Способ увеличения биомассы растения
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу увеличения биомассы фотосинтезирующего организма, который включает культивирование указанного фотосинтезирующего организма в присутствии пептида. Также раскрыта генная конструкция для увеличения биомассы фотосинтезирующего организма, а также вектор, ее включающий. Изобретение также относится к клетке для увеличения биомассы фотосинтезирующего организма, а также к самому организму, обладающему увеличенной биомассой по сравнению с нетрансгенным организмом. Изобретение позволяет эффективно увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма. 6 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству растительной биомассы. Настоящее изобретение, таким образом, относится к применению пептида, включающего шестичленное кольцо, образованное дисульфидной связью между двумя цистеинами, в увеличении биомассы растения, что находит применение в деревообрабатывающей промышленности, при получении энергии из возобновляемых источников и в сельском хозяйстве.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рост клеток как у растений, так и у животных управляется рядом внеклеточных сигналов, известных как гормоны или факторы роста (Galinha et al., 2009, Semin Cell Dev Biol. 20:1149-1156), которые действуют через специфичные мембранные рецепторы (Santner and Estelle 2009, Nature 459:1071-1078; De, I et al. 2009, Nat Cell Biol 11:1166-1173). Гормоны могут синтезироваться в растениях или могут поступать из других организмов, как в случае факторов, продуцируемых ризобактериями, которые способствуют росту своего растения-симбионта (Lugtenberg and Kamilova 2009, Annu Rev Microbiol 63:541-556).
Существует пять групп факторов роста растений: ауксины, гибереллины, цитокинины, абсцизовая кислота и ее производные и этилен. Указанные вещества широко распространены и могут, фактически, быть обнаружены у всех высших растений. Они являются специфичными в отношении своего действия, активными при очень низких концентрациях и регулируют рост клеток, деление клеток и дифференцировку, а также органогенез, старение и латентное состояние. Менее распространено, хотя не является совершенно неизвестным, явление, при котором сохранение структуры фактора роста происходит таким образом, что указанный фактор роста является функциональным как в растениях, так и в животных. Типичным примером является гликопротеин, известный как гранулин, который имеет представителей от грибов до млекопитающих и выполняет такие различные функции, как модуляцию вегетативного роста у овощей или регуляцию рака у животных (Bateman and Bennett 2009, Bioessays 31:1245-1254).
С целью регулировки развития растений и увеличения растительной биомассы было сделано множество попыток управлять их ростом посредством применения химических соединений, таких как, например, описанные в заявке на патент EP 0934951 A1 или удобрения. В заявке на патент US 2010/0016166 A1 описан способ увеличения количества семян и цветков растения, который включает культивирование растения в присутствии глутамата. В заявке на международный патент WO 2010/001184 A1 описана композиция, включающая (i) микронизированный природный минерал кальцит; (ii) микронизированный цеолит и (iii) одну или более добавок для стимуляции роста растения и повышения урожайности. Впрочем, применение минеральных удобрений оказывает отрицательное влияние на сельскохозяйственное производство, поскольку высокие концентрации удобрения могут повреждать почву, и не всегда достигается требуемая урожайность.
В последние годы и благодаря успехам в генной инженерии была создана новая стратегия увеличения биомассы растений, состоящая из регуляции экспрессии определенных генов, которые управляют метаболизмом растительной клетки. В этом отношении в заявке на патент США US 2009/0094716 A1 описан способ увеличения биомассы растения, включающий манипуляцию экспрессией гена fve, кодирующего белок (FVE), содержащий 6 копий домена WD40. Ингибирование экспрессии FVE приводит к растению с улучшенными сельскохозяйственными свойствами, в частности увеличенным выходом биомассы, производимой растением, по сравнению с контрольным растением. Кроме того, в заявке на международный патент WO 2007/027866 описано применение рекомбинантной ДНК для экспрессии белков, применимых в контроле морфологии, физиологии и роста растения. Указанная рекомбинантная ДНК включает функциональный в растениях промотор, ковалентно связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, который содержит по меньшей мере один домен белков семейства Pfam. В заявке на патент WO 2009/003429 A2 описан способ регуляции продукции биомассы в растениях, включающий модификацию экспрессии гена ckil или его ортологов или гомологов. В заявке на патент США US 2010/0037351 A1 описано увеличение биомассы растения и вместе с тем урожайности растения в условиях гиперосмотического стресса посредством оверэкспрессии в растениях гена, кодирующего фосфолипазу Dє (PLDє). Впрочем, способы, включающие генетическую модификацию растения, обычно дороги и не принимаются обществом.
В заявке на международный патент WO 2004/035798 раскрыта идентификация генов, экспрессия которых повышается или понижается в трансгенных растениях, оверэкспрессирующих E2Fa/DPa, и их применение для изменения характеристик растения; в частности раскрыт белок SEQ ID NO: 1848, хотя его возможное применение в качестве фактора роста растений не показано.
Кроме того, в заявке на международный патент WO 2004/035798 раскрыт, в общем, способ получения растения с увеличенной урожайностью по сравнению с соответствующим растением дикого типа, включающий, по меньшей мере, повышение активностей группы белков, включающей белки SEQ ID NO: 4659 и 4660, хотя способность указанных белков увеличивать биомассу растений не раскрыта.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании способов увеличения биомассы растения, альтернативных уже существующим, и, вместе с этим, урожайности, которые не имеют вышеуказанных недостатков.
Недавно было установлено, что введение адреномедуллина в растения и водоросли увеличивает их биомассу. Адреномедуллин (AM) и пептид длиной 20 аминокислот N-концевой области проадреномедуллина (PAMP) образуются в результате посттрансляционного процессинга одного и того же белка, препроадреномедуллина, который кодируется геном adm. Несмотря на отсутствие некоторого структурного подобия, оба пептида производят подобные и многочисленные физиологические ответы. Среди них - сосудорасширяющее действие, бронхорасширяющее действие, эффект регуляции подвижности и роста клеток, эффект модуляции для секреции других гормонов и эффект регуляции кишечной абсорбции (Lopez, J and Martinez, A. 2002. Int Rev Cytol 221:1-92). В отношении раковых клеток AM действует подобно фактору роста, повышает подвижность клеток, уменьшает апоптоз и вызывает ангиогенез (Martinez et al. 2002, J Natl Cancer Inst 94:1226-1237).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, неожиданно, введение адреномедуллина в растения и водоросли (включая микроводоросли), в общем, "фотосинтезирующие организмы", вызывает в указанных организмах рост их биомассы, обнаруживая, таким образом, новое применение указанного белка в качестве фактора роста в растениях и водорослях.
Как показано в Примере 1, каллусы моркови и табака помещали в условия с увеличивающимися концентрациями адреномедуллина и наблюдали, что по сравнению с контрольным образцом происходило увеличение роста каллусов в соответствии с дозозависимым ответом (Фигура 1). Кроме того, Пример 2 показывает, что микроводоросли (Chlorella), обработанные адреномедуллином, растут быстрее, чем необработанные микроводоросли.
Таким образом, на основании указанных открытий, настоящее изобретение позволяет увеличивать растительную биомассу растения или водоросли без необходимости в применении гормонов (гибереллинов, ауксинов, цитокининов и т.д.) или агрохимических продуктов. Кроме того, при условии, что это - фактор, не свойственный фотосинтезирующему организму (то есть он не вырабатывается растениями или водорослями в природе), он не будет производить побочных эффектов в отношении физиологии растения (движение сока, открытие устьиц, упругость, отношения с грибами-симбионтами и т.д.) или физиологии водоросли и влиять только на рост растения или водоросли, что является эффектом, который наблюдали. Дополнительно, тот факт, что он не вырабатывается в растениях или водорослях в естественных условиях, облегчает экологический контроль и контроль за распространением генетически модифицированного материала.
С другой стороны, известно, что адреномедуллин содержит характерный мотив (или идентифицирующий признак) в своей аминокислотной последовательности, который участвует в узнавании рецептора и состоит из кольца из 6 аминокислот, сформированного дисульфидной связью между двумя цистеинами [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]. Таким образом, не желая быть связанными с какой-либо теорией, предполагается, что любой белок, содержащий указанный мотив в своей аминокислотной последовательности, будет узнавать рецептор и вызывать процессы, которые приводят к увеличению биомассы указанных фотосинтезирующих организмов (например, растений или водорослей), выполняя свою роль в качестве фактора роста.
Таким образом, на основании указанного нового эффекта адреномедуллина в отношении фотосинтезирующих организмов (например, растений и водорослей) и принимая во внимание мотив, присутствующий в его аминокислотной последовательности, были определены следующие аспекты изобретения:
- Способ увеличения биомассы фотосинтезирующего организма, например растения или водоросли, который включает культивирование указанного фотосинтезирующего организма в присутствии пептида, включающего:
(i) аминокислотную последовательность
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1],
где Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 независимо обозначают аминокислоту, и
(ii) остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в (i), которые формируют дисульфидный мостик между ними.
- Генная конструкция, включающая:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, который включает:
(i) аминокислотную последовательность
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1],
где Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 независимо обозначают аминокислоту, и
(ii) остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в (i), которые формируют дисульфидный мостик между ними, и
(b) регуляторные элементы для регуляции ее экспрессии в фотосинтезирующем организме.
- Вектор, клетка-хозяин, клетка трансгенного фотосинтезирующего организма и трансгенный фотосинтезирующий организм, например растение или водоросль, включающие генную конструкцию, такую как конструкция, определенная выше, или нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, который включает: (i) аминокислотную последовательность Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1], в которой Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 независимо обозначают аминокислоту, и (ii) остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в (i), которые формируют дисульфидный мостик между ними.
Указанные аспекты изобретения, а также другие конкретные варианты его осуществления будут подробно обсуждаться ниже в подробном описании изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1 представляет собой гистограмму, на которой показан относительный рост биомассы растения в зависимости от молярной концентрации адреномедуллина, присутствующего в среде. Каждый столбик представляет собой статистическое среднее и стандартное отклонение для 8 независимых повторов.
Фигура 2 представляет собой график, на котором показано действие адреномедуллина на микроводоросли (Chlorella); микроводоросли, обработанные адреномедуллином, растут быстрее, чем необработанные микроводоросли.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ изобретения
В одном аспекте изобретение относится к способу увеличения биомассы фотосинтезирующего организма (в дальнейшем называемого способом изобретения), который включает культивирование указанного фотосинтезирующего организма в присутствии пептида (в дальнейшем называемого фактором роста изобретения), включающего:
(i) аминокислотную последовательность
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1],
где Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 независимо обозначают аминокислоту, и
(ii) остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в (i), которые формируют дисульфидный мостик между ними.
Аминокислоты Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 могут быть одинаковыми или отличными друг от друга. В конкретном варианте осуществления Xaa1, Xaa2, Xaa3 и/или Xaa4 являются аминокислотой, отличной от Cys.
Используемый в настоящей заявке термин "фотосинтезирующий организм" включает любой организм, способный осуществлять фотосинтез, то есть процесс, который превращает углекислый газ в органические соединения, в особенности сахара, с использованием энергии солнечного света. Фотосинтез происходит в растениях, водорослях и многих видах бактерий, например цианобактериях и т.д., но не в археях. Фотосинтезирующие организмы также называют фотоавтотрофами, так как они могут создавать свою собственную пищу.
Термин "растение", используемый в настоящей заявке, включает живые организмы, относящиеся к царству Растения, например деревья, цветы, травянистые растения, кустарники, травы, вьющиеся растения, папоротники, мхи, зеленые водоросли и т.д. В настоящее время растения могут быть разделены на три группы, а именно: (i) Наземные растения или эмбриофиты, более формально Embryophyta или Metaphyta, которые составляют самую известную группу растений и включают бессосудистые наземные растения или бриофиты (мохообразные), сосудистые растения или трахеофиты, которые включают семенные растения или сперматофиты; (ii) Зеленые растения, также известные как Viridiplantae, Viridiphyta или Chlorobiont, и (iii) Archaeplastida, Plastida или Primoplantae.
Используемый в настоящей заявке термин "водоросль" включает большую и разнообразную группу простых, как правило, автотрофных, организмов, от одноклеточных до многоклеточных форм. В конкретном варианте осуществления водоросль является микроводорослью, то есть микроскопической водорослью, как правило, встречающейся в пресноводных и морских системах.
Используемый в настоящей заявке термин "цианобактерии", которые обычно называют сине-зелеными водорослями, хотя и относили традиционно к водорослям в более ранних учебниках, много современных источников считают это устаревшим, поскольку они, как теперь полагают, являются бактериями.
В рамках настоящего изобретения "биомасса фотосинтезирующего организма" понимается и как количество биологического материала или органического вещества, которое составляет фотосинтезирующий организм, и как биологический материал или органическое вещество, образующиеся в биологическом процессе, спонтанном или не спонтанном (то есть вызванном). В одном варианте осуществления биомасса может применяться в качестве источника энергии, например древесина, отходы, (водородосодержащий) газ, спиртовые топлива и т.д.
В одном варианте осуществления, в котором фотосинтезирующий организм является сосудистым растением, биомасса указанного растения включает количество биологического материала или органического вещества, присутствующего в растении, то есть биологический материал или органическое вещество, составляющее как надземную часть растения, то есть стебель, ствол, листья, ветви, плоды, соцветия и т.д. (надземная биомасса), так и его подземную часть, то есть корни, каллусы, клубни и т.д. (подземная биомасса). "Биомасса растения" часто измеряется как сухая масса или вес (или "сырой вес" в соответствующих случаях) растения.
В настоящем изобретении выражение "увеличение биомассы фотосинтезирующего организма" следует понимать как воздействие на фотосинтезирующий организм с получением скорости роста, превышающей 1, где скорость роста (GR) определяется формулой:
GR = Конечный вес/начальный вес.
Другой способ измерения увеличения биомассы фотосинтезирующего организма основан на вычислении относительной скорости роста (RGR) или прироста биомассы в расчете на единицу биомассы и время и определяется формулой:
RGR=(LnW2-LnW1)/(t1-t2),
в которой W1 и W2 представляют собой вес растения в моменты времени 2 и 1 (t2-t1, соответственно) [Valladares, F. 2004, Ecologia del bosque mediterráneo en un mundo cambiante, pp. 191-227. Ministerio de Medio Ambiente (Ministry of the Environment), EGRAF, S.A., Madrid].
Как сумеет оценить специалист, квалифицированный в данной области техники, в случае сосудистых растений в уровне техники существуют другие параметры, которые прямо или косвенно связаны с GR и могут применяться для определения роста растительной биомассы указанного растения. Иллюстративные, неограничивающие примеры указанных параметров включают:
- отношение площади листа (LAR) или отношение площади листа к полному весу растения. Ее выражают в м2 (лист) кг-1 (растение). Площадь листа может быть измерена несколькими способами. Существуют автоматические устройства для измерения площади листа, которые снабжены видеокамерой, цифровой картой и компьютерной программой для анализа изображения, которые обеспечивают довольно быстрое выполнение измерений площади (в дополнение к другим измерениям: ширина, длина и т.д.) некоторого количества листьев. Другая система позволяет фотокопировать или сканировать листья и с помощью программы для анализа изображения оценивает поверхность. Другая простая альтернатива состоит в вырезании силуэтов фотокопируемых листьев и их взвешивании с использованием вырезаемой по их контуру бумаги с известной площадью поверхности для калибровки соотношения веса/площади. После измерения площади поверхности листьев листья сохраняют в бумажных конвертах с их описанием, сушат в термостате и взвешивают, получая, таким образом, "сухой вес";
- удельную площадь листа (SLA) или отношение площади листа к весу листа. Ее выражают в м2 (лист) кг-1 (растение);
- среднюю фракцию листьев (LMF) или отношение биомассы листьев к полной биомассе растения. Ее выражают в кг (лист) кг-1 (растение); или
- скорость истинной ассимиляции (NAR) или скорость увеличения веса растения на единицу площади листа. Ее выражают в кг (растение) м-2 (лист) день-1. Относительная скорость роста равна произведению LAR и NAR.
Другие параметры анализа роста включают:
- фракцию массы стебля (SMF) или отношение биомассы стебля к полной биомассе растения. Ее выражают в кг (стебель) кг-1 (растение);
- фракцию массы корня (RMF) или отношение биомассы корня к полной биомассе растения. Ее выражают в кг (корень) кг-1 (растение); и
- сухое вещество (DM) или отношение сухого веса растения к сырому весу растения. Ее выражают в кг (сухой вес) кг-1 (сырой вес).
Способ согласно изобретению может быть применен к любому типу фотосинтезирующего организма, например растению, водоросли и т.д. Таким образом, согласно настоящему изобретению, при контакте фактически любого фотосинтезирующего организма с фактором роста изобретения получают увеличение биомассы указанного фотосинтезирующего организма.
Как указано в начале настоящего описания, фактор роста изобретения представляет собой пептид, включающий мотив [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]. Впрочем, в конкретном варианте осуществления, фактор роста изобретения является пептидом, включающим мотив [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys], при условии, что указанный пептид не является пептидом SEQ ID NO: 4 или пептидом SEQ ID NO: 6.
Как сумеет оценить специалист, квалифицированный в данной области техники, указанный мотив, необязательно, будет фланкирован другими аминокислотными последовательностями, составляющими часть пептида, идентифицированного как фактор роста изобретения.
Таким образом, в конкретном варианте осуществления указанный пептид (фактор роста изобретения) включает аминокислотную последовательность:
X1-Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-X2,
в которой:
- X1 обозначает аминокислотную последовательность N-конца пептида, и
- X2 обозначает аминокислотную последовательность C-конца пептида.
Используемый в настоящем описании термин "пептид" относится к молекуле, сформированной при связывании аминокислот посредством пептидных связей, и он включает, в целях упрощения, пептиды, полипептиды и белки, хотя обычно принято, что термин "белок" применяют к полным биологическим молекулам со стабильной конформацией, тогда как термин "пептид" обычно относится к аминокислотным олигомерам с короткой цепью, которые часто не имеют стабильной трехмерной структуры; аналогичным образом, термин "полипептид" обычно относится к любой боковой цепи аминокислот, независимо от их длины (в большинстве случаев), которая часто не имеет определенной конформации.
Хотя длина аминокислотной последовательности N-концевого пептида (X1) может изменяться в пределах широкого диапазона, в конкретном варианте осуществления X1 имеет длину в пределах от 1 до 250 аминокислот, или еще более типично в пределах от 1 до 175 аминокислот, обычно в пределах от 1 до 100 аминокислот, чаще в пределах от 1 до 50 аминокислот, еще чаще в пределах от 2 до 40 аминокислот и даже еще чаще в пределах от 5 до 35 аминокислот.
Аналогичным образом, хотя длина аминокислотной последовательности C-конца (или карбоксильного конца) пептида (X2) может изменяться в пределах широкого диапазона, в конкретном варианте осуществления X2 имеет длину в пределах от 1 до 250 аминокислот или еще более типично в пределах от 1 до 175 аминокислот, обычно в пределах от 1 до 100 аминокислот, чаще в пределах от 1 до 50 аминокислот, еще чаще в пределах от 2 до 40 аминокислот.
В конкретном варианте осуществления аминокислотная последовательность C-конца пептида (X2) включает аминокислотную последовательность GRRRR (SEQ ID NO: 7), которая, в другом конкретном варианте осуществления, расположена на расстоянии 10-50 аминокислот от последнего Cys последовательности Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, то есть между последней аминокислотой (Cys) указанной последовательности и первой аминокислотой (G) последовательности GRRRR (SEQ ID NO: 7) присутствует от 10 до 50 аминокислот.
В конкретном варианте осуществления C-конец X2 амидирован.
Иллюстративные примеры пептидов, включающих указанный мотив [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys], включают, помимо прочего, адреномедуллин, белки Arabidopsis, аминокислотные последовательности которых показаны в последовательностях SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, белки Oryza sativa (рис), аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, и белок Thalassiosira pseudonana (диатомовая водоросль), аминокислотная последовательность которого показана в последовательности SEQ ID NO: 11.
Таким образом, в конкретном варианте осуществления способа изобретения фактор роста изобретения выбран из группы, состоящей из адреномедуллина, пептидов, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, и их комбинаций, которые будут подробно описаны ниже.
Адреномедуллин
Адреномедуллин (AM) представляет собой гипотензивный пептид, первоначально обнаруженный в феохромоцитоме человека, который состоит из 52 аминокислот, имеет внутримолекулярный дисульфидный мостик [Cys-Cys] и обладает высокой гомологией с пептидом, связанным с геном кальцитонина. Белок-предшественник, препроадреномедуллин (SEQ ID NO: 2) имеет длину 185 аминокислот (номер GenBank AAC60642.1), который в результате внутриклеточного процессинга приводит к образованию зрелого белка, содержащего 52 аминокислоты, который и является адреномедуллином. В конкретном варианте осуществления способа изобретения AM является адреномедуллином человека, определенным в SEQ ID NO: 3. Не желая быть связанными с какой-либо теорией, предполагается, что факт наличия активности AM человека в тканях растений обусловлен существованием подобного фактора в растениях или в микроорганизмах, связанных с ними.
[Аминокислотная последовательность адреномедуллина подчеркнута, а аминокислотная последовательность мотива GRRRR подчеркнута двойной линией и выделена жирным шрифтом]
[Характеристический мотив адреномедуллина (Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys) выделен жирным шрифтом, при этом два цистеина, формирующие дисульфидный мостик, подчеркнуты]
Как будет очевидно специалисту, квалифицированному в данной области техники, любой вариант SEQ ID NO: 3, обладающий способностью увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма, также включен в настоящее изобретение.
Используемый в настоящем описании термин "вариант SEQ ID NO: 3" относится к любому пептиду, аминокислотная последовательность которого может быть получена из SEQ ID NO: 3 посредством консервативных аминокислотных замен с проверкой того, что полученный в результате вариант обладает способностью увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма с помощью измерения любого из указанных выше параметров. Консервативные аминокислотные замены относятся к взаимозаменяемости остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, состоит из глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина; группа аминокислот, имеющих алифатические, гидроксильные боковые цепи, состоит из серина и треонина; группа аминокислот, имеющих боковые цепи, содержащие амидную группу, состоит из аспарагина и глутамина; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, состоит из фенилаланина, тирозина и триптофана; группа аминокислот, имеющих основные боковые цепи, состоит из лизина, аргинина и гистидина; и группа аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, состоит из цистеина и метионина. Предпочтительные группы консервативных аминокислотных замен являются следующими: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин.
Функционально эквивалентные варианты адреномедуллина включают полипептиды, которые являются по существу гомологичными нативному адреномедуллину [SEQ ID NO: 3]. Используемое в настоящем описании выражение "по существу гомологичный" относится к любой аминокислотной последовательности, обладающей степенью идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере 50%, преимущественно по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 85% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%. Степень идентичности между двумя пептидами может быть определена при использовании компьютерных алгоритмов и методов, которые широко известны специалистам, квалифицированным в данной области. Идентичность между двумя аминокислотными последовательностями двух пептидов предпочтительно определяют при использовании алгоритма BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410).
С другой стороны, адреномедуллин содержит в своей аминокислотной последовательности характеристический мотив (или идентифицирующий признак), который участвует в узнавании рецептора адреномедуллина и состоит из кольца из 6 аминокислот, сформированного дисульфидной связью между двумя цистеинами [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]. Адреномедуллин дополнительно имеет амидированный C-конец (CONH2), отделенный от мотива примерно 20-40 аминокислотами. Любой вариант адреномедуллина, содержащий мотив Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys в своей аминокислотной последовательности, будет узнавать рецептор адреномедуллина и вызывать процессы, которые приводят к увеличению биомассы фотосинтезирующего организма. Таким образом, настоящее изобретение также рассматривает такие варианты адреномедуллина, которые обладают способностью увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма и включают указанное кольцо из 6 аминокислот, сформированное дисульфидной связью между двумя цистеинами. Варианты SEQ ID NO: 3 могут дополнительно иметь амидированный C-конец.
В заключение, фрагменты адреномедуллина или его варианты, как определено выше, также включены в настоящее изобретение при условии, что они сохраняют способность увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма. Указанная способность может быть определена с помощью параметров, указанных в предыдущих параграфах.
Белки Arabidopsis
Другие конкретные варианты осуществления фактора роста изобретения включают белки Arabidopsis, описанные в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.
[Во всех случаях характеристический мотив фактора роста изобретения (Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys) выделен жирным шрифтом, два цистеина, формирующие дисульфидный мостик, подчеркнуты, и аминокислотная последовательность мотива GRRRR подчеркнута двойной линией и выделена жирным шрифтом]
Как сумеет оценить специалист, квалифицированный в данной области, варианты и фрагменты указанных белков также включены в рамки настоящего изобретения при условии, что они сохраняют характеристический мотив фактора роста изобретения и при введении в фотосинтезирующий организм увеличивают его биомассу. Увеличение биомассы фотосинтезирующего организма может быть установлено посредством любого из указанных выше параметров, например с помощью анализа увеличения биомассы растения, такого как анализ, описанный в Примере 1, или с помощью анализа увеличения биомассы водоросли, такого как анализ, описанный в Примере 2. Термин вариант и его значение в рамках настоящего изобретения были определены в предыдущих параграфах.
Белки Oryza sativa
Пептиды, включающие мотив [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys], включают, без ограничения, белки Oryza sativa (рис), аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
[Во всех случаях характеристический мотив фактора роста изобретения (Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys) выделен жирным шрифтом, два цистеина, формирующие дисульфидный мостик, подчеркнуты, и аминокислотная последовательность мотива GRRRR подчеркнута двойной линией и выделена жирным шрифтом]
Белок Thalassiosira pseudonana (диатомовая водоросль)
[Характеристический мотив фактора роста изобретения (Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys) выделен жирным шрифтом, два цистеина, формирующие дисульфидный мостик, подчеркнуты, и аминокислотная последовательность мотива GRRRR подчеркнута двойной линией и выделена жирным шрифтом]
Для того чтобы фактор роста изобретения производил требуемый эффект, то есть увеличивал биомассу фотосинтезирующего организма, необходим контакт указанного фактора роста с указанным фотосинтезирующим организмом. В уровне техники существует множество процессов, которые позволяют вводить активные компоненты (в настоящем изобретении фактор роста изобретения) в фотосинтезирующий организм, в особенности растения. Аналогичным образом, активный компонент включают в композицию таким способом, который подходит для применяемого способа введения.
Обычно для его введения в фотосинтезирующий организм фактор роста изобретения будет частью композиции, которую можно применять в твердой форме или в жидкой форме, например в форме смачиваемого порошка или эмульгируемого концентрата, включающего стандартные разбавители. Указанные композиции могут быть получены стандартным способом, например при смешивании фактора роста изобретения с разбавителем и, необязательно, с другими компонентами или элементами. В конкретном варианте осуществления фотосинтезирующий организм является растением, и при этом композиция, включающая фактор роста изобретения, может быть получена стандартными способами, путем смешивания фактора роста изобретения с разбавителем и, необязательно, с другими компонентами или элементами, которые обычно применяются в сельскохозяйственных композициях и которые известны специалисту, квалифицированному в данной области техники, такими как, помимо прочего, растворители, активные вещества или регуляторы pH, удобрения и т.д. В конкретном варианте осуществления фактор роста изобретения вводят в качестве добавки, дополняющей питательный раствор, поступающий растению в гидропонной системе, или, в другом конкретном варианте осуществления, его вводят в поливную воду указанного растения.
Концентрация фактора роста изобретения в композиции может изменяться в пределах широкого диапазона, как правило, от по меньшей мере 10-2 до 10-16 М, обычно от по меньшей мере 10-4 до 10-12 М, чаще от по меньшей мере 10-6 до 10-11 М, еще чаще от по меньшей мере 10-8 до 10-10 М. Дополнительными техническими особенностями указанной композиции являются, например, сельскохозяйственно приемлемые носители, которые могут использоваться, дополнительные компоненты, которые могут быть включены, форма ее представления, способ ее получения и т.д.
В смысле, используемом в настоящем описании, термин "сельскохозяйственно приемлемый носитель" включает любое вещество или комбинацию веществ, которые могут применяться в сельскохозяйственном секторе, при этом он включает любой сельскохозяйственно приемлемый жидкий или твердый материал, который может быть добавлен к и/или смешан с фактором роста изобретения для получения более простой или улучшенной в применении формы, или с применимой или требуемой интенсивностью активации.
Композиция, описанная в настоящей заявке, также может содержать, при необходимости, другие компоненты или элементы, обычно используемые в сельскохозяйственных композициях, такие как, без ограничения, растворители, активные вещества или регуляторы pH, удобрения и т.д., если все они позволяют, или не подвергают риску, или не нарушают способность фактора роста изобретения увеличивать растительную биомассу растения. Указанные компоненты или элементы, обычно используемые в сельскохозяйственных композициях, общеизвестны специалистам, квалифицированными в данной области техники.
Композиция, предложенная в настоящем изобретении, может быть получена стандартными способами, обычно основанными на смеси различных компонентов композиции в подходящих количествах.
Как указано выше, способ изобретения может применяться на любом фотосинтезирующем организме. В конкретном варианте осуществления способ изобретения применяют к таким фотосинтезирующим организмам, в которых увеличение биомассы является особенно желательным, таким как, например, растения и водоросли, которые могут в промышленном масштабе применяться в любой отрасли промышленности. Таким образом, в конкретном варианте осуществления фотосинтезирующий организм является растением, например растением для применения в производстве энергии, например возобновляемых источников энергии, для питания человека или животных, пород древесины, декоративных растений и т.д.
Примеры растений, биомасса которых используется в производстве топлив или возобновляемых источников энергии, включают, без ограничения:
(i) растения для применения в производстве электроэнергии, получаемой главным образом из быстрорастущих пород деревьев для получения энергии, таких как тополь, ива, эвкалипт, белая акация, хвойные деревья, акация, банановое дерево и т.д., а также травянистых растений, таких как чертополох, мискантус, гигантский тростник, молочай, опунция и т.д.; и
(ii) растения для применения в производстве биотоплива: производство биоспиртов, получаемых из свеклы, кукурузы, сладкого сорго, сахарной свеклы, картофеля, топинамбура и т.д., и биомасел, получаемых из семян рапса, подсолнечника, сои и т.д.
Как будет очевидно специалисту, квалифицированному в данной области техники, также растительную биомассу можно применять для получения тепловой энергии и в производстве топливных газов. Впрочем, из-за особенностей указанных процессов (тепловая энергия состоит из применения систем прямого сгорания для получения тепла, а производство топливных газов состоит из разрушения биомассы в метантанке с получением газа), биомасса, применяемая в производстве указанной энергии, может быть получена из любого растения.
Примеры древесных растений включают, помимо прочего, сосну, эвкалипт, пробковый дуб, кедр, дуб, дуб падуболистный и т.д.
Иллюстративные неограничивающие примеры представляющих интерес декоративных растений включают растения, относящиеся к роду Aeschynanthus; Carina; Columnea; Anemone; Azalea; Begonia; Calceolaria; Camelia; Dianthus; Freesia; Gerbera; Hibiscus; Hypoestes; Kalanchoe; Nicotiana; Pelargonium; Petunia; Primula; Ranunculus; Rhipsalidopsis; Rosa; Saintpaulia; Sinningia-gloxinia; Streptocarpus; Tigridia; Verbena или Zinnia. Другие декоративные растения включают орхидеи (семейство Orchidaceae) и декоративные кустарники, которые включают лавр благородный (Laurus nobilis), жимолость (Lonicera fragrantissima), магнолию звездчатую (Magnolia stellata), гортензию крупнолистную (Hydrangea macrophylla), бобовник (Laburnum x watereri), японскую розу или керрию (Kerria japonica) и т.д.
Иллюстративные неограничивающие примеры растений, применяемых для питания человека или животных, включают плодовые деревья, которые включают, помимо прочих, вишню, сливу, персик, абрикос, оливковое дерево, манго, грушу, яблоню, мушмулу японскую, айву, апельсин, лимон, инжир, папайю, каштан, дуб, дуб падуболистный, дуб кермесовый, лесной орех, миндаль, грецкий орех и т.д.; кормовые растения, которые включают, помимо прочих, бобовые (например, клевер, люцерну, клитории, арахис, леуцену, колокольчики и т.д.), травы (например, рожь, овсянницу, ежу сборную, бутелуа изящную, родсову траву, буйволиную траву, бородачи, ветвянки, бермудскую траву, которая считается газонной травой, и слоновую траву или щетинник, сахарную свеклу, арундо тайваньскую и метлицу полевую, которые являются фуражными, и т.д.), зерновые (например, сорго, пшеницу, рожь, ячмень и т.д.); растения для употребления человеком (салат, капуста, шпинат, швейцарский мангольд, зеленые бобы, томаты и т.д.) и т.д.
В другом конкретном варианте осуществления фотосинтезирующий организм является водорослью, например микроводорослью, такой как микроводоросли рода Chlorella, Botryococcus, Nannochloropsis, Haematococcus, Neochloris или Tetraselmis; другие иллюстративные, неограничивающие примеры водорослей в рамках настоящего изобретения включают аонори (Enteromorpha intestinalis) (несколько видов зеленой водоросли Моностромы) (Япония), араме (Eisenia bicyclis), алярию съедобную (Alaria esculenta), каролу (Callophyllis variegata) (Южная Америка), ирландский мох (Mastocarpus stellatus), хлореллу, ламинарию сахаристую, дурвиллею антарктическую, Palmaria palmata, Euchema cottonii, Caulerpa lentillifera, грацилярию, грацилярию конферовидную (Agardhiella tenera), хиджики или хизики (Sargassum fusiforme), хондавара (Sargassum enerve), Chondrus crispus, Porphyra laciniata/Porphyra umbilicalis, Ulva lactuca, Sargassum echinocarpum, Saccharina japonica, миру (Codium sp.), мозуки (Cladosiphon okamuranus), нори (несколько видов красной водоросли Porphyra), ламинарию пальчаторассеченную (Laminaria digitata), огонори (несколько видов красной водоросли Gracilaria), Fucus vesiculosus, нереоцистис Лютке (Nereocystis luetkeana), порфиру лопастную (Porphyra purpurea, syn. Porphyra laciniata), Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, морской ремешок (Himanthalia elongata), цуномато (несколько видов красной водоросли Chondrus), вакаме (Undaria pinnatifida) и т.д.
Генная конструкция изобретения
Другая, рассматриваемая в соответствии с настоящим изобретением возможность достижения того, что фактор роста изобретения увеличивает биомассу фотосинтезирующего организма, состоит во вставке в геном указанного фотосинтезирующего организма нуклеотидной последовательности, кодирующей указанный фактор роста, при этом, когда указанная нуклеотидная последовательность экспрессируется, это производит требуемый эффект в фотосинтезирующем организме.
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к генной конструкции, в дальнейшем генной конструкции изобретения, включающей:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, который включает
(i) аминокислотную последовательность
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1],
в которой
- Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 независимо обозначают аминокислоту, и
(ii) остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в (i), формируют дисульфидный мостик между ними, и
(b) регуляторные элементы для регуляции ее экспрессии в фотосинтезирующем организме.
В конкретном варианте осуществления указанные регуляторные элементы подходят для регуляции экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный пептид в водоросли; указанные элементы известны квалифицированным специалистам.
В другом конкретном варианте осуществления указанные регуляторные элементы подходят для регуляции экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный пептид в растении; указанные элементы также известны квалифицированным специалистам.
В конкретном варианте осуществления регуляторные элементы для регуляции экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный пептид, являются гетерологичными по отношению к указанной последовательности нуклеиновой кислоты, то есть, когда указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок Arabidopsis (например, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6), указанная последовательность нуклеиновой кислоты находится под контролем регуляторных элементов для регуляции ее экспрессии в растении, отличных от регуляторных элементов, которые регулируют экспрессию указанных белков Arabidopsis в указанном растении в природе, или когда указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок Oryza sativa (например, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10), указанная последовательность нуклеиновой кислоты находится под контролем регуляторных элементов для регуляции ее экспрессии в растении, отличных от регуляторных элементов, которые регулируют экспрессию указанных белков Oryza sativa в указанном растении в природе; или когда указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует Thalassiosira pseudonana (например, SEQ ID NO: 11), указанная последовательность нуклеиновой кислоты находится под контролем регуляторных элементов для регуляции ее экспрессии в водоросли, отличных от регуляторных элементов, которые регулируют экспрессию указанного белка Thalassiosira в указанной водоросли в природе.
Аминокислоты Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 могут быть одинаковыми или отличными друг от друга. В конкретном варианте осуществления Xaa1, Xaa2, Xaa3 и/или Xaa4 являются аминокислотой, отличной от Cys.
Таким образом, в конкретном варианте осуществления указанная генная конструкция изобретения включает:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, который включает
(i) аминокислотную последовательность
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1],
в которой
- Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 независимо обозначают аминокислоту, и
(ii) остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в (i), формируют дисульфидный мостик между ними, и
(b) регуляторные элементы для регуляции ее экспрессии в фотосинтезирующем организме,
с условием, что, когда указанная последовательность нуклеиновой кислоты (a) кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из белков, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, указанная последовательность нуклеиновой кислоты (a) находится под контролем регуляторных элементов для регуляции ее экспрессии в растении, отличных от регуляторных элементов, которые регулируют экспрессию указанных белков в Arabidopsis sp. в природе;
с условием, что, когда указанная последовательность нуклеиновой кислоты (a) кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из белков, аминокислотные последовательности которых показаны в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, указанная последовательность нуклеиновой кислоты (a) находится под контролем регуляторных элементов для регуляции ее экспрессии в растении, отличных от регуляторных элементов, которые регулируют экспрессию указанных белков в Oryza sativa sp. в природе; и
с условием, что, когда указанная последовательность нуклеиновой кислоты (a) кодирует белок, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 11, указанная последовательность нуклеиновой кислоты (a) находится под контролем регуляторных элементов для регуляции ее экспрессии в водоросли, отличных от регуляторных элементов, которые регулируют экспрессию указанных белков в Thalassiosira pseudonana (диатомовой водоросли) в природе.
В конкретном варианте осуществления генной конструкции изобретения указанный пептид включает аминокислотную последовательность
X1-Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-X2,
в которой:
- X1 обозначает аминокислотную последовательность N-конца пептида, и
- X2 обозначает аминокислотную последовательность C-конца пептида.
Хотя длина аминокислотной последовательности N-конца пептида (X1) может изменяться в пределах широкого диапазона, в конкретном варианте осуществления X1 имеет длину в пределах от 1 до 250 аминокислот, или еще более типично в пределах от 1 до 175 аминокислот, обычно в пределах от 1 до 100 аминокислот, чаще в пределах от 1 до 50 аминокислот, еще чаще в пределах от 2 до 40 аминокислот и еще чаще в пределах от 5 до 35 аминокислот.
Аналогичным образом, хотя длина аминокислотной последовательности C-конца пептида (X2) может изменяться в пределах широкого диапазона, в конкретном варианте осуществления X2 имеет длину в пределах от 1 до 250 аминокислот или еще более типично в пределах от 1 до 175 аминокислот, обычно в пределах от 1 до 100 аминокислот, чаще в пределах от 1 до 50 аминокислот, еще чаще в пределах от 2 до 40 аминокислот.
В конкретном варианте осуществления аминокислотная последовательность C-конца пептида (X2) включает аминокислотную последовательность GRRRR (SEQ ID NO: 7), которая, в другом конкретном варианте осуществления, расположена на расстоянии 10-50 аминокислот от последнего Cys последовательности Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys.
В конкретном варианте осуществления C-конец X2 амидирован.
В другом конкретном варианте осуществления указанный пептид выбран из группы, состоящей из адреномедуллина и белков, аминокислотные последовательности которых показаны в последовательностях SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, а также их функционально эквивалентных вариантах и фрагментах.
Генная конструкция изобретения может быть получена при использовании методов, известных из уровня техники [Sambrock et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol.1-3]. Указанная генная конструкция изобретения включает в себя функционально связанные с ней регуляторные элементы для регуляции ее экспрессии в фотосинтезирующем организме. Используемое в настоящем описании выражение "функционально связанные" означает, что нуклеиновая кислота, кодирующая фактор роста изобретения [то есть пептид, включающий аминокислотную последовательность Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys], экспрессируется в правильной рамке считывания под контролем регуляторных контрольных элементов или регулирующих экспрессию последовательностей. Контрольные регуляторные элементы представляют собой последовательности, которые контролируют и регулируют транскрипцию и, в соответствующих случаях, трансляцию белка, и включают промоторные последовательности, последовательности, кодирующие регуляторы транскрипции, последовательности связывания рибосомы (RBS) и/или последовательности терминации транскрипции.
Генная конструкция изобретения может быть встроена в геном клетки фотосинтезирующего организма, например клетку растения или ткань, или клетку водоросли, любым подходящим способом с получением трансформированных фотосинтезирующих организмов. Указанные способы могут включать, например, применение липосом, электропорации, диффузии, бомбардировки частицами, микроинъекции, генных пушек, химических соединений, которые увеличивают поглощение свободной ДНК, например преципитацию с фосфатом кальция, вирусные векторы и т.д.
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к вектору, включающему генную конструкцию изобретения.
В конкретном варианте осуществления указанный вектор является вектором, подходящим для трансформации водорослей; указанные векторы известны специалисту, квалифицированному в данной области (например, в WO 2009149470 раскрыты способы и композиции для трансформированных вектором клеток водорослей, где вектор включает в себя Vcp промотор, управляющий экспрессией гена устойчивости к антибиотику в клетке водоросли.
В другом конкретном варианте осуществления указанный вектор является вектором, подходящим для трансформации растений; указанные векторы также известны специалисту, квалифицированному в данной области. В более конкретном варианте осуществления векторы, подходящие для трансформации растений, включают векторы на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, такие как описанные в EP 120516. В дополнение к трансформирующим векторам, полученным на основе Ti или Ri плазмид Agrobacterium, для введения генной конструкции в клетки и ткани растения могут использоваться альтернативные методы, такие как, например, помимо прочих, методика вакуумной инфильтрации.
С другой стороны, как нуклеиновая кислота, кодирующая пептид, который включает (i) аминокислотную последовательность Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1], в которой Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 независимо обозначают аминокислоту, и (ii) остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в (i), которые формируют дисульфидный мостик между ними [в дальнейшем нуклеиновая кислота (a)], так и генная конструкция изобретения также могут быть включены в вектор, который включает прокариотический репликон, то есть последовательность ДНК, способную направлять автономную репликацию и поддержание внехромосомной рекомбинантной молекулы ДНК, когда она введена в прокариотическую клетку-хозяина, такую как бактерию. Указанные репликоны известны в уровне техники. Векторы, включающие прокариотический репликон, также обычно включают сайты рестрикции для вставки генной конструкции. Такие векторы известны в уровне техники и описаны, например, в патенте США 6268552.
Аналогичным образом, векторы также могут включать маркеры для проверки присутствия гетерологичной ДНК в фотосинтезирующих организмах, например клетках и/или тканях растения, или клетках водоросли, которые были трансформированы. Генетические маркеры, которые позволяют отбирать гетерологичную ДНК в указанных фотосинтезирующих организмах, например клетках растения, включают гены, которые придают устойчивость к антибиотикам, например ампициллину, тетрациклину, канамицину, гигромицину, гентамицину и т.д. Ген неомицинфосфотрансферазы обладает преимуществом возможности экспрессии как в эукариотических, так и прокариотических клетках. Маркер позволяет отбирать удовлетворительно трансформированные фотосинтезирующие организмы, например растения, выращенные в среде, содержащей соответствующий антибиотик, поскольку они содержат подходящий ген устойчивости.
Введение указанной нуклеиновой кислоты (a), как и введение указанной генной конструкции для трансформации фотосинтезирующего организма, например клетки или ткани растения, или клетки водоросли, и получения трансгенного фотосинтезирующего организма, например трансгенного растения или трансгенной водоросли, может быть выполнено, как было указано выше, любым способом, известным в уровне техники, включая, помимо прочего, перенос ДНК, опосредованный A. tumefaciens, предпочтительно с использованием неонкогенного T-ДНК вектора, электропорацию, прямой перенос ДНК, бомбардировку частицами и т.д. (для просмотра информации по указанным темам см., например, Marta Izquierdo Rojo in "Ingenieria Genetica y Transferencia Genica", 1999, Ediciones Piramide, S.A, Madrid).
В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, включающей указанную нуклеиновую кислоту (a), генную конструкцию согласно изобретению или вектор, как было описано выше. Подходящие клетки-хозяева для содержания генной конструкции согласно изобретению или вектора, как было описано выше, включают, без ограничения, прокариотические клетки, дрожжи или эукариотические клетки, такие как, например, клетки насекомых. Как будет очевидно специалисту, квалифицированному в данной области, в зависимости от трансформируемой клетки-хозяина, генная конструкция изобретения или содержащий ее вектор могут содержать последовательности контроля экспрессии, которые могут быть функциональными в прокариотических клетках и организмах, например бактериях и т.д., или функциональными в эукариотических клетках и организмах, например клетках насекомых, клетках млекопитающих и т.д.
В другом аспекте изобретение относится к трансгенной клетке растения или водоросли, включающей интегрированную в ее геноме указанную нуклеиновую кислоту (a) или указанную генную конструкцию изобретения. Способы культивирования трансформированных клеток и тканей растения или водоросли и регенерации трансгенных растений или водорослей известны в уровне техники, как и условия культивирования и роста указанных растений или водорослей (см., например, Marta Izquierdo (1999), процитированную выше).
Таким образом, трансгенное растение, полученное из клетки растения, трансформированного генной конструкцией изобретения, или водоросли, трансформированной генной конструкцией изобретения, составляет дополнительный изобретательский аспект настоящего изобретения.
Применение фактора роста изобретения
Способность фактора роста изобретения увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма находит применение в различных отраслях промышленности в зависимости от фотосинтезирующего организма. Таким образом, как указано в предыдущих аспектах изобретения, фактор роста изобретения может применяться для увеличения биомассы морских водорослей или растений, которые предполагается применять в производстве энергии, при получении древесины, для питания человека или животных, или в цветоводстве как способ улучшения внешнего вида декоративных растений.
Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение и не должны рассматриваться как ограничивающие его возможности.
ПРИМЕР 1
Увеличение растительной биомассы в растениях моркови и табака
Материал и Методы
Каллусы моркови (Daucus carota) и табака (Nicotiana tabacum) получали от компании Carolina Biological Supply Company (Burlington, NC, USA) и поддерживали в стерильных условиях в твердой среде для инициации роста каллуса для моркови или для табака соответственно (также предоставленной Carolina Biological). Ее определенный состав доступен в каталоге компании.
Одиночный каллус разделяли на небольшие фрагменты, полученные фрагменты взвешивали в стерильных условиях и высевали на свежую среду (твердая среда для инициации роста каллуса, полученная от Carolina Biologicals), которая содержала различные концентрации синтетического человеческого пептида адреномедуллина (AM) (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA). Через 30 дней роста в темноте каллусы снова взвешивали и вычисляли скорость роста как соотношение конечного веса, деленного на начальный вес.
Сухой вес каждого образца вычисляли, подвергая каллусы процессу сушки в термостате при 250°C в течение 24 часов.
Результаты
Увеличение роста каллусов в соответствии с дозозависимым ответом наблюдали и в моркови, и в табаке (Фигура 1). Наиболее эффективная концентрация AM для стимуляции роста клеток составляла 10-10 М. Более умеренное увеличение роста происходило при более низких или более высоких концентрациях. 60%-ное увеличение биомассы по сравнению с контролем получали при оптимальной дозе AM.
Для проверки того, что такое увеличение массы не происходило вследствие увеличения гидратации ткани, измеряли сухой вес ткани, и при этом обнаружили, что различия сохранялись, что указывает на то, что увеличение биомассы соответствовало чистому росту включенных тканей.
Эффект, наблюдаемый в клетках каллуса, состоящий в увеличении роста (клеточной пролиферации) клеток каллуса, идеально передавался на целые растения. Иногда увеличение пролиферации клеток влияет на органолептические или физические свойства растений. Однако увеличение биомассы будет происходить в растениях так же, как это происходит в клетках каллуса.
ПРИМЕР 2
Увеличение водорослевой биомассы в водорослях рода Chlorella
Материал и Методы
Две идентичные культуры хлореллы приготавливали в среде Гилларда F/2 (по 250 мл каждая) в двух отдельных стеклянных колбах [Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, pp 26-60. In Smith W.L. and Chanley M.H. (Eds.) Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Press, New York, USA.; Guillard, R.R.L. and Ryther, J.H. 1962. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239]. Затем 100 мкл указанной среды Гилларда F/2 добавляли в колбу и 100 мкл указанной среды Гилларда F/2, содержащей синтетический человеческий пептид-адреномедуллин (AM) (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA) в достаточном количестве, чтобы получить конечную концентрацию 10-8 М, в другую колбу.
Воздух, содержащий 5% CO2, непрерывно пропускали через культуру. Колбы освещали с фотопериодом 12 часов света/12 часов темноты.
Аликвоты периодически отбирали из среды для оценки роста микроводорослей. Спектральное поглощение измеряли при 680 нм с помощью спектрофотометра Perkin Elmer Lambda 35 UV/Visible.
Результаты
Обработанные AM микроводоросли растут быстрее и достигают стационарной фазы скорее, чем необработанные микроводоросли.
1. Способ увеличения биомассы фотосинтезирующего организма, который включает культивирование указанного фотосинтезирующего организма в присутствии пептида, включающего:
(i) аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3; или
(ii) функциональный вариант пептида, определенного в (i), где указанный вариант представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого обладает степенью идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере 70% и сохраняет свою способность увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма, и где указанный вариант включает аминокислотную последовательность
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1],
где Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 независимо обозначают аминокислоту, и остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, формируют дисульфидный мостик между ними.
2. Способ по п. 1, где указанный пептид является адреномедуллином, предпочтительно человеческим адреномедуллином.
3. Способ по п. 1, где указанный фотосинтезирующий организм является растением или водорослью.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где указанный фотосинтезирующий организм является растением, и указанный пептид вводят в качестве добавки для дополнения питательного раствора, который подают указанному растению в гидропонной системе, или его вводят к поливную воду указанного растения.
5. Способ по п. 4, где указанное растение выбрано из растения, применяемого для производства возобновляемых источников энергии; растения для питания человека или животных, породы древесины и декоративного растения.
6. Способ по любому из пп. 1-3, 5, где указанный пептид присутствует в концентрации от 10-2 М до 10-16 М, предпочтительно от 10-6 М до 10-11 М, более предпочтительно от 10-8 М до 10-10 М.
7. Генная конструкция для увеличения биомассы фотосинтезирующего организма, включающая:
(a) нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 3, или его функциональный вариант, где указанный вариант представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого обладает степенью идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере 70% и сохраняет свою способность увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма, и где указанный вариант включает аминокислотную последовательность
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1],
в которой Xaa1, Хаа2, Хаа3 и Хаа4 независимо обозначают аминокислоту, и остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, формируют дисульфидный мостик между ними, и
(b) регуляторные элементы для регуляции ее экспрессии в фотосинтезирующем организме.
8. Генная конструкция по п. 7, где указанный пептид является адреномедуллином, предпочтительно человеческим адреномедуллином.
9. Вектор для увеличения биомассы фотосинтезирующего организма, включающий генную конструкцию по любому из пп. 7 или 8.
10. Клетка-хозяин для увеличения биомассы фотосинтезирующего организма, включающая нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 3, или его функциональный вариант, где указанный вариант представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого обладает степенью идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере 70% и сохраняет свою способность увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма, и где указанный вариант включает аминокислотную последовательность Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1], в которой Хаа1, Xaa2, Хаа3 и Хаа4 независимо обозначают аминокислоту, и остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, формируют дисульфидный мостик между ними, или генную конструкцию по любому из пп. 7 или 8, или вектор по п. 9.
11. Клетка трансгенного фотосинтезирующего организма для увеличения биомассы фотосинтезирующего организма, включающая интегрированную в ее геноме нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 3, или его функциональный вариант, где указанный вариант представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого обладает степенью идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3, по меньшей мере 70% и сохраняет свою способность увеличивать биомассу фотосинтезирующего организма, и где указанный вариант включает аминокислотную последовательность Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1], в которой Xaa1, Xaa2, Xaa3 и Xaa4 независимо обозначают аминокислоту, и остатки цистеина аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, формируют дисульфидный мостик между ними, или генную конструкцию по любому из пп. 7 или 8.
12. Трансгенный фотосинтезирующий организм, включающий по меньшей мере одну клетку трансгенного фотосинтезирующего организма по п. 11, где трансгенный фотосинтезирующий организм обладает увеличенной биомассой по сравнению с нетрансгенным организмом.
