Применение катепсина н

Группа изобретений относится к медицине и касается применения катепсина Н для идентификации соединений, которые модулируют нейропатическую боль. Группа изобретений также касается применения клетки, гетерологично экспрессирующей катепсин Н или его функциональный фрагмент, для идентификации соединений, которые модулируют нейропатическую боль; применения катепсин Н-нокаутной клетки для идентификации или анализа соединений, которые модулируют нейропатическую боль; способа идентификации или анализа соединений, модулирующих и/или предотвращающих нейропатическую боль. Группа изобретений обеспечивает идентификацию соединений, которые модулируют нейропатическую боль. 16 н.п. ф-лы, 1 пр., 11 ил.

 

Настоящее изобретение относится к применению катепсина H. Другие аспекты изобретения относятся к способам скрининга лекарственных средств, диагностирования чувствительности к боли и лечения боли.

В западном мире хроническая боль является одной из основных нерешенных проблем здравоохранения, подрывающих здоровье и благополучие миллионов граждан. Хроническая боль серьезно ухудшает самочувствие испытывающего ее субъекта, и обычно ей сопутствуют или после нее наблюдаются вегетативные признаки, которые часто приводят к депрессии. Хроническая боль приводит к страданию отдельного человека и огромным социально-экономическим издержкам. Существующие виды фармакологической терапии боли часто являются неудовлетворительными как с точки зрения эффективности, так и безопасности.

С учетом серьезных недостатков, связанных с состоянием в области средств лечения боли, существует значительная потребность в новых средствах лечения уже существующей боли и диагностики и прогноза возможного развития хронической боли. Особенно в свете огромного разрыва между быстро растущим пониманием нейробиологии боли и неудовлетворенной клинической потребностью в предоставлении эффективных способов лечения, лишенных недостатков способов лечения существующего уровня техники, усилия должны быть направлены на открытие новых целей для новых классов анальгетиков.

Таким образом, целью настоящего изобретения является создание нового средства для разработки и предоставления новых классов лекарственных средств, модулирующих боль.

Указанная задача решается путем применения катепсина H или его функциональных фрагментов или производных для идентификации соединений, которые модулируют боль и особенно нейропатическую боль.

Изобретение основано на неожиданном открытии авторов изобретения, впервые показавших, что экспрессия катепсина H тесно коррелирует с чувствительностью к боли на мышиных моделях нейропатической боли.

Боль, согласно определению международной ассоциации по изучению боли, является неприятным сенсорным и эмоциональным переживанием, ассоциированным с реальным или потенциальным повреждением тканей, или описывается в терминах такого повреждения. Боль обычно является следствием активации ноцицептивной нервной системы, которая специализируется на обнаружении и кодировании повреждения или потенциального повреждения ткани. Таким образом, боль является частью системы сигнализации организма для инициации реакций по минимизации реального или потенциального повреждения организма. Боль может быть первичным симптомом медицинского состояния или может быть вторичным эффектом болезненного состояния, часто без какого-либо биологического значения.

Боль может быть острой или хронической. Острая боль является физиологическим сигналом о потенциальной или реальной травме. Появление боли сопровождается повреждением ткани, инфекцией, воспалением или другими острыми состояниями, предупреждая субъекта об опасности после телесного повреждения или нарушения функции. Если острую боль не лечить должным образом, это может привести к хронической боли.

Хроническая боль является болезненным состоянием, характеризующимся различным происхождением, продолжительностью, интенсивностью и специфическими симптомами.

Хроническая боль может быть ноцицептивного происхождения, воспалительного или нейропатического. Считается, что ноцицептивная боль соответствует текущей активации соматических или висцеральных нервных волокон, чувствительных к боли. Нейропатическая боль является болью, возникающей вследствие любого вида повреждения периферической или центральной нейрональной ткани; считают, что она поддерживается аберрантными соматосенсорными процессами в периферической нервной системе, в ЦНС или в обеих указанных системах. (Для обзора механизмов боли см., например, Scholz and Woolf, 2002; Julius and Basbaum, 2001, Woolf and Mannion, 1999; Wood, J.D., 2000; Woolf and Salter, 2000.)

Хроническая нейропатическая боль варьирует среди пациентов. Недавно полученные данные показывают, что индивидуальная чувствительность к боли играет важную роль для уровня индивидуального страдания, т.е. существует значительная наследственная предрасположенность к боли, в частности, к развитию нейропатической боли. Настоящее изобретение основано на обширных исследованиях авторов, которые направлены на идентификацию генов чувствительности к боли (т.е. генов, которые определяют степень боли, ощущаемой при наличии данной фиксированной степени повреждения ткани) в моделях хронической боли у грызунов. Модели на грызунах и экспериментальные параметры, используемые авторами изобретения, обеспечивали экспериментальные условия, при которых среди различных субъектов a) можно точно контролировать характер и равномерность нервного повреждения и b) можно минимизировать генетическую вариабельность и вариабельность, вызванную внешней средой.

Катепсин H (CTSH; альтернативные названия согласно Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology (http://atlasgeneticsoncology.org): ACC-4, ACC-5, CPSB, DKFZp686B24257, EC 3.4.22.16, MGC1519, алеураин, миницепь) является лизосомальной протеазой.

Генный локус катепсина H человека находится на хромосоме 15q24-125 (см., например, Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology). Ген содержит 12 экзонов, охватывающих свыше 23 kb геномных последовательностей. Нуклеотидная последовательность препрокатепсина H человека была опубликована, например, Fuchs and Gassen, 1989, Nucleic Acids Res. 17: 9471-9471. Генная структура катепсина H крысы была опубликована, например, Ishidoh et al, FEBS Letters, 1989, Vol. 253, number 1, 2, 103-107. Геномную последовательность CTSH homo sapiens на хромосоме 15 можно найти, например, на главной странице NCBI под номером доступа NG_009614.1 (SEQ ID NO:1).

Ген катепсина H имеет TATA- и CAAT-лишенный промотор и расположенный выше экзона 1 один бокс GC. Две различные формы кДНК катепсина H были обнаружены в тканях простаты и раковых клеточных линиях: непроцессированная форма (CTSH) и процессированная форма с делецией 12 аминокислот в области сигнального пептида (CTSHdelta 10-21) (см. Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology). Длина транскрипта препрофермента составляет 1005 п.н. Кодирующая полинуклеотидная последовательность катепсина H находится в открытом доступе в базе данных нуклеотидных последовательностей NCBI под несколькими номерами доступа, а именно: BC006878 (CTSH, полная кодирующая последовательность, mus musculus, SEQ ID NO:4, NM_004390.3 (CTSH Homo sapiens, транскриптный вариант 1 мРНК (SEQ ID NO:2), NM_148979.2 (CTSH Homo sapiens, транскриптный вариант 2 мРНК (SEQ ID NO:3)). Специалисту в данной области известно, как найти другие кодирующие или геномные последовательности катепсина H в базе данных NCBI (катепсин H других видов; мутанты или различные изоформы катепсина H, если существуют). Если в дальнейшем упоминается кодирующая последовательность катепсина H, это может означать любую из указанных выше мРНК или кодирующих последовательностей; причем последовательности согласно SEQ ID NO:2, 3 и 4 являются предпочтительными примерами.

Белковая последовательность катепсина H находится в открытом доступе в базе данных белков NCBI, например, под следующими номерами доступа: препробелок изоформы катепсина H homo sapiens (hs): NP_004381 (SEQ ID No:8); предшественник изоформы b hs: NP:683880 (SEQ ID NO:9); катепсин H мыши (mus musculus): препробелок: NP_031827; изоформа CRA_a mus musculus: EDL20900, изоформа CRA_b mus musculus: EDL20901; катепсин H крысы (Rattus norvegicus): NP_037071; изоформа CRA-a (Rattus norvegicus) катепсина H: EDL77562, изоформа CRA-b (Rattus norvegicus) катепсина H: EDL77563, катепсин H. Кроме того, последовательность белка находится в открытом доступе в базе данных UniProtKB (www.beta.uniprot.org), под номерами доступа: P09668 (HUMAN_CATH, катепсин H человека, SEQ ID NO:5). Если далее упоминается белок или аминокислотная последовательность катепсина H, это может означать любую из указанных выше белковых последовательностей или транслированных белковых последовательностей из перечисленных выше кодирующих последовательностей; например, следующих последовательностей: SEQ ID NO:5, 6, 7, 8 или 9.

NCBI является национальным центром биотехнологической информации (почтовый адрес: National Centre for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; web-adress: www.ncbi.nhm.nih.gov). Дополнительные последовательности (например, последовательности, имеющие номера доступа SwissProt или EMBL) можно найти в базе данных UniProtKB по www.beta.uniprot.org.

Катепсин H является лизосомальной протеазой с аминопептидазной и слабой эндопептидазной функцией. Он принадлежит к семейству C1 (папаин-подобных) цистеинпротеаз. Белок катепсина H синтезируется в виде препрофермента из 335 аминокислот и протеолитически процессируется в активную одиночную цепь внутри эндосом или лизосом. Наряду с тяжелой и легкой цепью (называемых вместе длинной цепью), катепсин H содержит так называемую миницепь "EPQNCSAT", которая образуется из пропептида. (О структуре катепсина H см. также Turk et al., Biological Chemistry, 1997). Миницепь, по-видимому, участвует в аминопептидазной активности катепсина H и играет ключевую роль в распознавании субстрата. Показано, что рекомбинантная форма катепсина H человека, не имеющая миницепи, является эндопептидазой (Valiljeva et al, 2003). Эндопептидазными субстратами катепсина H являются, например: Bz-Arg+NHNap, Bz-Arg+NH-Mec, Bz-Phe-Val-Arg+NHMec. Катепсин H обладает дипептидил-пептидазной активностью в отношении субстратов: Pro-Gly+Phe и Pro-Arg+NHNap. Он обладает аминопептидазной активностью в отношении субстратов: H-Arg-NH-Mec, Bz-Arg-NH-Mec, Bz-Arg-NH-Mec и H-Cit-NH-Mec (см., например, Rothe and Dodt, 1992; Bz=бензоил, NH-Mec=e-метилкумарил-7-амид; Cit=цитруллин). Природными ингибиторами катепсина H являются цистатины, альфа2-макроглобулин, а также антигены, полученные из мышиных цитотоксических лимфоцитов CTLA-2beta.

Катепсин H экспрессируется повсеместно с наиболее высоким уровнем в почках. Его экспрессия может быть повышена в некоторых раковых тканях. Катепсин располагается преимущественно в эндосомально-лизосомальном компартменте, но также секретируется до некоторой степени и циркулирует в крови.

Функции катепсина H включают, как правило: протеазную активность, например, гидролазную активность, пептидазную активность, например аминопептидазную, дипептидилпептидазную, экзопептидазную или эндопептидазную активность, трансацилазную активность (см. Koga et al., 1991); расщепление перечисленных выше субстратов; расщепление нативного C5 и образование хемотаксина C5a, процессинг гидрофобного сурфактант-ассоциированного белка C, расщепление и/или деградация фибронектина и фибриногена. Более конкретно, он участвует в качестве лизосомальной цистеинпротеазы во внутриклеточной деградации белка. Он участвует в образовании хемотаксина C5a путем расщепления нативного C5. Катепсин H участвует в процессинге гидрофобного сурфактант-ассоциированного белка C. Кроме того, он, по-видимому, участвует в образовании нестабильных атеросклеротических бляшек и, возможно, также в начальном атерогенезе.

Применение по настоящему изобретению предусматривает идентификацию новых веществ для предотвращения и/или лечения боли и особенно нейропатической боли. Применение по настоящему изобретению включает идентификацию соединений с желательными характеристиками (т.е. снижение болевой чувствительности), а также идентификацию соединений с нежелательными характеристиками (т.е. увеличение болевой чувствительности). Кроме того, настоящее изобретение предусматривает дополнительную характеристику соединений, уже идентифицированных как пригодные для предотвращения и/или лечения какого-либо заболевания или болезненного состояния. В этом случае настоящее изобретение можно использовать, например, для исключения идентифицированных активных соединений, обладающих нежелательными побочными эффектами (т.е. увеличение болевой чувствительности): соединения-кандидаты для данного заболевания, например, могут быть профилированы по их влиянию на катепсин H (белок и/или нуклеиновая кислота, экспрессия и/или функция, и т.д.).

Соединение/тестируемое соединение/активное соединение, которое применяют в различных аспектах настоящего изобретения может представлять собой любое биологическое или химическое вещество или экстракт природного продукта, очищенный, частично очищенный, синтезированный или изготовленный посредством биохимических или молекулярно-биологических методов.

Соединение, рассматриваемое как активное в модулировании боли, в смысле различных аспектов настоящего изобретения может представлять собой любое вещество, оказывающее влияние на одну из функций катепсина H или на количество катепсина H (белка или нуклеиновой кислоты) в клетке, на экспрессию катепсина H, посттрансляционную модификацию (например, N-гликозилирование или процессинг (например, расщепление), сворачивание белка или активацию.

В связи с этим, вещество может модулировать любую из функций катепсина H (например, функции, которые перечислены выше или ниже). Активность белка катепсина H может быть модулирована веществом, например, путем непосредственного взаимодействия и интерференции полипептида/белка катепсина H или его фрагментов. Вещество также может модулировать экспрессию катепсина H, например, на уровне транскрипции (инициации, элонгации, процессинга и т.д.), стабильность транскрипта, трансляцию. Кроме того, оно может модулировать посттрансляционную модификацию, процессинг из неактивной в активную форму (расщепление препроформы до активного белка), а также сворачивание белка и т.д. катепсина H. Вещество может проявлять указанные выше эффекты непосредственно или косвенно (в значении косвенно, т.е. путем взаимодействия (положительного или отрицательного) с природными сигнальными каскадами, оказывающими влияние на функцию катепсина H/белковую активность/экспрессию и т.д.).

Функции катепсина H включают функции, которые перечислены выше, например, протеазную активность; способность удалять дипептиды с аминоконца одного или более белковых субстратов; способность специфически взаимодействовать с одним или более белковыми субстратами (белок-белковое взаимодействие), такими как субстраты, перечисленные выше; способность расщеплять и/или активировать один или более белковых субстратов, таких как субстраты, перечисленные выше; способность процессировать белковые или пептидные субстраты, такие как субстраты, перечисленные выше, способность ингибироваться одним из ингибиторов, которые перечислены выше.

Функции катепсина H включают обычно также способность белка катепсина H или нуклеиновой кислоты или их фрагментов взаимодействовать с другими молекулами (включая, но не ограничиваясь ими: белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, синтетические молекулы) и предпочтительно относятся к его способности взаимодействовать с белковыми субстратами и расщеплять их.

Под субстратом фермента понимают, в терминах настоящей заявки, любую молекулу, которая может быть модифицирована ферментом. Природные субстраты в объеме настоящего изобретения представляют собой молекулы, которые соответствуют форме, в которой они находятся в природной физиологической или патологической ситуации (такие как молекулы, перечисленные выше), и которые также могут быть модифицированы соответствующим ферментом.

Модуляция боли и особенно нейропатической боли может представлять собой либо уменьшение, либо увеличение.

Согласно одному аспекту настоящей группы взаимосвязанных изобретений может быть использован фрагмент или производное катепсина H. Фрагмент может представлять собой фрагмент белка, полипептида или полинуклеиновой кислоты.

Фрагмент белка или полипептида представляет собой белок или полипептид, который содержит одну или более концевых областей (n- и/или c-концевые) и/или внутренние делеции одной, двух или более аминокислот, по сравнению с примерами непроцессированного катепсина H; фрагменты включают, например, домены и/или фрагменты, которые перечислены в описании фигуры 7 (см. ниже).

Функциональный фрагмент белка катепсина H представляет собой любой фрагмент данного белка, обладающий по меньшей мере одной или более функциональными характеристиками непроцессированного белка, особенно которые перечислены выше.

Фрагмент полинуклеотидной кислоты представляет собой полинуклеотидную кислоту или олигонуклеотид, содержащий одну или более концевых областей (5'- и/или 3'-) и/или внутренние делеции одного, двух или более нуклеотидов, по сравнению с непроцессированной геномной или кодирующей последовательностью. Функциональный фрагмент нуклеиновой кислоты катепсина H представляет собой любой фрагмент, обладающий по меньшей мере одной или более функциональными характеристиками непроцессированной полинуклеиновой кислоты (мРНК, геномная или кодирующая последовательность).

Термин “производное катепсина H” включает любой тип модификации катепсина H по сравнению с природной формой, и особенно по сравнению с катепсином H согласно SEQ ID NO:5, 6, 7, 8 или 9, которая не является делецией. Функциональное производное катепсина H представляет собой любое производное указанного белка, обладающее по меньшей мере одной и предпочтительно двумя или более функциональными характеристиками немодифицированного белка. Производные включают, например, модификации аминокислотной или нуклеотидной последовательности или любой другой вид модификации, такой как химическая или биологическая модификация, приводящая, например, к стабилизации полипептида или полинуклеотида (например, фосфоротиоатные модификации основной цепи нуклеиновой кислоты или замены связей между аминокислотами и т.д.), или придание специфической направленности полипептиду или полинуклеотиду к определенным клеткам, или облегчение их проникновения в клетки или их захвата клетками (такие как проникающие в клетку фосфопептиды, ортоприсоединение к проникающим в клетку пептидным векторам, например, на основе Antennapedia/проникновения, последовательности на основе TAT и сигнальных пептидов; или соединение с частями лигандов специфических переносчиков или импортеров).

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению не являющегося человеком трансгенного животного, гетерологично экспрессирующего катепсин H или его функциональный фрагмент, для идентификации или анализа соединений, которые модулируют боль и особенно нейропатическую боль.

Не являющееся человеком животное может представлять собой любое животное, которое не является человеком. Предпочтительными являются грызуны, такие как крысы или мыши.

Трансгенное животное представляет собой животное, которое содержит в своем геноме чужеродную ДНК, которая была преднамеренно перенесена туда. Введение чужеродной ДНК в геном животного может быть осуществлено в соответствии со стандартными методиками (см., например, Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook. C.A. Pinkert, editor; Academic Press Inc., San Diego, California, 1994 (ISBN: 0125571658).

Термин “гетерологичная экспрессия” относится к экспрессии, отличающейся от обычной экспрессии гена в организме-хозяине (в отношении уровня устойчивого состояния, количества, времени или распределения в тканях экспрессированного гена или в отношении типа экспрессированного гена (т.е. ген в обычных условиях вообще не экспрессируется в хозяине)). Гетерологичная экспрессия может быть конститутивной или индуцируемой. Подходящие индуцируемые системы экспрессии хорошо известны в данной области (например, тетрациклин-индуцируемая система или т.п.). Организмом может быть клетка или не являющееся человеком животное.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению не являющегося человеком трансгенного животного, гетерологично экспрессирующего катепсин H или его функциональный фрагмент, в качестве модельной системы для повышенной болевой чувствительности, особенности чувствительности к нейропатической боли.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению не являющегося человеком животного, нокаутного по гену катепсина H, для идентификации или анализа соединений, которые модулируют боль и особенно нейропатическую боль.

“Нокаутный организм” (например, животное или клетка) относится к организму, в котором экспрессия или функция гена частично или полностью делетируется и включает геномный и функциональный нокауты, индуцируемый и конститутивный нокауты. Создание нокаутных организмов хорошо известно в данной области, так же, как и клетки или животные, которые могут быть использованы для создания нокаутных организмов. Создание катепсин H-нокаутных мышей описано Pham and Ley, 1999.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению не являющегося человеком животного, нокаутного по гену катепсина H, в качестве модельной системы для пониженной болевой чувствительности и особенно пониженной чувствительности к нейропатической боли.

Применение клетки, гетерологично экспрессирующей катепсин H или его функциональный фрагмент, для идентификации соединений, которые модулируют боль, особенно нейропатическую боль, является другим аспектом настоящего изобретения.

Клетка может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку, такую как клетки, способные к трансфекции нуклеиновокислотным вектором и экспрессии гена-репортера. Клетки включают, прежде всего, первичные клетки и клетки клеточной культуры, например, культуры эукариотических клеток, включая клетки, полученные от многоклеточных организмов и тканей (такие как клетки HeLA, CHO, COS, SF9 или 3T3) или от одноклеточных организмов, таких как дрожжи (например, s. pombe или s. cerevisiae), или из культуры прокариотических клеток, предпочтительно Pichia или E.coli. Клетки и образцы, извлеченные из ткани, могут быть получены хорошо известными методами, такими как забор крови, пункция тканей или хирургические методы.

Согласно одному варианту осуществления используют модифицированную клетку, обладающую более низкой активностью катепсина H по сравнению с ее немодифицированным состоянием. Таким образом, можно, например, проверить, способны ли соединения, подлежащие тестированию, усилить или восстановить пониженную или полностью отсутствующую активность катепсина Н. Или можно проверить, способны ли вещества выполнять свою функцию (например, модуляцию боли или такую же функцию при другом болезненном состоянии или заболевании) в условиях пониженной болевой чувствительности.

Модификация может представлять собой любой тип модификации (стабильная или транзиторная, предпочтительно стабильная), которая приводит к снижению активности катепсина H, уровня устойчивого состояния транскрипта катепсина H (т.е. за счет активации транскрипции катепсина H или стабилизации транскрипта) или уровня устойчивого состояния белка катепсина H (т.е. за счет активации трансляции катепсина H или его посттрансляционного процессинга; путем модуляции посттрансляционной модификации катепсина H или путем активации его стабилизации или с путем ингибирования его деградации). Указанное выше можно успешно осуществить, например, путем применения доминантных негативных мутантов катепсина H, антисмысловых олигонуклеотидов, конструкций на основе РНКи катепсина H, путем создания функциональных или геномных нокаутов катепсина H (которые могут быть, например, индуцируемыми) или других подходящих методов, известных на современном уровне развития техники. Для обзора указанных выше методов см., например: Current protocols in Molecular biology (2000) J. G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc.; Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press; Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function, 2000; Antisense Therapeutics, 1996; Scherr et al, 2003.

Согласно одному варианту осуществления используют нокаутную по гену катепсина H клетку. Клеточные линии, подходящие для создания нокаутов, хорошо известны на существующем уровне техники, см., например, Current protocols in Molecular Biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc; or Gene Targeting a practical approach. (1995) Ed. A.L. Joyner, IRL Press. Получение нокаутных по гену катепсина H (DPPI) клеток также опубликовано Pham and Ley, 1999 (создание нокаутных клонов эмбриональных стволовых клеток мышей DPPI, см. стр. 8628, левая колонка, верхняя половина).

Другой аспект изобретения, таким образом, относится к применению катепсин-нокаутной клетки для идентификации или анализа соединений, которые модулируют боль, особенно нейропатическую боль.

Кроме того, применение катепсин-нокаутной клетки в качестве модельной системы с пониженной чувствительностью к боли, особенно с пониженной чувствительностью к нейропатической боли, является другим аспектом настоящей группы взаимосвязанных изобретений.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения клетка может характеризоваться более высоким уровнем катепсина H по сравнению с эталонной клеткой (например, той же самой клеткой в ее немодифицированном состоянии). Указанная клеточная система может служить для имитации состояния повышенной болевой чувствительности, поскольку уровень экспрессии катепсина H связан с болевой чувствительностью.

Настоящее изобретение, таким образом, относится также к применению клетки, гетерологично экспрессирующей катепсин H или его функциональный фрагмент, в качестве модельной системы с повышенной болевой чувствительностью, особенно чувствительностью к нейропатической боли.

Применение клетки, гетерологично экспрессирующей ген-репортер, связанный через экспрессию с промотором и/или энхансером катепсина H, для идентификации или анализа соединений, которые модулируют боль, особенно нейропатическую боль, является другим вариантом осуществления настоящей группы связанных изобретений.

Указанный выше аспект настоящего изобретения основан на типичном анализе гена-репортера, общеизвестном в данной области. С этой целью выбранный промотор вставляют в вектор экспрессии, подходящий для типа выбранной клетки-хозяина, выше выбранного гена-репортера, так чтобы обеспечить возможность экспрессии гена-репортера, если промотор является активным. Затем конструкцию вводят в выбранную клетку-хозяина. Подходящие способы трансформации или трансфекции хорошо известны в данной области, так же как и условия культивирования клеток и детекция экспрессии гена-репортера (см., например, стандартную литературу, перечисленную ниже). Подходящие условия хорошо известны в данной области, так же как и векторы, гены-репортеры и необходимые реагенты, которые также являются коммерчески доступными.

Вектор представляет собой кольцевую или линейную полинуклеотидную молекулу, например, плазмиду ДНК, бактериофаг или космиду, с помощью которой полинуклеотидные фрагменты (например, вырезанные из других векторов или амплифицированные с помощью ПЦР и вставленные в клонирующий вектор) могут быть специфически амплифицированы в подходящих клетках или организмах. Векторы экспрессии обеспечивают возможность гетерологичной экспрессии гена, представляющего интерес (например, гена-репортера), в клетке-хозяине или организме-хозяине. Тип клетки или организма в значительной степени зависит от задачи, и выбор находится в компетенции специалиста в данной области. Организмы, подходящие для амплификации нуклеиновой кислоты, представляют собой, например, преимущественно одноклеточные организмы с высокой скоростью пролиферации, как например, бактерии или дрожжи. Подходящие организмы также могут представлять собой выделенные и культивированные клетки многоклеточных тканей, как например, клеточные линии, полученные из различных организмов (например, клетки SF9 из Spodoptera Frugiperda и т.д.). Подходящие клонирующие векторы известны в данной области и коммерчески доступны от различных биотехнологических фирм-поставщиков, как например, Roche Diagnostics, New England Biolabs, Promega, Stratagene и многих других. Подходящие клеточные линии коммерчески доступны, например, в American Type Culture Collection (ATCC).

Что касается гетерологичной экспрессии белка или полипептида, то клетка может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку, которая может быть трансфицирована нуклеиновокислотным вектором и может экспрессировать ген, представляющий интерес, например, ген-репортер. Клетки включают, прежде всего, первичные клетки и клетки клеточной культуры, предпочтительно культуры эукариотических клеток, включая клетки, полученные из многоклеточных организмов и тканей (такие как клетки HEK293, RIN-5F, HeLA, CHO, COS, SF9 или 3T3) или из одноклеточных организмов, таких как дрожжи (например, S. pombe или S. cerevisiae), или культуры прокариотических клеток, предпочтительно Pichia или E.coli. Клетки и образцы, извлеченные из ткани, могут быть получены хорошо известными методами, такими как забор крови, пункция тканей или хирургические методы.

В контексте настоящей заявки термин "трансфекция" относится к введению нуклеиновокислотного вектора в клетку-хозяина (прокариотическую или эукариотическую) и включает, таким образом, термин "трансформация".

Трансфекция может быть стабильной или транзиторной трансфекцией.

Промотор катепсина H является частью гена катепсина H, способной управлять экспрессией генного продукта, представляющего интерес, если он введен в подходящий вектор экспрессии выше кодирующей последовательности генного продукта. Промотор катепсина H является частью геномной вышележащей 5'-последовательности гена катепсина H, который управляет активацией транскрипции расположенного ниже, транскрибируемого участка и может быть найден, например, в Ishidoh et al., FEBS letters, 1989 или Ishidoh et al, Biomed. Biochim. Acta, 1991, 50(4): 541-7.

Ген-репортер может быть любым геном, который позволяет легко провести количественное определение своего генного продукта. Многообразие генов-репортеров для эукариотических или прокариотических хозяев, а также методы детекции и необходимые реагенты известны в данной области техники и являются коммерчески доступными. Они включают, например, гены бета-лактамазы (lacZ), люциферазы, зеленого или синего флуоресцентного белка (GFP или BFP), DsRed, HIS3, URA3, TRP1 или LEU2 или бета-галактозидазы. Указанные гены кодируют белки, которые можно легко обнаружить с помощью видимой (цветной или люминесцентной) реакции (например, lacZ, люцифераза). Они включают генные продукты, которые можно легко обнаружить с помощью видимой (цветной или люминесцентной) реакции, или генные продукты, придающие устойчивость к антибиотикам, таким как ампициллин или канамицин, при их экспрессии. Другие продукты гена-репортера дают возможность экспрессирующим клеткам расти в определенных условиях, как например, ауксотрофные гены.

Функциональный фрагмент гена-репортера представляет собой любой фрагмент указанного гена-репортера, который позволяет легко провести количественное определение его генного продукта.

В контексте настоящей заявки термин "трансфекция" относится к введению нуклеиновокислотного вектора в клетку-хозяина (прокариотическую или эукариотическую) и таким образом включает термин "трансформация".

Трансфекция может быть стабильной или транзиторной трансфекцией.

Клетка может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку, способную к трансфекции нуклеиновокислотным вектором и к экспрессии гена-репортера. Клетки включают, прежде всего, первичные клетки и клетки клеточной культуры, предпочтительно культуры эукариотических клеток, включая клетки, полученные из многоклеточных организмов и тканей (такие как клетки HeLA, CHO, COS, SF9 или 3T3) или из одноклеточных организмов, таких как дрожжи (например, s. pombe или s. cerevisiae), или культуры прокариотических клеток, предпочтительно Pichia или E.coli. Клетки и образцы, извлекаемые из ткани, могут быть получены хорошо известными методами, такими как забор крови, пункция тканей или хирургические методы.

В контексте указанного выше аспекта настоящего изобретения контрольный вектор может быть любым подходящим вектором, который содержит ген-репортер или его функциональный фрагмент, но в котором экспрессия гена-репортера не управляется (функциональным) промотором катепсина H. Данный факт может означать, например, что ген-репортер или его функциональный фрагмент не связан функционально с функциональным промотором катепсина H (т.е. либо полностью лишенный промотора катепсина H, содержит нефункциональный промотор катепсина H или фрагмент промотора, либо в котором соединение промотора и гена-репортера не является функциональным). Другая возможность заключается в том, что ген-репортер или его функциональный фрагмент функционально связан с другим промотором, чем промотор катепсина H (например, SV40 или другой стандартный промотор). Функциональный вектор и контрольный вектор также могут быть трансфицированы в одну и ту же клетку, но в таком случае гены-репортеры должны быть различными.

Идентификация соединений в соответствии с указанными выше способами применения может быть осуществлена, например, согласно тестам, описанным ниже или известным в данной области техники.

Тест представляет собой любой тип аналитического метода или системы для наблюдения за биологическим процессом. Соответственно, молекулярные каскады и механизмы, представляющие собой части физиологических метаболических путей, а также патологических состояний, воспроизводятся в клеточных или биохимических (in vitro) системах. Фармакологическую активность предполагаемого фармацевтического соединения, таким образом, можно определить по его способности влиять на указанные каскады или механизмы или модулировать их.

Для применения в скрининге лекарственного средства, особенно высокопроизводительном скрининге новых фармацевтических соединений, тест должен быть воспроизводимым, а также предпочтительно масштабируемым и надежным. В объеме настоящего изобретения высокопроизводительный скрининг означает, что способ по настоящему изобретению проводят в очень небольшом масштабе, например, на 96, 386 или 1536-луночных планшетах в образцах очень небольшого объема в диапазоне от нескольких миллилитров до нескольких нанолитров или даже меньше. Таким образом, очень большое количество образцов можно проанализировать за короткое время. Высокопроизводительный скрининг преимущественно включает скрининг приблизительно 500000 различных соединений на определенное свойство с помощью всего одного теста. Тест предпочтительно подходит для высокопроизводительного скрининга химических веществ на их способность модулировать активность рассматриваемой молекулы-мишени. Тип теста зависит, например, от типа используемой молекулы-мишени (например, полипептид или полинуклеотид) и от "считывания", т.е. параметра, по которому определяют активность молекулы-мишени (см. ниже).

Различные типы таких тестов широко известны из уровня техники и коммерчески доступны от частных поставщиков.

Тесты, подходящие для различных целей, включают радиоизотопные или флуоресцентные тесты, например, тесты на основе флуоресцентной поляризации (такие как тесты, коммерчески предлагаемые Panvera) или Packard BioScience (HTRF; ALPHAScreen™) для измерения взаимодействия меченого члена с немеченым членом (например, взаимодействие меченых белков с их не мечеными белками-лигандами).

Дополнительные примеры включают клеточные тесты, в которых клеточная линия стабильно (индуцибельно или нет; в хромосомальной или эписомальной форме) или транзиторно экспрессирует рекомбинантный белок, представляющий интерес. Указанные тесты включают, например, тесты с использованием гена-репортера, в которых регуляция определенного промотора или пути сигнальной трансдукции участника каскада сигнальной трансдукции измеряют по активности репортерного фермента, экспрессия которого находится под контролем указанного определенного промотора. Для данного типа теста должна быть сконструирована рекомбинантная клеточная линия, содержащая ген-репортер под управлением определенного промотора, который исследуют или который регулируется изучаемым сигнальным каскадом. Подходящие репортерные ферменты широко известны из уровня техники и включают люциферазу светлячков, люциферазу Renilla (например, коммерчески доступные от Packard реагенты), β-галактозидазу. Подходящие клеточные линии зависят от цели теста, но преимущественно включают клеточные линии, которые легко трансфицировать и легко культивировать, такие как, например, HeLA, COS, CHO, NIH-3T3 и т.д.

Известны типичные форматы тестов для определения протеазной активности: например, применение субстрата, несущего репортерный маркер (например, белок/пептид или частица, испускающие люминесцентный/флуоресцентный или другой сигнал) в одном положении субстрата и гаситель (частица (например, другой пептид, ингибирующий эмиссию сигнала репортерного маркера до тех пор, пока субстрат является интактным/нерасщепленным) в другом положении; субстрат инкубируют с катепсином H в подходящих условиях, чтобы обеспечить возможность расщепления субстрата, приводящего к эмиссии детектируемого сигнала (например, световое излучение), в результате разделения гасителя и репортерного маркера.

Другие типы тестов и другие типы "считывания" хорошо известны на существующем уровне техники. Один тест для определения активности катепсина H в клетках можно найти, например, у Rüttger et. Al., BioTechniques, 2006.

Тесты по настоящему изобретению включают, например:

Способ идентификации или анализа соединений, модулирующих и/или предотвращающих боль, предпочтительно нейропатическую боль, включающий стадии:

a. Предоставление, по меньшей мере, двух образцов;

b. Приведение одного образца, содержащего катепсин H или его функциональный фрагмент или производное, в контакт с соединением,

c. Определение активности катепсина H в присутствии соединения,

d. Определение активности катепсина H в отсутствие соединения, и

e. Сравнение активности катепсина H согласно c) с активностью согласно d).

Способ идентификации или анализа соединений, которые модулируют и/или предотвращают боль, предпочтительно нейропатическую боль, включающий:

a. Приведение белка катепсина H или его функционального фрагмента или производного в контакт с тестируемым соединением; и

b. Определение того, модулирует ли тестируемое соединение активность белка катепсина H или его функционального фрагмента или производного.

Способ идентификации или анализа соединений, которые модулируют и/или предотвращают боль, предпочтительно нейропатическую боль, включающий:

a. Приведение клетки, которая обладает поддающимися детекции количеством или активностью катепсина H или его функционального фрагмента или производного, в контакт с тестируемым соединением;

b. Определение того, способно ли тестируемое соединение модулировать количество или активность катепсина H или его функционального фрагмента или производного, присутствующих в клетке.

Способ идентификации или анализа соединений, которые модулируют и/или предотвращают боль, предпочтительно нейропатическую боль, включающий:

a. Приведение нуклеиновой кислоты, кодирующей белок катепсина H или его функциональный фрагмент или производное, в контакт с тестируемым соединением в транскрипционно активной системе, и

b. Определение количества мРНК, кодирующей белок катепсина H или его функциональный фрагмент или производное, присутствующие в указанной системе в присутствии указанного соединения, и

c. Определение того, способно ли соединение модулировать количество мРНК, кодирующей белок катепсина H или его функциональный фрагмент или производное, присутствующие в указанной системе.

Транскрипционно активная система представляет собой любую биохимическую или клеточную систему, которая, по меньшей мере, обладает способностью к осуществлению транскрипционной реакции транскриптона. Такие системы хорошо известны в данной области и включают клетки, а также транскрипционные системы in vitro или наборы (например, на основе клеточных экстрактов), коммерчески доступные.

Способ идентификации соединений или анализа соединений, которые модулируют и/или предотвращают боль, предпочтительно нейропатическую боль, включающий:

a. Предоставление клетки, трансфицированной нуклеиновокислотным вектором, содержащим промотор гена катепсина H или его функционального фрагмента, функционально связанный с геном-репортером или его функциональным фрагментом.

b. Предоставление клетки, трансфицированной контрольным вектором, который содержит ген-репортер или его функциональный фрагмент, не связанный функционально с функциональным промотором катепсина H.

c. Определение активности гена-репортера клетки согласно a) и b) в присутствии тестируемого соединения;

d. Определение активности гена-репортера клетки согласно a) и b) в отсутствие тестируемого соединения.

Способ идентификации или анализа соединения, которое модулирует боль, предпочтительно нейропатическую боль, включающий

a. Отбор соединения, которое модулирует активность катепсина H, в качестве тестируемого соединения, и

b. Введение указанного тестируемого соединения субъекту, ощущающему боль, для определения того, является ли боль модулированной.

Способ идентификации или анализа соединения, которое модулирует и/или предотвращает боль, предпочтительно нейропатическую боль у субъекта, включающий:

c. Проведение анализа биологической активности катепсина H или его функционального фрагмента или производного в присутствии одного или более тестируемых соединений для идентификации одного или более модулирующих соединений, которые модулируют биологическую активность катепсина H, и

d. Тестирование одного или более модулирующих соединений в отношении их способности уменьшать боль (особенно нейропатическую боль) и/или ощущение боли (особенно ощущение нейропатической боли) и/или болевую чувствительность (особенно чувствительность к нейропатической боли) у субъекта.

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к фармакогеномным способам классификации групп пациентов и помощи врачу в адаптировании/корректировании лечения отдельных пациентов, таким как:

Способ анализа болевого порога (особенно порога нейропатической боли) у субъекта, включающий проведение анализа количества катепсина H во взятом образце указанного субъекта по сравнению с одним или более эталонными образцами, для определения того, отличается ли количество мРНК и/или белка катепсина H, присутствующих в указанном образце, от указанного количества в одном или более эталонных образцах, где наличие более высокого количества указывает на повышенную болевую чувствительность (особенно к нейропатической боли) и наличие более низкого количества указывает на сниженную болевую чувствительность (особенно к нейропатической боли) у указанного субъекта.

Способ адаптирования дозы лекарственного препарата для предотвращения и/или лечения боли у субъекта, причем указанный способ включает проверку взятого у субъекта образца на отличие количества мРНК и/или белка катепсина H, присутствующих в указанном образце, от аналогичного показателя в одном или более эталонных образцах, указанную дозу адаптируют в зависимости от того, отличается ли количество белка и/или мРНК во взятом у субъекта образце от аналогичного показателя в одном или более эталонных образцах, где более высокое количество катепсина H во взятом у субъекта образце указывает на необходимость применения более высокой дозы и более низкое количество катепсина H во взятом у субъекта образце указывает на необходимость применения более низкой дозы.

Термин "взятый образец", используемый в описании, относится к биологическому образцу, взятому/выделенному из организма одного или более отдельных субъектов (людей или не являющихся человеком животных). Биологический материал и биологические образцы включают, например, клетки, препараты или части тканей или органов (например, мозг, кровь, печень, селезенку, почки, сердце, кровеносные сосуды и т.д.), предпочтительно, если они получены у позвоночного, и более предпочтительно у млекопитающего, включая человека. Включены также клетки клеточной культуры, предпочтительно культуры эукариотических клеток, включая клетки, полученные из многоклеточных организмов и тканей (такие как клетки HeLA, CHO, COS, SF9 или 3T3) или из одноклеточных организмов, таких как дрожжи (например, s. pombe или s. cerevisiae), или культуры прокариотических клеток, предпочтительно Pichia или E.coli. Клетки и образцы, извлекаемые из ткани, могут быть получены хорошо известными методами, такими как забор крови, пункция тканей или хирургические методы. Получение рекомбинантных молекул и выделение природных молекул из клеток и тканей, а также получение клеточных или тканевых экстрактов хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, также стандартную литературу, перечисленную ниже).

Термин "эталонный образец" относится к биологическому образцу, взятому у одного или более субъектов с известным установленным болевым фенотипом, или к биологическому образцу in vitro (например, образцу, полученному из клеточной или тканевой культуры in vitro (например, культивируемые клетки)) и соответствующему по определенным характеристикам (например, уровню активности катепсина H, количеству или экспрессии) установленному болевому фенотипу (например, высокая болевая чувствительность или низкая болевая чувствительность).

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению средства для обнаружения катепсина H с целью определения повышенной болевой чувствительности (особенно чувствительности к нейропатической боли) у субъекта путем проведения анализа биологического образца, взятого из организма субъекта, которого обследуют.

Средство для обнаружения катепсина H может быть любым средством, позволяющим специфически обнаруживать полипептид/белок или нуклеиновую кислоту катепсина H, присутствующие в биологическом образце.

Средство обнаружения белка или полипептида катепсина H может быть любым средством, позволяющим специфически обнаружить любой белок/полипептид катепсина H дикого типа, а также может быть средством специфического обнаружения белка/полипептида катепсина H, содержащего одну или более мутаций, затрагивающих размер или аминокислотную последовательность, по сравнению с полипептидом/белком дикого типа. Предпочтительным примером такого средства является антитело, способное специфически обнаруживать белок катепсина H, например, при использовании в иммуногистологических или иммуногистохимических методах (например, обнаружение белка катепсина H или его определенных мутаций в гистологических срезах тканей или белка катепсина H, иммобилизованного на подходящих носителях, таких как мембраны, чипы, планшеты для ELISA и т.д.).

Средство для обнаружения нуклеиновой кислоты катепсина H, например, может быть средством для обнаружения мРНК/кДНК или геномной ДНК катепсина H дикого типа или также содержащих одну или более мутаций, затрагивающих их длину или их последовательность нуклеиновой кислоты, по сравнению с нуклеиновой кислотой катепсина Н дикого типа. Средство, например, может представлять собой средство для специфического обнаружения и/или количественного определения мРНК катепсина H и предпочтительно содержит или представляет собой специфический зонд для нуклеиновой кислоты катепсина H или набор праймеров, обеспечивающий амплификацию ДНК катепсина H, или, например, для применения в ПЦР-секвенировании (для обнаружения мутаций в нуклеотидной последовательности), или обеспечивающий амплификацию кДНК катепсина H, например, для применения в ПЦР-РВ (для обнаружения и/или количественного определения экспрессии мРНК катепсина H). Другим средством может быть, например, зонд для нуклеиновой кислоты, способный специфически гибридизоваться с мРНК или кДНК катепсина H в стандартных условиях, например, при использовании в нозерн-блоттинге или в методах гибридизации на чипе.

Термин “дикий тип” относится к генотипу или фенотипу, который находится в природе или в стандартном лабораторном фонде для данного организма. Согласно предпочтительному варианту осуществления последовательности катепсина H дикого типа представляют собой последовательности согласно SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и/или 9.

Конструирование и синтез подходящих праймеров хорошо известны в данной области (также см. выше). Наборы праймеров для обнаружения катепсина H, например, могли бы быть следующими:

Набор 1: (Длина продукта для определения транскриптного варианта 1 CTSH человека = 154 нуклеотидам, длина продукта для определения транскриптного варианта 2 CTSH человека = 118 нуклеотидам):

Набор 2: (Длина продукта для определения транскриптного варианта 1 CTSH человека = 153 нуклеотидам, длина продукта для определения транскриптного варианта 2 CTSH человека = 117 нуклеотидам):

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения средство представляет собой набор праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты катепсина H, и предпочтительно набор праймеров, содержащий по меньшей мере один из праймеров в соответствии с SEQ ID NO:10, 11 (собраны вместе в наборе 1), 12 и/или 13 (собраны вместе в наборе 2).

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения средство представляет собой зонд для обнаружения нуклеиновой кислоты катепсина H. Конструирование и синтез подходящих зондов хорошо известны в данной области (см. также стандартную литературу, приведенную ниже).

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения средство представляет собой антитело для специфического определения белка или полипептида катепсина H.

Получение подходящих антител или их функциональных фрагментов также хорошо известно в данной области, например, путем иммунизации млекопитающего, например, кролика, белком катепсина H или его фрагментом, при необходимости в присутствии, например, адъюванта Фрейнда и/или гелей гидроксида алюминия (см., например, Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349). Поликлональные антитела, которые образуются у животного в результате иммунологической реакции, затем могут быть выделены из крови с помощью хорошо известных методов и очищены, например, с помощью колоночной хроматографии. Моноклональные антитела могут быть получены, например, в соответствии с хорошо известным методом Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299). Подходящие методики получения моноклональных антител также хорошо известны в данной области (см., например, литературу по стандартным методам, перечисленную ниже). В контексте настоящего изобретения термин “антитело” или “фрагмент антитела” включает также антитела или их антиген-связывающие части, которые были получены рекомбинантно и, при необходимости, модифицированы, как например, химерные антитела, гуманизированные антитела, мультифункциональные антитела, биспецифические или олигоспецифические антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты F(ab) или F(ab)₂ (см., например, EP-B1-0368684, патент США 4816567, патент США 4816397, WO 88/01649, WO 93/06213 или WO 98/24884). Также коммерчески доступны антитела к катепсину H, такие как, козьи антитела против катепсина H мыши, каталожный № BAF1013, R&D Systems (Minneapolis, USA), крысиные антитела против катепсина H мыши, каталожный № MAB1013, R&D Systems (Minneapolis, USA), козьи антитела против катепсина H мыши, каталожный № AF1013 или кроличьи антитела против катепсина H человека, каталожный № ABIN285430 (antibodies-online GmbH, Germany, см. http://www.antikoerper-online.de), или мышиные антитела против катепсина H человека, каталожный № ABIN165388 (antibodies-online GmbH, Germany).

Получение антител к катепсину H и обнаружение катепсина H человека в цитозолях тканей и в сыворотке крови человека подробно описано, например, в публикации Schweiger et al., Journal of Immunological Methods, 2001, p. 165-172 (см., например, стр. 166-167 для материалов и методов).

Другой аспект настоящего изобретения относится к диагностическому набору для определения болевой чувствительности, и особенно к нейропатической боли, у субъекта, причем указанный тестовый набор содержит по меньшей мере одно средство для обнаружения катепсина H в биологическом образце, и к его применению.

В контексте настоящего изобретения под тестовым набором понимают любую комбинацию компонентов, идентифицированных в данной заявке, которые объединены пространственно для совместного использования в функциональный элемент, и которая может включать дополнительные компоненты.

В контексте настоящего изобретения тестовый набор включает, по меньшей мере, средство для детекции катепсина H (например, количества/или мутации) в биологическом образце, соответственно вместе с подходящими буферами и/или реагентами для проведения реакции детекции (например, иммунологической детекции катепсина H с помощью антитела, ферментной реакции для оценки активности катепсина H или т.п.), и/или для подготовки образца, и необязательно руководство по применению для осуществления соответствующего метода детекции.

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к способам лечения, таким как:

Способ лечения боли у субъекта, который испытывает боль, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества композиции, снижающей количество или активность катепсина H у указанного субъекта. Указанное количество или активность могут быть количеством или активностью катепсина H в целом или в определенной ткани, например, в нервной ткани, в лимфатической ткани или в клетках иммунной системы, таких как тучные клетки, макрофаги, нейтрофилы, T-клетки (такие как CD8+ T-клетки) и т.д., где терапевтически эффективное количество включает количество, достаточное для уменьшения ощущения боли или болевой чувствительности (особенно в отношении нейропатической боли) у субъекта.

Способ снижения болевой чувствительности (и особенно к нейропатической боли) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества композиции, снижающей количество (например, экспрессию, период полувыведения) или активность катепсина H у указанного субъекта (например, в лимфатической или нервной ткани или в клетках иммунной системы), относится к еще одному аспекту настоящего изобретения.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу модулирования болевой чувствительности (и особенно к нейропатической боли) у потомка не являющегося человеком субъекта-самки, включающему перенос (например, электропорацией) нуклеиновой кислоты, обеспечивающей модулированную экспрессию катепсина H, в зиготы, перенос зигот не являющейся человеком приемной матери и отбор потомка в соответствии с его характеристиками экспрессии катепсина H (снижение или прекращение экспрессии катепсина H по сравнению с субъектами дикого типа, такими как мыши).

Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению, которое способно снизить активность и/или экспрессию катепсина H, для лечения боли и особенно нейропатической боли.

Ингибиторы катепсина H известны в данной области, например, E-64d (см., например, Rüttger et al., BioTechniques, 41: 469-473, 2006) and Kirschke, H et al, 1995, Protein Profile 2: 1581-1643).

Для получения лекарственного средства модуляторы катепсина H по настоящему изобретению могут быть включены в состав вместе с подходящими добавками или вспомогательными веществами, такими как физиологический буферный раствор, например, раствор хлорида натрия, деминерализованная вода, стабилизаторы, такие как ингибиторы протеазы или нуклеазы, предпочтительно апротинин, ε-аминокапроновая кислота или пепстатин A, или комплексообразующие соединения, такие как EDTA, гелеобразные составы, такие как белый вазелин, парафин низкой вязкости и/или желтый воск, и т.д. в зависимости от вида введения.

Другие подходящие добавки представляют собой, например, детергенты, такие как, например, Тритон X-100 или дезоксихолат натрия, а также многоатомные спирты, такие как, например, полиэтиленгликоль или глицерин, сахара, такие как, например, сахароза или глюкоза, цвиттерионные соединения, такие как, например, аминокислоты, такие как глицин или, в частности, таурин или бетаин и/или белок, такой как, например, бычий или человеческий сывороточный альбумин. Детергенты, многоатомные спирты и/или цвиттерионные соединения являются предпочтительными.

Физиологический буферный раствор предпочтительно имеет значение pH приблизительно 6,0-8,0, особенно значение pH приблизительно 6,8-7,8, в частности, значение pH приблизительно 7,4, и/или осмолярность приблизительно 200-400 миллиосмоль/литр, предпочтительно приблизительно 290-310 миллиосмоль/литр. Значение pH лекарственного средства обычно регулируют с использованием подходящего органического или неорганического буфера, такого как, например, предпочтительно используемый фосфатный буфер, Трис-буфер (трис(гидроксиметил)аминометан), буфер HEPES ([4-(2-гидроскиэтил)пиперазино]этансульфоновая кислота) или буфер MOPS (3-морфолино-1-пропансульфоновая кислота). Выбор соответствующего буфера, как правило, зависит от желаемой молярности буфера. Фосфатный буфер подходит, например, для инъекционных и инфузионных растворов.

Лекарственное средство можно вводить общепринятым способом, например, с помощью пероральных готовых лекарственных форм, таких как, например, таблетки или капсулы, через слизистые оболочки, например, носовой или ротовой полости, в форме диспозиториев, имплантированных под кожу, с помощью инъекций, инфузий или гелей, которые содержат лекарственные средства по изобретению. Кроме того, можно вводить лекарственное средство местно и локально с целью лечения заболевания определенного сустава, как описано выше, при необходимости в форме липосомальных комплексов.

Кроме того, лечение можно проводить с помощью трансдермальной терапевтической системы (TTS), которая позволяет осуществить контролируемое по времени высвобождение лекарственных средств. TTS известны, например, из EP 0944398 A1, EP 0916336 A1, EP 0889723 A1 или EP 0852493 A1.

Инъекционные растворы обычно используют, если только относительно небольшие количества раствора или суспензии, например, приблизительно от 1 до приблизительно 20 мл, должны быть введены в организм. Инфузионные растворы, как правило, используют, если необходимо ввести большее количество раствора или суспензии, например, один или более литров. Поскольку, в отличие от инфузионного раствора, в случае инъекционных растворов вводят только несколько миллилитров, то небольшие отличия от значения pH и от значения осмотического давления крови или тканевой жидкости в инъекции не являются ощутимыми сами по себе или являются ощутимыми только в незначительной степени относительно ощущения боли. Соответственно, разведение композиции по изобретению перед применением обычно не является необходимым. Однако в случае введения относительно больших количеств, композицию по изобретению следует разводить незадолго до введения в такой мере, чтобы получить, по меньшей мере, приблизительно изотонический раствор. Примером изотонического раствора является раствор хлорида натрия 0,9% концентрации. В случае инфузии разведение можно выполнить, например, с использованием стерильной воды, тогда как введение можно осуществить, например, посредством, так называемого шунтирования.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления различных аспектов настоящего изобретения катепсин H, его производное или фрагмент могут быть использованы в виде выделенной молекулы.

В контексте настоящего изобретения термин "выделенная молекула", особенно по отношению к катепсину H, относится к полинуклеотидам или полипептидам катепсина H, очищенным из природных источников, а также к очищенным рекомбинантным молекулам (где термин “очищенный” включает частичную очистку, а также полную очистку).

Получение рекомбинантных полипептидных или полинуклеотидных молекул и очистка природных молекул из клеток или тканей, а также приготовление клеточных или тканевых экстрактов хорошо известны специалисту в данной области (см., например, также стандартную литературу, перечисленную ниже).

Указанное получение включает, например, амплифицирование полинуклеотидов желаемой длины посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе опубликованных геномных или кодирующих полинуклеотидных последовательностей и последующее клонирование полученных полинуклеотидов в клетках-хозяевах (см., например, стандартную литературу, перечисленную ниже).

В контексте настоящего изобретения термин “полипептид" относится к молекуле, содержащей аминокислоты, связанные друг с другом пептидными связями, содержащей по меньшей мере 50 аминокислот, соединенных друг с другом линейным образом с образованием полипептидной цепи. Более короткие молекулы такого вида обозначаются как пептиды. Термин “белок” относится к молекулам, содержащим по меньшей мере одну полипептидную цепь, но также может относиться к молекулам, содержащим более чем одну полипептидные цепи, ассоциированные или связанные друг с другом. Таким образом, термин “белок” включает также термин “полипептид”.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы:

Используемые штаммы мышей:

Использовали пять различных инбредных штаммов мышей: AKR/J (AKR), CBA/J (CBA), C3H/HeJ (C3H), C57BL/6J (B6) и C58/J (C58). Мышей получали от Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). В отношении указанных штаммов мышей было показано, что они существенно различаются по некоторым показателям боли in vivo (Mogil et al 1999).

Выделение общей РНК:

Общую РНК выделяли из DRG (дорсальных корешковых ганглиев) с помощью набора реагентов для выделения РНК PicoPure™ (Arcturus) в соответствии с инструкциями производителя. Качество РНК оценивали с помощью устройства Bioanalyzer 2100 и набора RNA 6000 Nano LabChip™ (Agilent).

Анализ на микрочипах Affymetrix GeneChip™:

Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием 500 нг общей РНК со 100 пМ T7-(dT)24 олигомера (GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-dT₂₄ SEQ ID NO:14) согласно публикации Baugh, L.R, Hill, A.A., Brown, E.L. and Hunter, C.P. (2001) Nucleic Acids Res. 29, e29 и обратной транскриптазой SuperScript II в соответствии с инструкциями производителя. Синтезировали двухцепочечную кДНК и затем экстрагировали, используя фенол-хлороформ, с последующей стадией осаждения этанолом. Реакцию транскрипции in vitro проводили с образцом двухцепочечной кДНК, используя набор реагентов BioArray High Yield RNA Transcription Labeling kit (Enzo) в соответствии с инструкциями производителя. Реакционные смеси для реакции транскрипции инкубировали при 37°C в течение 16 часов. Очищали кДНК с использованием протокола очистки РНК RNeasy™ Mini kit (Qiagen) и измеряли количественно с помощью спектрофотометра. Меченную биотином кРНК фрагментировали с помощью буфера фрагментации РНК (200 мМ Трис-ацетат, 500 мМ KOAc, 150 мМ MgOAc, pH 8,1). Гибридизацию и окрашивание микрочипа GeneChips™ Mouse Genome 430 2.0 (Affymetrix) осуществляли в соответствии с инструкциями производителя. Микрочипы исследовали с помощью сканера GeneChip™ 3000 и считанные данные вводили в компьютер и анализировали, используя программное обеспечение для анализа данных экспрессии Resolver v5.1 (Rosetta Biosoftware).

Рассечение спинномозгового нерва L5 и методы проведения ложной операции:

У мышей, находящихся под анестезией, выделяли левый спинномозговой нерв L5 и затем частично удаляли поперечный отросток позвонка. После отделения от спинномозгового нерва L4, рассекали спинномозговой нерв L5. Ложная операция была идентична операции рассечения спинномозгового нерва L5, однако спинномозговой нерв L5 не рассекали (см. DeLeo et al. 2000).

Определение порогового значения в реакции отдергивания лапы:

Пороговые значения в реакции отдергивания лапы (PWT) оценивали с помощью динамического подошвенного эстезиометра (см. Szabo et al. 2005). После адаптации животного в ячейке с металлическим сетчатым полом, под его заднюю лапу помещали стимулятор, прикасались прямой металлической нитью, приводимой в действие электродинамическим приводом, к подошвенной поверхности и оказывали возрастающее, направленное вверх воздействие до тех пор, пока животное не убирало лапу (пороговое значение в реакции отдергивания лапы, PWT). Значения PWT оценивали для задних лап на той же стороне, где была проведена операция, и на противоположной стороне. Каждое животное использовали в эксперименте только один раз. Во всех экспериментах с участием животных выполняли этические рекомендации для исследований на находящихся в сознательном состоянии животных, и процедуры были утверждены местным комитетом по этике.

Корреляционный анализ:

При корреляционном анализе "болевой фенотип" определяли для каждого животного с рассечением нерва (животное из группы модели Chung) как C1-S1, где

C1=ln(PWT на оперированной стороне/PWT на противоположной стороне) и

S1=среднее значение _{все животные контрольной группы одного штамма} ln(PWT на оперированной стороне/PWT на противоположной стороне).

Оценивали два измерения дифференциальной регуляции транскрипции для каждого животного, оперированного по модели Chung и для каждого измеряемого гена, исходя из результатов интенсивности его экспрессии. "Необработанный показатель интенсивности" получали как показатель интенсивности, вычисленный с помощью программного обеспечения для анализа результатов экспрессии Resolver (v5.1) для соответствующего гена и животного. "Показатель log отношения" вычисляли для конкретного гена и животного группы Chung как ln(C2/S2), где C2=интенсивность экспрессии гена в животного группы Chung и S2=среднее значение _{все животные контрольной группы одного штамма}

Ложная интенсивность экспрессии.

Перед вычислением корреляционных зависимостей проводили выборку в наборе генов, чтобы исключить гены с экспрессией ниже уровня шума и без статистически значимой регуляции в группе модели Chung по сравнению с контрольной группой. Подходящие гены должны регулироваться по меньшей мере у 60% животных в группе модели Chung с абсолютной кратностью изменения =>1,5 или по меньшей мере у 20% животных в группе модели Chung с абсолютной кратностью изменения =>2,0. Кроме того, соответствующая экспрессия генов должна быть детектируемой ("представленной") по меньшей мере у пяти животных, как определено соответствующей величиной p-значения <0,001. Для каждого гена вычисляли коэффициенты корреляции Пирсона между фенотипическими оценками боли и одним из определяемых показателей регуляции транскрипции с помощью пакета программного обеспечения R (http://www.r-project.org/). Исходя из указанных коэффициентов, получали p-значения статистической значимости и соответствующие уровни ложноположительных результатов (FDR) по методу Storey et al. (2002). Гены со значением FDR <0,05 для "показателя log отношения" или "показателя интенсивности" считали существенно коррелированными.

Условные обозначения к чертежам

Фигура 1. Катепсин H - поле корреляции

На фигуре 1 представлен фенотип нейропатической боли для каждой отдельной мыши (механическая гиперчувствительность, ось X) и соответствующая регуляция гена катепсина H (log отношения (модель Chung в сравнении с ложно оперированным контролем), ось Y) для DRG L5. Данные по мышам представлены в разном цвете в зависимости от штамма. Проводили корреляционный анализ по Пирсону и выявили статистически значимую положительную корреляцию двух параметров, болевого фенотипа и регуляции гена катепсина Н. В отношении отдельной мыши вышесказанное означает, что чем выше была экспрессия катепсина H в L5 DRG у оперированных по модели Chung нейропатических мышей, тем более выраженной была механическая гипералгезия, которая проявлялась в поведенческом тесте.

Указанная статистически значимая корреляция свидетельствует о причинно-следственной связи экспрессии гена катепсина H в случае индукции фенотипа нейропатической боли.

Фигура 2. Катепсин H - данные по интенсивности

Абсолютные значения экспрессии катепсина H в ганглиях L5 у отдельных мышей штаммов AKR, CBA и C57 после операции по модели Chung или ложной операции.

Фигура 3. Геномная последовательность ДНК катепсина H homo sapiens на хромосоме 15 в соответствии с эталонной последовательностью NCBI: NG_009614.1 (SEQ ID NO:1).

Фигура 4. Кодирующая последовательность транскриптного варианта 1 (SEQ ID NO:2) катепсина H homo sapiens согласно NM_004390.3, имеющая длину 1494 п.н. и кодирующая более длинную изоформу A катепсина H.

Фигура 5. Кодирующая последовательность транскриптного варианта 2 (SEQ ID NO:3) катепсина H homo sapiens согласно NM_148979.2, имеющая длину 1458 п.н. и кодирующая более короткую изоформу B катепсина H. В соответствии с указанной выше записью NCBI, указанный транскриптный вариант не имеет альтернативного сегмента внутри рамки по сравнению с вариантом 1, что дает в результате более короткий белок (изоформа B) по сравнению с изоформой A, кодируемой транскриптным вариантом 1. Это может привести к образованию белка (изоформа B), который скорее может быть секретируемым белком, чем лизосомальный белок.

Фигура 6. Кодирующая последовательность катепсина H (SEQ ID NO:4) mus musculus в соответствии с записью NCBI BC006878.1.

Фигура 7. Белковая последовательность катепсина H человека согласно UniProtKB/Swiss-Prot P09668 (SEQ ID NO:5), содержащая 335 аминокислот и образующая препроформу катепсина H человека (изоформа A). Указанная последовательность далее процессируется в зрелую форму; она расщепляется на 3 следующих цепи: миницепь катепсина H, тяжелая цепь катепсина H, легкая цепь катепсина H, (легкая и тяжелая цепи вместе могут быть обозначены как большая цепь); все цепи соединены вместе дисульфидными связями. Аминокислоты 1-22 составляют сигнальный пептид (длина 22 ак), аминокислоты 23-97 составляют активационный пептид (длина 75 ак), аминокислоты 98-105 составляют миницепь катепсина H (длина 8 ак), аминокислоты 106-115 составляют пропептид (длина 10 ак), аминокислоты 116-335 составляют длинную цепь катепсина H (длина 220 ак), состоящую из тяжелой и легкой цепи, соединенных вместе дисульфидными связями, аминокислоты 116-292 составляют тяжелую цепь катепсина H (длина 177 ак), аминокислоты 293-335 составляют легкую цепь катепсина H (длина 43 ак).

Фигура 8. Препробелок изоформы A человека в соответствии с NM_004390.3 (SEQ ID NO:6; транслированная аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2).

Фигура 9. Препробелок изоформы B человека в соответствии с NM_148979.2 (SEQ ID NO:7; транслированная аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3).

Фигура 10. Белковая последовательность препробелка изоформы a катепсина H в соответствии с NP_004381.2 (SEQ ID NO.8).

Фигура 11: белковая последовательность белка-предшественника изоформы b человеческого катепсина H в соответствии с NP_683880.1 (SEQ ID NO:9).

Ссылки:

Литература по стандартным лабораторным методам

Если не указано иное, стандартные лабораторные методы были осуществлены или могут быть осуществлены согласно следующей стандартной литературе:

Стандартная литература по лабораторным методам.

Если не указано иное, лабораторные методы были осуществлены или могут быть осуществлены согласно стандартным методам, перечисленным в приведенной ниже стандартной литературе:

1. Применение катепсина Н для идентификации соединений, которые модулируют нейропатическую боль.

2. Применение не являющегося человеком трансгенного животного, гетерологично экспрессирующего катепсин Н, для идентификации или анализа соединений, которые модулируют нейропатическую боль.

3. Применение не являющегося человеком трансгенного животного, гетерологично экспрессирующего катепсин Н, в качестве модельной системы с повышенной чувствительностью к нейропатической боли.

4. Применение не являющегося человеком катепсин Н-нокаутного животного для идентификации или анализа соединений, которые модулируют нейропатическую боль.

5. Применение не являющегося человеком катепсин Н-нокаутного животного в качестве модельной системы с пониженной чувствительностью к нейропатической боли.

6. Применение клетки, гетерологично экспрессирующей катепсин Н или его функциональный фрагмент, для идентификации соединений, которые модулируют нейропатическую боль.

7. Применение клетки, гетерологично экспрессирующей катепсин Н или его функциональный фрагмент, в качестве модельной системы с повышенной чувствительностью к нейропатической боли.

8. Применение катепсин Н-нокаутной клетки для идентификации или анализа соединений, которые модулируют нейропатическую боль.

9. Применение катепсин Н-нокаутной клетки в качестве модельной системы с пониженной чувствительностью к нейропатической боли.

10. Применение клетки, гетерологично экспрессирующей ген-репортер, связанный через экспрессию с промотором и/или энхансером катепсина Н или его функционального фрагмента, для идентификации или анализа соединений, которые модулируют нейропатическую боль.

11. Способ идентификации или анализа соединений, модулирующих и/или предотвращающих нейропатическую боль, включающий стадии:
a) предоставление, по меньшей мере, двух образцов,
b) приведение одного образца, содержащего катепсин Н или его функциональный фрагмент или производное, в контакт с соединением,
c) определение активности катепсина Н в присутствии соединения,
d) определение активности катепсина Н в отсутствие соединения, и
e) сравнение активности катепсина Н согласно с) с активностью согласно d),
где соединение, модулирующее и/или предотвращающее активность катепсина Н, идентифицируют как соединение, модулирующее и/или предотвращающее нейропатическую боль.

12. Способ идентификации или анализа соединений, которые модулируют нейропатическую боль, включающий:
a) приведение белка катепсина Н или его функционального фрагмента или производного в контакт с тестируемым соединением, и
b) определение того, модулирует ли тестируемое соединение активность белка катепсина Н или его функционального фрагмента или производного,
где тестируемое соединение, модулирующее активность белка катепсина Н или его функционального фрагмента или производного, идентифицируют как соединение, которое модулирует нейропатическую боль.

13. Способ идентификации или анализа соединений, которые модулируют нейропатическую боль, включающий:
a) приведение клетки, которая обладает поддающимися детекции количеством или активностью катепсина Н или его функционального фрагмента или производного, в контакт с тестируемым соединением,
b) определение того, способно ли тестируемое соединение модулировать количество или активность катепсина Н или его функционального фрагмента или производного, присутствующих в клетке,
где тестируемое соединение, способное модулировать количество или активность катепсина Н или его функционального фрагмента или производного, присутствующих в клетке, идентифицируют как соединение, которое модулирует нейропатическую боль.

14. Способ идентификации или анализа соединений, которые модулируют нейропатическую боль, включающий:
a) приведение нуклеиновой кислоты, кодирующей белок катепсина Н или его функциональный фрагмент или производное, в контакт с тестируемым соединением в транскрипционно активной системе, и
b) определение количества мРНК, кодирующей белок катепсина Н или его функциональный фрагмент или производное, присутствующие в указанной системе, в присутствии указанного соединения, и
с) определение того, способно ли соединение модулировать количество мРНК, кодирующей белок катепсина Н или его функциональный фрагмент или производное, присутствующие в указанной системе,
где соединение, способное модулировать количество мРНК, кодирующей белок катепсина Н или его функциональный фрагмент или производное, присутствующие в указанной системе, идентифицируют как соединение, которое модулирует нейропатическую боль.

15. Способ идентификации или анализа соединения, которое модулирует нейропатическую боль, включающий:
a) отбор соединения, которое модулирует активность катепсина Н, в качестве тестируемого соединения, и
b) введение указанного тестируемого соединения субъекту, ощущающему нейропатическую боль, для определения того, является ли нейропатическая боль модулированной.

16. Способ идентификации или анализа соединения, которое модулирует и/или предотвращает нейропатическую боль у субъекта, включающий:
a) проведение анализа биологической активности катепсина Н или его функционального фрагмента или производного в присутствии одного или более тестируемых соединений для идентификации одного или более модулирующих соединений, которые модулируют биологическую активность катепсина Н, и
b) тестирование одного или более модулирующих соединений в отношении их способности уменьшать боль, ощущение боли или болевую чувствительность у субъекта.