Кристаллическая форма метилового эфира 3-(n-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты, активный компонент, фармацевтическая композиция и лекарственное средство

Изобретение относится к кристаллической форме метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, обладающего свойствами агониста рецепторов TGR5, а также активному компоненту, фармацевтическим композициям и лекарственным средствам на ее основе, которые стимулируют секрецию инкретиновых гормонов, для профилактики и лечения заболеваний, связанных с метаболизмом глюкозы. Технический результат - более высокая скорость растворения и повышенная стабильность при хранении по сравнению с аморфной формой. 4 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил., 7 пр.

 

Изобретение относится к новому физиологически активному веществу, новому нестероидному агонисту рецепторов TGR5 - 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензоксазепин карбоксамиду, его новой кристаллической форме, активному компоненту для фармацевтических композиций, к фармацевтическим композициям и лекарственным средствам, содержащим нестероидный гетероциклический агонист рецепторов желчных кислот TGR5, который стимулирует секрецию инкретиновых гормонов, способу лечения метаболических заболеваний, таких как диабет, ожирение, метаболический синдром, а также сопутствующих им кардиоваскулярных и нейродегенеративных заболеваний.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения в 2008 году 347 миллионов человек во всем мире были больны диабетом [Информационный бюллетень ВОЗ №312. Сентябрь 2012 г.], при этом число больных более чем удвоилось по сравнению со 153 млн в 1980 г. [Danaei G. et.al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2 7 million participants. Lancet. 2011; 378(9785): 31-40]. Распространение диабета происходит ускоряющимися темпами. В 2010 году диабет был зарегистрирован у 6.4% мирового населения, в 2030 прогнозируется 7.7% больных в мире. [Farag Y, Gaballa М. Diabesity: an overview of a rising epidemic. Nephrol Dial Transplant 2011; 26: 28-35]

Особую опасность представляет диабет в сочетании с избыточным весом (ожирением или тучностью), который является ежегодной причиной смерти более 280 тысяч человек в США. Общепризнанным стал новый научно-медицинский термин "Diabesity" (в русском варианте - «Диабетучность»), означающий сочетание двух взаимосвязанных патологий: диабета и ожирения. В настоящее время диабетучность рассматривается как одна из самых серьезных медицинских проблем человечества, ставшая, фактически, первой неинфекционной эпидемией [Schmidt MI, Duncan ВВ. Diabesity: an inflammatory metabolic condition. Clin Chem Lab Med. 2003; 41: 1120-1130], [Dang MN, Hashem BE-S. The epidemiology of obesity. Gastroenterol Clin North Am. 2010; 39: 1-7]. Широкое распространение диабетучность приобрела и стала стремительно распространяться в течение прошлого столетия. Основными причинами этой эпидемии считают малоподвижный образ жизни и неправильную диету [Zimmet Р, Alberti KG, Shaw J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature 2001; 414: 782-787], а также генетическую предрасположенность [Ling С, Groop L. Epigenetics: a molecular link between environmental factors and type 2 diabetes. Diabetes 2009; 58: 2718-2725]. Диабетучность является также интегральной составляющей метаболического синдрома.

В настоящее время, такие простые способы лечения диабетучности, как специальные диеты, не приводят к решению проблемы - 98% потерявших вес приобретают его с избытком в течение 5 лет. Заметный эффект имеют различные хирургические операции в борьбе с диабетучностью (bariatric surgery), однако они сопряжены с большим числом побочных эффектов, связанных с нарушением гормонального гомеостаза [Tharakan G, Tan Т, Bloom S. Emerging therapies in the treatment of ′diabesity′: beyond GLP-1. Trend Pharm Sci. 2011; 32: 8-15]. Многочисленные усилия фармацевтических компаний по созданию высокоэффективных средств лечения диабета (диабетучности) до настоящего времени не привели к заметным успехам. Несмотря на то, что в настоящее время более 130 новых лекарственных кандидатов проходят различные испытания, к применению допущены не более десяти препаратов. Клинические испытания большого числа кандидатов были приостановлены из-за оказываемых ими серьезных побочных эффектов. Так, например, самое многообещающее антидиабетическое лекарство "Avandia" (Rosiglitazone - агонист PPARgamma рецепторов) оказалось увеличивает риск сердечного приступа и остановки сердца [Avorn J. Two centuries of assessing drug risks. New Engl J Med. 2012; 193-197]. Основные причины постоянных неудач исследователей заключаются в недостаточном понимании сложнейшей картины заболевания, в особенности, наличия его многочисленных сигнальных механизмов. Воздействие только на одну эффекторную мишень приводит к «ускользанию» патологического процесса за счет активизации других механизмов. Поэтому одним из основных направлений в разработке антидиабетических лекарств в настоящее время является поиск фармакологических агентов, способных приостановить развитие патологии. В частности, проводится поиск стимуляторов секреции инкретиновых белков, главным образом, GLP1, а также YYP и GIP. Такими свойствами обладают желочные кислоты (ЖК), которые специфически связываются с GPCR-рецепторами ЖК TGR5.

TGR5 рецепторы (известные также как GPBAR1, M-BAR, AXOR 109, GPR131 и GPCR19) являются GPCR-рецепторами класса А, связанными с Gs-белками [Tiwari А, Maiti P. TGR5: an emerging bile acid GPCR target for the potential treatment of metabolic disorders. Drug Disc Today. 2009; 14: 523]. Они экспрессированы главным образом в желчном пузыре, желудочно-кишечном тракте, селезенке, легких и плаценте [Maruyama Т. et al. Identification of membrane-type receptor for bile acids (M-BAR). Biochem Biophys Res Commun. 2002; 298: 714]. Связывание ЖК с TGR5 рецепторами активирует аденилат циклазу, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации сАМР с последующей активацией сигнального каскада МАР-киназы [Pols TWH, et al. The bile acid membrane receptor TGR5: a valuable metabolic target. Dig Dis. 2011; 29: 37]. С другой стороны, стимуляция TGR5 рецепторов регулирует целый ряд метаболических процессов [Chen X. et al. TGR5: a novel target for weight maintenance and glucose metabolism. Exp Diabetes Res. 2011; ID 853501]. В частности, показано, что действие агонистов на эти рецепторы энтероэндокринных клеток STC-1 существенно увеличивает секрецию пептида GLP-1. [Knop FK. Bile-induced secretion of GLP-1: patophysiological implication in type 2 diabetes? Am J Physiol Endocrinol Metab. 2010; Е10-Е13]. В свою очередь пептид GLP-1 улучшает гомеостаз глюкозы несколькими путями, включающими стимуляцию секреции инсулина и подавление секреции глюкагона, что исключительно важно в лечении таких заболеваний, как диабет, диабетучность и ожирение.

Поскольку эндогенные ЖК в силу своей стероидной (гормональной) природы способны взаимодействовать одновременно с множеством биомишеней [Makishima, М.; Okamoto, A.Y.; Repa, J.J.; Tu, H.; Learned, R.M.; Luk, A.; Hull, M.V.; Lustig, K.D.; Mangelsdorf, D.J.; Shanz, B. Science 1999, 284, 1362], включая нуклеарные FXR рецепторы [Prawitt J. et al. Bile acid metabolism and the pathogenesis of type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 2011; 11: 160], то следует вести поиск селективных агонистов TGR5 рецепторов. Наиболее обоснованным представляется поиск среди малых молекул нестероидной природы. Перспективность такого подхода подтверждается целой серией лекарственных кандидатов - нестероидных агонистов TGR5, находящихся в настоящее время на разных стадиях клинических и лабораторных разработок.

Так известно использование сульфамидного производного SB-756050 в лечении нарушений обмена веществ и нервной системы [WO 2007127505, SMITHKLINE ВЕЕСНАМ CORPORATION (US)].

Соединение 780688 используется для лечения или профилактики заболеваний или нарушений, связанных с TGR5 [WO 2012082947, IRM LLC (US)], а соединение Example 99 используется для лечения TGR5-опосредованного заболевания [WO 2008097976, KALYPSYS, INC. (US)].

Известны новые 1-гидроксиимино-3-фенил-пропаны, в частности Tauro-RO-5527239, которые являются GPBAR1 агонистами и могут быть использованы в качестве лекарственных средств для лечения таких заболеваний, как сахарный диабет II типа [WO 2012007365, F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (СН)].

Известны TGR5 агонисты, в частности 735274, а также их применение для лечения ожирения и диабета 2 типа [WO 2011071565, EXELIXIS, INC. (US)].

Известны производные триазола и имидазола, в частности 709679, для использования в качестве TGR5 агонистов в лечении сахарного диабета и ожирения [WO 2010093845, EXELIXIS, INC. (US)].

Известны агонисты соответствующих TGR5 рецепторов (GPBAR1, 109 AXOR, GPCR19), полезные для лечения сахарного диабета 2 типа и способные активировать рецепторы человека GPBAR1, экспрессированного в клетках СНО в цАМФ тесте ЕС₅₀=0,001 мкМ, например соединение 742569 [US 8420647, F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (CH)].

Известны изохинолины, GPR131 агонисты для лечения сахарного диабета, ожирения и гиперлипидемии, например, 712971 [WO 2010117084, MSD К.К. (JP)].

Известны производные желчных кислот формулы I как FXR лиганды для профилактики или лечения FXR-опосредованных заболеваний или состояний [US 7932244, INTERCEPT PHARMACEUTICALS, INC. (US)].

Описаны гетероциклические соединения формулы II [WO 2010014739, KALYPSYS, INC. (US)] или формулы III [WO 2009026241, KALYPSYS, INC. (US)], используемые в качестве модуляторов TGR5, и методы для лечения или профилактики метаболических, сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний.

Известны агонисты G-белковых рецепторов желчных кислот 1 (GPBAR1) формулы IV, потенциально полезные для лечения воспалительных и иммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, рассеянный склероз, псориаз, диабет II типа и ожирение [WO 2008125627, NOVARTIS AG (СН)].

Описаны гетероциклические модуляторы TGR5 формулы V для лечения резистентного к инсулину диабета, ревматоидного артрита, язвенного колита, воспалительных заболеваний кишечника и ожирение. Полученные соединения стимулируют производство цАМФ в TGR5 трансфицированных НЕК-293 клетках с ЕС₅₀ значением ниже 10 мкМ [WO 2008067222, KALYPSYS, INC. (US)].

Известны агонисты TGR5 рецептора, содержащие конденсированные соединения, представленные общей формулой VI [WO 2004067008, Takeda Pharmaceutical Co., Ltd. (JP)].

Таким образом, поиск эффективных нестероидных агонистов рецепторов TGR5 представляется исключительно важной и актуальной задачей.

Перечисленные, хотя далеко не все, агонисты TGR5 рецептора представляют различные классы соединения, но среди них не представлены 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензоксазепин карбоксамиды.

Для данного изобретения не рассматривались в качестве ближайших аналогов 1,4-бензоксазепин-3,5(2H,4H)-дионы, поскольку последние за счет наличия двух карбонильных групп в оксазепиновом кольце имеют отличные от 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензоксазепинов физико-химические свойства (за счет изменения донорно-акцепторных свойств соединений) и пространственные конфигурации, а также отличные способы получения.

Спектр исследований 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензоксазепинов достаточно широк. Это и лечение болезни Альцгеймера, инсульта, нейродегенеративных заболеваний, когнитивных расстройства за счет возможности регулировать уровень серотонина, лечение остеопороза, расстройства сна, артрита, болезней, опосредованных влиянием серотониновых 5-НТ₆ и 5-НТ_2С рецепторов, в число которых входит и ожирение. В подавляющем большинстве случаев 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензоксазепины исследуются в качестве противоопухолевых препаратов для лечения таких заболеваний, как рак молочной железы мантии клеточной лимфомы, почечно-клеточного рака, острый миелобластный лейкоз, хронический миелолейкоз, лимфома, рабдомиосаркома, рак яичников, рак эндометрия, немелкоклеточного рака легкого, небольшой рак легкого, аденокарцинома, полковник рака, рака прямой кишки, рака желудка, гепатоцеллюлярной карциномы, меланомы, рака панкреато, рак простаты, рак щитовидной железы, анапластической крупноклеточной лимфомы, глиобластома и т.д.

Подобные соединения в основном являются ингибиторами PI3 киназы и комплекса 1 mTOR. Возможно этим объясняется достаточно ригидная конструкция структур данных 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензоксазепинов, когда со стороны бензольного кольца все заместители имеют ароматическую арильную природу и со стороны оксазепинового кольца большая их часть (формула VII), что характеризуется достаточно низким уровнем числа вращаемых связей в молекуле [US 8648066, EXELIXIS, INC. (US)].

Известно использование данных соединений в качестве ингибиторов гамма-секретазы для лечения болезни Альцгеймера [RU 2332408, F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (СН)] или для избирательного действия на активацию серотонина 5-НТ_2С рецепторов и использования в качестве профилактического и лечебного средства для нижних мочевых путей, ожирение и/или пролапс тазовых органов [US 8247403, TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED (JP)], а также применение указанных соединений в лечение 5-НТ₆ опосредованных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, когнитивных расстройств, когнитивных нарушений, связанных с шизофренией, ожирение и болезни Паркинсона [WO 2007004959, ASTRAZENECA АВ (SE)].

Более традиционным является использование гетероциклодиазепинов как модуляторов СВ2 [WO 2009032754, KALYPSYS, INC. (US)]. Близкие им соединения используются для лечения аутоиммунных заболеваний [WO 2009032754, KALYPSYS, INC. (US)] или в лечении инсулинорезистентности и клинических состояний, связанных с ним [US 8263587, PIRAMAL LIFE SCIENCES LIMITED (IN)], а также в качестве модуляторов ионных каналов [WO 2013112932, GILEAD SCIENCES, INC. (US)] и применение в лечении различных болезненных состояний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний и диабета [US 8586732, GILEAD SCIENCES, INC. (US)].

Интересным представляется использование соединений данного класса в качестве селективных ингибиторов нейронной изоформы синтазы оксида азота [US 6489322, ASTRA AKTIEBOLAG (SE)], для селективного ингибирования или противодействия αVβ3 интегрина [WO 2002018377, PHARMACIA CORPORATION (US)], антагонистов рецепторов орексина [US 7192950, ACTELION PHARMACEUTICALS LTD. (СН)], активных в отношении S1P рецепторов [ЕА 17691, GLAXO GROUP LIMITED (GB)], для лечения гиперлипидемии [WO 2006129859, ТАКЕДА ФАРМАСЬЮТИКАЛ КОМПАНИ ЛИМИТЕД (JP)], для облегчения двигательных нарушений, связанных с лечением леводопой болезни Паркинсона [WO 2009069828, ДАЙИТИ САНКЕ КОМПАНИ, ЛИМИТЕД (JP)], для модулирования активности Btk и лечения заболеваний, связанных с чрезмерной активностью Btk [JP 5497152, F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (СН)], активных к рецептору MCH [WO 2012036233, Shionogi & Co., Ltd. (JP)].

Перечисленные, хотя далеко не все, 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензоксазепины проявляют различные свойства, но среди них неисследованной является стимуляция секреции инкретиновых гормонов, предпочтительно агонизм к рецепторам желчных кислот TGR5.

Таким образом, поиск эффективных нестероидных агонистов рецепторов TGR5, а именно 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензоксазепин карбоксамидов, представляется исключительно важной, актуальной и многообещающей задачей.

В настоящем изобретении заместитель со стороны бензольного кольца обладает гораздо более высокой подвижностью, но в пределах разумной возможности образовывать конформации для лучшего взаимодействия с активным сайтом исследуемой мишени. В рамках настоящего исследования в качестве биомишени был выбран принадлежащий широкому классу GPCR рецептор желчных кислот TGR5.

Авторами данного изобретения были выполнены синтез и широкие исследования активности различных 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензоксазепин карбоксамидов, среди которых наиболее предпочтительным и перспективным является метиловый эфир 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1.

Наиболее релевантным является Патент РФ [RU 2456287, АЛЛА ХЕМ, ЛЛС (US)], в котором описаны стимуляторы секреции инкретиновых гормонов, нестероидные соединения производные 2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепинов, которые представляют интерес в качестве лекарственных субстанций для создания новых препаратов, предназначенных для профилактики и лечения метаболических заболеваний.

Недостатком этого ряда соединений является трудность получения чистого пролекарства, поскольку получение происходит в несколько этапов - циклизация и восстановление алюмогидридом лития для получения помежуточного продукта, затем последующее ацилирование помежуточного продукта биарильным ацилгалогенидом. Это затрудняет получение лекарственного кандидата и проведение клинических исследований.

Также известно, что соединение метиловый эфир 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты зарегистрировано в CAS Registry под номером 951623-060-6 и предлагается к продаже фирмой ChemDiv, Inc (US).

Однако в отношении соединения С AS 951623-060-6 до настоящего времени имеется только сообщение о том, что это соединение получено комбинаторным способом посредством очистки с применением колоночной хроматографии, но ни его свойства, ни кристаллическая форма его неизвестны.

Необходимо выяснить, способно ли данное соединение кристаллизоваться и иметь кристаллические формы. Затем, если кристаллические формы существуют, необходимо найти воспроизводимые способы получения химически стабильных кристаллических форм и выявить новые кристаллические формы данного соединения.

Стабильность в твердом состоянии и срок хранения активных компонентов являются очень важными факторами. Лекарственное соединение и композиции, включающие его, должны обладать способностью эффективно храниться в течение значительных периодов времени, не проявляя значительного изменения физико-химических свойств активного компонента (например, его химического состава, плотности, гигроскопичности и растворимости). Кроме того, также является важным представить лекарственный препарат в форме, которая является как можно более чистой. В этом отношении аморфные соединения могут представлять значительные проблемы. Например, с такими соединениями труднее обращаться и включать их в лекарственные формы по сравнению с кристаллическим соединением, за счет сомнительной растворимости, и часто оказывается, что они нестабильны и химически загрязнены. Специалисту в данной области будет понятно, что, если лекарственный препарат можно легко получать в стабильной кристаллической форме, то можно решить вышеуказанные проблемы. Обычно невозможно предсказать только на основе молекулярной структуры, каким будет поведение соединения при кристаллизации и обычно это можно установить только эмпирически.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в нахождении новых стабильных кристаллических форм метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты.

Технический результат настоящего изобретения заключается в улучшенных свойствах данного соединения при его использовании, в частности более высокая скорость растворения и повышенная стабильность при хранении.

Поставленная задача и технический результат достигаются получением новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, или фармацевтически приемлемой солью или гидратом, или его рацемическими смесями или индивидуальными оптическими изомерами, с дифракционными пиками на порошковой рентгеновской дифрактограмме, которые характеризуют следующие показатели: углы дифракции (2θ,°), интенсивность (I, %).

Предметом настоящего изобретения является новая кристаллическая форма метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, имеющая на порошковой рентгеновской дифрактограмме характеристические пики при следующих углах дифракции 2θ (±0,10°): 8,9; 12,5; 15,4; 17,8; 19,6; 21,8; 25,4; 27,1

Предметом настоящего изобретения является активный компонент, обладающий свойством стимулятора секреции инкретиновых гормонов, предпочтительно свойствами агониста рецепторов желчных кислот TGR5, представляющий собой новую кристаллическую форму метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1. Нестероидные агонисты рецепторов желчных кислот специфически связываются с рецепторами TGR5 и стимулируют секрецию инкретиновых гормонов (GLP1, YYP, GIP), поэтому наиболее предпочтительными представляются агонисты рецепторов TGR5.

Предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для профилактики и лечения метаболических заболеваний, связанных с метаболизмом глюкозы, и связанных с ними кардиоваскулярных и нейродегенеративных заболеваний, содержащая в эффективном количестве активный компонент, обладающий свойством стимулятора секреции инкретиновых гормонов, предпочтительно свойствами агониста рецепторов желчных кислот TGR5, по настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемые эксципиенты. Под фармацевтически приемлемыми эксципиентами подразумеваются применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или носители. Фармацевтическая композиция наряду с активным компонентом по настоящему изобретению может включать и другие активные ингредиенты, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов, например аллергических реакций. При необходимости использования фармацевтических композиций по настоящему изобретению в клинической практике они могут смешиваться для изготовления различных форм, при этом они могут включать в свой состав традиционные фармацевтические носители; например, пероральные формы (такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, растворы или суспензии); формы для инъекций (такие как растворы или суспензии для инъекций, или сухой порошок для инъекций, который требует лишь добавления воды для инъекций перед использованием); местные формы (такие как мази или растворы).

Носители, используемые в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, представляют собой носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе: в пероральных формах используются связующие вещества, смазывающие агенты, дезинтеграторы, растворители, разбавители, стабилизаторы, суспендирующие агенты, бесцветные агенты, корригенты вкуса; в формах для инъекций используются антисептические агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы; в местных формах используются основы, разбавители, смазывающие агенты, антисептические агенты.

Фармацевтическая композиции по настоящему изобретению может быть получена смешением активного компонента, представляющего собой новую кристаллическую форму метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 с инертным наполнителем, растворителем и/или другими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

Предметом настоящего изобретения является лекарственное средство для профилактики и лечения метаболических заболеваний, связанных с метаболизмом глюкозы, в виде таблеток, капсул, инъекций, ректальных суспензий или гелей, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, содержащее в эффективном количестве активный компонент или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению.

Предметом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения метаболических заболеваний, связанных с метаболизмом глюкозы, согласно которому нуждающемуся субъекту вводят эффективное количество активного компонента, обладающего свойством стимулятора секреции инкретиновых гормонов, предпочтительно свойствами агониста рецепторов желчных кислот TGR5, или фармацевтической композиции, или лекарственного средства по настоящему изобретению.

Лекарственные средства могут вводиться перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, местно или ректально). Клиническая дозировка активного компонента (субстанции), фармацевтической композиции или лекарственного комбинированного средства, включающих фармацевтически эффективное количество активного компонента, у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 10~500 мг, предпочтительно - 50~300 мг. Поэтому во время приготовления фармацевтических композиций по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единица дозировки препарата должна содержать 10~500 мг, предпочтительно 50~300 мг. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени (предпочтительно - от одного до шести раз).

Ниже приведены определения терминов, которые используются в описании настоящего изобретения.

«Агонисты» означают соединения, которые, связываясь с рецепторами определенного типа, активно способствуют передаче этими рецепторами свойственного им специфического сигнала и тем самым вызывают биологический ответ клетки.

«Азагетероцикл» означает ароматическую или неароматическую моноциклическую или полициклическую систему, содержащую в цикле, по крайней мере, один атом азота.

«Активный компонент» (лекарственное вещество, лекарственная субстанция, drug-substance) означает физиологически активное вещество синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, микробного и прочего) происхождения, обладающее фармакологической активностью и являющееся активным началом фармацевтической композиции, используемой для производства и изготовления лекарственного препарата (средства).

«Антагонисты» означают лиганды, которые связываются с рецепторами определенного типа и не вызывают активного клеточного ответа. Антагонисты препятствуют связыванию агонистов с рецепторами и тем самым блокируют передачу специфического рецепторного сигнала.

«Аннелированный цикл» (конденсированный цикл) означает би- или полициклическую систему, в которой аннелированный цикл и цикл или полицикл, с которым он «аннелирован», имеют как минимум два общих атома. Аннелированными могут быть ароматические, неароматические системы и гетероциклические системы.

«Ароматический цикл» (ароматическая система) означает планарную циклическую систему, в которой все атомы цикла участвуют в образовании единой системы сопряжения, включающей, согласно правилу Хюккеля, (4n+π)π-электронов (n - целое неотрицательное число). Примерами ароматических циклов являются бензол, нафталин, антрацен и т.п. В случае «гетероароматических циклов» в системе сопряжения участвуют π-электроны и р-электроны гетероатомов, их суммарное число также равняется (4n+2). Примерами таких циклов являются пиридин, тиофен, пиррол, фуран, тиазол и т.п. Ароматический цикл может иметь один или более «заместителей циклической системы» и может быть анелирован с неароматическим циклом, гетероароматической или гетероциклической системой.

«Гетероциклил» означает ароматическую или неароматическую насыщенную моноциклическую или полициклическую систему, включающую от 3 до 10 атомов углерода, преимущественно от 5 до 6 атомов углерода, в которой один или несколько атомов углерода заменены на гетероатом, такой как азот, кислород, сера. Приставка «аза», «окса» или «тиа» перед гетероциклилом означает наличие в циклической системе, атома азота, атома кислорода или атома серы, соответственно. Гетероциклил может иметь один или несколько «заместителей циклической системы», которые могут быть одинаковыми или разными. Атомы азота и серы, находящиеся в гетероциклиле, могут быть окислены до N-оксида, S-оксида или S-диоксида. Представителями гетероциклилов являются пиперидинил, пирролидинил, пиперазинил, морфолинил, тиоморфолинил, тиазолидинил, 1,4-диоксан-2-ил, тетрагидрофуранил, тетрагидротиофенил и др.

«Гидрат» означает стехиометрическую или нестехиометрическую композицию соединения или его соли с водой.

«Желчные кислоты (эндогенные желчные кислоты, ЖК)» - Основными типами желчных кислот, имеющимися в организме человека, являются так называемые первичные желчные кислоты (первично секретируемые печенью): холевая кислота (3α,7α,12α-триокси-5β-холановая кислота) и хенодезоксихолевая кислота (3α,7α-диокси-5β-холановая кислота), а также вторичные (образуются из первичных желчных кислот в толстой кишке под действием кишечной микрофлоры): дезоксихолевая кислота (3α,12α-диокси-5β-холановая кислота), литохолевая (3α-маноокси-5β-холановая кислота), аллохолевая и урсодезоксихолевая кислоты. Из вторичных в кишечно-печеночной циркуляции во влияющем на физиологию количестве участвует только дезоксихолевая кислота, всасываемая в кровь и секретируемая затем печенью в составе желчи. Аллохолевая, урсодезоксихолевая и литохолевая кислоты являются стереоизомерами холевой и дезоксихолевой кислот. Все желчные кислоты человека имеют в составе своих молекул 24 атома углерода. Желчные кислоты предназначены для стимуляции инкретиновых гормонов.

«Заместитель» означает химический радикал, который присоединяется к скэффолду (фрагменту), например «заместитель алкильный», «заместитель аминогруппы», «заместитель карбамоильный», «заместитель циклической системы».

«Лекарственное средство (препарат)» - комбинация нескольких лекарственных веществ для одновременного использования в виде таблеток, капсул, инъекций, мазей, ректальных суспензий и гелей и др. готовых форм, предназначенный для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. Лекарственные вещества в одном комплекте могут быть представлены в виде различных готовых форм, предназначенных для введения в организм животного или человека различными способами, например перорально и ректально.

«Лиганды» (от латинского ligo - связывать) представляют собой химические вещества (малая молекула, неорганический ион, пептид, белок и прочее), способные взаимодействовать с рецепторами, которые трансформируют это взаимодействие в специфический сигнал.

«Метаболические заболевания» - группа заболеваний, связанных с нарушениями обмена веществ. Эти заболевания могут быть вызваны наследственной предрасположенностью, сбоями в эндокринной и нервной системах, а также нарушениями в работе метаболически активных органов. В настоящее время насчитывается большое количество метаболических нарушений, однако в данном изобретении рассматриваются главным образом болезни, связанные с сигнальным каскадом рецепторов TGR5, в частности, такие как диабет, ожирение, диабетучность, метаболический синдром, гиперхолестеринемия, дислипидемия и т.д.

«Нейродегенеративное заболевание» означает специфическое состояние и заболевание, характеризующиеся повреждением и первичной гибелью популяций нервных клеток в определенных областях центральной нервной системы. Нейродегенеративные заболевания включают, но не ограничивают, болезни Альцгеймера и Паркинсона; болезнь (хорею) Хантингтона; рассеянный склероз; мозжечковую дегенерацию; амиотрофический латеральный склероз; деменцию с тельцами Леви; спинальную мускульную атрофию; периферическую нейропатию; губчатый энцефалит («коровье бешенство», Creutzfeld-Jakob Disease); СПИД-ассоциированную деменцию; мультиинфарктную деменцию; лобно-височную деменцию; лейкоэнцефалопатию (болезнь исчезающей белого вещества); хронические нейродегенеративные заболевания; инсульт; ишемическое, реперфузионное и гипоксическое повреждение мозга; эпилепсия; церебральная ишемия; глаукома; черепно-мозговая травма; синдром Дауна; энцефаломиелит; менингит; энцефалит; нейробластома; шизофрения; депрессия. Кроме того, нейродегенеративные заболевания включают патологические состояния и расстройства, развивающиеся при гипоксии, злоупотреблении веществами, вызывающими зависимость, при воздействии нейротоксинов, инфекционных и онкологических заболеваниях головного мозга, а также нейрональные повреждения, ассоциированные с аутоиммунными и эндокринными заболеваниями; и прочие нейродегенеративные процессы.

«Рецепторы» (от латинского recipere - получать, узнавать) представляют собой биологические макромолекулы, расположенные на цитоплазматической мембране клетки или внутриклеточно, способные специфически взаимодействовать с ограниченным набором физиологически активных веществ (лигандов) и трансформировать сигнал об этом взаимодействии в определенный клеточный ответ.

«Рецепторы TGR5» рецепторы (известные также как GPBAR1, M-BAR, AXOR 109 и GPCR19) являются GPCR-рецепторами, связанными с Gs-белками. Они экспрессированы главным образом в желчном пузыре, желудочно-кишечном тракте, селезенке, легких, плаценте, а также в иммунных клетках (моноцитах и дендритных клетках).

«Сигнальный каскад» (сигнальная система, каскад передачи сигнала) означает совокупность взаимосвязанных последовательных и параллельных молекулярных процессов регуляции клеточного метаболизма внешними (первичными) сигналами, несущими в клетку информацию, что принципиально отличает их от других поступающих в клетку химических соединений, служащих для нее источником материи и энергии. Молекулярные механизмы передачи (трансдукции) внешних сигналов в клетку подразумевают не только передачу сигналов как таковую, но и весь комплекс событий, с ней сопряженных, в том числе усиление, ослабление и подавление (или выключение) сигналов.

«Стероиды» представляют группу природных, полусинтетических и синтетических соединений - производных частично или полностью гидрированного 1,2-циклопентенофенантрена, в молекулярном скелете которых 17 атомов углерода образуют 4 сочлененных кольца. Стероиды широко распространены в природе, они участвуют в осуществлении самых разнообразных биологических функций. Стероидную природу имеют половые гормоны, витамин D, гормоны надпочечников, желчные кислоты, гормоны метаморфоза и репелленты членистоногих, растительные фитостероиды и т.д. Стероиды при сходном строении проявляют сильно различающуюся физиологическую активность, они широко применяются в медицине в качестве противовоспалительных, сердечных, противозачаточных и других средств. Когда необходимо избежать гормональных эффектов стероидов, разрабатывают так называемые «нестероидные» лекарственные агенты.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя соединение общей формулы 1 и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависят от природы и способа назначения и дозировки.

Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например моностеарат алюминия и желатин.

Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, алгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями.

Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения. Фармацевтические композиции, как правило, получают с помощью стандартных процедур, предусматривающих смешение активного соединения с жидким или тонко измельченным твердым носителем. Для изготовления суппозиториев помимо активных компонентов используют также масло какао, сплавы его с парафином и гидрогенизированными жирами, растительные и животные гидрогенизированные жиры, твердый жир, ланоль, сплавы гидрогенизированных жиров с воском, твердым парафином и другие основы, разрешенные для медицинского применения.

«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе синтеза, выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валериаты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропионаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные. (Подробное описание свойств таких солей дано в Berge S.M., et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66: 1-19).

Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, при этом могут быть синтезированы соли металлов и аминов. К металлическим относятся соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из которых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид натрия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быть получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие достаточной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях (в частности, они должны обладать низкой токсичностью). К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, бензиламин, дибензиламин, дициклогексиламин, пиперазин, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)аминометан и подобные им. Кроме того, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как холин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитин и аргинин.

«Фармацевтически приемлемые эксципиенты» под фармацевтически приемлимыми эксципиентами подразумеваются применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или носители.

Также изобретение поясняется чертежами.

Фиг. 1. Порошковая рентгеновская дифрактограмма новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, полученной согласно настоящему изобретению.

Фиг. 2. Концентрационная зависимость активности новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, полученной согласно настоящему изобретению, в отношении рецептора hTGR5.

Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.

Пример 1. Метод синтеза соединения формулы 1. Синтез осуществляют в соответствии со Схемой 1.

Раствор соединения 2 (150 г, 0.75 моль) и этаноламина (68.6 г, 1.5 экв.) в толуоле (1 л) кипятят с ловушкой Дина-Старка 1 час. Затем толуол упаривают, добавляют еще одну порцию толуола (0.5 л) и снова упаривают. Полученную массу растворяют в этиловом спирте и добавляют частями при перемешивании NaBH₄ (42.8 г, 1.5 экв.). Через 1 час перемешивания при комнатной температуре растворитель упаривают, а полученную вязкую массу растворяют в водном аммиаке (0.6 л). Раствор отделяют от нерастворимого осадка и оставляют для кристаллизации. К полученной суспензии 3 (142.8 г, 0.58 моль) в дихлорметане (1 л) последовательно добавляют триэтиламин (116.3 г, 2 экв.) и boc2O (188.3 г, 1.5 экв.) и перемешивают ночь при комнатной температуре. Затем растворитель и триэтиламин частично упаривают при 60°C, а к полученной вязкой массе добавляют гексан (0.5 л). Выпавший твердый осадок отфильтровывают и промывают гексаном (2×300 мл). Получают 152.4 г чистого продукта 4 (выход - 76%).

Диизопропилазодикарбоксилат DIAD (88.9 г, 0.44 моль) добавляют небольшими порциями к раствору 4 (152.4 г, 0.44 моль) и трифенилфосфина (114.7 г, 0.44 моль) в тетрагидрофуране (ТГФ) (1 л) и перемешивают ночь при комнатной температуре. Затем растворитель упаривают, а полученную массу хроматографируют смесью эфир: гексан (1:3) на силикагеле (6 литров). Получают 136.7 г продукта 5 (выход - 95%).

К раствору соединения 5 (6.3 г, 19 ммол) в 30 мл ТГФ при -70°C прибавляют 2.5 М раствор BuLi в гексане и через 1 ч - ДМФА (2.2 мл, 28 ммол). Реакционную массу выдерживают 2 ч при комнатной температуре, разбавляют водой и экстрагируют хлороформом (2×100 мл). Органический слой упаривают (на 78%) и наносят на колонку (высота 70 мм и диаметр 100 мм) с силикагелем 230-400 М. Элюируют смесью (328 мл) гексан: эфир (70:30), выделяют (после упаривания на роторе и сушки в вакууме) 3.5 г (70%) соединения 6. Далее раствор соединения 6 (1.2 г, 4.3 ммоль), n-метиланилина (4.3 ммол) и TsOH (0.05 г) в толуоле (20 мл) кипятят 2 ч с насадкой Дина-Старка, затем полностью упаривают, остаток 7 растворяют в этаноле (15 мл) и добавляют двукратный избыток боргидрида натрия. Через час реакционную массу разбавляют 5% водным раствором (100 мл) поташа и экстрагируют хлороформом (2 раза 100 мл). Органический слой высушивают безводным сульфатом натрия, полностью упаривают и полученное техническое соединение 8, растворяют в 100 мл CH₂Cl₂ и прибавляли триэтиламин (0.62 мл, 4.3 ммоль) и ацетилхлорид (4.3 ммоль).

Реакционные массу выдерживают 3 ч, полностью упаривают, растворяют в 50 мл метанола и добавляют 5 мл концентрированной соляной кислоты. Через 12 ч реакционную массу полностью упаривают, разбавляют водой (100 мл), экстрагируют CH₂Cl₂ (2 раза по 50 мл) и наносили на короткую колонку (высота 35 мм и диаметр 50 мм) с силикагелем (230-400 М). Элюируют смесью (150 мл) гексан: CH₂Cl₂:МеОН (5:5:1), выделяют 0.7 г (52%) соединения 9.

К 0.063 г (0.000211 моль) трифосгена, растворенного в 1 мл дихлорметана, добавляют 1 мл раствора, содержащего соединение 9 (0.00057 моль) и диизопропилэтиламин DIPEA (0.00126 моль, 0.163 г). Перемешивают полученную массу при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 30 мин, а затем добавляют амин 10 (0.00057 моль) и DIPEA (0.081 г, 0.00063 моль), растворенные в 1 мл дихлорметана. Смесь после перемешивания при комнатной температуре (2 ч) разбавляют 30 мл дихлорметана, промывают 2 н. раствором HCl (20 мл), высушивают над сульфатом натрия и хроматографируют смесью СН₂О₂/EtOH (высота колонки 4 см, ширина 1 см). Получают метиловый эфир 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, LC MS m/z 494 (М+1), с выходом 70%.

Пример 2. Получение кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1.

10 мг метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 растворяют в 10 мл метанола, нагревая смесь до 42°C. К раствору, полученному в результате этого, по каплям добавляют 10 мл воды при той же температуре в течение 20 минут и полученную смесь охлаждают до 5°C в течение суток, после чего отфильтровывают и собирают кристаллическое вещество. Кристаллы сушат при 50°C при пониженном давлении до тех пор, пока масса кристаллов не перестанет уменьшаться при дальнейшем высушивании, в результате чего было произведено 9,52 мг белого твердого вещества.

Порошковый рентгеноструктурный анализ полученной кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 проводят при помощи дифрактометра Rigaku с детектором Saturn 944 HG и медного излучения CuKα. На спектре порошковой рентгеновской дифрактограммы кристаллического вещества (Фиг. 1) наблюдают характеристические пики при углах дифракции 2θ (±0,10°): 8,9; 12,5; 15,4; 17,8; 19,6; 21,8; 25,4; 27,1.

Пример 3. Определение агонистической активности соединения формулы 1 по отношению к рецептору hTGR5.

Определение агонистической активности библиотеки соединений, включающей соединение формулы 1, осуществляют с использованием линии клеток НЕК-293, в которых стабильно экспрессирован человеческий рецептор TGR5 (hTGR5). Агонистическую активность соединений оценивают по возрастанию внутриклеточной концентрации сАМР, так как из литературы известно, что активация рецептора hTGR5 путем последующей активации клеточной аденилатциклазы ведет к повышению внутриклеточного содержания с AMP. В качестве экспериментальной платформы выбирают тест-систему Lance Ultra сАМР (Perkin Elmer). Известные агонисты рецептора hTGR5 используются в качестве положительного контроля и для определения абсолютной величины максимального сигнала эксперимента. Вещества тестируют в конечной концентрации 10 µМ, в одной точке. Вещества, проявляющие агонистическую активность более чем 50% от максимального сигнала - 3×SD (минимального сигнала), номинируют на повторный тест в концентрации 10 µМ в репликатах для подтверждения проявленной активности.

Для наиболее активных соединений проводят анализ зависимости агонистической активности вещества от концентрации вещества. Из полученных графиков зависимости определяют значения EC₅₀ (концентрация вещества в мкмолях, которая вызывает 50% от максимального эффекта).

Клеточная линия: - иммортализованная линия НЕК 293, стабильно экспрессирующая hTGR5, Millipore, каталожный номер HTS238L. Культуральная среда для клеток представляет собой смесь DMEM, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, а также 1 мкг/мл пуромицина/400 мкг/мл G418/200 мкг/мл гигромицина Б в качестве селективной смеси антибиотиков.

Клетки размораживают на водяной бане при 37°C, ресуспендируют в 5 мл р-ра Хенкса, центрифугируют и еще раз ресуспендируют в 6 мл раствора Хенкса. Таким образом, осуществляют отмывку клеток от сыворотки и культуральной среды. Повторяют шаг центрифугирования и ресуспендировали клетки в стимулирующем буфере тест-системы (SB). Финальная концентрация клеток была 2.00×10⁵ клеток/мл, что давало 1000 клеток на лунку. сАМР-антитела добавляют к суспензии клеток в пропорции 1:150.

Вещества растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 2.5 тМ. Планшеты с веществами в ДМСО хранят при -20°C. Готовят буфер для эксперимента (SB): 1x HBSS, 5 mM HEPES, 0.1% BSA, рН 7.4. Смешивали 45 мл HBSS, 225 мкл 1М HEPES and 600 мкл 7.5% BSA.

Суспензию клеток, включающую 4-кратный раствор антител к сАМР, добавляют в 384-луночные планшеты для эксперимента, по 5 мкл в лунку с использованием автоматизированной системы Biomek 2000 (Beckman Coulter). Центрифугируют при 300 rpm, 1 минуту. 2-кратную смесь [SB+ вещества] добавляют к клеточной суспензии с использованием роботизированной системы Biomek FX 384. Для приготовления 2-кратной смеси [SB+ вещества], SB переносят в 384 луночный планшет, по 99 мкл/лунку. 1 мкл 200-кратного рабочего раствора веществ в DMSO переносят в тот же 384-луночный планшет. Полученную смесь тщательно перемешивают. 5 мкл 2-кратной смеси [SB+ вещества] добавляют к клеточной суспензии по 5 мкл на лунку. Экспериментальный планшет центрифугируют при 300 rpm, 1 минуту. Далее клеточную суспензию инкубируют с веществами в течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере, 300 rpm.

Исходный раствор Eu-cAMP трейсера разводят 1:100 в буфере для детекции сигнала, получая 2-кратный рабочий раствор трейсера. Далее раствор добавляют в экспериментальный планшет, по 10 мкл, используя роботизированную систему Biomek 2000. Клеточную суспензию инкубируют с раствором для детекции сигнала 60 минут на шейкере, 300 rpm.

Сигнал эссея измеряют на многофункциональном ридере Wallac 1420 Victor³ (Perkin Elmer), используя длину волны 665 нм, протокол LANCE High Count_665_OptiPlate.

Агонистическую активность веществ рассчитывают с использованием скрипта для обработки данных Grand CaLculate_0.1.1. В качестве минимального сигнала эксперимента использовали усредненные данные лунок 23 столбца экспериментального планшета, содержащие нестимулированные клетки. В качестве максимального сигнала эксперимента использовали усредненные данные всех лунок 24 столбца экспериментального планшета, содержащие клетки, стимулированные известным стероидным агонистом hTGR5.

Активация hTGR5 рецептора новой кристаллической формой метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 при данной концентрации 10 µМ составляет 94%. Данные анализируют в программе GraphPad Prizm (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Для построения концентрационной зависимости выбирают уравнение:

где Тор и Bottom - максимальная и минимальная концентрации, HillScope - коэффициент Хилла, ЕС₅₀ определяют, исходя из построенного графика, как концентрация вещества, которая вызывает 50% от максимального эффекта. При коэффициенте Хилла 4,117 значение ЕС50 новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 составляет 640 нМ (Фиг. 2).

Пример 4. Метаболическая модель и исследование действия соединения формулы 1 на секрецию инкретинового пептида GLP-1.

Исследуемое соединение - новую кристаллическую форму метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 - (доза 30 мг/кг) в водном растворе карбоксиметилцеллюлозы (0.5%) и Tween-20 (0.25%) вводят перорально DIO-мышам С57В L/6J (6 мышей на временную точку) за 15 минут до перорального введения декстрозы (2 г/кг в физиологическом растворе). Кровь для анализов собирают из хвостовой вены животных через 5, 10, 15 и 30 минут после введения сахара. В качестве контроля вводят водный раствор карбоксиметилцеллюлозы (0.5%) и Tween-20 (0.25%).

DIO-мыши (Diet Induced Obesity mice - мыши с ожирением, индуцированным диетой) широко используются для моделирования метаболического синдрома у человека, который характеризуется абдоминальным ожирением, высоким уровнем триглицеридов, нарушением гомеостаза глюкозы и гиперинсулинемией [Hariri N, Thibault L. High-fat diet-induced obesity in animal models. Nutr Res Rev. 2010; 23(2): 270-99]. Для создания DIO-модели используют мышей С57В L/6J, которых кормят диетой с высоким содержанием жира (high fat diet, HFD); пища включает 58% свиного сала. Диета D12492, Research Diet, New Brunswick, NJ; West D. et al. 1992). HFD-диета и вода предоставляют животным ad libitum в течение 28 дней до начала эксперимента.

Содержание инкретинового пептида GLP-1 в плазме определяют стандартным методом ELISA. В результате стимуляции секреции GLP-1 через 15 минут эксперимента содержание инкретинового пептида GLP-1 в крови превысило 6 нг/ммоль и через 30 минут после введения сахара содержание инкретинового пептида GLP-1 в крови превысило 5,5 нг/ммоль (или через 30 и 45 минут после введения соединения). Введение метилового эфир 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 (30 мг/кг) во всех случаях существенно и статистически достоверно стимулирует секрецию гормона GLP-1.

Пример 5. Исследование действия соединения формулы 1 на метаболизм глюкозы (тест толерантности к глюкозе ГТТ).

Исследуемое соединение - метиловый эфир 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 - (дозы от 5 до 100 мг/кг) в водном растворе карбоксиметилцеллюлозы (0.5%) и Tween-20 (0.25%) вводилось перорально DIO-мышам С57В L/6J (6 мышей на временную точку) за 15 минут до перорального введения декстрозы (2 г/кг в физиологическом растворе). Кровь для анализов собиралась из хвостовой вены животных через 0, 5, 10, 20, 30, 60 и 120 минут после введения сахара. В качестве контроля вводили водный раствор карбоксиметилцеллюлозы (0.5%) и Tween-20 (0.25%).

Данные, полученные в результате эксперимента, показывают существенное статистически достоверное снижение содержания глюкозы в плазме DIO-мышей под действием метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1:

Содержание глюкозы в плазме через 20 минут после начала эксперимента - 1000 мг/л;

Содержание глюкозы в плазме через 60 минут после начала эксперимента - 780 мг/л;

Содержание глюкозы в плазме через 120 минут после начала эксперимента - 560 мг/л;

Результаты однозначно свидетельствуют о перспективности использования метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 в подходе к лечению метаболических заболеваний.

Пример 6. Определение кинетики растворения кристаллической формы.

Кинетику растворения новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, полученной в примере 2, сравнивают с кинетикой растворения аморфного соединения С AS 951623-060-6. Прибор для определения скорости растворения представляет собой трехгорлый сосуд емкостью 1 л. В один из тубусов вводят термометр, в другой - стеклянную трубку для взятия проб и их комплексирования, а в третий - основную деталь прибора - цилиндрическую корзинку высотой 3,6 см и диаметром 2,5 см, сделанную из нержавеющей стали в виде сетки с отверстиями диаметром 40 меш (около 0,351 мм). Корзинка насажена на ось мотора.

В сосуд наливают растворяющую среду (1000 мл), в данном эксперименте ДМСО, поскольку он является важным биполярным апротонным растворителем и, благодаря своей сильной растворяющей способности, ДМСО часто используется как растворитель в химических реакциях и система биологического скрининга. Исследуемый образец помещают в цилиндрическую корзинку, которую устанавливают на расстоянии 2 см от дна сосуда.

Для сравнительного образца 1 используют 200 мг новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, а для сравнительного образца 2-200 мг аморфного соединения С AS 951623-060-6 с получением после полного растворения раствора, содержащего 200 м.д. соединения С AS 951623-060-6.

Температуру растворяющей среды во время опыта поддерживают постоянной (37±0,5°C). Скорость вращения корзинки в среде регулируют с точностью ±5%, она составляет 200 об/мин. Через установленные интервалы времени отбирают для анализа пробы по 1-2 мл для определения содержания лекарственного вещества. Взятый объем растворителя тотчас же восполняют новым.

Полученные результаты приведены в таблице 1 (где величины представляют собой количество (м.д.) образцов 1 или 2 в растворе:

Результаты демонстрируют, что скорость растворения новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1 в ДМСО выше, чем скорость растворения аморфного соединения CAS 951623-060-6. В частности, время, в течение которого происходит 50% растворение новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, в два раза меньше, чем для сравнительного образца аморфного соединения CAS 951623-060-6.

Пример 7. Исследование хранения кристаллической формы.

Все образцы хранились в стеклянных виалах, укупоренных резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками, в холодильной камере при температуре ~4,7°C и в морозильной камере при температура около -23°C. Количество примесей определялось методом внутренней нормализации, детектирование проводилось УФ-детектором при длине волны 220 нм.

В таблице 2 представлены результаты испытаний новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, свидетельствующие об улучшении ее стабильности при пониженной температуре по сравнению с аморфным соединением CAS 951623-060-6.

Результаты однозначно свидетельствуют о перспективности заявляемой новой кристаллической формы метилового эфира 3-(7-((N-п-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1.

Настоящее изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии, биохимии.

1. Кристаллическая форма метилового эфира 3-(7-((N-n-толилацетамидо)метил)-2,3,4,5-тетрагидробензо[f][1,4]оксазепин-4-карбоксамидо)тиофен-2-карбоновой кислоты формулы 1, имеющая на порошковой рентгеновской дифрактограмме характеристические пики при следующих углах 2θ (±0,10°): 8,9; 12,5; 15,4; 17,8; 19,6; 21,8; 25,4; 27,1

2. Активный компонент, обладающий свойством стимулятора секреции инкретиновых гормонов, предпочтительно свойствами агониста рецепторов желчных кислот TGR5, представляющий собой соединение формулы 1 по п. 1.

3. Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения метаболических заболеваний, связанных с метаболизмом глюкозы, содержащая в эффективном количестве активный компонент по п. 2.

4. Лекарственное средство для профилактики и лечения метаболических заболеваний, связанных с метаболизмом глюкозы, в виде таблеток, капсул, инъекций, ректальных суспензий или гелей, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, содержащее в эффективном количестве активный компонент по п. 2 или фармацевтическую композицию по п. 3.