Способ получения базовой композиции биопрепарата для растениеводства

Изобретение относится к технологии производства биопрепаратов для растениеводства. Изобретение представляет собой способ получения базовой композиции биопрепарата для растениеводства, включающий в себя наработку биомассы гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1134, удаление культуральной жидкости, извлечение из мицелия комплекса жирных кислот с преобладанием арахидоновой кислоты, приготовление из него спиртового раствора с введением дополнительных компонентов, где гриб выращивается на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды, инокуляция которой осуществляется до розлива, процесс культивирования длится 18-19 суток, разрушение мицелия осуществляется криодеструкцией и щелочным гидролизом, в конечный продукт добавляется биоразлагаемый детергент, где наработка биомассы происходит на картофельном отваре с добавлением глюкозы и хлорида кальция, наработка биомассы происходит в термостате, биомасса подвергается криодеструкции во влажном состоянии, щелочной гидролиз биомассы проводится при температуре 60°С, стадию щелочного гидролиза совмещают с первым этапом экстракции жирных кислот благодаря использованию раствора гидроксида натрия в 96% этиловом спирте, на втором этапе экстракции жирных кислот в качестве экстрагента используется н-гексан, комплекс жирных кислот после удаления н-гексана перерастворяется в 96% этиловом спирте. Способ позволяет существенно упростить и удешевить процесс получения базовой композиции биопрепаратов для растениеводства. 7 з.п. ф-лы, 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к технологии производства биологических средств, для повышения продуктивности культурных растений, обладающих комплексной активностью.

Известен способ получения композиции для иммунизации растений, предусматривающий культивирование микромицета Mortierella hygrophila ВКМ F-1854 на питательной среде, отделение мицелия и выделения из него целевого продукта, основным действующим компонентом которого является этиловый или метиловый эфир арахидоновой кислоты (RU 2058078, опубл. 20.04.1996). Недостатками этого способа являются использование специфических питательных сред, содержащих сравнительно дорогостоящие компоненты, и получение средства с узким спектром действия.

Известен способ получения полиненасыщенных жирных кислот из биомассы гриба Mortierella alpina Peyronel БС-2 (VKM F-3625), предусматривающий перевод липидной фракции в водорастворимые соли жирных кислот с последующим отделением их от биомассы и нейтрализацией соляной кислотой (RU 2141529, опубл. 20.11.1999). Недостатком данного способа является необходимость очистки продукта посредством фильтрации через силикагель и оксид алюминия.

Известен способ приготовления средства для обработки растений, предусматривающий культивирование микромицета Mortierella alpina, отделение биомассы, выделение липидсодержащего экстракта с использованием экстрагента в надкритическом состоянии и введением в экстракт дополнительных компонентов одновременно с переводом экстрагента в докритическое состояние (RU 2192746, опубл. 20.11.2002).

Недостатком этого способа является необходимость использования сжиженных газов, что значительно осложняет процесс получения целевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому является способ производства средства для обработки растений, предполагающий культивирование микромицета Mortierella alpina, отделение биомассы, выделение из нее полупродукта, содержащего в качестве активного начала производные арахидоновой кислоты, и введение в него дополнительных компонентов для получения целевого продукта (RU 2075934, опубл. 27.03.1997). Недостатком этого способа является получение средства, склонного к образованию расслаивающихся рабочих растворов и недостаточное время культивирования гриба, что уменьшает процентное содержание арахидоновой кислоты в продукте.

Кроме того, недостатком всех вышеперечисленных способов является энергозатратность при наработке биомассы микромицетов с использованием ферментеров, низкий выход биомассы по сравнению с количеством питательной среды и необходимость привлечения обслуживающего персонала в составе нескольких человек.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является упрощение и удешевление процесса получения базовой композиции биопрепарата.

Данная задача решается за счет того, что заявленный способ получения базовой композиции биопрепарата для растениеводства, включающий наработку биомассы гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1134, удаление культуральной жидкости, извлечение из мицелия комплекса жирных кислот с преобладанием арахидоновой кислоты, приготовление из него спиртового раствора с введением дополнительных компонентов, отличающийся тем, что гриб выращивается на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды, инокуляция которой осуществляется до розлива, процесс культивирования длится дольше, чем необходимо для достижения максимальной биомассы, разрушение мицелия осуществляется криодеструкцией и щелочным гидролизом, в конечный продукт добавляется биоразлагаемый детергент.

Это позволяет снизить энергопотребление при выращивании гриба, сделать возможным осуществление всех этапов приготовления композиции силами одного сотрудника (лаборанта), получать не менее 50% арахидоновой кислоты от суммы всех извлекаемых жирных кислот, достичь однородности конечной композиции биопрепарата.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения предполагается наработка биомассы М. alpina ВКПМ F-1134 на картофельном отваре с добавлением глюкозы (80 г/л) и хлорида кальция (0,6 г/л). Это позволяет удешевить питательную среду, сохраняя высокое содержание арахидоновой кислоты в сумме получаемых липидов.

Наработку биомассы предпочтительно осуществлять в термостате. Это позволит значительно снизить энергозатраты, так как при этом не осуществляется перемешивание и искусственная аэрация, в отличие от культивирования гриба в ферментере. Кроме того, для эксплуатации термостата достаточно одного сотрудника квалификации лаборант.

В предпочтительном варианте изобретения биомассу гриба подвергают криодеструкции во влажном состоянии, а щелочной гидролиз, осуществляемый с помощью этанольного раствора гидроксида натрия и являющийся первой стадией экстракции жирных кислот, проводится при температуре 60°С. Это способствует более полному извлечению жирных кислот из биомассы.

Второй этап экстракции предпочтительно проводить с использованием н-гексана в качестве экстрагента, поскольку он легко отгоняется и нетоксичен. Это позволяет практически полностью исключить затраты электроэнергии на данной стадии получения композиции и избежать повышения опасности и трудоемкости работы.

В предпочтительном варианте воплощения заявленного способа экстрагент удаляется, а комплекс жирных кислот с преобладаниемарахидоновой кислоты перерастворяется в 96% этиловом спирте, куда также добавляются аскорбиновая кислота и оксиэтилированный этаноламин. Это позволяет получить однородную базовую композицию биопрепарата для растениеводства и избежать расслаивания рабочего раствора при ее использовании.

Способ реализуется следующим образом.

Гриб Mortierella alpina ВКПМ F-1134 выращивают на картофельно-глюкозном отваре. Для этого в готовую питательную среду добавляют инокулят гриба, представляющий собой водную суспензию пропагул М. alpina, полученный посредством смыва биомассы микромицета со скошенной агаризованной среды Чапека, перемешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри. Их помещают в термостат и выдерживают при температуре 22-24°С в течение 18-19 суток. Несмотря на то, что максимальное накопление биомассы гриба наблюдается раньше (на 13-15 сутки), далее происходит дальнейшее накопление в мицелии жирных кислот, при этом также увеличивается доля арахидоновой кислоты. По истечении этого времени биомассу отделяют, промывают водопроводной водой, подсушивают с использованием фильтра Шотта и подвергают криодеструкции.

Замороженную биомассу измельчают и омыляют 10% раствором NaOH в этаноле в соотношении 1:1 масс. (биомасса : спиртовый раствор щелочи) при температуре 60°С в течение 30 мин. После этого отделяют жидкую фракцию от остатков мицелия с помощью вакуумной фильтрации. Полученный раствор нейтрализуют 10 Н HCl до рН 7,0, вносят туда н-гексан в соотношении 5:1 масс. соответственно и перемешивают. Дальнейшая экстракция жирных кислот происходит пассивно, при этом все имеющиеся жирные кислоты переходят в гексановую фракцию. Полученный раствор в н-гексане концентрируют путем отгона последнего в роторном испарителе. Полученный экстракт жирных кислот содержит 50-52% масс. арахидоновой кислоты.

Для приготовления базовой композиции биопрепарата для растениеводства 0,6 г концентрата жирных кислот растворяют в 1 л этилового спирта, куда добавляют 1 г/л оксиэтилированного этаноламина в качестве детергента и аскорбиновую кислоту.

Применение полученной таким образом базовой композиции биопрепарата выявило наличие у нее иммуномодулирующего и росторегулирующего действия, проявляющегося при применении на широком спектре культурных растений, выращиваемых в различных почвенно-климатических зонах.

Эффективность предлагаемого изобретения подтверждается примерами.

Пример 1. Озимая пшеница сорта Башкирская 10.

Исследования проводились на полях зернопарового севооборота в НП «Казангуловское», респ. Башкортостан. Схема испытания: 1. Контроль без обработки; 2. Композиция с содержанием арахидоновой кислоты 0,3 г/л. Предпосевная обработка семян, расход препарата - 1,0 мл/т, расход рабочей жидкости - 10 л/т. Опрыскивание растений в фазу кущения-выхода в трубку, расход препарата - 1,0 мл/га, расход рабочего раствора - 250-300 л/га; 3. Композиция с содержанием арахидоновой кислоты 0,3 г/л. Предпосевная обработка семян, расход препарата - 2,0 мл/т, расход рабочей жидкости - 10 л/т. Опрыскивание растений в фазу кущения-выхода в трубку, расход препарата - 20 мл/га, расход рабочего раствора - 250-300 л/га. Площадь опытных делянок - 100 м², площадь учетных делянок - 50 м². Повторность в опыте - четырехкратная.

Эффект от использования предложенной композиции существенно снизил число проростков, пораженных корневыми гнилями: с 63% (контроль) до 9%. Лучший результат по сдерживанию листостебельных болезней получили от обработки семян и посевов озимой пшеницы в фазах кущения и выхода в трубку. С повышением дозы внесения препарата его биологическая эффективность увеличилась по бурой ржавчине с 12 до 16%, по септориозу с 14 до 19%. Композиция обеспечивала длительную системную устойчивость растения к патогенам.

Композиция обеспечивала лучший рост и развитие растений озимой пшеницы, увеличивала продуктивную кустистость (1,13…1,21, в контроле - 1,10), озерненность колоса (17,8…21,4 зерен в колосе, в контроле - 15,0). Урожайность озимой пшеницы повышалась на 2,2…2,8 ц/га при обработке семян и на 3,4…4,8 ц/га дополнительно с обработкой их вегетирующих растений. Наблюдалось положительное влияние на качество зерна, повышение в нем содержания сырой клейковины и белка.

Пример 2. Соя сорта Вилана.

Исследования проводились на опытных полях Кубанского государственного аграрного университета, Краснодарский край. Схема опыта: 1. Контроль - без обработки; 2. Иммуноцитофит (эталон) - предпосевная обработка семян (расход препарата - 2 табл./кг, рабочего раствора - 10 л/т) + опрыскивание растений: 1-е - в фазу ветвления, 2-у - в фазу цветения (1 табл./50 м², 300 л/га); 3. Композиция с содержанием арахидоновой кислоты 0,3 г/л - предпосевная обработка семян (расход препарата - 1 мл/т, рабочего раствора - 10 л/т) + опрыскивание растений: 1-е - в фазу ветвления, 2-е - в фазу цветения (3 мл/га, 300 л/га); 4. Композиция с содержанием арахидоновой кислоты 0,3 г/л - предпосевная обработка семян (расход препарата - 2 мл/т, рабочего раствора - 10 л/т) + опрыскивание растений: 1-е - в фазу ветвления, 2-е - в фазу цветения (10 мл/га, 300 л/га). Учетная площадь делянки - 20 м², повторность четырехкратная.

Обработка семян сои перед посевом и двухкратная последовательная обработка растений (в фазах ветвления и цветения) испытуемой композицией усиливает рост растений в высоту (100,0-112,0 см, в контроле - 84,7 см), процессы ветвления (2,4-3,7, в контроле - 1,7 шт.) и листообразования (число листьев - 17,6-21,7, 11,7 шт. - в контроле; площадь листьев - 198,3-212,4 и 181,7 см² соответственно). Параллельно приросту листовой поверхности идет прирост биомассы (87,39-106,70 г, в контроле - 75,09 г/растение) и сухой массы (19,27-23,82 и 16,46 г соответственно) надземных органов. Анализ биометрических показателей структуры урожая показал, что испытуемая композиция, как и иммуноцитофит, стимулировали образование большего количества бобов - 46,8-50,1, в контроле - 43,3 шт.; масса бобов - 16,44-17,60 и 13,68 г соответственно), формирование семян (83,4-91,1 шт., в контроле - 76,3 шт.) более крупных и выровненных (масса 1000 семян - 114,4-134,0, в контроле - 106,7 г). При этом следует отметить, что наиболее высокие значения рассматриваемых показателей отмечены в варианте с обработкой семян и двукратно растений (в фазы ветвления и цветения) заявленной композицией (расход препарата на семенах - 1 мл/т, на растениях - 3 мл/га). Более того, в опытных вариантах получена урожайность, существенно превышающая контрольный вариант (20,9-21,6 ц/га, в контроле - 19,2 ц/га, НСР₀₅ - 1,0 ц/га). Максимальная прибавка урожая (12,5%) получена в варианте с использованием заявленной композиции (обработка семян (1 мл/т, 10 л/т) + обработка растений в фазы ветвления и цветения (3 мл/т, 300 л/га)). Сбор масла в указанном варианте возрос на 18,8% (в других опытных вариантах на 11,4 и 13,6%) в сравнении с контрольным вариантом (4,68-4,99 ц/га, в контроле - 4,20 ц/га).

Пример 3. Морковь столовая сорта Форте (сорто-тип Нантская).

Опыты по изучению эффективности действия предложенной композиции на моркови столовой проводились на опытном поле ГНУ ВНИИ овощеводства (Московская обл., Раменский р-н).

Схема опыта: 1. Контроль без обработки; 2. Эталон Оберегь. Замачивание семян в течение 1 часа, расход препарата - 0,4 мл/кг расход рабочей жидкости - 2,0 л/кг; 3. Композиция с содержанием арахидоновой кислоты 0,3 г/л. Предпосевная обработка семян, расход препарата - 0,2 мл/кг, расход рабочей жидкости - 1,0 л/кг. Опрыскивание растений в фазу 2-4 настоящих листьев, расход препарата - 3,0 мл/га, расход рабочего раствора - 250-300 л/га; 4. Композиция с содержанием арахидоновой кислоты 0,3 г/л. Предпосевная обработка семян, расход препарата - 0,5 мл/кг, расход рабочей жидкости - 1,0 л/кг. Опрыскивание растений в фазу 2-4 настоящих листьев, расход препарата - 5,0 мл/га, расход рабочего раствора - 250-300 л/га. Площадь опытных делянок - 20 м², площадь учетных делянок -10 м. Повторность - четырехкратная.

Установлено положительное влияние предпосевной обработки семян моркови регуляторами роста на посевные качества семян. Предпосевное замачивание в течение одного часа в растворе Оберегъ 0,4 мл/кг и заявленной композиции 0,2-0,5 мл/кг повышало энергию прорастания семян моркови соответственно на 10,4% и 9,8-14,2%, а также способствовало повышению полевой всхожести семян и густоты стояния растений моркови на 9,4% и 7,6-14,4%. Наибольший эффект был получен на варианте 4 при норме расхода заявленной композиции 0,5 мл/кг для замачивания семян и 5 мл/га для опрыскивания растений в фазу 2-4 листа. Различия с контролем были достоверны. Фенологические наблюдения показали, что при обработке семян и растений моркови заявленной композицией в обоих вариантах на 2-3 суток раньше появлялись дружные всходы, и ускорялось на 2-4 суток - образование 3-4 листьев, на 5-7 суток раньше наступала пучковая спелость на 7-9 суток - наступление технической спелости, что превосходило как контроль, так и эталон. Урожайность корнеплодов в обоих вариантах с испытуемой композицией была достоверно выше на 11,9-17,1%, относительно контроля. Эталонный препарат практически не оказывал влияния на урожайность моркови. Анализ химического состава полученного урожая показали, что комплексная обработка семян и растений заявленной композицией повышала содержание в корнеплодах Сахаров - на 0,3-0,6%, витамина С - 0,5-0,8 мг %, каротина - на 0,9-1,6 мг %, улучшая их вкусовые качества.

Предложенный способ позволяет существенно снизить материальные затраты на получение базовой композиции биопрепарата для растениеводства и значительно упростить процесс. Благодаря представленной технологии процесс получения становится безопаснее, чем при реализации аналогичных подходов, использующих сжиженные газы, и все этапы процесса может осуществлять один человек. Простота заявленного способа не отражается на выходе арахидоновой кислоты, являющейся основным действующим веществом базовой композиции, а добавление биоразлагаемого детергента позволяет решить проблему однородности композиции и ее рабочих растворов.

1. Способ получения базовой композиции биопрепарата для растениеводства, отличающийся тем, что включает в себя наработку биомассы гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1134, удаление культуральной жидкости, извлечение из мицелия комплекса жирных кислот с преобладанием арахидоновой кислоты, приготовление из него спиртового раствора с введением дополнительных компонентов, отличающийся тем, что гриб выращивается на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды, инокуляция которой осуществляется до розлива, процесс культивирования длится 18-19 суток, разрушение мицелия осуществляется криодеструкцией и щелочным гидролизом, в конечный продукт добавляется биоразлагаемый детергент.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что наработка биомассы происходит на картофельном отваре с добавлением глюкозы и хлорида кальция.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что наработка биомассы происходит в термостате.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биомасса подвергается криодеструкции во влажном состоянии.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что щелочной гидролиз биомассы проводится при температуре 60°С.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадию щелочного гидролиза совмещают с первым этапом экстракции жирных кислот благодаря использованию раствора гидроксида натрия в 96% этиловом спирте.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на втором этапе экстракции жирных кислот в качестве экстрагента используется н-гексан.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что комплекс жирных кислот после удаления н-гексана перерастворяется в 96% этиловом спирте.