Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе

Группа изобретений относится к медицине и касается лекарственного средства для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, которое содержит тромбомодулин в качестве активного ингредиента. При этом указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, выбранными из группы, состоящей из дисфункции печени, дисфункции почек, дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения, где значение международного нормализованного отношения (INR) в образце плазмы, полученном от указанного пациента, превышает 1,4. Также предложено лекарственное средство для уменьшения смертности у пациентов с сепсисом. Группа изобретений обеспечивает уменьшения смертности у пациентов с сепсисом, а именно у пациентов с тяжелым сепсисом, сопровождающимся одной или более дисфункциями печени, почек, органов дыхания или органов кровообращания. 2 н. 28 з.п. ф-лы, 4 табл., 8 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к лекарственному средству для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе у пациента с тяжелым сепсисом.

Уровень техники

Сепсис представляет собой синдром системной воспалительной реакции (SIRS), вызываемой инфекцией. Конкретно сепсис определяют как патологическое состояние, которое соответствует, помимо наличия инфекции, двум или более пунктам SIRS ((1) температура тела >38°C или <36°C, (2) частота сердечных сокращений >90/минуту, (3) частота дыхания >20/минуту, или PaCO₂ <32 торр, и (4) число лейкоцитов >12000/мкл или <4000/мкл, или количество незрелых лейкоцитов >10%). Хотя наличию бактерий в крови (бактериемии) до сих пор уделяется значительное внимание, положительный результат на наличие бактерий при посеве крови не является обязательным согласно приведенному выше определению. Помимо сепсиса состояние, характеризующееся дисфункцией органов, гипоперфузией органов или пониженным давлением (гипотензией), называют тяжелым сепсисом. Гипоперфузия органов или нарушенная перфузия включает молочнокислый ацидоз, олигурию, затуманивание сознания и т.п. Помимо тяжелого сепсиса состояние, при котором постоянно наблюдается гипотензия, несмотря на достаточно интенсивную инфузионную терапию, называется септическим шоком (непатентный документ 1). Считается, что нарушение кровообращения, наблюдаемое при указанных патологических состояниях, вызвано нарушением функции симпатической нервной системы или медиатора, высвобождаемого нейтрофилами, и т.п., и дисфункция органов вызывается тканевой гипоксией (dysoxia).

Тромбомодулин известен как вещество, которое специфически связывается с тромбином, ингибируя, таким образом, его коагуляционную активность, и в то же время проявляет антикоагулянтную активность, тем самым существенно усиливая способность тромбина активировать белок C. Также известно, что тромбомодулин увеличивает время свертывания, осуществляемого тромбином, или подавляет агрегацию тромбоцитов, вызываемую тромбином. Белок C является витамин К-зависимым белком, который играет важную роль в свертывании крови и фибринолизе, и он активируется под действием тромбина с превращением в активированный белок С. Известно, что активированный белок С инактивирует активированный фактор свертывания крови V и активированный фактор свертывания крови VIII in vivo, и участвует в образовании активатора плазминогена, обладающего тромболитической активностью (непатентный документ 2). Таким образом, считается, что тромбомодулин способствует активации белка C тромбином и в связи с этим полезен в качестве антикоагулянта или тромболитического агента. Также сообщалось, что в эксперименте на животных тромбомодулин эффективен при терапии или профилактике заболеваний, ассоциированных с состоянием гиперкоагуляции (непатентный документ 3).

Впервые тромбомодулин был открыт и получен в виде гликопротеина, экспрессированного на эндотелиальных клетках сосудов различных видов животных и человека, а затем успешно клонирован. Конкретно ген предшественника тромбомодулина человека, содержащий сигнальный пептид, клонировали из библиотеки кДНК клеток легких человека методами генной инженерии и установили полную последовательность гена тромбомодулина, и в результате открыли аминокислотную последовательность, состоящую из 575 остатков, содержащую сигнальный пептид (как правило, представленный 18 аминокислотными остатками) (патентный документ 1). Известно, что молекула зрелого тромбомодулина, от которой отщепляется сигнальный пептид, состоит из 5 областей, а именно N-концевой области (аминокислотные остатки 1-226, эти положения указаны для случая, когда сигнальный пептид состоит из 18 аминокислотных остатков, и то же самое относится к последующим описаниям), области, содержащей шесть EGF-подобных структур (аминокислотные остатки 227-462), области O-связанного гликозилирования (аминокислотные остатки 463-498), трансмембранной области (аминокислотные остатки 499-521) и цитоплазматической области (аминокислотные остатки 522-557), если считать с N-концевой стороны зрелого пептида. Также известно, что неполный белок, обладающий такой же активностью, как полноразмерный тромбомодулин (т.е. минимальная активная единица), преимущественно состоит из 4-й, 5-й и 6-й EGF-подобных структур, считая с N-конца в области, содержащей шесть EGF-подобных структур (непатентный документ 4).

Полноразмерный тромбомодулин плохо растворяется без сурфактанта (поверхностно-активного вещества), и добавление сурфактанта необходимо при производстве препарата полного тромбомодулина. Также существует растворимый тромбомодулин, который можно полностью растворить даже без сурфактанта. Растворимый тромбомодулин можно получить путем удаления по меньшей мере части трансмембранной области или всей трансмембранной области. Например, доказано, что растворимый тромбомодулин, состоящий только из 3 областей, а именно N-концевой области, области, содержащей шесть EGF-подобных структур, и области O-связанного гликозилирования (т.е. растворимый тромбомодулин, имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 19-516 SEQ ID NO: 9), можно получить с помощью рекомбинантных технологий, и что получаемый рекомбинантный растворимый тромбомодулин обладает такой же активностью, как и полноразмерный тромбомодулин (патентный документ 1). Также имеются некоторые другие сообщения относительно растворимых тромбомодулинов (патентные документы 2-9). Растворимый тромбомодулин, полученный из мочи человека, и т.п. также являются примерами нативных тромбомодулинов (патентные документы 10 и 11).

Как установлено во многих случаях, в результате спонтанных мутаций или мутаций, происходящих при получении тромбомодулинов, полиморфные мутации были обнаружены в генах человека. В настоящее время идентифицированы тромбомодулиновые белки, в которых аминокислота в положении 473 предшественника тромбомодулина человека, имеющего аминокислотную последовательность, состоящую из 575 аминокислотных остатков, заменена на Val или Ala. В нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, указанная вариация аминокислотного остатка соответствует мутации T или C в положении 1418 (непатентный документ 5). Однако два типа тромбомодулинов являются полностью идентичными по активности и физико-химическим свойствам, и их можно считать по существу идентичными.

Сообщается, что тромбомодулин является эффективным при терапевтическом лечении диссеминированного внутрисосудистого свертывания (в дальнейшем также обозначаемого как DIC) (непатентный документ 6). Что касается применения тромбомодулина, в дополнение к упомянутому выше применению, предполагается применение тромбомодулина при терапевтическом и профилактическом лечении различных заболеваний, таких как острый коронарный синдром (ACS), тромбоз, обструкция периферических сосудов, обструктивный артериосклероз, васкулит, функциональное нарушение, возникающее после операции на сердце, осложнение, вызванное трансплантацией органов, стенокардия, транзиторная ишемическая атака, токсикоз беременных, диабет, VOD печени (первичный тромбоз печеночных вен, например, скоротечный гепатит, тромбоз печеночных вен, возникающий после пересадки костного мозга) и тромбоз глубоких вен (DVT), и кроме того, сепсис и респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS) (патентный документ 12).

Ссылки на известный уровень техники

Патентные документы

Патентный документ 1: нерассмотренная патентная публикация Японии (Kokai) No. 64-6219

Патентный документ 2: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 5-213998

Патентный документ 3: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 2-255699

Патентный документ 4: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 3-133380

Патентный документ 5: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 3-259084

Патентный документ 6: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 4-210700

Патентный документ 7: WO92/00325

Патентный документ 8: WO92/03149

Патентный документ 9: WO93/15755

Патентный документ 10: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 3-86900

Патентный документ 11: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 3-218399

Патентный документ 12: WO03/061687

Непатентные документы

Непатентный документ 1: American College of Chest Physicians, CHEST/101/6-/JUNE, 1992:1481-1483

Непатентный документ 2: Koji Suzuki, Igaku no Ayumi (Progress of Medicine), Vol. 125, 901 (1983)

Непатентный документ 3: K. Gomi et al., Blood, 75, 1396-1399 (1990)

Непатентный документ 4: M. Zushi et al., J. Biol. Chem., 246, 10351-10353 (1989)

Непатентный документ 5: D.Z. Wen et al., Biochemistry, 26, 4350-4357 (1987)

Непатентный документ 6: S.M. Bates et al., Br. J. Pharmacol., 144, 1017-1028 (2005)

Сущность изобретения

Цель, которая достигается с помощью изобретения

Целью изобретения является предоставление лекарственного средства или способа эффективного терапевтического лечения или улучшения состояния при сепсисе у пациента с тяжелым сепсисом.

Средства достижения целей

Международное нормализованное отношение (также в дальнейшем обозначаемое сокращением "INR") в образце плазмы пациента с сепсисом, как известно, используют для обозначения коагулопатии. Например, на Конгрессе реаниматологии (CCM), проходившем в 2003 г., показатель INR>1,5, как и значение aPPT>60 с представлены в качестве критерия коагулопатии (Crit. Care Med., 31, pp. 1250-1256 (2003)). Однако показатель INR еще не принят официально в виде точного критерия, поскольку показатель INR не был подтвержден клиническими испытаниями и т.п. В действительности сообщается, что в III-й фазе клинического испытания по лечению пациентов с тяжелым сепсисом с применением Tifagofin в качестве ингибитора внешнего пути активации свертывания крови в классе антикоагулянтов более благоприятный исход получен в группе пациентов с INR≤1,2, чем в группе пациентов с INR>1,2 в качестве результата клинического теста, который преимущественно охватывал пациентов с INR>1,2 (JAMA, July 9, Vo. 290, No. 2, pp. 238-247 (2003)). В то же время в качестве другого результата упомянутого выше клинического теста сообщается, что в классе пациентов с INR>1,2 препарат оказывал более сильный эффект у пациентов с INR>1,5, чем у пациентов с INR>1,2. Кроме того, в случае Xigris, который является единственным препаратом, эффективность которого при сепсисе подтверждена клиническими испытаниями, наблюдали увеличение протромбинового времени (PT) у большинства пациентов в исследовании (93,4%).

Как показано выше, при терапевтическом лечении пациентов с сепсисом антикоагулянтом, высокая эффективность лечения с учетом некоторых результатов клинических исследований ожидается при выборе класса пациентов, у которых заболевание сопровождается коагулопатией. Однако следует принимать во внимание то, что определение коагулопатии еще не принято официально, поскольку, например, получены противоречивые клинические результаты. Другими словами, неясно, как можно получить хороший результат лечения путем подбора соответствующих пациентов с помощью показателя INR, и не существует общей технической информации о том, какой уровень показателя INR у пациента с сепсисом обеспечивает определенную эффективность препарата. В отношении взаимосвязи показателя INR и клинической эффективности считается, что известна только небольшая часть указанной взаимосвязи в виде отдельных случаев для некоторых отдельных препаратов.

В таких условиях авторы изобретения обратили свое внимание среди множества антикоагулянтов на тромбомодулин и провели различные исследования терапевтического эффекта и/или эффекта улучшения состояния при сепсисе. В результате они обнаружили, что сепсис можно лечить терапевтически и/или можно более эффективно улучшить состояние пациентов с тяжелым сепсисом и дисфункциями одного или более органов (за исключением пациентов с тяжелым сепсисом с дисфункцией органов, ограничивающихся печенью или почками), чем у пациентов с тяжелым сепсисом без дисфункции органов, если показатель INR у пациентов превышает 1,4, другими словами, в отношении терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе с помощью тромбомодулина, авторы изобретения обнаружили, что в группе пациентов с сепсисом существует определенная взаимосвязь между состоянием пациентов с тяжелым сепсисом и дисфункциями одного или более органов и показателем INR, превышающим 1,4, которая неожиданна для специалистов в данной области. Авторы изобретения также обнаружили, что у пациентов с тяжелым сепсисом при показателе INR выше 1,4 и равном или меньше 1,6, достигался особенно выраженный эффект, при котором разность между показателями смертности группы тромбомодулина и группы плацебо превышала 15%, и в результате авторы осуществили изобретение. Ввиду того, что разница в показателях смертности между группой лекарственного средства и группой плацебо составляет 6% при использовании препарата Xigris (N. Engl. J. Med., 344, No.10, March 8, pp. 699-709 (2001)), который является единственным коммерчески доступным препаратом в Европе для лечения сепсиса, значение 15% в качестве разницы в показателях смертности является заметным значением, которое выше приблизительно в 2,5 раза, и поэтому можно признать, что в одном из вариантов осуществления изобретения достигается неожиданно удивительный результат.

Конкретно изобретение включает нижеследующее:

[A1] Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, которое содержит тромбомодулин в качестве активного ингредиента, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[A1-2] Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, сопровождаемого коагулопатией, которое содержит тромбомодулин в качестве активного ингредиента, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[A2] Лекарственное средство по пунктам [A1] или [A1-2], упомянутым выше, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4 и равен или меньше 1,6.

[A3] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A2], упомянутых выше, где пациент с тяжелым сепсисом является пациентом с тяжелым сепсисом, у которого дисфункция органов не ограничивается дисфункциями печени или почек.

Если указанные номера пунктов обозначены в виде ряда пунктов "[A1]-[A2]", приведенных выше, и ряд включает пункт, обозначенный номером, имеющим подномер, такой как [A1-2], это значит, что пункт, обозначенный номером, имеющим подномер, такой как [A1-2], также приводится. То же самое относится к нижеследующим определениям.

[A4] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A3], упомянутым выше, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, выбранных из группы, состоящей из дисфункции печени, дисфункции почек, дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения.

[A5] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A4], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой растворимый тромбомодулин.

[A5-2] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A5], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин обладает следующими свойствами (1)-(4):

(1) эффект избирательного связывания с тромбином,

(2) эффект усиления активации белка C тромбином,

(3) эффект увеличения тромбинового времени и

(4) эффект подавления агрегации тромбоцитов, вызываемой тромбином.

[A5-3] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A5], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин обладает следующими свойствами (1)-(5):

(1) эффект избирательного связывания с тромбином,

(2) эффект усиления активации белка C тромбином,

(3) эффект увеличения тромбинового времени,

(4) эффект подавления агрегации тромбоцитов, вызываемой тромбином, и

(5) противовоспалительный эффект.

[A6] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A5-3], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой пептид, полученный из трансформированной клетки, созданной путем трансфекции клетки-хозяина с помощью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11.

[A7] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A6], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность (i-1) или (i-2), приведенную ниже, и указанный пептид представляет собой пептид, обладающий активностями тромбомодулина;

(i-1) аминокислотная последовательность из положений 19-516 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, или

(i-2) аминокислотная последовательность (i-1), приведенная выше, дополнительно содержащая замену, делецию или добавление одного или больше аминокислотных остатков.

[A7-2] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A6], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин представляет собой пептид, содержащий:

(i) аминокислотную последовательность из положений 367-480 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, и аминокислотную последовательность (ii-1) или (ii-2), упомянутую ниже, и указанный пептид представляет собой пептид, обладающий активностями тромбомодулина:

(ii-1) аминокислотная последовательность из положений 19-244 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, или

(ii-2) аминокислотная последовательность (ii-1), упомянутая выше, дополнительно содержащая замену, делецию или добавление одного или более аминокислотных остатков.

[A8] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A7-2], упомянутых выше, где тромбомодулин вводят в дозе 0,005-1 мг/кг в течение 5 мин с помощью внутривенного струйного введения.

[B1] Способ терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, который включает стадию введения тромбомодулина пациенту с тяжелым сепсисом, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[B1-2] Способ терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, сопровождаемого коагулопатией, который включает стадию введения тромбомодулина пациенту с тяжелым сепсисом, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[B-2] Способ по пунктам [B1] или [B1-2], упомянутым выше, который включает стадию введения тромбомодулина пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункцией одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4 и равен или меньше 1,6.

[B3] Способ по любому из пунктов [B1]-[B-2], упомянутых выше, где пациент с тяжелым сепсисом является пациентом с тяжелым сепсисом, у которого дисфункция органов не ограничивается дисфункциями печени или почек.

[B4] Способ по любому из пунктов [B1]-[B3], упомянутых выше, который включает стадию введения тромбомодулина пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, выбранных из группы, состоящей из дисфункции печени, дисфункции почек, дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения.

[B5] Способ по любому из пунктов [B1]-[B4], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой растворимый тромбомодулин.

[B6] Способ по любому из пунктов [B1]-[B5], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой пептид, полученный из трансформированной клетки, созданной путем трансфекции клетки-хозяина с помощью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11.

[B7] Способ по любому из пунктов [B1]-[B6], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность (i-1) или (i-2), упомянутую ниже, и указанный пептид представляет собой пептид, обладающий активностями тромбомодулина;

(i-1) аминокислотная последовательность из положений 19-516 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, или

(i-2) аминокислотная последовательность (i-1), упомянутая выше, дополнительно содержащая замену, делецию или добавление одного или более аминокислотных остатков.

[B8] Способ по любому из пунктов [B1]-[B7], упомянутых выше, где тромбомодулин вводят в дозе 0,005-1 мг/кг в течение 5 мин с помощью внутривенного струйного введения.

[B8-2] Способ по любому из пунктов [B1]-[B8], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой тромбомодулин, обладающий характерными особенностями, упомянутыми в пунктах [A5-2], [A5-3] или [A7-2], приведенных выше.

[B9] Применение тромбомодулина в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[B9-2] Применение по пункту [B9], упомянутому выше, где тромбомодулин представляет собой тромбомодулин, обладающий характерными особенностями, упомянутыми в пунктах [A5-2], [A5-3] или [A7-2], приведенных выше.

[B9-3] Применение по пункту [B9], упомянутому выше, которое обладает характерными особенностями, упомянутыми в любом из пунктов [A1]-[A8], приведенных выше.

[C1] Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или коррекции диссеминированного внутрисосудистого свертывания, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[C2] Лекарственное средство по пункту [C1], упомянутому выше, которое обладает характерными особенностями, упомянутыми в любом из пунктов [A1]-[A8], приведенных выше.

Эффект изобретения

С помощью лекарственного средства по изобретению, содержащего тромбомодулин, можно эффективно лечить и/или корректировать сепсис у пациента с тяжелым сепсисом, у которого показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

Варианты осуществления изобретения

Далее конкретно объясняются несколько предпочтительных вариантов осуществления изобретения (предпочтительные варианты осуществления изобретения, в дальнейшем также обозначаемые в описании как "варианты осуществления"). Однако объем изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, объясняемыми ниже.

Предпочтительно известно, что тромбомодулин по изобретению обладает эффектом (1) избирательного связывания с тромбином, (2) усиления активации белка C под действием тромбина. Кроме того, предпочтительным является то, что тромбомодулин, как правило, обладает (3) эффектом увеличения тромбинового времени, (4) эффектом подавления агрегации тромбоцитов, вызываемой тромбином, и/или (5) противовоспалительным эффектом. Такие эффекты, которыми обладает тромбомодулин, могут упоминаться как активности тромбомодулина.

Что касается эффектов тромбомодулина, тромбомодулин предпочтительно обладает эффектами (1) и (2), упомянутыми выше, и более предпочтительно обладает эффектами (1)-(4), упомянутыми выше. В отношении активностей тромбомодулина, тромбомодулин более предпочтительно обладает всеми эффектами (1)-(5), приведенными выше.

Эффект связывания тромбомодулина с тромбином может быть подтвержден методами исследования, описанными в различных известных публикациях, таких как Thrombosis and Haemostasis, 70(3): 418-422 (1993) и The Journal of Biological Chemistry, 264, 9, pp. 4872-4876 (1989). Что касается эффекта усиления активации белка C тромбином, то степень эффекта усиления активации белка C тромбином или наличия или отсутствия эффекта можно легко подтвердить методами исследования, подробно описанными в различных известных публикациях, включая, например, нерассмотренную патентную публикацию Японии No. 64-6219. Далее, эффект увеличения тромбинового времени и/или эффект подавления агрегации тромбоцитов, вызванной тромбином, можно без труда подтвердить аналогичным образом. Кроме того, противовоспалительный эффект также может быть подтвержден с методами исследования, описанными в различных известных публикациях, включая, например, Blood, 112: 3361-3670 (2008) и The Journal of Clinical Investigation, 115, 5: 1267-1274 (2005).

Тромбомодулин, используемый в изобретении, особенно не ограничен при условии, что он обладает активностями тромбомодулина. Тромбомодулин предпочтительно представляет собой растворимый тромбомодулин при условии отсутствия сурфактантов. Растворимость растворимого тромбомодулина в воде, например в дистиллированной воде, используемой для инъекций (в отсутствие сурфактанта, такого как Triton X-100 или полидоканол, и обычно при нейтральных значениях pH), составляет предпочтительно, например, 1 мг/мл или более, или 10 мг/мл или более; предпочтительно 15 мг/мл или более, или 17 мг/мл или более; более предпочтительно 20 мг/мл или более, 25 мг/мл или более, или 30 мг/мл или более; особенно предпочтительно 60 мг/мл или более. В некоторых случаях растворимость составляет, например, 80 мг/мл или более, или 100 мг/мл или более. Для того чтобы определить, хорошо ли растворяется в воде растворимый тромбомодулин, следует понимать, что в качестве простых критериев можно использовать прозрачность раствора и отсутствие заметных нерастворенных веществ, после того как растворимый тромбомодулин растворяют в воде и рассматривают раствор визуально, например, просто при белом свете в положении, соответствующем освещенности приблизительно 1000 люкс. Растворимость также можно определить по наличию или отсутствию какого-либо осадка после фильтрования раствора.

Молекулярная масса тромбомодулина не ограничена, при условии, что он обладает активностями тромбомодулина, которые описаны выше. Молекулярная масса предпочтительно составляет 100000 или меньше, более предпочтительно 90000 или меньше, еще более предпочтительно 80000 или меньше, наиболее предпочтительно 70000 или меньше, и молекулярная масса предпочтительно составляет 50000 или больше, наиболее предпочтительно 60000 или больше. Молекулярную массу растворимого тромбомодулина можно легко определить общепринятыми методами измерения молекулярной массы белка. Измерение с помощью масс-спектрометрии является предпочтительным, и метод MALDI-TOF-MS является более предпочтительным. Для получения растворимого тромбомодулина, обладающего молекулярной массой в желаемом диапазоне, растворимый тромбомодулин, который получают путем культивирования трансформированной клетки, созданной с помощью трансфекции клетки-хозяина ДНК, кодирующей растворимый тромбомодулин, с использованием вектора, можно подвергнуть фракционированию с использованием колоночной хроматографии или т.п., как описано ниже.

Тромбомодулин, используемый в изобретении, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков в положениях 19-132 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, которая известна как центральная часть, обеспечивающая активность тромбомодулина человека, и тромбомодулин особенно не ограничен, при условии, что тромбомодулин содержит аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков в положениях 19-132 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 19-132, представленных в SEQ ID NO: 1, может быть естественно или искусственно изменена при условии, что последовательность обладает эффектом усиления активации белка C тромбином, то есть одной из активностей тромбомодулина. В частности, последовательность может содержать замену, делецию или добавление одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 19-132, представленных в SEQ ID NO: 1. Приемлемый уровень изменений особенно не ограничен при условии, что аминокислотная последовательность обладает активностями тромбомодулина. Пример включает гомологию 50% или более в виде аминокислотных последовательностей, и гомология предпочтительно составляет 70% или более, более предпочтительно 80% или более, более предпочтительно 90% или более, особенно предпочтительно 95% или более и наиболее предпочтительно 98% или более. Такую измененную аминокислотную последовательность, содержащую замену, делецию или добавление одного или более аминокислотных остатков, называют гомологичной мутантной последовательностью. Как описано ниже, такие измененные аминокислотные последовательности можно легко получить с помощью обычных методов генной инженерии. Тромбомодулин конкретно не ограничен при условии, что он характеризуется вышеупомянутой последовательностью и эффектом селективного связывания с тромбином с усилением активации белка C тромбином по меньшей мере как целый тромбомодулин, но предпочтительно тромбомодулин также обладает противовоспалительным эффектом.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 содержит мутацию в виде аминокислоты Val в положении 125 последовательности SEQ ID NO: 1 вместо Ala. Тромбомодулин, используемый в изобретении, также предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-132, представленных в SEQ ID NO: 3.

Как описано выше, хотя тромбомодулин, используемый в изобретении, особенно не ограничен, если тромбомодулин имеет по меньшей мере аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-132, представленных в SEQ ID NO: 1 или 3, или мутантную последовательность, гомологичную упомянутой выше последовательности, и содержит по меньшей мере пептидную последовательность, обладающую активностями тромбомодулина, предпочтительные примеры тромбомодулина включают пептид, состоящий из последовательности с положениями 19-132 или 17-132 представленными в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 3, и пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной упомянутой выше последовательности и по меньшей мере обладающий активностями тромбомодулина. Пептид, состоящий из последовательности с положениями 19-132, представленными в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, является более предпочтительным. В другом варианте осуществления более предпочтительным является пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной упомянутой выше последовательности, состоящей из положений 19-132 или 17-132, представленных в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 3, и обладающий по меньшей мере активностями тромбомодулина.

В качестве другого варианта осуществления тромбомодулина согласно изобретению тромбомодулин предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5, которая особенно не ограничена, при условии, что тромбомодулин содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5. Аминокислотная последовательность, состоящая из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5, может представлять собой мутантную последовательность, гомологичную указанной выше последовательности, при условии, что последовательность обладает эффектом усиления активации белка C тромбином, т.е. одной из активностей тромбомодулина.

Последовательность SEQ ID NO: 7 содержит мутацию в виде аминокислоты Val в положении 473 последовательности SEQ ID NO: 5 вместо Ala. Тромбомодулин, используемый в изобретении, также предпочтительно содержит аминокислотную последовательность с положениями 19-480 в SEQ ID NO: 7.

Как описано выше, хотя тромбомодулин, используемый в изобретении, особенно не ограничен, если тромбомодулин имеет по меньшей мере последовательность, состоящую из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, или мутантную последовательность, гомологичную указанной выше последовательности, и содержит по меньшей мере пептидную последовательность, обладающую активностями тромбомодулина, предпочтительные примеры тромбомодулина включают пептид, состоящий из последовательности, состоящей из положений 19-480 или 17-480, представленных в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, и пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной упомянутой выше последовательности, и обладающий по меньшей мере активностями тромбомодулина. Пептид, состоящий из последовательности, состоящей из положений 19-480 в SEQ ID NO: 5 или 7, является более предпочтительным. В другом варианте осуществления пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной последовательности, состоящей из положений 19-480 или 17-480, представленных в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, и обладающий активностями тромбомодулина, является более предпочтительным.

В качестве другого варианта осуществления тромбомодулина согласно изобретению тромбомодулин предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 9, который особенно не ограничен, при условии, что тромбомодулин содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 9. Аминокислотная последовательность, состоящая из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 9, может представлять собой мутантную последовательность, гомологичную указанной выше последовательности, при условии, что последовательность обладает эффектом усиления активации белка C тромбином, т.е. активностью тромбомодулина.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 11 содержит мутацию в виде аминокислоты Val в положении 473 в SEQ ID NO: 9 вместо Ala. Тромбомодулин, используемый в изобретении, также предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 11.

Как описано выше, хотя тромбомодулин, используемый в изобретении, особенно не ограничен, при условии, что тромбомодулин имеет по меньшей мере последовательность, состоящую из положений 19-515 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, или мутантную последовательность, гомологичную вышеуказанной последовательности, и содержит пептидную последовательность, обладающую по меньшей мере активностями тромбомодулина, более предпочтительные примеры включают пептид, характеризующийся последовательностью, состоящей из положений 19-516, 19-515, 17-516 или 17-515, представленных в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, и пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной упомянутой выше последовательности, и обладающий по меньшей мере активностями тромбомодулина. Пептид, имеющий последовательность, состоящую из положений 19-516, 19-515, 17-516 или 17-515, представленных в SEQ ID NO: 9, является особенно предпочтительным. Смесь их также является предпочтительным примером. В другом варианте осуществления пептид, имеющий последовательность, состоящую из положений 19-516, 19-515, 17-516 или 17-515, представленных в SEQ ID NO: 11, является особенно предпочтительным. Смесь их также является предпочтительным примером. Кроме того, пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной указанной выше последовательности, и обладающий по меньшей мере активностями тромбомодулина, также является предпочтительным примером. Предпочтительно растворимый тромбомодулин также обладает противовоспалительным эффектом.

Пептид, имеющий гомологичную мутантную последовательность, является таким, как описано выше, и означает пептид, который может содержать замену, делецию или добавление по меньшей мере одного, а именно одного или более, предпочтительно нескольких (например, 1-20, предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1-5, особенно предпочтительно 1-3) аминокислотных остатков, в аминокислотной последовательности изменяемого пептида. Хотя приемлемый уровень изменения особенно не ограничен при условии, что пептид обладает активностями тромбомодулина, пример подходящего уровня гомологии включает 50% или более в виде аминокислотных последовательностей, и гомология может составлять предпочтительно 70% или более, более предпочтительно 80% или более, более предпочтительно 90% или более, особенно предпочтительно 95% или более и наиболее предпочтительно 98% или более.

Предпочтительные примеры тромбомодулина, используемого в изобретении, также включают пептид, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 14 (462 аминокислотных остатка), пептид, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 8 (272 аминокислотных остатка), и пептид, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 6 (236 аминокислотных остатков), как описано в нерассмотренной патентной публикации Японии No. 64-6219.

Тромбомодулин, используемый в настоящем изобретении, особенно не ограничен при условии, что тромбомодулин имеет по меньшей мере аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-132, представленных в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. В качестве такого тромбомодулина пептид, имеющий по меньшей мере аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, является предпочтительным, и пептид, имеющий по меньшей мере аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, является более предпочтительным. Более предпочтительный пример пептида, имеющего по меньшей мере аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, представляет собой пептид, имеющий последовательность, состоящую из положений 19-516, 19-515, 19-514, 17-516, 17-515 или 19-514, представленных в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11. Кроме того, смесь пептидов, каждый из которых состоит из последовательности, включающей положения 19-516, 19-515, 19-514, 17-516, 17-515 или 19-514, представленные в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, также является предпочтительным примером.

В случае упомянутой выше смеси, соотношение в смеси пептида, который начинается в положении 17, и пептида, который начинается в положении 19, в каждой из SEQ ID NO: 9 и 11 составляет, например, от 30:70 до 50:50, предпочтительно от 35:65 до 45:55.

Кроме того, соотношение в смеси пептида, который заканчивается в положении 514, пептида, который заканчивается в положении 515, и пептида, который заканчивается в положении 516, в каждой из SEQ ID NO: 9 и 11 составляет, например, от 0:0:100 до 0:90:10, или от 0:70:30 до 10:90:0, или от 10:0:90 до 20:10:70, если желательно.

Соотношение пептидов в смеси можно определить любом общепринятым способом.

Последовательность из положений 19-132, представленных в SEQ ID NO: 1, соответствует последовательности из положений 367-480, представленных в SEQ ID NO: 9, и последовательность из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5, соответствует последовательности из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 9. Кроме того, последовательность из положений 19-132, представленных в SEQ ID NO: 3, соответствует последовательности из положений 367-480, представленных в SEQ ID NO: 11, и последовательность из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 7, соответствует последовательности из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 11. Кроме того, все последовательности, состоящие из положений 1-18, представленных в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 и 11, являются идентичными последовательностями.

Как описано ниже, указанные тромбомодулины согласно изобретению могут быть получены из клеток-трансформантов, созданных путем трансфекции клеток-хозяев ДНК, кодирующей пептид (особенно, нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и т.п.), с использованием вектора.

Достаточно того, что указанные пептиды имеют только упомянутые выше аминокислотные последовательности, и может быть присоединена или не присоединена олигосахаридная цепь, которая особенно не ограничена. В методах генной инженерии тип олигосахаридной цепи, положение, в котором добавляют олигосахаридную цепь, и уровень добавления отличаются в зависимости от типа используемых клеток-хозяев, и могут быть использованы любые методы. Положение связывания олигосахаридной цепи и ее тип описаны в нерассмотренной патентной публикации Японии No. 11-341990, и тромбомодулины согласно изобретению могут быть дополнены такой же олигосахаридной цепью в том же положении. Два типа N-связанных олигосахаридных цепей, фукозилированный 2-антеннарный тип и фукозилированный 3-антеннарный тип, можно соединить с тромбомодулином по изобретению, и их соотношение составляет, например, от 100:0 до 60:40, предпочтительно от 95:5 до 60:40, более предпочтительно от 90:10 до 70:30. Соотношение указанных олигосахаридных цепей можно измерить на двумерной карте олигосахаридных цепей, описанной в Biochemical Experimental Methods, Vol. 23, Methods of Researches on Glycoprotein Sugar Chains, Japan Scientific Societies Press (1990), и т.п. Кроме того, если проверяют состав сахаров тромбомодулина по изобретению, определяют нейтральные сахариды, аминосахариды и сиаловую кислоту, содержание каждого из которых может составлять независимо, например, 1-30%, предпочтительно 2-20%, более предпочтительно 5-10%, в массовом отношении, исходя из содержания белка. Содержание сахаров можно измерить методами, описанными в Lecture of New Biochemical Experiments, Vol. 3, Sugar I, Glycoprotein (Book 1), Tokyo Kagaku Dojin (1990) (нейтральные сахариды: фенол-сернокислотный метод, аминосахариды: метод Эльсона-Моргана, сиаловая кислота: метод с йодной кислотой и резорцином).

Хотя способ получения тромбомодулина не ограничен получением с помощью генной инженерии, как описано далее, в качестве сигнальной последовательности, которую можно использовать при экспрессии, в случае, если тромбомодулин получают с помощью генной инженерии, можно использовать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность из положений 1-18 в SEQ ID NO: 9, и нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность из положений 1-16 в SEQ ID NO: 9, и также можно использовать другие известные сигнальные последовательности, такие как сигнальная последовательность активатора тканевого плазминогена человека (международная публикация WO88/9811).

Когда последовательность ДНК, кодирующую тромбомодулин, вводят в клетку-хозяина, примеры предпочтительных способов включают способ введения последовательности ДНК, кодирующей тромбомодулин, предпочтительно в вектор, более предпочтительно в экспрессионный вектор, способный экспрессироваться в клетках животных, и последующее введение ДНК с помощью вектора. Экспрессионный вектор представляет собой молекулу ДНК, которая представлена с промоторной последовательностью, последовательностью для добавления участка связывания рибосомы к мРНК, с последовательностью ДНК, кодирующей белок, который нужно экспрессировать, с сигналом сплайсинга, с терминирующей последовательностью для терминации транскрипции, с последовательностью, кодирующей начало репликации, и т.п. Примеры предпочтительного экспрессионного вектора для животной клетки включают pSV2-X, описанный Mulligan R.C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 2072 (1981)); pBP69T (69-6), описанный Howley P.M. et al. (Methods in Enzymology, 101, 387 (1983), Academic Press), и т.п. Кроме того, также существует другой предпочтительный вариант осуществления, в котором ДНК вводят в экспрессионный вектор, способный экспрессироваться в микроорганизме.

Примеры клеток-хозяев, которые можно использовать при получении таких пептидов, как приведенные выше пептиды, включают клетки животных. Примеры клеток животных включают клетки яичников китайского хомячка (CHO), клетки COS-1, COS-7, VERO (ATCC CCL-81), клетки BHK, клетки MDCK, полученные из почек собак, клетки хомячка AV-12-664 и т.п. Кроме того, примеры клеток-хозяев, полученных из клеток человека, включают клетки HeLa, WI38, человеческие клетки линии 293 и клетки PER.C6. Из указанных клеток наиболее распространенными и предпочтительными являются клетки CHO, и среди клеток CHO более предпочтительными являются клетки CHO, дефицитные по дигидрофолатредуктазе (DHFR).

В процессе манипуляции с генами или в процессе получения пептидов также часто используют микроорганизмы, такие как Escherichia coli. Предпочтительно используют систему хозяин-вектор, подходящую для каждого способа, и подходящую векторную систему также можно выбрать для вышеупомянутых клеток-хозяев. Был клонирован ген тромбомодулина, используемый в технологии генной рекомбинации. Были раскрыты примеры получения тромбомодулина с помощью указанной технологии генной рекомбинации, и кроме того, также известны способы очистки тромбомодулина для получения его очищенного продукта (нерассмотренные патентные публикации Японии №№ 64-6219, 2-255699, 5-213998, 5-310787, 7-155176; и J. Biol. Chem., 264: 10351-10353 (1989)). Таким образом, тромбомодулин, используемый в изобретении, можно получить с использованием способов, описанных в указанных выше публикациях, или с помощью аналогичных методов. Например, нерассмотренная патентная публикация Японии № 64-6219 раскрывает штамм Escherichia coli K-12 DH5 (номер доступа ATCC 67283), содержащий плазмиду pSV2TMJ2, которая содержит ДНК, кодирующую полноразмерный тромбомодулин. Указанный штамм, повторно сохраненный в бывшем Национальном институте бионауки и технологии человека (в настоящее время Независимое административное учреждение, Национальный институт передовых технических наук и технологий, Международный депозитарий запатентованных микроорганизмов) (Escherichia coli DH5/pSV2TMJ2) (FERM BP-5570) также можно использовать. Тромбомодулин согласно изобретению можно получить с помощью известной технологии генной инженерии с использованием ДНК, кодирующей полноразмерный тромбомодулин, в качестве исходного материала.

Тромбомодулин по изобретению можно получить общепринятым известным способом или аналогичным способом. Например, можно упомянуть указанный выше способ Yamamoto et al. (нерассмотренная патентная публикация Японии № 64-6219) или способ, описанный в нерассмотренной патентной публикации Японии № 5-213998. Конкретно, например, ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, получают из гена человеческого тромбомодулина с помощью технологии генной инженерии, и затем ДНК можно модифицировать в соответствии с требованием. При такой модификации для получения ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 (которая специфически состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 12), кодоны, кодирующие аминокислоту в положении 473 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 (в частности, нуклеотид в положении 1418 в SEQ ID NO: 10), изменяют с помощью сайт-направленного мутагенеза согласно способу, описанному Zoller M.J. et al. (Method in Enzymology, 100:468-500 (1983), Academic Press). Например, при использовании синтетической ДНК в случае мутации, характеризующейся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 13, нуклеотид T в положении 1418 в SEQ ID NO: 10 может быть изменен на нуклеотид C с получением измененной ДНК.

Молекулу ДНК, полученную, как описано выше, вводят, например, в клетки яичников китайского хомячка (CHO) для получения клеток-трансформантов. Проводят соответствующую селекцию среди таких клеток, и тромбомодулин, очищенный известным способом, можно получить из культурального раствора, полученного при культивировании выбранной клетки. Как описано выше, ДНК (SEQ ID NO: 10), кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, предпочтительно трансфицируют в вышеупомянутую клетку-хозяина.

Способ получения тромбомодулина по изобретению не ограничен упомянутым выше способом. Например, можно также экстрагировать и очистить тромбомодулин из мочи, крови, других жидкостей организма и т.п., или экстрагировать и очистить тромбомодулин из ткани, продуцирующей тромбомодулин, или из указанной выше культуры и т.п. Кроме того, тромбомодулин можно дополнительно подвергнуть процедуре расщепления с использованием при необходимости протеазы.

Для культуры указанной выше клетки-трансформанта можно использовать среду, применяемую для обычной клеточной культуры, и предпочтительно культивировать клетку-трансформант в различных видах сред, чтобы заранее выбрать оптимальную среду. Например, известная среда, такая как среда MEM, среда DMEM, и среда 199, может быть использована в качестве базовой среды, и другая усовершенствованная среда или среда, дополненная добавками для различных сред, может быть использована. Примеры способов культивирования включают сывороточную культуру, в которой культивирование осуществляют в среде, содержащей сыворотку крови, и бессывороточную культуру, в которой культивирование осуществляют в среде, не содержащей сыворотку крови. Хотя способ культивирования не является особенно ограниченным, бессывороточная культура является предпочтительной.

Если сыворотку добавляют в среду в случае сывороточной культуры, то бычья сыворотка является предпочтительной. Примеры бычьей сыворотки включают фетальную бычью сыворотку, неонатальную бычью сыворотку, телячью сыворотку, взрослую бычью сыворотку и т.п., и любой из указанных примеров можно использовать при условии, что сыворотка подходит для клеточной культуры. В качестве среды, не содержащей сыворотки, при бессывороточном культивировании можно использовать коммерчески доступные среды. Бессывороточные среды, подходящие для различных клеток, представлены на рынке, и, например, для клеток CHO, среды CD-CHO, CHO-S-SFMII и CHO-III-PFM предлагает Invitrogen, и среды IS CHO, IS CHO-CD и т.п. предлагает Irvine Scientific. Указанные среды можно использовать без какой-либо обработки, или среды можно улучшить или дополнить добавками перед использованием. Примеры бессывороточной среды также включают среду DMEM, содержащую по 5 мг/л инсулина, трансферрина и селенистой кислоты. Как описано выше, среда особенно не ограничена при условии, что среду можно использовать для получения тромбомодулина по изобретению. Способ культивирования не является особенно ограниченным, и можно использовать полунепрерывную культуру, повторяющуюся полунепрерывную культуру, культуру с подпиткой, проточную культуру и т.п.

Когда тромбомодулин, используемый в изобретении, получают указанным выше способом клеточного культивирования, можно наблюдать разнообразие N-концевых аминокислот, вызванное посттрансляционной модификацией белка. Например, аминокислота в положении 17, 18, 19 или 22 в SEQ ID NO: 9 может служить N-концевой аминокислотой. Кроме того, например, N-концевую аминокислоту можно модифицировать таким образом, что глутаминовая кислота в положении 22 заменяется пироглутаминовой кислотой. Предпочтительно аминокислота в положении 17 или 19 служит N-концевой аминокислотой, и более предпочтительно аминокислота в положении 19 служит N-концевой аминокислотой. Кроме того, также существует другой вариант осуществления, в котором аминокислота в положении 17 служит N-концевой аминокислотой, который является предпочтительным вариантом осуществления. Что касается модификации, разнообразия и тому подобных изменений, приведенных выше, сходные примеры можно упомянуть в отношении последовательности SEQ ID NO: 11.

Кроме того, если растворимый тромбомодулин получают с использованием молекулы ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, можно наблюдать разнообразие C-концевых аминокислот, и можно получить пептид, укороченный на один аминокислотный остаток. Конкретно C-концевая аминокислота может быть модифицирована так, что аминокислота в положении 515 служит С-концевой аминокислотой, и затем аминокислота в положении 515 амидируется. Кроме того, можно получить пептид, укороченный на два аминокислотных остатка. Конкретно аминокислота в положении 514 может служить C-концевой аминокислотой. Таким образом, могут быть получены любые пептиды, характеризующиеся существенным разнообразием N-концевой аминокислоты и C-концевой аминокислоты, или их смесь. Предпочтительно аминокислота в положении 515 или аминокислота в положении 516 служит C-концевой аминокислотой, и более предпочтительно аминокислота в положении 516 служит C-концевой аминокислотой. Кроме того, также существует другой вариант осуществления, в котором аминокислота в положении 514 служит C-концевой аминокислотой, который является предпочтительным вариантом осуществления. Что касается модификации, разнообразия и тому подобных изменений, приведенных выше, то же самое применимо к ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12.

Тромбомодулин, полученный способом, описанным выше, может представлять собой смесь пептидов, характеризующихся разнообразием N-концевых и C-концевых аминокислот. Конкретные примеры включают смесь пептидов, характеризующихся последовательностями из положений 19-516, положений 19-515, положений 19-514, положений 17-516, положений 17-515 и положений 17-514 в SEQ ID NO: 9.

Затем выделение и очистку тромбомодулина из культурального супернатанта или культуры, полученной, как описано выше, можно осуществить с помощью известных способов [опубликованных Takeichi Horio, Tanpakushitsu/Koso no Kiso Jikken Ho (Fundamental Experimental Methods for Proteins and Enzymes) (1981)]. Например, предпочтительно использовать ионообменную хроматографию или адсорбционную хроматографию, в которых используют взаимодействие между тромбомодулином и хроматографическим носителем, на котором иммобилизованы функциональные группы, несущие заряд, противоположный заряду тромбомодулина. Другим предпочтительным примером является аффинная хроматография, в которой используют специфическое сродство к тромбомодулину. Предпочтительные примеры адсорбента включают тромбин, который является лигандом тромбомодулина, и антитело против тромбомодулина. В качестве антитела можно использовать антитромбомодулиновые антитела, обладающие соответствующими свойствами или распознающие соответствующие эпитопы. Примеры включают, например, антитела, описанные в японской публикации патента (Kokoku) № 5-42920, в нерассмотренных патентных публикациях Японии №№ 64-45398 и 6-205692 и т.п. Другие примеры включают гель-фильтрационную хроматографию и ультрафильтрацию, которые основаны на использовании размера молекул тромбомодулина. Другие примеры дополнительно включают гидрофобную хроматографию, в которой используют гидрофобную связь между хроматографическим носителем, на котором иммобилизованы гидрофобные группы, и гидрофобной частью тромбомодулина. Кроме того, гидроксиапатит можно использовать в качестве носителя в адсорбционной хроматографии, примеры которого включают, например, носители, описанные в нерассмотренной патентной публикации Японии № 9-110900. Указанные способы при необходимости можно использовать в комбинации. Хотя степень очистки можно выбрать в зависимости от цели применения и т.п., желательно очистить тромбомодулин до получения одной полосы в результате проведения электрофореза, предпочтительно SDS-PAGE, или получения одного пика в результате проведения гель-фильтрационной ВЭЖХ или обращенно-фазовой ВЭЖХ выделенного и очищенного продукта. Следует понимать, что если используют два типа тромбомодулинов или более, предпочтительно, главным образом, получают только полосы, соответствующие тромбомодулинам, и необязательно получать только одну полосу.

Конкретные примеры способа очистки, используемого в изобретении, включают способ очистки с использованием активностей тромбомодулина в качестве критерия, например, способ очистки, включающий грубую очистку культурального супернатанта или культурального продукта с помощью ионообменной колонки Q-Sepharose Fast Flow для получения фракции, обладающей активностями тромбомодулина; затем очистку фракции с помощью аффинной колонки, которая представляет собой колонку DIP-тромбин-агароза (диизопропилфосфорилтромбин-агароза), в качестве основной стадии очистки, для извлечения фракции, обладающей сильной активностью тромбомодулина; затем концентрирование извлеченной фракции с последующей гель-фильтрацией с получением активной фракции тромбомодулина в виде очищенного продукта (Gomi K. et al., Blood, 75: 1396-1399 (1990)). Примером эффектов тромбомодулина, используемых в качестве критерия, является эффект усиления активации белка C тромбином. Другие предпочтительные примеры способов очистки будут представлены в качестве примеров ниже.

Выбирают подходящую ионообменную смолу, имеющую хорошие абсорбционные характеристики в отношении тромбомодулина, и осуществляют очистку с помощью ионообменной хроматографии. Особенно предпочтительным примером является способ, включающий использование колонки Q-Sepharose Fast Flow, уравновешенной 0,02 моль/л буфером Tris-HCl (pH 7,4), содержащим 0,18 моль/л NaCl. После отмывки в случае необходимости можно провести элюирование 0,02 моль/л буфером Tris-HCl (pH 7,4), содержащим 0,3 моль/л NaCl, например, для получения тромбомодулина в виде грубо очищенного продукта.

Затем, например, вещество, обладающее специфической аффинностью к тромбомодулину, можно иммобилизовать на смоле для проведения очистки с помощью аффинной хроматографии. Предпочтительные примеры включают колонку DIP-тромбин-агароза и колонку с моноклональным антителом против тромбомодулина. В случае колонки DIP-тромбин-агароза, колонку предварительно уравновешивают 20 ммоль/л буфером Tris-HCl (pH 7,4), содержащим 100 ммоль/л NaCl и 0,5 ммоль/л хлорид кальция, и затем в нее загружают упомянутый выше грубо очищенный продукт, промывают по необходимости и затем элюируют, например, 20 ммоль/л буфером Tris-HCl (pH 7,4), содержащим 1,0 моль/л NaCl и 0,5 ммоль/л хлорид кальция, с получением тромбомодулина в виде очищенного продукта. В случае колонки с моноклональным антителом к тромбомодулину, пример способа включает: приведение в контакт раствора моноклонального антитела к тромбомодулину в 0,1 моль/л буфере NaHCO₃ (pH 8,3), содержащем 0,5 моль/л NaCl, с сефарозой 4FF (GE Health Care Biosciences), предварительно активированной CNBr, с получением смолы сефарозы 4FF, соединенной с моноклональными антителами к тромбомодулину, уравновешивание смолы, предварительно помещенной в колонку, например, 20 ммоль/л фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим 0,3 моль/л NaCl, проведение необходимой промывки и затем осуществление элюирования 100 ммоль/л буфером глицерин-HCl (pH 3,0), содержащим 0,3 моль/л NaCl. Элюат можно нейтрализовать подходящим буфером, чтобы получить продукт в виде очищенного продукта.

В дальнейшем значение pH очищенного продукта доводят до 3,5 и затем помещают на катионообменную смолу, предпочтительно на SP-Sepharose FF (GE Health Care Biosciences), которая является сильным катионобменником, уравновешивают 100 ммоль/л буфером глицерин-HCl (pH 3,5), содержащим 0,3 моль/л NaCl, и проводят отмывку тем же буфером с получением неадсорбционной фракции. Полученную фракцию нейтрализуют подходящим буфером с получением высокоочищенного продукта. Указанные продукты предпочтительно концентрируют ультрафильтрацией.

Далее, также предпочтительно заменить буфер с помощью гель-фильтрации. Например, высокоочищенный продукт, концентрированный ультрафильтрацией, можно загрузить на колонку Sephacryl S-300 или колонку S-200, уравновешенную 20 ммоль/л фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим 50 ммоль/л NaCl, а затем провести фракционирование, используя 20 ммоль/л фосфатный буфер (pH 7,3), содержащий 50 ммоль/л NaCl. С помощью эффекта усиления активации белка C тромбином можно подтвердить, что собрана активная фракция, и таким образом получают высокоочищенный продукт с замененным буфером. В целях увеличения безопасности высокоочищенный продукт, полученный, как описано выше, предпочтительно фильтруют через подходящий фильтр для удаления вирусов, таких как Planova 15N (Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), и затем продукт можно сконцентрировать путем ультрафильтрации до получения желаемой концентрации. Наконец, продукт предпочтительно фильтруют через фильтр для асептической очистки.

Согласно изобретению предоставляется лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, которое содержит тромбомодулин в качестве активного ингредиента, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

Иными словами, лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе согласно указанному варианту осуществления представляет собой лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе у пациента с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

Также предоставляется лекарственное средство для снижения смертности у пациентов с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

Что касается терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, то примеры их предпочтительных эффектов включают, например, "предотвращение смерти пациента от сепсиса". Примеры также включают "предотвращение ухудшения общего состояния пациента при сепсисе".

Сепсис, упоминаемый в указанном варианте осуществления, известен как тяжелое системное инфекционное заболевание, при котором микроорганизмы постоянно или периодически поступают в кровь из очага инфекции, причем указанное заболевание вызывается заболеванием, таким как инфекционные заболевания, злокачественные опухоли, цирроз печени, почечная недостаточность, диабет и дистоция, или терапевтическим лечением травмы или заболевания, таким как применение постоянного катетера, инфузионного устройства, диализа и т.п. и трахеостомия. При развитии симптомов септический шок вызывает системный шок, т.е. быстрое снижение артериального давления и недостаточность периферического кровообращения, и летальность обусловлена нарушением функций жизненно важных органов, таких как легкие, почки, печень, сердце, пищеварительный тракт и центральная нервная система. В качестве осложнения, сопровождающего сепсис, развивается респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), характеризующийся интерстициальным отеком легких, кровотечением и острой дыхательной недостаточностью, вызванной обструкцией легочных капилляров, связанной с DIC или с активацией нейтрофилов и их миграцией и накоплением в паренхиме легких, что приводит к крайне неблагоприятному прогнозу.

Сепсис, упоминаемый в указанном варианте осуществления, представляет собой синдром системной воспалительной реакции (SIRS), вызываемый инфекцией. Более конкретно он включает патологическое состояние, которое помимо наличия инфекции соответствует двум или более признакам SIRS ((1) температура тела >38°C или <36°C, (2) частота сердечных сокращений >90/мин, (3) частота дыхания >20/мин, или PaCO₂ <32 торр, и (4) число лейкоцитов >12000/мкл или <4000/мкл, или лейкемоидная реакция >10%), и, как правило, сепсис можно диагностировать на основе такого патологического состояния.

Существует несколько способов диагностики сепсиса, и они обобщены в публикации Levy M. et al., Crit. Care. Med., 31:1250-1256. Например, существует способ, основанный на диагностировании, осуществляемом врачом, и способ с использованием лабораторных показателей и т.п. Примеры второго способа включают способ, в котором при наличии двух признаков из четырех, (1) температуры тела >38°C или <36°C, (2) частоты сердечных сокращений >90/мин, (3) частоты дыхания >20/мин, или необходимости искусственного дыхания, и (4) числа лейкоцитов >12000/мкл или <4000/мкл, или лейкемоидной реакции >10%, устанавливают диагноз SIRS, и SIRS, для которого установлен или предполагается микроорганизм в качестве его причины, диагностируют как сепсис [LaRosa S., the homepage of The Cleveland Clinic]. Другой способ, сходный с указанным выше способом, описан в Members of the American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: Crit. Care Med., 20, 864-874 (1992).

Примеры симптомов сепсиса включают, например, бактериемию, септицемию, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), сепсис (SIRS, при котором идентифицирован или предполагается микроорганизм, вызывающий его), тяжелый сепсис, септический шок, инкурабельный септический шок и синдром полиорганной недостаточности (в дальнейшем также обозначаемый как MODS) (Harrison′s Principles of Internal Medicine, 15th edition of original work, Section 124, pp. 828-833, Medical Science International, Ltd.). Упомянутые выше условия служат примерами симптомов, при которых эффективно лекарственное средство по изобретению для терапевтического лечения и/или коррекции.

Хотя сепсис особенно не ограничен при условии, что заболевание диагностируют как сепсис на основании упомянутых выше диагностических критериев, предпочтительно сепсис сопровождается нарушением свертывания (сепсис с коагулопатией). Хотя коагулопатия особенно не ограничена при условии, что INR образца крови, полученного от пациента, составляет более 1,2, указанный показатель предпочтительно составляет более 1,3, более предпочтительно составляет более 1,4.

Примеры бактериемии включают состояние, при котором наличие бактерий в крови подтверждено положительным результатом посева крови.

Примеры септицемии включают состояние, при котором подтверждено наличие микроорганизмов или других токсинов в крови.

Примеры синдрома системной воспалительной реакции (SIRS) включают состояние предварительной стадии DIC, которое описано выше.

Примеры тяжелого сепсиса включают сепсис, сопровождающийся одним или более симптомами, включая дисфункцию органов, например метаболический ацидоз, гипоперфузию органов, острую энцефалопатию, олигурию, гипоксемию или диссеминированное внутрисосудистое свертывание и гипотензию. В отношении сепсиса, тяжелым сепсисом называют наличие одной дисфункции органа, органной гипоперфузии или гипотензии. Органная гипоперфузия или нарушенная перфузия включает лактацидоз, олигурию, помрачение сознания и т.п. Помимо тяжелого сепсиса, состояние, при котором постоянно наблюдается гипотензия, несмотря на проводимую достаточную инфузионную терапию, называют септическим шоком.

Более конкретно тяжелый сепсис, упоминаемый в указанном варианте осуществления, представляет собой следующее.

Примеры септического шока включают состояние, характеризующееся гипотензией (артериальное давление 90 мм рт.ст. или ниже, или ниже, чем обычное артериальное давление на 40 мм рт.ст. или более), с отсутствием реакции на реанимацию с помощью инфузионной терапии, и сопровождающееся органной недостаточностью.

Примеры инкурабельного септического шока включают состояние септического шока, продолжающееся свыше 1 ч или дольше, и не поддающееся лечению прессорным агентом с использованием инфузионной терапии.

Примеры синдрома полиорганной недостаточности (MODS) включают состояние, характеризующееся дисфункцией одного или более органов, и требующее медицинского вмешательства для поддержания гомеостаза.

INR, упоминаемый в указанном варианте осуществления, представляет собой диагностический критерий, который позволяет выявить коагулопатию крови. INR означает протромбиновое время (в дальнейшем также обозначаемое в описании как PT), нормализованное, как и в случае разностей между произведенными партиями препаратов тромбопластина. INR обычно определяют следующим образом:

Показатель INR=(время свертывания (с) исследуемого образца/время свертывания (с) контрольного образца)^{(показатель ISI)}

В уравнении время свертывания (с) исследуемого образца означает PT исследуемого образца плазмы субъекта, которое проверяют, и ISI означает международный индекс чувствительности.

Примеры тяжелого сепсиса, упоминаемые в указанном варианте осуществления, включают сепсис, сопровождающийся одним или более симптомами, включающими дисфункцию органов, такую как метаболический ацидоз, острая энцефалопатия, олигурия, гипоксемия или диссеминированное внутрисосудистое свертывание и гипотензия, как описано выше. Термин “тяжелый” означает, что заболевание достигло критического состояния в отношении обеспечения жизнедеятельности. Примеры тяжелого сепсиса включают, в частности, сепсис, сопровождающийся дисфункцией одного или более органов. Хотя дисфункция органов особенно не ограничена при условии, что дисфункция органов вызвана сепсисом, дисфункция органов предпочтительно включает недостаточность органа, который необходим для жизнеобеспечения. Примеры одной или более органных дисфункций включают одну или более органных дисфункций, выбранных из группы, состоящей из дисфункции органов кровообращения, дисфункции органов дыхания, дисфункции почек и дисфункции печени, причем предпочтительные примеры включают одну или более органных дисфункций, выбранных из группы, состоящей из дисфункции органов дыхания, дисфункции органов кровообращения и дисфункции почек, и более предпочтительные примеры включают одну или более органных дисфункций, выбранных из группы, состоящей из дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения. Хотя количество органных дисфункций особенно не ограничено, при условии, что количество составляет одну дисфункцию или более, количество предпочтительно составляет два или более. В частности, предпочтительно существуют два вида органных дисфункций, выбранных из дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения.

Дисфункция органов кровообращения особенно не ограничена при условии, что это общеизвестная дисфункция органов кровообращения, и примеры включают, например, снижение давления крови и шок.

Дисфункция органов дыхания особенно не ограничена при условии, что это общеизвестная дисфункция органов дыхания, и примеры включают, например, гипоксемию, острое повреждение легких и диспноэ.

Дисфункция почек особенно не ограничена при условии, что это общеизвестная дисфункция почек, и примеры включают, например, нарушение функции почек, олигурию и почечную недостаточность.

Дисфункция печени особенно не ограничена при условии, что это общеизвестная дисфункция печени, и примеры включают, например, нарушение функции печени, желтуху, печеночную недостаточность и т.п.

Указанные дисфункции органов широко известны, поскольку они описаны в публикациях, представленных раньше даты подачи настоящей заявки, например, Funada H., "Elucidation and Treatment Strategy for Sepsis", Iyaku Journal Co., Ltd., p.38-(2006)), "Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock 2008" (Crit. Care Med., 2008 Jan; 36(1): 296-327) и т.п.

Предполагается, что дисфункция органов может быть вызвана другим фактором кроме сепсиса, таким как в случае дисфункции органа, индуцированной лекарством, и соответственно желательно исключить из числа пациентов с тяжелым сепсисом пациентов с дисфункцией органов, которые ограничиваются печенью или почками. Также известно, что тромбоцитопения может развиться в результате дисфункции органов. Хотя число тромбоцитов у пациентов, которым вводят лекарственное средство по изобретению, особенно не ограничено, при условии, что число тромбоцитов меньше 300000/мкл, указанное число предпочтительно меньше 200000/мкл, более предпочтительно меньше 150000/мкл.

В указанном варианте осуществления показатель INR в образце плазмы пациента с сепсисом особенно не ограничен, при условии, что показатель превышает 1,4, и если INR больше, чем 1,4, то применение тромбомодулина более эффективно у пациентов с сепсисом и с одной или более дисфункциями органов. Максимальное значение INR может составлять, например, 2,0 или меньше, предпочтительно 1,9 или меньше, более предпочтительно 1,8 или меньше, еще более предпочтительно 1,7 или меньше, наиболее предпочтительно 1,6 или меньше. Также значение может составлять предпочтительно 1,5 или меньше. Также предпочтительно исключают пациента со значением INR 1,7.

Выражение "INR больше 1,4" также может быть представлено в виде "INR>1,4".

В указанном варианте осуществления DIC представляет собой заболевание или синдром, при котором огромные количества веществ, ускоряющих свертывание крови, образуются в результате повреждения тканей, вызванного различными заболеваниями, таким образом, функция системы свертывания чрезмерно усилена, и мелкие тромбы образуются в системе кровеносных сосудов (образование микротромбов), и они забивают мелкие сосуды, и в то же время расходуются тромбоциты или факторы свертывания, необходимые для контроля кровотечения, вызывая тем самым аномальное свертывание. В частности, в результате образования фибрина в кровеносном сосуде происходит кровотечение вследствие коагулопатии потребления или органная недостаточность вследствие образования микротромбов. DIC также называют синдромом диссеминированного внутрисосудистого свертывания или синдромом диффузного внутрисосудистого свертывания.

DIC характеризуется различными типами клинических симптомов в зависимости от типа основного патогенного состояния. Помимо определения при осмотре кровотечения или органных симптомов предпочтительный метод диагностики заболевания как DIC включает оценку DIC на основе нескольких лабораторных показателей, как описано ниже, и затем диагностирование заболевания как DIC, если оценка DIC достигает определенного уровня. Примеры таких лабораторных показателей включают количество тромбоцитов, концентрацию фибрина/продуктов деградации фибриногена (в дальнейшем также сокращенно обозначаемых как FDP), расщепляемого плазмином, концентрацию D-димеров, концентрацию фибриногена и протромбиновое время. Кроме того, также возможно диагностировать определенное состояние как при DIC на основании снижения тромбоцитов, увеличения концентрации D-димеров или FDP, и т.п. без проведения оценки DIC (Masao Nakagawa, "Search report regarding use of criteria disseminated intravascular coagulation (DIC)," Research Study Team of Intractable Disease (Blood Coagulation Abnormality), the Ministry of Health and Welfare, Study report 1999, 1999: 65-72; Katsumi Deguchi, "Tentative plan regarding standards for initiation of early treatment of DIC," Research Study Team of Intractable Disease (Blood Coagulation Abnormality), the Ministry of Health and Welfare, Study report 1999, 1999: 73-77; и Katsumi Nakagawa & Hajime Tsuji, "Current diagnosis of DIC-Reports on results of inquiry survey" Clinical Blood. 1999, 40: 362-364).

В указанном варианте осуществления пациента с сепсисом, у которого значение INR в образце плазмы больше чем 1,2, предпочтительно больше чем 1,3, более предпочтительно больше чем 1,4, можно считать пациентом с DIC в широком смысле, и лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе согласно указанному варианту осуществления можно использовать в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и/или коррекции DIC.

Лекарственное средство по изобретению также можно использовать при DIC. Сепсис также рассматривается как SIRS, вызванный тяжелым клиническим течением инфекционного заболевания, и сепсис тесно связан с DIC, вызванным инфекционным заболеванием. DIC часто развивается одновременно с сепсисом, и лекарственное средство по изобретению также можно использовать для такого пациента с сепсисом с одновременно развивающимся DIC. Другими словами, лекарственное средство по изобретению можно использовать для пациента, у которого имеется или предположительно имеется либо DIC, либо сепсис, или оба состояния.

В указанном варианте осуществления INR можно измерить, например, следующим образом. В частности, тканевой тромбопластин и Ca²⁺ добавляют к плазме (исследуемый образец), полученной путем добавления цитрата натрия, измеряют время (PT), необходимое для свертывания (преципитации фибрина), и оценку осуществляют, исходя из относительного показателя времени, выраженного в секундах, отнесенного к аналогичному показателю контрольного образца (отношение активностей). Отношение активностей можно получить в виде "время свертывания крови (с) исследуемого образца/время свертывания крови (с) контрольного образца", но указанное отношение может варьировать в разных лабораториях, выполняющих данный тест, вследствие разной чувствительности используемого тканевого тромбопластина. Показатель INR был введен для устранения такого варьирования, и с помощью оценки PT с использованием показателя INR, скорректированного с помощью международного индекса чувствительности (в дальнейшем также обозначаемого в описании как ISI), варьирование, вызванное отличиями в работе лабораторий, можно устранить для получения стандартного результата. Значение ISI показывает отличие от международного стандартного образца. Значение ISI определяют для каждого реагента тканевого тромбопластина и прилагают к реагенту. Примеры реагента тромбопластина включают Thromborel S (зарегистрированная торговая марка, Sysmex Corp.), Thromboplastin C+ (зарегистрированная торговая марка, Sysmex Corp.), и т.п., но не ограничиваются указанными примерами. В Thromborel S (зарегистрированная торговая марка) используют человеческий плацентарный тромбопластин (значение ISI составляет приблизительно 1,0), и в thromboplastin C+ (зарегистрированная торговая марка) используют тромбопластин, полученный из мозга кролика (значение ISI составляет приблизительно 1,8).

Показатель ISI прилагается к каждому реагенту тканевого тромбопластина, и показатель INR рассчитывают согласно уравнению 1, приведенному выше.

Хотя контрольный образец особенно не ограничен при условии, что образец представляет собой коммерчески доступную объединенную нормальную человеческую плазму, можно использовать коммерчески доступную объединенную цитратную (цитрат Na) нормальную человеческую плазму и т.п., предлагаемую например, Kojin-Bio Co., Ltd. или International Bioscience Inc.

В качестве терапевтических видов лечения сепсиса обычно осуществляют такие основные виды лечения, как упомянутые ниже посредством ссылки на известные публикации (Surviving Sepsis Campaign: International guidelines for management of severe sepsis and septic shock: Crit. Care Med., 2008, 36: 296-327; Crit. Care Med., 32(3), 1250-56 (2003)), и тромбомодулин и другое лекарственное средство можно использовать в комбинации. Однако другое лекарственное средство, используемое в комбинации, не ограничивается лекарственными средствами, упомянутыми ниже.

Если гипотензия сохраняется у пациента с септическим шоком даже после увеличения центрального венозного давления (CVP) до требуемого значения, можно ввести дофамин, чтобы поднять среднее артериальное давление по меньшей мере до 60 мм рт.ст. Если доза дофамина превышает 20 мкг/кг/мин, можно дополнительно ввести другое сосудосуживающее средство (обычно норэпинефрин).

Для терапевтического лечения бактерий, вызывающих сепсис, обычно используют антибиотик. При выборе антибиотика необходима обоснованная оценка с учетом предполагаемой причины, клинических признаков, информации о микроорганизмах и информации о типе чувствительности, общей для конкретной палаты госпитализированных пациентов, результатов предварительного культурального теста и т.п. Интенсивная нормализация концентрации глюкозы крови у пациентов с сепсисом улучшает клинический исход у пациентов в критических состояниях.

Если используют антибиотик, то можно исследовать образец, например, крови, жидкости тела или части раны и выбрать препарат, эффективный в отношении возбудителя. Например, в случае септического шока неясной этиологии можно вводить в комбинации гентамицин или тобрамицин и цефалоспорин третьего поколения. Кроме того, если подозревают наличие инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам бактериями Staphylococcus или Enterococcus, дополнительно вводят ванкомицин.

В большинстве случаев дозу регулируют для поддержания сахара крови на уровне 80-110 мг/дл (4,4-6,1 ммоль/л) путем постоянного внутривенного введения инсулина.

Поскольку лечение кортикостероидами эффективно при терапевтическом лечении сепсиса, их можно вводить в дополнительной дозе.

Пациенту с высоким риском смерти (оценка по шкале APACHE II ≥25, полиорганная недостаточность, вызванная сепсисом, ARDS вследствие септического шока или сепсиса) рекомбинантный активированный белок C (rhAPC, дротрекогин альфа) можно вводить при отсутствии противопоказаний (кровотечение и т.п.).

Хотя число пациентов, которым подходит такое лечение, ограничено, может быть проведено переливание эритроцитарной массы для достижения значения Hb 7,0-9,0 г/дл.

При наличии у пациента с сепсисом сниженного эритропоэза, вызванного почечной недостаточностью, можно вводить эритропоэтин (EPO).

В случае тяжелого сепсиса можно вводить гепарин в виде низкой дозы нефракционированного гепарина или можно вводить низкомолекулярный гепарин для предотвращения DVT.

Лекарственное средство по изобретению может содержать носитель. В качестве носителя, применимого в изобретении, водорастворимый носитель является предпочтительным, и вещество, регулирующее тоничность, буферное вещество, загуститель, сурфактант, консервант, антисептик, смягчающее вещество, модификатор pH и сходные вещества, приемлемые в качестве фармацевтических вспомогательных веществ, обычно являются предпочтительными. Например, лекарственное средство по изобретению можно получить путем добавления сахарозы, глицерина, модификатора pH, состоящего из неорганической соли, или т.п., в качестве вспомогательных веществ. Кроме того, в случае необходимости аминокислоты, соли, углеводы, сурфактанты, альбумин, желатин или т.п. можно добавить, как раскрыто в нерассмотренных патентных публикациях Японии №№ 64-6219 и 6-321805. Способ добавления указанных вспомогательных веществ не является особенно ограниченным. Однако в случае получения лиофилизированного продукта примеры включают, например, способ смешивания раствора, содержащего по меньшей мере один лекарственный препарат, выбранный из иммунодепрессанта и лекарственного препарата для гемобластоза, и раствора, содержащего тромбомодулин, с последующим добавлением к смеси вспомогательных веществ и перемешиванием полученной смеси, и способ смешивания вспомогательных веществ по меньшей мере с одним лекарственным препаратом, выбранным из иммунодепрессанта и лекарственного препарата для гемобластоза, предварительно растворенного в воде, в воде для инъекций или в подходящем буфере, добавления раствора, содержащего тромбомодулин, к смеси, смешивания полученной смеси с получением раствора и лиофилизирования раствора обычно применяемыми способами. Если лекарственное средство по изобретению представляет собой лекарственное средство, содержащее комбинацию компонентов лекарственного средства, то каждый компонент предпочтительно получают путем добавления носителя согласно соответствующему способу получения. Лекарственное средство по изобретению можно предоставить в форме инъекции или в форме лиофилизированного препарата, который растворяют при использовании.

Что касается получения лекарственного средства по изобретению, то водный раствор для инъекций можно приготовить, наливая раствор, содержащий 0,1-10 мг тромбомодулина, воду для инъекций и вспомогательные вещества в ампулу или пузырек объемом, например, 0,5-10 мл. Примеры способов получения также включают способ замораживания такого раствора и высушивания замороженного раствора при пониженном давлении с получением лиофилизированного препарата.

Лекарственное средство по изобретению по желанию вводят путем парентерального введения, такого как внутривенное введение, внутримышечное введение и подкожное введение. Лекарственное средство также можно ввести путем перорального введения, интраректального введения, интраназального введения, сублингвального введения или т.п. Если лекарственное средство по изобретению представляет собой лекарственное средство, содержащее комбинацию нескольких активных ингредиентов, то каждый активный ингредиент лекарственного средства предпочтительно вводят способом введения, подходящим для ингредиента.

Примеры способа внутривенного введения включают способ введения желаемой дозы лекарственного средства в один момент времени (внутривенное струйное введение) и внутривенное введение с помощью капельной инфузии.

Способ введения желаемой дозы лекарственного средства в один момент времени (внутривенное струйное введение) является предпочтительным с той точки зрения, что при данном способе для введения препарата требуется очень небольшое время. Данный способ особенно предпочтителен в случае пациентов с сепсисом, которые нуждаются в неотложном лечении. Если лекарственное средство вводят в один момент времени, то период времени, необходимый для введения, при использовании инъекционного шприца, как правило, может изменяться. В целом, период времени, необходимый для введения, составляет, например, 5 мин или меньше, предпочтительно 3 мин или меньше, более предпочтительно 2 мин или меньше, еще более предпочтительно 1 мин или меньше, особенно предпочтительно 30 с или меньше, хотя время введения зависит от объема, который необходимо ввести. Хотя минимальное время введения не является особенно ограниченным, период времени составляет предпочтительно 1 с или больше, более предпочтительно 5 с или больше, еще более предпочтительно 10 с или больше. Доза особенно не ограничена при условии, что доза соответствует упомянутой выше предпочтительной дозе. Внутривенное введение с помощью капельной инфузии также является предпочтительным с учетом того, что можно легко поддерживать постоянный уровень тромбомодулина в крови.

Суточная доза лекарственного средства по изобретению может изменяться в зависимости от возраста, массы тела пациентов, тяжести заболевания, пути введения и т.п. Как правило, максимальная доза составляет предпочтительно 20 мг/кг или менее, более предпочтительно 10 мг/кг или менее, еще более предпочтительно 5 мг/кг или менее, особенно предпочтительно 2 мг/кг или менее и наиболее предпочтительно 1 мг/кг или менее, и минимальная доза составляет предпочтительно 0,001 мг/кг или более, более предпочтительно 0,005 мг/кг или более, еще более предпочтительно 0,01 мг/кг или более, особенно предпочтительно 0,02 мг/кг или более и наиболее предпочтительно 0,05 мг/кг или более, в терминах количества тромбомодулина.

В случае внутривенного струйного введения, хотя доза особенно не ограничена при условии, что доза соответствует упомянутой выше предпочтительной дозе, максимальная суточная доза предпочтительно составляет 1 мг/кг или менее, более предпочтительно 0,5 мг/кг или менее, еще более предпочтительно 0,1 мг/кг или менее, особенно предпочтительно 0,08 мг/кг или менее и наиболее предпочтительно 0,06 мг/кг или менее, и минимальная доза составляет предпочтительно 0,005 мг/кг или более, более предпочтительно 0,01 мг/кг или более, еще более предпочтительно 0,02 мг/кг или более и особенно предпочтительно 0,04 мг/кг или более.

Если лекарственное средство по изобретению вводят пациенту с массой тела свыше 100 кг, то предпочтительно вводить фиксированную дозу 6 мг, поскольку объем крови не пропорционален массе тела, и объем крови относительно снижен по сравнению с массой тела такого пациента.

В случае непрерывной внутривенной инфузии, хотя доза особенно не ограничена при условии, что доза соответствует упомянутой выше предпочтительной дозе, максимальная суточная доза составляет предпочтительно 1 мг/кг или менее, более предпочтительно 0,5 мг/кг или менее, еще более предпочтительно 0,1 мг/кг или менее, особенно предпочтительно 0,08 мг/кг или менее и наиболее предпочтительно 0,06 мг/кг или менее, и минимальная доза составляет предпочтительно 0,005 мг/кг или более, более предпочтительно 0,01 мг/кг или более, еще более предпочтительно 0,02 мг/кг или более и особенно предпочтительно 0,04 мг/кг или более.

Если лекарственное средство по изобретению вводят пациенту с массой тела свыше 100 кг, то предпочтительно вводить фиксированную дозу 6 мг, поскольку объем крови не пропорционален массе тела, и объем крови относительно снижен по сравнению с массой тела такого пациента.

Лекарственное средство вводят один раз или несколько раз в день при необходимости. Что касается интервала введения, то лекарственное средство можно вводить один раз в 2-14 дней, предпочтительно один раз в 2-7 дней, более предпочтительно один раз в 3-5 дней.

Расшифровка списка последовательностей

SEQ ID NO: 1: аминокислотная последовательность, кодируемая геном, используемым при получении TME456

SEQ ID NO: 2: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 3: аминокислотная последовательность, кодируемая геном, используемым при получении TME456M

SEQ ID NO: 4: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3

SEQ ID NO: 5: Аминокислотная последовательность, кодируемая геном, используемым при получении TMD12

SEQ ID NO: 6: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5

SEQ ID NO: 7: аминокислотная последовательность кодируемая геном, используемым при получении TMD12M

SEQ ID NO: 8: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 9: аминокислотная последовательность, кодируемая геном, используемым при получении TMD123

SEQ ID NO: 10: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 11: аминокислотная последовательность, кодируемая геном, используемым при получении TMD123M

SEQ ID NO: 12: нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 13: синтетическая ДНК для обеспечения мутации, используемая для осуществления сайт-направленного мутагенеза

ПРИМЕРЫ

Изобретение подробно объясняется со ссылкой на примеры и тестовые примеры. Однако изобретение не ограничивается указанными примерами.

Тромбомодулин по изобретению, используемый в тестовых примерах, получали по упомянутому выше способу Yamamoto et al. (способ описан в нерассмотренной патентной публикации Японии No. 64-6219). Примеры его получения описаны ниже. Безопасность тромбомодулинов, полученных в указанных примерах получения, подтверждали с помощью тестов с однократным и повторным внутривенным введением крысам и обезьянам, с помощью теста на возможные нарушения репродуктивной функции у мышей, с помощью теста определения местного раздражения, испытания на фармакологическую безопасность, тестирования инактивации вирусов и т.п.

Пример получения 1

Получение тромбомодулина

Высокоочищенный продукт получали указанным выше способом. А именно клетки яичников китайского хомячка (CHO) трансфицировали молекулой ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (которая специфически состояла из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 10). Из культуры указанных выше клеток-трансформантов получали высокоочищенный продукт путем сбора активной фракции с 20 ммоль/л фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим 50 ммоль/л NaCl согласно указанному выше общепринятому способу очистки. Затем продукт концентрировали, используя ультрафильтрационную мембрану, с получением раствора тромбомодулина с концентрацией 11,0 мг/мл (в дальнейшем также обозначаемого в описании как TMD123).

Получение раствора полисорбата

Полисорбат 80 взвешивали (0,39 г) в стеклянном химическом стакане, добавляли воду для инъекций (30 мл) и растворяли.

Получение и фасовка раствора лекарственного препарата

Раствор TMD123, полученный, как указано выше (2239 мг, соответствующие 24,63 г белка растворимого тромбомодулина, добавленного с 5% избытком), помещали в 5-литровый сосуд из нержавеющей стали. Затем добавляли раствор полисорбата, полученный, как указано выше, и добавляли хлорид натрия (27,9 г). Добавляли воду для инъекций (600 мл) и перемешивали смесь. Показатель pH смеси доводили до 6,0 добавлением 1 моль/л раствора хлористоводородной кислоты. Затем к смеси добавляли воду для инъекций до конечного количества 3940 г и смесь постоянно перемешивали. Указанный раствор лекарственного препарата стерилизовали фильтрованием, используя фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (MCGL10S, производства Millipore). Фильтрат разливали по ампулам в количестве 1,1 г в каждую ампулу с получением лекарственного препарата TMD123.

Пример получения 2

Клетки яичников китайского хомячка (CHO) трансфицируют ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 (которая специфически содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12), получают раствор тромбомодулина, выделенный из культуры указанных выше клеток-трансформантов (в дальнейшем также обозначаемый в описании как TMD123M) с помощью указанного выше общепринятого метода очистки, и препарат TMD123M получают таким же образом, как описано выше.

Пример получения 3

Клетки яичников китайского хомячка (CHO) трансфицируют ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (которая специфически содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2), получают тромбомодулин, выделенный из культуры указанных выше клеток-трансформантов (в дальнейшем также обозначаемый в описании как TME456) с помощью указанного выше общепринятого метода очистки, и препарат TME456 получают таким же образом, как описано выше.

Пример получения 4

Клетки яичников китайского хомячка (CHO) трансфицируют ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (которая специфически содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4), получают тромбомодулин, выделенный из культуры указанных выше клеток-трансформантов (в дальнейшем также обозначаемый в описании как TME456M) с помощью указанного выше общепринятого метода очистки, и препарат TME456M получают таким же образом, как описано выше.

Пример получения 5

Клетки яичников китайского хомячка (CHO) трансфицируют ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (которая специфически содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6), получают тромбомодулин, выделенный из культуры указанных выше клеток-трансформантов (в дальнейшем также обозначаемый в описании как TMD12) с помощью указанного выше общепринятого метода очистки, и препарат TMD12 получают таким же образом, как описано выше.

Пример получения 6

Клетки яичников китайского хомячка (CHO) трансфицируют ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (которая специфически содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8), получают тромбомодулин, выделенный из культуры указанных выше клеток-трансформантов (в дальнейшем также обозначаемый в описании как TMD12M) с помощью указанного выше общепринятого метода очистки, и препарат TMD12M получают таким же образом, как описано выше.

Пример получения 7

Получение препарата плацебо

Получение раствора полисорбата

Полисорбат 80 взвешивали (0,4 г) в стеклянном химическом стакане, добавляли воду для инъекций (30 мл) и растворяли.

Получение и фасовка раствора лекарственного препарата

Воду для инъекций (2000 мл) помещали в 5-литровый сосуд из нержавеющей стали. Затем добавляли раствор полисорбата, полученный, как описано выше. Затем к смеси добавляли воду для инъекций до общего количества 4000 г и непрерывно перемешивали смесь и взбалтывали. Указанный раствор лекарственного препарата стерилизовали фильтрованием, используя фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (MCGL10S, производства Millipore). Фильтрат разливали по ампулам в количестве 1,1 г в каждую ампулу с получением препарата плацебо.

Пример 1

Способ проведения эксперимента

При использовании TMD-123, полученного согласно примеру получения 1 в виде тромбомодулина, проводили рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование с участием пациентов с сепсисом и DIC. Общее запланированное число пациентов составляет 750, и из них число пациентов, которые получали исследуемый лекарственный препарат, составляло 741 (TMD-123 для 370 пациентов и плацебо для 371 пациента). TMD-123 вводили один раз в день по 0,06 мг/кг в течение последующих 6 дней путем внутривенного струйного введения. В качестве плацебо использовали препарат, изготовленный согласно примеру получения 7.

Пациентам с массой тела свыше 100 кг вводили фиксированную дозу 6 мг постоянно, один раз в день в течение последующих 6 дней с помощью внутривенного струйного введения, в целях предотвращения побочных эффектов, вызванных передозировкой.

Показатель INR плазмы крови пациента перед введением испытуемого препарата измеряли с помощью указанного выше метода, описанного в виде уравнения 1.

Пациентов с тяжелым сепсисом и дисфункцией органов, ограниченной печенью или почками, исключали из анализа. У пациентов с дисфункцией органов, ограниченной печенью или почками, дисфункция органов может быть связана с причинами, не ограничивающимися сепсисом, например, дисфункция органов, вызванная лекарствами.

Результаты получали через 28 дней после начала введения и рассчитывали показатель смертности (смертность) для каждой группы пациентов.

Кроме того, различие в показателе смертности между группой TMD-123 и группой плацебо рассчитывали в виде "разницы".

Результаты исследования

В группе пациентов без дисфункции органов у пациентов с показателем INR>1,5 в плазме перед введением исследуемого препарата наблюдали максимальное отличие (разница: 6,1%) между показателем смертности в группе, получавшей TMD-123, и показателем смертности в группе, получавшей плацебо, и в группе пациентов с INR>1,6 наблюдали вторую по величине разницу между показателями смертности (4,5%). В группе пациентов с INR>1,4 не наблюдали существенного увеличения разницы между показателями смертности в абсолютных или относительных значениях, т.е. разница показателей смертности составляла приблизительно 1,7% (табл. 1).

Как видно из табл. 1, максимальный результат соответствует нижним пределам INR 1,5-1,6, и если нижние пределы INR находились вне диапазона 1,5-1,6, то разница показателей смертности существенно уменьшалась.

При этом в группе пациентов с тяжелым сепсисом и дисфункциями одного или более органов, выбранными из дисфункции органов кровообращения, дисфункции органов дыхания, дисфункции почек и дисфункции печени, в группе пациентов с INR>1,4, но не в группе с INR>1,5, наблюдали максимальную разницу по показателю смертности (9,7%), которая представляет собой в абсолютных и относительных значениях большую разницу по показателю смертности, по сравнению со значениями, полученными для других нижних пределов INR (табл. 2). В группе пациентов с тяжелым сепсисом и дисфункциями одного или более органов, выбранными из дисфункции органов кровообращения, дисфункции органов дыхания, дисфункции почек и дисфункции печени, наблюдали более выраженную разницу между показателем смертности в группе TMD-123 и в группе плацебо в целом, по сравнению с аналогичным показателем, полученным для группы пациентов без дисфункции органов (соответственно 5,4% и -1,1%).

Кроме того, в группе пациентов с тяжелым сепсисом, имеющих дисфункции одного или более органов, выбранные из дисфункции органов кровообращения, дисфункции органов дыхания, дисфункции почек и дисфункции печени, у пациентов с показателем 1,4<INR≤1,6 наблюдали существенную разницу между показателями смертности, которая составляла 16,0% (табл. 3). Как видно из табл. 3, при любом другом значении INR, выходящем за указанные пределы, получали значения разницы между показателями смертности в диапазоне 10-12%, что показывает в общем и целом распознаваемую весьма высокую разницу по показателю смертности для указанной выше группы.

В то же время не наблюдали тенденции к заметному максимальному увеличению у какой-либо определенной группы в группе пациентов без дисфункции органов. Наибольшая разница между полученными показателями смертности составляла 7,1% (в группе пациентов с 1,4<INR≤1,7) (табл. 4).

Таблица 1
Значение INR плазмы до введения	TMD-123	Плацебо	Разница
Количество	Смертность	Количество	Смертность
INR>1,2	106	10/106=	9,4%	93	9/93=	9,7%	0,2%
INR>1,3	81	6/81=	7,4%	75	6/75=	8,0%	0,6%
INR>1,4	71	5/71=	7,0%	69	6/69=	8,7%	1,7%
INR>1,5	57	3/57=	5,3%	53	6/53=	11,3%	6,1%
INR>1,6	42	3/42=	7,1%	43	5/43=	11,6%	4,5%
INR>1,7	29	3/29=	10,3%	27	1/27=	3,7%	-6,6%
INR>1,8	22	3/22=	13,6%	20	1/20=	5,0%	-8,6%
INR>1,9	14	2/14=	14,3%	12	14/32=	8,3%	-6,0%
INR>2,0	9	1/9=	11,1%	7	1/7=	14,3%	3,2%

Таблица 2
Значение INR плазмы до введения	TMD-123	Плацебо	Разница
Количество	Смертность	Количество	Смертность
INR>1,2	184	44/184=	23,9%	186	55/186=	29,6%	5,7%
INR>1,3	160	40/160=	25,0%	162	52/162=	32,1%	7,1%
INR>1,4	137	33/137=	24,1%	136	46/136=	33,8%	9,7%
INR>1,5	101	26/101=	25,7%	100	34/100=	34,0%	8,3%
INR>1,6	81	23/81=	28,4%	77	26/77=	33,8%	5,4%
INR>1,7	61	19/61=	31,1%	65	25/65=	38,5%	7,3%
INR>1,8	45	15/45=	33,3%	48	19/48=	39,6%	6,3%
INR>1,9	36	14/36=	38,9%	32	14/32=	43,8%	4,9%
INR>2,0	27	13/27=	48,1%	25	14/25=	56,0%	7,9%

Таблица 3
Значение INR плазмы до введения	TMD-123	Плацебо	Разница
Количество	Смертность	Количество	Смертность
1,6>= INR >1,4	56	10/56=	17,9%	59	20/59=	33,9%	16,0%
1,7>= INR >1,4	76	14/76=	18,4%	71	21/71=	29,6%	11,2%
1,8>= INR >1,4	92	18/92=	19,6%	88	27/88=	30,7%	11,1%
1,9>= INR >1,4	101	19/101=	18,8%	104	32/104=	30,8%	12,0%
2,0>= INR >1,4	110	20/110=	18,2%	111	32/111=	28,8%	10,6%

Таблица 4
Значение INR плазмы до введения	TMD-123	Плацебо	Разница
Количество	Смертность	Количество	Смертность
1,6>= INR >1,4	29	2/29=	6,9%	26	1/26=	3,8%	-3,1%
1,7>= INR >1,4	42	2/42=	4,8%	42	5/42=	11,9%	7,1%
1,8>= INR >1,4	49	2/49=	4,1%	49	5/49=	10,2%	6,1%
1,9>= INR >1,4	57	3/57=	5,3%	57	5/57=	8,8%	3,5%
2,0>= INR >1,4	62	4/62=	6,5%	62	5/62=	8,1%	1,6%

Промышленная применимость

Лекарственное средство по изобретению, содержащее тромбомодулин, используется в качестве лекарственного средства, обеспечивающего эффективное терапевтическое лечение и/или улучшение состояния при сепсисе у пациента с тяжелым сепсисом, где значение INR в образце плазмы, полученном от указанного пациента, составляет более 1,4.

1. Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, которое содержит тромбомодулин в качестве активного ингредиента, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, выбранными из группы, состоящей из дисфункции печени, дисфункции почек, дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения, где значение международного нормализованного отношения (INR) в образце плазмы, полученном от указанного пациента, превышает 1,4.

2. Лекарственное средство по п. 1, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где значение международного нормализованного отношения (INR) в образце плазмы, полученном от указанного пациента, превышает 1,4 и равно или меньше 1,6.

3. Лекарственное средство по п. 1 или 2, где пациент с тяжелым сепсисом является пациентом с тяжелым сепсисом, у которого дисфункция органов не ограничивается дисфункциями печени или почек.

4. Лекарственное средство по п. 1, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, выбранными из группы, состоящей из дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения.

5. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что тромбомодулин представляет собой растворимый тромбомодулин.

6. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что тромбомодулин представляет собой пептид, полученный из трансформированной клетки, созданной путем трансфекции клетки-хозяина с помощью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11.

7. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что тромбомодулин представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность (i-1) или (i-2), упомянутую ниже, и указанный пептид представляет собой пептид, обладающий активностями тромбомодулина; (i-1) - аминокислотная последовательность из положений 19-516 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, или (i-2) - аминокислотная последовательность, которая идентична на 90% или более аминокислотной последовательности (i-1), упомянутой выше.

8. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что тромбомодулин вводят в дозе 0,005-1 мг/кг в течение 5 мин с помощью внутривенного струйного введения.

9. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что сепсис представляет собой тяжелый сепсис с коагулопатией.

10. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что дисфункция органов кровообращения представляет собой шок.

11. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что указанные дисфункции органов вызваны сепсисом.

12. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, где пациенты со значением INR, равным 1,7, исключены.

13. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что тромбомодулин вводят пациенту внутривенно.

14. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что тромбомодулин вводят пациенту в дозе 0,04-0,08 мг/кг/день.

15. Лекарственное средство по п. 1 или 4, отличающееся тем, что тромбомодулин вводят пациенту в течение 6 дней.

16. Лекарственное средство для уменьшения смертности пациента с сепсисом, которое содержит тромбомодулин в качестве активного ингредиента, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, выбранными из группы, состоящей из дисфункции печени, дисфункции почек, дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения, где значение международного нормализованного отношения (INR) в образце плазмы, полученном от указанного пациента, превышает 1,4.

17. Лекарственное средство по п. 16, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где значение международного нормализованного отношения (INR) в образце плазмы, полученном от указанного пациента, превышает 1,4 и равно или меньше 1,6.

18. Лекарственное средство по п. 16 или 17, где пациент с тяжелым сепсисом является пациентом с тяжелым сепсисом, у которого дисфункция органов не ограничивается дисфункциями печени или почек.

19. Лекарственное средство по п. 16, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, выбранными из группы, состоящей из дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения.

20. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что тромбомодулин представляет собой растворимый тромбомодулин.

21. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что тромбомодулин представляет собой пептид, полученный из трансформированной клетки, созданной путем трансфекции клетки-хозяина с помощью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11.

22. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что тромбомодулин представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность (i-1) или (i-2), упомянутую ниже, и указанный пептид представляет собой пептид, обладающий активностями тромбомодулина; (i-1) - аминокислотная последовательность из положений 19-516 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, или (i-2) - аминокислотная последовательность, которая идентична на 90% или более аминокислотной последовательности (i-1), упомянутой выше.

23. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что тромбомодулин вводят в дозе 0,005-1 мг/кг в течение 5 мин с помощью внутривенного струйного введения.

24. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что сепсис представляет собой тяжелый сепсис с коагулопатией.

25. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что дисфункция органов кровообращения представляет собой шок.

26. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что указанные дисфункции органов вызваны сепсисом.

27. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, где пациенты со значением INR, равным 1,7, исключены.

28. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что тромбомодулин вводят пациенту внутривенно.

29. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что тромбомодулин вводят пациенту в дозе 0,04-0,08 мг/кг/день.

30. Лекарственное средство по п. 16 или 19, отличающееся тем, что тромбомодулин вводят пациенту в течение 6 дней.