Способ ферментации газа, содержащего монооксид углерода
Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ ферментации газообразного субстрата. Способ включает подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в питательную водную среду в биореакторе, где указанная питательная водная среда включает один или несколько анаэробных ацетогенных микроорганизмов. Повышение плотности клеток путем регулирования удельного поглощения CO анаэробными ацетогенными микроорганизмами питательной водной среде, причем скорость изменения удельного поглощения CO включает регулирование скорости подачи CO, причем регулирование скорости подачи CO включает определение скорости подачи CO, определение скорости отвода CO и определение массы клеток. Изменение удельного поглощения CO в интервале от 0.1 до 1.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток. Подачу непрерывного потока водной среды в биореактор, отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора, причем указанные стадии повторяют до достижения нужной производительности по этанолу в интервале от 1 до 50 г/л. Изобретение обеспечивает повышение плотности клеток при микробиологической ферментации газообразного субстрата. 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 5 пр.
Настоящее описание относится к способам ферментации газов, содержащих монооксид углерода. Настоящее описание предлагает способы ферментации газа, содержащего монооксид углерода, для получения одного или нескольких спиртов.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ранее были предложены способы получения химических соединений, таких как органические кислоты, например, уксусная кислота, и спирты, например этанол, путем микробиологической ферментации газов, содержащих монооксид углерода, в среде, содержащей подходящие питательные вещества и следовые количества минералов, с помощью определенных микроорганизмов, таких как род Clostridium. Например, в патенте США №5173429, Gaddy и др., раскрыты Clostridium ljungdahlii ATCC №49587, анаэробные микроорганизмы, производящие этанол и ацетат из синтез-газа. В патенте США №5807722, Gaddy и др., раскрыты способ и аппаратура для превращения отходящих газов в полезные продукты, такие как органические кислоты, с помощью анаэробных бактерий типа Clostridium ljungdahlii ATCC №55380. В патенте США №6136577, Gaddy и др., раскрыты способ и аппаратура для превращения отходящих газов в полезные продукты, такие как органические кислоты и спирты (особенно этанол), с помощью анаэробных бактерий типа Clostridium ljungdahlii ATCC №55988 и 55989.
В патентной заявке США №20070275447 раскрыты бактерии Clostridium (Clostridium carboxidivorans, ATCC BAA-624, "P7"), способные синтезировать из отходящих газов продукты, применяемые в качестве биотоплива. В патенте США №7704723 раскрыты бактерии Clostridium (Clostridium ragsdalei, ATCC BAA-622, "P7"), способные синтезировать из отходящих газов продукты, применяемые в качестве биотоплива.
В патенте WO 2007/117157 описано использование Clostridium autoethanogenum (Accession No. DSM 10061, DSMZ, Germany) для получения этанола путем анаэробной ферментации субстратов, содержащих монооксид углерода. В WO 2009/064200 раскрыты другие бактерии (Clostridium autoethanogenum, Accession No. DSM 19630, DSMZ, Germany) для получения этанола анаэробной ферментацией субстратов, содержащих монооксид углерода.
Как известно, скорость образования химических соединений типа спиртов зависит от плотности клеток в ферментационной среде. Соответствующая высокая плотность клеток в биореакторе необходима для достижения и поддержания высокой скорости образования химических веществ.
В патенте США №6136577, Gaddy, раскрыт способ получения этанола ферментацией с использованием рецикла клеток для повышения их плотности.
В патенте США №7285402, Gaddy и др., раскрыт способ микробиологической ферментации для получения спирта, где предложен способ повышения плотности клеток при запуске процесса с использованием исходной культуры в избытке H2.
Запуск ферментации с использованием порции инокулята из посевной культуры обеспечивает качественный инокулят, не содержащий примесей, но не всегда удачный из-за довольно малой плотности клеток, особенно если параметры процесса, такие как скорость газа и скорость перемешивания, увеличивают слишком быстро сразу после инокуляции.
В настоящее время нужны усовершенствованные способы повышения плотности клеток в микробиологической ферментации газообразного субстрата. Настоящее изобретение предлагает ускоренный способ повышения плотности клеток в способах микробиологической ферментации газообразного субстрата.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение раскрывает способ получения одного или нескольких спиртов из газообразного субстрата, включающий: ферментацию газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (CO), в водной среде в биореакторе; указанный способ включает повышение плотности клеток путем регулирования удельного поглощения CO указанной водной средой; причем скорость изменения удельного поглощения CO включает регулирование скорости поглощения CO; изменение скорости удельного поглощения CO включает определение скорости подачи CO; определение скорости отвода CO; определение массы клеток; причем способ включает также изменение удельного поглощения CO в заданных количествах; а указанные заданные количества включают интервал от примерно 0.001 до примерно 10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; указанные заданные количества включают интервал от примерно 6.01 до примерно 5.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; указанные заданные количества включают интервал от примерно 0.1 до примерно 1.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; кроме того, способ включает подачу потока водной среды в биореактор, отвод потока ферментационного бульона из биореактора; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора; причем указанная водная среда содержит один или несколько микроорганизмов, включая биологически чистые микроорганизмы, природные микроорганизмы, не встречающиеся в природе микроорганизмы, не встречающиеся в природе генетически модифицированные микроорганизмы, мутанты природных микроорганизмов, мутанты не встречающихся в природе микроорганизмов, рекомбинантные микроорганизмы, микроорганизмы, полученные методом генной инженерии, искусственно синтезированные микроорганизмы; причем указанный биореактор включает один или несколько реакторов; указанный биореактор включает установку рецикла клеток; причем указанный CO-содержащий субстрат содержит водород; кроме того способ включает подачу питательной среды в указанный биореактор.
В одном варианте настоящее описание предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; причем указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO; регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO в интервале от примерно 0.01 до примерно 10 ммоль/мин/грамм сухих клеток.
В другом варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; причем указанный способ включает изменение заданного удельного поглощения CO с шагами в интервале от примерно 0.01 до примерно 10 ммоль/мин/грамм сухих клеток, регулирование потока газообразного субстрата таким образом, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO; повторение указанных шагов до достижения нужной плотности клеток в интервале от примерно 0.1 до примерно 15 г/л; после достижения указанной нужной плотности клеток переход к непрерывной работе.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO; регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно указанному заданному удельному поглощению CO в интервале от примерно 0.01 до примерно 10 ммоль/мин/грамм сухих клеток.
В другом варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO с шагами в интервале от примерно 0.01 до примерно 10 ммоль/мин/грамм сухих клеток, регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно указанному заданному удельному поглощению CO; повторение указанных шагов до достижения нужной плотности клеток в интервале от примерно 0.1 до примерно 15 г/л; после достижения указанной нужной плотности клеток переход к непрерывной работе.
Настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (CO), в водную среду в биореакторе; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает повышение плотности клеток путем регулирования удельного поглощения CO одним или несколькими указанными микроорганизмами в указанной водной среде; в одном варианте скорость изменения удельного поглощения включает один или несколько шагов; в одном варианте скорость изменения удельного поглощения CO включает регулирование скорости подачи CO; в другом варианте скорость изменения удельного поглощения CO включает определение скорости подачи CO; определение скорости отвода CO и определение массы клеток; способ также включает изменение удельного поглощения CO в заданных количествах в интервале от примерно 0.001 до примерно 10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; в другом варианте указанные заданные количества включают интервал от примерно 0.01 до примерно 5.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; в одном варианте указанные заданные количества включают интервал от примерно 0.1 до примерно 1.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; в другом варианте способ включает подачу непрерывного потока водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора; причем указанные шаги повторяют до достижения нужной производительности по этанолу в интервале от примерно 1 до примерно 50 г/л; в другом варианте способ включает подачу непрерывного потока водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора; причем указанные шаги повторяют до достижения заданной концентрации этанола в ферментационном бульоне в интервале от примерно 1 до примерно 50 г/л.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO; регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO в интервале от примерно 0.01 до примерно 10 ммоль/мин/грамм сухих клеток.
В другом варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO с шагами в интервале от примерно 0.01 до примерно 10 ммоль/мин/грамм сухих клеток, регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO; причем указанные шаги повторяют до достижения заданной плотности клеток в интервале от примерно 0.1 до примерно 15 г/л; после достижения желательной плотности клеток переход к непрерывной работе.
Настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает определение плотности клеток; регулирование подачи газообразного субстрата для повышения плотности клеток; изменение удельного поглощения в заданных количествах в интервале от примерно 0.001 до примерно 10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO; регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO в интервале от примерно 0.01 до примерно 10 ммоль/мин/грамм сухих клеток.
В другом варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO с шагами в интервале от примерно 0.01 до примерно 10 ммоль/мин/грамм сухих клеток, регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO; указанные шаги повторяют до достижения нужной плотности клеток в интервале от примерно 0.1 до примерно 15 г/л; после достижения желательной плотности клеток переход к непрерывной работе.
Варианты способа по настоящему изобретению, в которых указанные микроорганизмы включают один или несколько видов биологически чистых анаэробных ацетогенных бактерий; причем указанные микроорганизмы включают один или несколько видов природных биологически чистых анаэробных ацетогенных бактерий; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе биологически чистых анаэробных ацетогенных бактерий; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе биологически чистых анаэробных ацетогенных бактерий, анаэробных ацетогенных бактерий, полученных путем генетического модифицирования с помощью использования ацетогенных бактерий в качестве организма-хозяина; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе биологически чистых анаэробных ацетогенных бактерий, полученных внедрением генов анаэробных ацетогенных бактерий в организм хозяина.
В одном варианте указанные микроорганизмы по настоящему изобретению включают один или несколько видов микроорганизмов, в том числе: биологически чистые микроорганизмы, природные микроорганизмы, не встречающиеся в природе микроорганизмы, генетически модифицированные не встречающиеся в природе микроорганизмы, мутанты природных микроорганизмов, мутанты не встречающихся в природе микроорганизмов, рекомбинантные микроорганизмы, микроорганизмы, полученные методом генной инженерии, искусственно синтезированные микроорганизмы, причем указанные микроорганизмы выбирают из Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacteiium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693), Clostiidium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантного организма (DSM 24138) и их смесей.
Вариант способа по настоящему изобретению, в котором указанные микроорганизмы включают один или несколько штаммов Clostridium ljundahlii, или один или несколько штаммов Clostridium ragsdalei, или один или несколько штаммов Clostridium carboxidivorans, или один или несколько штаммов Clostridium autoethanogenum.
Вариант способа по настоящему изобретению, в котором указанные микроорганизмы включают один или несколько генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением одного или нескольких выбранных генов в организм хозяина, который выбирают из любых штаммов Clostridium ljundahlii, или любых штаммов Clostridium ragsdalei, или любых штаммов Clostridium carboxidivorans, или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.
Вариант способа по настоящему изобретению, в котором указанные микроорганизмы включают один или несколько видов генетически модифицированных организмов, полученных внедрением в любой организм хозяина одного или нескольких генов из любых штаммов Clostridium ljundahlii, или любых штаммов Clostridium ragsdalei, или любых штаммов Clostridium carboxidivorans, или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.
Вариант способа по настоящему изобретению, в котором указанный биореактор включает один или несколько реакторов; указанный биореактор включает установку для рецикла клеток; указанный СО-содержащий субстрат содержит водород.
Вариант включает также подачу питательной среды в указанный биореактор.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1 представляет схему, иллюстрирующую вариант способа микробиологической ферментации газообразного субстрата.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если не указано иное, следующие термины в этом изобретении определены приведенным ниже образом и могут включать либо единственную, либо множественные формы указанных ниже определений.
Термин «примерно» модифицирует любое количество и относится к вариации этого количества в реальных условиях поддержания культуры микроорганизма, например, в лаборатории, пилотной установке или производственной аппаратуре. Например, количество ингредиента или мера в смеси или любое количество, модифицированные словом «примерно», включают вариации и степень точности, обычно применяемые при определении в условиях эксперимента на производстве или в лаборатории. Например, количество компонента продукта, модифицированное словом «примерно», включает вариации порций в разных экспериментах на производстве или в лаборатории и вариации, присущие методу анализа. Независимо от того, модифицированы количества словом «примерно» или нет, количества включают эквиваленты этих количеств. Любое приведенное здесь количество, модифицированное термином «примерно», можно использовать в настоящем изобретении так же, как и количество, не модифицированное термином «примерно».
Термин «ацетоген» или «ацетогенный» относится к бактерии, которая генерирует ацетат в качестве продукта анаэробного дыхания. Эти организмы также называют ацетогенными бактериями, т.к. все известные ацетогены являются бактериями. Ацетогены находят в различных средах обычно в анаэробных условиях (отсутствие кислорода). Ацетогены могут использовать в качестве источников энергии и углерода различные соединения; лучшие изученные формы ацетогенного метаболизма включают использование диоксида углерода как источника углерода и водорода как источника энергии.
Термины «биореактор», «реактор» или «биореактор для ферментации» включают устройство для ферментации, состоящее из одного или нескольких сосудов и/или колонн или трубопроводов, которое включает проточный реактор с мешалкой (CSTR), барботажную колонну, газлифтный ферментер, миксер периодического действия или другие устройства, осуществляющие контакт газ-жидкость. В способе по данному изобретению биореактор для ферментации может включать культивационный реактор, из которого получаемый ферментационный бульон подают во второй ферментационный биореактор, в котором получают основную массу продукта.
Термин «плотность клеток» означает массу клеток микроорганизмов на единицу объема ферментационного бульона, например, г/литр.
Термин «рецикл клеток» означает вариант отделения жидкости (пермеата) от твердых микроорганизмов в ферментационном бульоне и возвращение всех или части указанных отделенных клеток твердых микроорганизмов обратно в ферментер, в котором получают указанный ферментационный бульон с использованием указанных микроорганизмов. Обычно для указанного разделения используют фильтрование. На фильтре получают поток пермеата, не содержащего твердых микроорганизмов, и поток концентрированных твердых микроорганизмов. Поток пермеата, не содержащего твердых частиц, может содержать твердые частицы размером меньше заданного.
Термин «конверсия» означает часть введенного количества, которая превратилась в продукт(ы); она обозначена в следующем уравнении: (введенное количество - количество на выходе)/(введенное количество).
Термин «производительность по этанолу» означает количество этанола, полученного на единицу объема ферментера в сутки. Объем ферментера является эффективным объемом или объемом жидкости в ферментере.
Термин «ферментация» означает ферментацию CO до спиртов и ацетата. Известно множество бактерий, способных проводить ферментацию CO до спиртов, в том числе бутанола и этанола, а также уксусной кислоты, пригодных для использования в способе по настоящему изобретению. Примеры таких бактерий включают род Clostridium, например, штаммы Clostridium ljungdahlii, в том числе описанные в WO 2000/68407, ЕР 117309, US Patent Nos. 5173429, 5593886 и 6368819, WO 1998/00558 и WO 2002/08438, штаммы Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 и DSM 19630 of DSMZ, Germany), включая описанные в WO 2007/117157 и WO 2009/151342, и Clostridium ragsdalei (PI 1, ATCC BAA622), включая описанные соответственно в патенте США №7704723 и "Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas," Hasan Atiyeh, изданной в трудах Oklahoma EPSCoR Annual State Conference, April 29, 2010, и Clostridium carboxidivorans (ATCC BAA-624), описанные в патентной заявке США №20070275447. Другие подходящие бактерии включают бактерии рода Moorella, в том числе Moorella sp HUC22-1, и бактерии рода Carboxydothermus. Содержание каждой из этих публикаций полностью введено здесь ссылками. Кроме того, специалисты в данной области могут выбрать другие бактерии для применения в способе по данному изобретению. Важно подчеркнуть, что в способе по настоящему изобретению можно применять смешанную культуру из двух или нескольких бактерий. Одним из видов микроорганизмов, пригодных для применения в настоящем изобретении, является Clostridium autoethanogenum. Ферментацию можно проводить в любом подходящем биореакторе, таком как проточный реактор с мешалкой (CTSR), барботажная колонна (BCR) или реактор с орошаемым слоем (TBR). Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах данного изобретения биореактор может включать первый культивационный реактор, в котором культивируют микроорганизмы, и второй реактор для ферментации, в который подают ферментационный бульон из культивационного реактора и в котором получают основную часть продукта (этанола и ацетата).
Термин «ферментационный бульон» означает: состав ферментационной среды включает все, что приводит к образованию ферментационного бульона, включая сырые субстраты, продукты ферментации, микроорганизм(ы) и производные компоненты, химические добавки, нутриенты, газы. В ферментационном бульоне присутствуют все три основные фазы: твердая, жидкая и газообразная, между которыми возможно взаимодействие.
Термин «ген» означает сегмент ДНК; он может включать области, предшествующие и следующие за кодирующей ДНК, а также интроны между экзонами; ген может быть единицей наследственности; в данном описании термин «ген» включает сегмент ДНК, который вносит вклад в фенотип/функцию; сегменты ДНК, которые транскрибируются клетками в РНК и транслируются, по крайней мере частично, в белки; последовательность оснований, состоящих из комбинаций A, T, C и G. В целом, как предложено в данном изобретении, это определение может иметь либо единственное, либо множественное значение.
Термин «микроорганизм» или «микроб» включает бактерии, грибки, дрожжи, археи и протисты; микроскопические растения (называемые зелеными водорослями); и животные, такие как планктон, планарии и амебы. Иногда сюда включают также вирусы, но их часто считают неживыми. Микроорганизмы живут во всех частях биосферы, где есть жидкая вода, включая грунт, горячие источники, дно океана, высокие слои атмосферы и провалы в скалах земной коры. Микроорганизмы критичны для рецикла нутриентов в экосистемах, т.к. они действуют как деструкторы. Микробы также применяют в биотехнологии, в производстве традиционной пищи и напитков и в современных генно-инженерных технологиях. Важно, что в данном изобретении можно применять микроорганизмы смешанных штаммов, которые могут содержать или не содержать штаммы разных микроорганизмов. Также важно, что с помощью направленной эволюции можно селективно подобрать микроорганизмы для применения в настоящем изобретении. Также очевидно, что технология на основе рекомбинантной ДНК позволяет создать микроорганизмы путем использования выбранных штаммов существующих микроорганизмов. Также с помощью технологии химического мутагенеза (мутирование бактериальной ДНК в присутствии различных химических соединений) можно создавать микроорганизмы путем подбора штаммов существующих микроорганизмов. Важно, что в настоящем изобретении можно применять бактерии, способные превращать CO и воду или H2 и CO2 в этанол и уксусную кислоту. Некоторые примеры полезных бактерий включают Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacijicus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693,), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali PII (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантный микроорганизм (DSM 24138J и их смеси. Специалист в данной области может выбрать другие бактерии для использования в этих способах. В целом, как показано в данном изобретении, определение может иметь единственное или множественное значение.
Термин «питательная среда» включает среду для культивирования микроорганизмов, которая может содержать один или несколько витаминов и минералов, способствующих культивированию выбранного микроорганизма. Компоненты разнообразных питательных сред, пригодных для применения в настоящем изобретении, известны и опубликованы в предшествующих работах, например, в Международной патентной заявке №WO 2008/00558, патенте США №7285402, патенте США №5807722; патенте США №5593886 и патенте США №5821111.
Термин «удельное поглощение CO» означает количество CO в молях, поглощенное единицей массы клеток микроорганизмов (г) в единицу времени в минутах, например ммоль/г/мин.
Термин «субстрат» означает вещество, которое под действием ферментов или микроорганизмов образует продукт. Например, сахар в ферментации сахара ферментом с образованием этанола; CO, CO2 и H2 в ферментации сингаза микроорганизмами для получения одной или нескольких карбоновых кислот и спиртов.
Термин «сингаз» или «синтез-газ» означает синтез-газ; так называется газовая смесь, содержащая различные количества монооксида углерода и водорода. Примеры способов получения синтез-газа включают паровой риформинг природного газа или углеводородов для получения водорода, газификацию угля и некоторые виды производств по газификации отходящих газов с получением энергии. Это название происходит от его применения в качестве интермедиата при получении синтетического природного газа (SNG), аммиака или метанола. Сингаз также используют как промежуточный продукт в производстве синтетической нефти, используемой в качестве топлива или смазки, путем синтеза Фишера-Тропша и ранее метода Мобил для превращения метанола в керосин. Сингаз состоит в основном из водорода, монооксида углерода и очень часто некоторого количества диоксида углерода.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (CO), в водную среду в биореакторе; причем указанная среда содержит один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает повышение плотности клеток путем регулирования удельного поглощения CO одним или несколькими видами микроорганизмов в указанной водной среде; причем изменение скорости удельного поглощения CO включает установление и/или регулирование одного или нескольких следующих шагов: регулирование скорости подачи CO; определение скорости отвода CO; определение массы клеток; кроме того, способ включает изменение удельного поглощения CO в заданных количествах; причем указанные заданные количества включают интервал примерно 0.001-10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; необязательно в одном варианте указанные заданные количества включают интервал примерно 0.01-5.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток и/или интервал примерно 0.1-1.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток; один вариант необязательно включает непрерывный поток водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора; повторение указанных шагов до достижения желательной производительности по этанолу в интервале примерно 1-50 г/л; один вариант необязательно включает подачу непрерывного потока водной среды в биореактор; отвод потока ферментационного бульона из биореактора; повторение указанных шагов до достижения заданной концентрации этанола в ферментационном бульоне в интервале примерно 1-50 г/л.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; причем указанная водная среда содержит один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO; регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO в интервале примерно 0.01-10 ммоль/мин/грамм сухих клеток.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего моноокисид углерода, в водную среду в биореакторе; причем указанная водная среда содержит один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO с шагами в интервале примерно 0.01-10 ммоль/мин/грамм сухих клеток, регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO; повторение указанных шагов до достижения заданной плотности клеток в интервале примерно 0.1-15 г/л; после достижения заданной плотности клеток переход на непрерывную работу.
Настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; причем указанная водная среда содержит один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает определение плотности клеток; регулирование подачи газообразного субстрата для повышения плотности клеток; изменение удельного поглощения CO в заданных количествах в интервале примерно 0.001-10.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; причем указанная водная среда содержит один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO; регулирование потока газа таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO в интервале примерно 0.01-10 ммоль/мин/грамм сухих клеток.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; причем указанная водная среда содержит один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает выбора заданного удельного поглощения CO с шагами в интервале примерно 0.01-10 ммоль/мин/грамм сухих клеток; регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO; повторение указанных шагов до достижения заданной плотности клеток в интервале 0.1-15 г/л; после достижения указанной нужной плотности клеток переход на непрерывную работу.
В одном из вариантов предложен способ по настоящему изобретению, в котором указанные микроорганизмы включают: один или несколько видов биологически чистых анаэробных ацетогенных бактерий; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов природных анаэробных ацетогенных бактерий; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе генетически модифицированных анаэробных ацетогенных бактерий, полученных с использованием анаэробных ацетогенных бактерий в качестве организма-хозяина; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных внедрением генов анаэробных ацетогенных бактерий в организм хозяина.
В качестве варианта предложен способ по настоящему изобретению, в котором указанные микроорганизмы включают один или несколько видов бактерий, которые выбирают из Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacijicus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubqcterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантного микроорганизма (DSM 24138) и их смесей.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанные микроорганизмы включают один или несколько штаммов Clostridium ljundahlii, или один или несколько штаммов Clostridium ragsdalei, или один или несколько штаммов Clostridium carboxidivorans, или один или несколько штаммов Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанные микроорганизмы включают один или несколько генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением одного или нескольких выбранных генов в организм хозяина, который выбирают из любых штаммов Clostridium ljundahlii, или любых штаммов Clostridium ragsdalei, или любых штаммов Clostridium carboxidivorans, или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанные микроорганизмы включают один или несколько генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением в любой организм хозяина одного или нескольких генов из любых штаммов Clostridium ljundahlii, или любых штаммов Clostridium ragsdalei, или любых штаммов Clostridium carboxidivorans, или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор включает один или несколько реакторов; в котором указанный биореактор включает установку для рецикла клеток; а указанный субстрат, содержащий СО, включает водород.
В одном варианте способа включает также подачу питательной среды в указанный биореактор.
На фиг. 1 представлен способ получения химических соединений, таких как смесь спиртов, из газообразного субстрата, такого как сингаз, содержащего монооксид углерода, путем ферментации с помощью бактерий, причем этот способ включает биореактор (100), содержащий ферментационный бульон с указанными клетками бактерий и ферментационную среду. Поток газообразного субстрата, содержащего CO (101), можно подавать в биореактор вместе с потоком ферментационной среды (102). Поток ферментационного бульона (110) с указанными клетками бактерий и указанные полученные химические соединения можно отводить из указанного биореактора. Поток отходящего газа из ферментера (120), включающий неиспользованную часть указанного потока газообразного субстрата, отводят из биореактора. В одном варианте поток ферментационного бульона (110) подают в аппарат для рецикла клеток (200), в котором клетки концентрируют и возвращают (220) в биореактор. Поток пермеата (210) из указанной аппаратуры для рецикла клеток направляют на стадию выделения указанных химических соединений. В одном варианте по меньшей мере часть потока ферментационного бульона (110) направляют на стадию выделения указанной смеси спиртов. В одном варианте по меньшей мере часть потока ферментационного бульона (210) направляют на стадию выделения указанной смеси спиртов.
В одном варианте биореактор (100) снабжен мешалкой (105), чтобы облегчить контакт газообразного потока субстрата и усилить массоперенос газообразного субстрата в жидкую ферментационную среду. Желательно установить хорошую скорость массопереноса и таким образом обеспечить перемешивание в биореакторе во время ферментации.
Имеется несколько вариантов отбора образцов потока газа, содержащего газовый субстрат, введенного в биореактор (101), и отходящего газа из биореактора (120) (не показаны на фиг.1). Есть вариант отбора образцов ферментационного бульона из реактора (не показан на фиг. 1). Указанные газообразные и жидкие образцы отбирают через определенные интервалы времени и анализируют на поглощение или образование различных компонентов газа, образование различных продуктов и оптическую плотность ферментационного бульона.
Эти величины можно использовать для расчета удельного поглощения (SCU) монооксида углерода (CO) и плотности клеток в ферментационном бульоне в реакторе с помощью следующих уравнений:
Поглощение СО, ммоль/мин = (ммоль/мин введенного СО) - (ммоль/мин отведенного СО) (1);
Плотность клеток, г/л = (оптическая плотность) (фактор разбавления) (константа массы клеток) (2);
Масса клеток, г = (плотность клеток) (объем биореактора) (3);
Удельное поглощение СО, ммоль/мин/г = (поглощение СО)/(масса клеток) (4).
Плотность клеток - это масса клеток на единицу объема ферментационного бульона в ферментере. Объем реактора - это объем жидкости в биореакторе в отсутствие перемешивания. Масса клеток - это масса (г) сухих клеток бактерий на литр ферментационного бульона с оптической плотностью, равной единице (1). Оптическая плотность - это оптическая плотность образца, полученного после разбавления ферментационного бульона подходящим растворителем, таким как солевой раствор.
Микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут включать один или несколько видов биологически чистых анаэробных ацетогенных бактерий.
Микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут включать один или несколько видов природных анаэробных ацетогенных бактерий; один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий; один или несколько видов не встречающихся в природе генетически модифицированных анаэробных ацетогенных бактерий, полученных с использованием анаэробных ацетогенных бактерий в качестве организма хозяина; один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных внедрением генов анаэробных ацетогенных бактерий в организм хозяина.
Микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут включать один или несколько видов бактерий, которые выбирают из Acetogenium kivui, Acetobacteiium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyn'bacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostn'dium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693 J, Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali PI 1 (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, recombinant microorganism (DSM 24138J и их смесей.
В одном варианте микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, включают один или несколько штаммов Clostridium ljundahlii, или один или несколько штаммов Clostridium ragsdalei, или один или несколько штаммов Clostridium carboxidivorans, или один или несколько штаммов Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, включают один или несколько генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением одного или нескольких генов в организм хозяина, выбранный из любых штаммов Clostridium ljundahlii, или любых штаммов Clostridium ragsdalei, или любых штаммов Clostridium carboxidivorans, или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, включают один или несколько видов генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением в любой организм хозяина одного или нескольких генов из любых штаммов Clostridium ljundahlii или любых штаммов Clostridium ragsdalei или любых штаммов Clostridium carboxidivorans или любых штаммов Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает определение плотности клеток и повышение плотности клеток путем регулирования подачи газообразного субстрата и повышения удельного поглощения CO. В одном варианте способ по настоящему изобретению включает определение плотности клеток и повышение плотности клеток путем регулирования подачи газообразного субстрата и уменьшения удельного поглощения CO. В одном варианте способ по настоящему изобретению включает определение плотности клеток и постепенное повышение плотности клеток до желаемой путем регулирования подачи газообразного субстрата и повышения удельного поглощения CO. В другом варианте способ по настоящему изобретению включает определение плотности клеток и постепенное повышение плотности клеток до желаемой путем регулирования подачи газообразного субстрата и уменьшения удельного поглощения CO. В одном варианте способ по настоящему изобретению включает определение плотности клеток и повышение плотности клеток путем постепенного повышения удельного поглощения CO до нужного удельного поглощения CO. В другом варианте способ по настоящему изобретению включает определение плотности клеток и повышение плотности клеток путем постепенного уменьшения удельного поглощения CO до нужного удельного поглощения CO. В другом варианте способ по настоящему изобретению включает определение плотности клеток, повышение плотности клеток и постепенное повышение производительности по этанолу до нужной производительности по этанолу путем повышения удельного поглощения CO. В другом варианте способ по настоящему изобретению включает определение плотности клеток, повышение плотности клеток и постепенное повышение производительности по этанолу до нужной производительности по этанолу путем повышения удельного поглощения CO. В одном варианте изменение удельного поглощения CO включает пошаговое повышение заранее определенной величины. В другом варианте изменение удельного поглощения CO включает пошаговое уменьшение заранее определенной величины. В одном варианте стадии изменения заданной величины включают изменение с одинаковым шагом. В одном варианте стадии изменения заданной величины включают изменение с неодинаковым шагом.
В одном варианте, если плотность клеток меньше заданного значения, способ включает выбор заданного удельного поглощения CO и регулирование потока газа, содержащего газовый субстрат, таким, чтобы удельное поглощение CO стало равным заданному удельному поглощения CO.
В одном варианте, если плотность клеток меньше заданного значения, способ включает выбор заданного удельного поглощения CO и регулирование потока газа, содержащего газовый субстрат, таким, чтобы удельное поглощение CO стало равным заданному удельному поглощения CO; и повторный выбор заданного удельного поглощения CO и регулирование потока газа, содержащего газовый субстрат, таким, чтобы удельное поглощение CO стало равным заданному удельному поглощения CO.
Величина указанного удельного поглощения CO может составлять примерно 0.1-10.0 ммоль CO в минуту на грамм сухих микроорганизмов. Величина заданного удельного поглощения CO может составлять примерно 0.1-10.0 ммоль/мин/г.
Величина заданной плотности клеток может составлять примерно 0.1-50 г/л. Величина заданной плотности клеток может составлять примерно 0.5-50 г/л.
Величина заданной производительности по этанолу составляет 1-50 г/л/сутки.
Величина заданной концентрации этанола в ферментационном бульоне составляет 1-20 г/л.
Обычно в лабораторном биореакторе типа New Brunswick Bioflow I скорость мешалки в интервале 300-900 оборотов в минуту (об/мин) обеспечивает адекватное перемешивание для регулирования нужной скорости массопереноса. В другом варианте скорость мешалки находится в интервале 500-700 об/мин. В одном варианте скорость мешалки находится в интервале 550-650 об/мин. В другом варианте скорость мешалки составляет примерно 600 об/мин. В другом варианте для реактора большего масштаба с объемом примерно 100-500 л скорость мешалки составляет примерно 50-500 об/мин. В одном варианте для промышленного биореактора объемом примерно 100000-1000000 л скорость мешалки составляет примерно 1-50 об/мин. В различных вариантах биореактор большего размера требует меньшей скорости перемешивания по сравнению с реактором меньшего размера.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает регулирование температуры в биореакторе в интервале 25-50°C.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор представляет собой один реактор. В другом варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор включает два или более реакторов.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор включает установку для рецикла клеток.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный поток газа, содержащий газовый субстрат, содержащий CO, включает также водород. В одном варианте указанный поток газа, содержащий газовый субстрат, содержащий CO, представляет собой сингаз. В одном варианте указанный поток газа, содержащий газовый субстрат, содержащий CO, включает отходящий газ сталелитейного производства. В другом варианте указанный поток газообразного субстрата, содержащего CO, представляет собой сингаз, полученный газификацией углеродных материалов, в том числе биомассы.
В одном варианте один или несколько ферментеров для культивирования или посева бактерий предлагают начальный посевной материал бактериальных клеток. В другом варианте один или несколько культивационных или посевных ферментеров продолжают поставлять клетки бактерий в биореактор согласно способу по данному изобретению. В одном варианте по настоящему изобретению способ включает рецикл клеток.
Способ получения смеси спиртов, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореакторе; причем указанная водная среда содержит один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO с шагом в интервале примерно 0.01-10 ммоль/мин/грамм сухих клеток, регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному поглощению CO; повторение указанных шагов до достижения заданного удельного поглощения CO в интервале примерно 0.01-10 ммоль/мин/грамм сухих клеток; кроме того, подачу непрерывного потока водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.
Способ получения смеси спиртов включает подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореактор; указанная водная среда содержит один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения CO в интервале примерно 0.01-10 ммоль/мин/грамм сухих клеток, регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному поглощению CO; повторение указанных шагов до достижения заданной производительности по этанолу в интервале примерно 1-50 г/л; кроме того, подачу непрерывного потока водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.
Способ получения смеси спиртов включает подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода, в водную среду в биореактор; указанная водная среда содержит один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает выбор заданного удельного поглощения СО в интервале примерно 0.01-10 ммоль/мин/грамм сухих клеток, регулирование потока газообразного субстрата таким, чтобы удельное поглощение CO было равно заданному удельному поглощению CO; повторение указанных шагов до достижения заданной концентрации этанола в ферментационном бульоне в интервале примерно 1-50 г/л; кроме того, подачу непрерывного потока водной среды в биореактор; отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора
Предполагается, что способ по настоящему изобретению включает: периодический процесс, полупериодический процесс, периодический процесс с подпиткой, переход от периодического к непрерывному процессу и непрерывный процесс.
Настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (CO), в водной среде в биореакторе; указанная водная среда содержит один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает определение плотности клеток; определение скорости введения CO; определение удельного поглощения CO; регулирование скорости подачи CO для повышения плотности клеток такой, чтобы удельное поглощение CO варьировалось в заданных количествах; необязательно повторение этих операций.
Питательная среда включает среду для культивации микроорганизмов, которая может содержать один или несколько витаминов и минералов, способствующих выращиванию выбранных микроорганизмов. В таблице 1 предложен вариант питательной среды по настоящему изобретению. Известна и другая питательная среда, пригодная для данного изобретения.
Кроме того, в настоящем изобретении можно использовать питательную среду, которая здесь не описана, но приготовлена из различных компонентов, приведенных в таблице 1. Настоящее изобретение предлагает улучшенные композиции питательной среды.
Таблица 1. Компоненты среды и их концентрации
| Компонент/ион | Добавлено в виде | Конц-ия, м.д. |
| NH4 | NH4Cl/(NH4)2HPO4 | ≤838 |
| Fe | FeCl2·4H2O | ≤17 |
| Mi | NiCl2·6H2O | ≤0.2 |
| Co | CoCl2·6H2O | ≤1.0 |
| Se | Na2SeO3 | ≤0.1 |
| Zn | ZnSO4·7H2O | ≤0.5 |
| Mo | Na2MoO4·2H2O | ≤0.3 |
| Mn | MnCl2·4H2O | ≤0.2 |
| B | H3BO3 | ≤1.1 |
| Cu | CuCl2·2H2O | ≤0.15 |
| W | Na2WO4·2H2O | ≤1.2 |
| K | KCl | ≤79 |
| Mg | MgCl2·6H2O | ≤60 |
| Na | NaCl | ≤80* |
| Ca | CaCl2·H2O | ≤55 |
| Цистеин·HCl | Цистеин·HCl | ≤250 |
| PO4 | H3PO4/(NH4)2HPO4 | ≤820 |
| Пантотеновая кислота | Пантотеновая кислота | ≤0.04 |
| Биотин | Биотин | ≤0.02 |
| Тиамин | Тиамин | ≤0.05 |
| * Концентрация Na+ только из NaCl. Она не включает Na из других компонентов типа Na2WO4·2H2O. | ||
| ** Концентрация Са+2 не включает ионы кальция из соли кальция пантотеновой кислоты (например, d-пантотенат кальция). |
ПРИМЕРЫ
Сравнительный пример (см. пример 11 из США 7285402)
Для приготовления запаса посевных культур в реакторе выращивали культуры Clostridium ljungdahlii, штамм С-01 (АТСС Accession No. 55988), в 150 мл бутылках с сывороткой на CO, CO2 и H2 в среде, содержащей 1 г/л дрожжевого экстракта и 1 г/л триптиказы, в солях и витаминах. Концентрация витамина составляла 0.4 мл/л среды водного раствора, содержащей 50.5 мг/л пантотената кальция, 20.6 мг/л d-биотина и 50.6 мг/л тиамина HCI. Бутылки инкубировали при 37°C во встряхиваемом инкубаторе. Культуры выращивали до фазы экспоненциального роста по визуальному наблюдению. При каждой инокуляции переносили примерно 90 мл запасной культуры из бутылки с сывороткой в 1 л среды, что составляло 9% объема инокуляции. Удачная инокуляция описана ниже. Для получения удачного инокулята всю процедуру повторяли несколько раз.
Удачный инокулят, 90 мл/л, добавили в 1 л порцию основной среды, содержащей 0.4 мл/л витаминов и солей (момент времени t=0). Скорость перемешивания составила 240 об/мин и pH 5.3, температура 38.5°C и время пребывания газа (непрерывный поток газа) 110 минут. Газовое сырье содержало 62% H2, 31% CO и 7% C2H6. Через 13 час (t=13 час) отметили некоторую конверсию CO и при t=23 час скорость перемешивания увеличили от 240 об/мин до 300 об/мин. Время пребывания газа уменьшили до 100 мин в момент времени t=27 час, и в момент времени t=46 час время пребывания газа уменьшили еще раз. Также скорость перемешивания увеличили до 100 об/мин в моменты времени t=28 час, 59 час, 72 час и 85 час.
При t=110 час система работала с временем пребывания газа 80 минут и скоростью перемешивания 600 об/мин. Концентрация клеток составила 0.5 г/л, и конверсия CO была равна 35%. Конверсия Н2 не наблюдалась, но некоторые количества этанола и ацетата (примерно 1 г/л каждого) накопились в бульоне данной порции. Вплоть до этого момента времени наблюдали повышение числа клеток в реакторе.
Поток среды с такой же концентрацией, как в основной среде, был подан при скорости 0.4 мл/мин в момент времени t=120 час. Затем была начата программа номинального повышения скорости газа, скорости перемешивания и скорости среды при тщательном сохранении избытка H2 в системе. В момент времени t=210 час концентрация этанола составила 17 г/л, концентрация ацетата 1 г/л, концентрация клеток 1.6 г/л, конверсия CO почти 100% и конверсия N2 90%. Производительность по этанолу достигла 11.4 г/л-сутки.
Снова запустили программу постепенного повышения скорости газа. Одновременно увеличили количество витамина и достигли скорости подачи витамина 0.7 мл/л среды. В момент времени t=610 час реактор производил 20 г/л этанола и примерно 2 г/л ацетата. Конверсия CO составила почти 100%, а конверсия H2 85%. Производительность по этанолу достигла 14 г/л-сутки.
Ферментационная среда в примерах 1-5 содержала один или несколько компонентов из приведенных в таблице 1.
Пример 1: Clostridium ljungdahlii PETC; запуск реактора с регулированием удельного поглощения монооксида углерода для повышения количества газа
Реактор New Brunswick bioflow I с ферментационной средой запустили при скорости активного культивирования штамма Clostridium ljungdahlii PETC, равной 0.32 г/л. Скорость перемешивания в реакторе в начале опыта установили равной 600 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали во время всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали в интервале примерно 38.5-39°C. Образцы подаваемого в биореактор сингаза и отходящего газа из биореактора и ферментационного бульона биореактора отбирали через определенные промежутки времени, например, пробы подаваемого газа, отходящего газа и ферментационного бульона примерно один раз в сутки, каждые два часа и каждые четыре часа соответственно. Указанные образцы анализировали на поглощение или образование различных компонентов газа, концентрацию ацетата в бульоне и оптическую плотность (плотность клеток) культуры. Во время опыта свободный объем реактора поддерживали на уровне 1300-1400 мл.
Таким образом, удельное поглощение CO (SCU) определили с помощью приведенных выше уравнений (1)-(4).
В этом конкретном примере заданное значение SCU установили от 0.75 до 0.89 ммоль/мин/г клеток. Кроме того, скорость газообразного потока в реактор не увеличивали до того, как культура поглощала 80% CO, поданного в реактор в данной точке.
В этом конкретном опыте система рецикла клеток (CRS) была присоединена к реактору до начала опыта. Через 18.6 час после посева добавили непосредственно в среду 60 мл культивационной среды и затем подали поток среды в реактор со скоростью 0.41 мл/мин. Через 21.5 час после посева скорость потока питательных веществ в реактор увеличили до 1.1 мл/мин и через систему рецикла клеток отбирали из реактора 1 мл/мин пермеата. Указанная стадия была проведена для того, чтобы предотвратить накопление ингибирующих количеств уксусной кислоты и этанола в культуре и чтобы доставить к культуре адекватные количества питательных веществ.
Плотность клеток повышали со временем и довели до 3 г/л клеток через 45 час после посева в реактор. В этой точке культура выдала более 6 г/л этанола и примерно 8 г/л уксусной кислоты.
В этом конкретном опыте pH культуры поддерживали между 4.69 и 4.71.
После начала активного культивирования бактерий в реакторе (когда плотность клеток в реакторе достигла величины, примерно на 50% превышающей начальную плотность клеток), в культуру добавляли композицию витаминов (кроме витаминов, уже находящихся в среде), если концентрация уксусной кислоты в культуральном бульоне была ниже заданной величины. Критерий для добавления в культуру витаминной композиции был следующим: если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было меньше примерно 2.5 г/л, добавляли примерно 0.34 мл витаминов на литр культуры; если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было меньше примерно 2 г/л, добавляли примерно 0.67 мл витаминов на литр культуры; если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было меньше примерно 1.5 г/л, добавляли примерно 1 мл витаминов на литр. Использованная композиция витаминов включала:
| Биотин | 0.08-1 мкМ |
| Тиамин HCl | 0.12-1.5 мкМ |
| Кальций d-пантотенат | 0.15-2 мкМ |
Наряду с биотином, тиамином и пантотенатом кальция к образцу РЕТС добавили витамины АТСС (catalog No. MD-VS) до конечной концентрации 1% (от ферментационной среды).
Пример 2: Clostridium ljungdahlii C-01
Биореактор New Brunswick Bioflow I с примерно 1.5 л (например, в интервале 1.45-1.65 л) ферментационной среды был запущен в присутствии примерно 0.3 г/л активно растущего штамма Clostridium ljungdahlii C-01. Скорость перемешивания в реакторе в начале опыта установили равной 600 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали во время всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали в интервале примерно 36-37.5°C. Следующие образцы отбирали и анализировали через разные промежутки времени (например, через 1-4 часа): подаваемого в биореактор сингаза; отходящего газа из биореактора; ферментационного бульона биореактора. Анализ образцов позволил определить: поглощение различных компонентов газа, получение различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты, концентрацию этанола и оптическую плотность ферментационного бульона.
Таким образом, определили удельное поглощение CO (SCU) с помощью приведенных выше уравнений (1)-(4).
Вначале с помощью указанных уравнений рассчитали подачу сингаза для величины SCU примерно 1.4 ммоль/мин/г и поток сингаза поддерживали на рассчитанном уровне, пока плотность клеток не увеличилась до величины примерно 1.5 г/л.
После того, как плотность клеток достигла примерно 1.5 г/л, регулируемую величину SCU уменьшили до примерно 1.2 ммоль/мин/г. После этого, как только масса клеток в реакторе достигла уровня примерно 2.5 г/л, регулируемую величину SCU уменьшили до примерно 1.0 ммоль/мин/г. Масса клеток возрастала во времени и достигла ожидаемой массы клеток примерно 2.8 г/л в течение примерно 79 час после посева в реактор. В этой точке культура вырабатывала более примерно 20 г/л этанола.
Через 13.97 час был подан поток среды для посева в реактор со скоростью примерно 0.2 мл/мин (примерное время удерживания клеток примерно 125 час).
Через примерно 28.08 час после начала поток посевной среды в реактор увеличили до примерно 0.5 мл/мин (примерное время удерживания клеток примерно 52 час). В ходе опыта pH поддерживали около примерно 4.5.
Постепенное уменьшение регулированного значения SCU при запуске этой процедуры имеет целью облегчить постепенный перевод культуры на низкое значение SCU (между примерно 0.7 и примерно 0.9 ммоль/мин/г), поддерживаемое в реакторе во время производства (стационарное состояние).
Приведенный способ требует менее примерно 80 час для выполнения поставленной цели по массе клеток (примерно 2.8 г/л) в реакторе.
Пример 3: Clostridium autoethanogenum
Биореактор New Brunswick Bioflow 1 с примерно 1.5 л (например, 1.45-1.65 л) ферментационной среды был запущен с активно растущими Clostridium autoethanogenum при концентрации примерно 0.47 г/л. Скорость перемешивания в реакторе в начале опыта установили равной 600 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали во время всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали в интервале примерно 36-37.5°C. Следующие образцы отбирали и анализировали через различные промежутки времени (например, через 1-4 часа): подаваемого в биореактор сингаза; отходящего газа из биореактора; ферментационного бульона биореактора. Анализ образцов позволил определить поглощение различных компонентов газа, образование различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты, концентрацию этанола и оптическую плотность ферментационного бульона.
Таким образом, определили удельное поглощение CO (SCU) с помощью приведенных выше уравнений (1)-(4).
Вначале с помощью указанных уравнений рассчитали подачу сингаза для величины SCU примерно 0.4 ммоль/мин/г и поток сингаза поддерживали на рассчитанном уровне, пока плотность клеток не увеличилась. Поток газа, соответствующий заданному значению SCU примерно 0.4 ммоль/мин/г, поддерживали в течение примерно 19 час. Между 19 и 21 час после посева заданное значение SCU составляло примерно 0.5 ммоль/мин/г. Через 21 час после посева заданное значение SCU было регулировано равным примерно 0.6. Масса клеток возрастала со временем и достигла величины примерно 3 г/л в течение примерно 79 час после посева в реактор. В этой точке культура вырабатывала более примерно 15 г/л этанола. Через 26 час после посева поток среды для посева в реактор подали со скоростью примерно 0.1 мл/мин (примерное время удерживания клеток примерно 240 час). Через 50 час после посева поток среды для посева в реактор увеличили до примерно 0.2 мл/мин (примерное время удерживания клеток примерно 119 час). Через примерно 71 час поток среды для посева в реактор увеличили до примерно 0.5 мл/мин (примерное время удерживания клеток примерно 50 час). Во время всего опыта pH поддерживали на уровне примерно 4.5.
Пример 4: Clostridium autoethanogenum
Биореактор New Brunswick Bioflow I с примерно 1.5 л (например примерно 1.45-1.65 л) ферментационной среды был запущен с активно растущими Clostridium autoethanogenum при концентрации примерно 0.47 г/л. Скорость перемешивания в реакторе в начале опыта установили равной 600 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали во время всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали в интервале примерно 36-37.5°C. Следующие образцы отбирали и анализировали через разные промежутки времени (например, через 1-4 часа): подаваемого в биореактор сингаза; отходящего газа из биореактора; ферментационного бульона биореактора. Анализ образцов позволил определить: поглощение различных компонентов газа, получение различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты, концентрацию этанола и оптическую плотность ферментационного бульона.
Таким образом, определили удельное поглощение CO (SCU) с помощью приведенных выше уравнений (1)-(4).
Вначале с помощью указанных уравнений рассчитали подачу сингаза для величины SCU примерно 0.6 ммоль/мин/г и поток сингаза поддерживали на рассчитанном уровне, пока плотность клеток не увеличилась. Через примерно 26 час после посева заданное значение SCU установили равным примерно 0.7. Масса клеток возрастала со временем и достигла примерно 2.97 г/л в течение примерно 64 час после посева в реактор. В этой точке культура вырабатывала более примерно 18 г/л этанола. Через 18.3 час после посева поток среды для посева в реактор запустили со скоростью примерно 0.1 мл/мин (примерное время удерживания клеток примерно 242 час). Через примерно 41.6 час поток среды для посева в реактор увеличили до примерно 0.2 мл/мин (примерное время удерживания клеток примерно 121 час). Во время опыта pH поддерживали около примерно 4.5.
Пример 5: Butyribacterium methylotrophicum (ATCC 33266); запуск реактора с регулированием удельного поглощения монооксида углерода для увеличпения количества газа.
В этом опыте протестировали способ запуска процедуры поглощения монооксида углерода неклостридиальным ацетогеном.
Этот опыт был запущен в биореакторе New Brunswick bioflow I с 1.31 г/л активно растущих Butyhbacterium Methylotrophicum в описанной выше ферментационной среде. Скорость перемешивания в реакторе в начале опыта установили равной 700 об/мин. Такую скорость перемешивания поддерживали в течение всего опыта. Температуру в биореакторе во время опыта поддерживали на уровне примерно 38.5-38.6°C. Образцы подаваемого в биореактор газа и отходящего газа из биореактора и ферментационного бульона в биореакторе отбирали через промежутки времени, например, образцы подаваемого газа, отходящего газа и ферментационного бульона отбирали примерно ежедневно, раз в два часа и раз в четыре часа соответственно. Указанные образцы анализировали на поглощение или получение различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты в бульоне, концентрацию этанола в бульоне и оптическую плотность (плотность клеток) культуры. Во время опыта свободный объем реактора поддерживали на уровне между 1150 и 1100 мл.
Таким образом, определили удельное поглощение CO (SCU) с помощью уравнений (1)-(4), приведенных выше.
В этом конкретном примере заданное значение SCU установили равным 0.8 ммоль/мин/г клеток.
Для сохранения устойчивости культуры скорость потока газа в реактор не увеличивали, если культура не поглощала 80% CO, подаваемого в реактор в любой данной точке. В этом опыте система рецикла клеток (CRS) была присоединена к реактору до начала опыта. Поток ферментационной среды (питательных веществ) в реактор подавали со скоростью 1 мл/мин и через CRS отбирали из реактора 0.9 мл/мин пермеата.
Плотность клеток в реакторе возрастала во времени и достигла 5.27 г/л клеток через 24 час после посева в реактор. В этой точке культура вырабатывала более 15 г/л этанола, 0.3 г/л бутанола и более 2 г/л уксусной кислоты.
В этом конкретном опыте pH культуры поддерживали между 4.67 и 4.71.
Специалисты в данной области могут осуществить многие модификации и вариации настоящего изобретения, не отклоняясь от его объема, включая конкретные варианты, примеры, формулу, заявку и т.д. Все опубликованные документы включены здесь ссылками.
1. Способ ферментации газообразного субстрата, включающий:
подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (CO), в питательную водную среду в биореакторе, где указанная питательная водная среда включает один или несколько анаэробных ацетогенных микроорганизмов;
повышение плотности клеток путем регулирования удельного поглощения CO одним или несколькими указанными анаэробными ацетогенными микроорганизмами в указанной питательной водной среде, причем скорость изменения удельного поглощения CO включает регулирование скорости подачи CO, причем регулирование скорости подачи CO включает определение скорости подачи CO, определение скорости отвода CO и определение массы клеток;
изменение удельного поглощения CO в интервале от 0.1 до 1.0 ммоль/мин/грамм сухих клеток;
подачу непрерывного потока водной среды в биореактор, отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора, причем указанные стадии повторяют до достижения нужной производительности по этанолу в интервале от 1 до 50 г/л.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий подачу потока водной среды в биореактор, отвод ферментационного бульона из биореактора.
3. Способ по п. 1, дополнительно включающий подачу непрерывного потока водной среды в биореактор, отвод непрерывного потока ферментационного бульона из биореактора.
4. Способ по п. 1, в котором указанные анаэробные ацетогенные микроорганизмы выбраны из: биологически чистых микроорганизмов; природных микроорганизмов; не встречающихся в природе микроорганизмов; не встречающихся в природе генетически модифицированных микроорганизмов; мутантов природных микроорганизмов; мутантов не встречающихся в природе микроорганизмов; рекомбинантных микроорганизмов; микроорганизмов, полученных методом генной инженерии, искусственно синтезированных микроорганизмов.
5. Способ по п. 1, в котором указанный биореактор включает один или несколько реакторов.
6. Способ по п. 1, в котором указанный биореактор включает установку для рецикла клеток.
7. Способ по п. 1, в котором указанный CO-содержащий субстрат включает водород.
