осуществлять посредством введения одной композиции или фармакологического белкового препарата, который содержит и вариант CNP, и другое терапевтическое средство(средства). Альтернативно другое терапевтическое средство (средства) можно принимать отдельно примерно в то же время, что и фармакологический препарат (например, таблетку, инъекцию или питье) варианта CNP. Вариант CNP также может быть приготовлен в виде пищевого продукта, такого как шоколадное пирожное, оладьи или торты, подходящие для приема в пищу.

В других альтернативных вариантах введение варианта CNP может предшествовать или следовать за введением другого терапевтического средства (средств) с интервалами в диапазоне от минут до часов. В вариантах, в которых другое терапевтическое средство (средства) и композицию CNP вводят раздельно, обычно необходимо гарантировать, чтобы вариант CNP и другое терапевтическое средство (средства) были введены в подходящее время относительно друг друга, так чтобы и вариант CNP, и другое терапевтическое средство (средства) могли оказывать, синергетически или аддитивно, полезное действие на пациента. Например, можно вводить композицию CNP примерно в пределах 0,5-6 часов (до или после) другого терапевтического средства (средств). В одном варианте композицию CNP вводят в пределах примерно 1 часа (до или после) другого терапевтического средства (средств).

Идентификация и мониторинг популяций пациентов

Могут быть разработаны протоколы для идентификации субъектов, подходящих для терапии CNP и для определения того, является ли данный пациент отвечающим на терапию CNP. Например, в случае лечения связанных с костями расстройств могут быть измерены показатели роста, такие как измерения роста длинных костей in utero и неонатально и измерения биомаркеров роста костей, таких как CNP, цГМФ, коллаген II, остеокальцин и ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA).

Одним из маркеров передачи сигнала CNP является цГМФ (циклический гуанозин-3',5'-монофосфат). Уровень такой молекулы внутриклеточной передачи сигналов возрастает после того, как CNP связывается и активирует свой рецептор NPR-B. Повышенные уровни цГМФ могут быть измерены в экстрактах культур клеток (in vitro) после воздействия CNP, в кондиционированной среде в исследованиях эксплантатов костей (ex vivo) после воздействия CNP и в плазме (in vivo) в пределах нескольких минут после введения CNP подкожно, внутривенно или другими путями введения, известными в данной области.

Специфичные для хряща и кости аналиты (или ассоциированные с хрящами и костями маркеры) также могут быть измерены, чтобы оценить эффективность CNP. Например, фрагменты расщепленного коллагена типа II являются специфичным для хряща маркером метаболизма хрящевой ткани. Коллаген типа II является основным органическим составляющим компонентом хряща, и фрагменты коллагена типа II (расщепленный коллаген) высвобождаются в кровообращение и затем выводятся в мочу после обновления хряща. Обновление хряща предшествует образованию новой кости.

Специфичным для кости биомаркером образования костей, который можно измерять, являются N-концевые пропептиды проколлагена типа I (PINP). Синтез коллагена типа I является важной стадией в образовании костей, так как коллаген типа I является основным органическим компонентом костного матрикса. Во время синтеза коллагена пропептиды высвобождаются из молекулы проколлагена и могут быть обнаружены в сыворотке. Кроме того, фрагменты коллагена типа I могут быть измерены в качестве маркера резорбции кости.

Другие потенциальные биомаркеры образования и роста хряща и кости включают аггрекан-хондроитинсульфат (специфичный для хряща маркер метаболизма хряща), пропептиды коллагена типа II (специфичный для хряща маркер образования хряща), щелочную фосфатазу (специфичную для кости) и остеокальцин (специфичный для кости маркер образования кости). Ассоциированные с хрящами и костями биомаркеры могут быть измерены, например, в сыворотке при исследованиях эффективности/фармакодинамики in vivo и в кондиционированной среде в исследованиях ex vivo с использованием коммерчески доступных наборов.

В одном варианте уровень по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера анализируют или измеряют у субъекта, которому был введен вариант CNP, для того чтобы контролировать влияние варианта CNP на образование и рост кости и хряща in vivo. Например, увеличение уровня по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера может свидетельствовать, что введение варианта CNP оказывает положительное влияние на рост костей и применимо для лечения дисплазий скелета и других связанных с костями или хрящами заболеваний или расстройств, ассоциированных с пониженной активностью CNP. Примеры ассоциированных с костями или хрящами биомаркеров включают, но без ограничения, CNP (например, эндогенные уровни CNP), цГМФ, пропептиды коллагена типа II и их фрагменты, коллаген типа II и его фрагменты, остеокальцин, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), пропептиды проколлагена типа I (PINP) и их фрагменты, коллаген типа I и его фрагменты, аггрекан-хондроитинсульфат и щелочную фосфатазу.

В одном варианте биомаркеры измеряют посредством получения биологического образца от субъекта, которому будут вводить, которому вводят или которому вводили вариант CNP. Биомаркеры могут быть измерены способами, известными в данной области, включая, но без ограничения, Вестерн-блот, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и анализ ферментативной активности. Биологическим образцом может быть кровь, сыворотка, моча или другие биологические жидкости.

Дополнительные аспекты и подробности изобретения будут очевидны на основании следующих примеров, которые предназначены для иллюстрации, а не для ограничения.

F. Примеры

ПРИМЕР 1

Синтез вариантов CNP

Варианты CNP получали с использованием способов, описанных в настоящей публикации. Замены природными или неприродными аминокислотами или пептидомиметиками осуществляли, как показано в таблицах 1-3 (показанных в примере 3), в соответствующих аминокислотных остатках в последовательности дикого типа CNP22. В некоторых вариантах добавляли дополнительные аминокислоты к N-концу и/или C-концу целой или части последовательности CNP22 дикого типа (см. таблицу 3).

Также получали варианты CNP, в которых остаток ПЭГ (или ПЭО) конъюгирован с N-концом CNP22 или его вариантов (см. таблицу 4, показанную в примере 3). Реагенты для пегилирования могут быть получены из коммерческих источников, показанных в таблице 5.

Таблица 5
Поставщик	Название продукта	Название	М.м. (Да)	Реагент для пегилирования
NOF	Sunbright ME-200CS	mПЭГ20K	20000	CH3(CH2CH2O)450-(CH2)5COO-NHS
NOF	Sunbright ME-050CS	mПЭГ5K	5000	CH3(CH2CH2O)110-(CH2)5COO-NHS
Pierce	(Метил-ПЭГ12)3-ПЭГ4-NHS сложный эфир	(mПЭГ12)3-ПЭГ4	2400	[CH3(CH2CH2O)12]3-(CH2CH2O)4-NHCO(CH2)3-COO-NHS
NOF	Sunbright ME-020HS	mПЭГ2K	2000	CH3(CH2CH2O)45-(CH2)5COO-NHS
NOF	Sunbright ME-020CS	mПЭГ2K	2000	CH3(CH2CH2O)45-(CH2)5COO-NHS
NOF	Sunbright ME-010HS	mПЭГ1K	1000	CH3(CH2CH2O)23-CO(CH2)2COO-NHS
Pierce	Метил ПЭГ24-NHS сложный эфир	MS(ПЭГ)24	1200	CH3(CH2CH2O)24-(CH2)2COO-NHS
Pierce	EZ-связь NHS-ПЭГ12-биотин	ПЭО12-биотин	940	Биотин-(CH2CH2O)12-(CH2)2COO-NHS
Pierce	Метил ПЭГ12-NHS сложный эфир	MS(ПЭГ)12	690	CH3(CH2CH2O)12-(CH2)2COO-NHS
Pierce	EZ-связь NHS-ПЭГ4-биотин	ПЭО4-биотин	590	Биотин-(CH2CH2O)4-(CH2)2COO-NHS
Pierce	Моно(лактозиламидо)моно (сукцинимидил)суберат	LSS	590
Pierce	EZ-связь NHS-LC-LC-биотин	LC-LC-биотин	570
Pierce	EZ-связь NHS-LC-биотин	LC-Биотин (LC = длинная цепь)	450
Pierce	EZ-связь NHS-биотин	Биотин	340

Полимеры ПЭГ (также называемого ПЭО), приобретенные из Pierce Biotechnology (Rockford, Illinois), являются монодисперсными - т.е. они содержат один дискретный полимер с конкретной молекулярной массой. Напротив, полимеры ПЭГ, приобретенные из NOF (Nippon Oil and Fat), являются полидисперсными - т.е. они содержат смесь полимеров, имеющих распределение по молекулярным массам.

Чтобы пегилировать CNP22 или его варианты, условия реакции и очистки оптимизировали для каждого конъюгата ПЭГ-CNP. Согласно общему способу пегилирования реакционные смеси содержат примерно 1 мМ CNP22 или его варианта и примерно от 1 до 5 мМ NHS-активированного ПЭГ в калий-фосфатном буфере, pH примерно от 5,0 до 6,5. Чтобы монопегилировать избирательно на N-конце пептида и минимизировать пегилирование на внутреннем участке (например, Lys4 в CNP22), реакцию пегилирования можно проводить в более кислых условиях (например, при pH примерно от 5,5 до 6,5), чтобы избирательно протонировать и, следовательно, дезактивировать более основную первичную аминогруппу боковой цепи лизина. После инкубации примерно в течение 1-3 часов при комнатной температуре реакцию пегилирования гасят добавлением водного глицинового буфера. Затем продукты реакции разделяют обращенно-фазовой ВЭЖХ, оптимизированной для каждого конъюгата ПЭГ-CNP. Фракционированные образцы подвергали скоростному вакуумированию досуха и перерастворяли/готовили в 1 мМ HCl. Идентификацию и определение чистоты каждого продукта ПЭГ-CNP осуществляли с использованием жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ/МС).

Пример 2A

Основанное на рекомбинации получение вариантов CNP

Варианты CNP могут быть получены с использованием методики рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения варианты CNP получают в виде слитых белков, содержащих отщепляемый пептид, белок-носитель или метку. Примеры способов рекомбинантного получения слитых белков CNP описаны ниже.

Материалы и способы

Клонирование слитых белков CNP в экспрессирующих векторах

Фрагменты ДНК CNP амплифицировали, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и амплифицированные ПЦР-фрагменты расщепляли, используя NdeI и BamHI, и клонировали в векторе pET21a (Novagen, Gibbstown, New Jersey). ДНК слитого белка CNP синтезировали, используя DNA2,0, и клонировали в разных экспрессирующих векторах (таблица 6).

Таблица 6
Конструкция	Вектор	Продукт	Химическое расщепление	Конечный продукт	Штамм E. coli для экспрессии
pJexpress-TAF-CNP	pJexpress401	TAF-CNP тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP	BL21; BL21(DE3)
pJexpress-KSI-CNP(M/N)	pJexpress404	KSI-CNP(M/N) тельца включения	CNBr (Met-X)	CNP(M/N)	BL21
pET-31b-KSI-CNP	pET-31b	KSI-CNP тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP	BL21(DE3)
pET-32a-Trx-CNP	pET-32a	Trx-CNP слитый белок (растворимый)	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP	BL21(DE3)
pMAL-CNP	pMAL-c2X	MBP-CNP слитый белок (растворимый)	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP	BL21(DE3)
CNP: GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Gly-CNP37 (SEQ ID NO: 75); TAF: фактор транскрипции TAF12 человека; KSI: изомераза кетостероидов; MBP: связывающий мальтозу белок; Trx: тиоредоксин.

Экспрессия слитых белков CNP в E. coli

Экспрессирующими плазмидами слитых белков CNP трансформировали E. coli BL21 или BL21(DE3). Трансформированные клетки высевали на планшеты с LB, содержащие 100 мкг/мл карбеницилина или 50 мкг/мл канамицина, и инкубировали в течение ночи при 37°C. Одну отдельную колонию собирали и культивировали в 4 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл карбеницилина или 50 мкг/мл канамицина, при 37°C и встряхивании. Когда OD₆₀₀ бактериальной культуры достигало 0,6, к культуральной среде добавляли 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) и среду инкубировали при 37°C в течение 3 часов при встряхивании. Для сбора клеток бактериальные клетки центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут и осадок клеток хранили при -80°C. Осадки клеток лизировали, используя реагент для экстракции бактерий B-PER II (PIERCE, 0,4 мл на 4 мл бактериальной культуры) и нуклеазу бензоназу (Novagen, 0,025 ед./мл) при комнатной температуре в течение 10 минут. Неочищенный экстракт бактерий собирали и центрифугировали, получая надосадок. Надосадок и неочищенный экстракт анализировали в отношении экспрессии и растворимости слитого белка CNP, используя SDS-ПААГ и Вестерн-блот.

Выявление экспрессии слитого белка CNP с использованием SDS-ПААГ и Вестерн-блота

Десять микролитров клеточных лизатов или растворимые надосадки разгоняли, используя электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ) (Invitrogen, Carlsbad, California, NuPAGE 4-12% бис-трис-гель, буфер MES SDS). Гель красили, используя 20 мл красителя Imperial Protein (Thermo Fisher, Rockford, Illinois), при комнатной температуре в течение 1 часа и краситель удаляли водой. Для Вестерн-блота белок переносили на мембрану с помощью Gel blot (Invitrogen). Мембрану блокировали в TBS-буфере с 5% молоком при комнатной температуре в течение 1 часа. Кроличье анти-CNP22-антитело (разведение 1:2500) (Bachem, Torrance, California) добавляли к мембране, которую затем инкубировали при комнатной температуре и встряхивании в течение 2 часов, и затем мембрану промывали 3 раза буфером TBS.

Конъюгированные со щелочным фосфатом (ЩФ) антитела против IgG кролика (разведение 1:5000) добавляли к мембране, которую затем инкубировали при комнатной температуре и встряхивании в течение 1 часа, и затем мембрану промывали 3 раза буфером TBS. К мембране добавляли десять миллилитров стабилизированного субстрата WESTERN BLUE® (Promega, Madison, Wisconsin), затем мембрану инкубировали при комнатной температуре и встряхивании в течение 1-5 минут, и затем мембрану промывали буфером TBS, чтобы удалить избыток краски.

Экспрессия слитого белка TAF-CNP в E. coli BL21

Клетки (E. coli, штамм BL21), экспрессирующие слитый белок TAF-CNP, получали из исходной культуры в глицерине, которую хранили при -80°C, и выращивали в 4 мл культуральной среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, при 37°C в течение ночи при встряхивании (250 об/мин). Четыре миллилитра выращенной ночной культуры клеток переносили в 200 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и выращивали при 37°C и встряхивании (250 об/мин). Когда OD₆₀₀ достигала 0,6, добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ, чтобы индуцировать экспрессию белка, при 37°C и встряхивании (250 об/мин) в течение 3 часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут и полученный клеточный осадок замораживали при -80°C.

Очистка телец включения TAF-CNP и расщепление муравьиной кислотой

Осадок клеток (из культуры объемом 200 мл) ресуспендировали в 25 мл буфера B-PER II (PIERCE), осадок обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут (50%, 1 секунда, пауза 2 секунды) на льду, центрифугировали при 12000 об/мин в течение 20 минут при 4°C, и затем осадок ресуспендировали в 25 мл разбавленного в 20 раз буфера B-PER II. Обработку повторяли до тех пор, пока надосадок не становился прозрачным (3-5 раз). Один миллилитр ресуспендированных телец включения TAF-CNP переносили в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 минут. Надосадок отбрасывали, а осадок растворяли с использованием 10 мкл 88% муравьиной кислоты и затем сразу добавляли 490 мкл воды, профильтрованной с использованием Millipore. Осадок хорошо перемешивали, используя устройство для встряхивания и перемешивания, и инкубировали при 55°C в течение 20-24 часов (альтернативные условия 70°C/6 часов). Продукты расщепления муравьиной кислотой анализировали в SDS-ПААГ и ЖХ/МС(C4RP).

Получение образца ЖХ/МС

Тельца включения выделяли из культуры объемом примерно 8 мл (OD примерно 1,5) и осадок солюбилизировали в 10 мкл формиата. Солюбилизированный осадок сразу же разбавляли в формиате в конечной концентрации 2% или 10% (0,5 мл) и инкубировали при 55°C в течение 21 часа (pH 2) (мутность была более выраженной в образце с 2% формиатом на следующий день). Оба образца центрифугировали при 15000 об/мин в течение 2 минут. Двадцать микролитров надосадка инъецировали в устройство для ЖХ/МС (C4RP).

Результаты

Слитые белки CNP экспрессировали в E. coli

Все слитые белки CNP экспрессировали в клетках E. coli, индуцированных 1 мМ IPTG при 37°C в течение 3 часов (фигура 1). Конструкции pJexpress-TAF-CNP, pJexpress-KSI-CNP(M/N) и pET-31b-KSI-CNP экспрессировали в виде телец включения, тогда как конструкции pET-32a-Trx-CNP и pMAL-CNP экспрессировали в виде растворимых слитых белков. Вестерн-блот с использованием анти-CNP22-антитела подтвердил экспрессию слитых белков CNP (фигура 1).

CNP получали из телец включения TAF-CNP расщеплением муравьиной кислотой

Тельца включения TAF-CNP частично очищали и обрабатывали 2% муравьиной кислотой при 55°C в течение 20-24 часов (альтернативные условия 70°C/6 часов). Большинство TAF-CNP были расщеплены, и в SDS-ПААГ появлялась одна дополнительная полоса, имеющая размер, сходный с размером пептида Gly-CNP37 (фигура 2). Расщепленный образец затем анализировали, используя ЖХ/МС(C4 RP). Результаты ЖХ/МС показали, что CNP высвобождался в растворимой форме из телец включения TAF-CNP после расщепления муравьиной кислотой. ЖХ/МС-анализ показал, что расщепление муравьиной кислотой слитых белков CNP приводило к образованию циклизованного Pro-Gly-CNP37 (М.м.=4102). Вычисление количества белка на основе анализа свидетельствует, что получали примерно 60 мкг образуемого при обработке муравьиной кислотой CNP из 8 мл культуры с очень низким значением OD. В случае культуры клеток небольшого масштаба (например, примерно 8 мл) с низким значением OD (например, OD 1,2) получали приблизительно 8 мкг/мл CNP, тогда как ферментация культуры клеток в большем масштабе (например, примерно 8 л) с более высоким OD (например, OD 38) могла давать приблизительно 1 мг/мл CNP.

Заключение

Создали пять экспрессирующих конструкций, чтобы экспрессировать слитые белки CNP. Экспрессия всех пяти конструкций давала растворимые (Trx и MBP) или нерастворимые (TAF и KSI) слитые белки CNP. Приблизительно 1 мг/мл растворимого CNP можно получить из телец включения TAF-CNP простым способом на основе расщепления муравьиной кислотой.

Пример 2B

Получение дополнительных вариантов CNP в E. coli

Получение вариантов CNP на основе рекомбинации осуществляли как описано в примере 2A. В данном примере дополнительные конструкции CNP создавали, используя набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II XL (Stratagene) или синтезировали, используя DNA2,0. Дополнительные конструкции CNP и экспрессирующие векторы перечислены в таблице 7.

Таблица 7
Конструкция	Вектор	Продукт	Химическое расщепление	Конечный продукт	Штамм E. coli для экспрессии
pJexpress-TAF(C/A)-Pro-CNP38	pJexpress401	TAF(C/A)-Pro-CNP38 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP38	BL21(DE3)
pJexpress-TAF(4D/4E)-Pro-CNP38	pJexpress401	TAF(4D/4E)-Pro-CNP38 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP38	BL21(DE3)
pJexpress-TAF (C/A&4D/4E)-Pro-CNP38	pJexpress401	TAF(C/A&4D/4E)-Pro-CNP38 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP38	BL21(DE3)
pJexpress-TAF (C/A&10D/10E)-Pro-CNP38	pJexpress401	TAF(C/A&10D/10E)-Pro-CNP38 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP38	BL21(DE3)
pJexpress-TAF-NL-(C/A & 6D/6E)-Pro-CNP38	pJexpress401	TAF-NL-(C/A & 6D/6E)-Pro-CNP38 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP38	BL21(DE3)

pJexpress-BMP-Pro-CNP38	pJexpress401	BMP-Pro-CNP38 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP38	BL21; BL21(DE3)
pJexpress-TAF-Pro-CNP37	pJexpress401	TAF-Pro-CNP37 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP37	BL21; BL21(DE3)
pJexpress-BMP-Pro-CNP37	pJexpress401	BMP-Pro-CNP37 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP37	BL21; BL21(DE3)
pJexpress-TAF-Pro-HSA-CNP	pJexpress401	TAF-Pro-HSA-CNP тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-HSA-CNP	BL21
pJexpress-TAF	pJexpress401	TAF тельца включения	не анализировали	не анализировали	BL21(DE3)
pJexpress-BMP	pJexpress401	BMP тельца включения	не анализировали	не анализировали	BL21(DE3)
pJexpress-TAF(C/A)	pJexpress401	TAF(C/A) тельца включения	не анализировали	не анализировали	BL21(DE3)
pJexpress-TAF(4D/4E)	pJexpress401	TAF(4D/4E) тельца включения	не анализировали	не анализировали	BL21(DE3)

pJexpress-TAF (C/A&4D/4E)	pJexpress401	TAF(C/A&4D/4E) тельца включения	не анализировали	не анализировали	BL21(DE3)
pJexpress-TAF (C/A&10D/10E)	pJexpress401	TAF(C/A&10D/10E) тельца включения	не анализировали	не анализировали	BL21(DE3)
pJexpress-TAF-NL-(C/A & 6D/6E)	pJexpress401	TAF-NL-(C/A&6D/6E) тельца включения	не анализировали	не анализировали	BL21(DE3)
pJexpress-TAF-Pro-CNP53	pJexpress401	TAF-Pro-CNP53 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	Pro-CNP53	BL21(DE3)
pJexpress-TAF-CNP34	pJexpress401	TAF-CNP34 тельца включения	Муравьиная кислота (Asp-Pro)	CNP34	BL21(DE3)

CNP38: GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Gly-CNP37 (SEQ ID NO: 75)];

Pro-CNP38: PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Pro-Gly-CNP37] (SEQ ID NO: 145);

CNP37: QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 60);

HSA-CNP: GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC [HSA-CNP27 (SEQ ID NO: 144)];

Pro-CNP53: PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIG-SMSGLGC (SEQ ID NO: 185);

CNP34: PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 163);

TAF-Pro-CNP38: MVLTKKKLQDLVREVCPNEQLDEDVEEMLLQIADDFIESVVTAA-CQLARHRKSSTLEVKDVQLHLERQWNMWIMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHT-GDDDDKHMDPGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 196);

TAF: домен укладки гистонов (HFD) фактора транскрипции TAF12 человека и линкер из вектора pET-15b;

TAF-NL: HFD TAF12 без линкера;

TAF12 HFD: VLTKKKLQDLVREVCPNEQLDEDVEEMLLQIADDFIESVVTAACQLA- RHRKSSTLEVKDVQLHLERQWNMWI (SEQ ID NO: 197);

Линкер pET-15b: MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTGDDDDKHMD (SEQ ID NO: 195);

TAF(C/A): цистеин в TAF заменен на аланин;

TAF(D/E): аспарагиновая кислота в TAF заменена на глутаминовую кислоту (число показывает, какой остаток аминокислоты изменен);

TAF(C/A и D/E): цистеин и аспарагиновая кислота в TAF заменены на аланин и глутаминовую кислоту, соответственно;

BMP: костный морфогенетический белок 2 с семью мутациями C/A (цистеин на аланин);

KSI: изомераза кетостероидов; MBP: связывающий мальтозу белок; TRX: тиоредоксин

Результаты

Все слитые белки CNP экспрессировали в клетках E. coli, индуцированных 1 мМ IPTG при 37°C в течение 3 часов. Конструкции pJexpress-BMP-Pro-CNP38, pJexpress-TAF-Pro-CNP37, pJexpress-BMP-Pro-CNP37, pJexpress-Pro-HSA-CNP, pJexpress-TAF и pJexpress-BMP были экспрессированы в виде телец включения. Вестерн-блот с использованием анти-CNP-антитела использовали для подтверждения экспрессии (фигура 3).

Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») получали из телец включения TAF-Pro-CNP38 расщеплением муравьиной кислотой

Муравьиную кислоту используют в качестве денатурирующего средства для белков телец включения, и она может специфично расщеплять пептидную связь между Asp и Pro в оптимизированных условиях. Тельца включения TAF-Pro-CNP частично очищали, как описано выше, и обрабатывали 50% муравьиной кислотой при 25°C, 37°C, 42°C и 55°C в течение 24 часов. Большинство TAF-Pro-CNP38 были расщеплены, и наблюдали одну дополнительную полосу в области, соответствующей размеру, сходному с размером пептида Gly-CNP37 («CNP38»), в SDS-ПААГ продуктов расщепления, полученных при 37°C, 42°C и 55°C (фигура 4A). Реакционные смеси для расщепления при 37°C и 55°C нейтрализовали 10 М NaOH и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 минут. Нерасщепленные TAF-Pro-CNP38, TAF и другие тельца включения выпадали в осадок. Надосадки содержали растворимый Pro-CNP38, и такие надосадки далее анализировали, используя ЖХ/МС. Результат ЖХ/МС показал, что надосадки содержали смесь неспецифичных расщепленных пептидов, образованных при гидролизе избытком кислоты.

Когда тельца включения TAF-Pro-CNP обрабатывали 2% и 10% муравьиной кислотой при 55°C в течение 20 часов, большинство TAF-Pro-CNP38 подвергалось расщеплению, и наблюдали одну дополнительную полосу, соответствующую размеру, сходному с размером Gly-CNP37, в SDS-ПААГ (фигура 4B). Расщепленный образец дополнительно анализировали, используя ЖХ/МС. ЖХ/МС-анализ показал, что правильный Pro-CNP38 высвобождался в растворимой форме из телец включения TAF-Pro-CNP38 после расщепления муравьиной кислотой. Выходы Pro-CNP38 в результате расщепления 2% и 10% муравьиной кислотой были сходными (фигура 4C).

Расщепление муравьиной кислотой и нейтрализация при получении и очистке Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38»)

Муравьиная кислота может растворять и расщеплять TAF-Pro-CNP38, BMP-Pro-CNP38 и другие тельца включения. Нейтрализация pH приводит к преципитации нерастворимых примесных белков/пептидов (нерасщепленные TAF-Pro-CNP38 и BMP-Pro-CNP38, TAF, BMP и другие). Растворимый Pro-CNP38 остается в надосадке после центрифугирования. TAF-Pro-CNP38 и BMP-Pro-CNP38 расщепляли в 2% муравьиной кислоте при 55°C или 70°C в течение 24 часов. Реакционные смеси для расщепления нейтрализовали, используя 0,5 М трис-буфер в соотношении 1:1, и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 минут. Результаты показали, что надосадки содержали почти чистые пептиды, и при нейтрализации не наблюдалось потери извлеченного Pro-CNP38. Указанный способ является простой и эффективной стадией очистки Pro-CNP38.

Анализ различных условий для расщепления муравьиной кислотой телец включения TAF-Pro-CNP38 для получения Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38»)

Муравьиная кислота может специфично расщеплять пептидную связь между Asp и Pro в оптимизированных условиях. Неспецифичное расщепление пептидных связей между Asp и любыми другими аминокислотами или даже неспецифичное расщепление любой пептидной связи может происходить в том случае, если условия расщепления муравьиной кислотой не оптимизированы. Тельца включения TAF-Pro-CNP38 расщепляли 2% муравьиной кислотой при 42°C, 55°C или 70°C в течение 6, 24 или 48 часов. На фигуре 5A показано, что TAF-Pro-CNP38 полностью расщеплялся при 70°C в течение 24 часов или при 55°C в течение 48 часов. Расщепление при 70°C может быть завершено за период времени, составляющий 17 часов (фигура 5B). Хотя расщепление 70°C/24 часа давало наибольший выход, уровень продуктов неспецифичного расщепления (например, пептид с молекулярной массой 3142, образованный из Pro-CNP38 при расщеплении пептидной связи между Asp и Arg) резко возрастал (фигура 5C).

Выход и чистоту полученного Pro-CNP38 повышали, когда тельца включения TAF-Pro-CNP38 очищали или обрабатывали буфером B-PER II перед расщеплением муравьиной кислотой. Так как буфер B-PER II содержит детергент октилтиоглюкозид и является относительно дорогим, то тестировали другие обычно используемые детергенты или буферы в отношении крупномасштабной продукции Pro-CNP38. Тельца включения TAF-Pro-CNP38 ресуспендировали в разных детергентах (октилсахароза; тритон x-100; твин-20; NP-40; CA-630) или буферах (B-PER II; B-PER II в разведении 1/20; B-PER; B-PER-фосфатный буфер; 25 мМ трис, 150 мМ NaCl, pH 7,9; 25 мМ трис, pH 7,5; профильтрованная вода; PBS) и инкубировали при комнатной температуре (КТ) в течение 24 часов. Все детергенты готовили в концентрации 1% в 25 мМ трис-буфере, pH 7,5. После инкубации в детергенте или буфере тельца включения TAF-Pro-CNP38 расщепляли 2% муравьиной кислотой при 55°C в течение 22 часов. Результаты показали, что BPER II продолжал давать высокий выход, и положительные результаты также получали в случае CA630 и тритона X-100.

Продукты протеолитического расщепления Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38»)

Одна неидентифицированная протеаза, вероятно ассоциированная с мембраной протеаза, расщепляла пептид Pro-CNP38 (полученный из штамма BL21, М.м. 4102) на два пептида во время очистки Pro-CNP38, давая в результате пептиды PGQEHPNAR (М.м. 1004) (SEQ ID NO: 198) и KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (М.м. 3115) (SEQ ID NO: 199). Не имея намерения быть связанными с какой-либо теорией, предполагают, что одной из возможных причин того, почему детергенты повышают выход и чистоту Pro-CNP38, является то, что детергенты могут удалять большую часть, но возможно не всю, неидентифицированную протеазу. Тестировали высокую температуру, щелочной pH и EDTA, чтобы выяснить, могут ли такие средства ингибировать расщеплением протеазами. Тельца включения TAF-Pro-CNP38 инкубировали при комнатной температуре или при 120°C в течение 2 часов и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 минут. Осадки ресуспендировали в 2% муравьиной кислоте и инкубировали при 55°C или 70°C в течение 18 часов. Добавляли 0,5 М трис в соотношении 1:1, чтобы нейтрализовать расщепление. Нейтрализованные образцы центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 минут и надосадки оставляли при комнатной температуре в течение 6 часов или 22 часов в присутствии или без 10 мМ EDTA, pH 10. Протеолитическое расщепление анализировали, используя ЖХ/МС (таблица 8).

Таблица 8 Результат ЖХ/МС протеолитического расщепления Pro-CNP38
Образец		A210 Площадь пика	Концентрация белка (мг/мл)		Процент М.м. 4102	Процент М.м. 3115
1	H 55C	942	0,04	*	91,8	8,2
2	H 70 0	2878	0,11	*	79,2	20,7
3	H 70 6H	2675	0,10	*	80,6	19,4
4	H 70 24	2741	0,11	*	79,2	20,7
5	H 70 EDTA	2385	0,09	*	80,8	19,2
6	H 70 pH 10	1917	0,07	*	81,2	18,8
7	55C	1291	0,05		61,1	38,9
8	70C 0	4533	0,18		96,8	3,2
9	70C 6H	4120	0,16		97,5	2,5
10	70C 24	4108	0,16		96,5	3,5
11	70C EDTA	4336	0,17		96,9	3,1
12	70C pH10	3425	0,13		97,5	2,4

Во всех образцах (8-12), расщепленных при 70°C, наблюдали ограниченное протеолитическое расщепление (менее чем 4% расщепление Pro-CNP38). Почти 40% Pro-CNP38 было расщеплено протеазой, когда расщепление осуществляли при 55°C (образец 7). Щелочной pH и EDTA не влияли на неспецифичное протеолитическое расщепление. Высокая температура (120°C в течение 2 часов) приводила к неспецифичному расщеплению Pro-CNP38.

Следует отметить, что штамм BL21(DE3) от Stratagene не имел неидентифицированной протеазы.

Получение Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») и других вариантов CNP из разных конструкций:

Pro-CNP38 можно получить в большом масштабе в E. coli посредством сверхэкспрессии слитого белка TAF-Pro-CNP38 в виде телец включения с последующим расщеплением слитого белка муравьиной кислотой. Следуя способам, описанным в настоящей публикации, другие слитые белки TAF-CNP (TAF-CNP34 и TAF-Pro-CNP53) экспрессировали в виде телец включения и затем расщепляли муравьиной кислотой, чтобы получить варианты CNP: CNP34 и Pro-CNP53. На фигуре 6 изображена экспрессия TAF-CNP34, на фигуре 7 экспрессия TAF-Pro-CNP53, на фигуре 8 продукты расщепления муравьиной кислотой TAF-CNP34 и TAF-Pro-CNP53, на фигуре 9 пик CNP-34 на ЖХ/МС-хроматограмме, и на фигуре 10 пик Pro-CNP53 на ЖХ/МС-хроматограмме.

Использование муравьиной кислоты может приводить к неспецифичному расщеплению(ям) другой пептидной связи (связей), отличной от целевой связи Asp-Pro. Чтобы повысить чистоту и общий титр требуемого продукта расщепления муравьиной кислотой, разные остатки аспарагиновой кислоты в TAF12 или его фрагментах заменяли глутаминовой кислотой. Кроме того, один или несколько остатков цистеина в TAF12 или его фрагментах заменяли аланином, чтобы предотвратить неспецифичное образование дисульфидных связей. Все слитые белки TAF-Pro-CNP38, имеющие такие мутации в TAF12, были экспрессированы в виде телец включения и расщеплены муравьиной кислотой с получением Pro-CNP38. На фигуре 7 показана экспрессия TAF-NL-(C/A и 6D/6E)-Pro-CNP38 и TAF(C/A и 10D/10E)-Pro-CNP38, на фигуре 11 экспрессия TAF(C/A и 4D/4E)-Pro-CNP38 и TAF(4D/4E)-Pro-CNP38, на фигуре 12 продукты расщепления муравьиной кислотой TAF(4D/4E)-Pro-CNP38 и TAF(C/A и 4D/4E)-Pro-CNP38 и на фигуре 13 продукты расщепления муравьиной кислотой TAF-NL-(C/A и 6D/6E)-Pro-CNP38 и TAF(C/A и 10D/10E)-Pro-CNP38. В таблице 9 суммированы чистота (до очистки) и титр Pro-CNP38, полученного из различных конструкций TAF-Pro-CNP38.

Таблица 9
Конструкция	Чистота	Титр (мкг/мл)
pJexpress-TAF-Pro-CNP38	32%	44
pJexpress-TAF(C/A)-Pro-CNP38	41%	50
pJexpress-TAF(4D/4E)-Pro-CNP38	36%	52
pJexpress-TAF(C/A & 4D/4E)-Pro-CNP38	42%	58
pJexpress-TAF(C/A & 10D/10E)-Pro-CNP38*	32%	26
pJexpress-TAF-NL-(C/A & 6D/6E)-Pro-CNP38	50%	55
*Клетки с конструкцией pJexpress-TAF(C/A и 10D/10E)-Pro-CNP38 росли медленнее и конечная плотность клеток (OD600) была ниже по сравнению с другими конструкциями TAF-Pro-CNP38.

Крупномасштабное получение Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») посредством ферментации и расщепления муравьиной кислотой

Клетки BL21(DE3), содержащие конструкцию pJexpress-TAF-CNP, выращивали в ферментере объемом 10 литров при 37°C в течение примерно 16-17 часов вплоть до достижения OD₆₀₀ 64. Затем клетки выращивали/культивировали в присутствии 1 мМ IPTG примерно при 35-37°C, чтобы индуцировать экспрессию слитого белка TAF-Pro-CNP38, в течение примерно 7-8 часов вплоть до достижения OD₆₀₀ 160. Ферментация давала титр TAF-Pro-CNP38, составляющий 9 г/л. На фигуре 14 показан Вестерн-блот слитого белка TAF-Pro-CNP38, полученного при ферментации.

Осадок клеток, извлеченный из культуры клеток объемом 750 мл из объема ферментации 10 л, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере, pH 7,4 (PBS) и лизировали тремя проходами через гомогенизатор под давлением (10000 бар). Полученный лизат центрифугировали при 6500 g в течение 10 минут и надосадок отбрасывали. Фракцию осадка, содержащую тельца включения с нерастворимым слитым белком TAF-Pro-CNP38, ресуспендировали в 500 мл PBS, используя роторно-статорное устройство. Суспензию центрифугировали при 6500 g в течение 10 минут и надосадок отбрасывали. Полученный осадок телец включения ресуспендировали в 500 мл воды, используя роторно-статорное устройство, и инкубировали при 55°C в течение 30 минут. 250 мл 6% муравьиной кислоты добавляли к теплой суспензии телец включения до конечной концентрации муравьиной кислоты 2% и инкубировали при 55°C в течение 20-24 часов. Через 20-24 часа добавляли 50 мл 400 мМ Na₂HPO₄, чтобы начать нейтрализацию реакционной смеси для расщепления муравьиной кислотой, и полученную смесь титровали, используя 50% масс./об. NaOH до pH 6,9-7,4 и оставляли при комнатной температуре на 30 минут. После нейтрализации образовывался плотный преципитат, и его удаляли центрифугированием при 6500 g в течение 10 минут. Надосадок оставляли, и он содержал в среднем 1,3 г/л культуры Pro-CNP38 с чистотой 80%. Основная часть E. coli и TAF-родственных белков и пептидов оставались в осадке.

Растворимый Pro-CNP38, полученный в результате расщепления муравьиной кислотой и нейтрализации надосадка, имел чистоту 80% и содержал смесь линейных и циклизованных пептидов Pro-CNP38, наряду с другими родственными продукту примесями. Надосадок с нейтральным значением pH, содержащий Pro-CNP38, стерильно фильтровали. Дальнейшую очистку анионообменной хроматографии с использованием колонки Fractogel TMAE Hi-CAP (EMD Biosciences) для удаления ДНК, эндотоксинов и пептидных примесей, которые должны связываться с колонкой, осуществляли при pH 7-7,4. Элюируемая фракция содержала частично циклизованный Pro-CNP38. К элюируемой фракции добавляли сульфат меди до конечной концентрации 10 мкМ и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавление Cu⁺⁺ при нейтральном значении pH катализировало окисление свободных сульфгидрильных групп цистеина в пептиде с образованием внутримолекулярной дисульфидной связи, приводящее к 100% циклизованному Pro-CNP38 и отсутствию выявляемого линейного пептида. Проводимость раствора доводили до значения <15 мС/см добавлением воды. Затем осуществляли катионообменную хроматографию с использованием колонки с SP-сефарозой (GE Healthcare) и натрий-фосфатного буфера (pH 7), чтобы удалить ДНК и эндотоксины, оставшиеся в элюате и дополнительно очистить Pro-CNP38 до чистоты примерно 95-96% с неродственными продукту примесями в количестве <0,5%. На фигуре 15 показан SDS-ПААГ фракций, элюруемых с колонки с SP-сефарозой; наиболее высокие концентрации Pro-CNP38 обнаружены во фракциях 22-30. Анализ с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ/МС необъединенной фракции 24 показал наличие 90% Pro-CNP38, 5% Pro-CNP38 с окисленным остатком метионина, 3% Pro-CNP38, расщепленного по связи Gly-Cys с образованием CNP-17, и 1,6% Pro-CNP38, расщепленного по связи Asp-Arg в циклическом домене. Выход чистого пептида Pro-CNP38 после конечной очистки составлял 0,9 г/л культуры клеток (общее извлечение 36%).

Pro-CNP38, собранный после пяти отдельных очисток, объединяли, получая препарат. Объединенный продукт содержал 93,5% Pro-CNP38, 3,3% Pro-CNP38 с окисленным остатком метионина, 1,3% дезамидированного Pro-CNP38 и 1% Pro-CNP38, расщепленный по связи Gly-Cys с образованием CNP-17. Образцы разбавляли 50 мМ фосфатом натрия (pH 7) до проводимости 10 мС/см и нагружали на колонку с CM-сефарозой (GE-Healthcare) для концентрирования и обмена буфера. Слабое катионообменное свойство смолы CM-сефарозы обеспечивает возможность диссоциации пептидов с колонки с использованием слабокислых растворов, а не обычных градиентов соли. Концентрации кислоты, необходимые для диссоциации Pro-CNP38 с колонки, содержащей CM-сефарозу, зависело от загрузки колонки. В случае 50 мг Pro-CNP38 на мл смолы достаточно 10 мМ HCl для элюирования Pro-CNP38. В случае 9 мг Pro-CNP38 на мл смолы для элюирования требуется 50 мМ HCl. Когда загрузка составляла 9 мг Pro-CNP38 на мл смолы, Pro-CNP38 элюировали в менее чем одном объеме колонки, что приводило к значительному концентрированию пептида. Фракция элюата содержала 20,3 мг/мл Pro-CNP38 с чистотой 95%, наряду с 3% Pro-CNP38 с окисленным остатком метионина, 1% дезамидированного Pro-CNP38 и <1% Pro-CNP38, расщепленного по связи Gly-Cys с образованием CNP-17. Концентрированный раствор Pro-CNP38 в слабой кислоте является подходящим для разбавления в соответствующих буферах для получения либо жидких, либо лиофилизированных препаратов.

ПРИМЕР 3

Расщепление вариантов CNP нейтральной эндопептидазой in vitro

Чтобы определить влияние аминокислотных замен, аминокислотных удлинений, модификаций остова, модификаций боковых цепей и пегилирования на чувствительность вариантов CNP к расщеплению нейтральной эндопептидазой (NEP), осуществляли анализы расщепления, используя анализ in vitro, в котором наблюдали исчезновение нерасщепленного варианта CNP.

Рекомбинантную NEP человека (конечная концентрация 1 мкг/мл) добавляли к 100 мкМ варианта CNP, разбавленного в 0,1 М трис, pH 7. Реакционную смесь инкубировали при 37°C в течение различных периодов времени и реакцию гасили, используя EDTA (конечная концентрация 10 мМ), с последующей термической денатурацией. Реакционную смесь восстанавливали и затем продукты реакции анализировали, используя ВЭЖХ и масс-спектроскопию. Время полужизни варианта CNP вычисляли на основе исчезновения интактного варианта CNP с течением времени. Результаты для расщепленных вариантов CNP сравнивали с параллельно расщепляемым wtCNP22 и нормализовали по отношению к результатам, полученным для 100 мкМ CNP22, расщепленного с использованием 1 мг/мл NEP (t_1/2=80 минут).

В таблице 1 указаны времена полужизни, основанные на анализе расщепления под действием NEP in vitro, для различных вариантов CNP, имеющих модификации остова и боковых цепей. Удаление трех из шести сайтов расщепления NEP в аналоге L, тем не менее, приводило к значимо более короткому времени полужизни. Из тестированных вариантов CNP наибольшую резистентность к расщеплению NEP проявлял аналог N, который содержит D-энантиомеры всех 22 аминокислот CNP22, и аналог M, который имеет N-метилированную амидную связь у Leu9 и Leu11. Однако оба аналога N и M не могли стимулировать продукцию цГМФ (см. ниже).

При сравнении времени полужизни аналогов A, B, E, F, G и H друг с другом определено, что время полужизни аналогов E и G примерно в 1,5-2,5 раза более длительное, чем время полужизни у аналогов A, B, F и H. Все указанные шесть аналогов проявляли резистентность или повышенную резистентность к расщеплению связи Cys6-Phe7 по сравнению с wtCNP22 (данные не показаны). Порядок ранжирования резистентности аналогов к NEP в концентрации 1 мкг/мл на основе времени полужизни: аналог G (3-Cl-Phe) ≥ аналог E (D-Phe) > аналог H («бета-2 Phe»), аналог B (N-Me-Phe) и аналог F (t-Bu-Gly)=wtCNP22 > аналог A (Cys-CH₂-NH). Аналоги E и G имели примерно в 1,5 раза более длительное время полужизни по сравнению с wtCNP22. Кроме резистентности к расщеплению связи Cys6-Phe7 аналоги B, E, F, G и H также проявляли резистентность к расщеплению связи Gly8-Leu9 в присутствии 1 мкг/мл NEP (данные не показаны). Полученные результаты показывают, что варианты CNP, имеющие модификации остова или боковых цепей между Cys6 и Gly8, могут быть резистентными к расщеплению под действием NEP связи Cys6-Phe7 и/или связи Gly8-Leu9, но необязательно обладают повышенной общей резистентностью к NEP или более длительным временем полужизни, чем CNP22. Результаты, как видно, противоположны сообщениям в литературе о том, что NEP сначала расщепляет связь Cys6-Phe7 в CNP22, а затем в других местах.

Таблица 1
Аналог	Модификации остова и боковых цепей	цГМФ-ответ по сравнению с 1 мкМ CNP221	Расщепление NEP
	Натрийуретический пептид	10 нМ	1 мкМ	(t1/2, мин)
	CNP22 (SEQ ID NO: 1)	46±10	100±13	802
N	D-CNP22 (все D-аминокислоты) (SEQ ID NO: 115)	2	1	>>160
A	CNP22, C6-CH2-NH (восстановленный карбонил) (SEQ ID NO: 56)	6	66	55
B	CNP22, N-метил-F7 (метилированный амид) (SEQ ID NO: 57)	2	38	80
BD	CNP22, N-метил-L9 (SEQ ID NO: 116)	2	8	НО
BN	CNP22, N-метил-L11 (SEQ ID NO: 117)	10	51	НО
BE	CNP22, N-метил-L20 (SEQ ID NO: 118)	2	5	НО
M	CNP22, N-метил-L9, N-метил-L11 (SEQ ID NO: 94)	1	11	>>160
K	CNP22, N-метил-L9, N-метил-L20 (SEQ ID NO: 92)	1	1	80
L	CNP22, N-метил-L9, N-метил-L11, N-метил-L20 (SEQ ID NO: 93)	18	10	30
J	CNP22, C6-CH2-NH, N-метил-L9, N-метил-L20 (SEQ ID NO: 91)	НО	НО	50

E	CNP22, D-F7 (D-Phe) (SEQ ID NO: 136)	2	6	130
H	CNP22, бета-2-F7 (3-амино-2-фенилпропионил) (SEQ ID NO: 57)	2	2	80
G	CNP22, 3-хлор-F7 (SEQ ID NO: 137)	17	93	135
F	CNP22, трет-бутил-G8 (SEQ ID NO: 58)	2	18	80
V	CNP22, K4G, 3,4-дихлор-F7 (SEQ ID NO: 119)	НО	НО	68
X	CNP22, K4G, 3-метил-F7 (SEQ ID NO: 120)	НО	НО	68
	ANP	10	23	НО
1 Стимуляция продукции цГМФ в клетках NIH3T3 натрийуретическим пептидом по сравнению с продукцией цГМФ в присутствии 1 мкМ CNP22; 2 t1/2 для резистентности CNP22 к NEP в среднем составляло 80 минут. Вследствие вариаций каталитической активности NEP в разных экспериментах все t1/2 для расщеплений CNP22 нормализовали по отношению к 80 минутам и разностное отношение использовали для расчета t1/2 аналогов в каждом эксперименте, чтобы получить скорректированное значение t1/2. НО = не определяли.

В таблице 2 указаны времена полужизни, основанные на анализе расщепления NEP in vitro, различных вариантов CNP, имеющих замены природными и/или неприродными аминокислотами. Из тестированных вариантов наибольшую резистентность к расщеплению NEP проявлял аналог BK, который имеет замены K4R и G15S, и аналог BJ, который имеет замены K4R и G15N.

Таблица 2

Аналог	Модификации остова и боковых цепей	цГМФ-ответ по сравнению с 1 мкМ CNP221	Расщепление NEP
	Натрийуретический пептид	10 нМ	1 мкМ	(t1/2, мин)
	CNP22 (SEQ ID NO: 1)	46±10	100±13	80
AH	CNP22, K4R (SEQ ID NO: 35)	59	121	80
BP	CNP22, K4R, G5S (SEQ ID NO: 121)	45	НО	НО
BO	CNP22, K4R, G5R (SEQ ID NO: 122)	18	80	НО
P	CNP22, K4G (SEQ ID NO: 123)	НО	НО	68
Z	CNP22, K4R, F7Y (SEQ ID NO: 95)	2	18	НО
AB	CNP22, K4R, G8S (SEQ ID NO: 97)	26±26	86±17	НО
AA	CNP22, K4R, G8V (SEQ ID NO: 96)	3	25	НО
AC	CNP22, K4R, G8T (SEQ ID NO: 98)	11±2	66±16	80
AD	CNP22, K4R, L9T (SEQ ID NO: 99)	4	68	НО
BH	CNP22, K4R, K10R (SEQ ID NO: 112)	12	80	НО
BF	CNP22, K4R, K10Cit (SEQ ID NO: 110)	6	33	НО
BG	CNP22, K4R, K10Q (SEQ ID NO: 111)	9	45	НО
BY	CNP22, K4R, K10S (SEQ ID NO: 124)	16	53	НО
BK	CNP22, K4R, G15S (SEQ ID NO: 114)	13±1	71±11	≥160
BJ	CNP22, K4R, G15N (SEQ ID NO: 113)	4	41	150
AE	CNP22, K4R, G15R (SEQ ID NO: 100)	0,3	0,3	НО
AF	CNP22, K4R, G15Cit (SEQ ID NO: 101)	1,4	2	НО

BZ	CNP22, K4R, S16Q (SEQ ID NO: 125)	42	116	НО
BX	CNP22, K4R, M17N (SEQ ID NO: 126)	40±2	103±17	НО
AG	CNP22, K4R, M17V (SEQ ID NO: 102)	10	65	НО
BQ	CNP22, K4R, G19S (SEQ ID NO: 127)	21	63	НО
BR	CNP22, K4R, G19R (SEQ ID NO: 128)	22±6	84±10	НО
AJ	CNP22, K4R, L20V (SEQ ID NO: 103)	0,2	8	НО
AK	CNP22, K4R, L20t-бутил-Ala (SEQ ID NO: 104)	1	21	НО
AT	CNP22, G1E, K4E (SEQ ID NO: 105)	11	54	60
BS	CNP22, K4R, L20R (SEQ ID NO: 129)	11	8	НО
BT	CNP22, K4R, G21S (SEQ ID NO: 130)	7	39	НО
BU	CNP22, K4R, G21T (SEQ ID NO: 131)	6	21	НО
BW	CNP22, K4R, G21R (SEQ ID NO: 132)	20	21	НО
	ANP	10	23	НО
1 Стимуляция продукции цГМФ в клетках NIH3T3 натрийуретическим пептидом по сравнению с продукцией цГМФ в присутствии 1 мкМ CNP22; 2 t1/2 для резистентности CNP22 к NEP в среднем составляло 80 минут. Вследствие вариаций каталитической активности NEP в разных экспериментах все t1/2 для расщеплений CNP22 нормализовали по отношению к 80 минутам и разностное отношение использовали для расчета t1/2 аналогов в каждом эксперименте, чтобы получить скорректированное значение t1/2. НО = не определяли.

В таблице 3 указаны времена полужизни, основанные на анализе расщепления NEP in vitro, вариантов CNP, имеющих N-концевые и/или C-концевые модификации, включая аминокислотные удлинения. Из тестированных аналогов аналоги AZ, CC, CF, BL, CS, CK и CL, Pro-Gly-CNP37 и HSA-CNP27 были наиболее резистентными к расщеплению под действием NEP.

Таблица 3
Аналог	Модификации остова и боковых цепей	цГМФ-ответ по сравнению с 1 мкМ CNP221	Расщепление NEP
	Натрийуретический пептид	10 нМ	1 мкМ	(t1/2, мин)
	CNP22	46±10	100±13	80
BC	Пентановая кислота (N-концевая)-CNP22, G1E (SEQ ID NO: 109)	НО	НО	НО
BB	Гептановая кислота (N-концевая)-CNP22, G1E (SEQ ID NO: 108)	32±4	84±19	45-65
AV	Пентановая кислота (N-концевая)-CNP22, G1E, K4E (SEQ ID NO: 106)	НО	НО	120
AW	Гептановая кислота (N-концевая)-CNP22, G1E, K4E (SEQ ID NO: 107)	НО	НО	<20
AX	CNP17 (дельта N-концевая) (SEQ ID NO: 2)	18	69	НО
	R-CNP22 (SEQ ID NO: 40)	НО	НО	НО
AZ	R-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 41)	54±11	106±15	≥160
	ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38)	НО	НО	НО
BA	ER-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 39)	38±10	113±10	90
	GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 65)	НО	НО	НО
AY	GANRR-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 36)	59±9	105±20	65
	GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 64)	НО	НО	НО
CH	GANQQ-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 69)	44±8	95±11	НО

	GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 66)	НО	НО	НО
CI	GANPR-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 37)	50±1	105±12	НО
	GANSS-CNP22 (SEQ ID NO: 67)	НО	НО	НО
CG	GANSS-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 70)	27±1	88±1	95
CA	AAWARLLQEHPNA-CNP22 (SEQ ID NO: 61)	24	76	НО
CB	AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (SEQ ID NO: 62)	36	84	НО
CC	DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (SEQ ID NO: 63)	34	101	>160
CF	GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (фрагмент IgG1(Fc)) (SEQ ID NO: 79)	23±9	72±19	>160
	PNARKYKGANKK-CNP22 (CNP34)	НО	НО	НО
BL	QEHPNARKYKGANKK-CNP22 (CNP37) (SEQ ID NO: 60)	43±15	97±27	>>160
	PQEHPNARKYKGANKK-CNP22 (Pro-CNP37)	НО	НО	НО
CE	GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (фрагмент HSA) (SEQ ID NO: 81)	15	87	НО
CY	GQHKDDNPNLPRGANPR-CNP22 (фрагмент HSA) (SEQ ID NO: 80)	НО	НО	НО
CQ	GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (фрагмент HRGP) (SEQ ID NO: 76)	16	95	НО
CX	GHHSHEQHPHGANPR-CNP22 (фрагмент HRGP) (SEQ ID NO: 78)	НО	НО	НО
CS	GQEHPNARKYKGANPK-CNP22 (модифицированный CNP37) (SEQ ID NO: 129)	19	61	>>160

CT	GQEHPNARKYKGANQK-CNP22 (модифицированный CNP37) (SEQ ID NO: 130)	60	121	НО
CU	GQEHPNARKYKGANQQ-CNP22 (модифицированный CNP37) (SEQ ID NO: 131)	9	57	НО
DB	GQEHPNARKYKGANKK-CNP22 (Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 75)	50±14	98±17	>> 160
	PGQEHPNARKYKGANKK-CNP22 (Pro-Gly-CNP37)	49±6	103±17	>>160
CW	GQEHPNARKYKGANKP-CNP22 (модифицированный CNP37) (SEQ ID NO: 74)	НО	НО	НО
CR	GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (фрагмент HRGP) (SEQ ID NO: 128)	14±5	77±12	НО
CZ	FGIPMDRIGRNPR-CNP22 («NRP-C-ингибитор» остеокрин) (SEQ ID NO: 82)	НО	НО	НО
DA	GKRTGQYKLGSKTGPGPK-CNP22 (фрагмент «гепарин-связывающего домена» FGF2) (SEQ ID NO: 83)	НО	НО	НО
CK	GQPREPQVYTGANQQ-CNP22, K4R (фрагмент IgG1(Fc)) (SEQ ID NO: 84)	2	32	≥160
CL	GVPQVSTSTGANQQ-CNP22, K4R (фрагмент HSA) (SEQ ID NO: 85)	3	35	>160
	GHKSEVAHRFKGANKK-CNP22 (HSA-CNP27) (SEQ ID NO: 144)	51±9	109±15	>>160
	PGHKSEVAHRFKGANKK-CNP22 (Pro-HSA-CNP27)	32	107	НО
CN	GQTHSSGTQSGANQQ-CNP22, K4R (фибриноген) (SEQ ID NO: 87)	12	115	НО

CM	GQPSSSSQSTGANQQ-CNP22, K4R (фибронектин) (SEQ ID NO: 86)	НО	НО	НО
CO	GSTGQWHSESGANQQ-CNP22, K4R (фибриноген) (SEQ ID NO: 88)	2	33	НО
CP	GSSSSSSSSSGANQQ-CNP22, K4R (цинковый палец) (SEQ ID NO: 89)	НО	НО	НО
CD	SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH («хвосты BNP») (SEQ ID NO: 68)	25	102	НО
CJ	RSSCFGGRIDRIGAC (“C-ANP4-23”, полученный из ANP) (SEQ ID NO: 133)	НО	НО	НО
	CNP22, K4R, K10R, Димер N-конец - N-конец/дисукцинимидилглутарат (SEQ ID NO: 134)	19	44	НО
	CNP22, K4R, K10R, Димер N-конец - N-конец/Бис-ПЭО5 (SEQ ID NO: 135)	19	41	НО
BM	CNP53 (SEQ ID NO: 4)	61	101	>>160
	ANP	10	23	НО
1 Стимуляция продукции цГМФ в клетках NIH3T3 натрийуретическим пептидом по сравнению с продукцией цГМФ в присутствии 1 мкМ CNP22; 2 t1/2 для резистентности CNP22 к NEP в среднем составляло 80 минут. Вследствие вариаций каталитической активности NEP в разных экспериментах все t1/2 для расщеплений CNP22 нормализовали по отношению к 80 минутам и разностное отношение использовали для расчета t1/2 аналогов в каждом эксперименте, чтобы получить скорректированное значение t1/2. НО = не определяли.

В таблице 4 указаны времена полужизни, основанные на анализе расщепления NEP in vitro, вариантов CNP, конъюгированных с полимерами ПЭГ (или ПЭО) на N-конце. Все тестированные и показанные в таблице 4 пегилированные варианты CNP проявляли резистентность или повышенную резистентность к расщеплению под действием NEP, за исключением ПЭО12-GANPR-CNP22(K4R), который имел такое же время полужизни, как wtCNP22. N-концевое пегилирование CNP22, имеющего замену K4G, по-видимому не обеспечивало значимого повышения резистентности к NEP. Например, ПЭГ2К-CNP22(K4G) был только слегка более резистентным к расщеплению NEP, чем CNP22 (данные не показаны), тогда как ПЭГ2К-CNP22 имел намного более длительное время полужизни in vitro, чем CNP22.

Таблица 4
N-концевое пегилирование	цГМФ-ответ по сравнению с 1 мкМ CNP221	Расщепление NEP
Натрийуретический пептид	ПЭГ	10 нМ	1 мкМ	(t1/2, мин)
CNP22		46±10	100±13	80
CNP22	ПЭГ20К	0	15	>>160
CNP22	ПЭГ5К	8±1	20±7	>>160
CNP22	ПЭГ2К	6±2	32±4	>>160
CNP22	ПЭО4-(ПЭО12)3 (разветвленный)	17±1	52±6	>>160
CNP22	ПЭО24 (1,2 кДа)	8±5	46±10	>>160
CNP22	ПЭГ1К	15±3	68±17	>160
CNP22	ПЭО12 (0,6 кДа)	12±7	57±18	160
CNP22	(ПЭО12)-биотин	19	81	140
CNP22, K4G	(ПЭО12)-биотин	10	27	100
CNP22, K4R	ПЭО24	15	56	НО
CNP22, K4R	ПЭО12	13	44	НО
CNP-17	ПЭГ2К	5	50	>160
R-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 41)	ПЭО24	15±2	75±12	НО
R-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 41)	ПЭО12	23±2	93±19	≥160
ER-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 39)	ПЭО24	6±2	60±10	НО

ER-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 39)	ПЭО12	20±1	92±25	НО
GANRR-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 36)	ПЭГ2К	15±2	45±18	НО
GANRR-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 36)	ПЭО24	28±9	82±18	>>160
GANRR-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 36)	ПЭГ1К	15±0,4	56±23	>160
GANRR-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 36)	ПЭО12	40±2	99±13	>160
GANQQ-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 69)	ПЭО24	16±13	73±30	НО
GANQQ-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 69)	ПЭО12	30	78	НО
GANPR-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 37)	ПЭО24	НО	НО	НО
GANPR-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 37)	ПЭО12	НО	НО	80
GANSS-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 70)	ПЭО24	8±5	46±21	НО
GANSS-CNP22, K4R (SEQ ID NO: 70)	ПЭО12	8±0,3	52±13	НО
1 Стимуляция продукции цГМФ в клетках NIH3T3 натрийуретическим пептидом по сравнению с продукцией цГМФ в присутствии 1 мкМ CNP22; 2 t1/2 для резистентности CNP22 к NEP в среднем составляло 80 минут. Вследствие вариаций каталитической активности NEP в разных экспериментах все t1/2 для расщеплений CNP22 нормализовали по отношению к 80 минутам и разностное отношение использовали для расчета t1/2 аналогов в каждом эксперименте, чтобы получить скорректированное значение t1/2. НО = не определяли.

На фигуре 16 показан профиль резистентности к NEP пяти N-концевых пегилированных конъюгатов CNP22. Пептиды CNP22, конъюгированные с полимерами ПЭГ (или ПЭО) с возрастающей массой, проявляли повышенную резистентность к расщеплению NEP. В частности, ПЭО24-CNP22, ПЭГ2К-CNP22 и ПЭГ5К-CNP22 были резистентными к расщеплению под действием NEP в ходе анализа, проводимого в течение периода времени, составляющего 160 минут.

На фигуре 17 показан профиль резистентности к NEP вариантов CNP: CNP37 (аналог BL), CNP53 и GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), имеющих N-концевое аминокислотное удлинение. Как ясно видно, оба пептида CNP37 и CNP53 были резистентными к расщеплению под действием NEP в таком анализе in vitro, тогда как GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) имел такую же лабильность к гидролизу под действием NEP, как и CNP22.

На фигуре 18 изображен профиль резистентности к NEP пептидов CNP 17 и GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), конъюгированных с остатком ПЭГ (или ПЭО) на N-конце. Пегилирование GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) значительно повышало резистентность к NEP такого варианта CNP, при этом ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) был полностью резистентным к расщеплению под действием NEP на протяжении всего периода анализа, продолжавшегося 160 минут. Увеличение массы остатка ПЭО примерно от 0,6 кДа (ПЭО12) до примерно 1,2 кДа (ПЭО24) повышало резистентность к NEP пегилированного GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36). Пегилирование GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) монодисперсным остатком ПЭО24, но не полидисперсным остатком ПЭГ1К, также повышало резистентность к NEP. Наконец, хотя и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) и ПЭГ2К-CNP17 имеют сходную общую массу (имея в виде, что ПЭГ2К является полидисперсным), первый проявлял значительно более высокую резистентность к NEP.

Анализы резистентности к NEP также осуществляли на wtCNP22 и вариантах CNP G-CNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 («CNP27-HSA», SEQ ID NO: 144) и ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО12») (SEQ ID NO: 36). На фигуре 19 показано, что G-CNP37 и CNP27-HSA были полностью резистентными к расщеплению NEP, и CNP27-ПЭО12 проявлял намного большую стабильность к расщеплению под действием NEP по сравнению с wtCNP22.

ПРИМЕР 4

Стимуляция вариантами CNP продукции цГМФ в клетках NIH3T3

Чтобы определить функциональную активность вариантов CNP, продукцию цГМФ измеряли в клетках NIH3T3, подвергнутых воздействию вариантов CNP. Мышиные клетки NIH3T3 эндогенно экспрессируют рецептор передачи сигнала CNP, NPR-B, который имеет 98% идентичность последовательности белка с последовательностью NPR-B человека. Клетки NIH3T3 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка и антибиотиков при 37°C с 5% CO₂. За 24-48 часов до передачи сигнала клетки высевали в 12-луночные планшеты при плотности 2-5×10⁵ клеток на лунку на момент анализа. Варианты CNP ресуспендировали в 1 мМ HCl до исходной концентрация 1 мг/мл (455 мкМ в случае wtCNP22) и затем разбавляли до получения 30 мкМ рабочего раствора фосфатно-солевым буфером (PBS). Готовили десятикратные серийные разведения в фосфатно-солевом буфере. Культуральную среду удаляли из клеток и заменяли 0,4 мл смесью PBS/модифицированная Дульбекко среда Игла (50/50, об./об.), содержащей 0,75 мМ изобутилметилксанина. Планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 15 минут перед добавлением 0,2 мл варианта CNP в PBS и продолжали инкубацию при 37°C в течение 15 минут. Реакции останавливали добавлением 0,2 мл лизирующего буфера, дополненного содержимым набора для анализа цГМФ CatchPoint (Molecular Devices), и продукцию цГМФ определяли с помощью анализа цГМФ CatchPoint (Molecular Devices). Все эксперименты по стимуляции проводили в двух повторах.

В таблицах 1-4 суммированы данные о способности вариантов CNP, имеющих модификации остова и боковых цепей, аминокислотные замены, N-концевые аминокислотные удлинения и/или N-концевое пегилирование, соответственно, стимулировать продукцию цГМФ в клетках NIH3T3. Во всех четырех таблицах значения продукции цГМФ в клетках NIH3T3, на которые воздействовали 10 нМ или 1 мкМ варианта CNP, нормализовали в отношении количества клеток и продукции цГМФ в присутствии 1 мкМ wtCNP22.

Что касается результатов, представленных в таблице 1, то только аналог G, имеющий 3-Cl-Phe в положении 7, проявлял по существу такую же активность в стимуляции NPR-B в концентрации 1 мкМ, как и wtCNP22. Что касается таблицы 2, то различные варианты CNP с аминокислотными заменами, включая аналоги AH, BO, AB, BH, BZ, BX и BR, проявляли активность в стимуляции NPR-B по существу сходную с активностью wtCNP22.

Что касается результатов, представленных в таблице 3, то многие варианты CNP, имеющие N-концевые и/или C-концевые модификации, включая аминокислотные удлинения, проявляли активность в стимуляции NPR-B, сравнимую с активностью wtCNP22. Функциональные варианты CNP включают аналог BB, который представляет собой CNP22(G1E), связанный с гептановой кислотой на N-конце, и аналог CD, который представляет собой циклический домен CNP22 («CNP17», сохраняющий последовательность Cys6-Cys22), конъюгированный с N-концевым и C-концевым «хвостами» BNP. Фигура 20 иллюстрирует, что GANRR-CNP22(K4R), CNP37 (SEQ ID NO: 36) (аналог BL) и CNP53 имели активность в стимуляции NPR-B, сходную с активностью wtCNP22, в анализе in vitro.

Из таблицы 3 видно, что среди вариантов CNP, анализируемых как в отношении функциональности CNP, так и в отношении резистентности к NEP, аналог AZ (R-CNP22(K4R)), аналог CC, аналог CF, аналог BL (CNP37), аналог DB (Gly-CNP37) и GHKSEVAHRFK-CNP27 (HSA-CNP27) (SEQ ID NO: 144) имели активность в стимуляции NPR-B, по существу сходную с активностью CNP22, при этом они были в значительной степени более резистентными к расщеплению под действием NEP, чем CNP22.

Что касается результатов, представленных в таблице 4, то девять пегилированных на N-конце вариантов CNP в концентрации 1 мкМ стимулировали продукцию цГМФ на уровне, составляющем по меньшей мере примерно 70% от уровня, достигаемого с использованием wtCNP22. В таблице 4 видны несколько заслуживающих внимания аспектов. Во-первых, N-концевое пегилирование GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) монодисперсным полимером ПЭО (ПЭО12 имеет массу примерно 0,6 кДа, ПЭО24 - примерно 1,2 кДа) приводило к улучшенной функциональности NPR-B, чем в случае полидисперсного полимера ПЭГ (ПЭГ1К имеет среднечисловую молекулярную массу (M_n) около 1 кДа, ПЭГ2К около 2 кДа) (см. также фигуру 21). Во-вторых, N-концевое пегилирование wtCNP22 полидисперсным полимером ПЭГ с возрастающими M_n (ПЭГ1К, ПЭГ2К, ПЭГ5К и ПЭГ20К) или монодисперсным полимером ПЭО с более высокой массой (ПЭО 12 и ПЭО24) соответственно снижало способность к активации NPR-B вариантов CNP (см. также фигуру 22). В-третьих, ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), имеющий N-концевое удлинение GANRR (SEQ ID NO: 8), стимулировал более высокую продукцию цГМФ, чем ПЭО24-CNP22 и ПЭО24-CNP22(K4R). Также заслуживает внимания, что среди пегилированных на N-конце вариантов CNP, анализируемых в отношении как функциональности CNP, так и резистентности к NEP, ПЭО12-R-CNP22(K4R), ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) имели активность в стимуляции NPR-B, по существу сходную с активностью CNP22, будучи при этом намного более резистентными к расщеплению под действием NEP, чем CNP22.

Среди вариантов CNP, перечисленных в таблицах 1-4 и анализируемых в отношении функциональности CNP и резистентности к NEP, аналоги G, BK, AZ, CC, CF, BL и DB, Pro-Gly-CNP37, HSA-CNP27 (GHKSEVAHRFK-CNP27) (SEQ ID NO: 144), ПЭГ1К-CNP22, (ПЭО12)-биотин-CNP22, ПЭО12-R-CNP22(K4R), ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) обладали активностью в стимуляции NPR-B, по существу сходной с активностью wtCNP22, будучи при этом намного более резистентными к расщеплению под действием NEP, чем wtCNP22.

Анализы продукции цГМФ также осуществляли с использованием wtCNP22 и вариантов CNP G-CNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 («CNP27-HSA», SEQ ID NO: 144), wtCNP29 и ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО12») (SEQ ID NO: 36). На фигуре 23 показано, что CNP22 и все анализируемые варианты CNP индуцировали сходные уровни продукции цГМФ как при низкой, так и при высокой дозе CNP.

ПРИМЕР 5

Специфичность связывания NPR-A, NPR-B и NPR-C

Анализ конкуренции в передаче сигнала

Чтобы определить специфичность связывания вариантов CNP с клиренс-рецептором NPR-C, осуществляли анализ конкуренции в передаче сигнала. Экспрессирующие плазмиды для NPR-B или NPR-C человека (приобретенные от OriGene) временно трансфицировали в клетки HEK293T и экспрессировали рецепторы. Через сорок часов после трансфекции клетки HEK293T с NPR-B, NPR-C и нативные клетки HEK293T собирали, подсчитывали и высевали в соотношении 1:1 (клетки NPR-B : конкурирующие клетки (либо NPR-C, либо нативные клетки HEK293T)) в 12-луночные или 96-луночные планшеты. Через двадцать часов после посева клетки подвергали анализу в отношении стимуляции NPR-B/цГМФ, описанному в примере 4. Предполагается, что в случае присутствия натрийуретический клиренс-рецептор, NPR-C, связывает и интернализует CNP, тем самым снижая общую концентрацию CNP, доступную для передачи сигнала через NPR-B, что приводит к снижению продукции цГМФ и сдвигу кривой зависимости «доза-ответ» вправо. Сдвиг вправо кривой зависимости «доза-ответ» был подтвержден для wtCNP22. Предполагается, что варианты CNP, обладающие пониженной аффинностью к NPR-C, не индуцируют сдвиг, или, как предполагается, индуцируют меньший сдвиг кривой зависимости «доза-ответ» вправо. Такой анализ конкуренции в передаче сигнала подобен анализу, ранее описанному Cunningham (патент США 5846932; B. Cunningham, EMBO J. 13(11): 2508-2515 (1994); H. Jin et al., J. Clin. Invest. 98(4): 969-976 (1996)).

Активность в стимуляции цГМФ wtCNP-22, Pro-Gly-wtCNP37 и ANP через NPR-B и NPR-A и их избирательность для NPR-B по сравнению с NPR-C и для NPR-A по сравнению с NPR-C оценивали в анализах конкуренции в передаче сигнала. NPR-A, NPR-B и NPR-C по отдельности временно трансфицировали в клетки HEK293T. Через тридцать часов после трансфекции клетки высевали в 96-луночные планшеты: (A) 20000 NPR-B-клеток + 20000 ложно трансфицированных клеток; (B) 20000 NPR-B-клеток + 20000 NPR-C-клеток; (C) 20000 NPR-A-клеток + 20000 ложно трансфицированных клеток; и (D) 20000 NPR-A-клеток + 20000 NPR-C-клеток. Через двадцать часов после посева культуральную среду удаляли и заменяли бессывороточной средой:PBS (1:1) + 0,75 мкМ IBMX на 15 минут. В случае передачи сигнала цГМФ через NPR-B добавляли серию доз ANP, CNP-22 и Pro-Gly-CNP37 и инкубировали при 37°C в течение 12 минут до остановки анализа посредством лизиса клеток. В случае передачи сигнала цГМФ через NPR-A серию доз CNP-22 и Pro-Gly-CNP37 инкубировали при 37°C в течение 12 минут, тогда как серию доз ANP инкубировали при 37°C в течение 6 минут (так как NPR-A, по-видимому, является «более быстрой» гуанилилциклазой, чем NPR-B, время инкубации в случае ANP укорачивали, чтобы не исчерпать все возможности (использовать весь клеточный ГТФ) слишком быстро при передаче сигнала с помощью ANP). На фигурах 24A и B показано, что CNP-22 и Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») стимулировали продукцию цГМФ через NPR-B со сходными кривыми зависимости доза-ответ и в намного большей степени, чем через NPR-A, и имели сходный профиль избирательности для NPR-B по сравнению с NPR-C в анализах конкурентной передачи сигнала.

Определение аффинностей связывания (K _i ) по отношению к NPR-A, NPR-B и NPR-C

Аффинности связывания (K_i) вариантов CNP с NPR-A, NPR-B и NPR-C определяли в анализе гетерологичного конкурентного связывания (патент США 5846932; B. Cunningham, EMBO J. 13(11): 2508-2515 (1994); H. Jin et al., J. Clin. Invest. 98(4): 969-976 (1996)). Мембраны из клеток HEK293 или другим соответствующим образом трансфицированной клеточной линии (например, клеток HeLa), экспрессирующей NPR-A, NPR-B или NPR-C человека, готовили для анализов связывания радиоактивно меченых лигандов. Препараты мембран разбавляли в соответствующем буфере и варьирующие концентрации wtCNP22 или варианта CNP (конкурента) добавляли вместе с I¹²⁵-меченым wtCNP22 (Bachem). Образцы инкубировали при комнатной температуре, чтобы обеспечить уравновешивание лиганд/рецептор, и связанный пептид отделяли от свободного пептида фильтрованием через мембранные фильтры PVDF. Фильтры промывали, затем добавляли сцинтиллятор и подсчитывали в сцинтилляционном счетчике. Связывание измеряли в двух повторах для каждой концентрации конкурирующего пептида. Аффинность вариантов CNP (K_i, равновесная константа диссоциации) и B_max (количество рецептора) вычисляли в анализе нелинейной регрессии и/или используя уравнение Ченга-Прусоффа.

Варианты CNP, имеющие пониженную аффинность к NPR-C, как ожидается, имеют пониженную чувствительность к клиренсу посредством NPR-C и, следовательно, более длительное время полужизни в плазме или сыворотке. Увеличенное время полужизни вариантов CNP в циркуляции может повышать доступность вариантов для проявления терапевтической активности.

ПРИМЕР 6

Влияние вариантов CNP на рост клеток хондросаркомы крыс (RCS) и продукцию цГМФ в клетках RCS

Чтобы оценить способность вариантов CNP стимулировать рост кости, имитировали скелетную дисплазию в культуре клеток обработкой клеток хондросаркомы крыс (RCS) фактором роста фибробластов 2 (FGF-2), который активирует рецептор фактора роста фибробластов 3 (FGFR-3) и индуцирует задержку роста (Krejci et al., J. Cell Sci., 118(21): 5089-5100 (2005)).

Оптимальные параметры обработки CNP определяли, варьируя концентрацию CNP (0,05, 0,1, 0,2 и 0,5 мкМ) и продолжительность и интервалы обработки (непрерывно; 2,5 минуты, 10 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа и 8 часов один раз в сутки; 2,5 минуты, 10 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа и 4 часа дважды в сутки). Через 72 часа клетки подсчитывали, используя автоматизированный счетчик клеток, и количество внеклеточного матрикса оценивали, используя окрашивание альциановым синим.

Затем клетки RCS обрабатывали вариантом CNP, используя оптимальные условия, определенные в экспериментах по оценке роста с использованием wtCNP22. Концентрацию цГМФ измеряли в конкурентном ELISA для необработанных клеток RCS, клеток RCS, обработанных CNP, и клеток RCS, обработанных вариантом CNP. Рост клеток и синтез матрикса в результате обработки вариантом CNP также контролировали и сравнивали с ростом клеток и синтезом матрикса в результате обработки CNP.

Чтобы оценить влияние вариантов CNP в системе культивирования клеток человека, первичные повторно дифференцированные хондроциты человека в альгинатных шариках обрабатывали wtCNP22 и вариантами CNP и концентрацию цГМФ определяли в конкурентном ELISA как меру эффективной передачи сигнала CNP.

Способы, описанные в настоящей публикации, могут быть применены для оценки способности вариантов CNP стимулировать продукцию цГМФ и рост клеток хондросаркомы крыс in vitro.

ПРИМЕР 7

Исследование зависимости доза-ответ в клетках хондросаркомы крыс

Тирозинкиназный рецептор, рецептор фактора роста фибробластов 3 (FGFR-3), негативный регулятор роста хондроцитов, является конститутивным у субъектов с ахондроплазией. Стимуляция рецептора FGFR-3 с использованием FGF-2 вызывает задержку роста посредством пролонгированной активации Erk MAPK и вызывает снижение синтеза матрикса и утрату матрикса, а также изменение формы клеток. Непрерывное воздействие на клетки хондросаркомы крыс (RCS) фактором роста фибробластов 2 (FGF-2) имитирует ахондроплазию в культуре клеток за счет активации FGFR-3 и индукции задержки роста (Krejci et al., J. Cell Sci., 118(21): 5089-5100 (2005)). Чтобы определить дозу варианта CNP и частоту дозирования, которые стимулируют достаточный рост костных клеток, осуществляли исследование зависимости доза-ответ, используя анализ клеток RCS, который описан в примере 6.

Клетки RCS высевали при плотности 10×10³ клеток на лунку в 24-луночные планшеты, выращивали в течение 24 часов, обрабатывали в течение 72 часов и затем подсчитывали. Клетки RCS подвергали непрерывному воздействию FGF-2 (5 нг/мл), чтобы имитировать конститутивно активный FGFR-3, который индуцировал задержку клеточного роста (см. столбик №5 на фигуре 25). CNP22 дикого типа (0,2 мкМ) присутствовал в культуре непрерывно (72 часа), 1 час ежедневно или 2 часа ежедневно. Все стимуляторы меняли ежедневно. Непрерывное воздействие на клетки RCS 0,2 мкМ CNP22 в присутствии 5,0 нг/мл FGF-2 частично отменяло индуцированную FGF-2 задержку роста, приводя к росту приблизительно 200×10³ клеток на лунку (столбик №6 на фигуре 25), по сравнению с приблизительно 100×10³ клетками на лунку в отсутствие CNP22 (столбик №5 на фигуре 25).

И 1-часовая экспозиция с CNP22 (0,2 мкМ) один раз в сутки, и 2-часовая экспозиция с CNP22 (0,2 мкМ) один раз в сутки достигала примерно 84% эффекта непрерывной экспозиции с CNP22 (0,2 мкМ) на рост хондроцитов (столбики № 7 и 8 на фигуре 25). Полученные результаты свидетельствуют, что непрерывное воздействие на задержанные в росте хондроциты пептидом CNP22 не требуется для отмены задержки клеточного роста. Кроме того, исследования зависимости доза-ответ показывают, что более низкие дозы CNP22 способны отменять задержку роста (фигура 26A).

Кроме того, гистологический анализ и клеточный морфологический анализ внеклеточного матрикса показали, что обработка CNP22 оказывала антагонистическое действие на опосредованную FGF-2 потерю внеклеточного матрикса в случае хондросаркомы и повышала синтез матрикса. Воздействие FGF-2 уменьшало синтез матрикса и увеличивало деградацию, в то время как добавление CNP22 к культуре клеток с FGF-2 увеличивало синтез матрикса и частично ингибировало FGF-2, как было оценено по включению ³⁵S-сульфата и ³H-Pro в матрикс или убыванию из матрикса (фигуры 27A-D). Анализ продукции аггрекана и фибронектина (мРНК и белка) в клетках RCS, культивируемых с FGF-2 и CNP22, показывает, что FGF-2 снижал уровень аггрекана и увеличивал уровень фибронектина, который был ингибирован добавлением CNP22 (фигуры 28A-C). FGF-2 индуцирует и активирует молекулы процессинга матрикса преимущественно через Erk, и добавление CNP22 оказывает некоторое влияние на такую активацию.

Дополнительные высокопроизводительные анализы для измерения задержки роста, такие как окрашивание кристаллическим фиолетовым, применимы для измерения влияния CNP22 и его вариантов на клетки RCS.

Подобные исследования зависимости доза-ответ могут быть проведены с использованием вариантов CNP, описанных в настоящей публикации, чтобы определить эффективную дозу таких вариантов для отмены FGF2-индуцированной задержки роста клеток RCS.

ПРИМЕР 8A

Стимуляция ex vivo роста большеберцовой кости и бедренной кости мышей с умеренной ахондроплазией

Модель на основе органной культуры большеберцовой кости мыши использовали для того, чтобы продемонстрировать эффективность CNP22 дикого типа в стимуляции продольного роста кости. Обработка большеберцовых костей дикого типа пептидом CNP22 в концентрации 10^-8, 10^-7 или 10^-6 М в течение 6 дней увеличивала продольный рост на 31%, 40% и 42%, соответственно. Гистологическая оценка также показала расширение зоны гипертрофии, например, увеличение количества и размера гипертрофических хондроцитов в ростовой пластинке (Agoston et al., BMC Dev. Biol. 7: 18 (2007)). Сходные результаты наблюдали в большеберцовых костях, выделенных из мышей FGFR3^Ach (Yasoda et al., Nat. Med. 10: 80-86 (2004)).

Чтобы определить эффективность вариантов CNP в стимуляции продольного роста костей, варианты CNP тестировали в основанной на культуре органов мыши модели роста эндохондральных костей у мышей дикого типа и трансгенных мышей, имеющих мутацию G380R в гене FGFR-3 человека (гетерозигота FGFR3^wt/Ach), которая представляет собой мышиную модель умеренной ахондроплазии. Кратко, фармакологическую активность CNP22 дикого типа и вариантов CNP сравнивали в основанной на культуре органов модели большеберцовых костей эмбриональных или неонатальных мышей, выделенных из однопометных мышей дикого типа и FGFR3^wt/Ach. Оценивали общий рост костей и гистологические изменения в ростовой пластинке. Кондиционированную культуральную среду также оценивали в отношении биомаркеров внутриклеточной передачи сигналов (цГМФ), метаболизма хряща (коллаген типа II, другие коллагены, аггрекан-хондроитинсульфат), метаболизма кости (щелочная фосфатаза кости, остеокальцин, коллаген типа I [C-телопептид, N-телопептид]) и воспаления (интерлейкин-1, интерлейкин 6, интерлейкин-11).

Эффективные варианты CNP идентифицировали по их способности, например, стимулировать продукцию цГМФ и рост костей, который измеряли по увеличенной длине костей в продольном направлении и экспансии клеток в зону гипертрофии ростовой пластинки.

Измерение роста костей

Эффективность wtCNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) в стимуляции продольного роста бедренных костей оценивали в модели на основе культуры органов мыши. Для таких экспериментов бедренные кости выделяли из мышей дикого типа 2-3-дневного возраста и культивировали в альфа-MEM с добавлением 0,2% БСА, 0,5 мМ L-глутамина, 40 единиц пенициллина/мл и 40 мкг стрептомицина/мл в течение 8 дней в присутствии наполнителя, CNP22 или вариантов CNP. Обработку начинали в 0 день и затем повторяли каждые два дня в момент замены среды. Кости измеряли перед обработкой и впоследствии каждые два дня с использованием препаровальной лупы, оборудованной 1-сантиметровой окулярной сеткой. Кондиционированную среду использовали для анализа биомаркеров. На 8 день кости фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 24 часов, декальцинировали в 5% муравьиной кислоте в течение 24 часов, дегидратировали и заливали в парафин. Делали срезы костей толщиной 5 мкм (микрон), которые затем депарафинировали, регидратировали и красили альциановым синим в течение 30 минут (pH 2,5; MasterTech). Альциановый синий окрашивает хрящ в синий цвет. Окрашенные срезы визуализировали и фотографировали, используя микроскопию с высокой освещенностью. Толщину гипертрофической области хряща ростовой пластинки определяли при анализе изображений.

Фигура 29 иллюстрирует влияние wtCNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR- CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) на продольный рост бедренных костей мышей дикого типа 3-дневного возраста, обрабатываемых пептидами CNP каждые два дня. Результаты нормализовали по отношению к измерениям до обработки (0 день). Исследования осуществляли в трех повторах (наполнитель) или в четырех повторах (пептиды CNP). Как показано на фигуре 29, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), а также CNP22, были эффективными в стимуляции продольного роста бедренных костей, при этом наиболее эффективным был пегилированный на N-конце вариант CNP.

Также оценивали рост бедренных костей и большеберцовых костей мышей дикого типа и мышей FGFR3^ach в ответ на CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО24») (SEQ ID NO: 36). Культивирование большеберцовых костей либо мышей дикого типа, либо мышей с ахондроплазией (FGFR3^ach) показало, что CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) увеличивали продольный рост большеберцовой кости по сравнению с наполнителем или CNP22 (фигуры 30 и 31). CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) также стимулировали рост бедренной кости у мышей дикого типа (фигура 32). Кроме того, каждый из CNP22, ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) и CNP37 увеличивал продольный рост бедренной кости мышей FGFR3^ach по сравнению с наполнителем (фигура 33).

Кроме того, оценивали распределение ex vivo CNP37 в ростовой пластинке большеберцовой кости мышей FGFR3^ach. Образцы кости готовили, как описано выше. Делали парафиновые срезы и фиксировали нагреванием в течение 1 часа при 60°C. После извлечения антигенов 1% гиалуронидазой при 37°C (30 минут) осуществляли блокирование сывороткой в течение 1 часа (10% нормальная сыворотка козы). CNP22-антитело (разведение 1:500; Peninsula Laboratories Inc., San Carlos, California) наносили в течение ночи при 4°C. Для иммунодетекции использовали набор Vectastain ELITE ABC (Vector, Burlingame, California) согласно рекомендациям производителя. Специфично связанную пероксидазу визуализировали при инкубации с набором для субстрата DAB (Vector) и реакцию проявляли в течение 3 минут. Затем стекла дегидратировали и монтировали и фотографировали, используя микроскоп с высокой освещенностью. Окрашивание в отношении CNP в ростовой пластинке большеберцовой кости мыши FGFR3^ach показало, что иммунореактивность CNP увеличивалась в областях артикулярных и гипертрофических хондроцитов (фигура 34), свидетельствуя, что CNP37 был доставлен в хондроциты.

В дополнение к распределению вариантов CNP в ростовой пластинке кости также оценивали влияние ex vivo CNP37, CNP22 и наполнителя на клетки в ростовых пластинках FGFR3^ach и дикого типа, например, на размер гипертрофических клеток и клеточность зоны пролиферации. Готовили образцы кости, включая окрашивание альциановым синим, как описано выше. Изображения полной проксимальной ростовой пластинки получали при 4×-увеличении. Ростовую пластинку делили на три зоны, начиная со стороны эпифиза хряща: резервную зону (отдельные небольшие хондроциты), зону пролиферации (колонки уложенных в стопки хондроцитов, параллельные продольной оси кости), и зону гипертрофии (крупные хондроциты и тонкая прослойка между хондроцитами). Измерения в указанных областях осуществляли, используя компьютерную программу ImageJ, включая количество пролиферирующих хондроцитов на колонку и плотность гипертрофических хондроцитов. Тестируемый квадрат (4×4 мм²) в пяти разных областях зоны гипертрофии использовали для определения плотности гипертрофических хондроцитов. Клеточный размер гипертрофических хондроцитов вычисляли по 1 на определяемую плотность клеток. Клеточность пролиферирующих колонок увеличивалась под действием CNP37 и CNP22 как у мышей дикого типа, так и у мышей FGFR3^ach (фигуры 35B и C). Гипертрофия хондроцитов у мышей FGFR3^ach также возрастала в результате культивирования с CNP22 или CNP37 (фигуры 36B и C).

Исследования ex vivo культур мышиных костей показали, что CNP37 доставлялся в ростовую пластинку и был способен увеличивать клеточность и гипертрофию хондроцитов, которые ассоциированы с расширением ростовой пластинки и продольным ростом костей. Чтобы оценить биораспределение CNP37 в ростовой пластинке кости in vivo и влияние CNP37 in vivo на ростовую пластинку (включая общую толщину ростовой пластинки, толщину зоны гипертрофии и клеточность зоны пролиферации), получали образцы костей из мышей FGFR3^ach, обработанных наполнителем или CNP37, как описано выше. Для исследований биораспределения и эффектов in vivo большеберцовые кости фиксировали и хранили в 70% этаноле. Для иммуногистохимии образцы декальцинировали в 5% муравьиной кислоте в течение 2 дней, дегидратировали и заливали в парафин. Делали срезы костей толщиной 5 мкм (микрон), которые затем депарафинировали, регидратировали и использовали для иммуногистохимии CNP, как описано выше. Для анализа клеточных изображений делали срезы костей толщиной 5 мкм (микрон) и затем депарафинировали, регидратировали и красили альциановым синим в течение 30 минут (pH 2,5; MasterTech) и гематоксилином и эозином в течение 30 секунд. Окрашенные срезы визуализировали и фотографировали, используя микроскоп с высокой освещенностью. Толщину пластинки роста и зон пролиферации и гипертрофии измеряли с использованием компьютерной программы ImageJ.

Исследования биораспределения in vivo показали, что подобно исследованиям ex vivo иммунореактивность CNP увеличивалась в областях артикулярных и гипертрофических хондроцитов в ростовой пластинке большеберцовой кости мышей FGFR3^ach, обработанных CNP37, что свидетельствует о том, что CNP37 был доставлен in vivo в ростовую пластинку большеберцовой кости мыши FGFR3^ach (фигура 37). Кроме того, обработка CNP37 значимо увеличивала общую толщину ростовой пластинки, толщину зоны пролиферации и толщину зоны гипертрофии большеберцовой кости мыши FGFR3^ach in vivo (фигуры 38A-C).

Полученные результаты демонстрируют, что варианты CNP согласно изобретению проникают в ростовую пластинку животных дикого типа и животных с ахондроплазией, увеличивают количество и размер хондроцитов, увеличивают толщину зоны пролиферации и зоны гипертрофии ростовой пластинки и увеличивают продольный рост кости у обработанных животных дикого типа и животных с ахондроплазией. Следовательно, варианты CNP применимы для стимуляции роста костей у субъектов с ахондроплазией.

Измерение биомаркеров

В дополнение к измерению роста кости в ответ на варианты CNP анализ уровней биомаркеров образования и роста хряща и кости, индуцированных в ответ на варианты CNP, применим для оценки влияния вариантов CNP на рост кости.

Бедренные кости и большеберцовые кости выделяли из мышей дикого типа и мышей FGFR3^ach, как описано выше. Кости культивировали с CNP22 или его вариантом в течение восьми дней с заменой среды через каждые два дня. На восьмой день среду собирали и анализировали в отношении биомаркеров цГМФ (циклического гуанозин-3',5'-монофосфата) и фрагментов расщепленного коллагена типа II, специфичного для хряща маркера метаболизма хряща. Оба маркера измеряли с использованием коммерчески доступных твердофазных иммуноферментных анализов (ELISA) для цГМФ (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, Michigan) и расщепленного коллагена типа II (Cartilaps) (Immunodiagnostic Systems, Fountain Hills, Arizona), следуя протоколу производителя.

Уровни цГМФ и фрагментов коллагена типа II измеряли в экстрактах культур клеток после воздействия CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО24») (SEQ ID NO: 36). На фигурах 39-42 показано большое увеличение (p<0,01) уровней цГМФ в среде после воздействия на эксплантаты бедренных костей и большеберцовых костей мышей дикого типа и мышей FGFR3^ach пептидов CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36). Кроме того, экспозиция бедренных костей мышей дикого типа и мышей FGFR3^ach с CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) увеличивала уровни расщепленного коллагена типа II, при этом в случае обработанных бедренных костей мышей FGFR3^ach наблюдали значимо повышенные (p<0,05) уровни фрагментов коллагена типа II (фигура 43). Повышенные уровни фрагментов коллагена типа II свидетельствуют об обновлении матрикса хряща, и обновление хряща обычно предшествует образованию новой кости в растущих костях.

ПРИМЕР 8B

Стимуляция ex vivo роста бедренной кости мышей с тяжелой ахондроплазией

Влияние варианта CNP на рост костей мышей с тяжелой ахондроплазией оценивали ex vivo. В исследовании использовали трансгенных мышей, экспрессирующих ген FGFR-3 человека, имеющий мутацию Y367C (FGFR3^Y367C) [S. Pannier et al., Biochim. Biophys. Acta, 1792(2): 140-147 (2009)], который представляет собой мышиную модель тяжелой ахондроплазии. Бедренные кости выделяли в день эмбрионального развития 16,5 и культивировали в течение 6 дней в присутствии 1 мкМ Pro-Gly-CNP37. Длину костей измеряли в 1 день и 7 день. Затем кости заливали в парафин, делали срезы и красили гематоксилином и эозином, чтобы оценить гистологические изменения и морфологию клеток. Обработка эксплантатов костей, выделенных из мышей FGFR3^Y367C, пептидом Pro-Gly-CNP37 («ProCNP38») приводила к увеличению роста костей и расширению ростовой пластинки (фигура 44). В случае бедренных костей мышей FGFR3^Y367C, обработанных наполнителем в течение 6 дней, наблюдали 18% недостаточность в росте при сравнении по длине с бедренными костями дикого типа, обработанными наполнителем. Обработка бедренных костей мышей FGFR3^Y367C с использованием 1 мкМ Pro-Gly-CNP37 в течение 6 дней снижала недостаточность роста до 11%, т.е. уменьшала дефект роста примерно на 40%.

ПРИМЕР 9

Стабильность в сыворотке/плазме вариантов CNP in vitro

В препарате для исследований фармакокинетики (ФК) оценивали стабильность вариантов CNP в сыворотке и/или плазме.

Коротко, аналит выделяли посредством удаления белков сыворотки или плазмы либо преципитацией 2% трихлоруксусной кислотой, либо преципитацией в смеси 1:3 сыворотка:ацетонитрил. Смесь для преципитации встряхивали при 14000 об/мин в течение пяти минут и часть надосадка извлекали и разбавляли водой перед переносом в силанизированный флакон автоматического пробоотборника для анализа. Затем экстракты сыворотки анализировали обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ОФ-ВЭЖХ) - масс-спектроскопией с ионизацией электроспреем (ESI-МС). Единичную массу (m/z), которая, как показано, специфична для варианта CNP, отслеживали в целях количественной оценки.

Сначала определяли стабильность и выход в анализе. Параметры анализов (ОФ-ВЭЖХ и ESI-МС) оптимизировали посредством анализа матричных стандартов (экстракты сыворотки с увеличенной концентрацией аналита после преципитации). После оптимизации определяли выход в анализе путем инъекции образцов сыворотки с известными концентрациями и сравнения ответа аналита с ответом матричных стандартов, приготовленных в сходных концентрациях. Также определяли стабильность аналита в экстрактах сыворотки, чтобы убедиться в том, что не происходит значимых потерь после преципитации сыворотки и до фактического анализа. Чтобы проверить влияние замораживания на стабильность в сыворотке, также осуществляли исследование двух циклов замораживания/размораживания. В данном исследовании в образец сыворотки вводили вариант CNP и анализировали перед замораживанием, которое затем осуществляли в течение ночи при -20°C. Затем образец размораживали при комнатной температуре и снова анализировали. Процесс повторяли, осуществляя второй цикл замораживания/размораживания.

Стабильность варианта CNP в сыворотке определяли путем внесения в образцы сыворотки/плазмы варианта CNP в концентрации 10 мкг/мл. Образец помещали на водяную баню при 37°C на три часа. С интервалами в 30 минут отбирали и анализировали аликвоты сыворотки в двух повторах. В случае явной быстрой потери аналита (>50% за 30 минут) исследование можно повторить с использованием 10-минутных временных точек.

В типичном способе определения стабильности вариантов CNP в плазме мышей смесь варианта CNP (10 мкл исходного раствора с концентрацией примерно 2,5-5,0 мг/мл), гепаринизированной плазмы мышей (50 мкл, Bioreclamation, CD-I Lith Hep 62231) и 5 М NaCl (10 мкл) инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение 0-5 часов и затем гасили 10x смесью ингибиторов протеаз (15 мкл, Sigma P2714). Для экстракции 150 мкл смеси MeOH/0,1% FA добавляли к 85 мкл реакционной смеси и полученную смесь встряхивали в течение 1 минуты и затем центрифугировали при 15°C в течение 15 минут. 75 мкл надосадка добавляли к 300 мкл водного 0,1% раствора FA. Небольшую часть полученной смеси подвергали ЖХ/МС-анализу.

ПРИМЕР 10

Фармакокинетика и продукция цГМФ у крыс и мышей

Исследования проводили у нормальных крыс, чтобы оценить профиль фармакокинетики (ФК) CNP22 и некоторых вариантов CNP и временной ход изменения концентрации цГМФ в плазме после одного внутривенного (в/в) или подкожного (п/к) введения пептидов CNP. Иммунореактивность CNP в плазме определяли, используя конкурентный радиоиммуноанализ (РИА) с кроличьим поликлональным анти-CNP-антителом. Концентрацию цГМФ в плазме определяли в РИА, используя коммерчески доступный набор (набор для анализа циклического ГМФ YAMASA, YAMASA Corporation).

Использовали нормальных крыс 7-8-недельного возраста. Оценивали рекомбинантный CNP22 дикого типа, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36). Дозу 20 нмоль/кг каждого пептида CNP в виде раствора в 5% манните инъецировали внутривенно один раз в хвост, или дозу 50 нмоль/кг каждого пептида CNP в виде раствора в буферном растворе 0,03 моль/л уксусной кислоты, pH 4,0, содержащем 1%(масс./об.) бензилового спирта и 10% (масс./об.) сахарозы, инъецировали подкожно один раз в спину.

Иммунореактивность CNP в плазме определяли в конкурентном РИА, используя кроличье поликлональное анти-CNP-антитело. Готовили стандарты и образцы для контроля качества. Пятьдесят микролитров стандартных образцов, образцов для контроля качества и анализируемых образцов добавляли, соответственно, в пробирки, содержащие 50 мкл буфера для РИА. В пробирки добавляли разбавленные кроличьи поликлональные анти-CNP-антитела (100 мкл). Все пробирки хранили при 4°C в течение ночи. Добавляли раствор ¹²⁵I-[Tyr⁰]-CNP22 (100 мкл) и раствор IgG кролика (100 мкл) и оставляли при температуре около 4°C в течение ночи. Добавляли один миллилитр сыворотки козы против IgG кролика, содержащий 10% полиэтиленгликоль, встряхивали и оставляли при температуре около 4°C по меньшей мере на 1 час и затем нерастворимую фракцию осаждали центрифугированием. После аспирации надосадка измеряли количество радиации (линия гамма-спектра) в осадке с помощью гамма-счетчика. Каждый образец измеряли в двух повторах, и среднее значение было принято в качестве определяемого значения.

Концентрации цГМФ в образце плазмы через 5, 30, 60 и 90 минут после внутривенного введения дозы или через 5, 30, 60, 120 и 180 минут после подкожного введения дозы определяли в конкурентном РИА, используя моноклональное анти-цГМФ-антитело. Готовили стандартные образцы. 100 мкл образцов для анализа (стандартные растворы для калибровочной кривой или разбавленные образцы плазмы для определения цГМФ) переносили в пробирки. Затем в пробирки добавляли 100 мкл раствора моноклонального анти-цГМФ-антитела и 100 мкл раствора ¹²⁵I-меченого сложного сукцинил-тирозинметилового эфира цГМФ, соответственно. Все пробирки хранили при 4°C в течение ночи. После добавления 500 мкл раствора угля, покрытого декстраном, пробирки встряхивали и затем помещали на лед на 10 минут. Реакционную смесь центрифугировали и 500 мкл надосадка переносили из каждого образца в новую пробирку. Количество радиации (линия гамма-спектра) в надосадке измеряли с помощью гамма-счетчика. Каждый образец измеряли в двух повторах и среднее значение принимали в качестве определяемого значения.

Иммунореактивность CNP в плазме использовали для фармакокинетического (ФК) анализа. ФК-анализ осуществляли, используя WINNONLIN® Professional (Pharsight Corporation). ФК-профили CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) после внутривенного введения вычисляли, используя параметры ФК, такие как концентрация в 0 часов (C₀: экстраполяция, пмоль/мл), общий клиренс из организма (CL_tot: мл/мин/кг), объем распределения в стационарном состоянии (V_dss: мл/кг), площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (AUC: пмоль·мин/мл), среднее время удержания (MRT: мин) и время полужизни (T_1/2: мин). ФК-профили пептидов CNP после подкожного введения вычисляли, используя такие ФК-параметры, как максимальная концентрация в плазме (C_max: пмоль/мл), время достижения C_max (T_max: мин), площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (AUC: пмоль·мин/мл), среднее время удержания (MRT: мин) и время полужизни (T_1/2: мин).

В экспериментах по извлечению внесенного в плазму материала РИА сходным образом выявлял CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) (данные не показаны).

Способы, подобные способам, описанным выше, применяли для исследования у мышей ФК-профилей CNP22 и его вариантов и их способности стимулировать цГМФ.

ФК-профили CNP22, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) после внутривенного введения у трех крыс показаны на фигуре 45. Как показано на фигуре 45, CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) имели намного более длительное время полужизни и намного большую биодоступность, чем CNP22. Время полужизни, T_1/2 (мин), составляло 1,42 (±0,45) для CNP22, 22,3 (±1,5) для ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), и 49,5 (±28,0) для CNP37. Площадь под кривой, AUC (пмоль·мин/мл), составляла 320 (±54) для CNP22, 1559 (±568) для CNP37 и 2084 (±424) для ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).

ФК-профили трех пептидов CNP после подкожного введения у трех крыс изображены на фигуре 46. По сравнению с CNP22, ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) имел намного более длительное время полужизни (78,1 мин (±16,4) по сравнению с 10,0 (±5,0)) и намного большую биодоступность (60% (±6%) по сравнению с 19% (±9%)).

Временной ход изменения концентраций цГМФ в плазме после внутривенного введения трех пептидов CNP у трех крыс показан на фигуре 47. На фигуре 47 ясно видно, что внутривенное введение CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) приводило к намного более высоким уровням в плазме цГМФ во временных точках 30, 60 и 90 минут, чем внутривенное введение CNP22.

Временные профили изменения концентраций цГМФ в плазме после подкожного введения трех пептидов CNP у трех крыс показаны на фигуре 48. Подкожное введение ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) и CNP37 также приводило к значимо более высоким концентрациям в плазме цГМФ, чем подкожное введение CNP22, при этом отличие от CNP22 увеличивалось с течением времени в случае ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), но уменьшалось с течением времени в случае CNP37.

Исследования на крысах показывают, что по сравнению с wtCNP22 варианты CNP CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) имели значимо более длительное время полужизни in vivo, имели значимо более высокую биодоступность in vivo и стимулировали значимо более высокие уровни продукции цГМФ in vivo в течение длительного периода времени. Резистентность CNP37 и ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) к расщеплению под действием NEP коррелирует с более длительным временем полужизни в плазме in vivo, которое в свою очередь коррелирует с пролонгированной передачей сигнала NPR-B/цГМФ in vivo. Полученные результаты показывают, что по сравнению с CNP22 варианты CNP согласно изобретению, вводимые посредством внутривенной или подкожной инъекции (например, один раз в день) могут быть более эффективными в лечении отвечающих на CNP состояний или расстройств, таких как связанные с костями расстройства и расстройства гладкой мускулатуры сосудов.

ПРИМЕР 11

Фармакокинетические исследования у мышей

Чтобы определить варианты CNP, обладающие повышенной резистентностью к NEP, для исследования эффективности у мышей FGFR3^ach (см. пример 13), проводили исследование фармакокинетики (ФК), в котором сравнивали фармакокинетические свойства вариантов CNP со свойствами CNP22 дикого типа. Мышь FGFR3^ach является мутантной мышиной моделью умеренной ахондроплазии и содержит один трансген на фоне генотипа мышей FVB.

CNP22 дикого типа или его вариант вводят в виде однократной внутривенной (в/в) дозы мышам FVB дикого типа 6-недельного возраста. Типичные ФК-исследования проводили с использованием wtCNP22. Мышам FVB/N шестинедельного возраста внутривенно вводили wtCNP22 в виде однократной дозы 100 нмоль/кг. Вычисляли средние уровни CNP22 в плазме, и было определено, что оцениваемое время полужизни CNP22 составляет от 0,76 минуты до 1,03 минуты.

Ожидается, что варианты CNP, обладающие более высокой резистентностью к расщеплению под действием NEP, имеют повышенные концентрации в сыворотке с течением времени и более длительное время полужизни in vivo.

ПРИМЕР 12

Эффективность вариантов CNP у мышей дикого типа

Влияние вариантов CNP in vivo на рост костей оценивали у мышей дикого типа. Самцы мышей FVB дикого типа трехнедельного возраста получали ежедневно подкожную (п/к) инъекцию либо наполнителя, либо G-CNP37 (200 нмоль/кг) или ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО12») (SEQ ID NO: 36) (200 нмоль/кг) в течение 5 недель. Массу тела измеряли по меньшей мере один раз в неделю. Длину хвоста измеряли по меньшей мере один раз в неделю, используя показания штангенциркуля с цифровой индикацией, и длину тела (длина от кончика носа до анального отверстия), длину костей (большеберцовой кости, бедренной кости, локтевой кости и плечевой кости), длину черепа (от переднего отдела черепа к заднему) и длину поясничного позвонка 5 (LV5) измеряли после 5 недель обработки, используя штангенциркуль. Рентгенограммы получали для исходного уровня и через 5 недель обработки.

Пятинедельная обработка мышей дикого типа с использованием G-CNP37 приводила к значимому приросту массы тела, при этом повышенную массу тела наблюдали, начиная с 9 дня (p<0,05) (фигура 49). Обработка G-CNP37 также приводила к значимо увеличенной длине хвоста, начиная со второй недели после обработки (p<0,01) (фигура 50).

В таблице 10 показано изменение в процентах длины хвоста, длины тела (от кончика носа до анального отверстия), длины черепа (от переднего отдела черепа к заднему), длины костей (бедренной кости, большеберцовой кости, плечевой кости и локтевой кости) и длины поясничного позвонка 5 (LV5) у мышей дикого типа, которым подкожно один раз в день инъецировали 200 нмоль/кг либо G-CNP37, либо ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО12») (SEQ ID NO: 36) в течение 5 недель, по сравнению со значением 100% для мышей дикого типа, обработанных только наполнителем.

Таблица 10
	Хвост	от кончика носа до анального отверстия	от переднего отдела к заднему (черепа)	бедренная кость	Больше-берцовая кость	плечевая кость	локтевая кость	LV5
G-CNP37	119%**	114%**	104%*	109%**	105%**	104%**	101%	108%*
CNP27-ПЭО12	101%	104%**	101%	102%*	100%	102%*	96%*	103%
**p<0,01, *p<0,05

Обработка G-CNP37 приводила к значимо увеличенной длине хвоста, длине тела (от кончика носа до анального отверстия), длине черепа, длине проксимальных костей (бедренной кости и плечевой кости), длине дистальных костей (большеберцовой кости) и длине позвонков (поясничного позвонка 5), по сравнению с обработкой наполнителем.

Более низкие дозы Pro-Gly-CNP37, вводимые ежедневно подкожно, 5 нмоль/кг, 20 нмоль/кг или 70 нмоль/кг, в течение пяти недель, приводили к зависимому от дозы увеличению длины хвоста, длины тела (от кончика носа до анального отверстия) и длины костей, по сравнению с наполнителем. В таблице 11 показано изменение в процентах длины хвоста, длины тела (от кончика носа до анального отверстия) и длины костей (бедренной кости, большеберцовой кости, плечевой кости и локтевой кости) у мышей дикого типа, которым подкожно инъецировали один раз в день 5 нмоль/кг, 20 нмоль/кг или 70 нмоль/кг Pro-Gly-CNP37 в течение 5 недель, по сравнению со значением 100% для мышей дикого типа, обработанных только наполнителем.

Таблица 11
	Хвост	От кончика носа до анального отверстия	Бедренная кость	Большеберцовая кость	Плечевая кость	Локтевая кость
5 нмоль/кг	107,6%**	102,7%**	103,3%**	101,7%**	101,1%	100,9%*
20 нмоль/кг	107,8%**	107,6%**	107,1%**	103,4%**	102,3%**	102,5%**
70 нмоль/кг	113,6%**	112,5%**	109,3%**	105,9%**	103,6%**	104,1%**
** p<0,01, *p<0,05

В другом исследовании, используя различные схемы дозирования, вводили Pro-Gly-CNP37 в течение девяти недель с последующей одной неделей восстановления. Мышам FVB дикого типа вводили подкожные дозы:

(1) наполнителя ежедневно в течение девяти недель с последующей одной неделей восстановления;

(2) 20 нмоль/кг Pro-Gly-CNP37 ежедневно в течение одной недели, затем три дозы в неделю в течение восьми недель с последующей одной неделей восстановления;

(3) 20 нмоль/кг Pro-Gly-CNP37 через неделю; или

(4) 5 нмоль/кг Pro-Gly-CNP37 ежедневно в течение девяти недель с последующей одной неделей восстановления.

Повышенный рост длины хвоста, длины тела и длины костей наблюдали во всех группах обработки (группы 2, 3 и 4) в конце исследования. В таблице 12 показано изменение в процентах длины хвоста, длины тела (от кончика носа до анального отверстия) и длины костей (бедренной кости, большеберцовой кости, плечевой кости и локтевой кости) у мышей дикого типа, которым вводили Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») с использованием схем дозирования, описанных выше, по сравнению со значением 100% для мышей дикого типа, обработанных только наполнителем.

Таблица 12
	Получено суммарно Pro-CNP38 (нмоль/кг)	Хвост	От кончика носа до анального отверстия	Бедренная кость	Большеберцовая кость	Плечевая кость	Локтевая кость
Группа 2	620	104,8%**	106,0%**	105,3%**	100,8%	102,5%	101,7%
Группа 3	700	106,7%**	106,5%**	104,1%**	102,5%**	102,6%*	102,8%*
Группа 4	350	104,9%**	105,1%**	107,3%**	102,7%**	102,3%**	103,6%**
**p<0,01, *p<0,05

Хотя все схемы дозирования Pro-Gly-CNP37 приводили к получению повышенных измеряемых параметров аксиального и аппендикулярного роста, ежедневное введение доз Pro-Gly-CNP37 стимулировало аппендикулярный рост (бедренной кости, большеберцовой кости, плечевой кости и локтевой кости) при более низком общем уровне дозы (группа 4) по сравнению со схемами, в которых использовали менее частое введение доз (группы 2 и 3).

ПРИМЕР 13

Эффективность в мышиной модели умеренной ахондроплазии

Эффективность вариантов CNP в усилении роста и корректировании ахондроплазии тестировали в мышиной модели умеренной ахондроплазии, используя линию трансгенных мышей, экспрессирующих ген FGFR-3 человека, имеющий мутацию G380R (FGFR3^ach) (Wang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96(8): 4455-4460 (1999); Naski et al., Development USA, 125: 4977-4988 (1998); патенты США № 6265632 и 6136040).

В 3-недельном возрасте мышей FGFR3^ach и однопометных мышей дикого типа анестезировали, чтобы получить латеральные рентгеновские снимки всего тела с помощью Faxitron, и рандомизировали по массе тела, распределяя на следующие группы обработки (n=8/группа): (1) дикий тип/наполнитель, (2) FGFR3^ach/наполнитель, (3) FGFR3^ach/CNP37 и (4) FGFR3^ach/ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36). Мыши получали один раз в день ежедневно подкожное (п/к) введение намеченного тестируемого продукта (наполнитель или 200 нмоль/кг варианта CNP) в течение 5 недель. Вспомогательные группы (n=3) использовали для подтверждения экспозиции с каждым тестируемым продуктом после однократного подкожного введения в 1 день. Самцов мышей FVB дикого типа, которые получали ежедневно подкожную инъекцию наполнителя в течение 5 недель, использовали в качестве контроля нормального роста.

Проводили рентгеновские измерения на исходном уровне и в конце исследования, чтобы определить изменения длины головы, площади черепа и наружного слухового прохода (EAM, ушной канал, проходящий от наружного уха до среднего уха). Массу тела и длину хвоста измеряли по меньшей мере один раз в неделю, используя штангенциркуль с цифровой индикацией, чтобы измерить длину хвоста, и длину тела (от кончика носа до анального отверстия) измеряли после 5-недельной обработки. Длину костей (большеберцовой кости, бедренной кости, локтевой кости и плечевой кости) измеряли при вскрытии, используя штангенциркуль с цифровой индикацией.

На 37 день всех мышей умерщвляли терминальной анестезией и получали фотографии целых животных и рентгеновские снимки с использованием Faxitron. Левые и правые большеберцовые кости, бедренные кости, плечевые кости и локтевые кости собирали и измеряли, используя штангенциркуль с цифровой индикацией. Левые части каждой кости обрабатывали для гистологического исследования, а правые части мгновенно замораживали в качестве архивных образцов. Образцы, полученные из костей, использовали, чтобы оценить влияние вариантов CNP на рост эндохондральных костей.

Обработка мышей FGFR3^ach пептидом CNP37 посредством подкожной инъекции один раз в день ежедневно в течение 5 недель приводила к значимо увеличенной длине тела (фигура 51), длине хвоста (фигура 52), длине дистальных костей (локтевой кости и большеберцовой кости) (фигуры 53A и B) и длине проксимальных костей (плечевой кости и бедренной кости) (фигуры 54A и B). Кроме того, обработка CNP37 увеличивала длину головы (фигура 56), площадь наружного слухового прохода (фигура 57) и длину позвоночника (фигура 58) в результате удлинения тел позвонков. Кроме того, обработка CNP37 корректировала ризомелию (диспропорцию длины проксимальных конечностей) у мышей FGFR3^ach, т.е. восстанавливала пропорциональный рост проксимальных костей, который оценивали по отношению бедренная кость:большеберцовая кость (фигура 55). В таблице 13 суммированы данные об изменении в процентах длины хвоста, длины тела (от кончика носа до анального отверстия) и длины кости (бедренной кости, большеберцовой кости, плечевой кости и локтевой кости) у мышей FGFR3^ach, которым инъецировали подкожно один раз в день ежедневно 200 нмоль/кг либо CNP37, либо ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО24») (SEQ ID NO: 36) в течение 5 недель, по сравнению со значением 100% для мышей FGFR3^ach, обработанных только наполнителем.

Таблица 13
	Хвост	От кончика носа до анального отверстия	Бедренная кость	Большеберцовая кость	Плечевая кость	Локтевая кость
CNP37	115%**	109%**	112%**	107%**	105%*	106%**
CNP27-ПЭО24	100%	99%	100%	102%	100%	101%
**p<0,01, *p<0,05

Результаты таких исследований показывают, что CNP37 может стимулировать рост позвоночника и длинных костей, помогает корректировать ризомелию благодаря преимущественному увеличению длины бедренной кости по сравнению с большеберцовой костью, и помогает восстанавливать черепно-лицевые пропорции у мышей FGFR3^ach. Полученные результаты свидетельствуют, что CNP37 и возможно другие варианты CNP могут быть эффективными в корректировке симптомов ахондроплазии и лечении субъектов, имеющих дефекты роста костей, или нуждающихся в увеличенном росте костей.

ПРИМЕР 14

Измерение биомаркеров и оценка иммуногенность у мышей дикого типа и мышей с ахондроплазией

Измерение биомаркеров после введения CNP

Уровни биомаркеров роста костей измеряли у мышей дикого типа и мышей с ахондроплазией (FGFR3^ach).

Трансгенных мышей FVB FGFR3^ach (мышиная модель умеренной ахондроплазии) обрабатывали ежедневно в течение 5 недель, используя подкожную инъекцию либо наполнителя (30 мМ буфер уксусная кислота/ацетат, 1% бензиловый спирт, 10% сахароза, pH 4,0), либо CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО24») (SEQ ID NO: 36) в концентрации 200 нмоль/кг каждого соединения CNP, как описано выше. Во время исследования собирали плазму и сыворотку. Собранную плазму хранили с 10x ингибитором протеаз при -80°C вплоть до анализа. Уровни цГМФ измеряли через 15 минут после инъекции на 36 день из пробирок для сбора плазмы K2-ЭДТА. Фрагменты расщепленного коллагена типа II (ассоциированные с хрящом биомаркеры), остеокальцин (ассоциированный с костью биомаркер) и IgG (имеющий отношение к иммуногенности) измеряли в сыворотке из образца терминальной крови в конце исследования (37 день). цГМФ измеряли, используя коммерчески доступный набор для ELISA (Cayman Chemical Co., Cat. No. 581021.1), расщепленный коллаген типа II (Cartilaps) измеряли, используя коммерчески доступный набор из Immunodiagnostic Systems (№ в каталоге 3CAL4000), и остеокальцин измеряли, используя коммерчески доступный набор из Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, Massachusetts).

На фигуре 59 показано увеличение уровней цГМФ в плазме у мышей FGFR3^ach, обработанных CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), по сравнению с наполнителем. На фигурах 60 и 61 показано, что введение CNP37 приводило к наибольшему повышению уровней в сыворотке расщепленного коллагена типа II и остеокальцина. Полученные результаты показывают, что введение пептидов CNP, в частности CNP37, мышам FGFR3^ach приводило к повышенным уровням маркеров роста кости, свидетельствующим о повышенном образовании и росте костей у обработанных пептидом CNP мышей FGFR3^ach.

Для оценки биомаркеров у мышей дикого типа, мышей FVB дикого типа обрабатывали ежедневно в течение 5 недель, используя подкожную инъекцию либо наполнителя (30 мМ буфер уксусная кислота/ацетат, 1% бензиловый спирт, 10% сахароза, pH 4,0), либо 200 нмоль/кг G-CNP37, 200 нмоль/кг ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО12») (SEQ ID NO: 36) или 20 нмоль/кг или 70 нмоль/кг Pro-Gly-CNP37. Во время исследования собирали плазму и сыворотку. Собранную плазму хранили с 10× ингибитором протеаз при -80°C вплоть до анализа. Уровни цГМФ измеряли через 15 минут после инъекции на 36 день из пробирок для сбора плазмы K2-ЭДТА. Уровни расщепленного коллагена типа II, специфичной для костей щелочной фосфатазы и IgG (имеющего отношение к иммуногенности) измеряли в сыворотке из терминального образца крови в конце исследования (37 день). цГМФ и расщепленный коллаген типа II (Cartilaps) измеряли как описано выше. Специфичную для костей щелочную фосфатазу измеряли, используя коммерчески доступный набор (Cusabio, № в каталоге CSB-E11914m).

Введение G-CNP37 значимо увеличивало (p<0,05) уровень цГМФ (фигура 62) и особенно уровень фрагментов расщепленного коллагена типа II (фигура 63) у мышей дикого типа по сравнению с наполнителем. Значимо более высокий уровень фрагментов коллагена типа II в результате введения G-CNP37, свидетельствует о метаболизме хрящевого матрикса, показывая, что G-CNP37 стимулировал образование новой кости в растущих костях у мышей дикого типа.

Обе дозы Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38»), 20 и 70 нмоль/кг, значимо увеличивали (p<0,05) уровень цГМФ в плазме через 15 минут после введения по сравнению с мышами дикого типа, обработанными наполнителем (фигура 64). Введение более высокой дозы (70 нмоль/кг) Pro-Gly-CNP37 также значимо увеличивало (p<0,05) уровень расщепленного коллагена типа II по сравнению с обработанными наполнителем мышами (фигура 65), свидетельствуя о том, что более высокая доза Pro-Gly-CNP37 стимулировала обновление хрящевого матрикса перед образованием новой кости у мышей дикого типа. Кроме того, введение более высокой дозы (70 нмоль/кг) Pro-Gly-CNP37 повышало (p<0,05) уровень специфичной для кости щелочной фосфатазы по сравнению с обработанными наполнителем мышами (фигура 66), свидетельствуя, что более высокая доза Pro-Gly-CNP37 увеличивала ремоделирование кости у мышей дикого типа.

Оценка иммуногенности вариантов CNP

Поскольку варианты CNP являются пептидными производными, возможно, что введение пептидов может приводить к иммуногенному ответу in vivo. Чтобы оценить, возникает ли иммунный ответ после последующих введений варианта CNP, осуществляли измерение уровней антител в сыворотке.

Осуществляли анализ IgG, чтобы оценить, запускается ли иммунный IgG-ответ в результате 5-недельного воздействия на мышей с ахондроплазией FGFR3^ach пептидами CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) («CNP27-ПЭО24») (SEQ ID NO: 36). IgG является наиболее преобладающим иммуноглобулином в сыворотке мышей и человека и его продукция является частью вторичного иммунного ответа на антиген. IgG-ответ на введение пептидов CNP определяли следующим образом. 96-луночные планшеты покрывали 100 нг/мл CNP22, CNP37 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) в буфере BupH PBS (Pierce/Thermo, Cat. No. 28372, Rockford, Illinois). После инкубации в течение ночи планшеты блокировали блокирующим буфером казеин-PBS (Pierce/Thermo, № в каталоге 37528) в течение двух часов при комнатной температуре и встряхивании при 300 об/мин. После промывки буфером для промывки (1× PBS с 0,05% твином) в планшет добавляли разбавленные образцы сыворотки, полученные из терминальной крови (разбавление 1:25). Положительный и отрицательный контроли также вносили в планшет. Положительный контроль представлял собой сыворотку в разведении 1:25 (объединенную от 6 отдельных мышей FVB) с добавленным анти-CNP22-антителом (Bachem, кроличий анти-CNP22-IgG, № в каталоге T-4222) в разведении 1:1000. Отрицательный контроль представлял собой разведенную объединенную сыворотку. После двухчасовой инкубации планшеты промывали и в лунки добавляли второе антитело, разбавленное в блокирующем буфере. В случае образцов сыворотки мыши добавляли антитело против Fcγ IgG мыши (конъюгированное с пероксидазой аффинно очищенное антитело козы против Fcγ-фрагмента IgG мыши, № в каталоге 115-035-071, Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania) в разведении 1:10000. В случае положительного и отрицательного контролей добавляли антитело против IgG кролика-HRP (Santa Cruz Biotechnology, № в каталоге SC-2004, Santa Cruz, California) к блокирующему буферу. После двухчасовой инкубации при комнатной температуре и встряхивании при 300 об/мин планшеты промывали буфером для промывки. Во все лунки добавляли 100 мкл TMB (One-step TMB, Pierce/Thermo, № в каталоге 34022). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут и встряхивании при 300 об/мин. Колориметрические реакции останавливали добавлением 100 мкл 2н H₂SO₄. Планшеты регистрировали при 450 нм (Spectramax, Molecular Devices, Sunnyvale, California) и данные анализировали, используя компьютерную программу SoftMax Pro (Molecular Devices).

В образцах сыворотки от мышей FGFR3^ach, обработанных CNP22 или ПЭО24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), не обнаружено положительного иммунного IgG-ответа ни у одной мыши. Только у одной из девяти CNP37-обработанных мышей FGFR3^ach обнаружен слегка положительный IgG-ответ.

Также оценивали иммуногенный ответ у мышей дикого типа, которым вводили G-CNP37, ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) или Pro-Gly-CNP37, который измеряли по увеличению уровня IgG в сыворотке, исследуя образцы сыворотки из терминальной крови, как описано выше. Ни у одной из мышей дикого типа, обработанных ПЭО12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) или Pro-Gly-CNP37 (20 или 70 нмоль/кг) не наблюдали положительного иммунного IgG-ответа, и только у одной из шести мышей дикого типа, которым вводили G-CNP37, наблюдали слабо положительный IgG-ответ.

Измерение биомаркеров при разных схемах дозирования CNP

Мышей FVB дикого типа обрабатывали ежедневно в течение 9 недель, используя подкожную (п/к) инъекцию наполнителя (30 мМ буфер уксусная кислота/ацетат, 1% бензиловый спирт, 10% сахароза, pH 4,0) или Pro-Gly-CNP37 («Pro-CNP38») согласно разным схемам дозирования. Группа 1 включала обработанных наполнителем мышей, которым ежедневно подкожно в течение 9 недель проводили инъекции с последующей 1 неделей без обработки. Группа 2 включала мышей, которых обрабатывали Pro-Gly-CNP37 (20 нмоль/кг) один раз в день ежедневно в течение 1 недели, затем тремя дозами в неделю в течение 8 недель с последующей 1 неделей без обработки. Группа 3 включала мышей, которых обрабатывали Pro-Gly-CNP37 (20 нмоль/кг) один раз в день ежедневно через неделю (1, 3, 5, 7 и 9 недели) с 1 неделей без обработки после каждой недели обработки. Группа 4 включала мышей, которых обрабатывали Pro-Gly-CNP37 (5 нмоль/кг) один раз в день ежедневно в течение 9 недель с последующей 1 неделей без обработки. Наконец группа 5 включала мышей, которых обрабатывали Pro-Gly-CNP37 (5 нмоль/кг) один раз в день ежедневно в течение 5 недель, не используя недельные периоды без обработки. Сыворотку мышей из терминальной крови собирали, и измеряли расщепленный коллаген типа II, общую щелочную фосфатазу и общий уровень антител. Уровни расщепленного коллагена типа II измеряли как описано выше. Уровни общей щелочной фосфатазы, главным образом в печени и костях, измеряли с помощью устройства для ветеринарного диагностического лабораторного тестирования (Antech).

Разработали общий анализ антител для оценки потенциального иммунного ответа. Основой, используемой для общего анализа антител, являлся электрохемилюминисцентный анализ (ECLA). В такой основе ECLA используется меченное биотином лекарственной средство (в данном случае биотин-Pro-Gly-CNP37) и меченное рутением лекарственное средство (в данном случае, Ru-Pro-Gly-CNP37). Меченое биотином лекарственное средство связывается с покрытым стрептавидином планшетом, который содержит электроды, а меченое рутением лекарственное средство функционирует в качестве регистрирующего компонента в анализе, так как рутений можно стимулировать электрохимически. Специфичное для лекарственного средства антитело (в данном случае CNP-специфичное антитело) связывается с меченным биотином лекарственным средством и меченным рутением лекарственным средством и «соединяет мостиком» два меченых лекарственных средства. Среди преимуществ методики ECLA тот факт, что можно регистрировать любой изотип антитела (IgG, IgM, и т.д.) и анализ ECLA не зависит от вида.

Общий анализ антител осуществляли следующим образом. Pro-Gly-CNP37 метили биотином в разрешающем соотношении 4:1, и Pro-Gly-CNP37 также метили отдельно рутением в разрешающем соотношении 10:1. Обе отдельные реакции мечения гасили добавлением глицина и в образцах, полученных в результате обеих реакций, заменяли буфер на PBS. Контроли качества для низкого и высокого уровня готовили, используя коммерчески доступное анти-CNP22-антитело (Bachem, кроличий анти-CNP22-IgG, № в каталоге T-4222), добавленное в низкой и высокой концентрациях к 5% разбавленной сыворотке мышей FVB. Образцы сыворотки мышей разбавляли до 5%, используя разбавитель для анализа (5% БСА в PBS, MSD, № в каталоге R93AA-1). Рабочий раствор готовили добавлением меченного биотином Pro-Gly-CNP37 к разбавителю для анализа, затем добавляли меченный рутением Pro-Gly-CNP37 к разбавителю для анализа, и затем оба раствора объединяли вместе. Двадцать пять микролитров контролей качестве низкого и высокого уровня наносили на планшет в качестве контролей. Затем добавляли по 25 мкл образца в не связывающий 96-луночный планшет с последующим добавлением 50 мкл рабочего раствора во все лунки. Образцы и контроли качества инкубировали с рабочим раствором при комнатной температуре в течение 2 часов при встряхивании при 350 об/мин. В это время планшет MSD со стрептавидином (MSD, № в каталоге L13SA-1) блокировали блокирующим буфером (MSD, № в каталоге R93AA-1) при комнатной температуре в течение 2 часов со встряхиванием при 350 об/мин. В конце двухчасового периода инкубации планшет MSD со стрептавидином промывали и затем по 50 мкл образца или контролей качества переносили в планшет MSD. Затем планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа со встряхиванием при 350 об/мин. В конце 1-часового периода инкубации планшет MSD промывали и в планшет добавляли 150 мкл 2x буфера для регистрации (MSD, № в каталоге R92TC-2). Планшет регистрировали, используя устройство MSD PR400.

Во всех пяти группах мышей наблюдали по существу сравнимые уровни расщепленного коллагена типа II (фигура 67). Обработка мышей в группе 5 с использованием 5 нмоль/кг Pro-Gly-CNP37 один раз в день ежедневно в течение 5 недель значимо увеличивала (p<0,001) уровень общей щелочной фосфатазы (фигура 68), который является показателем ремоделирования костей. В образцах сыворотки из каждой из четырех групп мышей, обработанных Pro-Gly-CNP37, не выявлено отрицательного гуморального ответа в общем анализе антител.

Не имея намерения быть связанными с какой-либо теорией, предложили возможные объяснения того, почему в четырех группах CNP-обработанных мышей не выявляли статистически значимого различия в уровне расщепленного коллагена типа II по сравнению с обработанными наполнителем мышами, и почему только в группе 5 мышей, обработанных CNP, обнаружено статистически значимое увеличение уровня общей щелочной фосфатазы по сравнению с обработанными наполнителем мышами. Вероятно, что поскольку обработанные наполнителем мыши в данном исследовании также росли, то расщепленный коллаген типа II и щелочная фосфатаза, которые являются биомаркерами роста, также продуцировались у обработанных наполнителем мышей. Кроме того, для мышей в каждой из групп 1-4 был однонедельный период без обработки, который вероятно нивелировал любые изменения уровней расщепленного коллагена типа II и общей щелочной фосфатазы среди обработанных CNP мышей в группах 1-3 и обработанных наполнителем мышей. Периода без обработки не было для обработанных CNP мышей в группе 5, и у таких мышей наблюдали значимо (p<0,001) более высокий уровень общей щелочной фосфатазы по сравнению с обработанными наполнителем мышами.

ПРИМЕР 15

Зависимости доза-ответ для вариантов CNP у мышей

Эффекты различных доз вариантов CNP оценивали у мышей FVB дикого типа.

Для исследования доз в двух отдельных исследования (S1 и S2) группам из 10 мышей вводили Pro-Gly-wtCNP37 («Pro-CNP38») в дозе 20 и 70 нмоль/кг подкожно один раз в день, всего 36 инъекций. В ходе обработки измеряли длину хвоста и массу тела. В конце эксперимента животных умерщвляли и оценивали длину костей.

Длина хвоста у обработанных наполнителем животных составляла приблизительно 8 см на 36 день, тогда как у животных, обработанных 20 нмоль/кг Pro-CNP38, наблюдали длину хвоста приблизительно 8,75 см, и у обработанных 70 нмоль/кг Pro-CNP38 наблюдали длину хвоста, увеличенную примерно до 9,5 см. Введение Pro-CNP38 в любой дозе индуцировало значимое (p<,05) относительное увеличение общей длины тела по сравнению с обработанными контролем животными, при этом обнаружено приблизительно 130% увеличение скорости роста при 20 нмоль/кг и приблизительно 160% увеличение скорости роста при 70 нмоль/кг Pro-CNP38 (фигура 69).

Обработка Pro-CNP38 также значимо увеличивала длину большинства оцениваемых длинных костей, а также общую длину от кончика носа до анального отверстия (длину тела) животного. В таблице 14 представлено относительное увеличение в % длины костей у обработанных животных по сравнению с обработанными наполнителем животными.

Таблица 14
Pro-CNP38	Хвост	От кончика носа до анального отверстия	LV4-6	Бедренная кость	Большеберцовая кость	Плечевая кость	Локтевая кость
20 нмоль/кг	8%*	7%*	10%*	7%*	4%*	3%*	3%
70 нмоль/кг	16%*	13%*	13%*	10%*	7%*	4%*	5%*
Относительное увеличение в %, *p<0,05 ANNOVA (Даннета) по сравнению с наполнителем

Также оценивали минеральную плотность костей (BMD) и содержание минеральных веществ в костях (BMC) после введения Pro-CNP38 в разных дозах. Результаты (фигура 70) показали, что введение Pro-CNP38 в дозе 70 нмоль/кг значимо снижало минеральную плотность костей (фигура 70A) и увеличивало содержание минеральных веществ в костях (фигура 70B), что свидетельствует о наличии задержки минерализации костей у обработанных животных, но обработка CNP не оказывала неблагоприятного влияния на процесс минерализации как таковой.

Не было значимых различий массы органов между обработанными Pro-CNP38 или обработанными наполнителем животными.

Биоаналитические исследования зависимости доза-ответ у мышей

Проводили биоаналитические исследования для измерения маркеров активности CNP после введения in vivo различных доз Pro-CNP38. Анализировали уровни цГМФ в плазме, уровни коллагена типа II в сыворотке и уровни щелочной фосфатазы в сыворотке из образцов, взятых in vivo. Мышам дикого типа вводили 20 и 70 нмоль/кг Gly-wtCNP37 («CNP38»), 20 и 70 нмоль/кг Pro-Gly-wtCNP37 («Pro-CNP38») и 70 и 200 нмоль/кг GHKSEVAHRFK-wtCNP27 («HSA-CNP27») (SEQ ID NO: 144) подкожно один раз в день в течение 36 дней. Плазму собирали через 15 минут после последней инъекции на 36 день и мышей умерщвляли спустя 24 часа. При умерщвлении собирали сыворотку терминальной крови и использовали для анализа биомаркеров, как описано ранее.

На фигуре 71 показано, что 20 нмоль/кг CNP38 и 70 нмоль/кг HSA-CNP27 значимо увеличивали цГМФ в плазме (p<0,01), повышая уровни цГМФ в плазме приблизительно до 300 пмоль и 400 пмоль, соответственно. Введение 70 нмоль/кг CNP38 повышало уровень цГМФ приблизительно до 500 пмоль (p<0,01), тогда как введение 70 нмоль/кг Pro-CNP38 повышало уровень цГМФ приблизительно до 575 пмоль (p<0,001). Введение 200 нмоль/кг HSA-CNP27 повышало уровень цГМФ приблизительно до 675 пмоль (p<0,001).

Варианты CNP также значимо увеличивали уровни расщепленного коллагена типа II в сыворотке (фигура 72). CNP38 в дозе 20 нмоль/кг повышал уровень коллагена приблизительно до 9 пг/мл (p<0,05), CNP38 в дозе 70 нмоль/кг повышал уровень коллагена приблизительно до 8 пг/мл (p<0,05), Pro-CNP38 в дозе 20 нмоль/кг повышал уровень коллагена приблизительно до 12 пг/мл (p<0,05), Pro-CNP38 в дозе 70 нмоль/кг повышал уровень коллагена приблизительно до 16 пг/мл (p<0,05), HSA-CNP27 в дозе 70 нмоль/кг повышал уровень коллагена приблизительно до 10 пг/мл, и HSA-CNP27 в дозе 200 нмоль/кг повышал уровень коллагена приблизительно до 10 пг/мл (p<0,05).

Уровни щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке также возрастали после введения вариантов CNP (фигура 73). CNP38 в дозе 20 нмоль/кг повышал уровень ЩФ приблизительно до 130 межд. ед./л, CNP38 в дозе 70 нмоль/кг повышал уровень ЩФ приблизительно до 160 межд. ед./л (p<0,001), Pro-CNP38 в дозе20 нмоль/кг повышал уровень ЩФ приблизительно до 155 межд. ед./л (p<0,001), Pro-CNP38 в дозе 70 нмоль/кг повышал уровень ЩФ приблизительно до 180 межд. ед./л (p<0,001), HSA-CNP27 в дозе 70 нмоль/кг повышал уровень ЩФ приблизительно до 120 межд. ед./л, и HSA-CNP27 в дозе 200 нмоль/кг повышал уровень ЩФ приблизительно до 140 межд. ед./л (p<0,01). Таблица 15 иллюстрирует процент ЩФ, которая является специфичной для кости, от общей ЩФ.

Таблица 15
	Общая ЩФ, межд. ед./л	Специфичная для кости ЩФ межд. ед./л	% от общей щелочной фосфатазы
Наполнитель	109,8	24,7	22,5
CNP38 (20 нмоль/кг)	135,9	47,9	35,2
CNP38 (70 нмоль/кг)	166,3	63,5	38,2
Pro-CNP38 (20 нмоль/кг)	159,9	65,9	41,2
Pro-CNP38 (70 нмоль/кг)	183,6	78,4	42,7
HSA-CNP27 (20 нмоль/кг)	121,4	51,7	42,6
HSA-CNP27 (70 нмоль/кг)	136,1	76,5	56,2

Анализ анти-CNP-антител показал, что только HSA-CNP27 вызывал гуморальный ответ в виде IgG у мышей.

Приведенные выше результаты показывают, что введение вариантов CNP повышало концентрацию коллагена типа II и щелочной фосфатазы в сыворотке, что свидетельствует о том, что CNP увеличивает уровни факторов, имеющих отношение к усиленному росту костей, и свидетельствует о том, что введение вариантов CNP в такой низкой дозе как 20 нмоль/кг, является эффективным в отношении усиления роста костей in vivo.

цГМФ-ответ после применения разных схем дозирования

Биоаналитический анализ также осуществляли в разных временных точках после введения Pro-Gly-wtCNP37 («Pro-CNP38») мышам CD-1 дикого типа 8-10-недельного возраста, (n=3 на группу обработки). Pro-CNP38 вводили в виде однократной подкожной дозы 200 нмоль/кг и уровни цГМФ измеряли через 15 минут, 3 часа, 1 день, 2 дня и 3 дня после инъекции в плазме, эпифизе, кортикальном слое кости (костный мозг удаляли), легком и головном мозге. Кровь собирали в K2-ЭДТА. Эпифиз большеберцовой кости и бедренной кости и кортикальный слой кости, ушные раковины, головной мозг, почки и легкие собирали, помещали в кипящую воду на 5 минут, затем замораживали при -70°C. И плазму, и ткани анализировали в отношении цГМФ (набор химический реактивов для ELISA циклического ГМФ Cayman).

Результаты показали, что уровни цГМФ возрастали через 15 минут после инъекции в плазме (приблизительно 1300 пмоль/мл) и эпифизе (приблизительно 2,5 пмоль/мл/мг). К 3 часам уровни в плазме снижались приблизительно до контрольных уровней, тогда как уровни в эпифизе были примерно в 3 раза более низкими, чем уровни цГМФ через 15 минут после инъекции, но выше чем контрольные уровни. Уровни в кортикальном слое кости возрастали приблизительно до 0,5 пмоль/мл/мг во временной точке 15 минут и оставались на этом уровне во временной точке 3 часа. Уровни цГМФ во всех временных точках возвращались к контрольному уровню через 1 день после инъекции. Выявляли мало цГМФ или совсем не выявляли цГМФ в легком или головном мозге в любой временной точке.

Уровни цГМФ также измеряли у мышей, которым вводили многократные инъекции Pro-CNP38. Группам мышей (n=3) вводили Pro-CNP38 следующим образом: однократная доза 20 нмоль/кг подкожно; однократная доза 200 нмоль/кг подкожно; 20 нмоль/кг подкожно в 0 и 1 день; 200 нмоль/кг подкожно в 0 и 1 день; 20 нмоль/кг подкожно в 0 и 3 день; 200 нмоль/кг подкожно в 0 и 3 день. Мышей умерщвляли через 15 минут после последней дозы Pro-CNP38 и анализировали уровни цГМФ в плазме. Не было выявлено модулирования сигнала цГМФ в плазме, обусловленного разными схемами дозирования. Также исследуют цГМФ-ответы в хряще.

Оценка потенциальной десенсибилизации рецептора NPR-B

Гистологический анализ показывает, что CNP при введении ежедневно в дозе 200 нмоль/кг накапливается в ростовой пластинке животных, судя по повышенной иммунореактивности CNP. Вероятно, что такое накопление или ежедневная стимуляция рецептора CNP в ростовой пластинке может десенсибилизировать рецептор CNP.

Чтобы определить, десенсибилизирует ли введение множественных доз рецептор NPR-B in vitro, нормальные артикулярные хондроциты человека культивировали с Pro-Gly-wtCNP37 («Pro-CNP38») в течение различных периодов времени и измеряли секрецию цГМФ.

Первичные нормальные хондроциты человека, выделенные из суставного хряща, культивировали согласно рекомендациям поставщика (Lonza). При слиянии на 60-80% хондроциты дважды обрабатывали с использованием 1 мкМ Pro-CNP38, при этом использовали возрастающие периоды времени между обработками (первую обработку в 0 время, затем через 15 минут, 30 минут, 60 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 6 часов после начальной обработки). В следующем эксперименте обработки либо проводили дважды с возрастающими периодами времени между обработками (первую обработку в 0 время, затем через 6, 16, 24, 48 часов после начальной обработки), либо только один раз параллельно со второй обработкой (только первичные ответы в точках 6, 16, 24 и 48 часов). Обработки проводили либо только в течение 15 минут (острая обработка), либо в течение всего эксперимента (хроническая обработка, когда CNP оставляли в среде). Лизаты клеток и кондиционированную среду собирали и анализировали в отношении секреции общего цГМФ (Molecular Devices ELISA).

В кратковременном эксперименте клетки стимулировали Gly-wtCNP37 («CNP38») в концентрации 1 мкМ два раза в течение 15 минут (острая обработка), или два раза CNP38 на протяжении всего культивирования (хроническая обработка). Периоды между обработками составляли 15 минут, 30 минут, 60 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа и 6 часов. При обработке клеток только один раз пиковую стимуляцию цГМФ получали в последней временной точке эксперимента (6 часов; >0,1 пмоль/лунку в остром эксперименте и 0,2 пмоль/лунку в хроническом эксперименте). В остром эксперименте, когда клетки обрабатывали дважды, ответ снижался до 0,1 пмоль/лунку, если клетки обрабатывали в 0 время и затем снова во временной точке 15 минут. В остром эксперименте, когда клетки обрабатывали дважды, ответ снижался приблизительно до 0,5 пмоль/лунку, если клетки обрабатывали в 0 время и снова в точках 30 минут, 60 минут, 2, 3 и 4 часа. В хроническом эксперименте, когда клетки обрабатывали дважды, ответ снижался приблизительно до 0,16 пмоль/лунку, если клетки обрабатывали в 0 время и в точке 15 минут. В хроническом эксперименте, когда клетки обрабатывали дважды, ответ снижался приблизительно до 0,6 пмоль/лунку, если клетки обрабатывали в 0 время и снова в точках 30 минут, 60 минут или 2 часов. В хроническом эксперименте, когда клетки обрабатывали дважды, ответ снижался до <0,5 пмоль/лунку, если клетки обрабатывали в 0 время и снова в точках 2, 4 или 6 часов.

Также проводили долговременные исследования. В случае острой обработки 1 мкМ CNP38 добавляли к культуре клеток, как описано выше. В случае хронической обработки 1 мкМ CNP38 добавляли к культуре клеток на протяжении всего эксперимента, как описано выше. Результаты показывают, что NPR-B-рецептор может десенсибилизироваться после многократного ежедневного введения CNP in vitro, и что 48 часов между дозами достаточно, чтобы восстановить до 60% от максимального ответа NPR-B на CNP38, если CNP удаляют после первой дозы, и до <40%, если с CNP инкубируют на протяжении всего эксперимента (фигура 74).

Чтобы оценить, десенсибилизирует ли обработка вариантом CNP NPR-B-рецептор in vivo, проводили эксперименты на мышах дикого типа. Самцам мышей CD-1 8-10-недельного возраста подкожно инъецировали контрольный наполнитель или Pro-Gly-wtCNP37 («Pro-CNP38») в дозе 200 нмоль/кг в соответствующие дни. Мышам инъецировали либо Pro-CNP38 ежедневно вплоть до 8 дней, либо инъецировали Pro-CNP38 в первый день, первый и второй день или первый и третий день исследования. Через пятнадцать минут после конечной инъекции мышей (n=3 на группу обработки) глубоко анестезировали и обескровливали посредством торакотомии и канюлирования аорты. Циркулирующую кровь вымывали из организма с использованием PBS через канюлю аорты. Почки и правые большеберцовые кости, правые бедренные кости и левые бедренные кости собирали, кипятили в воде в течение 5 минут и/или мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили на сухом льду или в морозильной камере при -70°C вплоть до анализа цГМФ. Для оценки продукции цГМФ в хряще, дистальные части бедренных костей и/или проксимальные части большеберцовых костей отсекали, взвешивали и превращали в порошок, используя Covaris Cryoprep CP02. Порошкообразные образцы гомогенизировали, используя ультразвуковое устройство Covaris E210, в 5% перхлорной кислоте и нейтрализовали в 60% KOH. Затем образцы центрифугировали при 10000 об/мин при 4°C в течение 5 минут и надосадок использовали для анализа цГМФ (набор для ферментного иммуноанализа циклического ГМФ, Cayman, Michigan). Кроме того, собирали левые большеберцовые кости, фиксировали в 10% нормальном забуференном формалине и хранили для дальнейшего иммуногистохимического анализа.

На фигуре 75A показано, что многократная ежедневная обработка мышей дикого типа 200 нмоль/кг Pro-CNP38 в течение 1, 4, 6, 7 и 8 дней не приводила к десенсибилизации цГМФ-ответа. Напротив, наблюдали потенциирование цГМФ-ответа после 4 дней ежедневной обработки. Кроме того, ежедневная обработка приводила к выходу цГМФ-ответа на плато вплоть до 8 дней. Результаты показывают, что ежедневная обработка мышей дикого типа 200 нмоль/кг Pro-CNP38 вплоть до 8 дней не десенсибилизировала цГМФ-ответ.

Также исследовали кинетику цГМФ-ответа в хряще дистального отдела бедренной кости после обработки мышей дикого типа пептидом Pro-CNP38. Обработка мышей один раз в день в течение двух дней усиливала цГМФ-ответ на Pro-CNP38, по сравнению с цГМФ-ответом на одну обработку (фигура 75B). Когда мышей обрабатывали в первый и третий дни, но не в первый и второй дни, цГМФ-ответ после второй обработки (на третий день) был по существу сходным с цГМФ-ответом, наблюдаемым после одной обработки в первый день (фигура 75B). Результаты свидетельствуют, что введение доз в последующие дни полезно для потенциирования цГМФ-ответа на Pro-CNP38 в таком исследовании на мышах.

Активация NPR-B в разных тканях

Чтобы оценить возможную активацию NPR-B в разных тканях вариантом CNP, самцам мышей CD-1 дикого типа инъецировали 200 нмоль/кг Gly-CNP37 и измеряли цГМФ-ответ в некоторых тканях в разных временных точках. Для каждой группы обработки использовали две мыши. Каждая мышь получала одну подкожную инъекцию Gly-CNP37 или контрольного наполнителя. Через пятнадцать, 30 или 60 минут или 3 часа после инъекции мышей глубоко анестезировали и обескровливали посредством торакотомии и канюлирования аорты. Циркулирующую кровь удаляли, используя промывку PBS, через канюлю аорты. Собирали сердце, печень, легкие, почки, ушные раковины, аорту и головной мозг. Все ткани кипятили в воде в течение 5 минут, тонко разрезали (включая вымывание костного мозга из кортикальных слоев костей с использованием PBS), взвешивали, охлаждали в жидком азоте и превращали в порошок в устройстве для получения порошка биологического материала. Полученные порошкообразные образцы гомогенизировали, используя Polytron, в 6% предварительно охлажденной перхлорной кислоте и нейтрализовали, используя 60% KOH. Затем образцы центрифугировали при 10000 об/мин и 4°C в течение 5 минут и надосадок использовали для анализа цГМФ (набор для ферментного иммуноанализа циклического ГМФ, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan). Результаты нормализовали по отношению к массе ткани.

Секрецию цГМФ в ответ на обработку Gly-CNP37 («CNP» на фигуре 76) можно было выявить в дистальных отделах бедренных костей (хряще и кости), кортикальном слое бедренной кости (кости), ушной раковине (хряще) и в почке (фигуры 76A-D). Максимальные цГМФ-ответы в таких тканях наблюдали через 15 минут после обработки. В тканях печени, сердца, легкого и головного мозга не выявляли заметной секреции цГМФ в ответ на Gly-CNP37, по сравнению с контрольным наполнителем в исследованных временных точках (фигуры 76E-H). Результаты показывают, что обработка 200 нмоль/кг Gly-CNP37 стимулировала цГМФ-секрецию в тканях хряща, кости и почек.

ПРИМЕР 16

Зависимости ответов от дозы вариантов CNP у обезьян

Влияние варианта CNP Pro-Gly-CNP37 на рост кости и уровни связанных с ростом костей биомаркеров оценивали у макак-крабоедов. Восьми здоровым молодым макакам-крабоедам (примерно 2,5-летнего возраста в начале проводимого в настоящее время исследования) подкожно ежедневно инъецировали 10 или 36 мкг/кг/сутки Pro-Gly-CNP37 (n=4 на группу дозирования). Четырем таким обезьянам вводили наполнитель в качестве контроля. Общая продолжительность обработки составляет 6 месяцев. Различные измерения расширения ростовой пластинки и роста кости осуществляли, используя цифровую рентгеновскую и магнитно-резонансную визуализацию, и наружно, измеряя длину конечностей и тела. Периодически собирали образцы крови и мочи для клинической оценки патологии и измерения уровней Pro-Gly-CNP37 и биомаркеров. После окончания исследования оценивали макропатологию и гистологически оценивали образцы ткани, чтобы определить эффективность и безопасность.

Данные, полученные на данный момент в проводимом в настоящее время исследовании, показывают, что обе дозы Pro-Gly-CNP37 давали увеличенную ширину ростовой пластинки по данным цифрового рентгеновского исследования (фигура 77), увеличенную длину правой и левой большеберцовых костей по данным цифрового рентгеновского исследования (фигуры 78A и B), увеличенную длину задних конечностей по данным наружного измерения (фигура 79), увеличенную длину передних конечностей по данным наружного измерения (фигура 80), увеличенную длину тела по данным наружного измерения (фигура 81) и повышенный уровень в сыворотке щелочной фосфатазы, биомаркера образования кости (фигура 82). Данные показывают, что Pro-Gly-CNP37 может стимулировать рост костей у здоровых молодых макак-крабоедов в гемодинамически приемлемых дозах.

ПРИМЕР 17

Влияние вариантов CNP на сердечно-сосудистую систему у мышей

Сообщалось, что натрийуретические пептиды, такие как CNP, влияют на сердечно-сосудистую систему. Wang с соавторами (Eur. J. Heart Fail. 9: 548-57, 2007) описывают, что CNP, как было показано, оказывают кардиозащитное действие в отношении предотвращения ишемии миокарда/реперфузионного повреждения и улучшения ремоделирования сердца после инфаркта миокарда у крыс. Wang показал, что мыши, сверхэкспрессирующие CNP, имеют пониженную частоту случаев гипертрофии сердца, вызванной инфарктом миокарда. Кроме того, CNP, как было показано, вызывает независимое от эндотелия расширение сосудов (M. Honing et al., Hypertension, 37:1179-1183 (2001)) и, следовательно, может временно снижать кровяное давление in vivo.

Чтобы оценить влияние вариантов CNP на сердечно-сосудистую систему, исследовали кровяное давление и частоту сердцебиений у анестезированных мышей FVB дикого типа после подкожной инъекции вариантов.

После пилотного исследования для определения широкого диапазона доз с сердечно-сосудистой активностью проводили исследование зависимости доза-ответ, чтобы выяснить влияние трех разных уровней доз каждого варианта CNP. Три самца мышей FVB в возрасте 8 недель составляют каждую группу обработку. Дозы вводят подкожно анестезированным мышам и контролируют систолическое, диастолическое и среднее артериальное давление (MAP), а также частоту сердечных сокращений с использованием имплантированных датчиков внутриартериального давления.

ПРИМЕР 18

Препарат вариантов CNP

Исследования предварительно приготовленных препаратов CNP осуществляли для того, чтобы оценить стабильность варианта CNP Gly-wtCNP37 («CNP38») при разных pH (pH 3, 4, 5, 6, 7 и 8) и температурах (5°C, 25°C и 40°C) с течением времени. CNP38 проявлял более высокую стабильность при pH 4-6, чем при других pH в исследованиях. CNP38 был стабильным при 5°C при pH 4-6, при этом примерно ≥95% CNP38 сохранялось спустя 15 недель. Когда температуру повышали до 25°C, при pH 4 примерно 85% CNP38 сохранялось спустя 15 недель, при pH 5 примерно 85% сохранялось спустя 15 недель и при pH 6 примерно 80% сохранялось спустя 15 недель. Когда температуру повышали до 40°C, при pH 4 сохранялось примерно 55-60% CNP38 спустя 15 недель, при pH 5 примерно 65% сохранялось спустя 15 недель и при pH 6 примерно 40% сохранялось спустя 15 недель. Фигура 83 иллюстрирует наблюдаемую зависимость константы скорости разложения псевдопервого порядка (K_obs) от pH в диапазоне от pH 3 до 8 и при 5°C, 25°C и 40°C. Данные о стабильности CNP38 в исследованиях предварительно приготовленных препаратов свидетельствуют о стабильности препаратов CNP, имеющих pH в диапазоне примерно от 4 до примерно 6. Кислый pH (например, pH≤ примерно 6) может способствовать стабильности варианта CNP, например, за счет минимизации или избегания дезамидирования остатка(ов) аспарагина и/или глутамина, изомеризации остатка(ов) аспарагиновой кислоты или разложения варианта CNP другими путями.

Варианты CNP могут быть приготовлены в фармацевтических носителях для введения субъектам, пораженных, например, расстройствами, влияющими на рост костей. В некоторых вариантах жидкие препараты вариантов CNP готовят в соответствии с любыми сочетаниями ингредиентов и их количествами или концентрациями, указанными в таблице 16.

Таблица 16
Класс ингредиентов	Ингредиент	Диапазон концентраций
Активный ингредиент	Вариант CNP	10 мг/мл ± 9,9 мг/мл
Буферное средство	Уксусная кислота/ацетат	10 мМ ± 5 мМ, или pH 5±1
Буферное средство	Лимонная кислота/цитрат	10 мМ ± 5 мМ, или pH 5±1
Средство для корректировки изотоничности	NaCl	140 мМ ± 20 мМ
Средство для корректировки изотоничности	Сахароза	10%±5%
Консервант	м-крезол	0,4%±0,1% или 0,2%

Консервант/ антиадсорбент	Бензиловый спирт	1,5%±0,5%
Стабилизатор	Глицерин (глицерол)	5%-100% (неразбавленный)1
Стабилизатор	Метионин	0,01%-0,2%
Стабилизатор	Аскорбиновая кислота/ аскорбатная соль	0,1%-1%
Стабилизатор	Тиоглицерин	0,1%-1%
Антиадсорбент	Полисорбат 20 Полисорбат 80 Бензиловый спирт	0,001%-0,5% 0,001%-0,5% 0,5%-1,5%
1 Глицерин используют для минимизации или предотвращения вызываемого водой гидролиза, дезамидирования, изомеризации или расщепления вариантов CNP. В случае лиофилизированных препаратов NaCl может быть заменен 4-6% или 6-20% маннитом или сахарозой.

В некоторых вариантах лиофилизированные препараты вариантов CNP получают из препаратов, приготовленных в соответствии с любыми из сочетаний ингредиентов и их количеств или концентраций, указанных а таблице 17.

Таблица 17
Класс ингредиентов	Ингредиент	Диапазон концентраций
Активный ингредиент	Вариант CNP	10 мг/мл ± 9,9 мг/мл
Буферное средство	Уксусная кислота/ацетат	10 мМ ± 5 мМ, или pH 5±1
Буферное средство	Лимонная кислота/цитрат	10 мМ ± 5 мМ, или pH 5±1

Средство для корректировки изотоничности/ Наполнитель	Сорбит	5%±3%
Средство для корректировки изотоничности/ Наполнитель	Маннит	5%±3%
Средство для корректировки изотоничности/ Наполнитель	Сахароза	10%±5%
Консервант	м-крезол	0,4%±0,2%
Консервант/ антиадсорбент	Бензиловый спирт	1,5%±0,5%
Стабилизатор	Глицерин (глицерол)	5%-100% (неразбавленный)1
Стабилизатор	Метионин	0,01%-0,2%
Стабилизатор	Аскорбиновая кислота/ аскорбатная соль	0,1%-1%
Стабилизатор	Тиоглицерин	0,1%-1%
Антиадсорбент	Полисорбат 20 Полисорбат 80 Бензиловый спирт	0,001%-0,5% 0,001%-0,5% 0,5%-1,5%
1 Глицерин используют для минимизации или предотвращения вызываемого водой гидролиза, дезамидирования, изомеризации или расщепления вариантов CNP.

В некоторых вариантах препарат, содержащий вариант CNP, имеет pH примерно 3-7 или примерно 3-6 или примерно 3,5-6,5 или примерно 4-6 или примерно 4-5 или примерно 4,5-5,5. В некоторых вариантах в случае pH 4-5,5 подходящим буферным средством является уксусная кислота/ацетат (например, ацетат натрия), и в случае pH 5,5-6 подходящим буферным средством является лимонная кислота/цитрат. Лимонная кислота/цитрат (например, цитрат натрия) также является подходящим буферным средством в диапазоне pH 3-6 или pH 4-6. В некоторых вариантах буферное средство имеет концентрацию в препарате, составляющую примерно 2-50 мМ или примерно 2-40 мМ, или примерно 2-30 мМ, или примерно 5-30 мМ, или примерно 2-20 мМ, или примерно 5-20 мМ, или примерно 5-15 мМ.

Чтобы минимизировать или избежать дезамидирования варианта CNP, вариант может быть приготовлен в фармацевтически приемлемых органических сорастворителях, таких как глицерин, этанол и пропиленгликоль. Поскольку дезамидирование происходит в результате гидролиза, то замена воды органическим сорастворителем минимизирует контакт варианта CNP с водой. Концентрация одного или нескольких органических растворителей в системе органических-водных растворителей может составлять, например, примерно от 10% до примерно 99% или примерно 100%, если воду не используют.

Также, чтобы минимизировать или избежать дезамидирования варианта CNP, воду можно удалить из препарата лиофилизацией. В некоторых вариантах лиофилизированные препараты содержат любое сочетание из следующих компонентов:

буфер: ацетат натрия и уксусная кислота или цитрат натрия и лимонная кислота;

средство для изотоничности/наполнитель: маннит (например, 3-10%, 2-8% или 4-6%); сахароза (например, 6-20%, 5-15% или 8-12%);

антиоксиданты: метионин и/или аскорбиновая кислота с молярным отношением каждого антиоксиданта к варианту CNP примерно от 0,1:1 до примерно 1:1, или примерно от 0,5:1 до примерно 5:1, или примерно от 1:1 до примерно 15:1, или примерно от 1:1 до примерно 10:1, или примерно от 3:1 до примерно 10:1.

Дезамидирование также может быть минимизировано или его можно избежать посредством хранения композиции CNP (например, жидкого препарата или лиофилизированного препарата) при более низкой температуре, такой как примерно 5°C, 0°C, -10°C, -20°C, -30°C, -40°C, -50°C, -60°C, -70°C, -80°C, -90°C или -100°C.

Чтобы минимизировать или избежать окисления окисляемых остатков (например, метионина) в варианте CNP, вариант может быть приготовлен в виде препарат с одним или несколькими антиоксидантами. Примеры антиоксидантов включают, но без ограничения, метионин, аскорбиновую кислоту и тиоглицерин. Окисление, например, остатков метионина также может быть минимизировано или предотвращено удалением кислорода из жидкой среды (если препарат жидкий) продувкой азотом или аргоном, и/или удалением кислорода из емкости или упаковки продувкой азотом или аргоном.

В некоторых вариантах, чтобы минимизировать или предотвратить адсорбцию (например, адсорбцию варианта CNP на пластике или стекле), к препарату CNP добавляют полисорбат 20, полисорбат 80 или бензиловый спирт или их сочетание. В некоторых вариантах каждый из антиадсорбентов присутствует в концентрации примерно от 0,001% до примерно 0,5%, или примерно от 0,01% до примерно 0,5%, или примерно от 0,1% до примерно 1%, или примерно от 0,5% до примерно 1%, или примерно от 0,5% до примерно 1,5%, или примерно от 0,5% до примерно 2%, или примерно от 1% до примерно 2%. Примерный диапазон(ны) антиадсорбентов в препарате включает без ограничения примерно от 0,001% до примерно 0,5% полисорбата 20, примерно от 0,001% до примерно 0,5% полисорбата 80, и/или примерно от 0,5% до примерно 1,5% бензилового спирта.

В некоторых вариантах жидкий препарат CNP содержит, или лиофилизированный препарат CNP приготовлен из препарата, который содержит, (1) буфер уксусная кислота/ацетат (например, ацетат натрия), имеющий концентрацию примерно 30 мМ ± 5 или 10 мМ буферного средства и pH примерно 4±0,5 или 1, и (2) бензиловый спирт (например, в качестве консерванта и/или антиадсорбента) в концентрации примерно 1% ± 0,5%, и необязательно (3) сахарозу в концентрации примерно 10% ± 5%.

ПРИМЕР 19

Клиническая оценка вариантов CNP

В следующем примере приведено руководство относительно параметров, используемых для клинической оценки композиций, содержащих CNP22 или его варианты, в терапевтических способах согласно настоящему изобретению. Как обсуждается в настоящем описании, CNP22 или его варианты будут использованы для лечения расстройств, отвечающих на CNP, включая расстройства костей и гладкой мускулатуры сосудов. Будут проведены клинические испытания, которые позволят получить оценку доз CNP22 или его вариантов в отношении безопасности, фармакокинетики и начального ответа как в виде косвенных, так и в виде определенных клинических результатов. Испытание будет проведено в течение минимум 24 недели, но не обязательно ограничено указанным сроком, чтобы собрать достаточно информации о безопасности, примерно на 100 оцениваемых пациентах. Начальная доза для испытаний будет варьировать примерно от 0,001 до примерно 1,0 мг/кг/неделю, или будет равна любой из доз, описанных в настоящей публикации. В том случае, когда начальная доза в данном диапазоне не приносит значимой прямой клинической пользы, то дозу следует увеличить в данном диапазоне или свыше данного диапазона, если это необходимо, и поддерживать в течение дополнительного минимального периода 24 недели, но не обязательно ограничивая таким сроком, чтобы затем установить безопасность и оценить эффективность.

Измерения безопасности будут включать неблагоприятные события, аллергические реакции, полную панель клинической химии (включая функции почек и печени), анализ мочи и общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы. Кроме того, будет проведена оценка других параметров, имеющих отношение к клиническим результатам. Настоящий пример также включает определение фармакокинетических параметров CNP22 или его вариантов, включая абсорбцию, распределение, метаболизм, экскрецию и время полужизни и биодоступность в крови. Предполагается, что такие анализы помогут соотнести дозу и клинический ответ.

Способы

Пациенты будут подвергнуты исследованию истории анамнеза и физикальному обследованию исходного уровня и стандартному набору клинических лабораторных тестов (включая общий анализ крови, панель 20, CH50 и UA). Пациенты будут подвергнуты тщательному наблюдению с еженедельными визитами в клинику. Пациенты будут возвращаться в клинику для полного обследования через одну неделю после завершения периода лечения. В случае если требуется повышение дозы, пациенты будут следовать такой же схеме, которая описана выше. Безопасность будет подвергнута контролю на протяжении всего испытания.

Критерии диагностики и критерии включения

Пациенты могут быть мужского или женского пола с подтвержденным документами диагнозом потенциально отвечающего на CNP расстройства. Конкретным примером потенциально отвечающего на CNP связанного с костями расстройства является ахондроплазия, которая может быть подтверждена при генетическом обследовании и посредством другого свидетельства мутации или дисфункции FGFR-3. Идеальным диапазоном возраста пациентов с ахондроплазией будет возраст от младенческого (возраст <1 года) до предподросткового (возраст <13 лет). Пациент(ка) будет исключен из данного исследования, если у пациентки выявлена беременность или лактация; пациент получал лекарственное средство, проходящее испытание, в течение 30 дней перед включением в исследование; или имел состояние здоровья, серьезное интеркуррентное заболевание или другое мешающее обстоятельство, которое может в значительной степени снижать соответствие требованиям исследования.

Безопасность

Терапия CNP22 или его вариантами будет определена как безопасная, если не будут происходить значимые острые или хронические реакции на лекарственное средство во время исследования. Долговременное введение лекарственного средства будет определено как безопасное, если не будет обнаружено значимых аномалий в клинических испытаниях, клинических лабораторных исследованиях или других соответствующих исследованиях.

Было показано, что по сравнению с CNP22 дикого типа некоторые варианты CNP согласно изобретению являются намного более резистентными к расщеплению под действием NEP in vitro, имеют намного более длительное время полужизни в плазме и биодоступность у крыс, стимулируют намного более высокий уровень продукции цГМФ у крыс и/или индуцируют значимо большее увеличение длины длинных костей и длины тела у мышей с ахондроплазией. Кроме того, было показано, что обработки с использованием коротких схем дозирования CNP22 почти также эффективны как непрерывная обработка CNP22 в отношении отмены FGF2-индуцированной задержки роста хондроцитов in vitro. Такие результаты, наряду с прочими, описанными в настоящей публикации, свидетельствуют о применимости вариантов CNP согласно изобретению для лечения отвечающих на CNP состояний или расстройств, таких как, например, связанные с костями расстройства и расстройства гладкой мускулатуры сосудов.

Следует понимать, что каждый вариант осуществления изобретения, описанный в настоящей публикации, необязательно можно сочетать с любым одним или несколькими другими вариантами, описанными в настоящей публикации. Каждый документ патентной литературы и непатентной литературы, цитированный в настоящей публикации, включен в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

Предполагается, что многочисленные модификации и изменения в описании, которые указаны в вариантах и иллюстративных примерах, описанных в настоящей публикации, могут быть осуществлены специалистами в данной области. Поэтому только такие ограничения, которые представлены в прилагаемой формуле изобретения, следует налагать на описание.

1. Натрийуретический пептид С-типа (CNP), где пептид CNP имеет аминокислотную последовательность:
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145).

2. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество CNP по п. 1 и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, для лечения костных нарушений или скелетных дисплазий, где костное нарушение или скелетная дисплазия выбраны из группы, состоящей из остеоартрита, гипофосфатемического рахита, ахондроплазии, гипохондроплазии, низкорослости, карликовости, остеохондродисплазии, танатофорной дисплазии, несовершенного остеогенеза, ахондрогенеза, точечной эпифизарной дисплазии, гомозиготной ахондроплазии, кампомелической дисплазии, наследственной летальной гипофосфатазии, перинатально-летального типа несовершенного остеогенеза, синдрома коротких ребер-полидактилии, ризомелического типа точечной эпифизарной дисплазии, метафизарной остеодисплазии Янсена, врожденной спондилоэпифизарной дисплазии, ателостеогенеза, диастрофической дисплазии, врожденного укорочения бедра, мезомелической дисплазии Лангера, мезомелической дисплазии Нивергельта, синдрома Робиноу, синдрома Рейнхардта, акродизостоза, периферического дизостоза, дисплазии Книста, фиброхондрогенеза, синдрома Робертса, акромезомелической дисплазии, микромелии, синдрома Моркио, синдрома Книста, метатрофной дисплазии и спондилоэпиметафизарной дисплазии.

3. Композиция по п. 2, которая представляет собой лиофилизированный препарат, полученный из препарата, который содержит буфер лимонная кислота/цитрат или буфер уксусная кислота/ацетат, имеющий pH примерно от 4 до примерно 6.

4. Композиция по п. 2, где
(a) лиофилизированный препарат получен из препарата, который дополнительно содержит средство для изотоничности и/или наполнитель, или
(b) лиофилизированный препарат получен из препарата, который дополнительно содержит антиоксидант.

5. Способ лечения костного нарушения или дисплазии скелета, включающий введение натрийуретического пептида С-типа (CNP) по п. 1 или фармацевтической композиции по любому из пп. 2-4 субъекту,
где костное нарушение или дисплазия скелета выбрана из группы, состоящей из остеоартрита, гипофосфатемического рахита, ахондроплазии, гипохондроплазии, низкорослости, карликовости, остеохондродисплазии, танатофорной дисплазии, несовершенного остеогенеза, ахондрогенеза, точечной эпифизарной дисплазии, гомозиготной ахондроплазии, кампомелической дисплазии, наследственной летальной гипофосфатазии, перинатально-летального типа несовершенного остеогенеза, синдрома коротких ребер-полидактилии, ризомелического типа точечной эпифизарной дисплазии, метафизарной остеодисплазии Янсена, врожденной спондилоэпифизарной дисплазии, ателостеогенеза, диастрофической дисплазии, врожденного укорочения бедра, мезомелической дисплазии Лангера, мезомелической дисплазии Нивергельта, синдрома Робиноу, синдрома Рейнхардта, акродизостоза, периферического дизостоза, дисплазии Книста, фиброхондрогенеза, синдрома Робертса, акромезомелической дисплазии, микромелии, синдрома Моркио, синдрома Книста, метатрофной дисплазии и спондилоэпиметафизарной дисплазии.

6. Способ по п. 5, где дисплазия скелета представляет собой ахондроплазию.

7. Способ рекомбинантного получения натрийуретического пептида С-типа (CNP), включающий культивирование в среде клетки-хозяина, содержащей первый полинуклеотид, кодирующий полипептид CNP, связанный со вторым полинуклеотидом, кодирующим отщепляемый пептид или белок, в условиях, которые приводят к экспрессии слитого полипептида, кодируемого полинуклеотидами, выделение экспрессированного слитого полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды и контактирование слитого белка с расщепляющим агентом,
при этом слитый полипептид содержит полипептид CNP, непосредственно связанный с отщепляемым пептидом или белком или связанный с ним опосредованно через линкер, где пептид CNP имеет аминокислотную последовательность:
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145).

8. Способ по п. 7, в котором отщепляемый пептид или белок выбран из группы, состоящей из гистидиновых меток, фактора транскрипции TAF12 человека, фрагментов TAF12, домена укладки гистонов TAF12, мутантов TAF12 и их фрагментов, TAF12(С/А), TAF12(D/E), TAF12(4D/4E), TAF12(6D/6E), TAF 12(10D/10E), TAF12(C/A и D/E), TAF12(С/А и 4D/4E), TAF12(С/А и 6D/6E), TAF12(С/А и 10D/10E), изомеразы кетостероидов, связывающего мальтозу белка, β-галактозидазы, глутатион-S-трансферазы, тиоредоксина, связывающего хитин домена, ВМР-2, мутантов ВМР-2, ВМР-2(С/А) и их мутантов и фрагментов.

9. Способ по п. 7, в котором клеткой-хозяином является бактериальная клетка.

10. Способ по п. 7, в котором слитый полипептид экспрессируется в виде растворимого белка или тельца включения.

11. Способ по п. 7, дополнительно включающий выделение экспрессированного слитого полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды.

12. Способ по п. 11, дополнительно включающий осуществление контакта выделенного слитого полипептида с расщепляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из муравьиной кислоты, бромистого циана (CNBr), гидроксиламина, саморасщепляемого белка, фактора Ха, энтерокиназы, ProTEV и протеазы SUMO.

13. Клетка-хозяин для экспрессии натрийуретического пептида С-типа (CNP), содержащая экспрессирующий вектор, при этом вектор содержит первый полинуклеотид, кодирующий полипептид CNP, связанный со вторым полинуклеотидом, кодирующим отщепляемый пептид или белок, где пептид CNP имеет аминокислотную последовательность:
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145).

14. Клетка-хозяин по п. 13, где клетку-хозяина культивируют в среде в условиях, подходящих для экспрессии слитого полипептида, кодируемого полинуклеотидами, при этом слитый полипептид содержит полипептид CNP, непосредственно связанный с отщепляемым пептидом или белком или связанный с ним опосредованно через линкер.

15. Способ лечения костного нарушения или дисплазии скелета, где костное нарушение или скелетная дисплазия выбраны из группы, состоящей из остеоартрита, гипофосфатемического рахита, ахондроплазии, гипохондроплазии, низкорослости, карликовости, остеохондродисплазии, танатофорной дисплазии, несовершенного остеогенеза, ахондрогенеза, точечной эпифизарной дисплазии, гомозиготной ахондроплазии, кампомелической дисплазии, наследственной летальной гипофосфатазии, перинатально-летального типа несовершенного остеогенеза, синдрома коротких ребер-полидактилии, ризомелического типа точечной эпифизарной дисплазии, метафизарной остеодисплазии Янсена, врожденной спондилоэпифизарной дисплазии, ателостеогенеза, диастрофической дисплазии, врожденного укорочения бедра, мезомелической дисплазии Лангера, мезомелической дисплазии Нивергельта, синдрома Робиноу, синдрома Рейнхардта, акродизостоза, периферического дизостоза, дисплазии Книста, фиброхондрогенеза, синдрома Робертса, акромезомелической дисплазии, микромелии, синдрома Моркио, синдрома Книста, метатрофной дисплазии и спондилоэпиметафизарной дисплазии, включающий введение CNP по п. 1 субъекту,
при этом увеличение уровня по меньшей мере одного ассоциированного с костями или хрящами биомаркера свидетельствует о терапевтическом эффекте, оказываемом CNP на субъекта или состояние или расстройство.

16. Способ по п. 15, в котором по меньшей мере один ассоциированный с костями или хрящами биомаркер выбран из группы, состоящей из CNP, цГМФ, пропептидов коллагена типа II и их фрагментов, коллагена типа II и их фрагментов, остеокальцина, ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), пропептидов проколлагена типа I (PINP) и их фрагментов, коллагена типа I и его фрагментов, аггрекан-хондроитинсульфата и щелочной фосфатазы.

17. Способ увеличения роста трубчатых костей, включающий введение CNP по п. 1 субъекту, нуждающемуся в этом, где введение увеличивает рост трубчатых костей.