Специфические к опухоли антитела и их применение

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии Описаны выделенные антитела и их фрагменты, которые связываются с опухолевыми антигенами. Также описаны композиции и агенты для доставки, которые включают раскрываемые антитела; клетки, которые продуцируют эти антитела; способы продуцирования этих антител; способы применения этих антител, нацеливания на опухоли и/или метастатические клетки, образуемые ими, и/или опухолевые стволовые клетки, и лечение опухолей и/или метастатических клеток, образуемых ими, и/или опухолевых стволовых клеток; и способы прогнозирования рецидива рака у субъекта. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 17 н. и 5 з.п. ф-лы, 22 ил., 4 табл., 8 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка является заявкой в частичное продолжение заявки США на патент с серийным номером 12/924,952, поданной 8 октября 2010 г., которая сама претендует на преимущества предварительной заявки США на патент с серийным номером 61/249,634, поданной 8 октября 2009 г.Каждая из этих заявок полностью включена в данную заявку посредством отсылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, связанных с настоящим изобретением, был представлен в Ведомство США по патентам и торговым знакам, действующее в качестве международного получающего ведомства, в электронном виде в виде текстового файла объемом двадцать один (21) Кб в кодировке ASCII, созданного 25 мая 2011 г. и озаглавленного "1276_5PCT_ST25.txt". Этот перечень последовательностей, поданный при помощи EFS-Web, полностью включен в данную заявку посредством отсылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Описанное в данной заявке изобретение относится к выделенным антителам или их фрагментам и их производным, которые связываются с антигенами, находящимися в опухолях, и к способам их применения. Согласно некоторым вариантам данное изобретение относится к выделенным антителам или их фрагментам и их производным, которые связывают член семейства эпителиальных муцинов MUC1, и к способам их применения для обнаружения опухолей, нацеливания на опухоли и клетки опухолей и лечения опухолей и их клеток, включая, но без ограничения, циркулирующие опухолевые клетки (СТС) и раковые стволовые клетки (CSC).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак поджелудочной железы занимает четвертое и пятое место как причина смерти от рака среди мужчин и женщин, соответственно, после смерти от рака легкого, рака толстой кишки и рака простаты у мужчин и после смерти от рака легкого, рака молочной железы, рака толстой кишки и рака яичника у женщин. Пациенты, у которых болезнь прогрессировала, с трудом поддаются лечению. Хирургия является единственным методом радикального лечения, однако, местное поражение с распространением на отдаленные органы возникает более чем у 80% от общего количества пациентов. Для увеличения количества выздоровевших пациентов необходимы попытки разработать более эффективные способы вмешательства.

Часто опухолевое превращение приводит к изменениям процесса экспрессии различных полипептидов в опухолевых клетках. Например, некоторые муцины и мутантные формы полипептидов онкогена K-ras сверхэкспрессируются в 90% клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (далее обозначаемой как "PDA"), и становятся мишенями для терапевтического вмешательства.

Однако до настоящего времени вакцины, которые нацелены на эти полипептиды, оказались не особенно успешными при проведении клинических испытаний. Вакцины не генерируют длительно сохраняющуюся иммунную память, вероятно, по меньшей мере частично, из-за наличия опухолей, адаптирующихся таким образом, который позволяет им избежать иммунного распознавания и гибели.

Некоторые агенты, которые могут модулировать иммунную переносимость, были испытаны в клинических условиях, но результаты были весьма скромными, возможно, из-за недостаточного количества агентов, достигающих места расположения опухоли и/или из-за того, что агенты сами приводят к появлению нежелательных побочных эффектов, таких, которые могут возникать вследствие их связывания с нормальными клетками.

Кроме того, основная цель лечения онкологических заболеваний заключается не только в лечении первичного заболевания, но и в предотвращении образования метастаз. В настоящее время считается, что метастатический процесс может возникнуть из-за миграции злокачественных клеток, часто называемых опухолевыми стволовыми клетками или раковыми стволовыми клетками, из расположения первичной опухоли к другим участкам, где они могут инфильтрировать в этот участок и образовать новые опухоли (см., например. Bonnet & Dick, 1997; Reya et al., 2001; Al-Hajj et al., 2003; Pardal et al., 2003; Dontu et al., 2004; Singh et al., 2004; Brabletz et al., 2005). В результате, было бы очень желательно уметь идентифицировать и удалять эти клетки, если они есть у пациента.

Таким образом, существует необходимость в создании новых композиций и способов обнаружения, нацеливания и лечения опухолей и опухолевых клеток.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В этом разделе перечислены несколько вариантов данного изобретения и во многих случаях вариации и комбинации этих вариантов. Этот раздел просто описывает примеры многочисленных и различных вариантов. Упоминание одного или более признаков данного варианта также является только примером. Такой вариант может обычно существовать при наличии упомянутого признака(-ов) или без него (них); точно также эти признаки могут быть применены в других вариантах данного изобретения, независимо от того, упомянуты они в этом разделе или нет. Для того, чтобы избежать повторений, в этом разделе перечислены не все возможные комбинации этих признаков.

Согласно различным вариантам данное изобретение предусматривает следующее:

Выделенные антитела, а также их фрагменты и их производные, которые специфически связываются с муцином-1 (MUC1) и с мутантными полипептидами онкогена K-ras, находящегося в эпителиальных опухолях.

Выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют выделенные антитела по данному изобретению и/или их последовательности.

Антитела, такие как моноклональные антитела и/или их пептиды, их фрагменты и/или их производные, которые связываются специфически с опухолями, такими как эпителиальные опухоли, включая опухоли поджелудочной железы, опухоли яичника, опухоли молочной железы, колоректальные новообразования и метастазы, вызванные этими опухолями.

Антитела, а также их фрагменты и производные, которые связываются специфически с эпитопом, находящимся в полипептиде MUC1 и/или мутантном полипептиде K-ras^G12D, по некоторым вариантам с эпитопом, находящимся в полипептиде человеческого MUC1. Согласно некоторым вариантам такой эпитоп находится в любой из SEQ ID NO:1-3.

Антитела, а также их фрагменты и производные, которые связываются специфически с MUC1 (по некоторым вариантам с MUC1 человека) и с мутантным K-ras^G12D, образовавшимся при помощи белковых лизатов на мышиной модели, которая представляет MUC1 и мутантный K-ras^G12D как опухоль-ассоциированные антигены.

Химерные молекулы, представляющие собой антитела, а также их фрагменты и их производные, присоединенные к эффекторам и/или иммуномоделирующим агентам, при этом антитела или их фрагменты или их производные связываются специфически с эпитопами, находящимися на полипептиде MUC1 и/или на полипептиде мутантного K-ras. Согласно некоторым вариантам эффекторы выбираются из группы, состоящей из эпитопных меток, вторичных антител (или их фрагментов или их производных), меток, цитотоксинов, липосом, радионуклидов, лекарств, пролекарств и хелатов, и иммуномоделирующий агент выбран из иммуномодуляторов, перечисленных, например, в Таблице 3.

Антитела, а также их фрагменты и производные, соединенные с иммуномоделирующим агентом; например, иммуномоделирующими агентами, перечисленными в Таблице 3.

Антитела, а также их фрагменты и производные, соединенные с диагностическими агентами.

Антитела, а также их фрагменты и их производные, содержащиеся в композициях, которые содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов.

Способы индукции иммунных ответов, которые согласно некоторым вариантам включают введение антител, их фрагментов и/или их производных и/или композиций, описанных в данной заявке, субъекту, такому как, но без ограничения, человек.

Способы обнаружения раковых клеток, включающие введение субъекту, такому как, но без ограничения, человек, антитела или его фрагмента или его производного, соединенного с детектируемой меткой, которые связываются специфически с полипептидом MUC1 и/или мутантным полипептидом K-ras.

Гибридные клетки (гибридомы), которые продуцируют антитела, их фрагменты и/или их производные согласно данному изобретению, такие как, но без ограничения, моноклональные антитела, которые связываются специфически с полипептидом MUC1, мутантным полипептидом K-ras^G12D или с обоими полипептидами.

Вакцины против эпителиального рака, включающие антитела, их фрагменты и/или производные согласно данному изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов, а также один или более иммуномоделирующих агентов.

Более конкретно, согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает антитела, их фрагменты и/или их производные, содержащие гипервариабельные (определяющие комплементарность) области (CDR) моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные являются поликлональными. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные являются моноклональными. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные являются человеческими или гуманизированными. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные выбраны из группы, состоящей из (а) моноклонального антитела, продуцированного гибридомной клеточной линией TAB-004, депонированной в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America, 16 декабря 2010 г.под номером доступа РТА-11550; (б) химерных антител или их фрагментов или их производных; (в) гуманизированных антител или их фрагментов или их производных; (г) одноцепочечных антител или их фрагментов или их производных; и (д) фрагментов Fab, при этом химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела или фрагменты Fab содержат CDR моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам выделенных антител или их фрагментов или их производных CDR содержат один или более следующих фрагментов: (i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:8; (ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:9; (iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:10; (iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID NO:11; (v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID NO:12; и (vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам выделенных антител или их фрагментов или их производных вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:5 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:4; и/или вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:7 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:6.

Настоящее изобретение предусматривает также композиции, содержащие описанные в данной заявке антитела или их фрагменты или их производные, и один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов. Согласно некоторым вариантам один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов приемлемы для применения для людей.

Настоящее изобретение предусматривает также композиции, содержащие описанные в данной заявке антитела или их фрагменты или их производные, конъюгированные с активным агентом. Согласно некоторым вариантам активный агент выбран из группы, состоящей из радиоактивной молекулы, радионуклида, молекулы сенсибилизатора, визуализирующего средства, радиоизотопа, токсина, цитотоксина, антиангиогенного агента, противоопухолевого агента, химиотерапевтического агента, иммуномодулирующего агента, цитокина, репортерной группы и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам радиоизотоп выбран из группы, состоящей из ¹⁰В, ²¹¹At, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S и ³H Согласно некоторым вариантам иммуномодулирующий агент выбран из группы, состоящей из ингибитора индоламин 2,3-диоксигеназы (IDO), возможно, 1-метил- DL-триптофана (1МТ); антагониста рецептора ЕР2/ЕР4; ингибитора циклооксигеназы, возможно, индометацина; и активатора дендритных клеток, возможно, олигодезоксинуклеотидов CpG (CpG ODN).

Данное изобретение предусматривает также наборы, содержащие описанные в данной заявке антитела или их фрагменты или их производные. Согласно некоторым вариантам описанные в данной заявке наборы включают инструкции по применению антител или их фрагментов или их производных, описанных в данной заявке.

Настоящее изобретение предусматривает также средства доставки для применения при нацеленной доставке активных агентов к опухолевым клеткам. Согласно некоторым вариантам носитель для доставки активных агентов содержит один или более агентов для нацеливания на мишени, которые представляют собой описанные в данной заявке антитела, или их фрагменты и их производные. Согласно некоторым вариантам активный агент представляет собой радиоактивную молекулу, радионуклид, молекулу сенсибилизатора, визуализирующий реагент, радиоизотоп, токсин, цитотоксин, антиангиогенный агент, противоопухолевый агент, химиотерапевтический агент, иммуномодулирующий агент, цитокин, репортерную группу или их комбинацию.

Настоящее изобретение предусматривает также выделенные клетки, которые продуцируют антитела, описанные в данной заявке или их фрагменты или их производные. Согласно некоторым вариантам выделенная клетка представляет собой гибридому, которая продуцирует описанные в данной заявке антитела. По некоторым вариантам гибридома является клеточной линией с номером доступа РТА-11550, которая была депонирована 16 декабря 2010 г. в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America), по условиям Будапештского договора.

Данное изобретение предусматривает также способ обнаружения наличия эпитопа, с которым связывается моноклональное антитело TAB-004 в биологическом образце. Согласно некоторым вариантам способы включают: контактирование биологического образца с одним или более описанными в данной заявке выделенными антителами или их фрагментами или их производными; и детектирование эпитопа, с которым в биологическом образце связано моноклональное антитело TAB-004. Согласно некоторым вариантам выделенные антитела или их фрагменты или их производные связываются с эпитопом, который находится в полипептиде муцина (MUC1) и/или с эпитопом, который находится в полипептиде K-ras, возможно, в полипептиде мутантного K-ras.

Данное изобретение предусматривает также способы получения антитела или его фрагмента или его производного. Согласно некоторым вариантам способы включают культивирование выделенной клетки по изобретению или гибридомы по изобретению в таких условиях, что происходит экспрессия указанного антитела или его фрагмента или его производного; и выделение указанных антитела или его фрагмента или его производного из клетки или гибридомы и/или из среды, в которой происходит рост клетки или гибридомы.

Данное изобретение предусматривает также способы обнаружения опухоли и/или раковой клетки у субъекта. Согласно некоторым вариантам эти способы включают контактирование биологического образца в организме субъекта или образца, выделенного у субъекта, с композицией, которая содержит описанное в данной заявке антитело или его фрагмент или его производное, в условиях, достаточных для связывания описанного в данной заявке антитела или его фрагмента или его производного с эпитопом, находящимся в опухоли и/или в раковой клетке, если они имеются в биологическом образце; и обнаружение наличия связывания описанного в данной заявке антитела или его фрагмента или его производного с эпитопом, при этом указанное обнаружение является показателем наличия опухоли и/или раковой клетки у субъекта. Согласно некоторым вариантам опухоль и/или раковая клетка представляет клетку опухоли поджелудочной железы, молочной железы, яичника, толстой кишки или прямой кишки и/или метастатическую клетку, порожденную этими опухолями, которая, возможно, экспрессирует MUC1, мутантный K-ras или и то, и другое. Согласно некоторым вариантам описанное в данной заявке антитело или его фрагмент или его производное связывается с детектируемой меткой, содержащей визуализирующее средство, которое по некоторым вариантам выбирается из группы, состоящей из парамагнитного, радиоактивного или флуорогенного ионов.

Согласно некоторым вариантам радиоактивный визуализирующий агент выбран из группы, состоящей из гамма-излучателей, излучателей позитронов и источников рентгеновского излучения. Согласно некоторым вариантам радиоактивный визуализирующий агент выбран из группы, состоящей из ⁴³K, ⁵²Fe, ⁵⁷Со, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁷Br, ⁸¹Rb/⁸¹MKr, ^87MSr, ^99MTc, ¹¹¹In, ¹¹³In, ¹²³I, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹²⁷Cs, ¹²⁹Cs, ¹³¹I, ¹³²I, ¹⁹⁷Hg, ²⁰³Pb и ²⁰⁶Bi. Согласно некоторым вариантам биологический образец представляет собой образец крови или фракцию крови.

Данное изобретение предусматривает также способы лечения опухоли у субъекта. Согласно некоторым вариантам эти способы включают введение субъекту композиции, содержащей описанное в данной заявке антитело или его фрагмент или его производное, связанное с активным агентом, при этом активный агент контактирует с опухолью с целью лечения этой опухоли. Согласно некоторым вариантам активный агент представляет собой терапевтический агент, возможно, химиотерапевтический агент, токсин, радиотерапевтический агент или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам химиотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из противоопухолевого лекарства, цитокина, антиметаболита, алкилирующего агента, гормона, метотрексата, доксорубицина, даунорубицина, цитозин-арабинозида, этопозида, 5-флуороурацила, мелфалана, хлорамбуцила, мустаргена, циклофосфамида, цисплатина, виндесина, алкалоидов винка, митомицина, блеомицина, пуротионина, макромомицина, производных 1,4-бензохинона, тренимона, стероидов, аминоптерина, антрациклинов, демекольцина, этопозида, митрамицина, доксорубицина, дауномицина, винбластина, неокарциностатина, макромицина, а-аманитина и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам токсин выбирают из группы, состоящей из яда гадюки Рассела, активированного фактора IX, активированного фактора X, тромбина, фосфолипазы С, фактора яда кобры, рицина, А-цепи рицина, экзотоксина Pseudomonas, токсина дифтерии, бычьей панкреатической рибонуклеазы, антивирусного белка лаконоса, абрина, А- цепи абрина, гелонина, сапорина, модецина, вискумина, волкенсина и их комбинаций. Согласно некоторьм вариантам радиотерапевтический агент выбирают из группы, состоящей из ⁴⁷Sc, ⁶⁷Cu, ⁹⁰Y, ¹⁰⁹Pd, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ²¹¹At, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ³²P, ³³P, ⁷¹Ge, ⁷⁷As, ¹⁰³Pb, ¹⁰⁵Ph, ¹¹¹Ag, ¹¹⁹Sb, ¹²¹Sn, ¹³¹Cs, ¹⁴³Pr, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹¹Os, ^193MPt и ¹⁹⁷Hg.

Данное изобретение предусматривает также способы подавления роста опухоли у субъекта. Согласно некоторым вариантам способы включают введение субъекту, имеющему опухоль, эффективного количества описанного в данной заявке антитела или его фрагмента или его производного, содержащего определяющие комплементарность области (CDR) моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы, молочной железы, яичника, толстой кишки или прямой кишки и/или метастатическую клетку, порожденную этими опухолями, которая, возможно, экспрессирует MUC1, мутантный K-ras или и то, и другое. Согласно некоторым вариантам CDR в TAB-004 содержат один или более следующих фрагментов: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:8; CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:9; CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:10; CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID NO:11; CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID NO:12; и/или CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:5 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:4, и/или вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:7 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:6.

Что касается способов лечения, описанных в данной заявке, согласно некоторым вариантам способы включают также применение для субъекта одного или более видов противоопухолевой терапии. Согласно некоторым вариантам один или более видов противоопухолевой терапии выбраны из группы, состоящей из радиотерапии, химиотерапии, дополнительной иммунотерапии, противовоспалительной терапии и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам противовоспалительная терапия включает введение субъекту ингибитора циклооксигеназы, возможно, специфического ингибитора циклооксигеназы-2. Согласно некоторым вариантам один или более видов дополнительной противоопухолевой терапии включает введение субъекту гемцитабина (4-амино-1-(2-дезокси-2,2-дифтор-β-D-эритро-пентафуранозил)пиримидин-2(1Н)-он-2′,2′-дифтор-2′-дезоксицитидина) и целекоксиба (4-[5-(4-метилфенил)-3-(трифторметил)пиразол-1-ил]бензосульфонамида) или фармацевтически приемлемых солей любого из них или обоих.

Данное изобретение включает также способы очистки раковых стволовых клеток. Согласно некоторым вариантам эти способы включают обеспечение популяции клеток, у которых подозревают наличие раковых стволовых клеток; идентификацию субпопуляции клеток, которые связываются с антителом, его фрагментом или его производным, содержащим CDR моноклонального антитела TAB-004; и очистку этой субпопуляции. Согласно некоторым вариантам такая популяция клеток содержит циркулирующие клетки, выделенные из организма субъекта, у которого имеются опухоль и/или раковое заболевание. Согласно некоторым вариантам описанные в данной заявке способы включают также удаление клеток позитивной линии (lin⁺) из популяции клеток перед стадией идентификации и/или после стадии очистки.

Данное изобретение предусматривает также способы нацеливания активных агентов на циркулирующие раковые стволовые клетки у субъектов. Согласно некоторым вариантам эти способы включают контактирование циркулирующих раковых стволовых клеток с композицией, содержащей описанное в данной заявке антитело или его фрагмент или его производное, которые содержат CDR моноклонального антитела TAB-004 и один или более активных агентов, при этом возможно, что один или более активных агентов представляют собой терапевтический агент, в том числе химиотерапевтический агент, токсин, радиотерапевтический агент или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам терапевтический агент представляет собой иммуномодулирующий агент, при этом возможно, что иммуномодулирующий агент выбран из группы, состоящей из ингибитора индоламин 2,3-диоксигеназы (IDO), например, 1-метил- DL-триптофана (1МТ); антагониста рецептора ЕР2/ЕР4 и активатора дендритных клеток, в том числе CpG-олигонуклеотидов (CpG ODN).

Данное изобретение предусматривает также способы прогнозирования рецидивов рака у субъекта, который подвергался лечению от рака. Согласно некоторым вариантам эти способы включают выделение биологического образца, содержащего циркулирующие клетки, из организма субъекта; контактирование биологического образца с описанными в данной заявке антителами или их фрагментами и их производными в условиях, достаточных для связывания антител или их фрагментов и их производных с эпитопом, содержащимся в опухоли и/или в раковой клетке, если они имеются в биологическом образце; и идентификацию в биологическом образце одной или более циркулирующих клеток, которые связываются с указанным антителом, его фрагментом или его производным, при этом у субъекта прогнозируется рецидив. Согласно некоторым вариантам биологический образец представляет собой кровь или ее фракцию. Согласно некоторым вариантам раковое заболевание представляет собой рак поджелудочной железы или рак молочной железы. Согласно некоторым вариантам антитела, их фрагменты или их производные выбраны из группы, состоящей из моноклональных тел, продуцируемых гибридомной клеточной линией TAB-004 с номером доступа РТА-11550, которая была депонирована 16 декабря 2010 г.в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America) по условиям Будапештского договора; химерных антител или их фрагментов и их производных; человеческих антител или их фрагментов и их производных; гуманизированных антител или их фрагментов и их производных; одноцепочечных антител или их фрагментов и их производных; и фрагментов Fab, при этом химерные антитела или их фрагменты и их производные, человеческие антитела или их фрагменты и их производные, гуманизированные антитела или их фрагменты и их производные, одноцепочечные антитела или их фрагменты и их производные и фрагменты Fab содержат определяющие комплементарность области (CDR) моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам CDR моноклонального антитела TAB-004 содержат следующие аминокислотные последовательности: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:8; CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:9; CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:10; CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID NO:11; CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID NO:12; и/или CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:5 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:4, и/или вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:7 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:6.

Данное изобретение предусматривает также способы прогнозирования прогрессирования рака у субъекта. Согласно некоторым вариантам эти способы включают выделение биологического образца, содержащего циркулирующие клетки, из организма субъекта; контактирование этого биологического образца с описанным в данной заявке антителом, его фрагментом или его производным в условиях, достаточных для связывания антител или их фрагментов и их производных с эпитопом, содержащимся в опухоли и/или в раковой клетке, если они имеются в биологическом образце; и идентификацию в биологическом образце одной или более циркулирующих клеток, которые связываются с указанными антителом, его фрагментом или его производным, при этом прогнозируется прогрессирование рака у субъекта. Согласно некоторьм вариантам биологический образец представляет собой кровь или ее фракцию. Согласно некоторым вариантам раковое заболевание представляет собой рак поджелудочной железы или рак молочной железы. Согласно некоторым вариантам антитела, их фрагменты или их производные выбраны из группы, состоящей из моноклональных тел, продуцируемых гибридомной клеточной линией TAB-004 с номером доступа РТА-11550, которая была депонирована 16 декабря 2010 г. в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America) по условиям Будапештского договора; химерных антител или их фрагментов и их производных; человеческих антител или их фрагментов и их производных; гуманизированных антител или их фрагментов и их производных; одноцепочечных антител или их фрагментов и их производных; и фрагментов Fab, при этом химерные антитела или их фрагменты и их производные, человеческие антитела или их фрагменты и их производные, гуманизированные антитела или их фрагменты и их производные, одноцепочечные антитела или их фрагменты и их производные и фрагменты Fab содержат определяющие комплементарность области (CDR) моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам CDR моноклонального антитела TAB-004 содержат следующие аминокислотные последовательности: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:8; CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:9; CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:10; CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID NO:11; CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID NO:12; и/или CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:5 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:4, и/или вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:7 или кодирован нуклеиновой кислотой, молекула которой содержит SEQ ID NO:6. Согласно некоторым вариантам прогрессирование ракового заболевания представляет собой метастазирование опухолей у субъекта.

Данное изобретение предусматривает также выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, включающие любую из последовательностей SEQ ID ID NO:4 и 6, и/или кодирующие любую из последовательностей SEQ ID NO:5 и 7-13.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержится в векторе, который, согласно некоторым вариантам, представляет собой экспрессионный вектор. Согласно некоторым вариантам выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержится в экспрессионном векторе, который функционально связан с одной или более нуклеотидными последовательностями, кодирующими последовательности молекул антител таким образом, что после введения вектора экспрессии в соответствующую клетку-хозяина интактное рекомбинантное антитело, содержащее одну или более последовательностей SEQ ID NO:5 и 7-13, или его фрагмент или его производное, экспрессируется в клетке-хозяине.

Таким образом, одна из целей данного изобретения состоит в получении выделенных антител, их фрагментов или их производных, которые связываются с антигенами, находящимися в опухолях. Помимо цели данного изобретения, указанной выше и достигнутой полностью или частично при помощи композиций и способов, описанных в данной заявки, имеются и другие цели, которые станут очевидными из следующего описания и прилагаемых Фигур, которые описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигурах 1А и 1В приведен ряд микрофотографий, показывающих специфическое связывание антитела, описанного в данной заявке, с опухолями поджелудочной железы человека и мыши. Темные пятна показывают положительное связывание этого антитела с клетками, содержащимися в образце. На Фигуре 1А приведен ряд микрофотографий, показывающих специфическое связывание антитела, описанного в данной заявке, с опухолями поджелудочной железы человека на стадиях 0 (в качестве контрольного образца применялась нормальная ткань поджелудочной железы) и 2-4. На Фигуре 1В приведен ряд микрофотографий, показывающих специфическое связывание антитела, описанного в данной заявке, со спонтанными опухолями, имеющимися в поджелудочной железе трансгенных мышей в возрасте 6, 16, 26 и 34 нед, клетки которых содержат трансген человеческого MUC1 и мутацию K-ras^G12D.

На Фигурах 2А-2С приведен ряд микрофотографий, показывающих специфическое связывание антитела, описанного в данной заявке, с тканью опухоли молочной железы у человека (Фигуры 2А и 2В), но не с нормальной тканью молочной железы (Фигура 2С).

Фигура 3 показывает схематически (верхняя левая панель) подход к созданию линии трижды трансгенных мышей, которая экспрессирует фермент, Cre-рекомбиназу, по всей поверхности поджелудочной железы, мутантный полипептид онкогена K-ras и полипептид человеческого MUC1. У этой мыши развивалась аденокарцинома поджелудочной железы (панкреатическая аденокарцинома), клетки которой использовали для получения линии клеток первичной опухоли КСМ (нижняя панель). Клеточная линия КСМ использовалась для определения связывания антитела по данному изобретению (обозначенного на Фигуре как "TAB" и в данном описании как "TAB-004") или самого этого антитела, или этого антитела, связанного с CpG-олигодезоксинуклеотидами (CpG ODN). Было установлено, что и несвязанные антитела, и конъюгированные антитела связывались с клеточной линией рака поджелудочной железы КСМ с одинаковым сродством (верхняя правая панель).

На Фигурах 4А и 4В приведены графики, показывающие, что антитело по изобретению (TAB-004) повышало цитотоксичность клеток-природных киллеров (NK) в процессе гибели целевых опухолевых клеток. Соединение этого антитела с CpG ODN еще более усиливало этот эффект, тем самым показывая, что это антитело было способно усиливать противоопухолевый иммунный ответ in vivo. Фигура 4А представляет линейный график, показывающий, что антитело TAB-004 ускоряло специфический лизис опухолевых клеток линии КСМ при различном отношении эффектор (NK-клетки)-мишень (отношение Е:Т) по сравнению с отрицательным контролем (минус антитело TAB-004). На Фигуре 4В представлена гистограмма, показывающий, что соединение антитела TAB-004 с CpG ODN еще более ускоряло специфический лизис опухолевых клеток при различных отношениях Е:Т по сравнению с не присоединившимся антителом.

Фигуры 5А и 5В иллюстрируют результаты экспериментов по определению способности антитела по изобретению (TAB-004) и его конъюгатов снижать объем развившейся опухоли КСМ у трансгенных мышей с геном MUC1 (MUC1 Tg).

На Фигуре 5А приведен линейный график, показывающий величины объема опухолей (в мм, измерен с помощью штангенциркуля с цифровой индикацией) у мышей, которым вводили только физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) (отрицательный контроль, закрашенные прямоугольники), только CpG ODN (X′s), несвязанное антитело TAB-004 (незакрашенные кружочки) или конъюгат TAB-004-CpG ODN (закрашенные кружочки).

На Фигуре 5 В приведена гистограмма, показывающая изменение величины объема опухолей у мышей на 19 и 27 день после последнего введения вещества. Следует отметить, что на 19 и 27 день после последнего введения вещества величина объема опухоли у мышей, которым вводили TAB-004-CpG ODN, не увеличилась по сравнению с контрольными мышами (то есть, теми, которым вводили только PBS, только CpG ODN или только антитело TAB-004). *:p<0.5. Только PBS (отрицательный контроль; столбцы не закрашены); только CpG ODN (заштрихованные столбцы); несвязанное антитело TAB-004 (столбцы заштрихованы темными линиями); конъюгат TAB-004-CpG ODN (столбцы заштрихованы накрест),

На Фигуре 6 приведено схематическое изображение типичных композиций по изобретению и их применение. ADCC - антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность; CDC - комплемент-зависимая цитотоксичность; ADEPT - антитело-опосредованная терапия с использованием ферментов и пролекарств.

На Фигурах 7А и 7В приведены гистограммы, показывающие разделение клеток CD133⁺ (Фигура 7А) по сравнению с клетками CD24⁺/CD44⁺/EpCAM⁺ (Фигура 7В) методом флуоресцентно-активированного клеточного сортинга (FACS) и степень, до которой антитело TAB-004, описанное в данной заявке, связалось с этими популяциями. Черточки слева на каждой панели соответствуют сортингу с отрицательным контролем и черточки справа - сортингу с антителом TAB-004.

На Фигурах 8A-8D показаны диаграммы рассеяния для FACS, иллюстрирующие связывание антитела TAB-004 с клетками опухоли поджелудочной железы ("Tumor 1") и соседней нормальной ткани ("Normal") с применением антитела TAB-004 и антитела против СХС- хемокинового рецептора 4 (CXCR4). MUC1: антитело TAB-004; CXCR4: антитело против CXCR4; FL1-H: интенсивность для флуоресцентного красителя 1 (Flourescein-FITC); FL2-H: интенсивность для флуоресцентного красителя 2 (Phycoerythrin-PE); SSC-H: интенсивность бокового светорассеяния; FSC-H: интенсивность в прямом направлении рассеяния; FL4-H: интенсивность для флуоресцентного красителя 4 (Allophycocyanin-APC).

На Фигуре 8А показана диаграмма рассеяния, иллюстрирующая распределение клеток в отсутствие какого-либо антитела. На Фигуре 8В показана диаграмма рассеяния, иллюстрирующая распределение клеток, окрашенных с применением изотипического контроля. На Фигуре 8С приведен ряд графиков рассеяния, показывающих распределение клеток в нормальной ткани, окрашенных антителом TAB-004 в сравнении с антителом CXCR4. На Фигуре 8D приведен ряд графиков рассеяния, показывающих распределение клеток в ткани аденокарциномы поджелудочной железы, окрашенной антителом TAB-004 в сравнении с антителом CXCR4.

На Фигурах 9А-9С приведен ряд диаграмм рассеяния возбужденной флуоресценции сортированных клеток, которые показывают, что антитело TAB-004 по изобретению превосходит стандартное антитело ЕрСАМ при обнаружении циркулирующих опухолевых клеток у пациентов с раком поджелудочной железы. Неокрашенные клетки (самые темные линии слева); клетки, окрашенные ЕрСАМ-РЕ (0,1 мг/мл) (темно-серые линии); клетки, окрашенные антителом TAB-004 (0,1 мг/мл) (самые темные линии справа); клетки, окрашенные антителом ТАВ-004-РЕ (0,02 мг/мл) (светло-серые линии); клетки, окрашенные антителом ТАВ-004-РЕ (0,004 мг/мл) (линии серого цвета). Обозначение "-РЕ" показывает, что антитела были мечены фикоэритрином для проведения сортинга.

На Фигуре 9А показано, что клетки клеточных линий рака поджелудочной железы человека PANC-1 были обнаружены с помощью антитела ТАВ-004-РЕ. На Фигурах 9 В и 9С циркулирующие опухолевые клетки ЕрСАМ-РЕ, содержащиеся в крови двух пациентов (пациент номер 1 и пациент номер два, соответственно), обнаруживали при помощи антитела ТАВ-004-РЕ (см. самые темные линии справа на Фигуре 9В и самые черные и светло-серые линии на Фигуре 9С), но не антитела ЕрСАМ-РЕ (см. светло-серые линии на Фигурах 9В и 9С), которое применяется в настоящее время.

На Фигуре 10 приведен гистограмма сравнения характеристик антитела, специфического относительно антигена СА15-3, с антителом TAB-004 при проведении ферментного иммуноферментного анализа (EIA, ИФА) для обнаружения раковых клеток в плазме крови. Прямоугольники белого цвета: антитело TAB-004. Прямоугольники с линиями черного цвета: антиген СА15-3. Пунктирная линия: нормальное пороговое значение TAB-004; точечная линия: нормальное пороговое значение антигена СА15-3.

На Фигуре 11 приведена гистограмма сравнения поведения TAB-004 при проведении ферментного иммуноферментного анализа (EIA) для определения уровней выделившихся клеток MUC1 в плазме крови у больных раком поджелудочной железы в зависимости от стадии в сравнении с данными EIA на основе СА15-3. Прямоугольники белого цвета: антитело TAB-004. Заштрихованные прямоугольники: антиген СА15-3.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 является аминокислотной последовательностью гена MUC1 человека. Она соответствует номеру доступа ААА60019 в банке данных GENBANK®.

SEQ ID NO:2 является аминокислотной последовательностью онкогена K-ras человека. Она соответствует номеру доступа NP_004976 в банке данных GENBANK®.

SEQ ID NO:3 является аминокислотной последовательностью пептида, с которым антитело TAB-004, описанное в данной заявке, может связываться при проведении анализа ELISA. Этот пептид включает эпитоп, с которым специфически связывается антитело TAB-004.

SEQ ID NO:4 и 5 представляют собой нуклеотидную и кодированную аминокислотные последовательности, соответственно, тяжелой цепи антитела TAB-004, описанного в данной заявке.

SEQ ID NO:6 и 7 представляют собой нуклеотидную и кодированную аминокислотные последовательности, соответственно, легкой цепи антитела TAB-004, описанного в данной заявке.

SEQ ID NO:8-10 представляют собой аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, в тяжелой цепи антитела TAB-004, описанного в данной заявке.

SEQ ID NO:11-13 представляют собой аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, в легкой цепи антитела TAB-004, описанного в данной заявке.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение будет описано более подробно ниже со ссылкой на прилагаемые Фигуры и ПРИМЕРЫ, в которых описаны репрезентативные варианты данного изобретения. Однако данное изобретение может быть осуществлено в различных формах и не ограничивается описанными в данной заявке вариантами. Эти варианты представлены таким образом, чтобы специалистам в данной области было ясно, что описание изобретения является полным и отражает объем данного изобретения

I. Определения

Терминология, используемая в данном описании, предназначена только для описания конкретных вариантов данного изобретения и никоим образом не ограничивает объем изобретения.

Несмотря на то, что следующие термины считаются понятными для специалистов, ниже даны определения этих терминов для облегчения объяснения данного изобретения.

Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

Несмотря на то, что следующие термины считаются хорошо известными специалистам, ниже даны определения этих терминов для облегчения объяснения данного изобретения.

Следует иметь в виду, что при описании данного изобретения приводится ряд методов и стадий. Каждый из них имеет свое преимущество и может быть также использован в сочетании с одним или более, а в некоторых случаях со всеми, другими описанными методами.

Соответственно, для ясности, в данном описании не повторяются все возможные комбинации отдельных стадий. Тем не менее, описание и формулу изобретения следует понимать таким образом, что такие комбинации полностью охвачены данным изобретением.

По давно сложившейся практике в области патентного законодательства термины в единственном числе, содержащиеся в данной заявке, включая формулу изобретения, относятся к "одному или более". Например, термин "антитело", применяемый в данной заявке относится к одному или более антителам, включая совокупность одного и того же антитела. Точно так же термин "по меньшей мере", относящийся к какому-либо элементу, относится, например, к 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 или более таким элементам, включая, но без ограничения, целые численные величины между 1 и 100 и более 100.

Если иное не указано, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции и т.п., применяемые в данном описании и в формуле изобретения, во всех случаях следует понимать как модифицированные за счет применения термина "примерно". Термин "примерно", используемый в данной заявке, относящийся к измеримой величине, такой как величина массы, веса, времени, объема, концентрации или процентного содержания, по некоторым вариантам охватывает изменения в пределах ±20%, по некоторым вариантам в пределах ±10%, по некоторым вариантам в пределах ±5%, по некоторым вариантам в пределах ±1%, по некоторым вариантам в пределах ±0,5% и по некоторым вариантам в пределах ±0,10%, от указанного количества, так как такие колебания допустимы при осуществлении описанных в данной заявке способов и/или при составлении описанных композиций. Соответственно, если не указано иное, численные параметры, указанные в данном описании и в формуле изобретения, являются приблизительными величинами, которые могут меняться в зависимости от желаемых свойств, которые должны быть получены при осуществлении данного изобретения.

Применяемый в данной заявке термин "и/или", используемый в контексте перечня элементов, относится к элементам, которые используются в отдельности или в комбинации. Так, например, выражение "А, В, С и/или D" включает А, В, С и D в отдельности, но также включает любую или все комбинации и подкомбинации А, В, С, и D.

Термин "охватывающий", который является синонимом терминов "включающий", "содержащий" или "характеризующийся", является охватывающим термином или ничем не ограниченным термином и не исключает дополнительных, не упомянутых элементов и/или стадий способов. Термин "содержащий" является специальным термином, который означает, что применяются указанные элементы и/или стадии способа, но могут быть добавлены другие элементы и/или стадии способа и они будут входить в объем данного изобретения.

Используемое выражение "состоит из" исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не упомянутые конкретно. Следует отметить, что когда выражение "состоит из" применяется в каком-либо пункте формулы изобретения, оно ограничивает только элемент, указанный в этом пункте; другие элементы не исключаются из формулы изобретения в целом.

Применяемое выражение "состоит по существу из" ограничивает объем соответствующего описания или соответствующего пункта формулы изобретения конкретными материалами и/или стадиями плюс такие материалы и стадии, которые не оказывают влияния на основные и новые характеристики описанного и/или заявленного объекта изобретения. Например, фармацевтическая композиция может "состоять по существу из" фармацевтически активного агента или совокупности фармацевтически активных агентов, что означает, что указанный фармацевтически активный агент (агенты) является (являются) единственными фармацевтически активными агентами, содержащимися в фармацевтической композиции. Однако следует отметить, что носители, эксципиенты и/или другие неактивные агенты могут содержаться и, скорее всего, будут содержаться в такой фармацевтической композиции.

Что касается терминов "содержащий", "состоящий из" и "состоящий по существу из", то, когда в данной заявке используется один из этих трех терминов, данное изобретение может включать применение любого из двух других терминов. Например, согласно некоторым вариантам данное изобретение относится к композициям, содержащим антитела. Средний специалист в данной области после просмотра данного описания будет иметь в виду, что настоящее изобретение охватывает композиции, которые состоят по существу из антител по изобретению, а также композиции, которые состоят из антител по изобретению.

Термин "субъект", применяемый в данной заявке, относится к представителю любых видов беспозвоночных и позвоночных животных. Соответственно, термин "субъект" согласно некоторым вариантам охватывает любого представителя "царства" животных, включая, но без ограничения, хордовых животных (например, членов классов Osteichythyes (костные рыбы). Amphibia (земноводные), Reptilia (рептилии), Aves (птицы) и Mammalia (млекопитающие) и все подклассы и семейства, охватываемые этими классами.

Композиции и способы по данному изобретению используются в особенности для теплокровных позвоночных животных. Так, согласно некоторым вариантам данного изобретения оно касается млекопитающих и птиц. Более конкретно, данное изобретение предусматривает композиции и способы, предназначенные для таких млекопитающих, как люди и другие приматы, а также для таких важных млекопитающих, как животные, находящиеся под угрозой исчезновения (например, сибирские тигры), животные, имеющие экономическое значение (животные, выращиваемые на фермах для потребления людьми) и/или животные, имеющие социальное значение для людей (домашние животные или животные в зоопарках), например, плотоядные животные, отличные от людей (такие как кошки и собаки), свиньи (поросята, боровы и дикие кабаны), жвачные животные (такие как крупный рогатый скот, быки, овцы, жирафы, олени, козы, бизоны и верблюды), грызуны (такие как мыши, крысы и кролики), сумчатые и лошади. Предусмотрено также применение описанных в данной заявке способов и композиций для птиц, включая те виды птиц, которые находятся под угрозой исчезновения, содержатся в зоопарках, а также домашних птиц, например, дичи, такой как индейки, цыплята, утки, гуси, цесарки и т.п., так как они тоже имеют экономическое значение для людей. Предусмотрено также применение описанных в данной заявке способов и композиций для домашнего скота, включая, но без ограничения, одомашненных свиней (свиноматок и боровов), жвачных животных, лошадей, дичь и т.п.

Точно так же все гены, названия генов и генные продукты, описанные в данной заявке, соответствуют гомологам и/или ортологам любых видов, для которых применимы способы и композиции по изобретению. Таким образом, эти термины включают, но без ограничения, гены и продукты генов людей и мышей. Следует понимать, что когда описывается ген или продукт гена, это описание приводится только для примера и его нельзя интерпретировать как ограничивающее, если только из контекста, в котором оно приведено, не следует иное. Так, например, в случае генов, представленных в GENBANK® под номерами доступа ААА60019 и NP_004976, описанные аминокислотные последовательности человека охватывают гомологичные гены и продукты генов других животных, включая, но без ограничения, других млекопитающих, рыб, земноводных, рептилий и птиц. Охватываются также любая и все нуклеотидные последовательности, которые кодируют описанные аминокислотные последовательности, включая, но без ограничения, описанные в соответствующих данных GENBANK® (а именно, J05582.1 и NM_004985, соответственно).

Термины "рак" и "опухоль" используются как взаимозаменяемые и могут относиться как к первичным, так и метастазированным твердым опухолям и карциномам любой ткани субъекта, включая, но без ограничения, ткани молочной железы, толстой кишки, прямой кишки, легкого, ротовой части глотки, гортанной части глотки; пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря, желчных протоков, тонкой кишки; мочевого тракта, включая почку, мочевой пузырь и уротелий; полового тракта женщин, включая шейку матки, матку, яичники (например, хориокарциному и гестационную трофобластическую болезнь); мужского полового тракта, включая простату, семенной пузырек, яички и половые клетки; эндокринные железы, включая щитовидную железу, надпочечную железу и гипофиз; кожу (например, гемангиомы и меланомы), костные или мягкие ткани; кровеносные сосуды (например, саркома Калоши); мозг, нервы, глаза и оболочку головного мозга (например, астроцитомы, глиомы, ретинобластомы, невромы, нейробластомы, шванномы и менингиомы). Применяемые в данной заявке термины "рак" и "опухоль" относятся также к многоклеточным опухолям, а также к отдельным неопластическим или пренеопластическим клеткам. Согласно некоторым вариантам опухоль представляет собой рак или опухоль эпителиальной ткани, такую как, но без ограничения, карцинома. В некоторых случаях опухоль представляет собой аденокарциному, являющуюся согласно некоторым вариантам аденокарциномой поджелудочной железы, молочной железы, яичника, толстой кишки или прямой кишки и/или метастатическую клетку аденокарциномы.

Применяемый при описании молекул термин "эффектор" относится к любой молекуле или комбинации молекул, активность которых желательно доставить в клетку и/или локализовать в клетке. Эффекторы включают, но без ограничения, метки, цитотоксины, ферменты, факторы роста, факторы транскрипции, лекарства и т.д.

Применяемый при описании клеток термин "эффектор" относится к клетке иммунной системы, которая может быть индуцирована для выполнения специфической функции, связанной с иммунным ответом на раздражитель. Примеры эффекторных клеток включают, но без ограничения, природные клетки-киллеры (NK) и цитотоксичные Т-клетки (T_c-клетки).

Применяемый в данной заявке термин "экспрессионный вектор" относится к последовательности ДНК, способной направлять экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующую клетку хозяина, содержащую промотор, функционально связанный с нужной нуклеотидной последовательностью, которая функционально связана с сигналами терминации. Он также обычно включает последовательности, которые требуются для нужной трансляции нуклеотидной последовательности. Конструкция, содержащая представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть химерной. Конструкция также может иметь природное происхождение, но быть получена в рекомбинантной форме, подходящей для гетерологичной экспрессии. Согласно некоторым вариантам экспрессионный вектор включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, которая по некоторым вариантам содержит любую последовательность, выбранную из SEQ ID ID NO:4 и 6 или кодирует любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:5 и 7-13. Согласно некоторым вариантам выделенная молекула нуклеиновой кислоты, находящаяся в экспрессионном векторе, функционально связана с одной или более дополнительными нуклеотидными последовательностями, кодирующими подпоследовательности молекул антител таким образом, что после введения вектора экспрессии в соответствующего хозяина, интактное рекомбинатное антитело, содержащее одну или более последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:5 и 7-13, или их фрагмент или их производное, экспрессируется в клетке-хозяине.

Применяемый в данной заявке термин "гибридома" относится к клетке или клеточной линии, которая продуцируется в лаборатории в результате слияния антитело-продуцирующего лимфоцита и не антитело-продуцирующей раковой клетки, обычно клетки миеломы или лимфомы. Как хорошо известно среднему специалисту в данной области, гибридома может пролиферировать и продуцировать непрерывно специфическое моноклональное антитело. Способы получения гибридом хорошо известны в уровне техники (см., например, Harlow & Lane, 1988).

Применяемый в данной заявке термин "функционально связанные" относится к транскрипционным регулирующим элементам (таким как, но без ограничения, промоторные последовательности, последовательности терминации транскрипции и т.д.), которые соединены с нуклеотидной последовательностью (например, кодирующей последовательностью или с открытой рамкой считывания) таким образом, что транскрипция нуклеотидной последовательности контролируется и регулируется этим регуляторным элементом, регулирующим транскрипцию. Подобным образом говорится, что нуклеотидная последовательность находится под "транскрипционным контролем" промотора, с которым она функционально связана. Методы функционального связывания участка промотора с нуклеотидной последовательностью известны из уровня техники.

Применяемый в данной заявке термин "пролекарство" относится к аналогу и/или предшественнику лекарства (например, к цитотоксическому агенту), у которого по существу отсутствует биологическая активность лекарства (например, цитотоксическая активность), пока он не подвергнется стадии активации. Стадии активации могут включать ферментативное расщепление, стадии химической активации, такие как действие восстановителя, и/или стадии физической активации, такие как фотолиз. В некоторых случаях активация происходит in vivo в организме субъекта.

II Антитела и их фрагменты и их производные и способы их получения

II.А. Общие положения

Данное изобретение согласно некоторым вариантам предусматривает выделенные антитела, а также их фрагменты и производные, которые связываются с антигенами, находящимися в опухолях, такими как, но без ограничения, антигены, находящиеся в MUC1 полипептидах.

Применяемые в данной заявке термины "антитело" и "антитела" относятся к белкам, содержащим один или более полипептидов, по существу кодируемых генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов. Гены иммуноглобулинов обычно включают гены каппа (κ), лямбда (λ), альфа (α), гамма (γ), дельта (δ), эпсилон (ε), и мю (µ) константной области, а также десятки тысяч генов вариабельной области иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируются как κ или λ. У млекопитающих тяжелые цепи классифицируются как γ, µ, α, δ или ε, что в свою очередь определяет классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Другие виды имеют другие гены легких и тяжелых цепей (например, некоторые птицы продуцировали иммуноглобулин, называемый IgY, являющийся типом иммуноглобулина, который куры откладывают в желтках их яиц), которые также охвачены данным изобретением.

Согласно некоторым вариантам термин "антитело" относится к антителу, которое специфически связывается с эпитопом, находящийся на опухолевом антигене, включая, но без ограничения, MUC1 полипептид и/или мутантный K-ras полипептид. Согласно некоторым вариантам термин "антитело" относится к антителу, которое специфически связывается с эпитопом, который находится в любой из последовательностей SEQ ID NO:1-3.

Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела), как известно, представляет собой тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну "легкую" цепь (средний молекулярный вес равен примерно 25 килодальтон (кДа) и одну "тяжелую" цепь (средний молекулярный вес равен примерно 50-70- кДа). Две идентичные пары полипептидных цепей удерживаются вместе в димерной форме при помощи дисульфидных связей, которые содержатся в тяжелой цепи. N-конец каждой цепи определяет вариабельную область из примерно 100-110 или более аминокислот, ответственных главным образом за распознавание антигена (она иногда называется "паратопом"). Названия "вариабельная область легкой цепи (V_L)" и "вариабельная область тяжелой цепи (V_H)" относятся к этим легким и тяжелым цепям, соответственно.

Антитела обычно существуют как интактные иммуноглобулины или как ряд хорошо охарактеризованных фрагментов, которые могут быть получены при расщеплении различными пептидазами. Например, расщепление молекулы антитела папаином происходит на участке у N-конца около дисульфидных связей. При этом образуются три фрагмента: два идентичных фрагмента "Fab", которые содержат легкую цепь и N-конец тяжелой цепи, и фрагмент "Fc", который включает С-концы тяжелых цепей, удерживаемых дисульфидными связями.

Пепсин, с другой стороны, расщепляет С-конец антитела около дисульфидной связи в шарнирной области с получением фрагмента, известного как "F(ab)′₂", фрагмента, который представляет собой димер фрагментов Fab, соединенных дисульфидной связью. Фрагмент F(ab)′₂ может быть восстановлен в мягких условиях для разрыва дисульфидной связи в шарнирной области, при этом димер F(ab)′₂ превращается в два мономера "Fab′". Мономер "Fab′" практически является фрагментом Fab с частью шарнирной области (см., Paul, 1993, для более подробного описания других фрагментов антитела). Что касается этих различных фрагментов, фрагменты Fab, F(ab′)₂ и Fab′ включают по меньшей мере один интактный антиген-связываюший домен (паратоп) и, таким образом, способны связываться с антигенами.

В то время как различные фрагменты антител описаны в данной заявке как продукты расщепления интактного антитела, специалист в данной области знает, что эти различные фрагменты (включая, но без ограничения, фрагменты Fab′) могут быть синтезированы de novo или химическим путем, или путем применения рекомбинантной ДНК. Таким образом, термин "антитело", применяемый в данной заявке, включает также фрагменты антител, полученные путем модификации целых антител и/или путем синтеза de novo с применением рекомбинантной ДНК. Согласно некоторым вариантам термин "антитело" охватывает фрагмент, который содержит по меньшей мере один антиген-связываюший домен (паратоп).

Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Применяемый в данной заявке термин "поликлональные" относится к антителам, которые находятся вместе в данной коллекции антител и которые получены из разных антителопродуцирующих клеток (например. В-клеток). Примеры поликлональных антител включают, но без ограничения, такие антитела, которые связываются с конкретным антигеном и находятся к крови животного после того, как животное дает иммунный ответ на антиген. Однако очевидно, что поликлональные антитела могут быть также приготовлены искусственно путем смешения по меньшей мере двух не идентичных антител. Таким образом, поликлональные антитела обычно включают различные антитела, которые направлены против (то есть связываются с ними) одинаковых и/или разных эпитопов (иногда называемых "антигенной детерминантой" или просто "детерминантой" любого данного антигена).

Применяемый в данной заявке термин "моноклональное антитело" относится к одному виду антител и/или к по существу гомогенной популяции антител одного вида. Или же иначе можно сказать, что термин "моноклональные антитела" относится к отдельным антителам или популяции отдельных антител, в которой антитела идентичны по специфичности и сродству, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут содержаться в небольших количествах. Обычно моноклональное антитело (mAb или moAb) генерируется одной В-клеткой или ее потомком (хотя данное изобретение также охватывает "моноклональные антитела", которые получаются методами молекулярной биологии, описанными в данном описании). Моноклональные антитела (mAb или moAb) обладают высокой специфичностью, которая обычно направлена против одного сайта антигена. Кроме того, по контрасту с поликлональными антителами данное антитело mAb обычно направлено против одного эпитопа антигена.

Помимо их специфичности антитела mAbs могут быть предпочтительны для некоторых целей, потому что они могут быть получены незагрязненными другими антителами. Однако термин "моноклональное" не следует понимать как определение, требующее получения антитела любым конкретным способом. Например, согласно некоторым вариантам mAbs по изобретению получаются с использованием гибридом, впервые описанных Kohler et al., 1975, и согласно некоторым вариантам они получаются с помощью рекомбинантной ДНК в клетках прокариот или эукариот (см., например, патент США №4,816,567, полное содержание которого включено в данную заявку посредством отсылки). Антитела mAbs могут быть также выделены из фаговых библиотек антител способами, описанными, например, Clackson et al., 1991 and Marks et al., 1991.

Антитела, их фрагменты и их производные по данному изобретению могут также включать химерные антитела. Применяемый здесь в связи с антителами термин "химерные" и грамматические варианты этого термина относятся к производным антител, которые имеют константные области, полученные практически или исключительно из константных областей антител одного вида, и вариабельные области, полученные практически или исключительно из последовательности вариабельной области антител другого вида.

Вариабельные области позволяют антителу селективно распознавать и специфически связывать эпитопы антигенов. То есть, домен V_L и домен V_H или подклассы областей, определяющих комплементарность (CDR) в указанных вариабельных областях антитела, соединяются с образованием вариабельного участка, который определяет трехмерный антиген- связывающий сайт.

Эта четвертичная структура антитела образует антиген- связывающий сайт, находящийся на конце каждого плеча антитела. Более конкретно, антиген- связывающий сайт определяется тремя CDR в каждой из цепей V_H и V_L. В некоторых случаях (например, в молекулах некоторых иммуноглобулинов, полученных из семейства верблюдовых или сконструированных на основе камелидных доменов) полная молекула иммуноглобулина может состоять только из тяжелых цепей и не содержит легких цепей (см., например, Hamers-Casterman et al., 1993).

В природных антителах имеются шесть CDR, находящихся в каждом антиген-связывающем домене, которые представляют собой короткие, не являющиеся смежными последовательности аминокислот, которые специфически расположены с образованием антиген-связывающего домена, так как антитело принимает трехмерную конфигурацию в водной среде. Остальные аминокислоты в антиген- связывающих доменах, называемые "каркасными" областями, характеризуются меньшей внутримолекулярной вариабельностью. Каркасные области часто принимают β-складчатую конформацию и CDR образуют петли, которые соединяют и, в некоторых случаях, образуют часть β-складчатой структуры. Таким образом, каркасные области образуют остов, который обеспечивает расположение CDR в правильной ориентации за счет внутрицепных нековалентных взаимодействий. Антиген- связывающий домен, образованный ориентированными CDR, определяет поверхность, которая комплементарна эпитопу иммунореактивного антигена. Эта комплементарная поверхность ускоряет нековалентное связывание антитела с его когнатным эпитопом. Аминокислоты, составляющие CDR и каркасные области, соответственно, могут быть легко проидентифицированы специалистом в данной области для каждой данной вариабельной области тяжелой и легкой цепи, так как они были точно определены (см., например, Chothia & Lesk, 1987; Kabat et al., 1991; Martin, 1996; Johnson & Wu, 2000).

Особым видом химерного антитела является "гуманизированное" антитело, когда антитела получаются, например, путем замены CDR мышиного антитела на CDR человеческого антитела (см., например международную заявку № WO 1992/22653). Таким образом, согласно некоторым вариантам гуманизированное антитело содержит константные области и вариабельные области, отличающиеся от CDR, которые получены по существу или исключительно из соответствующих областей млекопитающего, не являющегося человеком.

Антитела, фрагменты и производные согласно данному изобретению могут также быть одноцепочечными антителами и одноцепочечными фрагментами антител. Одноцепочечные фрагменты антител включают аминокислотные последовательности, содержащие по меньшей мере одну из вариабельных областей и/или CDR полных (нормальных) антител, описанных в данной заявке, но в них отсутствуют некоторые или все константные области этих антител. Эти константные области не являются необходимыми для связывания с антигенами, но они составляют основную часть структуры полных антител. Одноцепочечные фрагменты антител могут решить некоторые из проблем, связанных с применением антител, содержащих часть константных областей или все константные области. Например, одноцепочечные фрагменты антител стремятся освободиться от нежелательных взаимодействий между биологическими молекулами и константной областью тяжелой цепи и/или от других нежелательных видов биологической активности. Кроме того, одноцепочечные фрагменты антител по размеру значительно меньше, чем полные антитела и поэтому могут характеризоваться большей капиллярной проницаемостью, чем полные антитела, что позволяет одноцепочечным фрагментам антител локализовываться и связываться более эффективно с целевыми антиген-связывающими сайтами. Далее, фрагменты антител могут получаться в большем масштабе в клетках прокариот, что облегчает их продуцирование. Кроме того, относительно небольшой размер одноцепочечных фрагментов антител по сравнению с полными антителами делает менее вероятным провоцирование иммунного ответа у реципиента. Одноцепочечные фрагменты антител согласно данному изобретению включают, но без ограничения, одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) антител и их производные, такие как, но без ограничения, тандемные ди-scFv, тандемные три-scFv, диатела, триатела, тетратела, "мини-антитела" и "мини-тела".

Фрагменты Fv соответствуют вариабельным фрагментам N-концевых участков тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Оказалось, что фрагменты Fv обладают меньшей энергией взаимодействия их двух цепей по сравнению с фрагментами Fab. Для стабилизации ассоциации областей V_H и V_L они могут быть связаны с пептидами (см., например, Bird et al., 1988; Huston et al., 1988) дисульфидными мостиками (см., например, Glockshuber et al., 1990) и/или мутациями типа "выступ-во-впадину" (см., например, Zhu et al., 1997). Фрагменты ScFv могут быть получены способами, которые хорошо известны специалистам в данной области (см., например. Whitlow et al., 1991; Huston et al., 1993).

scFv могут быть получены в бактериальных клетках, таких как Е. Coli, или в эукариотных клетках. Одним недостатком scFv является одновалентность продукта, которая может препятствовать повышенной авидности антител из-за поливалентного связывания и короткого времени их полужизни. Попытки преодолеть эти недостатки включают бивалентные (scFv′)₂, полученные из scFv, содержащих дополнительные цистеиновые остатки в С-концевой области, путем химического связывания (см., например, Adams et al., 1993; McCartney et al., 1995) или путем спонтанной сайт-специфической димеризации scFv, которые содержат неспаренные С-концевые цистеиновые остатки (см., например, Kipriyanov et al., 1995).

Или же, альтернативно, можно заставить scFv образовать мультимеры путем укорачивания пептидного линкера до 3-12 остатков с получением "диател" (см., например, Holliger et al., 1993). Дальнейшее уменьшение размера линкера может привести к образованию тримеров scFv ("триател"; см., Kortt et al., 1997) и тетрамеров ("тетрател"; см., например, Le Gall et al., 1999). Создание бивалентных молекул scFv может быть также достигнуто путем генетического слияния с димеризующими мотивами белка с образованием "мини-антител" (см., например, Pack et al., 1992) и "мини-тел" (см.. например, Hu et al., 1996). Тандемы scFv-scFv ((scFv)₂) могут быть получены путем связывания двух единиц scFv третьим пептидным линкером (см., например, Kurucz et al., 1995).

Согласно данному изобретению биспецифические диатела могут быть получены с помощью нековалентного связывания двух одноцепочечных продуктов слияния, состоящих из домена V_H одного антитела, соединенного коротким линкером с доменом V_L другого антитела (см., например, Kipriyanov et al., 1998). Стабильность таких биспецифических диател может быть повышена при введении дисульфидных мостиков или мутаций типа "выступ-во-впадину", как описано выше, или путем образования одноцепочечных диател (scDb), где два гибридных фрагмента scFv соединены пептидным линкером (см., например, Kontermann et al., 1999).

Тетравалентные биспецифические молекулы могут быть получены, например, путем слияния фрагмента scFv с СН₃-доменом молекулы IgG или с фрагментом Fab с помощью шарнирного участка (см., например, Coloma et al., 1997). Альтернативно, тетравалентные биспецифические молекулы были созданы путем слияния биспецифических одноцепочечных диател (см., например, Alt et al., 1999). Тетравалентные биспецифические молекулы меньшего размера могут быть также образованы путем димеризации любых тандемов scFv-scFv с линкером, содержащим мотив спираль-петля-спираль (мини-антитела DiBi; см., например, Shalaby et al., 1992; Kostelny et al., 1992). Доступными являются также выделенные домены V_H и V_L (см, патенты США №№6,172,197; 6,248,516; и 6,291,158).

Данное изобретение охватывает также функциональные эквиваленты антител по изобретению. Применяемый в данной заявке термин "функциональный эквивалент", когда он относится к антителу, означает молекулу, которая имеет характеристики связывания, сравнимые с характеристиками связывания данного антитела. Согласно некоторым вариантам химерные, гуманизированные и одноцепочечные антитела, а также их фрагменты рассматриваются как функциональные эквиваленты соответствующих антител, на которых они основаны. Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает функциональные эквиваленты mAb TAB-004, описанного в данной заявке. Функциональные эквиваленты включают также полипептиды с аминокислотными последовательностями, которые являются по существу такими же, как аминокислотная последовательность вариабельных или гипервариабельных областей антител по изобретению. Используемый в данной заявке в отношении последовательностей нуклеиновой кислоты и/или аминокислот термин "по существу такие же" относится к биологическим последовательностям со степенью идентичности равной, согласно некоторым вариантам, по меньшей мере 80%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 85%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере примерно 90%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 91%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 92%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 93%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 94%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 95%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 96%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 97%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 97%, согласно некоторым вариантам по меньшей мере 98% и согласно некоторым вариантам по меньшей мере примерно 99%, по отношению к последовательности другой нуклеиновой кислоты и/или другой аминокислоты, как определено методом поиска FASTA в соответствии с Pearson & Lipman, 1988. Согласно некоторым вариантам определение степени идентичности осуществляется на основе полной длины последовательности нуклеиновой кислоты и/или аминокислоты антитела по изобретению.

Согласно некоторым вариантам функциональный эквивалент нуклеотидной последовательности представляет собой последовательность, которая кодирует ту же самую аминокислотную последовательность (то есть, последовательность, которая включает один или более функционально эквивалентных кодонов). Перечень функционально эквивалентных кодонов представлен в Таблице 1.

Таблица 1
Функционально эквивалентные кодоны
Аминокислота	Кодоны
Аланин (Ala или A)	GCA; GCC; GCG; GCU
Цистеин (Cys или C)	UGC; UGU
Аспартовая кислота (Asp или D)	GAC; GAU
Глутаминовая кислота (Glu или E)	GAA; GAG
Фенилаланин (Phe или F)	UUC; UUU
Глицин (Gly или G)	GGA; GGC; GGG; GGU
Гистидин (His или H)	CAC; CAU
Изолейцин (Ile или I)	AUA; AUC; AUU

Лизин (Lys или K)	AAA;AAG
Метионин (Met или M)	AUG
Аспарагин (Asn или N)	AAC;AAU
Пролин (Pro или P)	ССА; ССС; CCG; CCU
Глутамин (Gln или Q)	САА; CAG
Треонин (Thr или T)	АСА; АСС; ACG; ACU
Валин (Val или V)	GUA; GUC; GUG; GUU
Триптофан (Trp или W)	UGG
Тирозин (Tyr или Y)	UAC; UAU
Лейцин (Leu или L)	UUA; UUG; CUA; CUC; CUG; CUU
Аргинин (Arg или R)	AGA; AGG; CGA; CGC; CGG; CGU
Серии (Ser или S)	ACG; AGU; UCA; UCC; UCG; UCU

Согласно некоторым вариантам данного изобретения функциональный эквивалент данной аминокислотной последовательности представляет собой аминокислоту с одной или более консервативными аминокислотными заменами. Консервативными аминокислотными заменами являются замены одной аминокислоты другой аминокислотой того же класса (например, валин заменяется глицином или аргинин заменяется лизином). Полипептиды, которые функционально эквивалентны проурогуанилину и/или фрагментам проурогуанилина, могут быть получены с применением случайного мутагенеза к кодирующим нуклеиновым кислотам по методикам, хорошо известным специалистам в данной области. Однако более вероятно, что такие полипептиды будут получаться путем сайт- направленного мутагенеза (опять-таки с применением методик, хорошо известных специалистам в данной области). Такие полипептиды имеют повышенную функциональную активность или пониженную функциональную активность.

Функциональные эквиваленты могут также включать фрагменты антител, которые обладают теми же самыми или сравнимыми характеристиками связывания, что и полные антитела по изобретению. Такие фрагменты могут содержать один или оба фрагмента Fab, фрагмент F(ab′), фрагмент Fv или любой другой фрагмент, который включает по меньшей мере один антиген-связывающий домен. Согласно некоторым вариантам фрагменты антител содержат все шесть CDR полного антитела по изобретению (например, CDR, содержащие каждую из последовательностей SEQ ID NO:8-13), хотя фрагменты, содержащие не все такие области, а меньше, например, три, четыре или пять CDR, также могут быть функциональными эквивалентами по определению, рассмотренному в данной заявке. Кроме того, функциональные эквиваленты могут быть членами любого из следующих классов и подклассов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, или представлять собой сочетание этих иммуноглобулинов, другие подклассы также могут подходить для не млекопитающих (например, IgY для цыплят и птиц).

Функциональные эквиваленты могут также включать аптамеры и другие молекулы не-антител, при условии, что такие молекулы имеют такие же или сравнимые характеристики связывания, что и целое антитело по изобретению.

Согласно некоторым вариантам антитела, их фрагменты и производные выбираются из группы, состоящей из моноклонального антитела TAB-004, продуцируемого гибридомной клеточной линией АТСС No.РТА-11550, а также химерных антител или их фрагментов и их производных, гуманизированных антител или их фрагментов и их производных, одноцепочечных антител или их фрагментов и их производных, их фрагментов Fab, их фрагментов F(ab′)₂, их фрагментов Fv и их фрагментов Fab′. Согласно некоторым вариантам данного изобретения антитела, их фрагменты и их производные имеют характеристики связывания моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам данного изобретения антитела, их фрагменты и производные обладают по меньшей мере некоторыми и в некоторых случаях всеми характеристиками связывания моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам данного изобретения антитела, их фрагменты и их производные связываются с эпитопом, находящимся в любой из последовательностей SEQ ID NO:1-3, согласно другим вариантам - с эпитопом, находящимся в последовательности SEQ ID NO:3.

Применяемый в данной заявке термин "TAB-004" относится к моноклональному антителу (mAb), которое продуцируется гибридомой под названием "TAB-004", которая была депонирована в American Type Culture Collection (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America, 16 декабря 2010 г.под номером No. PTA-11550 по условиям Будапештского договора. TAB-004 представляет собой mAb изотипа IgG, которое, как было обнаружено, связывается с эпитопом, находящимся в полипептиде муцина-1 человека (MUC1). Более конкретно, согласно некоторым вариантам TAB-004 может связываться с эпитопом, находящимся в последовательности SEQ ID NO:3. Антитело TAB-004 само содержит последовательности CDR, находящиеся в SEQ ID NO:8-13.

Применяемое в данной заявке обозначение "MUC1" относится к молекуле, определение которой дается ниже. "MUC1" представляет собой одну из молекул семейства эпителиальных муцинов. MUC1 экспрессируется в большом числе эпителиальных раковых клеток и аберрантно гликозилирован, что делает его отличным по структуре и антигенным свойствам от MUC1, который экспрессируется в клетках доброкачественных опухолей (см., например, Barratt-Boyes, 1996; Price et al., 1998; Peterson et al., 1991). Доминантная форма MUC1 представляет собой молекулу с высоким молекулярным весом, состоящую из большого, иммуногенного в высокой степени, внеклеточного муциноподобного домена с большим количеством тандемных повторов двадцати аминокислот, трансмембранной области и цитоплазматического хвоста (Quin et al., 2000; McGucken et al., 1995; Dong et al., 1997).

MUC1 является сверхэкспрессированным и аберрантно гликозилированным в большей части эпителиальных аденокарцином, включая аденокарциномы молочной железы и поджелудочной железы. Аденокарциномы молочной железы и поджелудочной железы не только сверхэкспрессируют MUC1, но также "выбрасывают" MUC1 в кровоток. Высокие уровни MUC1 в сыворотке крови связаны с развитием заболевания. MUC1 использовали как перспективный биомаркер благодаря комплексной и гетерогенной природе эпитопов, экспрессированных внутри антигена. MUC1, синтезированный раковыми тканями, обычно проявляет аберрантный олигосахаридный профиль, который вызывает экспрессию неомаркеров, таких как sialyl-Lea (определяется при помощи теста СА19-9), sialyl-Lex и sialyl-Tn (TAG-72), а также криптических эпитопов, таких как Tn. Кроме того, из-за недостаточного гликозилирования пептидное ядро муцина становится таким, что эпитопы внутри ядра, которое внутри нормального тканевого MUC1 является недоступным, могут служить как потенциальные биомаркеры. Таким образом, различие между нормальными и злокачественными тканями может привести к появлению различных эпитопов, которые могут обладать высокой степенью специфичности по отношению к злокачественным тканям. В настоящее время для использования в терапии известны промышленные тесты для некоторых из этих эпитопов, включая тесты СА15-3 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinoise, United States of America), CA 27-29 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, New York, United States of America) и СА19-9 (Panomics Inc, Redwood City, California, United States of America). Однако до сих пор ни один из этих тестов не оказался имеющим значение для диагностирования, вероятно, по меньшей мере частично, из-за низкой степени специфичности, как показано в Таблице 2.

Таблица 2
Методы анализа, применяемые для оценки сверхэкспрессии MUC1 в различных тканях*
Название теста	Раковые заболевания со сверхэкспрессией MUC1	Доброкачественные заболевания со сверхэкспрессией MUC1
CA15-5	Рак молочной железы, легкого, яичника,	Заболевания печени (цирроз, гепатит), саркоидальная волчанка, туберкулез,
	эндометриоз, рак мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта	доброкачественные повреждения молочной железы
СА19-9	Рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак печени, желудка и желчных протоков	Заболевания поджелудочной железы, язвенный колит, воспаления кишечника, воспаление или блокада желчных протоков
СА27-29	Рак молочной железы, толстой кишки, желудка, печени, легкого, поджелудочной железы, яичника, простаты	Кисты на яичнике, болезни печени и почек, доброкачественные повреждения молочной железы
*см. источник Perkins et al., 2002.

Недавно с целью применения при диагностировании рака поджелудочной железы привлекло внимание другое MUC1 антитело, известное как РАМ4, благодаря его высокой чувствительности и специфичности для рака поджелудочной железы, но не для других эпителиальных раковых заболеваний, таких как рак молочной железы и рак яичника (Gold et al., 2007). В нормальной эпителиальной ткани MUC1 локализован на апикальной поверхности клеток. Злокачественное перерождение приводит к положительной регуляции MUC1 путем генной амплификации и/или повышенной активации транскрипции, и распределение MUC1 на поверхности клеток больше не ограничивается апикальной областью (Bieche & Lidereau, 1997). Хотя функция MUC1 все еще нуждается в подробном объяснении, высокая цитоплазматическая экспрессия MUC1 связана с плохим прогнозом для пациентов с раком молочной железы и/или раком яичника.

Было также показано, что MUC1 играет роль в клеточной адгезии, клеточной сигнализации и иммунных ответах (Quin et al., 2000; McGucken et al., 1995; Dong et al., 1997; Henderson et al., 1998).

Неограничивающим примером аминокислотной последовательности гена MUC1 человека является SEQ ID NO:1. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности гена MUC1 других видов включают GENBANK® с номерами доступа: ААА39755, 002496 и NP_038633 (мыши), NP_036734 (крысы), NP_001181906 (собаки), АА063589 (свиньи) и NP_776540 (коровы).

Дополнительно было установлено, что TAB-004 связывается с полипептидами K-ras и, в особенности, с мутантными полипептидами K-ras. Применяемое в данной заявке обозначение "K-ras" относится к онкогену K-ras и генным продуктам на его основе (см., например, Kahn et al., 1987). Примером генного продукта K-ras является ген K-ras человека, включающий, но без ограничения, ген, описанный в виде SEQ ID NO:2, которая соответствует номеру доступа NP_004976 в GENBANK®.

Применяемое в данной заявке обозначение "K-ras" относится к мутантным формам K-ras. Применяемые в данной заявке термины "мутантный K-ras", "мутантный полипептид K-ras" и "мутантный белок K-ras " используются как взаимозаменяемые для указания полипептида K-ras, содержащего по меньшей мере одну мутацию K-ras по сравнению с SEQ ID NO:2. Согласно некоторым вариантам мутантный полипептид K-ras содержит мутацию в аминокислотном положении 12 или 13 зрелого полипептида (то есть, в аминокислотном положении 13 или 14 в SEQ ID NO:2, так как зрелый полипептид не содержит метионинового остатка в положении 1 в SEQ ID NO:2). Согласно некоторым вариантам мутантный полипептид K-ras содержит мутацию, выбранную среди мутации замены глицина 12 на серин (обозначаемой далее как "G12S"), G12V, G12D, G12A, G12C, G13A и G13D. Примером мутантного полипептида K-ras^G12D, с которым частично связываются антитела по изобретению, является полипептид, представленный в SEQ ID NO:2 и описанный Kahn et al., 1987. Согласно некоторым вариантам антитела, их фрагменты и их производные по изобретению связываются с частью полипептида K-ras, которая содержит мутацию G12D (называемую в данной заявке "мутантным K-ras G12D" или "K-ras^G12D"). Дополнительные примеры мутантных полипептидов K-ras включают, но без ограничения, аллельные варианты, сплайс-варианты, варианты производных, варианты с заменами, варианты с делециями, варианты с инсерциями (вставками), слитые полипептиды, ортологи и межвидовые гомологи. Согласно некоторым вариантам мутантный полипептид K-ras может включать один или более дополнительных остатков на С- и N- концах, например, но без ограничения, остатки лидерных последовательностей, нацеленные остатки, метиониновые остатки на аминоконцах, остатки лизина, остатки меток и/или остатки слитых белков.

II.В. Композиции, содержащие антитела, их фрагменты и/или их производные по изобретению

Данное изобретение предусматривает также композиции, содержащие антитела, их фрагменты и/или их производные по изобретению. Схематическое изображение примерных композиций по изобретению и примерного их применения показано на Фигуре 6. Согласно некоторым вариантам композиция по изобретению содержит антитела, их фрагменты и/или их производные, описанные в данной заявке, и один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или эксципиентов. Согласно некоторым вариантам носитель (носители) и/или эксципиент (эксципиенты) является(-ются) фармацевтически приемлемым(-и) для людей. Подходящие составы включают водные и неводные стерильные растворы для инъекции, которые могут содержать антиоксиданты, буферные вещества, бактериостатические агенты, бактерицидные антибиотики и вещества, которые придают композиции изотоничность с жидкостями организма предполагаемого реципиента; и водные и неводные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загущающие агенты. Композиции могут выпускаться в однодозовых и многодозовых контейнерах, например, в герметичных ампулах и флаконах и могут храниться в замороженном или лиофилизированном состоянии, что требует только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением. Примеры некоторых ингредиентов включают додецилсульфат натрия (SDS), вводимый, согласно некоторым вариантам, в количестве 0,1-10 мг/мл, согласно некоторым вариантам, в количестве около 2,0 мг/мл; и/или маннит или другой сахар, вводимый, согласно некоторым вариантам, в количестве 10-100 мг/мл, согласно некоторым вариантам, в количестве около 30,0 мг/мл; и/или физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS). Могут быть также использованы любые другие агенты, обычные для фармацевтических композиций такого типа.

Композиция по изобретению может также содержать активный агент, причем этот активный агент представляет собой терапевтическое вещество, диагностическое вещество и/или биологически активное вещество. Применяемый в данной заявке термин "активный агент" относится к компоненту в составе описанных композиций, который обеспечивает благоприятный эффект для пациента, позволяет осуществить визуализацию клеток или тканей, в которых накапливаются композиции по изобретению, обнаружение эпитопов, с которыми связываются антитела, их фрагменты и/или их производные по изобретению и/или усиливает любую из указанных активностей. Согласно некоторым вариантам активный агент по изобретению выбирается из группы, состоящей из радиоактивной молекулы (включая, но без ограничения, радионуклиды и радиоизотопы), молекулы сенсибилизирующего агента, агента визуализации или другого детектируемого агента, токсина, цитотоксина, антиангиогенного агента, противоопухолевого агента, иммуномодулирующего агента, цитокина, репортерной группы и их комбинаций и т.п.

Согласно некоторым вариантам активный агент представляет собой химиотерапевтический агент. Различные химиотерапевтические агенты известны специалистам в данной области и включают, но без ограничения, алкилирующие агенты, такие как азотистые иприты (например, хлорамбуцил, циклофосфамид, изофамид, мехлорэтамин, мелфалан, урамустин), азиридины (например, тиотепу), метан-сульфонатные эфиры (например, бусульфан), нитрозомочевины (например, кармустин, ломустин, стрептозоцин), комплексы платины (например, цисплатин, карбоплатин) и биовосстановительные алкилирующие агенты (например, митомицин С, прокарбазин), агенты, разрушающие нити ДНК (например, блеомицин); ингибиторы ДНК-топоизомеразы I (например, камптотецин и его производные, включая, но без ограничения, 10-гидроксикамптотецин), ингибиторы ДНК-топоизомеразы II (например, амсакрин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, митоксантрон, этопозид, тенипозид, подофиллотоксин); минорные агенты, связывающиеся с бороздкой спирали ДНК (например, пликамицин); антиметаболиты, такие как антагонисты фолатов (например, метотрексат и триметрексат), антагонисты пиримидинов (например, флуорурацил, фтордезоксиуридин, СВ3717, азацитидин, цитарабин, флоксуридин), антагонисты пуринов (например, меркаптопурин, 6-тиогуанин, флударабин, пентостатин), аналоги модифицированного сахара (например, циктрабин, флударабин) и ингибиторы рибонуклеотид-редуктазы (например, гидроксимочевина); тубулиновые интерактивные агенты (например, винкристин, винбластин, паклитаксел); адреналовые кортикостероиды (например, преднизон, дексаметазон, метилпреднизолон, преднизолон); гормональные блокирующие агенты, такие как эстрогены и родственные соединения (например, этинилэстрадол, диэтилстилбестерол, хлортрианизен, иденестрол), прогестины (например, гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерон, мегестрол), андрогенные агенты (например, тестостерон, тестостерона пропионат, флуоксиместерон, метилтестостерон), гормональные агенты, высвобождающие люитенизирующий гормон, и/или антагонисты гонадотропин-высвобождающего гормона (напрмер, лейпролида ацетат, госерелина ацетат), антиэстрогенные агенты (например, тамоксифен), антиандрогенные агенты (например, флутамид) и антиадреналовые агенты (например, митотан, аминоглютетимид).

Другие химиотерапевтические агенты включают, но без ограничения, таксол, ретиноевую кислоту и ее производные (например, 13-цис-ретиноевую кислоту, все транс-ретиноевые кислоты и 9-цис-ретиноевую кислоту), сульфатиазол, митомицин С, микофенольную кислоту, сульфадиэтоксан и гемцитабин (4-амино-1-(2-дезокси-2,2-дифтор-β-D-эрмтро-пентафуранозил)пиримидин-2(1Н)-он-2′,2′-дифторо-2′-дезоксицитидин).

Согласно некоторым вариантам активный агент представляет собой антиангиогенный агент. Специалистам в данной области известны различные антиангиогенные агенты, которые включают, но без ограничения, ингибиторы и/или антагонисты членов семейства сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и его рецепторы (например, бавасизумаб и другие антитела, направленные против сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF)) и антагонисты нейропилина-1.

Согласно некоторым вариантам композиции по данному изобретению могут быть использованы с дополнительными адъювантами и/или иммуномодулирующими агентами. Применяемые в данной заявке термины "иммунный модулирующий агент" и "иммуномодулирующий агент" относятся к молекулам, способным модулировать иммунные ответы. Примеры иммуномодулирующих агентов включают, но без ограничения, цитокины (в том числе, но без ограничения, цитокины IFN-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, TNF и другие цитокины, влияющие на иммунные клетки, CpG-олигодезоксинуклеотиды (CpG ODN), которые функционируют как активаторы дендритных клеток (Rothenfusser et al., 2002), и иммуномодулирующие агенты, указанные в Таблице 3.

Таблица 3
Примеры иммуномодуляторов*
Мишень	Модуляторы
Индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO)	1MT; MTH-Trp
Аргиназа (ARG)	ABH; ВЕС
Индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS)	L-NMMA
ARG/iNOS	NCX-4016
COX-2	целекоксиб; рофекоксиб
ЕР2/ЕР4	CP-533536
TGFβRI	SB-505124; SD-505124; LY580276
JAK/STAT	JSI-124; CPA-7
VEGFR1/FLT1	SU5416; AG-013736
CCR4	IC-487892
CXCR4	AMD3100
CCR2	INCB3344
*см. Muller & Scherle, 2006 и содержащиеся в этом источнике ссылки. MTH-TRP: метил-тиогидантоин-триптофан; ABH: 2(5)-амино-6-бороногексановая кислота; ВЕС: S-(2-бороноэтил)-L-цистеин; L-NMMA: L-NG-монометиларгинин; NCX-4016: нитроаспирин; см. Emanueli et al., 2004; CP-533536: см. Cameron et al., 2009; SB-505124: см. DeCosta Byfield et al., 2004; SD-505124: см. Muller & Scherle, 2006; LY580276: см. Sawyer et al., 2004; JSI-124: см. Blaskovich et al., 2003; CPA-7: см. Littlefield et al., 2008; SU5416: см.

Fong et al., 1999; AG-013736 (акситиниб); см. Rugo et al., 2005; IC-487892: ICOS Corp., Bothell, Washington, United States of America; AMDS 100: см. Donzella et al., 1998.

Для терапевтических целей субъекту вводят терапевтически эффективное количество композиции по изобретению. "Терапевтически эффективным количеством" называют такое количество композиции, которое достаточно для продуцирования измеримого биологического ответа опухоли (такого как, но без ограничения, иммуностимулирующий ответ, антиангиогенный ответ, цитотоксический ответ, регрессия опухоли и/или ингибирование роста опухолей.

Величина доз активных ингредиентов в композиции по изобретению может меняться для того, чтобы ввести то количество активного(-ых) агента(-ов), которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа у конкретного субъекта. Выбранные величины доз зависят от различных факторов, включая, но без ограничения, активность композиции, ее состав, метод введения, комбинацию с другими лекарствами или методами лечения, размер опухоли и длительность ее существования и физическое состояние и предыдущая медицинская история (анамнез) субъекта, подвергающегося лечению.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения вводится минимальная доза и затем, при отсутствии токсичности, лимитирующей величину дозы, увеличивают вводимую дозу. Определение и регулирование терапевтически эффективной дозы, а также проведение оценки, когда и как осуществлять это регулирование, известны специалистам в данной области.

Для диагностических целей субъекту вводится детектируемое количество композиции по изобретению. Используемый в данной заявке термин "детектируемое количество" композиции относится к такой дозе этой композиции, которая может быть определена in vivo или in vitro. Детектируемое количество меняется в зависимости от различных факторов, включая, но без ограничения, химические характеристики композиции, мечение которой проводят, вид детектируемой метки, методы мечения, метод проявления изображения и параметры, связанные с ним, метаболизм меченого лекарства в организме субъекта, стабильность метки (включая, но без ограничения, период полужизни радионуклидной метки), промежуток времени после введения композиции до визуализации, путь введения, физическое состояние и предыдущую медицинскую историю субъекта, а также размер и длительность существования опухоли или опухоль, о наличии которой подозревают. Таким образом, детектируемое количество может меняться и может варьироваться в зависимости от конкретного применения. Специалист в данной области с учетом данного описания знает, как определить такое детектируемое количество.

Применяемые в данной заявке термины "детектируемое соединение", "детектируемая метка" и "детектируемый агент" относятся к любой молекуле, которая может быть детектирована с помощью любого агента, который может быть добавлен к антителу или к его фрагменту или его производному, и который позволяет обнаружить антитело, его фрагмент или его производное in vivo или in vitro. Примеры детектируемых соединений согласно данному изобретению включают, но без ограничения, хромофоры, флуоресцентные агенты, ферменты, антигены, группы со специфической реакционноспособностью, хемилюминесцентные агенты и электрохимически детектируемые агенты и т.п. Согласно некоторым вариантам антитела биотинилируют (метят биотином).

Согласно некоторым вариантам детектируемый агент представляет собой флуорофор. С композициями по изобретению можно применять любой флуорофор, при условии, что присоединение флуорофора приведет к образованию композиции, которая является детектируемой или in vivo (например, после введения субъекту), и/или in vitro и, кроме того, не оказывает отрицательного воздействия на способность антитела или его фрагмента или его производного связываться с его эпитопом.

Примеры флуорофоров включают, но без ограничения, 7-диметиламинокумарин-3-карбоновую кислоту, дансилхлорид, нитробензодиазоламин (NBD), дабсилхлорид, коричную кислоту, флуоресцеинкарбоновую кислоту, краситель нильский синий, тетраметилкарбоксиродамин, тетраэтилсульфородамин, 5-карбокси-Х-родамин (5-ROX) и 6-карбокси-Х-родамин (6-ROX). Следует отметить, что эти флуорофоры являются только примерами и могут быть применены другие флуорофоры. Например, это могут быть красители серии ALEXA FLUOR®, которая включает по меньшей мере 19 различных красителей, которые характеризуются различными спектрами испускания. Эти красители включают ALEXA FLUOR® 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700 и 750 (их можно приобрести в Invitrogen Corp., Carlsbad, California, United States of America), и выбор конкретного красителя может быть сделан специалистом в данной области после ознакомления с данным описанием на основе критериев, включающих, но без ограничения, химический состав конкретного красителя ALEXA FLUOR®, вопрос о том, нужно ли применять множественные детектируемые вещества, спектры испускания каждого красителя, метод детектирования и т.д.

Согласно некоторым вариантам детектируемое вещество представляет собой цианиновый краситель. Неограничивающие примеры цианиновых красителей, которые могут присоединяться к антителам, их фрагментам и/или их производным согласно данному изобретению, включают сукцинимидные эфиры Cy5, Cy5.5 и Cy7, производимые Amersham Biosciences (Piscataway, New Jersey, United States of America).

Согласно некоторым вариантам детектируемое вещество представляет собой краситель, поглощающий в ближней ИК-области (NIR). Неограничивающие примеры красителей, поглощающих в ближней ИК-области, которые могут присоединяться к антителам, их фрагментам и/или их производным согласно данному изобретению, включают NIR641, NIR664, NIT7000 и NIT782.

Согласно некоторым вариантам биотинилированные антитела детектируют с помощью вторичных антител, которые содержат авидин или стрептавидин и соединены с флуоресцентной меткой, включая, но без ограничения, Cy3, Cy5, Cy7 и любую из серии флуоресцентных меток ALEXA FLUOR®, доступных от INVITROGEN™ (Carlsbad, California, United States of America). Согласно некоторым вариантам осуществляют непосредственное мечение антитела, его фрагмента или производного флуоресцентной меткой и клетки, которые связываются с антителом, отделяются путем флуоресцентно-активированного клеточного сортинга. Другие методы детектирования известны специалистам в данной области.

Для диагностических целей (включая, но без ограничения, детектирование и визуализацию) антитела согласно данному изобретению могут быть мечены детектируемым веществом. Детектируемое вещество может быть любым таким веществом, которое способно, или непосредственно, или косвенно, продуцировать детектируемый сигнал. Например, детектируемое вещество может быть радиоизотопом, таким как, но без ограничения, ³H, ¹⁴С, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I и ¹³¹I; флуоресцентным или хемилюминесцентным соединением, таким как, но без ограничения, флуоресцеина изоцианат, родамин или люциферин; или ферментом, таким как, но без ограничения, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или пероксидаза хрена.

Данное изобретение предусматривает также способы диагностирования опухоли, когда образец опухоли или биопсии оценивается in vitro. Согласно некоторым вариантам нацеленный лиганд согласно данному изобретению представляет собой детектируемую метку, такую как флуоресцентная метка, эпитопная метка или радиоактивная метка, каждая из которых будет описана вкратце ниже.

Флуоресценция.

Согласно данному изобретению может быть использован любой флуоресцентный краситель, включая, но без ограничения, FITC (флуоресцеина изоцианат), FLUOR X™, ALEXA FLUOR®, OREGON GREEN®, TMR (тетраметилродамин), ROX (Х-родамин), TEXAS RED®, BODIPY® 630/650 и Су5 (доступны в Amersham Pharmacia Biotech of Piscataway, New Jersey, United States of America, или в Molecular Probes Inc. of Eugene, Oregon, United States of America).

Флуоресцентная метка может быть детектирована непосредственно на основе (спектров испускания и поглощения, которые подходят для каждой конкретной использованной метки. Для in vitro детектирования флуоресценции было создано широко распространенное оборудование, включая приборы, доступные в компании GSI Lumonics (Watertown, Massachusetts, United States of America) и в компании Genetic MicroSystems Inc. (Wobum, Massachusetts, United States of America). Большинство промышленных систем использует методы сканирования с фотоэлектронным умножителем для детектирования. Критерии рассмотрения при анализе флуоресцентных образцов приведены в источнике Alexay et al., 1996.

Детектирование эпитопной метки

В случае использования эпитопной метки можно применять белок или соединение, которое связывает эпитоп. Репрезентативным примером эпитопной метки является биотин, который можно обнаружить путем связывания конъюгированного с авидином флуорофора, например, авидина-FITC. Или же, альтернативно, метку можно детектировать путем связывания комплекса авидин- пероксидаза хрена (HRP) и конъюгата стрептавидина с последующим колориметрическим детектированием продукта фермента HRP. Определение колориметрического или люминесцентного комплекса продукт-конъюгат можно проводить с помощью спектрофотометра или люминометра, соответственно.

Авторадиографическое детектирование

При применении радиоактивной метки (например, ¹³¹I или ^99mTc) детектирование может быть проведено методом обычной авторадиографии или путем применения устройства для визуализации, что хорошо известно специалистам в данной области. Предпочтительным авторадиографическим методом является метод, использующий фотостимулируемые люминесцентные пластины (Fuji Medical Systems of Stamford, Connecticut, United States of America). Вкратце, фотостимулируемая люминесценция показывает количество света, испускаемого облученными фосфорсодержащими пластинами после стимуляции лазером во время сканирования. Люминесцентный ответ пластин прямо пропорционален активности (Amemiya et al., 1988; Hallahan et al., 2001a).

При этом можно применять любой метод связывания антитела с детектируемой меткой, известный из уровня техники (см., например. Hunter et al., 1962; David et al., 1974; Pain et al., 1981); и Nygren, 1982.

Носители лекарств

Композиции согласно данному изобретению могут также содержать носитель лекарства для облегчения проникновения лекарства и его введения. Может быть использован любой подходящий носитель или средство для доставки, включая, но без ограничения, вектор в генной терапии (например, вирусный вектор или плазмиду), микрокапсулу, например, микросферу или наносферу (Manome et al., 1994; Hallahan et al, 2001b; Saltzman & Fung, 1997), пептид (см. патенты США №№6127339 и 5574172), глюкозаминогликан (см. патент США №6106866), масляную эмульсию (см. патент США №5651991), липид или производное липида (см. патент США №5786387), коллаген (см. патент США №5,786,387), коллаген (см. патент США №5922356), полисахарид или его производное (см. патент США №5688931), наносуспензию (см. патент США №5858410), полимерную мицеллу или конъюгат (Goldman et al., 1997; патенты США №№4551482; 5714166; 5510103; 5490840; и 5855900) и полисомы (патент США №5922545).

Конъюгирование нацеленных лигандов

Антитела, их фрагменты или их производные могут также соединяться с лекарствами или с носителями лекарств с использованием способов, известных из уровня техники, включая, но без ограничения, карбодиимидное конъюгирование, этерификацию, окисление периодатом натрия с последующим восстановительным алкилированием и сшивание глутаровым альдегидом (см., например, Goldman et al., 1997; Cheng, 1996; Neri et al., 1997; Nabel, 1997; Park et al., 1997; Pasqualini et al., 1997; Bauminger & Wilchek, 1980; патент США №6,071,890; и Европейский патент №0439095).

Методы введения

Подходящие методы введения композиции согласно данному изобретению включают, но без ограничения, внутрисосудистый, подкожный, внутримышечный и внутриопухолевый методы введения. Согласно некоторым вариантам применяется внутрисосудистое введение. Применяемые в данной заявке термины "внутрисосудистое введение" и "внутрисосудистое обеспечение" относятся к методу введения композиции непосредственно в сосудистую сеть субъекта. Методики, которые могут быть применены для внутрисосудистого введения композиций по изобретению, хорошо известны специалистам в данной области и включают, но без ограничения, внутривенное введение и внутриартериальное введение. Очевидно, что в зависимости от вида субъекта, которому должна быть введена композиция по изобретению, могут быть выбраны какое-либо место внутрисосудистого введения и метод внутрисосудистого введения.

В случае необходимости доставки композиции по изобретению в легочные пути композиции могут вводиться в виде аэрозоля или крупнокапельной струи.

III. Методы детекции эпитопов в биологических образцах

Антитела, и/или их фрагменты и/или производные, раскрываемые в настоящем изобретении, также применимы для визуализации in vivo, при этом антитело, меченное детектируемой частицей, такой как агент, не пропускающий радиоизлучение, и/или радиоизотоп, вводят субъекту, согласно некоторым вариантам изобретения, внутривенно, и определяют присутствие и местонахождение меченого антитела в организме-хозяине. Этот метод визуализации можно применять при стадировании и лечении злокачественных опухолей.

Так, согласно некоторым вариантам изобретения композиция по настоящему изобретению содержит метку, которую можно детектировать in vivo. Термин "in vivo" в настоящем описании обозначает методы визуализации или детекции, относится в основном к неинвазивным методам, таким как сцинтиграфические методы, магнито-резонансная (ЯМР) томография, ультразвук или флуоресценция, короткое описание каждого из этих методов приводится ниже в данном описании. Термин "неинвазивные методы" не исключает методы, в которых применяется введение контрастного агента для того, чтобы способствовать визуализации in vivo.

Согласно некоторым вариантам изобретения детектируемая частица может быть конъюгирована или иным образом ассоциирована с антителом, фрагментом или производным предмета по настоящему изобретению, терапевтическим, диагностическим агентом, носителем лекарственного средства или их комбинацией, более подробно представленными выше. Спустя некоторое, достаточное для связывания, время после введения меченой композиции субъекту биораспределение композиции можно визуализировать. Термин "время, достаточное для связывания" относится к временному интервалу, позволяющего осуществить связывание меченого агента с индуцирующей излучение молекулой-мишенью.

Сцинтиграфические методы визуализации

Сцинтиграфические методы визуализации включают SPECT (однофотонную эмиссионную компьютерную томографию, ОФЭКТ), PET (позитронную эмиссионную томографию, ПЭТ), визуализацию с помощью сцинтилляционной камеры (детекция гамма-излучения) и прямолинейное сканирование. Сцинтилляционная камера и прямолинейный сканер представляют собой приборы, которые позволяют проводить планарную сцинтиграфию. Большинство систем SPECT основаны на применении одной или более сцинтилляционных камер, которые поворачиваются вокруг исследуемого субъекта, и в результате получают общие сведения о радиоактивности более чем в одной проекции. Системы PET включают кольцевой ряд детекторов, которые также детектируют радиоактивность во многих измерениях.

Приборы для визуализации, применимые для практических методов обнаружения и/или визуализации по настоящему изобретению, и инструкция по их применению легко доступны. Как системы PET, так и системы SPECT предлагаются фирмой ADAC из Milpitas, California, United States of America, и фирмой Siemens из Hoffman Estates, Illinois, United States of America. Для сцинтиграфии можно также применять прибор для обнаружения радиоактивности, который включает ряд сенсоров с коллимирующими элементами, имеющими фокус с общим истоком.

При применении сцинтиграфической визуализации согласно некоторым вариантам изобретения детектируемая метка представляет собой радионуклидную метку, которую выбирают, согласно некоторым вариантам изобретения, из группы, состоящей из ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁵Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁷Br, ^80mBr, ⁹⁵Ru, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Ru, ^99mTc, ¹⁰⁷Hg, ²⁰³Hg, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹²⁶I, ¹³¹I, ¹³³I, ¹¹¹In, ^113mIn, ^99mRe, ¹⁰⁵Re, ¹⁰¹Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ^121mTe, ^122mTe, ^125mTc, ¹⁶⁵Tm, ¹⁶⁷Tm, ¹⁶⁸Tm и образованных из них нитридов иди оксидов. Согласно некоторым вариантам изобретения радионуклидная метка представляет собой ¹³¹I или ^99mTc.

Методы мечения радионуклидами молекулы, применяемой в соответствии с методами, раскрываемыми в настоящем изобретении, известны в уровне техники. Например, можно получить производное молекулы-мишени таким образом, чтобы радиоизотоп связывался непосредственно с ней (Yoo et al., 1997). Или же можно присоединять линкер, чтобы содействовать конъюгации. Типичные линкеры включают диэтилентетрамин-пентаацетат (DTPA, ДТПА)-изотиоцианат, сукцинил 6-гидразиний никотината гидрохлорид (SHNH) и гексаметилпропиленамина оксим (НМРАО; Chattopadhyay et al., 2001; Sagiuchi et al., 2001; и патент США No.6024938). Другие методы можно найти в патенте США No. 6080384; Hnatowich et al., 1996; и Tavitian et al., 1998.

Если меткой является радионуклид, для уменьшения или предупреждения поражения, вызванного радиоактивным излучением, в композицию, содержащую меченую молекулу-мишень, можно добавлять стабилизаторы, такие как аскорбиновая кислота, гентизиновая кислота или другие подходящие антиоксиданты.

Магнито-резонансная томография (MRI. МРТ). Методы магнито-резонансной томографии позволяют получать изображения на основании относительных скоростей релаксации протонов в молекулах воды в уникальной химической среде. Применяемый в данном описании термин "магнито-резонансная томография" относится к методам ЯМР-спектроскопии, включающим конвенциональную магнито-резонансную томографию, перенос намагниченности (MTI), протонную ЯМР-спектроскопию (MRS, ¹H ЯМР), диффузионную МРТ (DWI, ДТВ) и функциональную МРТ (fMRI, ФМРТ; см., например, Rovaris et al., 2001; Pomper & Port, 2000; и цитированные в них ссылки).

Контрастные агенты для МРТ включают, но без ограничения, парамагнитные или суперпарамагнитные ионы, наночастицы оксида железа (Weissleder et al., 1992; Shen et al., 1993) и водорастворимые контрастные агенты. Парамагнитные и суперпарамагнитные ионы можно выбрать из группы металлов, включающей железо, медь, марганец, хром, эрбий, европий, диспрозий, гольмий и гадолиний. Предпочтительными металлами являются железо, марганец и гадолиний; наиболее предпочтителен гадолиний.

Специалисты в области введения диагностических меток понимают, что ионы металлов могут связываться с помощью хелатирующих частиц, которые, в свою очередь, могут конъюгироваться с терапевтическим агентом в соответствии с методами по настоящему изобретению. Например, ионы гадолиния образуют хелат с диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTPA). Ионы лантаноидов образуют хелаты с тетраазациклододекан-содержащими соединениями. См. патенты США No.5738837 и 5707605. Или же носителем контрастного агента может являться липосома (Schwendener, 1992).

Изображения с использованием магнитного источника можно получать, например, на сверхпроводящем квантовом магнетометре (SQUID (СКВИД), поставляемом вместе с инструкцией фирмой Quantum Design of San Diego, California, United States of America; cm. Также патент США No.5738837).

Ультразвук. Ультразвуковую визуализацию можно применять для получения количественной информации и сведений о структуре целевой ткани, включающей опухоль. Введение контрастного вещества, такого как микропузырьки газа, может улучшить визуализацию ткани-мишени в процессе ультразвукового исследования. Согласно некоторым вариантам изобретения контрастный агент можно селективно нацеливать на соответствующую ткань-мишень, например, используя пептид для управляемой доставки лекарства (например, управляемая излучением доставка лекарства) по настоящему изобретению. Примеры агентов для введения микропузырьков in vivo включают, но без ограничения, наполненные газом липофильные пузырьки или пузырьки на основе липидов (например, патенты США No.6245318; 6231834; 6221018 и 5088499). Помимо этого, газ или жидкость можно заключать в пористые неорганические частицы, которые способствуют высвобождению микропузырьков при доставке субъекту (патенты США No.6254852 и 5147631).

Газы, жидкости и их комбинации, пригодные для применения по настоящему изобретению, включают воздух; азот; кислород; диоксид углерода; водород; оксид азота; инертный газ, такой как гелий, аргон, ксенон или криптон; фторид серы, такой как гексафторид серы, дитиодекафторид или трифторметилтиопентафторид; гексафторид селена; необязательно галогенированный силан, такой как тетраметилсилан; низкомолекулярный углеводород (например, содержащий до 7 углеродных атомов), например, алкан, такой как метан, этан, пропан, бутан или пентан, циклоалкан, такой как циклобутан или циклопентан, алкен, такой как пропен или бутен, или алкин, такой как ацетилен; простой эфир; кетон; сложный эфир; галогенированный низкомолекулярный углеводород (например, содержащий до 7 углеродных атомов); или смесь любых вышеперечисленных соединений. Газообразные галогенированные углеводороды могут иметь повышенную продолжительность действия и поэтому в некоторых случаях являются предпочтительными для применения. Типичные газы из этой группы включают декафторбутан, октафторциклобутан, декафторизобутан, октафторпропан, октафторпиклопропан, додекафторпентан, декафторциклопентан, декафторизопентан, перфторгексан, перфторциклогексан, перфторизогексан, серы гексафторид и перфтороктаны, перфторнонаны; перфтордеканы, необязательно, бромированные.

Связывание нацеливающих лигандов с липофильными пузырьками можно осуществлять с помощью химических сшивающих агентов стандартными методами связывания белок-полимер или белок-липид (например, с помощью карбодиимида (EDC) или тиопропионата (SPDP)). Для повышения эффективности нацеливания большие пузырьки газа можно связывать с нацеливающим лигандом, используя гибкое спейсерное плечо, такое как разветвленный или линейный синтетический полимер (патент США No.6245318). Нацеливающий лиганд может быть связан с пористыми неорганическими частицами с помощью покрытия, адсорбции, нанесения слоя или реакции внешней поверхности частицы с нацеливающим лигандом (патент США No.6254852).

Описание оборудования для ультразвукового исследования и технических методов получения набора данных можно найти в работах Coatney, 2001; Lees, 2001; и в цитированных в них ссылочных материалах.

Флуоресцентная визуализация. Неинвазивные методы визуализации могут также включать детекцию флуоресцентной метки. Лекарственное средство, содержащее липофильный компонент (терапевтический агент, диагностический агент, вектор или носитель лекарственного средства) может быть помечен любым из множества липофильных красителей, пригодных для визуализации in vivo (см., например, Heredia et al., 1991; Ragnarson et al., 1992; Fraser, 1996). Типичные метки включают, но без ограничения, карбоцианиновые и аминостириловые красители, предпочтительно, диалкилкарбоцианины с длинной цепью (например, DiI, DiO и DiD, выпускаемые Molecular Probes Inc. из Eugene, Oregon, United States of America) и диалкиламиностириловые красители. Липофильные флуоресцентные метки можно вводить методами, известными специалисту в данной области техники. Например, растворы VYBRANT™ для мечения клеток позволяют эффективно метить культивированные клетки других липофильных компонентов (Molecular Probes Inc. из Eugene, Oregon, United States of America).

Флуоресцентная метка может также представлять собой сульфоцианиновые красители, включая Cy5.5 и Cy5 (выпускаются Amersham of Arlington Heights, Illinois, United States of America), IRD41 и IRD700 (выпускаются Li-Cor, Inc., Lincoln, Nebraska), NIR-1 (выпускается Dejindo of Kumamoto, Japan) и LaJolla Blue (выпускается Diatron of Miami, Florida, United States of America; см. также Licha et al., 2000; Weissleder et al., 1999; Vinogradov et al., 1996).

Помимо этого, флуоресцентные метки может также содержать хелаты, образованные ионами лантаноида с органическими лигандами, например, флуоресцентные хелаты тербия и европия (Патент США No. 5928627). Такие метки могут быть конъюгированы или связаны ковалентной связью с лекарственным средством, раскрываемым в настоящем изобретении.

Для in vivo детекции флуоресцентной метки создается изображение с применением спектров излучения и поглощения, которые соответствуют конкретной используемой метке. Изображение можно визуализировать, например, с помощью оптической диффузионной спектроскопии. Другие методы и системы построения визуализации описаны, среди прочего, в патентах США No. 5865754; 6083486 и 6246901.

IV. Методы обнаружения и лечения опухолей

В некоторых вариантах изобретения антитела, фрагменты и/или производные по настоящему изобретению применяются для in vivo визуализации опухолей, причем субъекту вводят композицию по настоящему изобретению, помеченную визуализирующей частицей, такой как не пропускающий излучение агент, радиоизотоп или другой визуализирующий агент, и определяют местоположение композиции с детектируемой меткой в организме субъекта. Этот метод визуализации можно применять при стадировании и лечении злокачественных опухолей. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело метят любой частицей, которую можно детектировать у субъекта in situ, например, методами ядерного магнитного резонанса, лучевой диагностики или другими методами детекции, известными в уровне техники.

В этой связи настоящее изобретение включает также методы детекции опухолей у субъектов. Согласно некоторым вариантам изобретения методы по настоящему изобретению включают (а) введение субъекту композиции, содержащей антитело, или его фрагмент или производное, по настоящему изобретению, конъюгированное с детектируемой меткой; и (б) обнаружение детектируемой метки, чтобы тем самым обнаружить опухоль. Согласно некоторым вариантам изобретения опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы, молочной железы, яичника, ободочной кишки или прямой кишки, и/или ее метастатические клетки, которые, необязательно, экспрессируют MUC1, мутантный K-ras, или и тот, и другой.

Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения детектируемая метка содержит визуализирующий агент, выбранный из группы, состоящей из парамагнитных, радиоактивных или флуорогенных ионов, включая, но без ограничения, ионы, описанные выше более подробно. С учетом вышесказанного радиоактивный визуализирующий агент может представлять собой, например, гамма-излучатель, излучатель позитронов, излучатель рентгеновских лучей или любой другой агент, метод детекции которого существует. Примеры таких радиоактивных визуализирующих агентов включают ⁴³K, ⁵²Fe, ⁵⁷Co, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁷Br, ⁸¹Rb/⁸¹MKr, ^87MSr, ^99MTc, ¹¹¹In, ¹¹³In, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹²⁷Cs, ¹²⁹Cs, ¹³¹I, ¹³²I, ¹⁹⁷Hg, ²⁰³Pb и ²⁰⁶Bi, на предмет настоящего изобретения не ограничивается только этими радиоизотопами.

Настоящее изобретение включает также методы лечения опухолей. Согласно некоторым вариантам изобретения методы заключаются во введении субъекту композиции, содержащей антитело, или его фрагмент или производное, по настоящему изобретению, конъюгированное с активным агентом, причем активный агент контактирует с опухолью, тем самым осуществляется лечение опухоли. Примеры активных агентов раскрываются в настоящем изобретении и включают, но без ограничения, терапевтические агенты, необязательно, химиотерапевтические агенты, токсины, агенты для лучевой терапии и любые комбинации вышеперечисленных агентов.

Например, композиция по настоящему изобретению может содержать антитело, или его фрагмент или производное, по настоящему изобретению, конъюгированное с химиотерапевтическим агентом. Согласно некоторым вариантам изобретения химиотерапевтический агент выбирают из противоопухолевого лекарства, цитокина, антиметаболита, алкилирующего агента, гормона, метотрексата, доксорубицина, даунорубицина, цитозин-арабинозида, этопозида, 5-фторурацила, мелфалана, хлорамбуцила, мустаргена (азотистого иприта), циклофосфамида, цисплатина, виндезина, алкалоидов винка, митомицина, блеомицина, пуротионина, макромомицина, производных 1,4-бензохинона, тренимона, стероидов, аминоптерина, антрациклинов, демекольцина, этопозида, митрамицина, доксорубицина, дауномицина, винбластина, неокарциностатина, макромицина, α-амантина и их комбинаций.

Помимо этого, композиция по настоящему изобретению может содержать антитело, или его фрагмент или производное, по настоящему изобретению, конъюгированное с токсином. Примеры токсинов включают, но без ограничения, яд гадюки Рассела, активированный Фактор IX, активированный Фактор X, тромбин, фосфолипазу С, фактор яда кобры, рицин. А-цепь рицина, эндотоксин Pseudomonas, дифтерийный токсин, бычью панкреатическую рибонуклеазу, антивирусный белок лаконоса, абрин. А-цепь абрина, гелонин, сапорин, модецин, вискумин, волкензин и их комбинации.

Композиции по настоящему изобретению могут также содержать антитело, или его фрагмент или производное, по настоящему изобретению, конъюгированное с агентом для лучевой терапии. Примеры агентов для лучевой терапии включают, но без ограничения, ⁴⁷Sc, ⁶⁷Cu, ⁹⁰Y, ¹⁰⁹Pd, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ²¹¹At, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ³²P, ³³P, ⁷¹Ge, ⁷⁷As, ¹⁰³Pb, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹Ag, ¹¹⁹Sb, ¹²¹Sn, ¹³¹Cs, ¹⁴³Pr, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹¹Os, ^193MPt и ¹⁹⁷Hg.

Настоящее изобретение предусматривает также методы подавления роста опухоли у субъекта. Согласно некоторым вариантам изобретения эти методы заключаются во введении субъекту, имеющему опухоль, эффективного количества выделенного антитела, фрагмента или производного по настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам изобретения антитело, фрагмент или производное по настоящему изобретению связывается с эпитопом в пределах любой из последовательностей SEQ ID NO:1-3. Согласно некоторым вариантам изобретения опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы, молочной железы, яичника, ободочной кишки или прямой кишки, и/или ее метастатические клетки, которые, согласно некоторым вариантам изобретения, экспрессируют MUC1, мутантный K-ras, или и тот, и другой.

Настоящее изобретение охватывает также применение композиций и методов, раскрываемых в настоящем изобретении, в комбинированной терапии. Так, в некоторых вариантах настоящее изобретение включает назначение субъекту одного или более видов дополнительного противоопухолевого лечения. Примеры противоопухолевого лечения включают, но без ограничения, лучевую терапию, химиотерапию, дополнительную иммунотерапию и противовоспалительную терапию и их комбинации.

Например, противовоспалительная терапия может включать введение субъекту противовоспалительного агента, такого, но без ограничения, как нестероидное противовоспалительное средство (NSAID, НСПВС). Примеры NSAID включают, но без ограничения, ингибиторы циклооксигеназы (например, индометацин), в частности, циклооксигеназа-2-специфические ингибиторы, такие, но без ограничения, как целекоксиб и рофекоксиб.

Комбинированная терапия может также включать введение субъекту одного или более дополнительных противоопухолевых лекарственных средств, например, введение гемцитабина, который представляет собой 4-амино-1-(2-дезокси-2,2-дифтор-β-D-эритропентофуранозил)пиримидин-2(1Н)-он-2′,2′-дифтор-2′-дезоксицитидин; целекоксиба, который представляет собой 4-[5-(4-метилфенил)-3-(трифторметил)пиразол-1-ил]бензолсульфонамид, их фармацевтически приемлемых солей и/или их комбинации.

Комбинированная терапия может также включать назначение субъекту лучевой терапии до, во время и/или после проведения курса лечения любой композицией по настоящему изобретению.

Для применения в терапии антитела, их фрагменты, производные и/или конъюгаты можно вводить субъекту, например, в виде фармацевтически приемлемой лекарственной формы. Их можно вводить внутривенно в виде болюса или в виде непрерывного вливания в течение некоторого времени, внутримышечно, подкожно, интраартикулярно, интрасиновиально (в полость суставов), интратекально, перорально, местно или в виде ингаляций. Антитела и/или конъюгаты можно также вводить внутрь опухоли, перитуморально, внутрь очага поражения или рядом с очагом поражения (перилезионально), чтобы, при желании, вызвать как местный, так и системный терапевтический эффект.

Соответствующие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и/или эксципиенты общеизвестны и могут применяться специалистами в данной области техники в соответствии с клинической ситуацией. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или эксципиентов включают: (1) фосфатно-солевой буферный раствор, приготовленный по методу Дульбекко, рН около 7.4, содержащий около 1 мг/мл - 25 мг/мл альбумина человеческой сыворотки, (2) 0.9% физиологический солевой раствор (0.9% вес/об NaCl) и (3) 5% (вес/об) раствор декстрозы.

Скорее в жидкой лекарственной форме, нежели в лиофилизированной форме, антитело, как правило, готовится с концентрацией около 0.1 мг/мл - 100 мг/мл, хотя допускаются значительные колебания за пределами этого интервала.

Дополнительные указания, относящиеся к лекарственной форме и дозе, см. В патентах США No.5326902; 5234933; Международной опубликованной заявке РСТ No.WO 1993/25521; Gennaro, 1990; Goodman et al., 1996; Berkow et al., 1997; Speight et al., 1997; Duch et al., 1998; Ebadi, 1998; Katzung, 2001; Gennaro, 2003.

Композиции и методы по настоящему изобретению можно применять in vitro, in vivo или ex vivo.

Композиции и методы по настоящему изобретению можно применять для скрининга и/или лечения такого ракового заболевания, при котором наблюдается усиленная экспрессия MUC1 или мутантного K-ras. Примеры таких раковых заболеваний включают, но без ограничения, рак яичника, молочной железы, легкого, поджелудочной железы и простаты.

Подходящая для лечения заболевания доза антитела, его фрагмента или производного и/или конъюгата по настоящему изобретению может зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, тяжести и прогрессирования заболевания, от того, вводятся антитела и/или конъюгаты с целью предупреждения или лечения, от предыдущего лечения, от анамнеза пациента и от реакции на антитела и/или конъюгаты и от выбора лечащего врача. Антитела и/или конъюгаты по настоящему изобретению можно вводить субъекту одновременно или в течение курса лечения, в который входит несколько или много видов терапии.

V. Способы детекции, очистки опухолевых клеток и опухолевых стволовых клеток и нацеливания на эти клетки

Настоящее изобретение включает также методы детекции, очистки опухолевых клеток, раковых стволовых клеток, или и тех и других, и нацеливания на опухолевые клетки, раковые стволовые клетки, или и те и другие, которые находятся в организме субъекта или выделены из него, с использованием антител, или их фрагментов или производных, по данному изобретению. Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение предусматривает методы детекции опухолевых клеток, раковых стволовых клеток, или и тех и других, путем детекции связывания антитела, или его фрагмента или производного, с опухолевыми клетками, раковыми стволовыми клетками, или и теми и другими в биологических образцах, взятых у субъекта, который был болен раком и/или болен раком в настоящее время. Для этой цели можно использовать композиции, раскрываемые в настоящем изобретении, в которых применяются детектируемые метки.

Помимо этого, настоящее изобретение предусматривает методы очистки раковых стволовых клеток. Согласно некоторым вариантам изобретения методы включают (а) предоставление популяции клеток, предположительно, содержащей раковые стволовые клетки; (б) идентификацию субпопуляции клеток, которые связываются с антителом, или его фрагментом или производным, причем связываются с эпитопом в пределах любой из последовательностей SEQ ID NO:1-3; и (в) очистку субпопуляции. Что касается способов очистки, то согласно некоторым вариантам изобретения популяция клеток содержит циркулирующие (в крови) клетки субъекта, больного раком.

Согласно некоторым вариантам изобретения помимо этого способы включают удаление позитивных по линии клеток (lin⁺), дифференцированных из популяции клеток перед стадией идентификации или удаление lin⁺ клеток из очищенной субпопуляции. Методы удаления lin⁺ клеток из популяций известны в уровне техники. Типичный метод приводится ниже:

Образцы суспензий одиночных клеток либо берут у субъекта (например, из крови, лимфатической жидкости, аспирата костного мозга и т.д.), либо готовят из тканей. В последнем случае срезы ткани, предположительно содержащей раковые стволовые клетки (например, ткани панкреатической аденокарциномы) можно гомогенизировать механическими способами и расщеплять с помощью коллагеназы IV и ДНК-азы в течение 30 минут при 37°С. Можно осуществлять истощение клеток линии в цельной крови и в суспензии одиночных клеток опухоли, используя, например, один из нескольких видоспецифических наборов Lineage Cell Depletion Kit от фирмы Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany), которые позволяют удалять клетки, экспрессирующие следующие антигены: CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 и CD235a, из суспензии клеток. Затем можно провести скрининг субпопуляции клеток, негативных по линии дифференцировки, методом проточной цитометрии на клетки, экспрессирующие MUC1, используя, например, моноклональное антитело TAB-004 по настоящему изобретению. Понятно, что различные стадии селекции можно осуществлять в любом порядке. При необходимости можно также использовать антитела, специфические к маркерам стволовых клеток CD133 (AC133) и/или CD24⁺/CD44⁺.

Настоящее изобретение предусматривает также методы нацеливания активного агента на циркулирующую раковую стволовую клетку в организме субъекта. Согласно некоторым вариантам изобретения методы включают контактирование раковой стволовой клетки (необязательно, циркулирующей раковой стволовой клетки) с композицией, содержащей антитело, или его фрагмент или производное, по настоящему изобретению и активным агентом. Таким образом, композиция доставляет активный агент к раковой стволовой клетке. Любой из активных агентов по настоящему изобретению может быть нацелен на раковые стволовые клетки при использовании композиций и методов по настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам изобретения активный агент представляет собой терапевтический агент, химиотерапевтический агент, токсин, агент для лучевой терапии или их комбинацию.

Например, согласно некоторым вариантам изобретения терапевтический агент представляет собой иммуномодулятор, который в некоторых вариантах изобретения может быть одним или более агентом, выбранным из группы: ингибитор индоламин 2,3-диоксигеназы (ГОО) (например, 1-метил-DL-триптофан (1МТ)); антагонист рецептора ЕР2/ЕР4; антагонист CXCR4, антагонист рецептора 1 сосудистого эндотелиального фактора роста 1, целебрекс, антагонист TGFβR1 и активатор дендритных клеток. Неограничивающие примеры этих иммуномодуляторов представлены выше, в Таблице 3.

VI. Методы прогнозирования рецидива и/или прогрессирования ракового заболевания у субъекта

Как и в 2010 году, в настоящее время рак молочной железы и рак поджелудочной железы являются, соответственно, третьей и четвертой основной причиной смерти, обусловленной раком. У женщин рак молочной железы является наиболее часто диагностируемым раковым заболеванием, но хотя рак поджелудочной железы встречается реже, из всех раковых заболеваний у него наихудший прогноз. Плохой прогноз при раке поджелудочной железы, по меньшей мере частично, обусловлен отсутствием методов диагностики на ранней стадии, болезнь диагностируется на поздней стадии. Хотя маммография значительно улучшила раннюю диагностику рака молочной железы, этот метод тоже не без недостатков. До 20% случаев рака молочной железы не распознается, ложноположительные результаты могут вызвать боязнь, беспокойство, и потребуется дорогое дополнительное исследование. Отсутствие специфичности при маммографическом исследовании может стать причиной "гипердиагностики" доброкачественных опухолей и ненужного лечения.

Другим затруднением является образование у пациентов метастазов первичных опухолей в удаленных от этих первичных опухолей областях, присутствие этих метастазов обычно согласуется с неблагоприятным прогнозом и, следовательно, существенно влияет на терапию пациента. Современные методы, которые можно применять для детекции метастазов, включают компьютерную томографию (СТ), позитронную эмиссионную томографию (PET) и магнито-резонансную томографию (MRI). Эти методы дороги, потенциально опасны для человека, могут иметь недостаточную специфичность и чувствительность и обычно не способны обнаружить микрометастазы.

Для того чтобы подобрать соответствующее конкретное лекарственное лечение, также может быть необходим мониторинг рецидива у пациентов. Для этих целей можно использовать анализы крови на опухолевые антигены, включая, но без ограничения, СА 19-9, СА 15-3 и СА 27-29. Однако часто эти анализы также не являются специфическими, так как повышение этих и других предполагаемых "связанных с опухолями антигенов" могут вызывать другие заболевания, отличные от рака. Также часто уровни экспрессии этих маркеров недостаточно высоки на ранних стадиях рака, чтобы обнаружить прогрессирование ракового заболевания до проявления симптомов. Развитие методологии специфической детекции рака на ранней стадии, а также детекции микрометастазов и рецидива было бы очень важно для улучшения результатов у больных раком поджелудочной и молочной железы.

VI.A. Методы прогнозирования рецидива ракового заболевания

Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение предусматривает также методы прогнозирования рецидива рака у субъекта. Согласно некоторьм вариантам изобретения методы включают (а) взятие у больного раком биологического образца, содержащего циркулирующие клетки; (б) контактирование биологического образца с одним или более антител, фрагментов или производных по настоящему изобретению; и (в) идентификацию в биологическом образце одной или более циркулирующих клеток, которые связываются с одним или более антител, фрагментов или производных по настоящему изобретению, тем самым прогнозируется рецидив рака у больного. Что касается этих методов, то идентификация циркулирующих клеток, которые связываются с антителами, фрагментами и/или производными по настоящему изобретению, может свидетельствовать о рецидиве рака у пациента, если ранее у него наблюдалась отрицательная реакция в отношении таких циркулирующих клеток. Согласно некоторым вариантам изобретения присутствие циркулирующих клеток, которые связываются с одним или более антител, фрагментов или производных по настоящему изобретению, говорит о том, что у субъекта имеется повышенный риск метастатического заболевания по сравнению с субъектом, негативным в отношении таких циркулирующих клеток.

VI.B. Методы прогнозирования прогрессирования ракового заболевания

Настоящее изобретение включает также методы прогнозирования прогрессирования ракового заболевания у субъекта. Согласно некоторым вариантам изобретения методы включают взятие у больного раком биологического образца, содержащего циркулирующие клетки; контактирование биологического образца с антителом, или его фрагментом или производным, по настоящему изобретению в условиях, достаточных для того, чтобы антитело или его фрагмент или производное связались с эпитопом на опухоли и/или раковой клетке, если она имеется в биологическом образце; и идентификацию в биологическом образце одной или более циркулирующих клеток, которые связываются с антителом или его фрагментом или производным, тем самым прогнозируется прогрессирование ракового заболевания у больного. Согласно некоторым вариантам изобретения биологический образец представляет собой пробу крови, лимфы или их фракции. Согласно некоторым вариантам изобретения рак представляет собой рак поджелудочной железы или рак молочной железы.

Согласно некоторым вариантам изобретения антитело является моноклональным антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией TAB-004, депонированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, United States of America, 16 декабря 2010 года согласно Будапештскому договору под номером доступа No. РТА-11550. Согласно некоторым вариантам изобретения его фрагмент или производное выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, или его фрагмента или производного; гуманизированного антитела, или его фрагмента или производного; человеческого антитела, или его фрагмента или производного; одноцепочечного антитела, или его фрагмента или производного; и фрагмента Fab, причем химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, одноцепочечное антитело или фрагмент Fab содержит участки CDR моноклонального антитела TAB-004. Согласно некоторым вариантам изобретения участки CDR моноклонального антитела TAB-004 включают CDR1 тяжелой цепи с SEQ ID NO:8; CDR2 тяжелой цепи с SEQ ID NO:9; CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO:10; CDR1 легкой цепи с SEQ ID NO:11; CDR2 легкой цепи с SEQ ID NO:12; и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO:13.

Выражение "прогнозирование прогрессирования ракового заболевания" в настоящем описании относится к оценке признака ракового заболевания в данный момент времени и его сравнение с этим признаком ракового заболевания в более ранний момент времени, причем сравнение является характерным для прогрессирования ракового заболевания у субъекта. Согласно некоторым вариантам изобретения прогрессирование ракового заболевания включает метастазирование рака у субъекта.

Собственно, антитело или его фрагмент или производное по настоящему изобретению можно применять для детекции циркулирующих опухолевых клеток (СТС) в крови или других биологических образцах больного раком, так как присутствие СТС может быть важным показателем возможности метастатического процесса и неблагоприятного прогноза. В настоящее время система CELLSEARCH® (Veridex, LLC, Raritan, New Jersey, United States of America) является единственным одобренным Управлением по контролю да пищевыми продуктами и лекарственными препаратами (FDA) США методом определения СТС у пациентов с метастатическим раком молочной железы, ободочной и/или прямой кишки и предстательной железы. Эта система основана на детекции поверхностного маркера адгезии эпителиальных клеток ЕрСАМ в СТС. Было показано, что при метастатическом раке молочной железы детекция СТС перед началом терапии первой линии позволяет с высокой степенью уверенности прогнозировать выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость. Для пациентов, у которых исходный уровень и уровень при последующей записи (через 4 недели) >5 СТС на 7.5 мл крови, прогноз более неблагоприятный, чем для пациентов с СТС менее пяти (Cristofanilli et al., 2005). Аналогично, при раке поджелудочной железы уровень >1 СТС/7.5 мл крови коррелировал с более неблагоприятным прогнозом (Kurihara et al., 2008).

Однако, способность СТС образовывать истинные метастатические поражения остается под вопросом. Поскольку опухолевые клетки с инвазивным фенотипом утрачивают некоторые эпителиальные антигены в процессе трансформации, называемом эпителиально-мезенхимным переходом (ЕМТ), СТС, экспрессирующие ЕрСАМ, в настоящее время позволяют предсказывать метастазирование с минимальной степенью точности. Действительно, сообщалось о низкой экспрессии ЕрСАМ микрометастазами, а попытки выделить СТС с применением антител против ЕрСАМ до настоящего времени не удались. Поскольку клетки, экспрессирующие MUC1, обладают высоким метастатическим потенциалом и поскольку было найдено, что MUC1 экспрессируется на СТС, антитела по настоящему изобретению и их фрагменты и производные, включающие, но без ограничения, антитело TAB-004, могут служить в качестве высоконадежного и более совершенного прогностического показателя по сравнению с методами, основанными на попытках детектировать СТС, экспрессирующие ЕрСАМ.

VII. Другое применение

Антитела по настоящему изобретению можно применять также в различных методах анализа, таких, но без ограничения, как анализы конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализы и иммунопреципитация (см., например, Zola, 1987; Harlow & Lane, 1988).

Антитела по настоящему изобретению применимы также в качестве агентов для аффинной очистки. В данном процессе одно или более антител иммобилизуют на соответствующем носителе (таком, но без ограничения, как смола Sephadex или фильтровальная бумага) методами, известными в уровне техники. См., например, Harlow & Lane, 1988.

ПРИМЕРЫ

Нижеприведенные примеры включают иллюстративные варианты изобретения. С учетом настоящего раскрытия и на основании общего уровня специалиста в данной области техники этот специалист поймет, что нижеприведенные примеры даются только в качестве типичных и что можно использовать множество изменений и модификаций, не отступая от объема настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Получение мышей с панкреатической аденокарциномой, экспрессирующих человеческий MUC1

Стратегия получения трижды трансгенной мышиной линии, которая экспрессирует человеческий MUC1 и образует панкреатическую адренокарциному, показана на Фигуре 3. Кратко говоря, мыши P48^Cre/+, которые экспрессировали Cre рекомбиназу по всему объему развивающейся и взрослой поджелудочной железы (Kawaguchi et al., 2002), скрещивали с мышами LSL-Kras^G12+, содержавшими транскрипционно неактивный K-ras^G21D аллель, который активировался в клетках, экспрессирующих Cre (Jackson et al., 2001; Kawaguchi et al., 2002). Потомство, позитивное как в отношении P48^Cre/+, так и в отношении LSL-Kras ^12D+(обозначенное "PDA мыши"), спаривали с трансгенной линией мышей (MUC1.Tg), которая несла человеческий MUC1 трансген, и сохраняли в виде гетерозиготных мышей (см. Фигура 3). Мыши MUC1.Tg, экспрессировали человеческий MUC1, проявляли толерантность к В- и Т-клеточным компартментам и были резистентны к иммунизации белком, кодированным трансгеном (Rowse et al., 1998). Так как у этих мышей трансген человеческого MUC1 стимулировался своим собственным промотором, его уровни экспрессии были тканеспецифическими и приемлемыми. Наблюдались люминальные поверхности нормальной эпителиальной ткани с низким уровнем и повышенная экспрессия в опухолях.

P48^Cre/+, LSL-Kras^G12D+ и человеческий MUC1-позитивные мыши (называемые в настоящем изобретении "PDA.MUC1.Tg" мыши) несли три трансгена. У всех мышей PDA×MUC1.Tg развилась панкреатическая интраэпителиальная неоплазия (PanINs) на различной стадии, включая PanIN-IA, PanIN-IB, PanIN-2, PanIN-3, и аденокарцинома (Tinder et al., 2008; Mukherjee et al., 2009). Характерные срезы разного возраста PDA×MUC1.Tg поджелудочной железы показаны на Фигуре 1В. Примерно, у 80% обнаруживали аденокарциному в возрасте 26 недель, и почти у 100% мышей наблюдали карциному в возрасте 34 недели.

При использовании PDA.MUC1.Tg мышей (Фигура 3), которые экспрессировали опухолевые антигены- человеческий MUC1 и мутантный K-ras^G12D, были приготовлены белковые лизаты чтобы получить антисыворотку к ассоциированным с опухолью антигенам, экспрессирующимся в трижды трансгенных мышах. Коротко говоря, 5 мг белкового лизата смешивали с неполным адъювантом Фрейнда (IFA) и применяли для иммунизации мышей Balb/c. Гибридомы получали слиянием клеток селезенки иммунизированных мышей с миеломными клетками, а антитело TAB-004 идентифицировали скринингом гибридом. Было определено, что это моноклональное антитело является антителом IgG изотипа. Очищенное антитело связывалось с ассоциированным с опухолью гликозилированным MUC1.

Скринингом эпитопов было определено, что моноклональное антитело (mAb) TAB-004 по данному описанию связывалось с эпитопом в SEQ ID NO:3. Антитело прочно связывалось с опухолевой тканью, выделенной из поджелудочной железы человека (Фигура 1В), человеческой молочной железы (Фигуры 2А и 2В), но не связывалось в заметной степени со здоровой тканью поджелудочной или молочной железы (см. Фигуры 1А и 2С).

Интересно отметить, что антитело TAB-004 перекрестно реагировало с мутантным K-ras, поэтому для этих опухолевых тканей, экспрессировавших мутацию K-ras, но не человеческий MUC1, также наблюдалось позитивное окрашивание при обработке антителом. Все метастатические поражения показали позитивную реактивность, и, как оказалось, TAB-004 могло связываться с эпитопом на мутантном K-ras полипептиде.

ПРИМЕР 2

Флуоресцентный (методом FACS) сортинг опухолевых клеток

Антитело TAB-004 тестировали на различных образцах, чтобы определить его способность связываться с опухолевыми клетками и сортировать эти клетки в различных средах и в разных условиях, используя флуоресцентно- активированный сортинг клеток (FACS).

В первом эксперименте антитело TAB-004 применяли для окрашивания клеток очищенных популяций клеток CD133⁺ и CD24⁺/CD44⁺/EpCAM⁺. Срезы панкреатических аденокарцином гомогенизировали механическим методом и расщепляли с использованием коллагеназы IV и ДНК- азы в течение 30 м 37°С. Истощение клеток линии в цельной крови и в суспензии одиночных опухолевых клеток осуществляли, используя набор Lineage Cell Depletion Kit от фирмы Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany, Catalogue No. 130- 092-211), при этом удаляя клетки, экспрессирующие следующие антигены: CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 и CD235a, из суспензии клеток. Затем осуществляли скрининг клеток негативной линии дифференцировки (lin^-) методом проточной цитометрии на клетки, экспрессирующие MUC1, используя антитело TAB-004, а затем маркеры панкреатических стволовых клеток CD133 (АС133) и/или CD24⁺/CD44⁺.

На Фигурах 7А и 7В представлены гистограммы разделения клеток CD133⁺ (Фигура 7А) и CD24⁺/CD44⁺/EpCAM⁺ (Фигура 7В) методом сортинга флуоресцентно-активированных клеток (FACS) и степени связывания антитела TAB-004 по данному описанию с этими популяциями.

Далее FACS анализ проводили для сравнения экспрессии MUC1, используя антитело TAB-004, в нормальных и панкреатических опухолевых клетках, выделенных из панкреатических опухолевых тканей, а также экспрессии CXCR4, полипептида, который ассоциируется с подвижностью клеток, включая раковые клетки. Результаты показаны на Фигуре 8.

На Фигуре 8 приводится распределение клеток в гистологически нормальной панкреатической ткани (Фигура 8С) и прилегающей ткани панкреатической аденокарциномы (Фигура 8D), окрашенной антителом TAB-004, в сравнении с антителом CXCR4. Как можно видеть, клетки, которые являются MUC1- или CXCR4-позитивными, более многочисленны в ткани панкреатической аденокарциномы, нежели в гистологически нормальной соседней панкреатической ткани. На Фигурах 8А и 8В показаны результаты негативного контроля (Фигура 8А - антитело отсутствует; Фигура 8В - контроль на основе изотипа антител).

И наконец, антитело TAB-004 сравнивали с антителом ЕрСАМ, которое используется в настоящее время для обнаружения эпителиального рака. На Фигуре 9 представлен ряд графиков FACS, которые показывают, что антитело TAB-004 обладает более высокой способностью детектировать циркулирующие опухолевые клетки у больных раком поджелудочной железы по сравнению со стандартным антителом ЕрСАМ.

Сначала в цельную кровь здорового контрольного индивидуума добавляли 250 клеток PANC1 линии раковых клеток поджелудочной железы на 700 мл крови и клетки PANC1 окрашивали с применением антитела TAB-004. Сравнение крайней справа черной, светло- серой и средней серой линий, которые соответствуют трем различным концентрациям антитела TAB-004 в интервале от 0.1 мг/мл до 0.004 мг/мл, с темно-серой линией, которая соответствует антителу ЕрСАМ, показывает, что эти все четыре препарата способны детектировать клетки PANC1 в этих препаратах сравнительно точно.

Далее, проверяли способность антител TAB-004 и ЕрСАМ детектировать циркулирующие опухолевые клетки в крови двух пациентов (пациента номер 1 и пациенты номер 2, соответственно). Как показано на Фигурах 9В и 9С, наблюдалось четкое различие между способностью антитела TAB-004 и антитела ЕрСАМ детектировать циркулирующие опухолевые клетки в крови пациента. В частности, антитело ТАВ-004-РЕ (см. крайнюю справа черную линию на Фигуре 9В и крайнюю справа черную и светло-серую линии на Фигуре 9С), но не антитело ЕрСАМ-РЕ (см. темно-серую линию на Фигурах 9В и 9С), было способно детектировать эти циркулирующие клетки в крови пациентов, это позволяет предположить, что антитело TAB-004 намного лучше подходит для этой цели, нежели применяемое в настоящее время антитело ЕрСАМ.

ПРИМЕР 3

Получение конъюгатов TAB-004

Проводили конъюгацию антитела TAB-004 по настоящему изобретению с 1-метил-DL-триптофаном (1МТ), ингибитором индоламин 2,3- диоксигеназы (IDO); антагонистом рецептора ЕР2/ЕР4; и CpG олигонуклеотидами, которые действуют как активаторы дендритных клеток (CpG ODN) (Rothenfusser et al., 2002). Данные о функциональной роли антитела TAB-004, конъюгированного с CpG ODN, приводятся в качестве неограничивающего примера функциональных возможностей антител и конъюгатов по настоящему изобретению.

Антитело TAB-004, самостоятельно или в виде конъюгата с CpG ODN, связывалось с клетками опухолевой линии (называемой в данном описании "KCM" клеточной линией; см. Фигуру 3), полученную от трижды трансгенных мышей PDA.MUC1.Tg. Хотя заявители не хотят связывать себя какой-либо конкретной теорией, по-видимому, антитело активировало натуральные киллерные клетки (NK клетки), а конъюгация с CpG ODN дополнительно повышала литическую активность NK клеток в отношении их мишеней, таких как YAC клетки, а также линии КСМ клеток (см. Фигуру 4).

ПРИМЕР 4

In vivo противоопухолевая активность конъюгата TAB-004-CpG ODN

Десяти (10) мышам инъецировали клетки КСМ стандартной линии панкреатических раковых клеток, полученных от трижды трансгенных мышей PDA.MUC1.Tg. Терапевтические группы, схема и доза представлены на Фигурах 5А и 5В. Коротко говоря, 3×10⁶ КСМ опухолевых клеток вводили мышам подкожно в бок (n=10 мышей) в день 0. В дни 4, 10 и 16 каждой мыши внутрь опухоли вводили 50 мкг конъюгата TAB-004-CpG ODN (без адъюванта). Для сравнения такие же количества антитела вводили группе животных, получающих только антитело (неконъюгированное антитело TAB-004). Мышей умерщвляли на 20 день и опухоли извлекали.

Как показано на Фигуре 5, обработка конъюгированным антителом полностью прекращала рост развившейся опухоли, приводя к ее полной ликвидации. Данные также показали, что даже после прекращения обработки у мышей, получавших конъюгат TAB-004-CpG ODN, опухоли не вырастают снова (см. Фигуру 5), подтверждая возможность применения конъюгата TAB-004-CpG ODN в качестве вакцины против рака, такого, но без ограничения, как эпителиальные раковые заболевания, в частности, раковые заболевания поджелудочной железы.

ПРИМЕР 5

Клонирование антител, получение рекомбинантных антител, доказательство связывания с антигеном и секвенирование (CDR)

Для того, чтобы подтвердить способность антитела TAB-004 связываться с MUC1 и определить аминокислотные последовательности участков CDR, извлекали тотальную РНК гибрид омной клеточной линии АТСС No.РТА-1155 0 и осуществляли ПЦР с обратной транскрипцией (RT- PCR, ОТ-ПЦР) с применением набора праймеров, специфических к тяжелой и легкой цепям иммуноглобулина, и набор QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit. Для каждого набора проводили несколько реакций RT- PCR тяжелых и легких цепей с применением смесей вырожденных прямых праймеров, охватывающих лидерные последовательности вариабельных областей. Прямые праймеры применяли в различных концентрациях, тогда как количество обратных праймеров (локализованных в константных областях генов тяжелой или легкой цепи) составляло 50 нг на реакцию. Применялись следующие условия реакции ОТ-ПЦР:

Обратная транскрипция: 30 минут при 50°С;

Начальная стадия активации ПЦР: 15 минут при 95°С;

Осуществление циклов: 20 циклов при 94°С в течение 25 секунд;

54°С в течение 30 секунд;

72°С в течение 30 секунд;

Заключительное удлинение: 10 минут при 72°С.

Затем во втором раунде проводили полугнездовую ПЦР. Прямые праймеры были идентичными прямым праймерам, которые использовались в ОТ- ПЦР в первом раунде, хотя количество каждого праймера было вдвое больше количества, применявшегося в описанной выше ОТ- ПЦР. Количество обратных праймеров для полугнездовой ПЦР, специфических к последовательностям тяжелой цепи, составляло 100 нг на реакцию. Применялись следующие условия проведения ПЦР:

Начальная денатурация в течение 5 минут при 95°С;

Циклы: 25 циклов при 95°С в течение 25 секунд;

57°С в течение 30 секунд;

68°С в течение 30 секунд;

Заключительное удлинение: 10 минут при 68°С.

По завершении ПЦР образцы продуктов ПЦР разделяли на агарозных гелях и продукты визуализировали. Некоторые ПЦР- продукты тяжелой и легкой цепи субклонировали и вариабельные области тяжелой и легкой цепи секвенировали. Полученные нуклеотидные последовательности и кодируемые ими аминокислотные последовательности представлены в SEQ ID NO:4-7, а предсказанные аминокислотные последовательности CDR показаны в Таблице 4.

Таблица 4
Амнокислотные последовательности CDR тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела TAB-004
Цепь IgG	Последовательность CDR1	Последовательность CDR2	Последовательность CDR3
Тяжелая	GYTFTNYW (SEQ ID NO:8)	INPSSGYT (SEQ ID NO:9)	STYYGDYLFPY (SEQ ID NO:10)
Легкая	QDIVYGNGNTY (SEQ ID NO:11)	KVS (SEQ ID NO:12)	FQGSHVPYT (SEQ ID NO:13)

Затем получали рекомбинантные антитела в другом раунде ОТ-ПЦР амплификации тотальной РНК, выделенной из гибридомной клеточной линии АТСС No.РТА-1155 0, с последующей во втором раунде полугнездовой ПЦР, как представлено выше. Амплифицированные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи по отдельности субклонировали в плазмидные векторы для экспрессии антитела.

Затем плазмиды трансфецировали в клетки СНО и получали рекомбинантный IgG, имеющий скелет человеческого IgG1. Супернатанты трансфецированных клеток СНО тестировали на связывание с антигеном в 96-луночном ELISA формате. В некоторых образцах супернатанта наблюдалось очень прочное связывание, хотя концентрации рекомбинантного IgG в супернатантах были низкими (а именно, около 10 нг/мл). С учетом низкой концентрации антитела в супернатанте можно считать, что результаты ELISA указывают на то, что рекомбинантные антитела были очень эффективными.

Последовательности инсертов в рекомбинантные плазмиды для экспрессии антител определяли секвенированием ДНК. Все они соответствовали одной последовательности тяжелой цепи и одной последовательности легкой цепи. Определяли нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, а предсказанные последовательности CDR представлены в SEQ ID NO:8-13.

ПРИМЕР 6

Сравнение эффективности антитела TAB-004 с другими методами обнаружения на основе опухолевых антигенов при раке молочной и поджелудочной желез

Современные клинические анализы крови на опухолевые антигены включают СА15-3 и СА27-29 для рака молочной железы и СА19-9 для рака поджелудочной железы. Нераковые, или незлокачественные заболевания могут вызывать повышенные уровни этих опухолевых антигенов, тем самым отрицательно влияя на способность этих антител применяться для точной детекции рака. Вследствие такой низкой специфичности важное значение этих тестов для диагностики еще требует доказательства.

Исходя из этого способность антитела TAB-004 детектировать уровень "слущивающегося" с клетки MUC1 в плазме пациентов сравнивали с сравнивали с эффективностью этих антител в образцах плазмы. Ферментативный иммуноанализ, иммуноферментный анализ (EIA, ИФА, ФИА) оптимизировали, применяя антитело TAB-004 для захвата и детекции уровня "слущивающегося" MUC1 в кровотоке. Коротко говоря, 96-луночный планшет ELISA сенсибилизировали, используя 100 мкл антитела TAB-004 с концентрацией 50 мкг/мл в PBS, и инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубации избыток иммобилизованного антитела TAB-004 удаляли из планшета. Планшет блокировали с помощью 200 мкл 1% сухого молока в PBS во избежание неспецифического связывания и инкубировали в течение 1 часа при 4°С. Планшеты тщательно отмывали (3 раза) с помощью 250 µ1 PBS, содержащего 0.05% (об/об) TWEEN®-20, используя устройство (вошер) для отмывки планшетов ELISA. Готовили стандарт MUC1, используя препарат 25-мерного полипептида MUC1 TR с концентрацией 0-2000 Ед./мл. Тестируемую плазму разводили 1:2 и 1:10 в 0.1% молока в PBS, в соответствующие лунки в тройном повторе добавляли 100 мкл, и планшеты инкубировали 2 часа при 37°С.

Затем планшеты отмывали и в каждую лунку добавляли 100 мкл поликлонального кроличьего антитела против антитела к MUC1 (Genway) в разведении 1:300000 в 0.1% молока в PBS, планшеты инкубировали 1 час при 37°С. Поликлональное антитело отмывали в лунках и добавляли меченное пероксидазой хрена антитело козы против кроличьего IgG в разведении 1:1000 в 0.1% молока в PBS и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После отмывки планшетов в лунки добавляли 100 мкл раствора, содержащего субстрат пероксидазы (ТМВ), и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. Реакцию прекращали, добавляя 25 мкл 4.0 N серной кислоты, и считывали оптическую плотность при 450 нм на спектрофотометре SPECTRA-MAX 250. Строили стандартные кривые с применением регрессивного анализа для определения концентраций неизвестных образцов.

Относительные единицы (Ед.)/мл выбирали на основании исходного контрольного эталона MUC1. Было определено, что линейный интервал составлял 50-800 Единиц/мл MUC1 антигена. Колебания в пределах анализа и между анализами контролировали, включая нормальные и аномальные образцы, чтобы гарантировать, что используемое оборудование, техник и применяемые в тесте реагенты работают как и предполагалось.

Сравнивали TAB-004 ИФА анализ в отношении образцов СА15-3 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, United States of America) рака молочной железы. Также проводили сравнение с образцами СА27-29 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY) для рака молочной железы и с СА19-9 (Panomics Inc, Redwood City, California, United States of America) для рака поджелудочной железы методами анализа ИФА. Для оценки чувствительности и специфичности TAB-004 ИФА по сравнению с имеющимися анализами ИФА проводили статистические анализы.

TAB-004 ИФА проводили, используя плазму 36 больных раком молочной железы, 24 больных раком простаты, 4 больных раком поджелудочной железы, 13 больных раком пищевода, 12 здоровых людей в качестве контроля, 3 больных панкреатитом и 1 больного диабетом (известно, что панкреатит и диабет представляют собой два заболевания, которые детектируются как ложноположительные в анализах, в которых определяется присутствие антигенов СА 15-3, СА 27-29 и СА 19-9). Большинство тестированных образцов от больных раком получены от больных на поздних стадиях заболевания

В предварительных результатах достигнута предельная концентрация <40 Ед/мл для здоровых пациентов (n=12). Найденная величина среднего и стандартного отклонения составляет 17.42 и 7.07 единиц/мл плазмы, соответственно (см. Фигуру 10). Начиная это исследование, мы планировали использовать величину менее 40 единиц/мл в качестве стандарта. Она охватила бы более 99.8% популяции при условии нормального распределения. Мы планировали, как часть этого исследования, уточнить величину предельной концентрации (порога), учитывая, что в наших предварительных результатах у нас было только 12 образцов, что, по- видимому, неестественно завышало стандартное отклонение.

При таком значении пороговой концентрации<40 Ед/мл, ни у одного из здоровых или больных панкреатитом пациентов показатели плазмы не были положительными, тогда как концентрация в плазме у всех больных раком составляла >40 Ед/мл (см. Фигура 10). Данные показывают, что в сравнении с анализом, в котором детектируется антиген СА15-3, анализ TAB-004 ИФА превосходит его, позволяя с более высокой специфичностью и чувствительностью обнаруживать антиген в плазме больных раком молочной железы по сравнению с плазмой здоровых добровольцев. В то время как ложноположительные результаты в анализе с TAB-004 отсутствовали, в анализе с СА15-3 у 5 из 12 здоровых пациентов получены ложноположительные результаты (p=0.031, при использовании одностороннего критерия; <31 Ед/мл, опубликованное пороговое значение для анализа на основе СА15-3). Пробы плазмы всех больных раком были позитивны в отношении TAB-004, но 3 из 36 образцов плазмы были ложноотрицательными в случае с СА-15-3 (<31 Ед/мл). В общем, разница между показателями в плазме больных раком молочной железы и здоровых людей была значительно выше в тесте с TAB-004 по сравнению с СА15-3 тестом. Также в СА 15-3 тесте наблюдалось значительное перекрывание между показателями для плазмы здоровых людей и больных раком, тогда как в TAB-004 тесте такое перекрывание отсутствовало (см. Фигура 10).

Для того, чтобы лучше оценить эффективность антитела TAB-004 для определения стадии заболевания, проводили TAB-004 ИФА образцов плазмы от n=5 на стадии 0, 2, 3, и 4 больных раком поджелудочной железы. На Фигуре 11 показано, что средняя разница между анализами TAB-004 и СА 15-3 была статистически значимой на всех 4 стадиях рака (стадия 0 p=0.049; стадия 2 p=0.008; стадия 3 p=0.017; и стадия 4 p=0.008). Анализ TAB-004 дает значения, которые выше значений в анализе СА15-3 для всех 20 образцов. Кроме того, уровни в анализе TAB-004 зависели от стадии опухоли, поскольку они повышались с прогрессированием заболевания (p<0.0001), в отличие от анализа СА 15-3, который не смог предсказать разницу между стадиями 0, 2 и 3. При сравнении данных, собранных по стадиям, с диапазоном значений для здоровых людей (нормального интервала), найденном на Фигуре 10 (<40 Ед/мл), становится очевидным, что анализ TAB-004 превосходит анализ СА15-3 в диагностике стадий 2 и 3, так как у всех больных на стадии 2 и 3 анализ TAB-004 дает значения выше нормального интервала, тогда как только у 2 из 10 больных в анализе СА 15-3 значения были выше нормального.

ПРИМЕР 7

Корреляция уровней циркулирующего MUC1 с прогрессированием заболевания и рецидивом

Оценивали возможность применения TAB-004 для точного прогнозирования рецидива и прогрессирования заболевания. Образцы плазмы от n=100 больных раком молочной железы на стадиях П и III/IV проверяли во время премедикации и через 6, 12 и 18 месяцев после окончания стандартного лечения. Рецидив в этой группе оценивали через 24 месяца. Образцы плазмы от n=50 больных раком поджелудочной железы на стадиях 2, 3 и 4 оценивали при премедикации и через 3, 6, 9 и 12 месяцев после стандартного лечения.

Сбор образцов для анализа. Образец плазмы отбирали во время очередного визита. Стадию заболевания подтверждали с помощью патологической оценки, а рецидив подтверждали стандартными методами визуализации. Базы данных сохраняли подробную информацию о любой химиотерапии и вспомогательной терапии, которую применяли для лечения больных раком поджелудочной железы.

При раке молочной железы частота рецидивов обычно значительно ниже по сравнению с раком поджелудочной железы и поэтому изучалось меньшее число больных раком поджелудочной железы (статистически обоснованно меньшее). Периодичность сбора образцов плазмы у больных раком молочной и раком поджелудочной желез также различается ввиду разницы в стандартной частоте очередных визитов.

Обычно у немногих больных раком поджелудочной железы на стадии 3 и 4 выживаемость составляет от более 6 месяцев до года, и поэтому невозможно ждать окончания лечения для повторного сбора образцов вследствие высокого коэффициента смертности после диагностики. Образцы отбирали во время проведения терапии. У пациентов, которым предстоит операция, образцы отбирали перед операцией и через 3, 6, 9 и 12 месяцев после операции вне зависимости от их схемы лечения. У пациентов с неоперабельным раком образцы отбирали при диагностике перед началом терапии, а затем через 3, 6, 9, 12 месяцев после диагностики вне зависимости от схемы лечения. Так как рецидив у большинства пациентов ожидается в течение года, лечение прекращают через 12 месяцев. У больных раком молочной железы только на стадии III/IV рецидив обычно ожидают в пределах 2 лет. Однако для сравнения были включены больные на стадии II. Образцы плазмы отбирали при премедикации, а затем через 6, 12 и 18 месяцев после окончания лечения.

Анализ и статистика: Были проведены анализы, чтобы узнать, позволят ли анализы на основе TAB-004 прогнозировать рецидив и/или смерть больных раком молочной железы. Пациентов делили на тех, у кого был рецидив за период исследования, и тех, у кого не было рецидива. Строили графики зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (кривые ROC), чтобы определить, имеется ли естественная точка отсечки для TAB-004 для прогнозирования рецидива. Для пациентов с рецидивом в анализе использовали предыдущий уровень TAB-004, тогда как для пациентов без рецидива использовали конечные значения TAB-004. Например, если рецидив происходит через 15 месяцев, тогда использовали уровень TAB-004 в момент 12 месяцев. Проверяли модели пропорциональных опасностей (модели Кокса) с временем до рецидива в качестве зависимой (конечная точка) переменной. Модель Кокса является многовариантной процедурой, которая позволяет корректно учитывать потерянные и дополнительные данные и цензурированную информацию. Возраст, стадия рака и степень злокачественности и значения TAB-004 регистрировались как независимые прогностические показатели. Если ROC определяет естественную точку отсечки для прогнозирования рецидива, тогда прогоняют другую модель Кокса с этой дихотомической (выше или ниже точки отсечки) переменной вместо действительного значения TAB-004 в модели. Статистически значимое значение р для TAB-004 переменной показывает, что TAB-004 является независимым прогностическим фактором для рецидива при корректировке по возрасту пациента, стадии рака и степени злокачественности опухоли. Повторяют предыдущую серию анализов с временем до рецидива или смерти в качестве зависимой переменной. Для больных раком на стадии 0, I и II применяли такой же подход, чтобы прогнозировать время до стадии III/IV (метастатического) рака.

Эту серию анализов проводили также, используя данные для больных раком поджелудочной железы. При чрезвычайно высоком коэффициенте смертности при раке поджелудочной железы получить устойчивые оценки коэффициентов в модели Кокса для предсказания времени до рецидива или до 4 стадии заболевания может быть трудно. Соответственно, за период исследования могло произойти несколько рецидивов рака или несколько случаев прогрессирования рака от стадий 2 или 3 до стадии 4 метастатического рака.

ПРИМЕР 8

Корреляция уровней TAB-004-позитивных СТС с прогнозом заболевания и уровнями TAB-004 в плазме и сравнение числа и метастатического потенциала СТС, выделенных при использовании антитела TAB-004 versus антитело ЕрСАМ

Циркулирующие опухолевые клетки (СТС) определяются как опухолевые клетки в кровотоке. В настоящее время система Veridex CELLSEARCH® является единственной системой, одобренной FDA, для определения числа СТС у больных метастатическим раком молочной железы, раком прямой или ободочной кишки и предстательной железы (простаты). С применением этой системы было показано, что у больных раком поджелудочной железы наблюдалась корреляция между СТС<1 и выживаемостью. Примечательно, что в том же самом исследовании было показано, что присутствие СТС коррелировало с повышенными сывороточными уровнями опухолевого антигена СА 19-9, это показывает, что сывороточные уровни опухолевых антигенов могут также являться показателями опухолевых клеток в кровотоке. Было найдено, что у больных метастатическим раком молочной железы ≤5 СТС является независимым прогностическим фактором выживаемости без прогрессирования заболевания и общей выживаемости. Помимо этого, уровни СТС у больных метастатическим раком молочной железы являются более ранним, лучше воспроизводимым показателем статуса заболевания, чем современные методы визуализации.

Одобренный метод определения СТС включает выделение клеток, экспрессирующих ЕрСАМ, из образцов крови, а затем подтверждение этих клеток как СТС с помощью специфического к эпителиальным клеткам окрашивания цитокератином, соответствующего окрашивания ядер и отсутствия лейкоцит-специфического CD45. Возражение против этого метода вызвано тем, что он ограничивается клетками, экспрессирующими ЕрСАМ. Исследования показали, что клетки, приобретающие миграционный фенотип, теряют свои эпителиальные характеристики и приобретают признаки мезенхимных клеток, которые, как было показано, фенотипически являются клетками, ответственными за развитие агрессивной опухоли. Поэтому очевидно, что выделение на основе ЕрСАМ могло упустить наиболее активные СТС-клетки, имеющие фенотип мезенхимных клеток.

Как первичные, так и метастатические опухоли молочной и поджелудочной желез экспрессировали высокие уровни ассоциируемого с опухолью MUC1, распознаваемого нашим антителом TAB-004. Следовательно, СТС у этих пациентов должны были распознаваться антителом TAB-004. В предварительных экспериментах уровни MUC1 определяли, используя антитело TAB-004. Сначала проверяли возможность применения системы Veridex CELLSEARCH® для количественного определения экспрессирующих MUC1 СТС на образцах крови 7.5 мл (аналогичных человеческим образцам), в которые добавляли клетки PANC1, которые являются клетками клеточной линии рака поджелудочной железы человека. Около 90% клеток СТС (ЕрСАМ+клеток) экспрессировали MUC1. Затем брали образцы у пациентов, и было найдено, что TAB-004 распознает СТС с эффективностью от около 33% до 100%. Таким образом, применение антитела TAB-004 позволяет точно детектировать микрометастазы у больных раком поджелудочной и молочной желез.

ССЫЛОЧНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Все перечисленные ниже ссылочные материалы, а также все материалы, цитированные в настоящем раскрытии, включая, но без ограничения, все патенты, заявки на патент и опубликованные заявки на патент, статьи из научных журналов и значения в базах данных (например, значения в базе данных GENBANK® и все имеющиеся там примечания) полностью включены в настоящее изобретение в качестве отсылки в тех случаях, когда они дополняют, поясняют, поясняют предпосылки, или дают принципы, методы и/или композиции, применяемые в настоящем изобретении.

Adams et al. (1993) Cancer Res 53:4026-4034.

Alexay et al. (1996) The PCT International Society of Optical Engineering 2705/63.

Al-Hajj et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:3983-3988.

Alt et al. (1999) FEBS Lett 454:90-94.

Amemiya et al. (1988) Topics Curr Chem 147:121-144.

Barratt-Boyes (1996) Cancer Immunol Immunother 43:142-151.

Basnet al. (2006) J Immunol 177:2391-2402.

Bauminger & Wilchek (1980) Meth Enzymol 70:151-159.

Berkow et al. (1997) The Merck Manual of Medical Information, Home ed. Merck Research

Laboratories, Whitehouse Station, New Jersey, United States of America.

Bieche & Lidereau (1997) Cancer Genetics and Cytogenetics 98:75-80.

Bird et al. (1988) Science 242:423-426.

Blaskovich et al. (2003) Cancer Res 63:1270-1279.

Bonnet & Dick (1997) Nat Med 3:730-737.

Brabletz et al. (2005) Nat Rev Cancer 5:744-749.

Cameron et al. (2009) Bioorg Med Chem Lett 19:2075-2078.

Chattopadhyay et al. (2001) Nucl Med Biol 28:741-744.

Cheng (1996) Hum Gene Ther 7:275-282.

Chothia & Lesk (1987) J Mol Biol 196:901-917.

Cristofanilli et al. (2005) J Clin Oncol 23:1420-1430.

Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628.

Coatney (2001) Ilar J 42:233-247.

Coloma et al. (1997) Nature Biotechnol 15:159-163.

David et al. (1974) Biochemistry 13:1014.

DeCosta Byfield et al. (2004) Mol Pharmacol 65:744-752.

Dong et al. (1997) J Pathology 183:311-317.

Dontu et al. (2004) Breast Cancer Res 6:R605-615.

Donzella et al. (1998) Nat Med 4:72-77.

Duchetal. (1998) Toxicol. Lett. 100-101:255-263.

Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology. CRC Press, Boca Raton, Florida,

United States of America.

Emanueli et al. (2004) Arterioscler Thromb Vase Biol 24:2082-2087.

European Patent No 0439095.

Fong et al. (1999) Cancer Res 59:99-106.

Fraser (1996) Meth Cell Biol 51:147-160.

GENBANK® номера доступа. AAA39755; AAA60019; AA063589; J055821; NM_004985.3; NP_001181906; NP_004976; NP_036734; NP_038633; P_776540; Q02496.

Gennaro (1990) Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pennsylvania, United States of America.

Gennaro (ed.) (2003) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania, United States of America.

Glockshuber et al. (1990) Biochemistry 29:1362-1367.

Gold et al. (2007) Clin Cancer Res 13:7380-7387.

Goldman et al. (1997) Cancer Res 57:1447-1451.

Goodman et al. (1996) Goodman & Gilman′s the Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th ed. McGraw-Hill Health Professions Division, New York, New York, United States of America.

Hallahan et al. (2001a) Am J Clin Oncol 24:473-480.

Hallahan et al. (20010) J Control Release 74:183-191.

Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448.

Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, United States of America).

Heijnen et al. (1997) J Immunol 159:5629-5639.

Henderson et al. (1998) J Immunother 21:247-256.

Heredia et al. (1991) J Neurosci Meth 36:17-25.

Hingorani et al. (2003) Cancer Cell 4:437-450.

Hnatowich et al. (1996) J Pharmacol Exp Ther 276:326-334.

HoUigGTetal. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448.

Holliger et al. (1999) Cancer Res 59:2909-2916.

Hu et al. (1996) Cancer Res 56:3055-3061.

Hunter et al. (1962) Nature 144:945.

Huston et al. (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:5879-5883.

Huston et al. (1993) Int Rev Immunol 10:195-217.

Jackson et al. (2001) Genes Dev 15:3243-3248.

Johnson & Wu (2000) Nucleic Acids Res 28:214-218.

Kabat et al. (1991) (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. Fifth Edition. NIH Publication No.91-3242.

Kahn et al. (1987) Anticancer Res 7:639-652.

Kahnet al. (1987) Anticancer Res 7(4A):639- 652.

Katzung (2001) Basic & Clinical Pharmacology, 8th ed., Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub. Division, New York, New York, United States of America.

Kawaguchi et al. (2002) Nat Genet 32:128-134.

Kipriyanov et al. (1995) Cell Biophys 26:187-204.

Kipriyanov et al. (1998), Int J Cancer 77:763-772.

Kipriyanov et al. (1999) J Mol Biol 293:41-56.

Kohler et al. (1975) Nature 256:495.

Kontermann et al. (1999) J Immunol Meth 226:179-188.

Kortt et al. (1997) Protein Eng 10:423-433.

Kostelny et al. (1992), J Immunol 148:1547-1553.

Kurihara et al. (2008) J Hepatobiliary Pancreat Surg 15:189-195.

Kwiczetal. (1995) J Immunol 154:4576-4582.

Le Gall et al. (1999) FEBS Lett 453:164-168.

Lees (2001) Semin Ultrasound CT MR 22:85-105.

Licha et al. (2000) Photochem Photobiol 72:392-398.

Littlefield et al. (2008) Inorg Chem 47:2798-2804.

Manome et al. (1994) Cancer Res 54:5408-5413.

Marks et al. (1991) J Mol Biol 222:581-597.

Martin (1996) Proteins 25:130-133.

McCartney et al. (1995) Protein Eng 8:301-314.

McGucken et al. (1995) Human Pathology 26: 432-439.

Mukherjee et al. (2000) J Immunol 165:3451-3460.

Mukherjee et al. (2007) Vaccine 25:1607-1618.

Mukherjee et al. (2009) J Immunol 182:216-224.

Muller & Scherle (2006) Nature Rev Can 6:613-625. Muller et al. (1998) FEBS Lett 432:45-49.

Nabel (1997) Vectors for Gene Therapy In Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, New York, New York, United States of America.

Neri et al. (1997) Nat Biotechnol 15:1271-1275.

Nygren (1982) J Histochem Cytochem 30:407.

Pack et al. (1992) Biochemistry 31:1579-1584.

Pain et al. (1981) J Immunol Meth 40:219).

Pardal et al. (2003) Nat Rev Cancer 3:895-902.

Park et al. (1997) Adv Pharmacol 40:399-435.

Pasqualini et al. (1997) Nat Biotechnol 15:542-546.

Paul (1993) Fundamental Immunology, Raven Press, New York, New York, United States of America.

Опубликованные Международные заявки на патент РСТ No. WO 1992/22653; WO 1993/25521.

Pearson & Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:2444-2448.

Perkins et al. (2003) Am Fam Physician 68:1075-1082.

Peterson et al. (1991) m Breast Epithelial Antigens, (Ceriani, ed). Plenum Press, New York, New York, United States of America, pages 55-68.

Pomper & Port (2000) Magn Reson Imaging Clin N Am 8:691-713.

Price etal. (1998) Tumor Biology 19:1 20.

Quin et al. (2000) Int J Cancer 87:499-506.

Ragnarson et al. (1992) Histochemistry 97:329-333.

Reya et al. (2001) Nature 414:105-111.

Rothenfusser et al. (2002) Human Immunology 63:1111-1119.

Rovaris et al. (2001) J Neurol Sci 186 Suppl 1:S3-9.

Rowse et al. (1998) Cancer Res 58:315-321.

Rugo et al. (2005) J din Oncol 23:5474-5483.

Sagiuchi et al. (2001) Ann Nucl Med 15:267-270.

Saltzman & Fung (1997) Adv Drug Deliv Rev 26:209-230.

Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, United States of America.

Sawyer etal. (2004) Bioorg Med Chem Lett 14:3581-3584.

Schwendener (1992) Chimia 46:69-77.

Shalaby et al. (1992) JExp Med 175:217-225.

Sharkey et al. (2003) Cancer Res 63:354-363.

Sharkey et al. (2003) din Cancer Res 9:3897S-3913S.

Shen et al. (1993) Magn Reson Med 29:599-604.

Speight et al. (1997) Avery′s Drug Treatment: A Guide to the Properties, Choice, Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management, 4th ed., Adis International, Auckland, New Zealand.

Singh et al. (2004) Nature 432:396-401.

Tavitian et al. (1998) Nat Med 4:467-471.

Tinder et al. (2008) J Immunol 181:3116-3125.

Патенты США No.4551482; 4816567; 5088499; 5147631; 5234933; 5326902; 5490840; 5510103; 5574172; 5651991; 5688931; 5707605; 5714166; 5738837; 5786387; 5855900; 5858410; 5865754; 5922356; 5922545; 5928627; 5994392; 6024938; 6071890; 6080384; 6083486; 6106866; 6127339; 6172197; 6221018; 6231834; 6245318; 6246901; 6248516; 6254852; 6291158; 6548643; 7183388.

Vinogradov et al. (1996) Biophys J 70-1609-1617.

Weissleder et al. (1992) Magn Reson Q 8:55-63.

Weissleder et al. (1999) Nat Biotechnol 17:375-378.

Whitlow et al. (1991) Methods companion Methods Enzymol 2:97-105.

Yoo et al. (1997) JNucl Med 38:294-300.

Zhu et al. (1997) Protein Sci 6:781-788.

Zola (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc, Boca Raton, Florida, United States of America, pp 147-158.

Понятно, что различные детали раскрываемого настоящего изобретения можно изменять, не отступая от объема настоящего изобретения. Кроме того, вышеприведенное описание дается только с целью иллюстрации, но не с целью ограничения.

1. Выделенное антитело, или его фрагмент, которые специфически связываются с муцином-1 человека (MUC1 человека) и с мутантным K-ras^G12D, содержащее гипервариабельные участки (CDR) моноклонального антитела ТАВ-004, где указанное выделенное антитело, или его фрагмент, является поликлональным или моноклональным, где
(i) CDR моноклонального антитела ТАВ-004 включают CDR1 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 8; CDR2 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 9; CDR3 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10; CDR1 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 11; CDR2 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 12; и CDR3 легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 13; и/или
(ii) антитело, или его фрагмент, включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 5 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 4; и вариабельный участок легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 7 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 6.

2. Выделенное антитело, или его фрагмент, по п. 1, выбранное из группы, состоящей из моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией ТАВ-004, депонированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером доступа РТА-11550; химерного антитела или его фрагмента; гуманизированного антитела или его фрагмента; одноцепочечного антитела или его фрагмента; и фрагмента Fab, при этом химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или фрагмент Fab содержит CDR моноклонального антитела ТАВ-004, при этом:
(i) CDR моноклонального антитела ТАВ-004 включают CDR1 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 8; CDR2 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 9; CDR3 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10; CDR1 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 11; CDR2 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 12; и CDR3 легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 13; и/или
(ii) антитело, или его фрагмент, включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 5 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 4; и вариабельный участок легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 7 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 6.

3. Композиция для лечения такого ракового заболевания, при котором наблюдается усиленная экспрессия MUC1 человека или мутантного K-ras^G12D, содержащая антитело, или его фрагмент, по п. 1, и фармацевтически приемлемый носитель, в которой, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель приемлем для введения людям.

4. Композиция для скрининга такого ракового заболевания, при котором наблюдается усиленная экспрессия MUC1 человека или мутантного K-ras^G12D, содержащая антитело, или его фрагмент, по п. 1, конъюгированное с детектируемым агентом, в которой детектируемый агент выбран из группы, состоящей из хромофора, флюоресцентного агента, флуорофора, цианинового красителя, красителя, поглощающего в ближней ИК-области, фермента, антигена, хемилюминесцентного соединения, электрохимически детектируемого агента, биотина, радиоактивной молекулы и их комбинаций.

5. Композиция по п. 4, причем детектируемый агент является биотином или радиоизотопом, выбранным из группы, состоящей из ¹⁰В, ²¹¹At, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, and ³H.

6. Набор для лечения такого ракового заболевания, при котором наблюдается усиленная экспрессия MUC1 человека или мутантного K-ras^G12D, содержащий антитело, или его фрагмент, по п. 1, и инструкции по его применению.

7. Выделенная клетка, которая продуцирует антитело, или его фрагмент, по п. 1.

8. Гибридома, продуцирующая антитело по п. 1, которая является клеткой гибридомной клеточной линии с номером доступа РТА-11550, депонированной в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (АТСС)) по условиям Будапештского договора.

9. Способ обнаружения наличия эпитопа, с которым связывается моноклональное антитело ТАВ-004 в биологическом образце, включающий:
(а) приведение биологического образца в контакт с выделенным антителом, или его фрагментом, по п. 1; и
(б) обнаружение наличия эпитопа, с которым моноклональное антитело ТАВ-004 связывается в биологическом образце и который находится на полипептиде муцина (MUC1 человека) или на полипептиде K-ras^G12D.

10. Способ получения антитела или его фрагмента, включающий:
(а) культивирование выделенной клетки по п. 7 или гибридомы по п. 8 в таких условиях, в которых происходит экспрессия указанного антитела, его фрагмента; и
(б) выделение указанного антитела, или его фрагмента, из клетки или гибридомы и/или из среды, в которой происходит рост клетки или гибридомы.

11. Способ обнаружения опухолевой и/или раковой клетки у субъекта, включающий:
(а) приведение биологического образца, необязательно, образца крови или ее фракции, в организме субъекта или образца, взятого у субъекта, в контакт с композицией, содержащей антитело, или его фрагмент, по п. 1, в условиях, достаточных для связывания антитела, или его фрагмента, по п. 1 с эпитопом, присутствующим в опухолевой и/или в раковой клетке, если они имеются, в биологическом образце; и
(б) обнаружение связывания антитела, или его фрагмента, по п. 1 с эпитопом,
при этом обнаружение является показателем наличия опухолевой и/или раковой клетки у субъекта; при этом где опухолевая и/или раковая клетка экспрессирует MUC1 человека и/или мутантный K-ras^G12D полипептид; и, необязательно:
(i) опухоль и/или раковая клетка представляет собой опухоль поджелудочной железы, молочной железы, яичника, толстой кишки или прямой кишки и/или метастатическую клетку, происходящую из нее, которая, необязательно, экспрессирует MUC1 человека, мутантный K-ras^G12D или и то, и другое; или
(ii) антитело, или его фрагмент, конъюгировано с детектируемой меткой, включающей визуализирующий агент, выбранный из группы, состоящей из парамагнитного, радиоактивного или флуорогенного ионов,
где радиоактивные ионы; или
(iii) радиоактивный визуализирующий агент выбран из группы, состоящей из ⁴³K, ⁵²Fe, ⁵⁷Со, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁷Br, ⁸¹Rb/^81MKr, ^87MSr, ^99MTc, ¹¹¹In, ¹¹³In, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹²⁷Cs, ¹²⁹Cs, ¹³¹I, ¹³²I, ¹⁹⁷Hg, ²⁰³Pb и ²⁰⁶Bi.

12. Способ подавления роста опухоли у субъекта, включающий введение субъекту, имеющему опухоль, эффективного количества выделенного антитела, или его фрагмента, содержащего гипервариабельные участки (CDR) моноклонального антитела ТАВ-004, где опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы, молочной железы, яичника, толстой кишки или прямой кишки и/или метастатическую клетку, происходящую из нее, которая экспрессирует MUC1 человека, мутантный K-ras^G12D или и то, и другое, и где
(i) CDR моноклонального антитела ТАВ-004 включают CDR1 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 8; CDR2 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 9; CDR3 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10; CDR1 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 11; CDR2 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 12; и CDR3 легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 13; и/или
(ii) антитело, или его фрагмент, включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 5 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 4; и вариабельный участок легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 7 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 6.

13. Способ по п. 12, дополнительно включающий проведение одной или более дополнительных противоопухолевых терапий субъекта, где, необязательно, одна или более дополнительных противоопухолевых терапий выбраны из группы, состоящей из лучевой терапии, химиотерапии, при необходимости включающей введение гемцитабина (4-амино-1-(2-дезокси-2,2-дифтор-β-D-эритро-пентофуранозил) пиримидин-2(1Н)-он-2′,2′-дифтор-2′-дезоксицитидина), целекоксиба (4-[5-(4-метилфенил)-3-(трифторметил)пиразол-1-ил]бензосульфонамида) или фармацевтически приемлемых солей любого из них или обоих; дополнительной иммунотерапии; противовоспалительной терапии, при необходимости включающей введение субъекту ингибитора циклооксигеназы, необязательно, ингибитора, специфического к циклооксигеназе - 2; и их комбинаций.

14. Способ очистки раковой стволовой клетки, при этом раковая клетка экспрессирует MUC1 человека и/или мутантный K-ras^G12D полипептид, включающий:
(а) предоставление популяции клеток, предположительно, содержащей раковые стволовые клетки, необязательно, циркулирующие клетки, выделенные у субъекта, имеющего опухоль и/или больного раком.
(б) идентификацию субпопуляции клеток, которые связываются с антителом, или его фрагментом, содержащим CDR моноклонального антитела TAB- 004; и где
(i) CDR моноклонального антитела ТАВ-004 включают CDR1 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 8; CDR2 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 9; CDR3 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10; CDR1 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 11; CDR2 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 12; и CDR3 легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 13; и/или
(ii) антитело, или его фрагмент, включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 5 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 4; и вариабельный участок легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 7 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 6;
(в) очистку субпопуляции; и при необходимости
(г) удаление клеток, позитивных по линии дифференцировки (lin⁺), из популяции клеток перед стадией идентификации и/или после стадии очистки.

15. Способ нацеливания активного агента на циркулирующую раковую стволовую клетку у субъекта, включающий приведение циркулирующей раковой стволовой клетки в контакт с композицией, содержащей антитело, или его фрагмент, которые содержат CDR моноклонального антитела ТАВ-004 и активный агент, при этом раковая клетка экспрессирует MUC1 человека и/или мутантный K-ras^G12D полипептид, и при этом активный агент при необходимости представляет собой терапевтический агент, химиотерапевтический агент, токсин, радиотерапевтический агент или их комбинацию; и где
(i) CDR моноклонального антитела ТАВ-004 включают CDR1 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 8; CDR2 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 9; CDR3 тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10; CDR1 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 11; CDR2 легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 12; и CDR3 легкой цепи CDR3, содержащий SEQ ID NO: 13; и/или
(ii) антитело, или его фрагмент, включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 5 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 4; и вариабельный участок легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 7 или кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 6.

16. Способ по п. 15, где терапевтический агент включает иммуномодулирующий агент, необязательно выбранный из группы, состоящей из ингибитора индоламин 2,3-диоксигеназы (IDO), при необходимости 1-метил- DL-триптофана (1МТ); антагониста рецептора ЕР2/ЕР4; и активатора дендритных клеток, при необходимости CpG-олигодезоксинуклеотидов (CpG ODN).

17. Способ прогнозирования рецидивов и/или прогрессирования рака у субъекта, который подвергался лечению от рака, при котором наблюдается усиленная экспрессия MUC1 человека или мутантного K-ras^G12D; включающий:
(а) выделение биологического образца, содержащего циркулирующие клетки, из организма субъекта, больного раком, где:
(i) биологический образец представляет собой пробу крови, пробу лимфы или их фракцию; и/или
(ii) рак представляет собой рак поджелудочной железы или рак молочной железы;
(б) приведение биологического образца в контакт с антителом, или его фрагментом, по п. 1 или п. 2 в условиях, достаточных для связывания антитела, или его фрагмента, по п. 1 с эпитопом, содержащимся в опухоли и/или в раковой клетке, если они имеются, в биологическом образце; и
(в) идентификацию в биологическом образце одной или более циркулирующих клеток, которые связываются с антителом, или его фрагментом, по п. 1 или п. 2,
причем у субъекта прогнозируют рецидив и/или прогрессирование ракового заболевания.

18. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его фрагмент которые специфически связываются с муцином-1 человека (MUC1 человека) и с мутантным K-ras^G12D, которая:
(i) содержит последовательности SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6; или
(ii) кодирует последовательности SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7; или
(iii) кодирует вариабельный участок тяжелой цепи, включающий SEQ ID NO: 8-10; или
(iv) кодирует участок легкой цепи включающий SEQ ID NO: 11-13.

19. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 18, которая находится в векторе, необязательно, в экспрессионном векторе, и кроме того, при необходимости в экспрессионном векторе функционально связана с одной или более дополнительными нуклеотидными последовательностями, кодирующими последовательности молекул антитела таким образом, что при введении экспрессионного вектора в соответствующего хозяина клетка-хозяин экспрессирует интактное рекомбинантное антитело, содержащее одну или более последовательностей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8-10, и/или SEQ ID NO: 11-13.

20. Способ обнаружения опухолевой и/или раковой клетки у субъекта in vitro, включающий:
(а) приведение биологического образца, необязательно, образца крови или ее фракции, в организме субъекта или образца, взятого у субъекта, в контакт с композицией, содержащей антитело, или его фрагмент, по п. 1, в условиях, достаточных для связывания антитела, или его фрагмента, по п. 1 с эпитопом, присутствующим в опухолевой и/или в раковой клетке, если они имеются, в биологическом образце; и
(б) обнаружение связывания антитела, или его фрагмента, по п. 1 с эпитопом,
при этом обнаружение является показателем наличия опухолевой и/или раковой клетки у субъекта; при этом опухолевая и/или раковая клетка экспрессирует MUC1 человека и/или мутантный K-ras^G12D полипептид; и:
(i) опухоль и/или раковая клетка представляет собой опухоль поджелудочной железы, молочной железы, яичника, толстой кишки или прямой кишки и/или метастатическую клетку, происходящую из нее, которая, необязательно, экспрессирует MUC1 человека, мутантный K-ras^G12D или и то, и другое; или
(ii) антитело, или его фрагмент, конъюгировано с детектируемой меткой, включающей визуализирующий агент, выбранный из группы, состоящей из парамагнитного, радиоактивного или флуорогенного ионов,
где радиоактивные ионы; или
(iii) радиоактивный визуализирующий агент выбран из группы, состоящей из ⁴³K, ⁵²Fe, ⁵⁷Со, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁷Br, ⁸¹Rb/^81MKr, ^87MSr, ^99MTc, ¹¹¹In, ¹¹³In, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹²⁷Cs, ¹²⁹Cs, ¹³¹I, ¹³²I, ¹⁹⁷Hg, ²⁰³Pb и ²⁰⁶Bi.

21. Композиция для скрининга такого ракового заболевания, при котором наблюдается усиленная экспрессия MUC1 человека или мутантного K-ras^G12D, содержащая антитело, или его фрагмент, по п. 1, и фармацевтически приемлемый носитель, в которой, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель приемлем для введения людям.

22. Набор для скрининга такого ракового заболевания, при котором наблюдается усиленная экспрессия MUC1 человека или мутантного K-ras^G12D, содержащий антитело, или его фрагмент, по п. 1, и инструкции по его применению.