Катионный тетрапептид phe-d-arg-phe-lys-nh2 как ингибитор митохондриальной синтазы оксида азота

Изобретение относится к медицине и касается применения катионного тетрапептида Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота. Изобретение обеспечивает лучшую по сравнению со средством-прототипом (унитиол) выживаемость подопытных животных при нарушениях мозгового кровообращения, более позднее наступление судорог и существенное увеличение продолжительности жизни подопытных животных в условиях гиперкапнической гипоксии. 3 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, касается средства, ингибирующего митохондриальную синтазу оксида азота и ограничивающего дезинтеграцию митохондрий.

В настоящее время сформировались взгляды в отношении функционального дуализма свободных радикалов, прежде всего кислорода, в процессах повреждения клетки и регуляции метаболических процессов. Известно, что активные формы кислорода являются универсальными повреждающими агентами как при непосредственном окислении биосубстратов, так и вследствие изменения редокс-статуса системы. Свободные радикалы кислорода могут также выступать в качестве естественных метаболитов клетки, оказывающих позитивное действие на многие метаболические процессы посредством прежде всего тиолдисульфидных конформаций биологически активных молекул. В этой связи для достижения протективного эффекта принципиальное значение имеет направленное воздействие на короткоживущие свободные радикалы, в особенности на гидроксильный радикал, обладающий наибольшей окислительной способностью. Образование гидроксильного радикала в организме возможно при протекании следующих биохимических процессов: реакции Фентона, реализация которой осуществляется в присутствии металлов переменной валентности, а также протекающей в кислой среде реакции декомпозиции пероксинитрита, обладающего высокой пенетрантной способностью. Именно пероксинитрит вследствие его физико-химических свойств может рассматриваться в качестве наиболее опасного повреждающего агента, продукция которого может стать объектом фармакологической регуляции. Образование предшественника пероксинитрита - оксида азота (NO) катализируется синтазой оксида азота при определенных условиях насыщения энзима тетрагидробиоптерином.

Ингибиторы синтазы оксида азота различаются по своей специфичности в отношении различных изоформ фермента: индуцибельной (iNOS) и двух конституитивных форм - эндотелиальной (eNOS) и нейрональной (nNOS). В настоящее время описано большое количество соединений, обладающих способностью угнетать активность энзима посредством воздействия на его синтазный домен. Ингибиторы оксидазного центра фермента, активные in vitro, оказались весьма токсичными, в связи с чем не рассматривались. Вместе с тем описаны свойства митохондриальной синтазы оксида азота (mtNOS). Подобно конституитивным изоформам она также является кальцийзависимой [1]. Продуцируемый ею оксид азота угнетает клеточное дыхание при связывании с цитохром С оксидазой и может конъюгировать с супероксидным анион-радикалом, образующимся при утечке электронов с комплексов дыхательной цепи, с образованием пероксинитрита (ONOO-). Расположенные в матриксе митохондрий ферменты цикла Кребса являются поставщиками протонов в межмембранное пространство через комплексы I, III и IV дыхательной цепи, необходимых для инициации декомпозиции пероксинитрита с образованием гидроксильного радикала. В этой связи ингибирование mtNOS может стать тем решающим фактором, который позволит повысить эффективность реакций дыхательной цепи и предотвратить дезинтеграцию митохондрий с последующей индукцией апоптоза [2].

Проблема ингибирования mtNOS связана с наличием мембранных барьеров, которые не могут преодолеть известные ингибиторы фермента. Соединения, избирательно ингибирующие митохондриальную изоформу NOS, в настоящее время не известны.

При решении задачи направленной доставки фармакологических средств в митохондрии определенный интерес представляют соединения на основе трифенилфосфониевого катиона (иона Скулачева), включающие фрагменты витамина Ε (mitoE), изученные и описанные В.П. Скулачевым [3]. Однако данных об использовании трифенилфосфония и других катионных фрагментов для транспорта в митохондрии ингибиторов синтазы оксида азота при анализе доступной информации не выявлено. Нет данных и о том, что ион Скулачева может найти применение при создании ингибиторов митохондриальной изоформы синтазы оксида азота и что для векторной доставки фармакофорного фрагмента в митохондрии могут быть использованы катионные ионы другой структуры.

Известно также, что снижение концентрации оксида азота и пероксинитрита посредством связывания в нитрозотиолы возможно за счет использования тиольного соединения (унитиола), являющегося субстратным антиоксидантом, которое наиболее близко по технической сущности к заявленному изобретению и выбрано в качестве прототипа.

Однако тиолы не находят широкого практического применения при терапии ряда заболеваний и неотложных состояний, так как обладают рядом существенных недостатков:

- большинство тиолов не способны проникать в митохондрии в восстановленном состоянии;

- при передозировке тиолы изменяют окислительно-восстановительные градиенты и нарушают синтез макроэргов;

- связывание оксида азота с тиолами обратимо, пул оксида азота может мобилизоваться при определенных условиях при взаимодействии с восстановителями.

Указанные негативные свойства средства-прототипа определили необходимость изыскания соединений, направленно снижающих активность митохондриальной синтазы оксида азота.

Целью изобретения явилось изыскание средства, ингибирующего митохондриальную синтазу оксида азота и ограничивающего дезинтеграцию митохондрий.

Указанная цель достигается применением в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота катионного тетрапептида Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (SS-20).

Катионный тетрапептид SS-20 синтезировали в химической лаборатории с применением коммерчески доступных аминокислот по общепринятой методике. Идентификацию синтезированного катионного тетрапептида и степень его очистки определяли хроматографически.

Заявляемое средство было впервые синтезировано в 2005 г. с целью применения в качестве антиоксиданта [4]. Сведения об изучении и использовании катионного тетрапептида SS-20 в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота в доступной информации отсутствуют.

Возможность достижения цели изобретения подтверждается следующими примерами. Достоверность различий средних значений контролируемых показателей в группах оценивали по t-критерию Стьюдента.

Пример 1. Исследование влияния средства-прототипа и заявляемого средства на активность синтазы оксида азота в митохондриях и их набухание

Критериями влияния средства-прототипа и заявляемого средства на активность синтазы оксида азота в митохондриях служили снижение продукции нитритов (продукт окисления оксида азота кислородом) и степень набухания митохондрий.

Для получения митохондрий методом градиентного центрифугирования использовали гомогенат головного мозга подопытных животных - белых беспородных крыс-самцов массой 180-220 г. Выделение фракции, обогащенной митохондриями, осуществляли последовательным центрифугированием по схеме, приведенной Г.Н. Крыжановским, при помощи холодовой утрацентрифуги [5]. Полученную суспензию митохондрий разводили охлажденным раствором Хенкса с аргинином, помещали в пробирки, термостатировали при температуре 37°С и насыщали кислородом посредством барботирования через капилляр. Стимуляцию активности митохондриальной синтазы оксида азота осуществляли внесением в среду хлорида кальция в конечной концентрации 0,16 мкМ. После внесения индуцирующего агента в среду вносили средство-прототип (унитиол) или заявляемое средство (катионный тетрапептид SS-20). Контролем служили пробы, в которые вносили раствор Хенкса. Через 1 час после инкубации в реакции с реактивом Грисса-Илосвая регистрировали количество нитрит-иона. Степень набухания митохондрий оценивали нефелометрически с учетом того, что снижение степени рассеивания света суспензией косвенно характеризует степень набухания митохондрий.

Результаты экспериментов, приведенные в таблице 1, доказывают существенные преимущества заявляемого средства перед средством-прототипом. Применение средства-прототипа (унитиол) способствует снижению на 30% количества нитритов, но при этом не оказывает существенного влияния на процессы набухания митохондрий, что доказывает низкую вероятность его проникновения в матрикс. В то же время заявляемое средство (катионный тетрапептид SS-20) существенно (на 26%) ограничивает продукцию нитритов и почти в 2 раза уменьшает скорость набухания митохондрий по сравнению со средством-прототипом.

Таким образом экспериментально установлено эффективное влияние заявляемого средства на активность синтазы оксида азота в митохондриях. Результаты опытов in vitro доказывают наличие у заявляемого средства свойств ингибитора синтазы оксида азота, так как иных источников нитритов в среду не вносили.

Пример 2. Исследование влияния средства-прототипа и заявляемого средства на выживаемость крыс и активность синтазы оксида азота после эспериментального инсульта

В ходе эксперимента проводили гистохимическое определение активности синтазы оксида азота в нейронах после поэтапной перевязки сонных артерий и терапии с применением средства-прототипа или заявляемого средства (ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота).

Для моделирования острого ишемического инсульта у подопытных животных (белых беспородных крыс-самцов массой 180-220 г) применяли методику двухстадийной перевязки общей сонной артерии с реперфузией [6]. Вначале подопытным животным выполняли одностороннюю перевязку сосуда, а через 30 сут после этого проводили вторую операцию, состоящую в том, что общую сонную артерию на контралатеральной стороне пережимали на 10 мин и, сняв лигатуру, восстанавливали нарушенный кровоток. Затем рану ушивали и проводили введение средства-прототипа или заявляемого средства в течение 3 сут. Выживших животных подвергали аутопсийному исследованию. Применяемые в эксперименте средства вводили внутрибрюшинно, причем средство-прототип вводили в дозе 50 мг/кг, а заявляемое средство - в дозе 1 мг/кг.

Гистохимическое определение активности синтазы оксида азота в пирамидных нейроцитах сенсомоторной коры проводили в соответствии с методикой [7], предусматривающей оценку НАДФН2-диафоразной активности фермента путем обработки исследуемого препарата растворами солей тетразолия в присутствии НАДФН2 после выдержки препарата в течение 10 мин в 4% водном растворе нейтрального формалина и проведение комплекса гистохимических реакций, включающего дополнительно оценку сопряжения функционирования каталитических центров фермента в ходе НСТ-теста путем окрашивания препарата в течение 30 мин в 0,2% растворе нитросинего тетразолия в забуференном физиологическом растворе (рН 7,4) и выявления нитритов путем выдержки препарата в свежеприготовленном реактиве Грисса-Илосвая в течение 30 мин при температуре 37°С. Активность синтазы оксида азота определяли фотометрически по содержанию в клетках препарата продуктов цитохимических реакций на нитриты и диформазан.

Как показали результаты эксперимента, приведенные в таблице 2, заявляемое средство действительно проявляет свойства ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота. Выживаемость крыс с нарушениями мозгового кровообращения была выше в 2 раза, а вероятность неферментативного окисления биосубстратов снижалась более чем на 30% по сравнению с соответствующими показателями средства-прототипа.

Пример 3. Исследование антигипоксического действия средства-прототипа и заявляемого средства

Антигипоксическое действие средства-прототипа и заявляемого средства исследовали на модели гиперкапнической гипоксии (гипоксии в гермообъеме).

Эксперименты выполнены на белых нелинейных мышах-самцах массой 18-22 г. В эксперименте формировали три группы животных по 6 особей в каждой: контрольную и две опытные.

Животным контрольной группы за 10 мин до воздействия вводили изотонический раствор. Животным первой опытной группы вводили средство-прототип (унитиол) в дозе 50 мг/кг, а животным второй опытной группы - заявляемое средство (катионный тетра-пептид SS-20) в дозе 1 мг/кг. Применяемые в ходе эксперимента средства вводили внутрибрюшинно.

Критериями устойчивости к гипоксии, развивающейся под воздействием применяемых средств, служили время начала судорог и продолжительность жизни подопытных животных.

Результаты исследований представлены в таблице 3, из которой видно, что под воздействием средства-прототипа судороги начинаются практически в то же время, что и в контрольной группе.

В случае же использования заявляемого средства по сравнению со средством-прототипом развивается большая устойчивость к гипоксии: судороги наступают через 19,6±1,08 мин, то есть почти в 1,5 раз позже, а продолжительность жизни подопытных животных составляет 31,9±9,45 мин, то есть в 1,7 раз превышает аналогичный показатель унитиола.

Таким образом, экспериментально доказано, что применение заявляемого средства позволяет обеспечить ингибирование активности митохондриальной синтазы оксида азота и ограничение дезинтеграции митохондрий при острых повреждениях гипоксической природы, что подтверждает достижение цели изобретения.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна», так как впервые предложено использовать известное антиоксидантное средство - катионный тетрапептид Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 - в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота, ограничивающего дезинтеграцию митохондрий.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень», так как на основании доступной информации возможность применения известного антиоксидантного средства, а именно катионного тетрапептида Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2, в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота, способного ограничить дезинтеграцию митохондрий, не представляется очевидной.

Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для применения» подтверждается результатами исследований, показавшими, что заявляемое средство действительно проявляет свойства ингибитора синтазы оксида азота, значимо ограничивает продукцию нитритов и снижает степень набухания митохондрий, обеспечивает лучшую по сравнению с унитиолом выживаемость подопытных животных при нарушениях мозгового кровообращения, а также способствует более позднему наступлению судорог и существенному увеличению продолжительности жизни подопытных животных в условиях гиперкапнической гипоксии.

Список литературы

1. Ghafourifar P. Mitochondrial nitric oxide synthase / P. Ghafourifar, C.K. Sen // Front Biosci. - 2007. - Vol. 12. - P. 1072-1078.

2. Haynes V. Mitochondrial nitric-oxide synthase: role in pathophysiology / V. Haynes, S.L. Elfering, R.J. Squires, N. Traaseth, J. Solien, A. Ettl, C. Giulivi // IUDMB Life. - 2003. - Vol. 55, №10-11. - P. 599-603.

3. RU 2318500 C2, 10.03.2008.

4. RU 2376028 C2, 20.12.2009.

5. Крыжановский Г.Н. Общая патофизиология нервной системы: Руководство. - М.: Медицина, 1997. - 351 с.

6. Чепур C.B. Особенности экспериментального моделирования соматических и неврологических заболеваний для оценки эффективности лекарственных препаратов / С.В. Чепур, В.Н. Быков, М.А. Юдин, А.С. Никифоров, И.В. Фатеев, А.А. Арутюнян / Биомедицина. - 2012. - Т. 1, №1. - С. 16-28.

7. RU 2202110 C1, 10.04.2003.

Катионный тетрапептид Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 как ингибитор митохондриальной синтазы оксида азота

Применение катионного тетрапептида Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к кристаллической форме меглюмина 6-карбокси-2-(3,5-дихлорфенил)-бензоксазола, где указанная кристаллическая форма имеет порошковую рентгенограмму, содержащую пики при углах дифракции (2θ) 10,7±0,2, 11,8±0,2, 13,3±0,2, 14,8±0,2, 17,9±0,2, 21,4±0,2 и 21,7±0,2.

Предложена пероральная композиция для лечения заболеваний и/или расстройств, которые можно лечить при помощи S-аденозил-L-метионина. Композиция содержит S-аденозил-L-метионин («SAM-е» или «SAMe») и один или более сложных эфиров галловой кислоты, выбранных из этилгаллата, изоамилгаллата, пропилгаллата и октилгаллата, причем соотношение (масса:масса) сложного эфира галловой кислоты к S-аденозилметионину составляет от 1:1 до 1:80.

Изобретение относится к медицине, а именно к спортивной медицине, и может быть использовано для восстановления спортсменов в период интенсивных физических нагрузок.

Изобретение относится к ветеринарии и предназначено для лечения и профилактики дисбиозов животных. Способ включает приготовление препарата путем смешивания изъятой цитрированной крови убойного животного крупного рогатого скота с молочной сывороткой, сквашенной при 37°C чистыми культурами в дозе Lactobacillus plantarum 2×109 КОЕ, Lactobacillus fermentum 2×109 КОЕ и Bifidobacterium bifidum 5×108 КОЕ.

Изобретение относится к новым производным транс-2-деценовой кислоты, представленным формулой (1′), или к их фармацевтически приемлемым солям, в которой значения для групп Y′, W′ определены в формуле изобретения.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и реконструктивно-пластической хирургии. Выполняют подкожную мастэктомию и лимфаденэктомию с одномоментной реконструкцией силиконовым имплантатом.

Изобретение относится к способу получения средства из корней астрагала перепончатого, обладающего адаптогенным действием. Указанный способ характеризуется тем, что проводят ультразвуковую экстракцию измельченного растительного материала 55-65% этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент 1:(8-10) в течение 20-30 мин, далее растительный материал экстрагируют дважды тем же экстрагентом в соотношении сырье:экстрагент 1:(18-20) при температуре 85-90°С в течение 80-100 мин, затем спиртовые извлечения объединяют и концентрируют, сгущенный экстракт высушивают и измельчают.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматокосметологии. Способ волюмизации мягких тканей лица и/или шеи, включающий забор венозной крови в объеме 9-36 мл, затем кровь центрифугируют с ускорением равным 1000G в течение 5 минут, затем из пробирки забирают 3,0 мл полученной ТАП шприцами с системой замка luer-lock.

Изобретение относится к медицине и предназначено для лечения синдрома раздраженного кишечника у субъекта с возрастом 63 года и старше. Вводят рифаксимин в дозе 550 мг три раза в день.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению антиапоптозных фрагментов белка DAXX, и может быть использовано в медицине для лечения острого инфаркта миокарда (AMI), церебрального инфаркта, при трансплантации органов, операциях на сердце, острых нарушениях кровообращения, реперфузионных повреждениях и ишемии.
Изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается фармацевтической композиции, содержащей пептид, выбранный из группы pGLU-ASN-TRP-LYS-C8, pGLU-ASN-TRP-TRP и pGLU-ASN-TRP для местного применения для уменьшения интенсивности симптомов кожного нарушения у субъекта, где кожное нарушение выбрано из группы, состоящей из вирусной инфекции герпеса, вирусной инфекции ветряной оспы, сыпи, укусов насекомых, укусов медуз, ожогов, псориаза, зуда, кожной аллергической реакции, поражений кожи, вызванных побочными эффектами или осложнениями после применения лекарственного средства или терапевтического лечения, где симптомы выбраны из группы, состоящей из покраснения кожи, отека, зуда, покалывания, ощущения жжения, сыпи, водянки, очагов поражения, волдырей и псориатического шелушения, где непосредственно лечение боли исключено.

Изобретение относится к применению соединений на основе тетрапептидных и трипептидных групп и соответствующих пептоидных групп при лечении или профилактике ракового заболевания у человека, которое характеризуется повышенным уровнем экспрессии или активности Gadd45β по сравнению с обычными здоровыми клетками, в случае зависимости жизнеспособности и/или роста раковых клеток от NF-κB.
Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается терапевтического или профилактического средства, стимулирующего миграцию клеток ткани слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, содержащего пептид с аминокислотной последовательностью Ser-Ser-Ser-Arg или его фармацевтически приемлемую соль.

Изобретение относится к пептидам, включающим фикоцианобилин (PCB), и медицинскому применению указанных пептидов и PCB, благодаря идентифицированному у них нейропротекторному и/или нейрорегенеративному действию.

Изобретение относится к соединениям, обладающим повышенной активностью, направленной на модуляцию активности NMDA-рецептора, и их применению для лечения заболеваний и расстройств, таких как нарушение способности к обучению, когнитивные расстройства и аналгезия, а в частности, для ослабления и/или устранения невропатической боли.

Группа изобретений относится к области медицины и фармакологии и касается лекарственного средства пептидной природы для лечения гиперхолестеринемии и процессов тромбообразования.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новым тетрапептидам, представляющим собой Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-Arg-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Lys)-Lys-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(D-Lys)-(D-Arg)-Arg-amide; Acetyl-Lys-(NMe-Lys)-Arg-Arg-amide; Acetyl-Lys-Lys-(NMe-Arg)-Arg-amide; Acetyl-(D-Lys)-(D-Lys)-(D-Arg)-(D-Arg)-amide; Acetyl-(D-Arg)-(D-Arg)-(D-Lys)-(D-Lys)-amide, которые обладают церебропротекторной и антиамнестической активностью.
Группа изобретений относится к медицине и касается применения тетрапептида Pro-Gly-Pro-Val в качестве средства профилактики или лечения нарушений липидного обмена; способа профилактики или лечения нарушений липидного обмена, включающего интраназальное применение лекарственного средства, содержащего тетрапептид Pro-Gly-Pro-Val в эффективном количестве; фармацевтической композиции для профилактики или лечения нарушений липидного обмена, включающей пептид Pro-Gly-Pro-Val с гипохолестерин- и триглицеридемическим действием в качестве активного вещества и вспомогательное вещество в качестве консерванта.

Изобретение относится к новым биологически активным производным 1-(1-адамантил)этиламина (ремантадина), представляющим собой адамантил-пептиды, обладающие противовирусным действием.

Изобретение относится к лигандам в форме синтетических пептидных амидов каппа-опиатного рецептора и особенно к агонистам каппа-опиатного рецептора, которые демонстрируют низкую степень ингибирования P450 CYP и низкую степень проникновения в мозг.

Изобретение относится к пептидному соединению Ra-R1-R2-R3-R4-Rb (I) или Ra-R4-R3-R2-R1-Rb (II), где Ra представляет собой N-концевую первичную аминную группу аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную аминозащитной группой, Rb представляет собой гидроксильную группу С-концевой карбоксильной группы аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную гидроксизащитной группой, и R1-R2-R3-R4 или R4-R3-R2-R1 представляют собой HADD, KADD, DDAK, RADD, DDAR, KAED, DEAK, RAED, DEAR, HADE, EDAH, KADE, EDAK, RADE, EDAR, HAEE, EEAH, KAEE, EEAK, RAEE и EEAR. Настоящее изобретение также относится к применению указанных полезных пептидных соединений, в частности, для связывания с β-амилоидными пептидами и ингибирования полимеризации их в виде амилоидных бляшек. Соединения могут быть использованы в качестве лекарственного средства или для подготовки или определения препаратов с целью лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера. 7 н. и 14 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине и касается применения катионного тетрапептида Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота. Изобретение обеспечивает лучшую по сравнению со средством-прототипом выживаемость подопытных животных при нарушениях мозгового кровообращения, более позднее наступление судорог и существенное увеличение продолжительности жизни подопытных животных в условиях гиперкапнической гипоксии. 3 табл., 3 пр.

Наверх