Ферментный биокатализатор для нейтрализации фосфорорганических соединений in vivo

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментному биокатализатору в виде наноразмерных частиц, представляющих собой нековалентные полиэлектролитные комплексы, образованные полигистидинсодержащим полипептидом с активностью органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полиглутаминовой кислотой. Полипептид и блок-сополимер для приготовления ферментного биокатализатора берут в мольном соотношении в диапазоне от 2:1 до 1:5. Ферментный биокатализатор дополнительно содержит низкомолекулярный полиэтиленгликоль с молекулярной массой 0,4-6 кг/моль, вводимый в мольном соотношении «полипептид:полиэтиленгликоль» в диапазоне от 2:1 до 1:100. Изобретение обеспечивает способ получения указанного ферментного биокатализатора и способ детоксификации фосфорорганических соединений (ФОС) in vivo путём внутривенного, внутримышечного, внутрибрюшного или трансбуккального введения указанного ферментного биокатализатора в организм человека или животных. Изобретение позволяет получить ферментный биокатализатор с улучшенной эффективностью осуществления детоксификации ФОС в организме, за счёт улучшенного проникновения в кровоток и пролонгированной циркуляции в нём. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментным биокатализаторам в виде наноразмерных частиц, представляющих собой нековалентные полиэлектролитные комплексы, образованные полигистидинсодержащим полипептидом с активностью органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полиглутаминовой кислотой, содержащие дополнительно вводимый низкомолекулярный полиэтиленгликоль и предназначенные для детоксификации фосфорорганических соединений (ФОС) in vivo путем их гидролиза. Изобретение может быть использовано в качестве антидота при профилактике и элиминировании интоксикации, вызванной попаданием ФОС в организм человека или животных в результате чрезвычайных ситуаций (катастроф или террористических актов) или регулярного контакта с ФОС при их производстве, применении, хранении и утилизации.

Являясь производными ортофосфорной и алкилфосфоновой кислот, ФОС широко применяются в качестве пестицидов (в сельском, приусадебном и домашнем хозяйстве), ингибиторов коррозии (в теплоэнергетике, нефте- и газодобывающей промышленности), пластификаторов и стабилизаторов (в строительной промышленности, в составе моющих и чистящих средств промышленного назначения) [Basic and Clinical Toxicology of Organophosphorus Compounds (eds. Balali-Mood M. and Abdollahi M.)// London: Springer-Verlag, 2014, ISBN 978-1-4471-5624-6, 257 р.]. Кроме того, к числу ФОС относятся высокотоксичные боевые отравляющие вещества нервно-паралитического действия (зоман, зарин, Vx) и продукты их разложения (метилфосфоновая кислота и ее эфиры).

Ежегодно ФОС производят, складируют и применяют в объеме сотен тысяч тонн [Pesticides industry sales and usage. (Eds. Grube A., Donaldson D., Kiely Т., Wu L.).// Washington: United States Environmental Protection Agency, 2011, EPA 733-R-11-001], что вместе с низкими скоростями их разложения в условиях окружающей среды приводит к накоплению и обнаружению этих веществ первоначально в почве, откуда затем они проникают в грунтовые и речные воды, продукты питания, табачные и хлопчатобумажные изделия и даже домашнюю пыль [Obendorf S.K., Lemley А.Т., Hedge A., Kline А.А., Tan K., Dokuchaeva Т. Distribution of pesticide residues within homes in central New York state. // Arch. Environ. Contam. Toxicol, 2006, V. 50(1), р. 31-44]. ФОС оказывают на организм человека преимущественно нейротоксичное воздействие, которое в зависимости от концентрации ФОС может быть острым или отставленным, что сопровождается широким спектром заболеваний различной этиологии [Eaton D.L., Daroff R.B., Autrup Н., Bridges J., Buffler P., Costa L.G., Coyle J., McKhann G., Mobley W.C., Nadel L., Neubert D., Schulte-Hermann R., Spencer P.S. Review of the toxicology of chlorpyrifos with an emphasis on human exposure and neurodevelopment. // Crit. Rev. Toxicol., 2008, 38 Suppl 2, p. 1-125].

Детоксификация различных ФОС с помощью таких биокатализаторов, как ферменты, обладающих широким гидролитическим субстратным спектром действия и высокой избирательной каталитической активностью по отношению к ФОС, имеет ряд преимуществ, а именно она проходит в мягких условиях, и продукты гидролиза, как правило, являются биологически деградируемыми соединениями. На сегодняшний день наиболее высокоактивным ферментом, осуществляющим биодеструкцию самого широкого спектра ФОС, является органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1, арилдиалкилфосфатаза), катализирующая гидролиз эфирной связи в производных ортофосфорной и фосфоновой кислот [Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. // Успехи биол. химии, Т. 44, 2004, с. 307-340]. Поэтому целесообразным представляется использование данного фермента или его структурных производных при создании биокатализаторов, предназначенных для детоксификации ФОС in vivo.

Известно несколько ферментных биокатализаторов, разработанных на основе ОРН и ее производных для использования в качестве антидотов против нейротоксичного действия ФОС in vivo.

Для их получения чаще всего используется химическая модификация поверхности фермента, например:

- полиэтиленгликолем [Jun D., Musilová L., Link M., Loiodice M., Nachon F., Rochu D., Renault F., Masson P. Preparation and characterization of methoxy polyethylene glycol-conjugated phosphotriesterase as a potential catalytic bioscavenger against organophosphate poisoning. // Chem. - Biol. Interact., 2010, V. 187, p. 380-383; Trovaslet-Leroy M., Musilova L., Renault F., Brazzolotto X., Misik J., Novotny L., Froment M.T., Gillon E., Loiodice M., Verdier L., Masson P., Rochu D., Jun D., Nachon F. Organophosphate hydrolases as catalytic bioscavengers of organophosphorus nerve agents. // Toxicol. Lett., 2011, V. 206 (1), p. 14-23; Novikov B.N., Grimsley J.K., Kern R.J., Wild J.R., Wales M.E. Improved pharmacokinetics and immunogenicity profile of organophosphorus hydrolase by chemical modification with polyethylene glycol.// J. Control. Release, 2010, V. 146, p. 318-325; Perezgasga L., Sánchez-Sánchez L., Aguila S., Vazquez-Duhalt R. Substitution of the catalytic metal and protein PEGylation enhances activity and stability of bacterial phosphotriesterase. // Appl. Biochem. Biotechnol, 2012, V. 166(5), p. 1236-1247],

- полиакриламидом [Wei W., Du J., Li J., Yan M., Zhu Q., Jin X., Zhu X., Hu Z., Tang Y., Lu Y. Construction of robust enzyme nanocapsules for effective organophosphate decontamination, detoxification, and protection. // Adv. Mater., 2013, V. 25(15), p. 2212-2218],

- блок-сополимером полиэтиленгликоля с полипропиленгликолем (плюроником) [Suthiwangcharoen N., Nagarajan R. Enhancing enzyme stability by construction of polymer-enzyme conjugate micelles for decontamination of organophosphate agents. // Biomacromolecules, 2014, V. 15(4), p. 1142-1152].

Недостатками данных ферментных биокатализаторов являются невысокая ферментативная активность, которая может достигать всего 25% от исходного уровня фермента, взятого для получения биокатализатора, и трудоемкая процедура их получения. Подобных недостатков лишен ферментный биокатализатор, получение которого основано на использовании физических или физико-химических взаимодействий.

Известен ферментный биокатализатор на основе ОРН, нанокапсулированной в полиоксазолиновый разветвленный полимер и предназначенный для применения в качестве антидота [Petrikovics I., Wales М.Е., Jaszberenyi J.C., Budai M., Baskin S.I., Szilasi M., Logue B.A., Chapela P., Wild J.R. Enzyme-based intravascular defense against organophosphorus neurotoxins: Synergism of dendritic-enzyme complexes with 2-PAM and atropine. // Nanotoxicology, 2005, V. 1(2), p. 85-92; Petrikovics I., Wales M., Budai M., Yu J.C., Szilasi M. Nano-intercalated organophosphorus-hydrolyzing enzymes in organophosphorus antagonism. // AAPS PharmSciTech, 2012, V. 13(1), p. 112-117]. Биокатализатор получают в 50 мМ бис-трис-пропановом буфере (рН 8,5) путем смешивания полимера с ферментом в весовом соотношении 20:1. Конечная концентрация комплекса в буфере составляет 20 г/л, который далее лиофилизуют. Активность готового препарата составляет 1-5 Ед/мг_преп, или в пересчете на фермент - 48-238 Ед/г_белка. Внутривенное введение такого ферментного биокатализатора мужским особям мышей в дозе 500-2500 мг/кг позволяет улучшить в 2,85 раза защиту животных от токсичного действия Параоксона, вводимого внутрибрюшно через 1 ч после введения биокатализатора, по сравнению с результатом применения неинкапсулированного фермента в тех же условиях.

Вместе с этим описанный ферментный биокатализатор обладает рядом существенных недостатков, а именно:

- его низкая удельная активность приводит к необходимости введения его в огромных дозах для достижения целевого эффекта, что существенно усложняет саму процедуру введения, поскольку в расчете на 1 человека применяемая доза достигает 150 г сухого препарата внутривенно, а потому может приводить к иммунотоксичному воздействию биокатализатора на организм in vivo и повышать экономические затраты на применение препарата;

- отсутствие данных по каталитическим характеристикам и возможности детоксификации других ФОС кроме Параоксона, а также отсутствие данных по диапазону рН- и температурного действия, термостабильности, фармакокинетических характеристиках данного биокатализатора не позволяют оценить потенциал его практического применения.

Известен ферментный биокатализатор на основе гексагистидин-содержащей ОРН (His₆-OPH) в виде фермент-полиэлектролитных комплексов с блок-сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля (плюрониками) [Kim М., Gkikas М., Huang A., Kang J.W., Suthiwangcharoen N., Nagarajan R., Olsen B.D. Enhanced activity and stability of organophosphorus hydrolase via interaction with an amphiphilic polymer. // Chem. Commun. (Camb.), 2014, V. 50(40), p. 5345-5348]. Биокатализатор получают в 40 мМ HEPES-буфере (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоновая кислота), содержащем 100 мМ NaCl и 0,1 мМ CoCl₂, при рН 8,0 путем смешивания очищенного фермента и плюроников с различным строением (ПЭГ_x-ППГ_y-ПЭГ_x и ПЭГ_x-ППГ_y) и молекулярной массой (в диапазоне 3,4-13,2 кг/моль). Каталитическая эффективность действия полученного биокатализатора может быть изменена за счет варьирования мольного соотношения «фермент:полимер». Максимальная эффективность действия может быть получена при соотношении 1:1000 (для плюроника Р123, ПЭГ₂₀-ППГ₇₀-ПЭГ₂₀, молекулярная масса 5,8 кг/моль) и 1:100000 (для плюроника F127, ПЭГ₁₀₁-ППГ₅₆-ПЭГ₁₀₁, молекулярная масса 12,5 кг/моль). Этот биокатализатор характеризуются увеличенной на 10-40% активностью в отношении Метилпараоксона и стабильностью при хранении в разбавленном виде (концентрация 0,2 мг/л и менее), может сохранять на 40% больше активности по сравнению с исходным ферментом в течение 2-часовой реакции гидролиза.

Исследование описанного биокатализатора имеет ряд недостатков:

- отсутствие информации о возможности его использования in vivo, а следовательно, и фармакокинетических данных;

- отсутствие данных о способности ферментного биокатализатора гидролизовать различные ФОС.

Известен ферментный биокатализатор на основе His₆-OPH в виде фермент-полиэлектролитных комплексов с блок-сополимерами полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты для применения в качестве детоксифицирующего средства in vivo [Патент РФ 2525658, 2014; МПК⁷ C12N 11/02, C12N 11/08, C12N 9/16. Наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo]. Биокатализатор получают смешиванием очищенного фермента с блок-сополимером, имеющего молекулярную массу 6,5-13 кг/моль, в зарядовом соотношении в диапазоне от 2:1 до 1:5, при рН 7,5-10,5 и температуре 8-30°С. Биокатализатор проявляет активность при рН 7,0-12,0 и температуре 15-60°С в отношении Параоксона, Хлорпирифоса, Паратиона, Диазинона, Метилпаратиона, Кумафоса и вещества Vx, причем каталитическая эффективность действия составляет 95-100% от активности исходного фермента. При внутривенном введении ферментных биокатализаторов в дозе 1 мг/кг клиренс (скорость выведения) у белых крыс составляет 27,6-41,5 мл/ч. При введении этого биокатализатора испытуемым крысам за 1 ч до введения LD₅₀ вещества Vx позволяет снизить количество погибших животных в 2-3 раза по сравнению с контрольной группой (без защиты).

Этот ферментный биокатализатор также обладает рядом недостатков:

- он характеризуется большим диапазоном скорости выведения, которая должна быть максимально сниженной для пролонгирования действия ферментного биокатализатора in vivo;

- для биокатализатора показан лишь 1 способ введения - внутривенно, обеспечивающий детоксификацию ФОС in vivo, и при другом способе введения биокатализатора могут возникать сложности с проникновением препарата в кровоток.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по своему назначению и способу получения, а именно получению наноразмерного биокатализатора с органофосфатгидролазной активностью, представляющего собой нековалентный комплекс фермента с блок-сополимером и предназначенного для детоксификации ФОС in vivo, принято за прототип.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка ферментного биокатализатора в виде наноразмерных частиц для детоксификации ФОС in vivo, представляющих собой высокоактивные и термостабильные нековалентные полиэлектролитные комплексы с широким субстратным спектром действия, улучшенным проникновением в кровоток и пролонгированной циркуляцией в нем, то есть увеличенным временем выведения.

Поставленная задача решается тем, что ферментный биокатализатор, предназначенный для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo, получают в виде наноразмерных частиц нековалентных полиэлектролитных комплексов, сформированных полигистидинсодержащим полипептидом со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимером полиэтиленгликоля с полиглутаминовой кислотой разной степени полимеризации, взятыми в зарядовом соотношении «полипептид:блок-сополимер» в диапазоне от 2:1 до 1:5, при рН 7,0-10,5 и температуре +4÷30°С, и дополнительно содержащих низкомолекулярный полиэтиленгликоль с молекулярной массой 0,4-6 кг/моль, вводимый в мольном соотношении «полипептид:полиэтиленгликоль» в диапазоне от 2:1 до 1:100.

В качестве основного каталитического элемента в предлагаемом изобретении используется оригинальный полигистидинсодержащий полипептид с активностью органофосфатгидролазы, который характеризуется существенно улучшенными по отношению к исходному ферменту органофосфатгидролазе каталитическими характеристиками, позволяющими использовать его для гидролиза ФОС в более широком диапазоне рН и температуры, а также большей эффективностью [Патент РФ 2255975, 2005; МПК⁷ C12N 1/21, C12N 15/52, C12N 15/70. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы; Патент РФ 2296164, 2007; МПК⁷ C12S 13/00, A62D 3/00. Способ ферментативного гидролиза боевых отравляющих веществ. Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. Свойства гексагистидин-содержащей органофосфатгидролазы. // Биохимия, 2006, Т. 76, №2, с. 216-222].

Наличие полигистидиновой последовательности в молекуле полипептида позволяет проводить высокоэффективную быструю очистку и выделение такого фермента из клеток E.coli в одну стадию за счет образования множественных координационных связей между молекулой гибридного белка и металл-хелатирующими носителями [Efremenko Е., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. Purification of Hise-organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microb. Biotech., 2006, V. 70(5), p. 558-563], и, следовательно, масштабирование процесса его наработки с целью использования при получении заявляемого ферментного биокатализатора легко реализуемо.

Для стабилизации ферментативной активности полигистидинсодержащего пептида в крови при его непосредственном введении в организм, согласно заявляемому изобретению, формируют нековалентный полиэлектролитный комплекс, для чего ферментный раствор смешивают в определенном соотношении с раствором блок-сополимера полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты. Получение такого комплекса способствует формированию наноразмерных частиц, удобных для применения in vivo [Патент РФ 2525658, 2014; МПК⁷ C12N 11/02, C12N 11/08, C12N 9/16. Наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo] и использования в процессе детоксификации нейротоксинов. Кроме того, поскольку такая модификация поверхности фермента способствует снижению его иммуногенности как чужеродного белка, вводимого в организм животных или человека, а также позволяет увеличить время пребывания фермента в организме в каталитически активной форме за счет увеличения его стабильности и снижения его доступности к гидролитическому воздействию литических ферментов крови.

В качестве блок-сополимера для модификации полигистидинсодержащего полипептида с активностью ОРН в заявляемом изобретении используется блок-сополимер полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, имеющей разную степень полимеризации. Такое техническое решение обеспечивает формирование устойчивого полиэлектролитного комплекса между положительно заряженными функциональными группами, локализованными на стороне, противоположной активному центру фермента, и полианионом. При этом блок-сополимер не затрагивает активный центр фермента, позволяя сохранять его высокую активность, но при этом существенно стабилизирует активную конформацию белка. Физический метод стабилизации полипептида, используемый в заявляемом изобретении, гарантирует максимальное сохранение исходных характеристик фермента.

Диапазон варьирования зарядового соотношения фермента и блок-сополимера (от 2:1 до 1:5), применяемый для получения заявляемого биокатализатора, выбран экспериментально и обеспечивает получение высокоактивного и термостабильного ферментного биокатализатора в виде наноразмерных частиц. Увеличение этого соотношения в сторону повышения доли фермента приводит к снижению стабильности его действия в диапазоне рН 7,0-12,0 и температуры 15-60°С, а увеличение доли полимера в соотношении фермент:полимер свыше 1:5 приводит к снижению каталитической активности биокатализатора и не приводит к заметному улучшению термостабильности ферментного биокатализатора.

Для улучшения эффективности проникновения биокатализатора в кровоток и увеличения длительности его циркуляции в заявляемом изобретении используется введение в состав биокатализатора низкомолекулярного полиэтиленгликоля с молекулярной массой 0,4-6 кг/моль. Обладая амфифильностью, данный компонент облегчает мембранный транспорт различных низко- и высокомолекулярных соединений, особенно - плохо- или нерастворимых в воде [Li М., Si L., Pan Н., Rabba А.К., Yan F., Qiu J., Li G. Excipients enhance intestinal absorption of ganciclovir by P-gp inhibition: assessed in vitro by everted gut sac and in situ by improved intestinal perfusion. // Int. J. Pharm., 2011, V. 403(1-2), p. 37-45]. Оптимальное мольное соотношение «фермент:полиэтиленгликоль», установленное экспериментально, находится в диапазоне от 2:1 до 1:100. Его снижение приводит к отсутствию значимого эффекта на пенетрацию препарата, а превышение указанного диапазона - к снижению каталитической эффективности действия ферментного биокатализатора. Еще одним позитивным эффектом от введения низкомолекулярного полиэтиленгликоля является увеличение длительности циркуляции биокатализатора в кровотоке.

Такое сочетание всех основных компонентов наноразмерного ферментного биокатализатора, которое указано в заявляемом техническом решении, с использованием заявляемых соотношений фермента и блок-сополимера, эффективное взаимодействие которых осуществляется при рН 7,0-10,5 и температуре 4÷30°С, ранее известно не было и позволяет характеризовать предлагаемое техническое решение как новое.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц, приготовленный на основе His₆-OPH и ПЭГ-ПГК₅₀, взятых в зарядовом соотношении 2:1, содержащий ПЭГ₉ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₉»=1:10.

К очищенному ферменту His₆-OPH, находящемуся в 100 мМ карбонатном буфере (рН 9,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ₁₁₉-ПГК₅₀ (M_W=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,09 г/л. В приготовленную смесь вносят 56 мг/л ПЭГ₉ (M_W=0,4 кг/моль) и оставляют при температуре +8°С на 40 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 2:1, содержащего ПЭГ₉ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₉»=1:10.

Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 40±4 нм, обладает каталитической константой действия по фосфорорганическому пестициду Параоксону 4440±270 с^-1, константой Михаэлиса 18,4±2,7 мкМ и константой эффективности действия (2,4±0,5)×10⁸ M^-1c^-1, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Снижение активности данного биокатализатора, экспонированного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 4%. Расчетный период полуинактивации биокатализатора при 37°С составляет как минимум 490 ч. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс (скорость выведения) у белых крыс составляет 27,3 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.

Пример 2. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц, приготовленный на основе His₆-OPH и ПЭГ-ПГК₁₀, взятых в зарядовом соотношении 1:1, содержащий ПЭГ₆₈ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₆₈»=1:1.

К очищенному ферменту His₆-OPH, находящемуся в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,8) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ₁₁₉-ПГК₁₀ (M_W=6,5 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,45 г/л. В приготовленную смесь вносят 42 мг/л ПЭГ₆₈ (M_W=3 кг/моль) и оставляют при комнатной температуре на 30 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:1, содержащего ПЭГ₆₈ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₆₈»=1:1.

Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 35±5 нм, обладает константой эффективности действия (3,5±0,2)×10⁷ M^-1c^-1 по фосфорорганическому пестициду Паратиону, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Снижение активности данного биокатализатора, экспонированного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 5%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс (скорость выведения) у белых крыс составляет 27,9 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.

Пример 3. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц, приготовленный на основе His₆-OPH и ПЭГ-ПГК₅₀, взятых в зарядовом соотношении 1:2, содержащий ПЭГ₉ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₆»=1:100.

К очищенному ферменту His₆-OPH, находящемуся в 100 мМ карбонатном буфере (рН 10,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ₁₁₉-ПГК₅₀ (M_W=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,36 г/л. В приготовленную смесь вносят 0,56 г/л ПЭГ₉ (M_W=0,4 кг/моль) и оставляют при температуре 30°С на 20 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:2, содержащего ПЭГ₉ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₉»=1:100.

Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 41±3 нм, обладает константой эффективности действия (6,6±0,6)×10⁶ M^-1c^-1 по фосфорорганическому пестициду Метилпаратиону, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Снижение активности данного биокатализатора, экспонированного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 6%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс (скорость выведения) у белых крыс составляет 27,0 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.

Пример 4. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц, приготовленный на основе His₆-OPH и ПЭГ-ПГК₅₀, взятых в зарядовом соотношении 1:5, содержащий ПЭГ₁₃₆ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₁₃₆»=2:1.

К очищенному ферменту His₆-OPH, находящемуся в 50 мМ карбонатном буфере (рН 10,5) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ₁₁₉-ПГК₅₀ (M_W=13 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,9 г/л. В приготовленную смесь вносят 42 мг/л ПЭГ₁₃₆ (M_W=6 кг/моль) и оставляют при температуре 20°С на 30 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:5, содержащего ПЭГ₁₃₆ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₁₃₆»=2:1.

Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 37±4 нм, обладает константой эффективности действия (7,0±0,5)×10⁵ M^-1c^-1 по фосфорорганическому пестициду Кумафосу, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Снижение активности данного биокатализатора, экспонированного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 5%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс (скорость выведения) у белых крыс составляет 31,5 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.

Пример 5. Ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц, приготовленный на основе His₆-OPH и ПЭГ-ПГК₁₀₀, взятых в зарядовом соотношении 1:4, содержащий ПЭГ₁₃₆ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₁₃₆»=1:5.

К очищенному ферменту His₁₂-OPH, находящемуся в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,0) в концентрации 1 г/л, добавляют 20 г/л водный раствор ПЭГ₁₁₉-ПГК₁₀₀ (M_W=20,5 кг/моль) так, чтобы концентрация блок-сополимера составила 0,57 г/л. В приготовленную смесь вносят 0,42 г/л ПЭГ₁₃₆ (M_W=6 кг/моль) и оставляют при температуре 4°С на 30 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:4, содержащего ПЭГ₁₃₆ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₁₃₆»=1:5.

Полученный ферментный биокатализатор имеет размер частиц 30±5 нм, обладает константой эффективности действия (2,7±0,3)×10⁵ M^-1c^-1 по фосфорорганическому пестициду Диазинону, функционирует в диапазоне рН 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Снижение активности данного биокатализатора, экспонированного при 55°С в течение 15 мин, составляет менее 3%. При внутривенном введении ферментного биокатализатора в дозе 1 мг/кг клиренс (скорость выведения) у белых крыс составляет 27,1 мл/ч. Специфические антитела к ферментному биокатализатору этого состава при его введении в указанной дозе в плазме крови исследованных животных отсутствуют.

Пример 6. Свойства заявляемого ферментного биокатализатора как антидота при детоксификации ФОС in vivo.

Ферментный биокатализатор в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 2:1, содержащего ПЭГ₉ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₉»=1:10, получение которого описано в Примере 1, вводят внутривенно белым крысам в дозе 1 мг/кг. Через 2 ч крысам внутривенно вводят вещество Vx в дозе LD₅₀, фиксируют гибель 16,7% животных и наблюдают уменьшение количества погибших животных в 3 раза по сравнению с контрольной группой.

Ферментный биокатализатор в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:2, содержащего ПЭГ₉ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₉»=1:100, получение которого описано в Примере 3, вводят внутрибрюшно белым крысам в дозе 1 мг/кг. Через 3 ч крысам внутримышечно вводят Параоксон в дозе 4×LD₅₀ (соответствует 3,6×LD₁₀₀) и фиксируют отсутствие гибели животных.

Ферментный биокатализатор в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 1:4, содержащего ПЭГ₁₃₆ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₁₃₆»=1:5, получение которого описано в Примере 5, вводят внутримышечно белым крысам в дозе 1 мг/кг. Через 10 ч крысам внутримышечно вводят Параоксон в дозе 2×LD₅₀ (соответствует 1,8×LD₁₀₀) и фиксируют отсутствие гибели животных.

Ферментный биокатализатор в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с зарядовым соотношением фермента и блок-сополимера 2:1, содержащего ПЭГ₉ в мольном соотношении «фермент:ПЭГ₉»=1:10, получение которого описано в Примере 1, вводят трансбуккально белым крысам в дозе 1 мг/кг. Через 2 ч крысам внутримышечно вводят Параоксон в дозе 2×LD₅₀ (соответствует 1,8×LD₁₀₀) и фиксируют гибель 20±5% животных.

Таким образом, заявляемое изобретение в сравнении с прототипом характеризуется:

- улучшенной эффективностью проникновения патентуемого ферментного биокатализатора в кровоток и, как следствие этого, увеличенным уровнем ферментативной активности в крови;

- пролонгированным временем циркуляции биокатализатора в крови, что вместе с улучшенным проникновением биокатализатора позволяет более эффективно осуществлять детоксификацию различных ФОС в организме in vivo;

- возможностью применения разных способов введения нанобиокатализатора (внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшно, трансбуккально), а не только внутривенно.

1. Ферментный биокатализатор, предназначенный для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo, в виде наноразмерных частиц нековалентных полиэлектролитных комплексов, включающих полигистидинсодержащий полипептид со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимер полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, взятых в зарядовом соотношении «полипептид:блок-сополимер» в диапазоне от 2:1 до 1:5, отличающийся тем, что дополнительно содержит низкомолекулярный полиэтиленгликоль с молекулярной массой 0,4-6 кг/моль, вводимый в мольном соотношении «полипептид:полиэтиленгликоль» в диапазоне от 2:1 до 1:100.

2. Ферментный биокатализатор по п. 1, отличающийся тем, что молекулярная масса блок-сополимера находится в диапазоне 6,5-20,5 кг/моль, а полиглутаминовая кислота имеет степень полимеризации 10-100.

3. Способ получения ферментного биокатализатора по п. 1, включающий смешивание полигистидинсодержащего полипептида со свойствами органофосфатгидролазы и блок-сополимера полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, взятых в зарядовом соотношении «полипептид:блок-сополимер» в диапазоне от 2:1 до 1:5, и добавление низкомолекулярного полиэтиленгликоля с молекулярной массой 0,4-6 кг/моль, вводимого в мольном соотношении «полипептид:полиэтиленгликоль» в диапазоне от 2:1 до 1:100, с формированием наноразмерных полиэлектролитных комплексов при pH 7,0-10,5 и температуре +4÷(+30)°C.

4. Способ детоксификации фосфорорганических соединений in vivo, включающий внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшное или трансбуккальное введение ферментного биокатализатора по п. 1 в фармацевтически приемлемом количестве.