Способ выделения нуклеиновых кислот

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине. Изобретение раскрывает способ выделения нуклеиновых кислот с использованием изопропанола на этапе преципитации и осаждения ДНК, отличающийся тем, что при начальной обработке биологического материала используют гидрохлорид гуанидина и детергент в натрий-ацетатном буфере, а в качестве соосадителя нуклеиновых кислот применяют 0,05% линейный полиакриламид. Выделенная данным способом нуклеиновая кислота может быть использована при постановке полимеразной цепной реакции, также в практической медицине и ветеринарии для диагностики наследственных заболеваний человека и животных, судебной медицине, генной дактилоскопии, диагностике возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных, в том числе заболеваний передающихся половым путем. Преимуществом способа является упрощение выделения НК из крови и тканей человека и животных, что весьма актуально при проведении массовых анализов различных образцов в процессе диагностики инфекционных заболеваний. Использование в изобретении линейного полиакриламида ЛПАА в качестве соосадителя позволяет повысить выход НК из образца. 1 ил., 3 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине, является способом выделения нуклеиновых кислот из крови, ткани и мазков человека и животных. Выделенная данным способом НК может быть использована при постановке полимеразной цепной реакции, также в практической медицине для диагностики наследственных заболеваний человека, судебной медицине, генной дактилоскопии, диагностике возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных, в том числе заболеваний передающихся половым путем.

В основе диагностики и лечения многих заболеваний человека и животных лежат идентификация возбудителя и определение этиологии заболевания. Постановка полимеразной цепной реакции необходима в следующих случаях: для уточнения диагноза, в силу наличия у многих заболеваний серонегативного периода в ИФА, выявления наследственной патологии, предрасположенности к тому или иному заболеванию. ПЦР исследование отличается высокой чувствительностью и специфичностью, возможностью автоматизации процесса. Метод ПЦР включает в себя следующие основные этапы: выделение нуклеиновых кислот - ДНК и РНК, амплификация и анализ результатов. В основе ПЦР диагностики лежит многократное увеличение определенного участка последовательности нуклеиновых кислот при помощи фермента - термостабильной ДНК-полимеразы Taq-полимеразы. В случае анализа РНК этому этапу предшествует этап синтеза кДНК на матрице РНК с помощью РНК-полимеразы. Для улучшения чувствительности и специфичности ПЦР-анализа необходимо качественное и быстрое выделение и очистка нуклеиновых кислот - НК обеспечивающая минимальные потери материала. Проблема качественного получения НК для анализа наиболее остро стоит в случае с РНК, из-за ее быстрого лизиса РНК-азами. Учитывая вышесказанное, разработка нового метода для выделения НК является актуальной и практически значимой задачей.

В настоящее время существует несколько способов получения НК. Так для получения НК используются следующие методы:

1. Для выделения ДНК

Известен способ подготовки биологического материала для ДНК-ПЦР генамплификационной диагностики путем лизиса образца, многократной экстракции водонасыщенным фенолом или смесью фенол-хлороформ и осаждение ДНК этанолом в присутствии ацетата натрия (Мазин А.В. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990, с. 13-14). Основными недостатками данной методики является использование токсичных агентов, требующих особых условий работы, хранения и утилизации, длительностью выделения 3,5-4 часа в связи с переосаждением целевого продукта, низким выходом 25-30%.

2. Для выделения РНК

Основным способом выделения РНК является фенохлоформная экстракция по Хромински (Chomezynski P., Mackey К. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures. 1996. V. 10. P. 221-224).

100 мкл исследуемого образца смешивается с 600 мкл лизирующего раствора 4 M гуанидин изотиоционат, 50 мM цитрат натрия, 0.5% лаурил саркозилат, 100 мM µ-меркаптоэтанол, после чего добавляется 60 мкл 2 M NaAc pH=4.0, 600 мкл водонасыщенного фенола, тщательно перемешивается пипетированием. К полученной смеси приливается 120 мкл хлороформа, и инкубируется на льду в течение 10 минут. Смесь центрифугируется 15 минут при 12000 g. Водная (верхняя) фазу отбирается в отдельные пробирки, смешивается с равным объемом хлороформа, тщательно перемешивается и инкубируется при комнатной температуре 30 минут. Раствор отцентрифугировать 15 минут при 12000 g. Осадок двукратно промывается 80% этанолом, высушивается. После растворения РНК можно использовать для постановки обратной транскрипции. Основными недостатками данной методики является использование токсичных агентов, требующих особых условий работы, хранения и утилизации, а также с длительностью протокола 3 часа в связи с переосаждением целевого продукта, а также низким выходом около 7%.

3. Выделение ДНК и РНК

Выделение ДНК/РНК методом сорбции на силике. 100 мкл исследуемого образца смешивается со 450 мкл лизирующего раствора 6 M Guanidine thiocyanate; 50 мМ NaAc pH=5.4; 5 мМ EDTA; 5% Triton Х-100, после чего в каждую пробирку добавляется по 25 мкл 0,1% силики. Сорбент последовательно отмывают раствором 4 M гуанидинтиоционата, дважды 70%-ным этанолом, затем ацетоном и после чего проводят элюцию ДНК с сорбента. Супернатант содержит очищенные РНК и ДНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции и ПЦР. (см. Boom R., Sol С.J. А et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acid. J. Clin. Microbiol., 1990, v. 28, N 3, p. 495-503). Основным недостатком данного метода является сложность подготовки сорбента и большое количество отмывок получаемого материала, кроме того, использование данного метода для получения нуклеиновых кислот требует использования дополнительного оборудования шейкера.

Наиболее близким к предлагаемому методу является следующий.

Осадок клеток ресуспендируется в лизирующем растворе 3 M натрий изотиоционат, 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 15 мМ ЭДТА, pH 8.0, 1% N-лаурилсаркозил, 1% поливинилпирролидон, 10 мМ дитиотриэтол и 0.6 г Ballotini бус 0.1 мм. Образец гомогенизируется в течение 1-3 мин, из супернатанта прецитипитируется НК при помощи изопропанола в течение 20 мин на льду, после чего центрифугируется в течение 20 мин при 14,000 × g, супернатант удаляется и осадок промывается дважды этанолом, высушивается и ресуспендируется в буфере (см. S. Mcllroy, К. Porter, R. J. Seviour, and D. Tillet Appl / Environ Microbiol. 2008 November; 74(21):6806-6807). Данный метод предназначен для выделения НК из растворов с высокой концентрацией 10-15 мг биомассы, при использовании данного метода при выделении НК из клинических образцов характеризующихся низкой концентрацией НК, поливинилпирролидон ингибирует ферментативные реакции, в том числе обратную транскрипцию.

Задача изобретения - упрощение способа выделения НК из крови и тканей человека и животных, что весьма актуально при проведении массовых анализов различных образцов в процессе диагностики инфекционных заболеваний.

Существенным отличием заявляемого способа является использование линейного полиакриламида (ЛПААГ) в качестве соосадителя для очистки и концентрирования НК. ЛПААГ не ингибирует большинство ферментативных реакций, что позволяет использовать его для выделения НК, которые служат матрицей в реакциях полимеризации. Линейный 0,05% полиакриламид связывается с ДНК и хорошо осаждается спиртами, что повышает выход НК из образца.

Способ осуществляют следующим образом:

Вносят 300 мкл лизирующего раствора в пластиковую пробирку емкостью 1,5 мл, не касаясь ее края. Добавляют 100 мкл исследуемого образца и, плотно закрыв крышку пробирки, перемешивают на вортексе в течение 3-5 сек. Термостатируют пробу 15 мин при 65°C, осаждают конденсат центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 сек. Добавляют 500 мкл реагента для преципитации НК и перемешивают пробу на вортексе в течение 3-5 сек. Центрифугируют пробирку при 14000 об/мин в течение 15 мин. Не задевая осадок, полностью удаляют надосадочную жидкость отдельным наконечником из каждой пробирки. Добавляют к осадку 500 мкл промывочного раствора №1 и 3-5 раз аккуратно переворачивают пробирку. Центрифугируют пробирку при 14000 об/мин в течение 5 мин. Не задевая осадок, полностью удаляют надосадочную жидкость отдельным наконечником из каждой пробирки. Добавляют к осадку 300 мкл промывочного раствора №2 и 3-5 раз аккуратно переворачивают пробирку. Центрифугируют пробирку при 14000 об/мин в течение 5 мин. Не задевая осадок, полностью удаляют надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки). Открывают крышку пробирки и высушивают осадок при 65°C в течение 5 мин. Добавляют к осадку 50 мкл буфера для растворения НК и прогревают пробу при 65°C в течение 10 мин. Осаждают капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в течение 3-5 сек. Готовый препарат используют для постановки полимеразной цепной реакции.

Составы смесей для выделения НК следующие:

Лизирующий буфер

гуанидин тиоцианат 4 M,

NaAc pH=5.2 150 мМ,

EDTA 25 мМ,

Triton Х-100 5%,

b-MeEtOH* 0.1 M,

линейный ПААГ 0.05%

Буфер для преципитации

NaAc pH=5.2 400 мМ,

изопрапанол 90%

Промывочный раствор 1

Этанол 70%

Промывочный раствор 2

Ацетон 70%

Пример 1. Приготовление линейного политакриламида

Линейный полиакриламид ЛПААГ хорошо осаждается спиртом, что позволяет использовать его в качестве соосадителя для очистки и концентрирования ДНК. ЛПААГ не ингибирует большинство ферментативных реакций. Для осаждения следует брать 2-5 мкл 0.5% раствора (в зависимости от объема осаждаемой ДНК).

Приготовить 10% AA (без МБАА) в 40 мМ TrisHCl, 20 мМ NaAc, 1 мM EDTA, pH 7.8. Добавить 1/100 V 10% персульфата аммония и 1/1000 ТЕМЕД, 30 мин. Осадить 2.5 V EtOH. Центрифугировать как для осаждения ДНК. Осадок промыть 70% EtOH. Растворить с концентрацией 10 мкг/мкл 1%.

Пример 2. Обнаружение возбудителя боррелиоза

Клеща вносили в 300 мкл лизирующего раствора и прокалывали пластиковым носиком. Пробу термостатировали 15 мин при 65°C, конденсат осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 сек, после чего добавляли 500 мкл реагента для преципитации НК и пробу перемешивали на вортексе в течение 3-5 сек. Пробирку центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 мин. Не задевая осадок, полностью удаляли супернатант. Осадок промывали 500 мкл раствора 1, затем после центрифугирования при 14000 об/мин в течение 5 мин, осадок промывали раствором 2. Пробу центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 мин. Не задевая осадок, полностью удаляли супернатант, пробирки высушивали при 65°C в течение 5 мин. К осадку добавляли 50 мкл буфера для растворения НК и прогревали пробу при 65°C в течение 10 мин. Полученный препарат использовали для постановки ПЦР реакции в режиме реального времени на амплификаторе iqCycler4 Bio-rad. В качестве референс метода использовали выделение ДНК фенол хлороформной экстракцией и медом сорбции на силике (табл.1).

Таблица 1
Выявляемость возбудителя клещевого боррелиоза, N=300
Метод выделения Группы сравнения Выявляемость клещевого боррелиоза
Выделение ДНК методом сорбции на силике вся группа 10,7%
не напитавшиеся клещи 10,7%
напитавшиеся клещи 10,7%
Выделение РНК методом переосаждения из раствора с хаотропными агентами вся группа 17%
не напитавшиеся клещи 18,7%
напитавшиеся клещи 15,3%
Выделение ДНК методом экстракции фенол хлороформом вся группа 16,3%
не напитавшиеся клещи 17,3%
напитавшиеся клещи 15,3%

Различия в выявляемости возбудителя клещевого боррелиоза статистически достоверны отличия метода переосаждения из раствора с ЛПААГ и метода сорбции на силике p<0.05, выделения ДНК методом экстракции фенол-хлороформом и методом сорбции на силике p<0.05. Различия в выявляемости методом переосаждения из раствора с хаотропными агентами и выделение ДНК методом экстракции фенол-хлороформом статистически не достоверны.

Пример 3

Выделение РНК для обнаружения вируса клещевого энцефалита Пробы обрабатывали так, как написано в примере 2. Было проведено сравнение эффективность выделения РНК методом сорбции на силике, и методом переосаждения из раствора с ЛПААГ, и экстракцией по Хромински для выделения РНК (Таб. 2).

Проведенный эксперимент показал статистически значимые отличия в выявляемости вируса клещевого энцефалита между методом переосаждения из раствора с ЛПААГ и методом сорбции на силике p<0.05, оценено при помощи критерия Хи-квадрат с использованием программы Statistika, а также выделения РНК по Хромински и методом сорбции на силике p<0.05.

Таблица 2
Выявляемость вируса клещевого
Метод выделения Группы сравнения Выявляемость клещевого энцефалита
Выделение ДНК/РНК методом сорбции на силике вся группа 8,0%
не напитавшиеся клещи 7,3%
напитавшиеся клещи 8,7%
Выделение РНК/ДНК методом переосаждения из раствора с хаотропными агентами вся группа 13,0%
не напитавшиеся клещи 12,0%
напитавшиеся клещи 14%
Выделение РНК по Хромински вся группа 14,0%
не напитавшиеся клещи 12,6%
напитавшиеся клещи 15,3%

Различия в выявляемости методом переосаждения из раствора с ЛПААГ и выделение РНК по Хромински статистически не значимы.

Пример 4

Была проведена серия экспериментов по выделению РНК из культуральной среды РНК-содержащего фага MS2. Выделение РНК проводилось одновременно тремя различными методами фенол-хлоформная экстракция по Хроминки, при помощи набора для выделения РНК «RNA-Ss», Россия и переосаждением РНК из раствора с ЛПААГ. Критериями сравнения являлись чувствительность и воспроизводимость результатов эксперимента. Наиболее предпочтительный метод выделения РНК определяли при помощи титрования, табл. 3.

Эффективность амплификации при выделении РНК методом фенол-хлороформной экстракции составила 1.84 (92%), при выделении комплектом реагентов с ЛПААГ - 1.88 (94%).

Таблица 3
Средние значения пороговых циклов C(t) для различных методов выделения
Метод Значения порогового цикла C(t) при различных концентрациях исходного материала (количество фаговых частиц/мл)
5*105 5*104 5*103 5*102
Выделение РНК методом фенол-хлороформной экстракции 36.06±0.87 39.10±0.93 45.09±1.33 46.62±1.53
Выделение РНК с ЛПААГ 35.27±0.82 39.45±0.95 43.39±0.89 46.16±1.08
Выделение РНК набором для выделения «RNA-Ss» Никаких достоверных результатов получено не было

На рисунке показаны графики зависимости накопления флуоресценции от цикла амплификации для внутреннего контрольного образца при титровании в 10 раз при использовании комплекта реагентов с ЛПААГ.

Из полученных данных видно, что с помощью сравнения значений пороговых циклов при выделении РНК различными методами можно сделать вывод, что наиболее предпочтительными методами являются выделение РНК методом фенол - хлороформной экстракции и комплектом реагентов с ЛПААГ. Однако, метод выделение РНК методом фенол-хлороформной экстракции является достаточно трудоемким и тем самым неудобным для технологического применения. При выделении РНК набором для выделения «RNA-Ss» никаких достоверных результатов получено не было.

Как видно из предложенных примеров, обработка биологических материалов и их ПЦР-анализ позволяют быстро и надежно выявлять вирусо-и бактерионосительство не только у людей, в том числе клинически здоровых серонегативных лиц, но и проводить выделение возбудителей заболеваний в организмах-переносчиках (например в клещах).

Таким образом, применение подготовки биологических материалов предложенным способом позволяет ускорить время исследования без снижения чувствительности ПЦР теста. Чувствительность и специфичность ПЦР близки к предельно возможной, а результаты получают в течение одного дня. Данная обработка позволяет использовать для ПЦР практически любой материал: целых насекомых, гистологические препараты, сухие пятна крови и тканей, количество исследуемого материала во многих случаях составляет несколько микролитров.

Способ выделения нуклеиновых кислот с использованием изопропанола на этапе преципитации и осаждения ДНК, отличающийся тем, что при начальной обработке биологического материала используют гидрохлорид гуанидина и детергент в натрий-ацетатном буфере, а в качестве соосадителя нуклеиновых кислот применяют 0,05% линейный полиакриламид.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа. Способ выделения щелочной фосфатазы плацентарного типа путем гомогенизации ткани плаценты до однородной массы, экстракции трис-HCl буфером, содержащим бутанол, через сутки указанную смесь центрифугируют с диэтиловым эфиром, собирают водную фазу и далее проводят аффинную хроматографию щелочной фосфатазы плацентарного типа на иммобилизованном лектине бодяги речной, после чего промывают раствором NaCl, забуференным трис-HCl буфером, и элюируют связанную на колонке щелочную фосфатазу плацентарного типа раствором лактозы в боратном буфере при определенных условиях.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для диагностики степени тяжести пародонтита у больных бронхиальной астмой. Для чего определяют зрелые (EN-PO) и ранние (DPOH) нейтрофилы в слюне и смыве из полости рта пациентов, не принимающих и принимающих гормональные препараты.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования риска развития профессиональной бронхиальной астмы. Cущность способа прогнозирования риска развития профессиональной бронхиальной астмы состоит в том, что определяют наличие родственников с аллергической реакцией, наличие в анамнезе ринита, крапивницы либо другой аллергической реакции, бытовой, пищевой и лекарственной аллергической реакции, профессиональной вредности, при этом дополнительно определяют концентрацию общего IgE в сыворотке крови, в качестве профессиональной вредности определяют «симптомы элиминации», «экспозиционный тест», «эффект реэкспозиции» каждый признак оценивают в баллах.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ дифференциальной диагностики у детей гломерулярного и тубулоинтерстициального заболеваний почек нетоксической природы и ассоциированных с токсическим действием Cd, Pb, Cr и фенола, характеризующийся тем, что при содержании указанных веществ в крови выше референтного значения осуществляют генетическое исследование, при наличии полиморфизма генов CYPOX, RCYT 450, SULTA1 проводят ультразвуковое исследование, при установлении обеднения кровотока в подкапсульной зоне почек, отклонений показателей спектрограммы импульсно-волнового допплера и повышения эхогенности паренхимы почек, осуществляют дополнительные исследования, и при отклонении относительно физиологической возрастной нормы 65% или более из следующих показателей: содержание ОАС, Cu/Zn-СОД, ГлПО; повышение уровня каталазы, гидроперекисей липидов, МДА; и снижении абсолютного фагоцитоза и фагоцитарного числа диагностируют заболевание, ассоциированное с токсическим действием, а при отсутствии таких отклонений - заболевание нетоксической природы.

Изобретение относится к медицине и предназначено для уточнения стадии фиброза печени в клинико-лабораторных условиях. В качестве определяемых белковых продуктов используют цитокины CXCL11/ITAC, TNFα и CCL20/MIP-3α.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования тяжести течения гломерулонефрита. Сущность способа состоит в том, что больному с гломерулонефритом проводят иммуноферментный анализ сыворотки крови на содержание тиреотропного гормона (ТТГ).

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для бесконтактного манипулирования, концентрирования и сортировки бактериальных клеток E.coli и/или диамагнитных микрочастиц в микрофлюидных системах.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу исследования реакции организма человека при трансфузии эритромассы путем анализа кислорода в крови. Сущность способа состоит в том, что предварительно определяют артериовенозные разницы содержания по кислороду до и после трансфузии эритромассы с получением коэффициента Р.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода, включающий выделение внеклеточной ДНК из образца крови беременной женщины, приготовление геномных библиотек и их обогащение регионами генома, секвенирование, картирование полученных чтений на референсный геном, корректировку полученного значения покрытия для каждого региона генома на общее покрытие генома, сравнение скорректированного значения покрытия со значениями покрытий, полученных для обучающей выборки и определение наличия анеуплоидий плода.

Изобретение относится к областям биологии и генетической инженерии. Предложен выделенный пептид для терапевтических целей, содержащий последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную SEQ ID NO:4 (GG00444), или его фрагмент или вариант, способные связываться со слизью кишечника человека, а также содержащая его ворсинчатая структура, пищевой продукт, фармацевтическая композиция, полинуклеотид, экспрессионный вектор, клетка-хозяин, кластер генов, антитело, способ лечения и способ скрининга пробиотических бактериальных штаммов.
Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для диагностики постнагрузочного бронхоспазма у больных бронхиальной астмой (БА). Диагностику проводят у больных БА легкой и средней степени тяжести во внеприступный период. Определяют пиковую объемную скорость форсированного выдоха в процентах от должной величины (ПОС, в %) с помощью спирографии. Определяют уровень насыщения крови кислородом (SaO2, в %) посредством транскутанной пульсоксиметрии. Определяют фракцию изгнания левого желудочка сердца (ФИ, в %) и толщину межжелудочковой перегородки в диастолу (МЖПд, см) с помощью метода эхокардиографии. Определяют процентное содержания эозинофилов в периферической крови (Эоз, в %) с помощью гематологического анализатора (в клиническом анализе крови). Рассчитывают дискриминантную функцию (D) по формуле. Граничное значение D равно 90,40. При D, равной или больше граничного значения, диагностируется отсутствие синдрома постнагрузочного бронхоспазма. При D меньше граничного значения диагностируется наличие синдрома постнагрузочного бронхоспазма. Способ позволяет точно провести диагностику синдрома постнагрузочного бронхоспазма за счет использования результатов наиболее значимых методов обследования больных БА. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологическим методам экспериментального моделирования процессов, протекающих в полости рта человека, в частности образования зубного камня. Для этого предложен способ моделирования процесса образования зубного камня из аналога раствора слюны человека, основанный на синтезе зубного камня в искусственно созданной модельной среде, при котором готовят модельную среду указанного состава: NaCl - 9,00 ммоль/л, K2CO3 - 5,00 ммоль/л, (NH4)2HPO4 - 5,60 ммоль/л, NH4Cl - 29,49 ммоль/л, NH4F - 0,01 ммоль/л, KCl - 25,00 ммоль/л, CaCl2·H2O - 6,90 ммоль/л, MgCl2·6H2O - 3,00 ммоль/л. Синтез проводят при значении pH=6,95±0,05 и температуре 37.0±0.5°C, при этом через 60 дней образуется фаза в виде брушита, а через 90 дней из модельной системы образуется гидроксилапатит, который является основным компонентом зубных камней человека. Изобретение позволяет обнаружить предрасположенность к заболеванию и выработать профилактические меры для предотвращения роста зубного камня. 5 ил., 2 табл.,1 пр.

Настоящее изобретение относится к области биоаналитических исследований и представляет собой способ анализа цитохрома С в интактных митохондриях с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), включающий подготовку митохондрий и их нанесение на подложку на основе диэлектрического химически инертного материала с наноструктурированным покрытием толщиной 1-10 мкм в виде кольцевых наноструктур серебра, при этом ободки серебряных колец состоят из сообщающихся друг с другом пористых агрегатов серебра, на поверхности которых расположены округлые наночастицы серебра размером 2-90 нм, с последующей иммобилизацией митохондрий на данные наноструктурированные покрытия, детектирование спектров ГКР с последующей расшифровкой характеристических колебаний анализируемой пробы спектров ГКР с использованием стандартного программного обеспечения. Осуществление изобретения позволяет расширить область применимости ГКР и проводить исследования в интактных функционирующих митохондриях. 11 з.п. ф-лы, 4 пр., 1 ил.

Настоящее изобретение относится к области биоаналитических исследований и представляет собой способ анализа цитохрома С в интактных митохондриях с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), включающий подготовку митохондрий и их нанесение на подложку на основе диэлектрического химически инертного материала с наноструктурированным покрытием толщиной 1-10 мкм в виде кольцевых наноструктур серебра, при этом ободки серебряных колец состоят из сообщающихся друг с другом пористых агрегатов серебра, на поверхности которых расположены округлые наночастицы серебра размером 2-90 нм, с последующей иммобилизацией митохондрий на данные наноструктурированные покрытия, детектирование спектров ГКР с последующей расшифровкой характеристических колебаний анализируемой пробы спектров ГКР с использованием стандартного программного обеспечения. Осуществление изобретения позволяет расширить область применимости ГКР и проводить исследования в интактных функционирующих митохондриях. 11 з.п. ф-лы, 4 пр., 1 ил.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования течения рассеянного склероза (PC) путем исследования крови, отличающийся тем, что из крови, взятой из вены, выделяют лейкоцитарную взвесь, затем из лейкоцитарной взвеси выделяют ДНК и методом ПЦР в режиме реального времени определяют наличие или отсутствие патологических аллелей в полиморфных вариантах генов rs1800629 (TNFα) и rs6074022 (CD40), причем при выявлении аллеля G полиморфного локуса rs1800629 (TNFα) и аллеля С полиморфного локуса rs6074022 (CD40) прогнозируют повышенную среднюю скорость прогрессирования рассеянного склероза. Осуществление изобретения позволяет повысить точность прогнозирования, что способствует выбору соответствующей стратегии лечения. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования метастазов в печени при раке прямой кишки. Сущность способа состоит в том, что после радикального оперативного вмешательства в объеме гемиколэктомии в ткани злокачественной опухоли у больных раком прямой кишки определяют уровень активной формы васкулоэндотелиального фактора роста А (VEGF-A) и растворимого рецептора васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF-R), вычисляют их соотношение. При значениях, превышающих показатель в интактной ткани слизистой прямой кишки в 18 и более раз, прогнозируют метастатическое поражение печени в ближайшие 3,5 месяца. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность прогнозирования метастазов в печени при раке прямой кишки. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для лечение бесплодия у женщин с миомой матки. Для этого определяют уровень аутоантител к ХГЧ в сыворотке крови и при их значениях от +11% до +20% и от -21% до -30% назначают профилактическое лечение, при их значениях выше +20% и ниже -30% назначают хирургическое лечение. Способ позволяет выбрать оптимальную тактику лечения бесплодия у женщин с миомой матки при его безопасности и низкой затратности. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к детской хирургии. Для прогнозирования течения язвенно-некротического энтероколита у новорожденных определяют характеристику лейкоцитарной формулы (X1), как: регенераторный сдвиг - 1, нормопения - 2, лейкопения - 3; оценивают наличие или отсутствие признаков поражения дыхательной системы (Х2), как: пневмония - 1, гипоплазия легких - 2, кистозные поражения легких - 3, синдром дыхательных расстройств - 4, сочетанные пороки и заболевания легких - 5, нет признаков поражения дыхательной системы - 6; сывороточный уровень (нг/мл) матричной металлопротеиназы 2 типа (X3); концентрацию кальпротектина (мкг/г) в кале (X4); сывороточный уровень (нг/мл) ингибитора матричных металлопротеиназ 9 типа (X5); значение шкалы оценки тяжести полиорганных нарушений SOFA в баллах (X6). Прогнозируют течение язвенно-некротического энтероколита у новорожденного по формуле: d=-7,148+X1*(0,915)+X2*-0,292+X3*0,005+X4*0,002+X5*0,001+X6*0,201, где X1,2,3,4,5,6 - числовые значения параметров пациента, и при значении d от 0 до -1,258 - прогноз благоприятный, а при d от 0 до 2,124 - высокая вероятность летального исхода. Способ позволяет с высокой точностью прогнозировать течение язвенно-некротического энтероколита у новорожденных, за счет использования корреляционно-регрессионного анализа. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для лечения цервикальных неоплазий II-III степени, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией. Для этого на 1-м этапе лечения в случае выявления анаэробного дисбиоза вводят нео-пенотран по 1 суппозиторию 1 раз в день 7 дней или нео-пенотран форте L по 1 суппозиторию 1 раз в день 7 дней. При выявлении Atopobium vaginae вводят макмирор-комплекс по 1 свече 2 раза в день 7 дней. При аэробном дисбиозе вводят тержинан по 1 вагинальной таблетке 1 раз в день 7 дней. На 2-м этапе проводят коррекцию местного иммунитета путем воздействия на шейку матки кавитированным низкочастотным ультразвуком раствором гексапептида имунофана 5,0, разведенным в 50 мл физиологического раствора, 1 раз в день в течение 5 дней. На 3-м этапе восстанавливают pH среды путем введения фемилекса 2 раза в день в течение 6 дней. На 4-м этапе проводят деструкцию: при цервикальной интраэпителиальной неоплазии II степени - электроэксцизию, при цервикальной интраэпителиальной неоплазии III - электроконизацию. Способ обеспечивает профилактику рака шейки матки, снижение рецидивирования и осложнений при лечении предраковой патологии шейки матки высокой степени в результате проведения патогенетически обоснованной комплексной терапии. 2 табл.

Изобретение относится к медицине и предназначено для дифференциальной диагностики асцитно-инфильтративной формы рака яичников и абдоминального туберкулеза. В асцитической жидкости определяют уровень маркера НЕ4, при его значении 244,1±22,7 пМоль/л диагностируют асцитно-инфильтративную форму рака яичников, а при значении 43,5±4,8 пМоль/л диагностируют абдоминальный туберкулез. Способ позволяет улучшить результаты дифференциальной диагностики рака яичников асцитно-инфильтративной формы и абдоминального туберкулеза. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине. Изобретение раскрывает способ выделения нуклеиновых кислот с использованием изопропанола на этапе преципитации и осаждения ДНК, отличающийся тем, что при начальной обработке биологического материала используют гидрохлорид гуанидина и детергент в натрий-ацетатном буфере, а в качестве соосадителя нуклеиновых кислот применяют 0,05 линейный полиакриламид. Выделенная данным способом нуклеиновая кислота может быть использована при постановке полимеразной цепной реакции, также в практической медицине и ветеринарии для диагностики наследственных заболеваний человека и животных, судебной медицине, генной дактилоскопии, диагностике возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных, в том числе заболеваний передающихся половым путем. Преимуществом способа является упрощение выделения НК из крови и тканей человека и животных, что весьма актуально при проведении массовых анализов различных образцов в процессе диагностики инфекционных заболеваний. Использование в изобретении линейного полиакриламида ЛПАА в качестве соосадителя позволяет повысить выход НК из образца. 1 ил., 3 табл., 4 пр.

Наверх