Бензо[1,2,4]тиадиазиновые ингибиторы репликации вируса гепатита в и фармацевтическая композиция для лечения гепатита в

Изобретение относится к новым ингибиторам репликации вируса гепатита В, представляющим собой 1,1-диоксо-1,4-дигидро-2Н-бензо[1,2,4]тиадиазин-3-оны общей формулы 1, их фармацевтически приемлемые соли и/или гидраты. В общей формуле 1

где Ar¹ и Ar² представляют собой фенил, необязательно замещенный одним, двумя или тремя одинаковыми или различными заместителями, выбранными из С₁-С₄алкила, метоксила, галогена, карбоксила и карбонитрила. Изобретение также относится к фармацевтической композиции в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, для лечения гепатита В и к способу профилактики или лечения гепатита В. 5 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

 

Данное изобретение относится к новым ингибиторам репликации вируса гепатита В (HBV), новой фармацевтической композиции для лечения гепатита В, способу их получения и применения.

Гепатит В - это инфекция печени, потенциально представляющая угрозу для жизни, вызываемая HBV. Он представляет одну из основных проблем глобального здравоохранения. Гепатит В может приводить к развитию хронической болезни печени и создавать высокий риск смерти от цирроза и рака печени.

По данным ВОЗ самые высокие уровни распространенности гепатита В отмечаются в Африке к югу от Сахары и в Восточной Азии. Большинство жителей этих регионов приобретают инфекцию гепатита В в детстве, а от 5% до 10% взрослого населения имеют хроническую инфекцию.

Высокие показатели хронических инфекций отмечаются также в районе Амазонки и в южных частях Восточной и Центральной Европы. По оценкам хронически инфицировано от 2% до 5% общего населения Ближнего Востока и Индийского субконтинента. В Западной Европе и Северной Америке хронически инфицировано менее 1% населения.

Вероятность того, что вирусная инфекция гепатита В станет хронической, зависит от возраста, в котором человек приобретает инфекцию. Хронические инфекции развиваются у 80-90% детей, инфицированных в течение первого года жизни и у 30-50% детей, инфицированных в возрасте до шести лет. Среди взрослых людей хронические инфекции развиваются у <5% инфицированных, здоровых в остальных отношениях людей. 5-25% взрослых людей, ставших хронически инфицированными в детстве, умирают от связанных с гепатитом В рака или цирроза печени.

Более 240 миллионов человек имеют хронические (длительные) инфекции печени. Около 780000 человек ежегодно умирает от острых или хронических последствий гепатита В.

С 1982 года доступна вакцина против гепатита В. Эта вакцина эффективна в предотвращении инфекции и ее хронических последствий на 95% и является первой вакциной против одного из основных видов рака человека.

Людей с хроническим гепатитом В, которые нуждаются в лечении, лечат противовирусными препаратами, такими как тенофовир и энтекавир, а также уколами интерферона. Лечение может замедлять развитие цирроза, уменьшать заболеваемость гепатоцеллюлярной карциномой и улучшать выживаемость в долговременной перспективе.

В последние годы были открыты ненуклеозидные гетероциклические соединения, ингибирующие репликацию вируса гепатита В [US 6436943, US 2013/0071354, WO 2013/102655], в том числе: methyl (R)-4-(2-chloro-4-fluorophenyl)-2-(3,5-difluoro-2-pyridinyl)-6-methyl-1,4-dihydro-pyrimidine-5-carboxylate (BAY 41-4109) [О. Weber et al. Inhibition of human hepatitis В virus (HBV) by a novel non-nucleosidic compound in a transgenic mouse model. Antiviral Res. 54, 69-78, 2002.], а также сульфамоилариламиды [WO 20013/006394, WO 2013/096744, WO 2014/033170, WO 2014/033176], сульфамоилтиофенамиды [WO 2014/184365].

Известны производные 1,1-диоксо-2Н-1,2,4-бензотиадиазин-3(4Н)-она, показавшие высокую активность как антагонисты рецептора орексина-2 и заявленные для лечения и профилактики наркотической зависимости, двигательных расстройств, нарушений сна, нейрологических заболеваний, ассоциируемых с депрессией, когнитивных расстройств, болезни Альцгеймера. Также описан способ их получения взаимодействием 2-нитробензенсульфонил хлорида и замещенного анилина с последующим восстановлением нитрогруппы в присутствии дихлорида олова и циклизацией в присутствии трифосгена [WO 2014006402]. Известен твердофазный синтез 2,4-дизамещенных 1,2,4-бензотиадиазин-3-он 1,1-диоксидов из 4-нитрофенилуксусной кислоты [Shingo Makino et al. Efficient synthesis of 2,4-disubstituted 1,2,4-benzothiadiazin-3-one 1,1-dioxides on solid support. J. Comb. Chem. 5(1), 73-78, 2003].

Однако специального лечения острого гепатита В до настоящего времени нет. В этой связи поиск новых препаратов для лечения гепатита В является актуальной задачей.

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании этого изобретения.

«Алкил» означает алифатическую углеводородную линейную или разветвленную группу с 1-12 атомами углерода в цепи. Разветвленная означает, что алкильная цепь имеет один или несколько «низших алкильных» заместителей. Алкил может иметь один или несколько одинаковых или различных заместителей, включая галоген, алкенилокси, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, ароил, циано, гидрокси, алкокси, карбокси, алкинилокси, аралкокси, арилокси, арилоксикарбнил, алкилтио, гетероарилтио, аралкилтио, арилсульфонил, алкилсульфонилгетероаралкилокси, аннелированный гетероарилциклоалкенил, аннелированный гетероарилциклоалкил, аннелированный гетероарилгетероцикленил, аннелированный гетероарилгетероциклил, аннелированный арилциклоалкенил, аннелированный арилциклоалкил, аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбонил, гетероаралкилоксикарбонил или R_k ^aR_k+1 ^aN-, R_k ^aR_k+1 ^aNC(=O)-, R_k ^aR_k+1 ^aNC(=S)-, R_k ^aR_k+1 ^aNSO₂-, где R_k ^a и R_k+1 ^a независимо друг от друга представляют собой «заместители аминогруппы», например, атом водорода, алкил, арил, аралкил, гетероаралкил, гетероциклил или гетероарил, или R_k ^a и R_k+1 ^a вместе с атомом N, с которым они связаны, образуют через R_k ^a и R_k+1 ^a 4-7 членный гетероциклил или гетероцикленил. Предпочтительными алкильными группами являются метил, трифторметил, циклопропилметил, циклопентилметил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил, 3-пентил, метоксиэтил, карбоксиметил, метоксикарбонилметил, этоксикарбонилметил, бензилоксикарбонилметил метоксикарбонилметил и пиридилметилоксикарбонилметил. Предпочтительными «алкильными заместителями» являются циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, гидрокси, алкокси, алкоксикарбонил, аралкокси, арилокси, алкилтио, гетероарилтио, аралкилтио, алкилсульфонил, арилсульфонил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбонил, гетероаралкилоксикарбонил или R_k ^aR_k+1 ^aN-, R_k ^aR_k+1 ^aNC(=O)-, аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил.

«Алкокси» или «алкилокси» означает алкил-О-группу, в которой алкил определен в данном разделе. Предпочтительным алкилокси группами являются метокси, этокси, н-пропокси, изо-пропокси и н-бутокси.

«Арил» означает ароматическую моноциклическую или полициклическую систему, включающую от 6 до 14 атомов углерода, преимущественно от 6 до 10 атомов углерода. Арил может содержать один или более «заместителей циклической системы», которые могут быть одинаковыми или разными. Представителями арильных групп являются фенил или нафтил, замещенный фенил или замещенный нафтил. Арил может быть аннелирован с неароматической циклической системой или гетероциклом.

«Галоген» означает фтор, хлор, бром и иод. Предпочтительными яляются фтор, хлор и иод.

«Гетероциклил» означает ароматическую или неароматическую насыщенную моноциклическую или полициклическую систему, включающую от 3 до 10 атомов углерода, преимущественно от 5 до 6 атомов углерода, в которой один или несколько атомов углерода заменены на гетероатом, такой как азот, кислород, сера. Приставка «аза», «окса» или «тиа» перед гетероциклилом означает наличие в циклической системе, атома азота, атома кислорода или атома серы, соответственно. Гетероциклил может иметь один или несколько «заместителей циклической системы», которые могут быть одинаковыми или разными. Атомы азота и серы, находящиеся в гетероциклиле могут быть окислены до N-оксида, S-оксида или S-диоксида. Представителями гетероциклилов являются пиперидин, пирролидин, пиперазин, морфолин, тиоморфолин, тиазолидин, 1,4-диоксан, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен и др.

«Гидрат» означает стехиометрическую или нестехиометрическую композицию соединения или его соли с водой.

«Заместитель карбамоильный» означает заместитель, присоединенный к карбамоильной группе, значение которой определено в данном разделе. Заместитель карбамоильный представляет собой водород, алкил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, алкоксикарбонилалкил, аралкоксикарбонилалкил, гетероаралкилоксикарбонилалкил или R_k ^aR_k+1 ^aN-, R_k ^aR_k+l ^aNC(=O)-алкил, аннелированный гетероарилциклоалкенил, аннелированный гетероарилциклоалкил, аннелированный гетероарилгетероцикленил, аннелированный гетероарилгетероциклил, аннелированный арилциклоалкенил, аннелированный арилциклоалкил, аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил. Предпочтительными «заместителями карбамоильными» являются алкил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, алкоксикарбонилалкил, аралкоксикарбонилалкил, гетероаралкилоксикарбонилалкил или R_k ^aR_k+1 ^aN-, R_k ^aR_k+l ^aNC(=O)-алкил, аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил.

«Заместитель циклической системы» означает заместитель, присоединенный к ароматической или неароматической циклической системе, включая водород, алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил, аралкил, гетероаралкил, гидрокси, гидроксиалкил, амино, аминоалкил, алкокси, арилокси, ацил, ароил, галоген, нитро, циано, карбокси, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, аралкоксикарбонил, алкилоксиалкил, арилоксиалкил, гетероциклилоксиалкил, арилалкилоксиалкил, гетероциклилалкил-оксиалкил, алкилсульфонил, арилсульфонил, гетероциклилсульфонил, алкилсульфинил, арилсульфинил, гетероциклилсульфинил, алкилтио, арилтио, гетероциклилтио, алкилсульфонилалкил, арилсульфонилалкил, гетероциклилсульфонилалкил, алкилсульфинилалкил, арилсульфинилалкил, гетероциклилсульфинилалкил, алкилтиоалкил, арилтиоалкил, гетероциклилтиоалкил, арилалкилсульфонилалкил, гетероциклилалкилсульфонилалкил, арилалкилтиоалкил, гетероциклилалкилтиоалкил, циклоалкил, циклоалкенил, гетероциклил, гетероцикленил, амидино, R_k ^aR_k+1 ^aN-, R_k ^aN=, R_k ^aR_k+l ^aN-алкил-, R_k ^aR_k+1 ^aNC(=O)- или R_k ^aR_k+1 ^aNSO₂-, где R_k ^a и R_k+1 ^a представляют собой независимо друг от друга «заместители аминогруппы», например, водород, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аралкил, или необязательно замещенный гетероаралкил, или заместитель R_k ^aR_k+1 ^aN-, в котором R_k ^a может быть ацил или ароил, а значение R_k+1 ^a определено выше, или «заместителями циклической системы» являются R_k ^aR_k+1 ^aNC(=O)- или R_k ^aR_k+1 ^aNSO₂-, в которых R_k ^a и R_k+1 ^a вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют через R_k ^a и R_k+1 ^a 4-7 членный гетероциклил или гетероцикленил.

«Карбамоил» означает C(=O)NR_k ^aR_k+1 ^a-группу. Карбамоил может иметь один или несколько одинаковых или различных «заместителей карбамоильных» R_k ^a и R_k+1 ^a, включая водород, алкенил, алкил, арил, гетероарил, гетероциклил.

«Карбоксил» означает НОС(=O)-(карбоксильную) группу.

«Лекарственное начало» (лекарственная субстанция лекарственное вещество, drug-substance) означает физиологически активное вещество синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, микробного и прочего) происхождения, обладающее фармакологической активностью и являющееся активным началом фармацевтической композиции, используемой для производства и изготовления лекарственного препарата (средства).

«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции) в виде таблеток капсул инъекций, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.

«Низший алкил» означает линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода.

«Терапевтический коктейль» представляет одновременно администрируемую комбинацию двух и более лекарственных препаратов, обладающих различным механизмом фармакологического действия и направленных на различные биомишени, участвующие в патогенезе заболевания.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя соединение формулы 1 и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлимых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.

«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе синтеза, выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валериаты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропионаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные (Подробное описание свойств таких солей дано в Berge S.M., et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66: 1-19). Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, при этом могут быть синтезированы соли металлов и аминов. К металлическим относятся соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из которых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид натрия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быть получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие достаточной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях (в частности, они должны обладать низкой токсичностью). К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, бензиламин, дибензиламин, дициклогексиламин, пиперазин, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)аминометан и подобные им. Кроме того, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как, холин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитин и аргинин.

Предметом данного изобретения являются новые ингибиторы репликации вируса гепатита В, представляющие собой 1,1-диоксо-1,4-дигидро-2Н-бензо[1,2,4]тиадиазин-3-оны общей формулы 1, их фармацевтически приемлемые соли и/или гидраты.

где Ar¹ и Ar² представляют собой необязательно одинаковые арилы, в том числе фенил, необязательно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из С₁-С₄алкила, метоксила, галогена, карбоксила необязательно замещенного карбамоила и карбонитрила.

Соединения общей формулы 1, как неожиданно установили авторы, оказались эффективными ингибиторами репликации вируса гепатита В.

Согласно данному изобретению предпочтительными ингибиторами общей формулы 1 являются 1,1-диоксо-1,4-дигидро-2Н-бензо[1,2,4]тиадиазин-3-оны 1.1-1.15.

Ингибиторы репликации вируса гепатита В общей формулы 1 являются коммерчески доступными соединениями от ряда компаний, в том числе от ChemDiv, Inc. (USA) [база данных SciFinder® от Chemical Abstracts Service].

Ингибирующую активность соединений общей формулы 1 (ингибирование секреции "е"-антигена (HBeAg) в культуре клеток HepG2/NTCP, зараженных HBV) определяли методом ELISA по протоколу, описанному ниже в Примере 1, а их цитотокчичность определяли по протоколу, описанному ниже в Примере 2.

Согласно данному изобретению новые ингибиторы общей формулы 1 представляют собой лекарственное начало для приготовления фармацевтической композиции и готовых лекарственных форм для профилактики и лечения HBV у теплокровных животных и людей.

Предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, для лечения гепатита В у людей и теплокровных животных, включающая в свой состав ингибитор репликации HBV общей формулы 1 в терапевтически эффективном количестве.

Фармацевтические композиции могут включать фармацевтически приемлемые эксципиенты. Под фармацевтически приемлемыми экспициентами подразумеваются применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или носители. Фармацевтическая композиция наряду с ингибитором общей формулы 1 или их фармацевтически приемлемой солью и/или гидратом по настоящему изобретению может включать и другие активные субстанции, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов.

При необходимости использования фармацевтической композиции по настоящему изобретению в клинической практике она может смешиваться с традиционными фармацевтическими носителями.

Носители, используемые в фармацевтических композиций по настоящему изобретению, представляют собой носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе: в пероральных формах используются связующие вещества, смазывающие агенты, дезинтеграторы, растворители, разбавители, стабилизаторы, суспендирующие агенты, бесцветные агенты, корригенты вкуса; в формах для инъекций используются антисептические агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы; в местных формах используются основы, разбавители, смазывающие агенты, антисептические агенты.

Предметом данного изобретения является способ получения фармацевтической композиции смешением с инертным наполнителем и/или растворителем, по крайней мере, одного ингибитора общей формулы 1 или его фармацевтически приемлемой соли в терапевтически эффективном количестве.

Предметом данного изобретения являются также терапевтические коктейли для лечения гриппа, включающие в качестве одного из компонентов новое лекарственное средство или новую фармацевтическую композицию, содержащих в качестве активного компонента, по крайней мере, одно соединение общей формулы 1 или его фармацевтически приемлемую соль и/или гидрат.

Терапевтический коктейль для лечения HBV, наряду с фармацевтической композицией по данному изобретению, может включать другие известные препараты, предназначенные для лечения вируса гепатита В, или препараты, усиливающие иммунную систему пациента.

В соответствии с данным изобретением способ профилактики и лечения гепатита В у животных и людей заключается во введении пациенту новой фармацевтической композиции или нового терапевтического коктейля.

Лекарственные средства могут вводиться через ингалятор, перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местно). Клиническая дозировка средства общей формулы 1 у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 10~500 мг. Поэтому во время приготовления из фармацевтической композиции ингибитора по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единица дозировки препарата должна содержать 10~500 мг ингибитора общей формулы 1. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени.

Предметом данного изобретения является также способ ингибирования активности HBV в естественных условиях, включающий стадию контактирования ингибитора общей формулы 1 и HBV. Данное изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Определение противовирусной активности фармацевтической композиции, содержащей в качестве активной субстанции один из ингибиторов общей формулы 1, в отношении вирусов гепатита В (HBV) в культуре клеток человеческой гепатомы (HepG2/NTCP), зараженной HBV in vitro (Elife 2012 Nov 13; 1: e00049. doi: 10.7554/eLife.00049).

Для определения активности ингибиторов использовался иммунный in vitro тест ELISA на "е"-антиген вируса HBV (HBeAg). С помощью этого теста измерялась эффективность ингибирования тестируемыми соединениями продукции антигена (и, следовательно, репликации вируса) в клетках, инфицированных вирусом HBV. Использованная в данном эксперименте культура клеток HepG2/NTCP способна, будучи инфицированной вирусом HBV, поддерживать полный цикл вирусной репликации.

Препарат HBV, использованный в данном эксперименте для инфекции клеток HepG2/NTCP, был получен из супернатантов клеточных культур линии AD38, секретирующей HBV в отсутствии тетрациклина (Antimicrob. Agents Chemother. 1997 Aug; 41(8): 1715-20).

Клетки HepG2/NTCP были высеяны в 96-луночные платы (3,0×10³ клеток на лунку) в среде Huh-7 (50 мкл на каждую лунку). Для каждого тестируемого соединения приготовили 6 растворов в среде Huh-7 в диапазоне концентраций 0,2-60 мкМ. Спустя 4 часа после высеивания клеток исходный раствор был удален при помощи аспирации, после чего к каждой лунке добавили 50 мкл раствора тестируемого соединения, а также 50 мкл препарата HBV. Таким образом, финальные концентрации тестируемых соединений были в диапазоне 0,1-30 мкмоль/л. После инкубации в течение 24 часов вирусная среда была удалена при помощи аспирации, и к культурам были добавлены тестируемые соединения в исходных концентрациях до конечного объема 200 мкл. Клетки и тестируемые соединения инкубировали дополнительно в течение 7 дней при 37°С в атмосфере воздуха, содержащей 5% углекислого газа (CO₂). Культуральные супернатанты исследовали на содержание HBeAg при помощи коммерческого диагностического набора "HBeAg Elisa 4.0" (MP Biomedicals, Singapore) в соответствии с рекомендациями производителя. Кратко, от 10 до 50 мкл супернатантов вносили в 96-луночные планшеты с адсорбированными антителами к HBeAg, добавляли второе анти-HBeAg антитело, меченое пероксидазой хрена, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Промывали каждую лунку троекратно раствором PBS, затем обрабатывали 100 мкл/лун раствора OPD (приготовлен растворением 1 таблетки OPD в 12 мл цитрат-фосфатного буфера с добавлением 5 мкл 30% Н₂О₂) в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением к каждой лунке 100 мкл 2N H₂SO₄, после чего измеряли поглощение при длине волны 490 нм. Величину ЕС₅₀, представляющую из себя концентрацию тестируемого соединения, при котором репликация вируса понижается вдвое, определяли для каждого тестируемого соединения при помощи программы Xlfit.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой противовирусной активности ингибиторов общей формулы 1 в отношении HBV. Так, например, в таблице 1 представленны значения ЕС₅₀ для некоторых представителей ингибиторов общей формулы 1 в отношении HBV.

Пример 2. Определение цитотоксичности ингибиторов общей формулы 1.

Для определения цитотоксичности субстанций клетки HepG2/NTCP высевались в черной микроплате с прозрачным дном (96 ячеек, 3,0×10³ клеток на лунку). Для каждого ингибитора использовали три независимых повтора. Тестируемые ингибиторы добавляли через 18 часов, после чего клетки инкубировали с веществами в течение 7 дней. Промывали дважды каждую лунку фосфатно-солевым буфером PBS (0,2 мл/лун) и затем лизировали клетки добавлением клеточного буфера (50 мкл/лун) (все указанные реактивы входят в комплект набора ATPLite, Perkin-Elmer, USA). Микроплату инкубировали в течение 5 минут на вращающейся платформе при 600 об/мин, после чего добавляли в каждую лунку 50 мкл раствора субстрата (часть набора ATPLite). Инкубировали еще 5 минут на вращающейся платформе при 600 об/мин, выдерживали 10 минут в темноте и затем измеряли люминесценцию на приборе TopCount NXT (Packard, Perkin Elmer). Величину CC₅₀, представляющую из себя концентрацию тестируемого соединения, при котором жизнеспособность клеток понижается вдвое, определяли для каждого тестируемого ингибитора общей формулы 1 и общей формулы 2 при помощи программы Xlfit. Полученные результаты свидетельствуют о низкой цитотоксичности ингибиторов (СС₅₀ >30 µМ) общей формулы 1.

Пример 3. Получение лекарственного средства в форме таблеток. Смешивают 1600 мг крахмала, 1600 мг измельченной лактозы, 400 мг талька и 1000 мг ингибитора 1.13 и спрессовывают в брусок. Полученный брусок измельчают в гранулы и просеивают через сита, собирая гранулы размером 14-16 меш. Полученные гранулы таблетируют в подходящую форму таблетки весом 560 мг каждая.

Пример 4. Получение лекарственного средства в форме капсул. Тщательно смешивают ингибитор 1.13 с порошком лактозы в соотношении 2:1. Полученную порошкообразную смесь упаковывают по 600 мг в желатиновые капсулы подходящего размера.

Пример 5. Получение лекарственного средства в форме инъекционных композиций для внутримышечных, внутрибрюшинных или подкожных инъекций. Смешивают 500 мг ингибитора 1.13 с 300 мг хлорбутанола, 2 мл пропиленгликоля и 100 мл инъекционной воды. Полученный раствор фильтруют и помещают по 1 мл в ампулы, которые запаивают.

1. Ингибиторы репликации вируса гепатита В, представляющие собой 1,1-диоксо-1,4-дигидро-2Н-бензо[1,2,4]тиадиазин-3-оны общей формулы 1, их фармацевтически приемлемые соли и/или гидраты.

где Ar¹ и Ar² представляют собой фенил, необязательно замещенный одним, двумя или тремя одинаковыми или различными заместителями, выбранными из С₁-С₄алкила, метоксила, галогена, карбоксила и карбонитрила.

2. Ингибитор по п. 1, представляющие собой 1,1-диоксо-1,4-дигидро-2Н-бензо[1,2,4]тиадиазин-3-он выбранный из ряда соединений формулы 1.1-1.15.
3. Фармацевтическая композиция в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, для лечения гепатита В, содержащая ингибитор репликации вируса гепатита В общей формулы 1 по п. 1, его фармацевтически приемлемую соль и/или гидрат в терапевтически эффективном количестве.

4. Способ получения фармацевтической композиции смешением с инертным наполнителем и/или растворителем, по крайней мере, одного ингибитора общей формулы 1 по п. 1 или его фармацевтически приемлемой соли и/или гидрата в терапевтически эффективном количестве.

5. Способ профилактики и лечения вируса гепатита В, заключающийся во введении пациенту ингибитора репликации вируса гепатита В общей формулы 1 по п. 1, его фармацевтически приемлемой соли и/или гидрата или фармацевтической композиции по п. 3, содержащей в качестве активного компонента, по крайней мере, один ингибитор репликации вируса гепатита В общей формулы 1 по п. 1, его фармацевтически приемлемую соль и/или гидрат.

6. Способ ингибирования активности вируса гепатита В в естественных условиях, включающий стадию контактирования ингибитора общей формулы 1 по п. 1, его фармацевтически приемлемой соли и/или гидрата и вируса гепатита В.