Хелперный пептид ракового антигена

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой пептид, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученных из белка WT1, и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II. Такая аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 3; аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 4; аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 5. Изобретение касается также экспрессирующего вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий пептид, антитела против пептида, фармацевтической композиции, содержащей пептид, способа лечения рака путем введения пептида субъекту. Изобретение позволяет получить эффективное средство для индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток связыванием с молекулой МНС класса II и использовать его для лечения рака. 14 н. и 3 з.п. ф-лы, 18 ил., 9 табл., 5 пр.

 

2420-180885RU/015

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к хелперному пептиду WT1, полинуклеотиду, кодирующему этот пептид, WT1-специфическим хелперным Т-клеткам, индуцируемым этим пептидом, фармацевтической композиции для лечения/предупреждения рака, содержащей их, и т.п. Данная заявка заявляет приоритет в отношении Японской патентной заявки № 2009-105286, поданной 23 апреля 2009 года, причем описание Японской патентной заявки № 2009-105286 включено здесь посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ген WT1 (ген опухоли Вильмса 1) является геном, идентифицированным в качестве этиологического фактора опухоли Вильмса, которая является раком почки у детей (непатентные документы 1 и 2), и представляет собой фактор транскрипции, имеющий структуру “цинковых пальцев”. Сначала этот ген WT1 считали геном-супрессором рака. Однако, последующее исследование показало, что вышеуказанный ген служит скорее в качестве ракового гена в опухолях гемопоэтических органов и солидных раковых опухолях (непатентные документы 3-6).

Поскольку ген WT1 высоко экспрессируется во многих злокачественных опухолях, продукт гена WT1, который является аутобелком, не имеющим мутации, проверяли на наличие или отсутствие иммуногенности in vivo. В результате, было показано, что белок, полученный из этого гена WT1, экспрессируемый в высокой степени в опухолевых клетках, фрагментируется внутриклеточным процессингом, и полученный пептид образует комплекс с молекулой МНС класса I, который экспонируется (представляется) на поверхности клетки, и что цитотоксические Т-клетки (далее называемые здесь CTL), узнающие такой комплекс, могут индуцироваться вакцинацией пептидом WT1 (непатентные документы 7-9). Было также показано, что мыши, иммунизированные пептидом WT1 или кДНК WT1, отторгают имплантируемые WT1-ген-экспрессирующие опухолевые клетки в высокой степени (непатентные документы 7 и 10), но нормальные ткани, эндогенно экспрессирующие ген WT1, не повреждаются индуцированными CTL. До этого, предполагали с большой уверенностью, что можно индуцировать WT1-специфическиие CTL не только в мышах, но также и в человеке, и что такие CTL имеют цитотоксическую активность против опухолевых клеток, экспрессирующих в высокой степени ген WT1, но не имеют цитотоксической активности против нормальных клеток, эндогенно экспрессирующих этот ген WT1 (непатентные документы 7 и 10-14).

С другой стороны, сообщалось, что присутствие хелперных Т-клеток, специфических в отношении ракового антигена, является важным для эффективной индукции CTL (непатентный документ 15). Эти хелперные Т-клетки (CD-4-положительные Т-клетки) индуцируются, пролиферируют и активируются узнаванием комплекса молекулы МНС класса II с антигенным пептидом на антигенпрезентирующих клетках. Активированные хелперные Т-клетки продуцируют цитокины, такие как IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, или интерферон (IFN) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других субпопуляций Т-клеток. Таким образом, считается, что связывание антигенного пептида с молекулой МНС класса II эффективно активирует CTL и другие клетки посредством индукции хелперных Т-клеток и усиливает иммунную функцию (непатентный документ 16). До этого сообщалось только связывание антигенного пептида с HLA-DRB1*0401 и HLA-DRB1*0405 молекулы МНС класса II в отношении WT1 (непатентный документ 17 и патентный документ 1), и необходимо было найти антигенные пептиды для других подтипов.

ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Непатентные документы

Патентный документ 1: International Publication № WO 2005/045027

Непатентные документы:

Непатентный документ 1: Daniel A. Harber et al., Cell. 1990 Jun 29; 61(7): 1257-69.

Непатентный документ 2: Call K.M. et al., Cell. 1990 Feb 9; 60(3): 509-20.

Непатентный документ 3: Menke A.L., Int Rev. Cetol. 1998; 181: 151-212. Review.

Непатентный документ 4: Yamagami T. Et al., Blood. 1996 Apr 1: 87(7): 2878-84.

Непатентный документ 5: Inoue K. et al., Blood. 1998 Apr 15; 91(8): 2969-76.

Непатентный документ 6: Tsuboi A. et al., Leuk Res. 1999 May; 23(5): 499-505.

Непатентный документ 7: Oka Y. et al., J. Immunol. 2000 Feb 15; 164(4): 1873-80.

Непатентный документ 8: Melief C.J. et al., Immunol. Rev. 1995 Jun; 145: 167-77.

Непатентный документ 9: Ritz J, J. Clin. Oncol. 1994 Feb; 12(2): 237-8.

Непатентный документ 10: Tsuboi A. Et al., J. Clin. Immunol. 2000 May; 20(3): 195-202.

Непатентный документ 11: Oka Y. et al., J. Immunogenetics. 2000 Feb; 51(2): 99-107.

Непатентный документ 12: Ohminami H. et al., Blood. 2000 Jan 1; 95(1): 286-93.

Непатентный документ 13: Gao L. et al., Blood. 2000 Apr 1; 95(7): 2198-203.

Непатентный документ 14: Ohminami H. et al., Blood. 2000 Jan 1; 95(1): 286-93.

Непатентный документ 15: Cancer. Res. 62: 6438, 2002.

Непатентный документ 16: J. Immunol. Immunother., 24: 195, 2001.

Непатентный документ 17: Cancer. Immunol. Immunother. 51: 271, 2002.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, ПОДЛЕЖАЩИЕ РЕШЕНИЮ ЭТИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Таким образом, целью, которая должна быть достигнута данным изобретением, является обеспечение пептида, индуцирующего WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с различными молекулами МНС класса II, полинуклеотида, кодирующего этот пептид, WT1-хелперных Т-клеток, индуцируемых этим пептидом, и фармацевтической композиции для лечение/предупреждения рака, содержащей их.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ЭТИХ ПРОБЛЕМ

Авторы этого изобретения провели интенсивные исследования для достижения этой цели. В результате, они обнаружили, что пептид, имеющий часть последовательности смежных аминокислот, представляющей белок WT1, функционирует в качестве ракового антигенного хелперного пептида, другими словами, этот пептид экспонируется (представляется) на антигенпрезентирующих клетках связыванием с молекулой МНС класса II и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки, и показали, что этот пептид может быть использован в фармацевтической композиции для лечения/предупреждения рака.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает:

(1) Пептид, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученную из белка WT1, и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II, где эта аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

(а) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:3;

(b) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:4;

(с) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:5, и

(d) аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот являются замещенными, делетированными или добавленными в аминокислотных последовательностях, изображенных в (а)-(с);

(2) Пептид по (1), где этой аминокислотной последовательностью является аминокислотная последовательность, изображенная в SEQ ID NO:3;

(3) Пептид по (1) или (2), где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102;

(4) Пептид по (1) или (2), где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202 и DQB1* 0601;

(5) Полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из (1)-(4);

(6) Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по (5);

(7) Антитело против пептида по любому из (1)-(4) или полинуклеотид по (5);

(8) Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака, содержащая пептид по любому из (1)-(4), полинуклеотид по (5) или вектор по (6);

(9) Способ лечения или предупреждения рака, который предусматривает введение эффективного количества пептида по любому из (1)-(4), полинуклеотида по (5) или вектора по (6) субъекту, имеющему молекулу МНС класса II по (3) или (4);

(10) Применение пептида по любому из (1)-(4), полинуклеотида по (5) или вектора по (6) для лечения или предупреждения рака;

(11) Антигенпрезентирующие клетки, которые экспонируют (представляют) пептид по любому из (1)-(4) посредством молекулы МНС класса II по (3) или (4);

(12) Способ индукции антигенпрезентирующих клеток, который предусматривает культивирование незрелых антигенпрезентирующих клеток в присутствии пептида по любому из (1)-(4) и индукцию антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) этот пептид посредством молекулы МНС класса II по (3) или (4), из незрелых антигенпрезентирующих клеток;

(13) WT1-специфические хелперные Т-клетки, которые индуцируются пептидом по любому из (1)-(4);

(14) Способ индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, который предусматривает культивирование мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии пептида по любому из (1)-(4) и индукцию WT1-специфических хелперных Т-клеток из этих мононуклеарных клеток периферической крови;

(15) Набор для индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, содержащий, в качестве существенного ингредиента, пептид по любому из (1)-(4);

(16) Набор для предупреждения или лечения рака, содержащий, в качестве существенного ингредиента, пептид по любому из (1)-(4), полинуклеотид по (5) или вектор по (6);

(17) Способ определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем молекулу МНС класса II по (3) или (4), причем указанный способ предусматривает стадии:

(а) реакции пептида по любому из (1)-(4) с пробой, полученной из этого субъекта; и затем

(b) определения присутствия или количества цитокина, содержащегося в этой пробе.

ЭФФЕКТЫ ЭТОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно данному изобретению, можно получать хелперные пептиды WT1, которые связываются со многими типами молекул МНС класса II, такими как DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102, фармацевтическую композицию для лечения/предупреждения рака, включающую в себя их и т.п. Таким образом, становится возможной индукция WT1-специфических хелперных Т-клеток in vivo и in vitro в различных субъектах (в частности, большинство японцев имеют вышеуказанные молекулы). Поскольку WT1-специфические хелперные Т-клетки индуцируются данным изобретением, можно также эффективно активировать Т-клетки и В-клетки в раке, экспрессирующем WT1 в высокой степени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток после стимуляции каждой пептид-специфической Т-клеточной линии, которую получали обработкой в импульсном режиме каждым из трех пептидов (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄), с каждым пептидом. На этом рисунке, символ “-“ показывает отсутствие стимуляции пептидом.

Фиг.2 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток после стимуляции каждой пептид-специфической Т-клеточной линии, которую получали обработкой в импульсном режиме тремя пептидами (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄), с каждым соответствующим пептидом в присутствии анти-МНС класса I или II-антитела. На этом рисунке, символ “-“ показывает отсутствие стимуляции пептидом. Символ “имп/мин” в ординате показывает количество импульсов в минуту.

Фиг.3 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток каждой WT1-пептид-специфической Т-клеточной линии в ответ на клетки С1498, клетки С1498, обработанные в импульсном режиме тремя пептидами (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄), а также клетки С1498, имеющие усиленную экспрессию белка WT1. Символ “имп/мин” в ординате показывает количество импульсов в минуту.

Фиг.4 показывает результаты, полученные измерением IFN-γ-продуцирующей способности в каждой пептид-специфической Т-клеточной линии, полученной обработкой в импульсном режиме тремя пептидами (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄).

Фиг.5 показывает результаты, полученные измерением CTL-цитотоксической активности трех пептидов (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄). ● показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием клеток RMAS, обработанные в импульсном режиме пептидом WT1₁₂₆ (рестриктированным МНС класса I пептидом). ○ показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием контрольных клеток RMAS.

Фиг.6 показывает схематическое изображение временного ряда при проведении имплантации опухоли и иммунизации в эксперименте с имплантацией опухоли. Иммунизацию хелперным пептидом mWT1₃₅ проводили в 7-й, 14-й и 21-й дни после подкожной имплантации WT1-экспрессирующих лейкозных клеток мышам и вскрытие проводили в 29-й день. Направленные вниз белые стрелки показывают временные точки, в которых внутрикожно вводили контроль (ЗФР) (IFA/30 мкл). Направленные вниз черные стрелки показывают временные точки, в которых внутрикожно вводили хелперный пептид mWT1₃₅ (50 мкМ/IFA/30 мкл).

Фиг.7 показывает размеры опухолей в мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT1₃₅, и долю не имеющих заболевания популяций мышей. В мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT1₃₅, 4 из 10 мышей не имели заболевания. С другой стороны, в мышах, иммунизированных контролем, в 9 мышах не было мышей без заболевания.

Фиг.8 показывает коэффициент выживаемости без заболевания в мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT1₃₅.

Фиг.9 показывает цитотоксическую активность CTL в мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT1₃₅. ● показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом mWT1₁₂₆ (пептидом МНС I). ○ показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием контрольных клеток RMAS. Число в скобках обозначает размер опухоли (мм).

Фиг.10 показывает цитотоксическую активность mWT1-специфических CTL в контрольных мышах. ● показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом mWT1₁₂₆ (пептидом МНС I). ○ показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием контрольных клеток RMAS. Число в скобках обозначает размер опухоли (мм).

Фиг.11 показывает цитотоксическую активность mWT1₁₂₆ специфических CTL (слева) и долю WT1₁₂₆ тетрамер-положительных Т-клеток (справа) при введении пептида WT1₃₅.

Фиг.12 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток посредством стимуляции пептидом WT1₃₅, в мононуклеарных клетках периферической крови каждого здорового субъекта, имеющего молекулы МНС класса I.

Фиг.13 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного здорового субъекта (здорового субъекта А)] Стимулятором [PBMC, полученными из DRB1* 0405/0901-, DPB1* 0201/0501- и DQB1* 0303/0401-положительного субъекта (здорового субъекта В)]. Ордината показывает количество включенного ³Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).

Фиг.14 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного здорового субъекта (здорового субъекта А)] Стимулятором [PBMC, полученными из DRB1* 0405/0803-, DPB1* 0202/0501- и DQB1* 0401/0601-положительного субъекта (здорового субъекта G)]. Ордината показывает количество включенного ³Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).

Фиг.15 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного здорового субъекта (здорового субъекта А)] Стимулятором [PBMC, полученными из DRB1* 0101/0803-, DPB1* 0501/- и DQB1* 0501/0601-положительного субъекта (здорового субъекта Н)]. Ордината показывает количество включенного ³Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).

Фиг.16 показывает результаты, полученные измерением IFN-γ-продуцирующей способности при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0405/0803-, DPB1* 0202/0501- и DQB1* 0401/0601-положительного здорового субъекта (здорового субъекта G)] Стимулятором [l-клетки, содержащие включенный ген DQB1* 0601]. Ордината показывает долю количества IFN-γ в Т-клетках. Абсцисса показывает присутствие или отсутствие IFN-γ (+ или -) импульса с пептидом WT1_35.

Фиг.17 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 1502/1502-, DPB1* 0201/0901- и DQB1* 0601/0601-положительного здорового субъекта (здорового субъекта D)] Стимулятором [PBMC, полученными из того же самого здорового субъекта, что и в случае респондера). Ордината показывает количество включенного ³Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).

Фиг.18 показывает результаты, полученные измерением IFN-γ-продуцирующей способности при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/1501-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0501/0602-положительного здорового субъекта (здорового субъекта I)] Стимулятором [PBMC, полученными из того же самого здорового субъекта, что и в случае респондера). Ордината показывает долю количества IFN-γ в Т-клетках. Абсцисса показывает присутствие или отсутствие IFN-γ (+ или -) импульса с пептидом WT1_35.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте, данное изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот, полученных из белка WT1 мыши или человека. Ген WT1 экспрессируется в высокой степени, например, в опухолях гемопоэтических органов, таких как лейкоз; миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома; солидных раках, таких как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника. Таким образом, пептид данного изобретения присутствует в раковых клетках, экспрессирующих в большом количестве ген WT1.

Пептид данного изобретения является пептидом, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученных из белка WT1 человека, изображенную в SEQ ID NO:2, сохраняет способность связываться с молекулами МНС класса II, как показано ниже, и имеет способность индуцировать WT1-специфические хелперные Т-клетки. Не существует конкретного ограничения в отношении этой аминокислотной последовательности и длины пептида данного изобретения, пока этот пептид имеет вышеуказанные признаки. Однако слишком длинный пептид чувствителен к действию протеаз, а слишком короткий пептид не может связываться с пептидом, приспособленным к углублению бороздки. Длина пептида данного изобретения равна предпочтительно 10-25 аминокислотам, более предпочтительно 15-21 аминокислотам, еще более предпочтительно 16-20 аминокислотам, например, 17 аминокислотам, 18 аминокислотам или 19 аминокислотам. Конкретными примерами пептида данного изобретения являются пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:3; аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:4, и аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:5.

Пептид данного изобретения включает в себя также варианты вышеупомянутых пептидов. Эти варианты могут содержать, например, пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая имеет замену, делецию или добавление нескольких аминокислот, например, 1-9, предпочтительно 1-5, 1-4, 1-3, более предпочтительно 1-2 аминокислот, еще более предпочтительно одной аминокислоты в одной из указанных выше аминокислотных последовательностей. Замена аминокислот в пептидах может проводиться в любых положениях и любыми типами аминокислот. Предпочтительными являются консервативные аминокислотные замены. Например, остаток Glu может быть заменен остатком Asp, остаток Phe остатком Tyr, остаток Leu остатком Ile, остаток Ala остатком Ser, остаток His остатком Arg. Добавление или делеция аминокислот может проводиться предпочтительно на N-конце и С-конце в пептидах, но может проводиться во внутренней последовательности. Предпочтительный конкретный пример пептида данного изобретения имеет последовательность SEQ ID NO:3. В этой связи, все вышеуказанные пептиды должны сохранять способность связываться с молекулой МНС класса II и быть способными индуцировать WT1-специфические хелперные Т-клетки.

В этой связи, молекула МНС класса II, с которой связывается пептид данного изобретения, может принадлежать к любому подклассу HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. Предпочтительно, молекула МНС класса II является молекулой, выбранной из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102. Более предпочтительно, молекулой МНС класса II является DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1403, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0601 или DRB5* 0102 и наиболее предпочтительно DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202 или DQB1* 0601. В данном описании, пептид, который сохраняет способность индуцировать WT1-специфические хелперные Т-клетки, называют хелперным пептидом WT1. В описанных ниже примерах, пептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:3, называют также пептидом WT1₃₅, хелперным пептидом WT1₃₅ или пептидом WT1₃₅.

Пептид данного изобретения может быть также пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученную из белка WT1 мыши, изображенную в SEQ ID NO:1, и вышеуказанная аминокислотная последовательность может быть пептидом (SEQ ID NO:6), в котором аминокислотный остаток в положении 9 в аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:4, заменен лейцином; или пептидом (SEQ ID NO:7), в котором аминокислотный остаток в положении 11 в аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:5, заменен серином. Кроме того, пептид данного изобретения может содержать пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая имеет замену, делецию или добавление нескольких аминокислот, например, 1-9, предпочтительно 1-5, 1-4, 1-3, более предпочтительно 1-2 аминокислот, еще более предпочтительно одной аминокислоты в аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7. В описанных ниже примерах, пептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:6, называют также пептидом WT1₈₆ или хелперным пептидом WT1₈₆, и пептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:7, пептидом WT1₂₉₄, хелперным пептидом WT1₂₉₄.

Пептид данного изобретения может быть произведен из белка WT1 и может состоять из вышеуказанной последовательности смежных аминокислот или содержать эту последовательность. Таким образом, пептид данного изобретения может быть, например, пептидом, состоящим из самой вышеуказанной аминокислотной последовательности, или белком WT1, содержащим вышеуказанную аминокислотную последовательность или ее часть. Пептид данного изобретения может быть также пептидом, полученным модификацией вышеуказанной аминокислотной последовательности. Аминокислотные остатки в вышеуказанной аминокислотной последовательности могут быть модифицированы известным способом. Такой модификацией может быть например, эстерификация, алкилирование, галогенирование, фосфорилирование, сульфирование, амидирование и т.п. на функциональной группе в боковой цепи аминокислотного остатка, входящего в состав пептида. Можно также связывать различные вещества с N-концом и/или С-концом пептида, содержащего вышеуказанную аминокислотную последовательность. Например, с этим пептидом могут быть связаны аминокислота, пептид, его аналог и т.п. В случае, если эти вещества связаны с пептидом данного изобретения, они могут быть обработаны, например, ферментом in vivo и т.п., или с использованием такого способа, как внутриклеточный процессинг, таким образом, что, в конечном счете, генерируют пептид, состоящий из вышеуказанной аминокислотной последовательности, которая представлена на поверхности клетки в виде комплекса с молекулой МНС класса II, являющийся посредством этого способным к генерированию эффекта индукции хелперных Т-клеток. Эти вещества могут быть веществами, регулирующими растворимость пептида этого изобретения, веществами, улучшающими стабильность этого пептида, например, устойчивость к протеазам, веществами, делающими возможной специфическую доставку пептида данного изобретения, например, к конкретной ткани или конкретному органу, или веществами, имеющими усиливающее действие на эффективность поглощения антигенпрезентирующих клеток или другое действие. Эти вещества могут быть также веществами, увеличивающими способность индукции CTL, например, хелперными пептидами, другими, чем пептид данного изобретения.

Модификация пептида данного изобретения может быть модификацией аминогруппы на N-концевой аминокислоте или карбоксильной группы на С-концевой аминокислоте этого пептида. Модифицирующие группы аминокислотной группы на N-концевой аминокислоте включают в себя, например, одну-три алкильные группы, имеющие 1-6 атомов углерода, фенильные группы, циклоалкильные группы и ацильные группы. Конкретные примеры ацильной группы включают в себя алканоильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, алканоильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, замещенную фенильной группой, карбонильную группу, замещенную циклоалкильной группой, имеющей 5-7 атомов углерода, алкилсульфонильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, фенилсульфонильную группу, алкоксикарбонильную группу, имеющую 2-6 атомов углерода, алкоксикарбонильную группу, замещенную фенильной группой, карбонильную группу, замещенную циклоалкоксигруппой, имеющей 5-7 атомов углерода, феноксикарбонильную группу и т.п. Пептиды, имеющие модификацию карбоксильной группы на С-концевой аминокислоте, включают в себя, например, эстерифицированные и амидированные пептиды. Конкретные примеры этого сложного эфира включают в себя сложный алкиловый эфир, имеющий 1-6 атомов углерода, сложный алкиловый эфир, имеющий 0-6 атомов углерода, замещенный фенильной группой, сложный циклоалкиловый эфир, имеющий 5-7 атомов углерода и т.п., и конкретные примеры амида включают в себя амид, амид, замещенный одной или двумя алкильными группами, имеющими 1-6 атомов углерода, амид, замещенный одной или двумя алкильными группами, имеющими 0-6 атомов углерода, замещенными фенильной группой, амид, образующий 5-, 7-членный азоциклоалкан, включающий в себя атом азота амидной группы, и т.п.

Модификация пептида данного изобретения может проводиться также связыванием аминокислотных остатков друг с другом через связь, другую чем пептидная связь, такую как связь углерод-углерод и связь углерод-сера. Кроме того, пептид данного изобретения может содержать одну или несколько D-аминокислот.

Вышеупомянутые пептиды, вариантные пептиды и модифицированные пептиды согласно данному изобретению являются только иллюстративными, и специалисты с квалификацией в данной области могут легко допустить, получить, оценить и использовать другие вариации вышеуказанных пептидов.

Пептид данного изобретения может быть синтезирован с использованием способа, рутинно используемого в данной области или его модифицированного способа. Такой способ синтеза описан, например, в Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol.2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Development of Medicines (continuation), Vol.14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Co., 1991 и т.п. Пептид данного изобретения может быть получен с использованием способа генетической инженерии на основе информации нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид данного изобретения. Такой способ генетической инженерии хорошо известен квалифицированным в данной области специалистам. Такой способ может проводиться в соответствии со способом, описанным в литературе [Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983); DNA Cloning, DM. Glover. IRL PRESS (1985)], как описано выше, или способом, описанным ниже, и другими способами.

Можно определить, связывается ли пептид данного изобретения или его кандидатный пептид с вышеуказанной молекулой МНС класса II и индуцирует ли хелперные Т-клетки, известным способом, например, таким как способ, описанный в Cancer Immunol. Immunother. 51:271 (2002), или способ, описанный в примерах данного описания, и другими способами.

Поскольку пептид данного изобретения активирует хелперные Т-клетки (CD4-положительные Т-клетки), этот пептид индуцирует и поддерживает дифференцировку CTL и проявляет действие активации эффекторных клеток, таких как макрофаги. Таким образом, можно использовать пептид данного изобретения для эффективного лечения или предупреждения рака.

В другом аспекте, данное изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему вышеуказанный хелперный пептид WT1 (далее называемый здесь полинуклеотидом WT1). Полинуклеотид данного изобретения может быть ДНК или РНК. Последовательность оснований полинуклеотида данного изобретения может быть определена на основе аминокислотной последовательности вышеуказанного хелперного пептида WT1. Этот полинуклеотид может быть получен, например, способом синтеза ДНК или РНК, ПЦР-способом и т.п.

Полинуклеотид данного изобретения включает в себя полинуклеотид, который гибридизуется с комплементарной последовательностью полинуклеотида, кодирующего пептид данного изобретения, при строгих условиях и кодирует пептид, имеющий активность, сравнимую с активностью пептида данного изобретения. Что касается термина “гибридизуются при строгих условиях”, используемая здесь гибридизация может проводиться в соответствии с общепринятым способом, описанным, например, в Molecular Cloning, 2^nd edition, Sambrook, J., Frisch, E.F., Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и т.п. Термин “строгие условия” включает в себя, например, условия, в которых гибрид образуется в растворе, содержащем 6×SSC (10×SSC является раствором, содержащим 1,5 М NaCl и 0,15 М тринатрийцитрат) и 50% формамид, при 45°С и затем промывают 2×SSC при 50°С (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6) и т.п.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему вышеуказанный полинуклеотид (далее называемому здесь также экспрессирующим вектором WT1). Тип экспрессирующих векторов, других последовательностей, содержащихся, наряду с вышеуказанной полинуклеотидной последовательностью, и т.п. может быть выбран должным образом в зависимости от типа хозяев, в которые вводят эти экспрессирующие векторы, от цели этого введения и т.п. Примеры этого экспрессирующего вектора включают в себя плазмиды, фаговые векторы, вирусные векторы и т.п. В случае, когда хозяином являются клетки Escherichia coli, примеры этого вектора включают в себя плазмидные векторы, такие как pUC118, pUC119, pBR322 и pCR3, а также фаговые векторы, такие как λZAPII и λgt11. В случае, когда хозяином являются дрожжевые клетки, примеры этого вектора включают в себя pYES2, pYEUra3 и т.п. В случае, когда хозяином являются клетки насекомых, примером этого вектора является pAcSGHisNT-A и т.п. В случае, когда хозяином являются клетки животного, примеры этого вектора включают в себя плазмидные векторы, такие как pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV и pRc/CMV, вирусные векторы, такие как ретровирусный вектор, аденовирусный вектор и аденоассоциированный вирусный вектор. Этот вектор может необязательно содержать такие факторы, как индуцируемый экспрессией промотор, ген, кодирующий сигнальную последовательность, маркерный ген для отбора и терминатор. Для легкого выделения и легкой очистки к этому вектору могут быть добавлены последовательность, экспрессируемая в виде слитого белка с тиоредоксином, His-метка, GST (глутатион-S-трансфераза) и т.п. В этом случае, можно использовать GST-слитый белковый вектор (pGEX4T и другие), имеющий подходящий промотор (lac, tac, trc, trp, CMV, ранний промотор SV40 и т.д.), функциональный в клетках-хозяевах, вектор (pcDNA3.1/Myc-His, и т.д.), имеющий последовательность-метку, такую как Myc и His, а также вектор (pET32a), экспрессирующий слитый белок с тиоредоксином и His-метку, и т.п.

При введении экспрессирующего вектора данного изобретения субъекту для получения хелперного пептида WT1 in vivo, WT1-специфические хелперные Т-клетки, индуцированные этим пептидом, продуцируют различные цитокины (например, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 или интерферон (IFN), и т.д.) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других Т-клеток. Таким образом, опухолевые клетки, которые имеют молекулу МНС класса II и экспрессируют в высокой степени WT1, могут повреждаться специфически с использованием этого экспрессирующего вектора WT1 данного изобретения.

В другом аспекте, данное изобретение относится к антителу против вышеуказанного хелперного пептида WT1 или полинуклеотида, кодирующего этот пептид (далее называемому здесь антителом WT1). Антитело данного изобретения может быть либо поликлональным антителом, либо моноклональным антителом. Способ получения такого антитела уже известен, и антитело данного изобретения может быть получено также в соответствии с таким общепринятым способом (Current protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., (ed.), 1987, John Wiley and Sons (pub.), Section 11.12-11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H.D. et al., (ed.), Cold Spring Harber Laboratory Press (pub.), New York, 1989).

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или предупреждения рака, содержащей вышеуказанный хелперный пептид WT1, полинуклеотид WT1 или экспрессирующий вектор WT1. Ген WT1 экспрессируется в высокой степени, например, в опухолях гемопоэтических органов, таких как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома, а также солидных раках, таких как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника, и, следовательно, эту фармацевтическую композицию данного изобретения можно использовать для лечения или предупреждения рака, экспрессирующего ген WT1. При введении фармацевтической композиции данного изобретения субъекту, имеющему молекулу МНС класса II, WT1-специфические хелперные Т-клетки, индуцируемые хелперным пептидом WT1, содержащимся в этой фармацевтической композиции, продуцируют различные цитокины (например, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 или интерферон (IFN), и т.д.) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других субпопуляций Т-клеток. Таким образом, опухолевые клетки, которые имеют молекулу МНС класса I и экспрессируют в высокой степени WT1, могут специфически повреждаться с использованием пептида данного изобретения.

Фармацевтическая композиция данного изобретения может содержать, например, носитель, эксципиент и т.п., наряду с вышеуказанным хелперным пептидом WT1, полинуклеотидом WT1 или экспрессирующим вектором WT1, в качестве эффективного компонента. Хелперный пептид WT1, содержащийся в фармацевтической композиции данного изобретения, индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки, и, следовательно, фармацевтическая композиция данного изобретения может содержать подходящий адъювант или может вводиться с подходящим адъювантом для усиления эффективности индукции. Примеры предпочтительного адъюванта включают в себя, но не ограничиваются ими, полный или неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия и т.п. Фармацевтическая композиция данного изобретения может также содержать известный антигенный пептид рака, другой, чем вышеуказанный хелперный пептид WT1, например, пептид WT1₁₂₆, индуцирующий WT1-специфические CTL, в качестве эффективного компонента (Oka et al., “Cancer immunotherapy targeting Wilms' tumor gene WT1 product”, Journal of Immunology, 164:1873-1880, 2000; и Oka et al., “Human cytotoxic T-lymphocyte responses specific for peptides of the wild-type Wilms' tumor gene (WT1) product”, Immunogenetics, 51: 99-107, 2000).

Кроме того, фармацевтическая композиция данного изобретения может вводиться в комбинации с известным раковым антигенным пептидом. Например, известный раковый антигенный пептид, например, пептид WT1₁₂₆, может вводиться до или после введения фармацевтической композиции данного изобретения. Фармацевтическая композиция данного изобретения имеет признак, который активирует В-клетки или другие Т-клетки индуцированием WT1-специфических хелперных Т-клеток, и, следовательно, можно дополнительно усиливать активность CTL, индуцированных введением известного ракового антигенного пептида, и значительно увеличивать терапевтические действия.

Способ введения фармацевтической композиции данного изобретения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от таких условий, как тип заболеваний, состояние субъектов и сайты нацеливания. Примеры способа введения включают в себя, но не ограничиваются ими, внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, внутривенное введение, трансназальное введение, пероральное введение и т.п. Способом введения может быть также терапия с использованием лимфоцитов или терапия с использованием DC (дендритных клеток). Количество пептида, содержащееся в фармацевтической композиции данного изобретения, форма и частота введения этой фармацевтической композиции и т.п. могут быть соответствующим образом выбрано в зависимости от таких условий, как тип заболеваний, состояние субъектов и сайты нацеливания. Обычно, количество пептида, вводимого на одну дозу, равно 0,0001-1000 мг и предпочтительно 0,001-10000 мг.

В другом аспекте, данное изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, который предусматривает введение эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции субъекту, имеющему вышеупомянутую молекулу МНС класса II. Подлежащими лечению карциномами могут быть любые карциномы, пока они экспрессируют ген WT1, и включают в себя, например, опухоли гемопоэтических органов, такие как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому и злокачественную лимфому, а также солидные типы раков, такие как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника.

В другом аспекте, данное изобретение относится к применению вышеуказанного хелперного пептида WT1, полинуклеотида WT1 или экспрессирующего вектора WT1 для лечения или предупреждения рака.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к применению хелперного пептида WT1 для получения фармацевтической композиции для лечения или предупреждения рака.

Еще в одном другом аспекте, данное изобретение относится к применению полинуклеотида WT1 или экспрессирующего вектора WT1 для получения фармацевтической композиции, содержащей вышеуказанные полинуклеотид WT1 или экспрессирующий вектор WT1.

В другом аспекте, данное изобретение относится к клеткам, включающим в себя вышеуказанные хелперный пептид WT1, полинуклеотид WT1 или экспрессирующий вектор WT1. Эти клетки данного изобретения могут быть получены, например, трансформацией клеток-хозяев, таких как клетки Escherichia coli, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки животных, с использованием вышеуказанного экспрессирующего вектора. Трансформация клеток-хозяев экспрессирующим вектором может проводиться с использованием различных способов, выбранных должным образом. Пептид данного изобретения может быть получен культивированием трансформированных клеток и извлечением и очисткой продуцируемого ими хелперного пептида WT1.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к антигенпрезентирующим клеткам (например, дендритным клеткам, В-лимфоцитам, макрофагам и т.д.), которые экспонируют (представляют) вышеописанный хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II. Антигенпрезентирующие клетки данного изобретения индуцируются вышеуказанным хелперным пептидом WT1. WT1-специфические хелперные Т-клетки эффективно индуцируются с использованием антигенпрезентирующих клеток данного изобретения.

Еще в одном другом аспекте, данное изобретение относится к способу индуцирования антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II, причем этот способ предусматривает культивирование незрелых антигенпрезентирующих клеток в присутствии хелперного пептида WT1 и индуцирование антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) вышеописанный хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II, из этих незрелых антигенпрезентирующих клеток. В данном описании, незрелыми антигенпрезентирующими клетками называют клетки, которые могут стать антигенпрезентирующими клетками, такие как, например, дендритные клетки, В-лимфоциты и макрофаги, после созревания. Субъекты, из которых получают незрелые антигенпрезентирующие клетки, могут быть любыми субъектами, пока они имеют молекулу МНС класса II. Поскольку незрелые антигенпрезентирующие клетки содержатся, например, в мононуклеарных клетках периферической крови и т.п., такие клетки можно культивировать в присутствии вышеописанного хелперного пептида WT1.

В другом аспекте, данное изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, предусматривающему введение антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством вышеописанной молекулы МНС класса II, субъекту, имеющему ту же самую молекулу, что и вышеописанная молекула МНС класса II. Способ введения антигенпрезентирующих клеток может быть соответствующим образом выбран в зависимости от таких условий, как тип заболеваний, состояние субъектов и сайты нацеливания. Примеры этого способа включают в себя, но не ограничиваются ими, внутривенное введение, внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, трансназальное введение, пероральное введение и т.п.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к способу предупреждения или лечения рака индукцией антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) вышеописанный хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II, причем этот способ предусматривает стадии:

(а) реакции пробы с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:2) белка WT1, или нуклеиновой кислотой, имеющей ее частичную последовательность, или вышеуказанным хелперным пептидом WT1;

(b) получения антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1, содержащийся в этой пробе, посредством вышеуказанной молекулы МНС класса II; и

(с) введения антигенпрезентирующих клеток субъекту, имеющему ту же самую молекулу, что и вышеуказанная молекула МНС класса II.

Пробами в вышеуказанном способе могут быть любые пробы, пока они имеют возможность содержания лимфоцитов или дендритных клеток и включают в себя, например, полученные из субъекта пробы, такие как кровь, растворы культуры клеток и т.п. Реакция в вышеуказанном способе может проводиться с использованием общепринятого способа и предпочтительно с использованием электропорации. Получение антигенпрезентирующих клеток может проводиться с использованием способа, известного квалифицированным в данной области специалистам. Условия культивирования клеток в пробе в каждой стадии могут быть определены соответствующим образом квалифицированными в данной области специалистами. Способ введения этих антигенпрезентирующих клеток может быть способом, описанным выше.

В следующем аспекте, данное изобретение относится к WT1-специфическим хелперным Т-клеткам, индуцированным вышеуказанным хелперным пептидом WT1. Хелперные Т-клетки данного изобретения индуцируются, пролиферируют и активируются при узнавании комплекса хелперного пептида WT1 с молекулой МНС класса II. Эти активированные WT1-специфические хелперные Т-клетки продуцируют цитокины, такие как IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, или интерферон (IFN) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других субпопуляций Т-клеток. Таким образом, опухолевые клетки, которые имеют молекулу МНС класса I и экспрессируют в высокой степени WT1, могут специфически повреждаться с использованием хелперных Т-клеток данного изобретения.

В другом аспекте, данное изобретение относится к способу индуцирования WT1-специфических хелперных Т-клеток, предусматривающему культивирование мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии хелперного пептида WT1 и индуцирование WT1-специфических хелперных Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови. Субъекты, из которых получают мононуклеарные клетки периферической крови, могут быть любыми субъектами, пока они имеют вышеуказанную молекулу МНС класса II. Культивированием мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии хелперного пептида WT1, WT1-специфические хелперные Т-клетки индуцируются из клеток-предшественников хелперных Т-клеток в мононуклеарных клетках периферической крови. Можно лечить или предупреждать опухоли гемопоэтических органов и солидные опухоли в субъекте введением WT1-специфических хелперных Т-клеток, полученных согласно данному изобретению, субъекту, имеющему вышеуказанную молекулу МНС класса II. В этой связи, мононуклеарные клети периферической крови в данном изобретении включают в себя незрелые антигенпрезентирующие клетки (например, клетки-предшественники дендритных клеток, В-лимфоциты, макрофаги и т.д.). Поскольку незрелые антигенпрезентирующие клетки содержатся, например, в мононуклеарных клетках периферической крови и т.п., такие клетки можно культивировать в присутствии вышеописанного хелперного пептида WT1.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к набору для индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, содержащему вышеописанный хелперный пептид WT1 в качестве существенного ингредиента. Предпочтительно, этот набор используют в вышеуказанном способе индуцирования WT1-специфических хелперных Т-клеток. Этот набор данного изобретения может содержать, например, средства для получения мононуклеарных клеток периферической крови, адъювант, реакционный сосуд и другие компоненты, наряду с вышеописанным хелперным пептидом WT1. Обычно, этот набор сопровождается инструкциями. WT1-специфические хелперные Т-клетки могут быть эффективно индуцированы с использованием набора этого изобретения.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, предусматривающему введение WT1-специфических хелперных Т-клеток субъекту, имеющему молекулу МНС класса II. Способ введения WT1-специфических хелперных Т-клеток может быть должным образом выбран в зависимости от таких условий, как тип заболеваний, состояние субъектов и сайты нацеливания. Примеры способа введения включают в себя, но не ограничиваются ими, внутривенное введение, внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, трансназальное введение, пероральное введение и т.п.

Кроме того, данное изобретение относится к набору для предупреждения или лечения рака, содержащему вышеописанный хелперный пептид WT1, полинуклеотид WT1 или экспрессирующий вектор WT1 в качестве существенного ингредиента. Этот набор является набором, характеризующимся индукцией антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством вышеописанной молекулы МНС класса II. Набор данного изобретения может также содержать, например, средства для получения проб, реакционный сосуд и другие компоненты, наряду с вышеописанным основным ингредиентом. Обычно, этот набор сопровождается инструкциями. Антигенпрезентирующие клетки, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством вышеописанной молекулы МНС класса II, могут быть эффективно получены с использованием этого набора данного изобретения и использованы для лечения или предупреждения рака посредством их введения.

В другом аспекте, данное изобретение относится к способу определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем вышеуказанную молекулу МНС класса II, предусматривающему стадии:

(а) реакции комплекса вышеуказанного хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II с пробой, полученной из этого субъекта; и затем

(b) определения присутствия или количества хелперных Т-клеток, узнающих комплекс, содержащийся в этой пробе.

Пробами, полученными из субъектов, могут быть любые пробы, пока они имеют возможность содержания лимфоцитов, и они включают в себя, например, биологические жидкости, такие как кровь, лимфатическая жидкость, ткани и т.п. Комплекс WT1-специфических хелперных Т-клеток с молекулой МНС класса II может находиться, например, в форме тетрамера, пентамера и т.п., например, с использованием способа, известного квалифицированным в данной области специалистам, такого как способ с использованием биотина-стрептавидина. Присутствие или количество хелперных Т-клеток, узнающих такой комплекс, может быть определено способом, известным квалифицированным в данной области специалистам. В этом аспекте данного изобретения вышеуказанный комплекс может быть меченым. В качестве метки, могут быть использованы известные метки, такие как флуоресцентная метка и радиоактивная метка. Посредством мечения присутствие или количество хелперных Т-клеток может быть просто и быстро определено. С использованием способа этого аспекта данного изобретения, становятся возможными диагностика и прогноз и т.п. рака.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает также композицию, содержащую комплекс хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II, для определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем вышеуказанную молекулу МНС класса II.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает набор, содержащий комплекс хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II, для определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем вышеуказанную молекулу МНС класса II.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к способу определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем вышеуказанную молекулу МНС класса II, предусматривающему стадии:

(а) реакции вышеуказанного хелперного пептида WT1 с пробой, полученной из этого субъекта; и

(b) определения присутствия или количества цитокина, содержащегося в этой пробе.

Пробами, полученными из субъектов могут быть любые пробы, пока они имеют возможность содержания лимфоцитов и включают в себя, например, мононуклеарные клетки периферической крови, кровь, биологические жидкости, ткани и другие, и предпочтительно мононуклеарные клетки периферической крови. Реакция в вышеуказанной стадии (а) может проводиться реакцией вышеуказанного хелперного пептида WT1 в вышеуказанной пробе, полученной из субъекта, с использованием общепринятого способа. Условия культивирования клеток в пробе в каждой стадии могут быть определены должным образом квалифицированными в данной области специалистами. Присутствие или количество цитокина, содержащегося в пробе, может быть измерено способом, известным квалифицированным в данной области специалистам. Этот цитокин может быть цитокином, способным индуцироваться хелперными Т-клетками, таким как интерферон-γ и интерлейкин-10. В этом аспекте данного изобретения, вышеуказанный цитокин может быть меченым. В качестве меток могут быть использованы известные метки, такие как флуоресцентная метка и радиоактивная метка. С использованием этого присутствия или количества вышеуказанного цитокина в качестве индикатора становится возможным простое и быстрое определение присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток.

В следующем аспекте, данное изобретение относится к способу получения WT1-специфических хелперных Т-клеток с использованием комплекса хелперного пептида WT1 с молекулой МНС класса II, предусматривающему стадии:

(а) реакции пробы с этим комплексом; и

(b) получения хелперных Т-клеток, которые содержатся в этой пробе и узнают этот комплекс.

Комплекс хелперного пептида WT1 с молекулой МНС класса II является таким, как комплекс, описанный выше. Пробами могут быть любые пробы, пока они имеют возможность содержания лимфоцитов и включают в себя, например, полученные из субъекта пробы, такие как кровь, растворы культуры ткани и т.п. Получение хелперных Т-клеток, узнающих этот комплекс, может проводиться, например, с использованием способа, известного квалифицированным в данной области специалистам, такого как FACS и MACS. Можно культивировать полученные WT1-специфические хелперные Т-клетки и использовать их для лечения и предупреждения различных раков.

Таким образом, данное изобретение относится также к WT1-специфическим хелперным Т-клеткам, которые могут быть получены способом получения WT1-специфических хелперных Т-клеток с использованием комплекса хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II.

Кроме того, данное изобретение относится к набору для получения WT1-специфических хелперных Т-клеток, содержащему комплекс хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к способу диагностики рака, который предусматривает использование вышеуказанных WT1-специфических хелперных Т-клеток, вышеуказанных антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II, или вышеуказанного антитела. Предпочтительно, для способа диагностики рака данного изобретения используют WT1-специфические хелперные Т-клетки. Например, вышеуказанные хелперные Т-клетки, антигенпрезентирующие клетки или антитело могут инкубироваться с пробой, полученной из субъекта, имеющего молекулу МНС класса II, или вводиться субъекту, имеющему молекулу МНС класса II, и затем, например, могут быть определены местоположение, участок, количество и т.п. этих хелперных Т-клеток, антигенпрезентирующих клеток или антитела для диагностики рака. Вышеуказанные хелперные Т-клетки, антигенпрезентирующие клетки или антитело могут быть мечеными. Посредством мечения, можно эффективно проводить способ диагностики рака данного изобретения.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к набору для диагностики рака, содержащему вышеуказанные WT1-специфические хелперные Т-клетки, антигенпрезентирующие клетки, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством вышеуказанной молекулы МНС класса II, или антитело против хелперного пептида WT1 или антитела против полинуклеотида, кодирующего этот пептид, в качестве существенного ингредиента.

Данное изобретение будет описано конкретно и описано подробно ниже при помощи примеров, но они не должны пониматься как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1

Отбор кандидатных пептидов WT1, связывающихся с молекулами МНС класса II

Для поиска пептидных последовательностей, которые связываются с молекулами МНС класса II, использовали способ показанный Rammensee et al. (Rammensee et al, Immunogenetics 41:178-228, 1995). Конкретно, отбор проводили с использованием программ, описанных в столбце правой стороны в таблицах вместе с законом Rammensee et al. Согласно этому способу, пептиды WT1₃₅ сужались до пептидных последовательностей, показанных в таблицах 1 и 2, пептиды WT1₈₆ до пептидных последовательностей, показанных в таблицах 3 и 4 и пептиды WT1₂₉₄ до пептидных последовательностей, показанных в таблицах 5 и 6. Столбец левой стороны в таблицах 1-6 обозначает “пригодность” в качестве кандидатной пептидной последовательности. Чем больше число “О”, тем выше пригодность в законе Rammensee et al. Отсутствие какой-либо метки показывает слабую пригодность. Группа аминокислот в скобках столбца “кандидатных пептидных последовательностей, связывающихся с молекулами МНС класса II”, в таблицах 1-6 показывает, что одна аминокислота может быть выбрана из группы аминокислот, перечисленных в этих скобках. Например, описание [FLM] означает одну аминокислоту, выбранную из группы аминокислот F, L и M. Описание [VYI(AL)] также означает одну аминокислоту, выбранную из группы аминокислот V, Y и I, или одну аминокислоту из группы аминокислот А и L. “x” показывает, что эта аминокислота может быть любой аминокислотой. Столбец правой стороны показывает “название программы” программ, используемых для списка кандидатных пептидных последовательностей.

Затем кандидатные пептиды WT1 визуально выбирали из таблиц 1-6, пептиды, показанные в следующей таблице 7, идентифицировали в качестве предпочтительных кандидатных пептидов для молекул МНС класса II и анализировали фактические функции этих пептидов, как описано ниже.

Таблица 7
Идентификация пептидных кандидатов для молекул МНС класса II мыши
WT135	WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:3)	18-мер	MW 1819,01
WT186	EQCLSAFTLHFSGQFTG (SEQ ID NO:6)	17-мер	MW 1944,01
WT1294	FRGIQDVRRVSGVAPTLVR (SEQ ID NO:7)	19-мер	MW 2126,48

Получение WT1-пептид-специфических клеточных линий и измерение способности пролиферации клеток

Сначала, вышеуказанные пептиды WT1 эмульгировали с неполным адъювантом Фрейнда (Montanide ISA 51) и мышей внутрикожно инокулировали каждым пептидом WT1 в количестве, соответствующем 100 мкг/мышь. Иммунизацию проводили 3 раза с интервалами периода одной недели, селезенку удаляли после недели 1 конечной иммунизации и получали клетки селезенки. Эти клетки селезенки стимулировали 3 раза с интервалами 10 дней с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме тем же самым пептидом WT1, который использовали для иммунизации каждой мыши, и облучали, в качестве стимулятора. Затем, проводили 4-ую стимуляцию с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом (пептидом WT1₃₅, WT1₈₆ или WT1₂₉₄), как показано в таблице 7, и облучали, в качестве стимулятора, и реакцию пролиферации в ответ на каждый стимулятор измеряли в эксперименте с ³Н-включением. Пептид OVA (овальбумин), не относящийся к пептидам WT1, использовали в качестве контроля. В результате, клетки селезенки мыши, иммунизированные пептидом WT1₃₅, пептидом WT1₈₆ или пептидом WT1₂₉₄, в каждом случае отвечали на стимулятор, действующий в импульсном режиме с пептидом WT1₃₅, пептидом WT1₈₆ или пептидом WT1₂₉₄, и пролиферировали (фиг.1А-1С).

Как описано выше, клетки селезенки стимулировали in vitro 3 раза с интервалами 10 дней с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом WT1 и облучали. При проведении затем 4-ой стимуляции с использованием клеток селезенок неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом, описанным выше, и облучали, в качестве стимулятора, и измеряли реакцию пролиферации, антитело МНС класса I (D^b-антитело) или антитело МНС класса II (A^b-антитело) добавляли к культуральному раствору и измеряли ³Н-включение. В результате, реакция пролиферации в ответ на стимулятор, подаваемый в импульсном режиме с каждым из пептида WT1₃₅, пептида WT1₈₆ и пептида WT1₂₉₄, подавлялась добавлением антитела МНС класса II (фиг.2А-2С).

Как описано выше, клетки селезенки стимулировали in vitro 3 раза с интервалами 10 дней с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом WT1 и облучали. Затем измеряли реакцию пролиферации по ³Н-включению с использованием облученных клеток С1498, не экспрессирующих белка WT1, клеток С1498, обработанных в импульсном режиме каждым из вышеуказанных пептидов WT1, или клеток С1498, экспрессирующих белок WT1 вследствие введения гена WT1, в качестве стимулятора. В результате, эта реакция пролиферации была получена в ответ на клетки С1498, обработанные в импульсном режиме тем же самым пептидом WT1, который использовали в иммунизации in vivo, и клетки С1498, экспрессирующие белок WT1 вследствие введения гена WT1 (фиг.3). Это выявило, что пептид WT1₃₅, пептид WT1₈₆ и пептид WT1₂₉₄ продуцировались внутриклеточным процессом эндогенного белка WT1 и экспонировались (представлялись) на молекуле МНС класса II. На основании вышеуказанных фактов, было показано, что эти три пептида WT1 являются рестриктированными относительно МНС класса II пептидами WT1.

Измерение IFN-γ-продуцирующей активности

Как описано выше, клетки селезенки стимулировали in vitro 3 раза с интервалами 10 дней с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом WT1 и облучали. Затем измеряли концентрацию IFN-γ и IL-4 в культуральном супернатанте с использованием набора ELISA (BIOSOURCE Immunoassay Kit, Invitrogen). В результате, клетки селезенки двух отдельных мышей отвечали на клетки селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом WT1 и облучали, и продуцировали интерферон-γ, но мало интерлейкина-4 (фиг.4). Это выявило, что эти три типа пептидов WT1 индуцируют Th1-тип WT1-специфических хелперных Т-клеток.

Пример 2

Измерение WT1-специфических цитотоксических Т-клеток (CTL)

Мышей иммунизировали 3 раза одним пептидом WT1₁₂₆ (MHC класса I), пептидом WT1₁₂₆ (MHC класса I) + пептидом WT1₃₅ (MHC класса II), пептидом WT1₁₂₆ (MHC класса I) + пептидом WTl₈₆ (MHC класса II) или пептидом WT1₁₂₆ MHC класса I) + пептидом WT1₂₉₄ (MHC класса II) и получали клетки селезенки этих мышей. Затем эти клетки селезенки стимулировали один раз in vitro с использованием пептида WT1₁₂₆ (MHC класса I) и на 6-ой день измеряли цитотоксическую активность с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом WT1₁₂₆ (MHC класса I), в качестве клетки-мишени. Клетки RMAS, не обработанные в импульсном режиме пептидом WT1₁₂₆ (MHC класса I), использовали в качестве контрольной клетки-мишени. В результате, клетки селезенки мыши, иммунизированные пептидом WT1₁₂₆ (MHC класса I) + хелперным пептидом WT1 (MHC класса II), индуцировали WT1-специфические цитотоксические Т-клетки более сильно в сравнении с клетками селезенки мыши, иммунизированными только WT1₁₂₆ (MHC класса I) (фиг. 5). Это демонстрировало, что эти три пептида (MHC класса II) являются WT1-специфическими хелперными пептидами.

Пример 3

Эксперимент с имплантацией опухоли

WT1-экспрессирующие лейкозные клетки С1498 подкожно имплантировали в мышей в соотношении 2,5×10⁵ клеток на мышь и 50 мкг/мышь хелперного пептида WT1₃₅ вводили внутрикожно вместе с неполным адъювантом Фрейнда один раз в неделю, всего 3 раза, контроля, вместо хелперного пептида WT1₃₅ вводили внутрикожно физиологический раствор вместе с неполным адъювантом Фрейнда. Размер подкожной опухоли измеряли во времени и коэффициент выживаемости с отсутствием заболевания рассчитывали до дня 29 после подкожной имплантации. В результате, эта опухоль разрасталась во всех мышах контрольной группы, тогда как пролиферация этой опухоли полностью подавлялась в 4 из 10 мышей иммунизированной хелперным пептидом WT1₃₅ (МНС класса II) группы (фиг.7). Наблюдали также значимое различие (р<0,05) между иммунизированной хелперным пептидом WT1₃₅ группой и контрольной группой (фиг.8). Это демонстрировало, что хелперный пептид WT1₃₅ (МНС класса II) является пептидом WT1, имеющим способность индуцировать иммунизацию опухоли in vivo.

Затем мышей вскрывали на 29-ый день после начала вышеописанного эксперимента, селезенку вырезали и WT1-специфическую иммунную реакцию анализировали с использованием клеток селезенки. Вкратце, селезенку иссекали при вскрытии мышей иммунизированной хелперным пептидом WT1₃₅ (МНС класса II) группы и контрольной группы и получали клетки селезенки. Эти клетки селезенки стимулировали один раз пептидом WT1₁₂₆ (МНС класса I) и на 6-ой день после стимуляции измеряли цитотоксическую активность клеток селезенки с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом WT1₁₂₆ (МНС класса I), в качестве клетки-мишени. В качестве контроля, цитотоксическую активность клеток селезенки измеряли с использованием клеток RMAS в качестве клетки-мишени. В результате, WT1-специфические цитотоксические Т-клетки индуцировались во всех 4 мышах иммунизированной хелперным пептидом WT1₃₅ (МНС класса II) группы (фиг.9). С другой стороны, WT1-специфические цитотоксические Т-клетки очень слабо индуцировались в 3 мышах контрольной группы (фиг.10). WT1-специфические цитотоксические Т-клетки не индуцировались в одной мыши. Было также ясно, что индукция WT1-специфических цитотоксических Т-клеток была более низкой в сравнении с иммунизированной хелперным пептидом WT1₃₅ (МНС класса II) группой (фиг.9 и 10). Это показывает, что WT1-специфические хелперные Т-клетки индуцировались введением хелперного пептида WT1₃₅ класса II, и посредством действия WT1-специфических хелперных Т-клеток WT1-специфические цитотоксические Т-клетки индуцированные иммунным ответом на белок WT1, экспрессируемый имплантированными опухолевыми клетками, в сильной степени амплифицировались in vivo. Таким образом, эти результаты продемонстрировали применимость хелперного пептида WT1₃₅.

Затем анализировали специфический цитолиз в мышах вышеуказанной иммунизированной хелперным пептидом WT1₃₅ (МНС класса II) группы и контрольной группы. Вкратце, степень цитолиза (%), полученную вычитанием степени цитолиза (%), когда клетками-мишенями были клетки RMAS, из степени цитолиза (%), когда клетками-мишенями были клетки RMAS, обработанные в импульсном режиме пептидом WT1₁₂₆ (МНС класса I), в вышеуказанных экспериментах использовали в качестве специфического цитолиза (%) (фиг.11, слева). Полученные, как описано выше, клетки селезенки и флуоресцентно-меченый тетрамер WT1 (Н-2Db WT1 Tetramer-REMPNAPYL-PE) инкубировали при 4°С в течение 20 минут, промывали, затем окрашивали флуоресцентно-мечеными CD3- и CD8-антителами, опять промывали и анализировали при помощи FACS. CD3-положительные, CD8-положительные и WT1-тетрамер-положительные клетки служили в качестве WT1-специфических цитотоксических Т-клеток (фиг.11, справа). В результате, значимо более высокие WT1-специфические цитотоксические Т-клетки (р<0,05) индуцировались в клетках селезенки мышей иммунизированной хелперным пептидом WT1₃₅ (МНС класса II) группы в сравнении с клетками селезенки мышей контрольной группы (фиг.11).

Пример 4

Измерение способности пролиферации WT1-специфических цитотоксических Т-клеток (CTL) в человеке

Мононуклеарные клетки периферической крови получали из 6 здоровых субъектов, имеющих подкласс молекул DRB1, DPB1, DQB1 или DRB5, показанный на фиг.12. К мононуклеарным клеткам периферической крови добавляли хелперный пептид WT1₃₅ и эти клетки культивировали в течение одной недели. Затем, мононуклеарные клетки периферической крови стимулировали 4 раза в целом при интервалах периода одной недели с использованием идентичных полученных из субъекта мононуклеарных клеток периферической крови, которые обрабатывали в импульсном режиме хелперным пептидом WT1₃₅ и облучали, в качестве стимулятора, и ³Н-включение измеряли на 6-ой день. Во всех 6 субъектах, мононуклеарные клетки периферической крови отвечали на хелперный пептид WT1₃₅ и пролиферировали (фиг.12). Это показало, что хелперный пептид WT1₃₅ имеет функцию связывания с вышеупомянутыми молекулами HLA класса II и вызывания реакции пролиферации. В этой связи, пептид WT1₈₆ и пептид WT1₂₉₄ мыши отличаются от пептида WT1₈₆ (SEQ ID NO:4) и пептида WT1₂₉₄ (SEQ ID NO:5) человека в одной аминокислоте в положениях, заключенных в квадратах, как показано в таблице 8.

Таблица 8
Различия в последовательностях между пептидами WT135, WT186 и WT1294 мыши и человека
mWT135	Мышь	WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:3)	18-мер
hWT135	Человек	WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:3)
mWT186	Мышь	EQCLSAFTLHFGQFTG (SEQ ID NO:6)	17-мер
hWT186	Человек	EQCLSAFTVHFGQFTG (SEQ ID NO:4)
mWT1294	Мышь	FRGIQDVRRVSGVAPTLVR (SEQ ID NO:7)	19-мер
hWT1294	Человек	FRGIQDVRRVPGVAPTLVR (SEQ ID NO:5)

Пример 5

Рестриктированность по молекулам HLA класса II пептида WT1 ₃₅

Для определения рестриктированности по молекулам HLA класса II пептида WT1₃₅, проводили дополнительный эксперимент при помощи способа, хорошо известного квалифицированным в данной области специалистам, вкратце описанный здесь. Сначала, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные из здорового субъекта [DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного субъекта (далее называемого здесь здоровым субъектом А)], стимулировали 5 раз пептидом WT1₃₅ с получением Респондера. Затем мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные из другого здорового субъекта, отличающиеся в типе HLA класса II [DRB1* 0405/0901-, DPB1* 0201/0501- и DQB1* 0303/0401-положительного здорового субъекта (далее называемого здесь здоровым субъектом В)], обрабатывали в импульсном режиме пептидом WT1₃₅ с получением Стимулятора и измеряли пролиферацию клеток [количество включенного ³Н-тимидина (имп/мин)]. Это измерение проводили при условиях без добавления антитела, с добавлением анти-HLA-DR-антитела (+а-DR), с добавлением анти-HLA-DQ-антитела (+а-DQ). Обычный тип HLA класса II, который является положительным как в Респондере, так и в Стимуляторе, показывает рестриктированность пептида WT1₃₅. Как результат этих экспериментов, было показано, что пептид WT1₃₅ является DRB1* 0405-рестриктированным, так как пролиферация была подавлена при условии добавления анти-DR-антитела, и DRB1* 0405 был общим в здоровых субъектах А и В, как показано на фиг.13.

Затем, эксперимент проводили при тех же самых условиях, что и условия вышеуказанного эксперимента, за исключением того, что в качестве PBMC, полученные из здорового субъекта, отличающегося от здорового субъекта А [DRB1* 0405/0803-, DPB1* 0202/0501- и DQB1* 0401/0601-положительного субъекта, называемого здоровым субъектом G)] использовали в качестве Стимулятора. В результате было показано, что пептид WT1₃₅ является DRB1* 0405-, DPB1* 0201- и DPB1* 0202-рестриктированным, так как пролиферация подавлялась при условии добавления анти-HLA-DR-антитела или анти-HLA-DP-антитела и DRB1* 0405, DPB1* 0201 и DPB1* 0202 были общими в здоровом субъекте А и здоровом субъекте G (DPB1* 0201 и DPB1* 0202 имеют высокую аналогию и являются перекрестно реактивными и, следовательно, они считаются общей молекулой), как показано на фиг.14.

Затем проводили эксперимент при тех же самых условиях, что и условия в вышеописанном эксперименте, за исключением того, что PBMC, полученные из здорового субъекта, отличающегося от здорового субъекта А [DRB1* 0101/0803-, DPB1* 0501/- и DQB1* 0501/0601-положительного субъекта (называемого здоровым субъектом Н)] использовали в качестве Стимулятора. В результате было показано, что пептид WT1₃₅ является DRB1* 0101-рестриктированным, так как пролиферация подавлялась при условии добавления анти-HLA-DR-антитела и DRB1* 0101 был общим в здоровом субъекте А и здоровом субъекте Н, как показано на фиг.15.

Кроме того, PBMC, полученные из здорового субъекта G использовали в качестве Респондера и L-клетки, имеющие введенный ген DQB1* 0601, использовали в качестве Стимулятора для определения рестриктированности пептида WT1₃₅. Измеряли различие в количестве IFN-γ, продуцируемом в присутствии или в отсутствие импульса с пептидом WT1₃₅ L-клеток. Долю внутриклеточного продуцирования IFN-γ измеряли с использованием способа FACS, который является способом, хорошо известным квалифицированным в данной области специалистам. В результате, было показано, что пептид WT1₃₅ является DQB1* 0601-рестриктированным, так как этот Респондер активировался импульсом с пептидом WT1₃₅ на L-клетках, как показано на фиг.16.

Затем, проводили эксперимент, как описано выше, с использованием PBMC, полученных из того же самого здорового субъекта, что и Респондер и Стимулятор. Типы молекул HLA класса II, которыми обладали здоровые субъекты, используемые в этом эксперименте, суммированы в таблице 9 ниже.

Таблица 9
Типы молекул HLA класса II, которыми обладали здоровые субъекты, использованные в этом эксперименте
№ здорового субъекта	DRB1	DPB1	DQB1
А	*0101/0405	*0201/0402	*0401/0501
В	*0405/0901	*0201/0501	*0303/0401
С	*0802/1201	*0201/0501	*0301/0302
D	*1502/1502	*0201/0901	*0601/0601
E	*0405/0901	*0202/0501	*0303/0401
F	*1403/1502	*0201/0901	*0301/0601
G	*0405/0803	*0202/0501	*0401/0601
H	*0101/0803	*0501/-	*0501/0601
I	*0101/1501	*0201/0402	*0501/0602

В результате было обнаружено, что добавление анти-DR-антитела или анти-DP-антитела при проведении этого эксперимента с использованием PBMC, полученных из здоровых субъектов А-Е, приводило к уменьшению количества включенного ³Н-тимидина (имп/мин) и, следовательно, к супрессии пролиферации. Добавление только анти-DR-антитела при использовании PBMC, полученных из здорового субъекта F, также приводило к супрессии пролиферации. Кроме того, добавление только анти-HLA-DP-антитела при использовании PBMC, полученных из здорового субъекта G, приводило к супрессии пролиферации. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта А было показано, что пептид WT1₃₅ является DRB1* 0101- или 0405-рестриктированным и DPB1* 0201- или 0402-рестриктированным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта С было показано, что пептид WT1₃₅ является DRB1* 0802- или 1201-рестриктированным и DPB1* 0201- или 0501-рестриктированным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта D было показано, что пептид WT1₃₅ является DRB1* 1502-рестриктированным, так как DRB1* 1502 является гомозиготой (фиг.17). Кроме того, было показано, что пептид WT1₃₅ является DPB1* 0201- или 0901-рестриктированным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта Е было показано, что пептид WT1₃₅ является DRB1* 0405- или 0901-рестриктированным и DPB1* 0202- или 0501-рестрикимрованным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта F было показано, что пептид WT1₃₅ является DRB1* 1403- или 1502-рестриктированным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта G было показано, что пептид WT1₃₅ является DRB1* 0202- или 0501-рестриктированным.

Различие в количестве IFN-γ, продуцируемом в присутствии или в отсутствие импульса с пептидом WT1₃₅, также измеряли с использованием PBMC, полученных из здорового субъекта I в качестве Респондера и Стимулятора. Долю внутриклеточного продуцирования IFN-γ измеряли при помощи FACS, способа, хорошо известного квалифицированным в данной области специалистам. В результате, доля количества IFN-γ заметно увеличивалась импульсом пептида WT1₃₅ (фиг.18). Это показывает, что пептид WT1₃₅ является рестриктированным по любому из DRB1* 0101, DRB1* 1501, DPB1* 0201, DPB1* 0402, DQB1* 0501 и DQB1* 0602.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Данное изобретение обеспечивает пептид WT1, который является рестриктированным по многим типам молекул МНС класса II, полинуклеотид, кодирующий этот пептид, фармацевтическую композицию, содержащую их, и т.п. Таким образом, они могут быть использованы в области фармацевтических веществ, например, в области развития и получения профилактических или терапевтических лекарственных средств для различных опухолей гемопоэтических органов и солидных опухолей, которые в высокой степени экспрессируют ген WT1.

1. Пептид, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученных из белка WT1, и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II, где эта аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(a) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 3;
(b) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 4;
(c) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 5, и
(d) аминокислотной последовательности, в которой одна аминокислота является замещенной в аминокислотных последовательностях, изображенных в (а)-(с).

2. Пептид по п. 1, где этой аминокислотной последовательностью является аминокислотная последовательность, изображенная в SEQ ID NO: 3.

3. Пептид по п. 1 или 2, где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102.

4. Пептид по п. 1 или 2, где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202 и DQB1* 0601.

5. Полинуклеотид, кодирующий пептид по п. 1 или 2, где пептид индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II.

6. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по п. 5.

7. Антитело против пептида по любому из пп. 1-4, где антитело получают иммунизацией животного пептидом по любому из пп. 1-4, и где антитело специфично связывается с пептидом по любому из пп. 1-4.

8. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая эффективное количество пептида по любому из пп. 1-4 и подходящий адъювант.

9. Способ лечения рака, который предусматривает введение эффективного количества пептида по любому из пп. 1-4 субъекту, имеющему молекулу МНС класса II по п. 3 или 4.

10. Применение пептида по любому из пп. 1-4 для лечения рака.

11. Выделенная антигенпрезентирующая клетка, которая экспонирует (представляют) пептид по любому из пп. 1-4 посредством молекулы МНС класса II по п. 3 или 4.

12. Способ индукции антигенпрезентирующих клеток, который предусматривает культивирование незрелых антигенпрезентирующих клеток в присутствии пептида по любому из пп. 1-4 и индукцию антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) этот пептид посредством молекулы МНС класса II по п. 3 или 4, из незрелых антигенпрезентирующих клеток.

13. WT1-специфическая хелперная Т-клетка, которая индуцирована in vitro пептидом по любому из пп. 1-4 с молекулой МНС класса II, где указанная клетка специфически распознает комплекс пептида по любому из пп. 1-4 и молекулы МНС класса II.

14. Способ индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, который предусматривает культивирование мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии пептида по любому из пп. 1-4 и индукцию WT1-специфических хелперных Т-клеток из этих мононуклеарных клеток периферической крови.

15. Набор для индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, содержащий в качестве существенного ингредиента пептид по любому из пп. 1-4 и подходящий адъювант.

16. Применение фармацевтической композиции для лечения рака, экспрессирующего ген WT1, содержащей, в качестве существенного ингредиента, пептид по любому из пп. 1-4 и подходящий адъювант, где рак выбран из группы, состоящей из опухолей гемопоэтических органов, таких как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома, и солидных раковых заболеваний, таких как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника.

17. Способ определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем молекулу МНС класса II по п. 3 или 4, причем указанный способ предусматривает стадии:
(а) реакции пептида по любому из пп. 1-4 с пробой, полученной из этого субъекта;
(b) определения присутствия или количества цитокина, содержащегося в этой пробе; и затем
(c) использования присутствия или количества цитокина в качестве индикатора.