Лиофилизированный препарат цитотоксических дипептидов

Изобретение относится к новому лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему цитотоксический дипептид, такой как мелфалан фторфенамид гидрохлорид, и сахарозу, способам его получения, композициям, содержащим лиофилизированный фармацевтический препарат, и к их применению в лечении злокачественных опухолей. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 21 ил., 14 табл., 5 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к лиофилизированным фармацевтическим препаратам, содержащим цитотоксические дипептиды или их фармацевтически приемлемые соли, к способам их получения, композициям, содержащим лиофилизированные фармацевтические препараты, и к их применению в лечении злокачественных опухолей.

Уровень техники

Злокачественная опухоль представляет собой заболевание, которое трудно лечить и которое может быть летальным. В связи с этим, исследования по разработке новых способов лечения злокачественных опухолей постоянно проводятся учеными. Подавляющее большинство злокачественных опухолей представлено в виде солидных опухолей, например рак легких, рак молочной железы, рак предстательной железы, тогда как остальные представляют собой гематологические и лимфоидные злокачественные новообразования, например, лейкозы и лимфомы.

Химиотерапию часто используют в попытках вылечить или временно облегчить заболевание. Так как злокачественные клетки, как правило, быстро делятся, химиотерапия обычно оказывает действие, убивая быстро делящиеся клетки. В широком смысле, большинство химиотерапевтических лекарственных средств оказывают действие, нарушая митоз (т.е. клеточное деление), эффективно воздействуя на быстро делящиеся клетки. Так как эти лекарственные средства вызывают повреждение клеток, их принято называть цитотоксическими. Некоторые лекарственные средства вызывают у клеток апоптоз (так называемую "программируемую гибель клеток"). Часто применяют комбинированную химиотерапию, при которой два или более лекарственных средства, имеющие различные способы действия, применяют совместно для оптимизации противоопухолевого эффекта, минимизации побочных эффектов и предотвращения развития устойчивости. Результаты, получаемые при химиотерапии, различаются в зависимости от типа опухоли. Некоторые опухоли являются очень чувствительными, и тогда лечение с высокой вероятностью ведет к исцелению.

Химиотерапевтические лекарственные средства можно, в общем, разделить на алкилирующие средства, антиметаболиты, антрациклины, растительные алкалоиды, ингибиторы топоизомераз и другие противоопухолевые средства. Лекарственные средства нарушают клеточное деление или синтез ДНК.

Алкилирующие средства, такие как лекарственные средства, полученные на основе азотистого иприта, то есть производные бис(2-хлорэтил)амина, используют в качестве химиотерапевтических лекарственных средств при лечении широкого спектра опухолевых заболеваний. Алкилирующие средства обладают способностью ковалентно присоединять алкильные группы к электроотрицательным сайтам в клетке. Таким образом, эти средства действуют, повреждая функционирование клетки, за счет образования ковалентных связей с гетероатомами в биологически важных молекулах, таких как РНК, ДНК и белки. Примерами алкилирующих средств являются мехлоретамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, ифосфамид, темозоломид и мелфалан, который химически модифицирует ДНК клетки.

В WO 01/96367 описаны алкилирующие ди- и трипептиды и одна или две дополнительные аминокислоты или производные аминокислот. Было показано, что эти производные обладают повышенной эффективностью против ряда типов опухолей.

Мелфалан, т.е. p-[бис-(2-хлорэтил)амино]фенилаланин, представляет собой конъюгат азотистого иприта и аминокислоты фенилаланин, который был синтезирован в середине 1950-ых (патент США № 3032584). Это классическое алкилирующее вещество быстро стало значимым лекарственным средством в области химиотерапии и по-прежнему сохраняет важность при лечении, например, миеломы. Клиническое применение мелфалана в лечении солидных опухолей на поздней стадии имеет, однако, ограниченную эффективность. В ходе поисках более избирательно действующих на злокачественные клетки веществ были синтезированы аналоги мелфалана.

В работе Larionov L. F., Cancer Res (1961), 21, 99-104 описаны различные производные на основе мелфалана.

В файлах реестра STN RN: 1060633-95-5, RN: 88 7609-28-1, RN 790650-89-4, RN: 781606-39-1, RN: 773046-98-3, RN: 767621-58-9, RN: 760165-58-0 и RN: 757941-61-0 описаны различные производные на основе мелфалана.

В работе Koltun, M et al., Biopharmaceutics & Drug disposition (210), 31, 450-454 описаны формы мелфалана.

В работе Ma D Q et al., International Journal of Pharmaceutics (1999), 189, 227-234 описаны формы мелфалана.

В работе Murav'ev I et al., Farmatsiya (1978), 27, (2), 13-15 (с рефератом в Chemical Abstracts № 1978:412066) описаны производные на основе мелфалана.

Лиофилизация или замораживание-высушивание представляет собой способ обезвоживания образцов, используемый для хранения или увеличения стабильности, или предотвращения деградации. Благодаря низкому содержанию воды в лиофилизированных препаратах, как правило, около 1-4%, ингибируется воздействие микроорганизмов и ферментов и срок службы препарата, таким образом, увеличивается. При лиофилизации образец, предназначенный для лиофилизации, растворяют в водном растворе и затем замораживают, после чего понижают окружающее давление. Образец затем подвергается сублимации, необязательно за счет воздействия тепла, для переведения замороженной воды напрямую из твердой фазы в газообразную фазу. Итоговое содержание воды в препарате является очень низким, как правило, от 1% до 4%. Лиофилизация является общеупотребительной в области фармацевтики для увеличения срока годности фармацевтических препаратов.

Сущность изобретения

Обычно липофильные производные сложных эфиров дипептидов характеризуются плохой растворимостью в водных растворах. Таким образом, использование органических растворителей, таких как DMA (диметилацетамид), является необходимым для растворения таких дипептидов. Однако органические растворители часто являются токсичными и могут также вызывать повреждения медицинских устройств, используемых для введения дипептидов субъектам, таким как пациенты со злокачественной опухолью. Таким образом, для преодоления проблемы с растворением и предоставлением цитотоксических дипептидов в органическом растворителе, существует необходимость в альтернативных фармацевтических препаратах, содержащих цитотоксические дипептиды, обладающих достаточной растворимостью в физиологически приемлемых растворах.

Настоящее изобретение относится к лиофилизированным препаратам, содержащим этиловый сложный эфир мелфаланил-L-p-фторфенилаланина, также известный как мелфалан фторфенамид, а также его фармацевтически приемлемые соли, в частности, этилового сложного эфира мелфаланил-L-p-фторфенилаланина гидрохлорид, также известный как мелфалан фторфенамида гидрохлорид, или J1.

Один аспект настоящего изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему

(i) мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль; и

(ii) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей

полисорбат; полиэтиленгликоль; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и аминокислоту.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, растворимому в водном растворе.

Еще один аспект настоящего изобретения относиться к способу получения лиофилизированного фармацевтического препарата, описанного в настоящем изобретении, в котором:

a) мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль растворяют в органическом растворителе для получения раствора мелфалан фторфенамида;

b) воду добавляют к раствору мелфалан фторфенамида для получения водного раствора мелфалан фторфенамида с концентрацией, равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;

c) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей полисорбат; полиэтиленгликоль; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и аминокислоту, добавляют к раствору мелфалан фторфенамида; и

d) водный раствор мелфалан фторфенамида, содержащий эксципиент(ы), подвергают лиофилизации.

Еще один аспект изобретения относится к набору компонентов, включающих первый контейнер, содержащий лиофилизированный фармацевтический препарат, как определено в настоящем изобретении, и второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый раствор.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, как определено в настоящем изобретении, для применения в качестве лекарственного средства.

Еще один аспект изобретения относится к набору компонентов, как определено в настоящем изобретении, для применения в качестве лекарственного средства.

Один аспект настоящего изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, как определено в настоящем изобретении, для применения в лечении и/или профилактике злокачественных опухолей, таких как рак яичников, рак легких, рак мочевого пузыря, мезотелиома, множественная миелома, рак молочной железы и/или любые солидные или гематологические злокачественные опухоли.

Еще один аспект изобретения относится к набору компонентов, как описано в настоящем изобретении, для применения в лечении и/или профилактике злокачественных опухолей, таких как рак яичников, рак легких, рак мочевого пузыря, мезотелиома, множественная миелома, рак молочной железы и/или любые солидные или гематологические злокачественные опухоли.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения и/или профилактике злокачественной опухоли, такой как рак яичников, рак легких, рак мочевого пузыря, мезотелиома, множественная миелома, рак молочной железы и/или любые солидные или гематологические злокачественные опухоли, в котором лиофилизированный фармацевтический препарат, как описано в настоящем изобретении, вводится в терапевтически эффективной дозе пациенту.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистами в области, к которой относится это изобретение. Хотя способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описываемым в настоящем изобретении, можно использовать в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и вещества описаны далее. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упоминаемые в настоящем изобретении, в полном объеме включены в качестве ссылки. В случае конфликта следует использовать настоящее описание, включая определения. Кроме того, вещества, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Другие особенности и преимущества по изобретению станут понятны из следующих подробного описания, чертежей, примеров и из формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг.1A-D приведены графики четырех повторенных измерений скорости растворения мелфалан фторфенамида, лиофилизированного без эксципиентов, по способу A, согласно примеру 2. Образцы отбирали в указанные моменты времени и количество растворенного мелфалан фторфенамида определяли с помощью ВЭЖХ. По оси y показано количество мелфалан фторфенамида в мг/мл.

На фиг.2A-E приведены графики измерений скорости растворения мелфалан фторфенамида, лиофилизированного в присутствии эксципиентов, указанных на фигурах, по способу A, согласно примеру 2. Образцы отбирали в указанные моменты времени и количество растворенного мелфалан фторфенамида определяли с помощью ВЭЖХ. По оси y показано количество мелфалан фторфенамида в мг/мл.

На фиг.3 показан график измерения скорости растворения мелфалан фторфенамида без эксципиентов по способу B, согласно примеру 2. Образцы отбирали в указанные моменты времени и количество растворенного мелфалан фторфенамида определяли с помощью ВЭЖХ. По оси y показано количество мелфалан фторфенамида в мг/мл.

На фиг.4A-E приведены графики измерений скорости растворения мелфалан фторфенамида, лиофилизированного в присутствии эксципиентов, указанных на фигурах, по способу В, согласно примеру 2. Образцы отбирали в указанные моменты времени и количество растворенного мелфалан фторфенамида определяли с помощью ВЭЖХ. По оси y показано количество мелфалан фторфенамида в мг/мл.

На фиг.5A-D приведены следующие графики измерений скорости растворения, A: мелфалан фторфенамид, лиофилизированный без Полисорбата 80; B: мелфалан фторфенамид, лиофилизированный в присутствии 10% Полисорбата 80; C: мелфалан фторфенамид, лиофилизированный в присутствии 50% Полисорбата 80; D: мелфалан фторфенамид, лиофилизированный в присутствии 100% Полисорбата 80. Количества приведены по отношению к количеству мелфалан фторфенамида. По оси y показано количество растворенного мелфалан фторфенамида, относительно внутреннего стандарта, определенное при помощи ВЭЖХ.

На фиг.6 показана фотография пробирок с мелфалан фторфенамидом (J1), который после лиофилизации растворили в концентрации, равной 1 мг/мл, в 5% растворе глюкозы, мелфалан фторфенамид (J1) содержит 50% (моль) Полисорбата 80 (слева) и не содержит Полисорбата 80 (справа).

На фиг.7 приведены структурные формулы мелфалан фторфенамида (этиловый сложный эфир L-мелфаланил-L-p-фторфенилаланина), изопропилового сложного эфира L-мелфаланил-L-p-фторфенилаланина (JV28), этилового сложного эфира L-пролинил-L-мелфаланил-L-p-фторфенилаланина (J3).

Подробное описание изобретения

Не лиофилизированные цитотоксические дипептиды или их фармацевтически приемлемые соли могут обладать низкой растворимостью в водных растворах, что может вызывать необходимость использования органических растворителей, таких как DMA (диметилацетамид), для растворения указанных дипептидов или их фармацевтически приемлемых солей. Таким образом, когда цитотоксический дипептид следует ввести пациенту, вещество сначала необходимо растворить в органическом растворителе, таком как DMA, и затем разбавить в растворе для инфузий перед введением пациенту. Пациент, при использовании данного способа, подвергается действию органических растворителей, действие которых может быть вредным для пациента. Кроме того, органический растворитель может повредить медицинские устройства, используемые для введения мелфалан фторфенамида субъектам, таким как пациенты со злокачественной опухолью.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что если некоторые цитотоксические дипептиды или их фармацевтически приемлемые соли лиофилизировать в присутствии эксципиента, итоговый лиофилизированный фармацевтический препарат может иметь более высокую растворимость в физиологически приемлемом растворе. Фактически, растворимость может быть настолько высокой, что стадию растворения цитотоксических дипептидов или их фармацевтически приемлемых солей в органическом растворителе можно опустить, и цитотоксический дипептид можно непосредственно растворить в водном физиологически приемлемом растворе и ввести пациенту. Предпочтительно, указанный цитотоксический дипептид представляет собой мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль.

По прежним способам мелфалан фторфенамид получали после синтеза в виде белого порошка в кристаллической форме. Такую кристаллическую форму можно растворить только в сильнокислых водных растворах, которые для практических целей изготовления недопустимы. Наличие эксципиентов как таковых не достаточно улучшает растворимость. Таким образом, ранее мелфалан фторфенамид вместо этого растворяли в DMA (диметилацетамид) в растворе глюкозы. Препарат является пригодным, но неустойчивым: деградация 7%/час. Кроме того, происходит димеризация и раствор становиться ярко-желтым. Такой способ получения, однако, является ненадежным, и скорость полимеризации варьирует неприемлемым способом.

Таким образом, существует необходимость нахождения альтернативных способов получения препарата, содержащего мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, являющегося растворимым и обладающего повышенной стабильностью. Кроме того, препарат должен быть водорастворимым, чтобы избежать отрицательных последствий от наличия органического растворителя в продукте, предоставляемом пациенту (такого как DMA).

Один аспект настоящего изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему:

(i) мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль; и

(ii) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей полисорбат; полиэтиленгликоль; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и аминокислоту.

В одном из вариантов осуществления данного аспекта указанный эксципиент выбирают из группы, включающей Полисорбат 80; ПЭГ 400; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; ПЭГ 300; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и гистидин.

В другом варианте осуществления данного аспекта указанный мелфалан фторфенамид представляет собой мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1).

В другом аспекте изобретения предоставляется фармацевтический препарат, содержащий:

(i) мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1); и

(ii) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей

полисорбат; полиэтиленгликоль; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и аминокислоту.

В одном из вариантов осуществления данного аспекта указанный по меньшей мере один эксципиент представляет собой полисорбат или полиэтиленгликоль.

В другом варианте осуществления данного аспекта указанный по меньшей мере один эксципиент представляет собой Полисорбат 80.

В другом варианте осуществления данного аспекта указанный по меньшей мере один эксципиент обладает свойствами поверхностно-активного вещества. Такие свойства увеличивают стабильность лиофилизированного фармацевтического препарата. Указанный по меньшей мере один эксципиент, обладающий свойствами поверхностно-активного вещества, может представлять собой полисорбат или полиэтиленгликоль, такие как Полисорбат 80 или ПЭГ 400.

В другом варианте осуществления данного аспекта препарат содержит мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1) и эксципиент Полисорбат 80. Наличие эксципиента Полисорбата 80 увеличивает стабильность лиофилизированного фармацевтического препарата. Кроме того, итоговый препарат не содержит или практически не содержит органических растворителей и, таким образом, менее токсичен.

Изобретение относится к лиофилизированному препарату, являющемуся стабильным в сухой форме и растворимым в водном растворе без присутствия органического растворителя. Хотя ранее было возможно получить лиофилизированный препарат, содержащий только мелфалан фторфенамид, такой препарат растворяется слишком медленно в водных растворах, по сравнению со скоростью деградации. Введение эксципиентов в лиофилизированный препарат, содержащий мелфалан фторфенамид, (за счет использования предварительного раствора в органическом растворителе) значительно повышает скорость растворения, но существенно не влияет на стабильность растворенного мелфалан фторфенамида. В результате, временное окно для растворенного мелфалан фторфенамида расширяется и это улучшает лечение пациентов, например, позволяя использовать меньшую скорость инфузии, когда это необходимо. "Не содержащий органического растворителя" препарат может содержать незначительные количества органического растворителя, как правило менее чем 0,5% (масс./масс.).

Лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, как описано в настоящем изобретении, представляет собой белый рассыпчатый порошок, в отличие от не лиофилизированного мелфалан фторфенамида или его фармацевтически приемлемой соли, которые могут быть в форме плотного немного желтоватого порошка.

Как правило, лиофилизация включает четыре стадии, предварительную обработку, замораживание, первичную сушку и вторичную сушку. На стадии предварительной обработки вещество, предназначенное для лиофилизации, подготавливают к лиофилизации, например, изготавливая раствор, имеющий желаемую концентрацию, или смешивая вещество с дополнительными компонентами для получения приемлемых результатов. Стадию замораживания можно проводить в колбе для замораживания-высушивания в бане, охлаждаемой, например, с помощью механической холодильной установки, сухого льда и метанола или жидкого азота. Устройства для замораживания-высушивания доступны для лиофилизации в широком диапазоне. Обычно температура замораживания находится между -50°C и -80°C.

На стадии первичной сушки давление снижают до нескольких миллибар и могут подавать тепло для сублимации воды из вещества. Количество необходимого тепла можно вычислить, используя скрытую теплоту сублимации сублимируемых молекул. Продолжительность этой стадии зависит от условий и может длиться в течение нескольких суток для сохранения структуры вещества.

Цель завершающей стадии, стадии вторичной сушки, заключается в удалении любых молекул размороженной воды. В ходе этой стадии температура может быть выше 0°C для разрушения любых физико-химических взаимодействий между молекулами воды и замороженным веществом.

В контексте настоящего изобретения следует понимать, что мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемая соль являются лиофилизированными. Термин "лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль", таким образом, следует понимать так, что мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемая соль являются лиофилизированными.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения предоставляют лиофилизированный мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, набор компонентов, содержащих такой мелфалан фторфенамид, способы получения такого мелфалан фторфенамида или его фармацевтически приемлемой соли, композиции, содержащие такой лиофилизированный мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, и их применение.

Термины "лиофилизация", "лиофилизированный" и т.д. могут в данном контексте быть взаимозаменяемыми с терминами "замораживание-высушивание", "замороженный-высушенный" и т.д.

Примеры цитотоксических дипептидов, которые можно лиофилизировать, как описано в настоящем изобретении, изложены в WO 01/96367. N-конец молекулы предпочтительно должен быть незащищенным, таким как амид или карбамат. Это означает, что R₄ в формуле I, приведенной в упомянутом изобретении, должен предпочтительно не являться защитной группой, такой как формил, ацетил, или пропионил, или бензоил, так как защищенные формы вещества, в основном, имеют более низкую цитотоксическую активность, чем соответствующие незащищенные формы. Природные аминокислоты относятся к аминокислотам, которые в норме присутствуют и выполняют свои функции в живых организмах. Модифицированные аминокислоты относятся к аминокислотам, модифицированным каким-либо способом, по химической структуре и химическому составу, отличающихся от природных аминокислот. Примером природной циклической аминокислоты является пролин. Примерами ароматических аминокислот являются фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин.

Цитотоксические дипептиды, такие как мелфалан фторфенамид, могут также содержать не природные пропорции изотопов по одному или нескольким из их атомов. Например, вещества могут нести метку в виде радиоактивного изотопа, такого, как, например, тритий (³H), дейтерий (²H), йод-125 (¹²⁵I) или углерод-14 (¹⁴C).

Цитотоксический дипептид мелфалан фторфенамид явно отличается от мелфалана:

Различие в структуре (мелфалан фторфенамид содержит этиловый сложный эфир на C-конце, тогда как мелфалан содержит карбоновую кислоту. Мелфалан тем самым представляет собой цвиттер-ион, а мелфалан фторфенамид не является таковым).

Различие в размере (мелфалан фторфенамид представляет собой дипептид, т.е. он приблизительно в два раза больше мелфалана).

Различие в липофильности, так как мелфалан фторфенамид явно более липофильный.

Различие в стабильности в водных растворах. Мелфалан в 10000 раз более стабилен в водных растворах, по сравнению с J1. J1 быстро гидролизуется в воде.

Различие в путях деградации. Основной путь деградации мелфалан фторфенамида включает гидролиз этилового сложного эфира, тогда как основной путь деградации мелфалана относится к реактивности (хлор)алкильных групп.

На основании вышеуказанных различий, но не ограничиваясь ими, становится ясно, что идеи, относящиеся к мелфалану и, в частности, к препаратам и составам с ним, не относятся к мелфалан фторфенамиду и препаратам и составам с ним.

Включение по меньшей мере одного эксципиента (такого как Полисорбат 80, обладающего свойствами поверхностно-активного вещества) предоставляет лиофилизированный препарат, который является стабильным как таковой и растворяется в водном растворителе без присутствия органического растворителя с достаточной скоростью, по сравнению со скоростью деградации, и таким образом являющийся полезным в терапии и менее токсичным.

Лиофилизированный фармацевтический препарат по изобретению может содержать только мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, или смесь мелфалан фторфенамида с одним или несколькими другими цитотоксическими дипептидами или их фармацевтически приемлемыми солями. Дополнительно, лиофилизированный фармацевтический препарат может содержать смесь двух или более различных фармацевтически приемлемых солей.

Один аспект изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему:

(i) мелфалан фторфенамид; и

ii) комбинацию двух или более эксципиентов, выбранных из группы, включающей полисорбат; полиэтиленгликоль; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и аминокислоту.

Еще один аспект изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему:

(i) мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1); и

(ii) комбинацию двух или более эксципиентов, выбранных из группы, включающей полисорбат; полиэтиленгликоль; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и аминокислоту.

В одном из вариантов осуществления данного аспекта указанная комбинация эксципиентов представляет собой смесь Полисорбата 80 и ПЭГ 400.

Фармацевтически приемлемые соли по всем аспектам настоящего изобретения могут представлять собой, например, соль присоединения кислоты вещества, описываемого в настоящем изобретении, являющегося достаточно основным, например, соль присоединения кислоты, например, неорганической или органической кислоты, например, соляной, бромистоводородной, азотной, метансульфоновой, серной, фосфорной, трифторуксусной, пара-толуолсульфоновой, 2-мезитиленсульфоновой, лимонной, уксусной, винной, фумаровой, молочной, янтарной, яблочной, малоновой, малеиновой, 1,2-этандисульфоновой, адипиновой, аспарагиновой, бензолсульфоновой, бензойной, этансульфоновой или никотиновой кислоты.

В настоящем изобретении, при использовании термина "мелфалан фторфенамид" также подразумевается его фармацевтически приемлемая соль(и), даже если это не указано явно.

Как указано выше, когда мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль лиофилизируют в присутствии фармацевтически приемлемого эксципиента, такого как любой выбранный из полисорбата; полиэтиленгликоля; β-циклодекстрина; α-циклодекстрина; гидроксипропил-β-циклодекстрина; сульфобутилового эфира-β-циклодекстрина; лактозы; бензилового спирта; сукцината динатрия; пропиленгликоля; Cremophor EL; диметилсульфоксида; D-маннита; трегалозы; сахарозы и аминокислоты; можно получить неожиданно высокое увеличение растворимости лиофилизированного фармацевтического препарата, позволяющее непосредственно растворять лиофилизированный мелфалан фторфенамид в водном растворе, таком как физиологически приемлемый раствор. В отличие от не лиофилизированного мелфалан фторфенамида, который невозможно растворить непосредственно в водном растворе, а сначала необходимо растворить в органическом растворителе, перед разбавлением в водном растворе. Таким образом, в настоящем изобретении предоставляется лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, где мелфалан фторфенамид лиофилизирован в присутствии эксципиента. Предпочтительно, указанный эксципиент выбирают из полисорбата или полиэтиленгликоля, таких как Полисорбат 80 или ПЭГ 400.

Мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль можно лиофилизировать в присутствии одного или нескольких эксципиентов (например, одного, двух, трех, четырех, пяти или более эксципиентов). Примеры эксципиентов, которые можно использовать, как описано в настоящем изобретении, включают в качестве неограничивающих примеров полисорбаты, такие как Полисорбат 20, Полисорбат 40, Полисорбат 60 и Полисорбат 80; полиэтиленгликоли, такие как ПЭГ 400 и ПЭГ 300; β-циклодекстрин, α-циклодекстрин, сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин, гидроксипропил-β-циклодекстрин, лактозу, бензиловый спирт, сукцинат динатрия, пропиленгликоль, Cremophor EL, диметилсульфоксид, D-маннит, трегалозу, сахарозу и аминокислоты, такие как гистидин.

В одном из аспектов изобретения эксципиент выбирают любым из Полисорбата 80; ПЭГ 400; β-циклодекстрина; α-циклодекстрина; гидроксипропил-β-циклодекстрина; сульфобутилового эфира-β-циклодекстрина; лактозы; бензилового спирта; сукцината динатрия; пропиленгликоля; ПЭГ 300; Cremophor EL; диметилсульфоксида; D-маннита; трегалозы; сахарозы и гистидина.

В одном из аспектов изобретения эксципиент выбирают из Полисорбата 80; ПЭГ 400; лактозы; бензилового спирта; сукцината динатрия; пропиленгликоля; ПЭГ 300; Cremophor EL; диметилсульфоксида; D-маннита; трегалозы; сахарозы и гистидина, или комбинации двух или более указанных эксципиентов.

В одном из вариантов осуществления данного аспекта эксципиент выбирают из Полисорбата 80 и ПЭГ 400, или комбинации указанных двух эксципиентов.

Количество эксципиента, такого как Полисорбат 80, ПЭГ 400 или β-циклодекстрин, составляет, как правило, приблизительно 10-100% по массе относительно количества мелфалан фторфенамида, как, например, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10% по массе относительно количества мелфалан фторфенамида.

В еще одном из аспектов изобретения количество эксципиента, такого как Полисорбат 80, ПЭГ 400 или β-циклодекстрин, составляет, как правило, приблизительно 10-50% по массе относительно количества мелфалан фторфенамида, как, например, 50, 40, 30, 20 или 10% по массе относительно количества мелфалан фторфенамида.

В одном из вариантов осуществления данного аспекта эксципиент представляет собой Полисорбат 80 или ПЭГ 400 и его количество составляет, как правило, приблизительно 10-50% по массе относительно количества мелфалан фторфенамида, как, например, 50, 40, 30, 20 или 10% по массе относительно количества мелфалан фторфенамида.

Еще один из аспектов изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему:

(i) мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль; и

(ii) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей Полисорбат 80; ПЭГ 400; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; ПЭГ 300; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и гистидин;

где количество эксципиента составляет приблизительно 10-100% по массе относительно мелфалан фторфенамида.

В одном из вариантов осуществления данного аспекта по меньшей мере один эксципиент выбирают из Полисорбата 80 и ПЭГ 400.

В другом варианте осуществления данного аспекта мелфалан фторфенамид представляет собой мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1).

Еще один из аспектов изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему:

(i) мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль; и

(ii) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей:

Полисорбат 80; ПЭГ 400; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; ПЭГ 300; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и гистидин;

где количество эксципиента составляет приблизительно 10-50% по массе относительно мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1).

В одном из вариантов осуществления данного аспекта по меньшей мере один эксципиент выбирают из Полисорбата 80 и ПЭГ 400.

В другом варианте осуществления данного аспекта мелфалан фторфенамид представляет собой мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1).

Еще один из аспектов изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему:

(i) мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1); и

(ii) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей:

Полисорбат 80; ПЭГ 400; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; ПЭГ 300; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и гистидин;

где количество эксципиента составляет приблизительно 10-100% по массе относительно мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1).

В одном из вариантов осуществления данного аспекта по меньшей мере один эксципиент выбирают из Полисорбата 80 и ПЭГ 400.

Еще один из аспектов изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, содержащему:

(i) мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1); и

(ii) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей Полисорбат 80; ПЭГ 400; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; ПЭГ 300; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и гистидин;

где количество эксципиента составляет приблизительно 10-50% по массе относительно мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1).

В одном из вариантов осуществления данного аспекта по меньшей мере один эксципиент выбирают из Полисорбата 80 и ПЭГ 400.

В одном из вариантов осуществления изобретения количество эксципиента, такого как Полисорбат 80 или ПЭГ 400, может достигать количества вплоть до клинически приемлемого.

При использовании в качестве единственного эксципиента, количество Полисорбата 80 или ПЭГ 400, составляет, например, приблизительно 50% по массе относительно количества мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1).

Один из аспектов изобретения относится к комбинации эксципиентов Полисорбата 80 и ПЭГ 400.

Один из аспектов изобретения относится к комбинации эксципиентов Полисорбата 80, ПЭГ 400 и β-циклодекстрина, такой как 80% по массе Полисорбата 80, 80% по массе ПЭГ 400 и 50% по массе β-циклодекстрина относительно количества мелфалан фторфенамида. Лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий производное мелфалана или его фармацевтически приемлемую соль, может, в соответствии с изобретением, включать один или несколько производных мелфалана или их фармацевтически приемлемые соли и один или несколько эксципиентов, как определено в настоящем изобретении.

Как указано выше, один из эффектов от присутствия эксципиента во время лиофилизации заключается в том, что итоговый лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий мелфалан фторфенамид, имеет улучшенную растворимость в водных растворах, таких как физиологически приемлемый раствор, по сравнению с мелфалан фторфенамидом, лиофилизированным без эксципиента, как описано в настоящем изобретении. В частности, растворимость в водных растворах мелфалан фторфенамида, лиофилизированного в присутствии эксципиента(ов), выше, по сравнению с растворимостью не лиофилизированного вещества. Такое повышение растворимости мелфалан фторфенамида, в частности, лиофилизированного в присутствии эксципиента, как описано в настоящем изобретении, по сравнению с не лиофилизированным веществом, имеет существенные преимущества в том, что касается введения мелфалан фторфенамида пациенту.

Из-за низкой растворимости не лиофилизированного мелфалан фторфенамида в водных физиологически приемлемых растворах, используемых для введения лекарственного средства пациенту, необходимо сначала растворять не лиофилизированный мелфалан фторфенамид в органическом растворителе, таком как DMA. Мелфалан фторфенамид, таким образом, часто хранят растворенным в DMA. Ранее не было возможности непосредственно растворять мелфалан фторфенамид в водном растворе, а приходилось использовать органические растворители. После растворения в органическом растворителе, полученный раствор мелфалан фторфенамида в органическом растворителе можно растворить в физиологически приемлемом растворе для введения субъекту.

Так как мелфалан фторфенамид является очень токсичным, то для минимизации контакта медицинского персонала с таким лекарственным средством используются специальные устройства для переноса лекарственного средства после растворения в органическом растворителе в раствор для введения. Эти переносящие устройства часто представляют собой пластиковые трубки, содержащие поликарбонат. Однако такие трубки чувствительны к и могут повреждаться органическим растворителем, таким как DMA. Таким образом, в случаях, когда лекарственное средство, которое следует ввести, растворено в таком органическом растворителе, может быть невозможным использование переносящих устройств и растворенное лекарственное средство вместо этого необходимо напрямую добавлять в физиологически приемлемый раствор, используемый для введения, непосредственно перед введением пациенту. Это может быть вредным для медицинских сотрудников, подвергающихся риску контакта с токсичным лекарственным средством.

Как указано выше, лиофилизация мелфалан фторфенамида повышает его растворимость в физиологически приемлемых растворах. Такое повышение может быть даже более выраженным, когда мелфалан фторфенамид лиофилизирован в присутствии одного или нескольких эксципиентов. Как описано в настоящем изобретении, когда мелфалан фторфенамид лиофилизирован в присутствии эксципиента, как описано в настоящем изобретении, растворимость мелфалан фторфенамида может увеличиться, по сравнению с не лиофилизированным мелфалан фторфенамидом. Использования органического растворителя, такого как DMA, для предварительного растворения мелфалана фторфенамида можно, таким образом, избежать.

Мелфалан фторфенамид, лиофилизированный в присутствии по меньшей мере одного эксципиента, такого как полисорбат, например, представляющий собой Полисорбат 80; полиэтиленгликоль, например, представляющий собой ПЭГ 400 или ПЭГ 300; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактоза; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалоза; сахароза; или аминокислота, такая как гистидин; или комбинации двух или более этих эксципиентов; можно непосредственно растворять в физиологически приемлемом растворе, таком как приблизительно 4,5-5,5% масс., например, приблизительно 5% масс. растворе глюкозы или водном растворе NaCl (например, приблизительно 0,9% масс. NaCl). В связи с этим, устройства, содержащие поликарбонат и используемые для введения мелфалан фторфенамида, можно использовать, минимизируя риск контакта медицинского персонала с лекарственным средством. Также, таким образом, введения токсичного DMA пациенту можно избежать. Это позволяет непосредственно изготавливать раствор, содержащий мелфалан фторфенамид с концентрацией, подходящей для введения пациенту. Альтернативно, можно сначала изготовить концентрированный раствор, содержащий лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий мелфалан фторфенамид, в физиологически приемлемом растворе и затем перенести его в мешок для инфузий, используя общеупотребительные переносящие устройства.

Также, когда мелфалан фторфенамид растворяют в DMA возможно образование аддуктов мелфалан фторфенамида и DMA. Используя лиофилизированный фармацевтический препарат, получаемый в соответствии с изобретением, возможно растворять лиофилизированный мелфалан фторфенамид непосредственно в физиологически приемлемом растворе, избегая необходимости предварительного растворения мелфалан фторфенамида в DMA. Вследствие этого, образования аддуктов DMA и мелфалан фторфенамида можно избежать и ни аддукт, ни сам DMA не вводить пациенту.

Также в настоящем изобретении предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, как определено в настоящем изобретении, необязательно полученный способом изготовления такого лиофилизированного препарата, описанным в настоящем изобретении. Такая фармацевтическая композиция может дополнительно содержать физиологически приемлемый раствор, такой как водный раствор NaCl (например, приблизительно 0,9% масс.) или раствор глюкозы (например, приблизительно 4,5-5,5% масс., как, например, приблизительно 5% масс. глюкозы). Данная фармацевтическая композиция может представлять собой концентрированный раствор, предназначенный для разбавления перед введением субъекту, или раствор, позволяющий непосредственное введение пациенту.

Благодаря повышенной растворимости мелфалан фторфенамида после лиофилизации в присутствии одного или нескольких эксципиентов, как описано в настоящем изобретении, возможно получить раствор мелфалан фторфенамида, такой как фармацевтическая композиция, содержащая мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, практически не содержащий органических растворителей, таких как DMA, дихлорметан, тетрагидрофуран, 2-метилтетрагидрофуран, этилацетат, ацетон, диметилформамид, ацетонитрил, диметилсульфоксид, диоксан, простой диэтиловый эфир, уксусная кислота, н-бутанол, изопропанол, н-пропанол, трет-бутанол, втор-бутанол, метанол, этанол и уксусная кислота. Под "практически не содержит" в настоящем изобретении подразумевается, что фармацевтическая композиция содержит только незначительные количества органического растворителя, как, например, в общей сложности менее чем приблизительно 0,1% масс. органического растворителя. В одном из аспектов, лиофилизированный препарат или фармацевтическая композиция не содержат каких-либо измеряемых количеств органического растворителя. Такие препараты являются менее токсичными и, таким образом, лучше переносятся пациентом, т.е. вызывают меньше побочных эффектов, таких как рвота, тошнота или другие общие симптомы, при инфузии.

В одном из аспектов изобретения предоставляется лиофилизированный фармацевтический препарат, как описано в настоящем изобретении, не содержащий или практически не содержащий органических растворителей.

Фармацевтическая композиция может состоять из лиофилизированного фармацевтического препарата, как описано в настоящем изобретении, содержащего мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, и физиологически приемлемого раствора, такого как раствор глюкозы. Как описано в настоящем изобретении ранее, производное мелфалана может представлять собой мелфалан фторфенамид или смесь мелфалан фторфенамида и одного или нескольких других цитотоксических дипептидов, либо лиофилизированных совместно, либо раздельно.

Фармацевтическую композицию можно получать, растворяя мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль в физиологически приемлемом растворе. Способ получения фармацевтической композиции, включающий стадию растворения лиофилизированного фармацевтического препарата, содержащего мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, в физиологически приемлемом растворе, таким образом, также предоставляется в настоящем изобретении.

Формулировка "физиологически приемлемый раствор", как определено в настоящем изобретении, подразумевает водный раствор, такой как раствор NaCl (такой как приблизительно 0,9% масс. NaCl) или раствор глюкозы, такой как приблизительно 4,5-5,5% масс. глюкозы, например, приблизительно 5% масс., или другой физиологически приемлемый раствор. Любой такой раствор может необязательно являться буфером.

Фармацевтическая композиция, содержащая лиофилизированный мелфалан фторфенамид и физиологически приемлемый раствор для непосредственного введения пациенту, как правило, содержит мелфалан фторфенамид в концентрации, равной приблизительно 1 мг/мл или менее, как, например, приблизительно 0,2 мг/мл. Однако фармацевтическая композиция может содержать мелфалан фторфенамид в концентрации до приблизительно 4 мг/мл, для разбавления в физиологически приемлемом растворе перед введением пациенту.

Один из аспектов изобретения предоставляет способ изготовления лиофилизированного фармацевтического препарата, в котором:

a) мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль растворяют в органическом растворителе для получения раствора мелфалан фторфенамида;

b) воду добавляют к раствору мелфалан фторфенамида для получения водного раствора мелфалан фторфенамида, с концентрацией, равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;

c) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей полисорбат; полиэтиленгликоль; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и аминокислоту, добавляют к раствору мелфалан фторфенамида; и

d) водный раствор мелфалан фторфенамида, содержащий эксципиент(ы), подвергают лиофилизации.

В одном из вариантов осуществления данного аспекта предоставляется способ, в котором:

a) мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль растворяют в органическом растворителе;

b) воду добавляют к раствору, полученному на стадии a), для получения раствора указанного мелфалан фторфенамида или его фармацевтически приемлемой соли с концентрацией, равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;

c) по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, включающей полисорбат; полиэтиленгликоль; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и аминокислоту, добавляют к раствору, полученному на стадии b); и

d) раствор, полученный на стадии c), подвергают лиофилизации.

Органический растворитель можно выбрать любым из этанола, содержащей этанол кислоты, глицерина, пропиленгликоля, бензилового спирта, диметилацетамида (DMA), N-метил-2-пирролидона, изопропанола, н-бутанола, трет-бутанола, метил трет-бутил простого эфира, диметилсульфоксида, тетрагидрофурана, 2-метил тетрагидрофурана, ацетона, диметилформамида, ацетонитрила, диоксана, уксусной кислоты, молочной кислоты, пропионовой кислоты, н-бутанола, изопропанола, н-пропанола, трет-бутанола, втор-бутанола, метанола и смеси этанола и воды. Предпочтительно, указанный органический растворитель представляет собой этанол.

Эксципиент можно выбрать из группы, включающей Полисорбат 80; ПЭГ 400; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; ПЭГ 300; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и гистидин. Предпочтительно, указанный эксципиент выбирают из Полисорбата 80 и ПЭГ 400.

Мелфалан фторфенамид в указанных способах представляет собой предпочтительно мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1).

Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизированного фармацевтического препарата, как описано в настоящем изобретении, в котором:

a) мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль растворяют в органическом растворителе;

b) воду добавляют к раствору, полученному на стадии a), для получения раствора указанного мелфалан фторфенамида или его фармацевтически приемлемой соли с концентрацией, равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;

c) по меньшей мере один эксципиент, как определено в настоящем изобретении, добавляют к раствору, полученному на стадии b); и

d) раствор, полученный на стадии c), подвергают лиофилизации.

Предпочтительно, указанный органический растворитель представляет собой этанол.

Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизированного фармацевтического препарата, как описано в настоящем изобретении, в котором:

a) мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1) растворяют в органическом растворителе;

b) воду добавляют к раствору, полученному на стадии a), для получения раствора указанного мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) или его фармацевтически приемлемой соли с концентрацией, равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;

c) по меньшей мере один эксципиент, как определено в настоящем изобретении, добавляют к раствору, полученному на стадии b); и

d) раствор, полученный на стадии c), подвергают лиофилизации.

Примеры органических растворителей, используемых для растворения мелфалан фторфенамида или его фармацевтически приемлемой соли на стадии a), могут быть любыми, выбранными из этанола, содержащей этанол кислоты, глицерина, пропиленгликоля, бензилового спирта, диметилацетамида (DMA), N-метил-2-пирролидона, изопропанола, н-бутанола, трет-бутанола, метил трет-бутил простого эфира, диметилсульфоксида, тетрагидрофурана, 2-метил тетрагидрофурана, ацетона, диметилформамида, ацетонитрила, диоксана, уксусной кислоты, молочной кислоты, пропионовой кислоты, н-бутанола, изопропанола, н-пропанола, трет-бутанола, втор-бутанола, метанола и смеси этанола и воды.

Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизированного фармацевтического препарата, как описано в настоящем изобретении, в котором:

a) мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль растворяют в органическом растворителе, выбранном любым их этанола, содержащей этанол кислоты, глицерина, пропиленгликоля, бензилового спирта, диметилацетамида (DMA), N-метил-2-пирролидона, изопропанола, н-бутанола, трет-бутанола, метил трет-бутил простого эфира, диметилсульфоксида, тетрагидрофурана, 2-метил тетрагидрофурана, ацетона, диметилформамида, ацетонитрила, диоксана, уксусной кислоты, молочной кислоты, пропионовой кислоты, н-бутанола, изопропанола, н-пропанола, трет-бутанола, втор-бутанола, метанола и смеси этанола и воды;

b) воду добавляют к раствору, полученному на стадии a), для получения раствора указанного мелфалан фторфенамида или его фармацевтически приемлемой соли с концентрацией, равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;

c) по меньшей мере один эксципиент, как определено в настоящем изобретении, добавляют к раствору, полученному на стадии b); и

d) раствор, полученный на стадии c), подвергают лиофилизации.

Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизированного фармацевтического препарата, как описано в настоящем изобретении, в котором:

a) мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1) растворяют в органическом растворителе, выбранном из этанола, содержащей этанол кислоты, глицерина, пропиленгликоля, бензилового спирта, диметилацетамида (DMA), N-метил-2-пирролидона, изопропанола, н-бутанола, трет-бутанола, метил трет-бутил простого эфира, диметилсульфоксида, тетрагидрофурана, 2-метил тетрагидрофурана, ацетона, диметилформамида, ацетонитрила, диоксана, уксусной кислоты, молочной кислоты, пропионовой кислоты, н-бутанола, изопропанола, н-пропанола, трет-бутанола, втор-бутанола, метанола и смеси этанола и воды;

b) воду добавляют к раствору, полученному на стадии a), для получения раствора указанного мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) или его фармацевтически приемлемой соли с концентрацией, равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;

c) по меньшей мере один эксципиент, как определено в настоящем изобретении, добавляют к раствору, полученному на стадии b); и

d) раствор, полученный на стадии c), подвергают лиофилизации.

Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизированного фармацевтического препарата, как описано в настоящем изобретении, в котором:

a) мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1) растворяют в органическом растворителе;

b) воду добавляют к раствору, полученному на стадии a), для получения раствора указанного мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) или его фармацевтически приемлемой соли с концентрацией равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;

c) по меньшей мере один эксципиент, как определено в настоящем изобретении, добавляют к раствору, полученному на стадии b); и

d) раствор, полученный на стадии c), подвергают лиофилизации;

где указанный по меньшей мере один эксципиент выбирают из Полисорбата 80 и ПЭГ 400.

Когда этанол, содержащий кислоту, используют для растворения мелфалан фторфенамида или его фармацевтически приемлемой соли на стадии a) по вышеописанному способу, кислота может представлять собой HCl в концентрации, равной, например, 5-20 мМ, или концентрация HCl может равняться, например, 10 мМ, в этаноле.

Когда мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль растворяют в этаноле и воде, концентрация этанола может составлять приблизительно 10-100% по объему, как, например, 10-90% по объему, 50-90% по объему или приблизительно 70% по объему.

Вода, используемая для растворения и/или разбавления образцов лиофилизированного фармацевтического препарата, в соответствии с настоящим изобретением, является стерильной или очищенной водой, или водой для инъекций (WFI).

При использовании этанола для растворения мелфалан фторфенамида или его фармацевтически приемлемой соли, раствор, полученный на стадии a), разбавляют на стадии b) так, что концентрация этанола равняется приблизительно 2-100% по объему, как, например, приблизительно 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%, или, как, например, 5-15%, как, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15%. Как правило, концентрация этанола после стадии разбавления b) равняется приблизительно 9%.

Раствор, полученный на стадии b), можно подвергнуть стерилизующей фильтрации перед стадией лиофилизации c).

Стадия лиофилизации c) включает, как правило, стадию замораживания, первичной и вторичной сушки, как описано в настоящем изобретении. Информацию о том, как проводится лиофилизация можно найти, например, в Rey, L. and May, J. Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products (2010), ISBN 978-1439B2575-4. На стадии замораживания образец замораживают, например, в бане с сухим льдом и ацетоном, при температуре, равной приблизительно от -70°C до -90°C, такой как приблизительно -70°C, -75°C, -78°C, -80°C, -82°C, -85°C, -88°C или -90°C, например, в течение от 10 минут до 120 минут.

Альтернативно, образец можно замораживать в холодильной установке при температуре, равной приблизительно от -14°C до -25°C, такой как -14°C, -16°C, -18°C, -20°C, -22°C или -25°C, например, в течение приблизительно от 10 минут до 24 часов. Также возможно заморозить образец в жидком азоте.

Стадию c) можно проводить, используя общепринятые способы лиофилизации, см., например, Rey, L. and May, J. Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products (2010), ISBN 978-1439B2575-4.

Например, на стадии первичной сушки давление можно понизить до приблизительно от 0,1 миллибар до 50 миллибар, как, например, от 1 миллибар до 10 миллибар. Температуру устанавливают, как правило, ниже 0°C, как, например, от -50 до 0°C, или от -20 до -1°C, например -50, -40, -30, -20, -10 или -5°C. Данная стадия может продолжаться, например, в течение от 4 часов до 48 часов, например от 12 часов до 24 часов.

На завершающей стадии вторичной сушки, когда большая часть воды уже испарилась, температура может быть как во время стадии первичной сушки или выше 0°C.

Когда один или несколько эксципиентов, как определено в настоящем изобретении, должны присутствовать во время лиофилизации, их можно добавлять на стадии b) перед или после разбавления раствора, полученного на стадии a), и перед проведением лиофилизации. Эксципиенты можно добавлять в форме порошка, но, как правило, их добавляют в виде водного раствора. Эксципиенты могут, таким образом, присутствовать во время лиофилизации.

Настоящее изобретение также относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, как определено в настоящем изобретении, получаемому вышеописанным способом.

Также в настоящем изобретении предоставляется набор компонентов, включающий:

(i) первый контейнер, содержащий лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий мелфалан фторфенамид, как описано в настоящем изобретении; и

(ii) второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый раствор, такой как раствор NaCl (такой как приблизительно 0,9% масс. NaCl) или раствор глюкозы, такой как приблизительно 4,5-5,5% масс. раствор глюкозы, например, приблизительно 5% масс. раствор глюкозы, или другой физиологически приемлемый раствор.

Такой набор может также включать устройство для смешивания содержимого двух контейнеров друг с другом и/или для переноса полученной смеси в устройство, такое как мешок, содержащий раствор глюкозы, для введения пациенту.

Такой набор может состоять из первого контейнера, содержащего лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий мелфалан фторфенамид, как описано в настоящем изобретении, и второго контейнера, содержащего физиологически приемлемый раствор. Мелфалан фторфенамид в наборе может также находиться в смеси с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом. Один пример представляет собой 5% глюкозу с, например, 1% альбумином или другим белком, или веществом. Количество физиологически приемлемого раствора может либо являться небольшим количеством для изготовления концентрированного раствора лиофилизированного фармацевтического препарата, содержащего мелфалан фторфенамид, или большим количеством, позволяющим получить раствор, имеющий желаемую концентрацию, для введения пациенту. Альтернативно, набор может включать два контейнера, один, содержащий физиологически приемлемый раствор для изготовления концентрированного раствора лиофилизированного фармацевтического препарата, и второй контейнер, такой как инфузионный мешок, содержащий большее количество физиологически приемлемого раствора, для получения более разбавленного раствора для введения субъекту.

Лиофилизированный фармацевтический препарат, фармацевтическая композиция или набор, предоставляемые в настоящем изобретении, могут содержать только мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль в качестве противоопухолевого средства. Однако мелфалан фторфенамид можно также комбинировать с одним или несколькими противоопухолевыми средствами, такими как другие противоопухолевые вещества, такие как гемцитабин, этопозид, доксорубицин или таксаны, или другие терапевтически эффективные вещества. При комбинировании, например, в наборе или в фармацевтической композиции, с другими противоопухолевыми средствами их можно либо смешивать с мелфалан фторфенамидом или его фармацевтически приемлемой солью перед лиофилизацией и, таким образом, лиофилизировать вместе с мелфалан фторфенамидом или его фармацевтически приемлемой солью, либо комбинировать с лиофилизированным мелфалан фторфенамидом или его фармацевтически приемлемой солью после лиофилизации. Лиофилизированный мелфалан фторфенамид можно также смешивать с одним или несколькими противоопухолевыми веществами в сухой форме, даже не лиофилизированной, после лиофилизации мелфалан фторфенамида или его фармацевтически приемлемой соли.

Мелфалан фторфенамид, предоставляемый в настоящем изобретении, обладает цитотоксической активностью и может, таким образом, использоваться для профилактики и/или лечения злокачественной опухоли, как описано в других изобретениях (см., например, WO 01/96367). Снижение выживаемости опухолевой клетки этими веществами показано в WO 01/96367 относительно различных гематологических и/или солидных опухолей, например рака легких, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака молочной железы и рака яичников. Кроме того, в WO 01/96367 показано, что такие вещества преодолевают устойчивость к мелфалану. Такие вещества можно, таким образом, использовать для профилактики и/или лечения злокачественной опухоли, снижения роста опухоли и/или разрушения опухолевых клеток. Таким образом, эти вещества можно использовать для излечения и/или продления жизни пациентов, страдающих злокачественными заболеваниями.

Также в настоящем изобретении предоставляется лиофилизированный фармацевтический препарат, набор или фармацевтическая композиция, как описано и сформулировано в настоящем изобретении, для применения в качестве лекарственного средства. Изобретение также относится к такому лиофилизированному фармацевтическому препарату, набору или фармацевтической композиции для применения в лечении и/или профилактике злокачественной опухоли, такой как рак яичников, рак легких, рак мочевого пузыря, мезотелиома, множественная миелома, рак молочной железы и/или любая другая солидная или гематологическая злокачественная опухоль.

Один аспект настоящего изобретения относится к использованию лиофилизированного фармацевтического препарата, набора или фармацевтической композиции, как описано и сформулировано в настоящем изобретении, в качестве лекарственного средства в лечении и/или профилактике злокачественной опухоли, такой как рак яичников, рак легких, рак мочевого пузыря, мезотелиома, множественная миелома, рак молочной железы и/или любая другая солидная или гематологическая злокачественная опухоль.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к лиофилизированному фармацевтическому препарату, набору или фармацевтической композиции, содержащим мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1) в сочетании с другим лекарственным средством, используемым для лечения злокачественной опухоли, для применения в лечении и/или профилактике злокачественной опухоли, такой как рак яичников, рак легких, рак мочевого пузыря, мезотелиома, множественная миелома, рак молочной железы и/или любая другая солидная или гематологическая злокачественная опухоль.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, такой как рак яичников, рак легких, рак мочевого пузыря, мезотелиома, множественная миелома, рак молочной железы и/или любая другая солидная или гематологическая злокачественная опухоль. Способ может включать введение лиофилизированного фармацевтического препарата, набора или фармацевтической композиции, предоставленных в настоящем изобретении, в терапевтически эффективной дозе пациенту. Субъект представляет собой, как правило, человека или домашнее животное.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, такой как рак яичников, рак легких, рак мочевого пузыря, мезотелиома, множественная миелома, рак молочной железы и/или любая другая солидная или гематологическая злокачественная опухоль, в котором лиофилизированный фармацевтический препарат, набор или фармацевтическая композиция, содержащие мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1), предоставляются в терапевтически эффективной дозе пациенту, в сочетании с другим лекарственным средством, используемым для лечения злокачественной опухоли. Субъект представляет собой, как правило, человека или домашнее животное.

Введение лиофилизированного фармацевтического препарата, набора или фармацевтической композиции пациенту может осуществятся посредством внутривенных инъекций. Также возможно вводить лиофилизированный мелфалан фторфенамид или фармацевтическую композицию, содержащую такой лиофилизированный мелфалан фторфенамид, в полости тела, например, закапывая в мочевой пузырь или в перитонеальную, или плевральную полости.

Мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить в количестве, равном приблизительно 20-130 мг, таком как 30-75 мг, например, 50 мг общего количества мелфалан фторфенамида за одно введение. Фармацевтическая композиция или набор, предоставляемые в настоящем изобретении, содержащие мелфалан фторфенамид, могут, таким образом, содержать количество лиофилизированного мелфалан фторфенамида, равное количеству, которое можно вводить.

Лиофилизированный мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить ежедневно, непрерывно или три раза в сутки, еженедельно, непрерывно, три или четыре раза в неделю, или даже в виде высокой однократной дозы (например, перед трансплантацией) в зависимости от субъекта и типа злокачественной опухоли, которую надлежит лечить.

Формулировка "предупреждение", как используют в настоящем изобретении, включает терапию пациента, подвергаемого химиотерапии против любого типа злокачественной опухоли, как описано в настоящем изобретении, и подвергаемого продолжительной терапии для предотвращения возникновения любых метастазов, вызванных указанной злокачественной опухолью.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к использованию эксципиента, выбранного из группы, включающей Полисорбат 80; ПЭГ 400; β-циклодекстрин; α-циклодекстрин; гидроксипропил-β-циклодекстрин; сульфобутиловый эфир-β-циклодекстрин; лактозу; бензиловый спирт; сукцинат динатрия; пропиленгликоль; ПЭГ 300; Cremophor EL; диметилсульфоксид; D-маннит; трегалозу; сахарозу и гистидин, в лиофилизированном препарате, содержащем мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, для уменьшения времени растворения лиофилизированного препарата, содержащего мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль, при растворении в водном растворителе.

Указанный мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемая соль предпочтительно представляют собой мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1).

Указанный эксципиент предпочтительно выбирают из Полисорбата 80 и ПЭГ 400.

Указанный мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль предпочтительно растворяют в этаноле перед объединением указанного мелфалан фторфенамида с указанным эксципиентом.

В настоящем изобретении термины "лиофилизация", "замораживание-высушивание", "лиофилизированный", "замороженный-высушенный" и т.п. могут использоваться взаимозаменяемо.

Полисорбат 80 (имеющий химическое название Полиоксиэтилен 20 сорбитан моноолеат и регистрационный номер CAS 9005-65-6) является коммерчески доступным от, например, Fluka или Sigma-Aldrich.

ПЭГ 400 имеет эмпирическую формулу HOCH₂(CH₂OCH₂)_mCH₂OH, где m равняется 8,7, и среднюю молекулярную массу, равную 380-420, и является коммерчески доступным от, например, Fluka или Sigma-Aldrich.

ПЭГ 300 имеет эмпирическую формулу HOCH₂(CH₂OCH₂)_mCH₂OH, где m равняется 6,4, и среднюю молекулярную массу, равную 285-315, и является коммерчески доступным от, например, Fluka или Sigma-Aldrich.

Cremophor EL® является торговой маркой, поставляемой Sigma-Aldrich, и представляет собой Полиоксиэтилен касторовое масло, имеющее регистрационный номер CAS 61791-12-6.

Примеры цитотоксических дипептидов, которые можно использовать, как описано в настоящем изобретении, также описаны в WO 01/96367 и могут иметь формулу V

где R₁ обозначает алкилоксигруппу, циклоалкилоксигруппу, арилоксигруппу, арилалкилоксигруппу, NH₂, алкиламиногруппу, циклоалкиламиногруппу или ариламиногруппу;

R₃ обозначает NH₃, OH, O-алкил, N-алкил, O-ацил, NH-ацил, N(CH₂CH₂Cl)₂, NO₂, F, CF₂ или H; и

R₄ обозначает природную или модифицированную циклическую или ароматическую аминокислоту, или H; а также их фармацевтически приемлемые соли.

Кроме того, цитотоксические пептиды, которые можно использовать, как описано в настоящем изобретении, включают пептиды с формулой I или V, где R₃ обозначает F. Дипептиды представляют собой примеры пептидов с формулой I или V, где R₁ обозначает алкилоксигруппу; R₃ обозначает F, CF₃, H, OH, O-алкил, NO₂, N(CH₂CH₂Cl)₂, NH-ацил или NH₂; и R₂ обозначает H.

Трипептиды представляют собой примеры пептидов с формулой I или V, где R₁ обозначает алкилоксигруппу; R₃ обозначает F, CF₃, H, OH, O-алкил, NH-ацил, NO₂, N(CH₂CH₂Cl)₂ или NH₂; и R₄ обозначает природную или модифицированную циклическую или ароматическую аминокислоту.

Мелфалан фторфенамид или его фармацевтически приемлемую соль можно получать способом, описанным в WO 01/96367, описание которого включено в качестве ссылки. Пример 1 из WO 01/96367 описывает способ синтеза для получения мелфалан фторфенамида (этиловый сложный эфир L-мелфаланил-L-p-фторфенилаланина), а также его гидрохлоридной соли - мелфалан фторфенамида гидрохлорида J1 (этилового сложного эфира L-мелфаланил-L-p-фторфенилаланина гипохлорид, вещество J1), описание которого содержится в настоящем изобретении.

Производные дипептидов, раскрытые в WO 01/96367, можно синтезировать из трет-бутоксикарбонил(Boc)-защищенного мелфалана, как описано в вышеуказанном изобретении, и можно лиофилизировать и использовать, как описано в настоящем изобретении. Кроме того, в WO 01/96367 описан способ получения производных трипептидов, в котором Boc-защищенные аминокислоты соединяли с производными дипептидов, содержащими мелфалан, используя EDC/NMM/HOBt в качестве связывающих реагентов (EDC представляет собой триэтиламин или 1-[3-диметил(амино)пропил]-3-этилкарбодиимида гидрохлорид, NMM представляет собой N-метилморфолин и HOBt представляет собой 1-гидроксибензотриазол). Такие производные трипептидов можно лиофилизировать и использовать, как описано в настоящем описании.

Примеры производных мелфалана, которые можно лиофилизировать и использовать, как описано в настоящем изобретении, во всех аспектах включают в качестве неограничивающих примеров мелфалан фторфенамид, изопропиловый сложный эфир L-мелфаланил-L-p-фторфенилаланина (JV28), этиловый сложный эфир L-пролинил-L-мелфаланил-L-p-фторфенилаланина (J3) (фиг.7) и их фармацевтически приемлемые соли. Эти вещества описаны ранее в WO 01/96367, где также предоставляются способы их получения. Мелфалан фторфенамид, JV28 и J3 могут трансформироваться в мелфалан в организме. В WO 01/96367 показано, что эти производные обладают повышенной цитотоксической активностью против опухолей, даже при использовании в более низкой концентрации, чем мелфалан. Кроме того, они могут преодолевать устойчивость к мелфалану.

Изобретение будет далее описано с помощью следующих примеров, которые не ограничивают объем изобретения.

Экспериментальная часть

Пример 1

Лиофилизация мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) при различных условиях

В данном эксперименте тестировали лиофилизацию мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) при различных условиях.

Пример 1A

Взвешенные количества J1 растворяли в различных объемах деионизированной воды в ультразвуковой ванне с незначительным подогревом для получения прозрачных растворов. Образцы замораживали в бане с сухим льдом и ацетоном (-78°C, образцы A1-A3) или в холодильной установке при -16°C (образцы B1-B3). Лиофилизацию заем проводили в течение 16 часов при давлении 1 миллибар при комнатной температуре с ловушкой с сухим льдом и ацетоном (-78°C) между сушильной колбой и насосом.

Внешний вид после высушивания резюмирован в таблице 1.

Таблица 1 Шесть различных растворов J1, замороженных при различной концентрации или температуре
Номер эксперимента	J1, мг	Вода, мл	Концентрация (мг/мл)	Внешний вид после высушивания
J1A1	2,4	6	0,4	белый рассыпчатый порошок
J1A2	2,7	27	0,1	белый рассыпчатый порошок - немного не полностью высушенный
J1A3	2,5	10	0,25	белый рассыпчатый порошок
J1B1	2,7	6,75	0,4	белое плотное вещество
J1B2	2,5	25	0,1	ярко-желтый порошок
J1B3	2,8	11,2	0,25	белый рассыпчатый порошок

Пример 1B

Образцы высушенных веществ растворяли в 50% водном ацетонитриле и анализировали с помощью ВЭЖХ (ACE-колонка, C8, 50×3 мм, 10-97% CH₃CN за 3 мин, 1 мл/мин). В одном случае (J1A1) водный раствор анализировали с помощью ВЭЖХ до замораживания-высушивания (J1A1-start). Чистота после высушивания резюмирована в таблице 2.

Таблица 2 Чистота после замораживания-высушивания. Rt = время удержания
Номер эксперимента	J1: Rt 2,27 (%)	Rt 1,87 (%)	Rt 1,44 (%)
J1A1-start	88	12
J1A1	79	21
J1A2	80	20
J1A3	41	45	14
J1B1	34	42	25
J1B2	36	43	21
J1B3	79	21

Пример 1C

Затем тестировали применение либо слабокислой воды (например, 0,01% HCl) для увеличения скорости растворения, либо предварительного растворения J1 в этаноле до добавления воды (нейтральной или слабокислый).

Три образца J1 получили, растворив мелфалан фторфенамид (приблизительно 3 мг) в 70% водном этаноле (0,5 мл). Растворы разбавляли 5 мМ HCl до получения концентрации, равной 0,4 мг/мл. Так как мелфалан фторфенамид быстро растворяется в водном этаноле не было необходимости в использовании ультразвуковой ванной или подогрева для получения прозрачного раствора. Растворы затем замораживали в бане с сухим льдом и ацетоном (-78°C) и высушивали, используя ловушку с сухим льдом и ацетоном (-78°C) между сушильной колбой и насосом. Внешний вид после высушивания резюмирован в таблице 3.

Таблица 3 Три образца J1, растворенные в этаноле и кислоте
Номер эксперимента	J1, мг	HCl, мл	Концентрация (мг/мл)	Внешний вид после высушивания
J1C1	3,0	7,0	0,4	белое плотное вещество, частично налипшее на стекло
J1C2	3,2	7	0,4	белое плотное вещество, частично налипшее на стекло
J1C3	2,9	6,75	0,4	белое плотное вещество, частично налипшее на стекло

Пример 1D

Два измерения с помощью ВЭЖХ проводили с каждым образцом: одно для твердого вещества, которое можно извлечь из колбы, и одно для вещества, получаемого за счет растворения остатка в колбе (таблица 4).

Таблица 4 Чистота после замораживания-высушивания
Измерение 1
Номер эксперимента	J1: Rt (%)	Rt (%)	Rt (%)
J1C1	2,25 (97%)	2,32 (3%)
J1C2	2,24 (97%)	1,87 (1%)	1,98 (1%)
J1C3	2,22 (99%)	1,87 (1%)
Измерение 2
J1C1	2,25 (100%)
J1C2	2,25 (95%)	1,88 (3%)	1,98 (2%)
J1C3	2,25 (97%)	1,87 (3%)

В заключение, растворяя J1 в 70% этаноле, разбавляя 5 мМ HCl и проводя замораживание-высушивание получили три образца с чистотой >95%.

Пример 1E

Затем тестировали возможность не использовать кислоту и вместо этого разбавляли этанол деионизированной водой. Три образца J1 получили, растворяя J1 (приблизительно 3 мг) в 70% водном этаноле (0,5 мл) при комнатной температуре. Растворы разбавляли деионизированной водой до получения концентрации, равной 0,4 мг/мл. Растворы затем замораживали в бане с сухим льдом и ацетоном (-78°C). Замораживание-высушивание затем проводили в течение 16 часов при давлении 1 миллибар, при комнатной температуре с ловушкой с сухим льдом и ацетоном (-78°C) между сушильной колбой и насосом. Внешний вид после высушивания резюмирован в таблице 5 и чистота в таблице 6.

Таблица 5 Три образца J1, растворенные в этаноле и воде
Номер эксперимента	J1, мг	Вода, мл	Концентрация (мг/мл)	Внешний вид после высушивания
J1D1	3,15	7,37	0,4	белый рассыпчатый порошок
J1D2	3,11	7,27	0,4	белый рассыпчатый порошок
J1D3	3,17	7,42	0,4	белый рассыпчатый порошок

Таблица 6 Чистота после замораживания-высушивания
Номер эксперимента	J1: Rt (%)
J1D1	2,26 (~100%)
J1D2	2,26 (~100%)
J1D3	2,25 (~100%)

Растворяя J1 в 70% этаноле, разбавляя водой и проводя замораживание-высушивание получили три образца с такой же чистотой, как у исходного вещества.

Пример 2

Эффект от эксципиентов на скорость растворения лиофилизированного мелфалан фторфенамида

В данном эксперименте тестировали эффект на скорость растворения от добавления эксципиентов на стадии замораживания-высушивания к мелфалан фторфенамида гидрохлориду (J1). Использовали следующие эксципиенты, все из которых являются типичными компонентами составов, признанными безопасными (GRAS), согласно FDA (US Food and Drug Administration):

- D-маннит, трегалозу и сахарозу;

- тризма (Trizma) гидрохлорид и L-гистидин;

- Полисорбат 80, β-циклодекстрин;

J1 использовали во всех экспериментах.

D-Маннит был куплен у Sigma № 33440;

D-(+)-трегалозы дигидрат был куплен у Sigma № T9449-25 g;

тризма гидрохлорид был куплен у Sigma № T3253-100 g;

β-циклодекстрина гидрат был куплен у Sigma № 856088-5 g;

Полисорбат 80 был куплен у Fluka 59924-100 g.

Замораживание-высушивание проводили на установке Leybold Lyovac GT2. ЖХМС (жидкостная хроматография-масс-спектрометрия) проводили на HP1 100-system, используя ацетонитрил-0,1% трифторуксусную кислоту в воде в качестве элюента. Использовали ACE-колонку C8, 50×3 мм и градиент 10-97% ацетонитрила за 3 мин. Фильтровальные пробирки были получены у Whatman, Mini-UniPrep, 0,45 мкм.

(i) Способ A, замораживание-высушивание

Мелфалан фторфенамид (30,1 мг) растворяли в 5 мл 70% этанола с 1 мМ HCl, полного растворения достигали в течение 12 мин при 18-19°C. Раствор разбавляли водой (70 мл) и распределяли (по 10 мл) в 250 мл круглодонные колбы с и без эксципиента (например β-циклодекстрин, 9 мг). После растворения всех веществ растворы замораживали, погружая в баню с сухим льдом и ацетоном, при -78°C. Замороженные растворы затем подвергали лиофилизации при давлении <0,1 миллибар в течение ночи при комнатной температуре, обезвоживая до сухого состояния образцы, сохраняемые замороженными.

(ii) Способ A, измерение скорости растворения

5% раствор глюкозы (10 мл) добавляли в виде одной порции при 18,5-19°C к замороженному-высушенному веществу и перемешивали с помощью магнита. Аликвоты (приблизительно 0,3 мл) отбирали, используя 1-мл шприц, в различные моменты времени и фильтровали, используя фильтровальную пробирку (0,45 мкм). Фильтрат (8 мкл) анализировали с помощью ВЭЖХ.

(iii) Способ B, замораживание-высушивание

Мелфалан фторфенамид (10,2 мг) растворяли в 1,67 мл 70% этанола с 5 мМ HCl, полного растворения достигали в течение 5 мин при 25°C. Раствор разбавляли водой (23,3 мл) и распределяли (по 10 мл) в колбы с и без эксципиента (например, β-циклодекстрин, 9 мг). Раствор J1 и эксципиента распределяли по пластиковым пробиркам с установленным внутри фильтром 0,45 мкм (0,25 мл в каждую пробирку). Пробирки замораживали, погружая в баню с сухим льдом и ацетоном, при -78°C и затем держали при -20°C в течение ночи в держателе для пробирок. Замороженные пробирки затем оборачивали алюминиевой фольгой для предотвращения взаимного загрязнения и, оставляя их в охлажденном до -20°C держателе, помещали держатель в десикатор, создавая давление <0,1 миллибар на ночь, таким образом, обезвоживая до сухого состояния образцы, сохраняемые замороженными.

(iv) Способ B, измерение скорости растворения

Добавляли 5% раствор глюкозы (0,5 мл), содержащий внутренний стандарт (3-метоксибензойную кислоту, 0,08 мг/мл). Через различные отрезки времени (15 сек - 12 мин) содержимое пробирок фильтровали, фильтрат сразу переносили в стеклянные пробирки, чтобы избежать попадания не растворенного вещества в фильтрат, и 8 мкл фильтрата анализировали, используя ЖХМС.

Определение скорости растворения

В первом подходе, по способу A, водные растворы J1 с различными добавками были заморожены-высушены в круглодонных колбах. К каждому замороженному-высушенному веществу добавляли раствор глюкозы при контролируемом перемешивании. Небольшие аликвоты отбирали шприцем в определенные моменты времени и фильтровали через 0,45 мкм GHP шприцевые фильтры. Степень растворения J1 в фильтрате определяли с помощью ВЭЖХ. Данный способ использовали для лиофилизированного мелфалан фторфенамида одного или вместе с D-маннитом, трегалозой, сахарозой, Полисорбатом 80 и β-циклодекстрином. Результаты этих тестов показали, что J1 полностью растворялся в течение 2-4 мин, вне зависимости от эксципиента (см. фиг.1, без эксципиентов, и фиг.2, с эксципиентами. См. также таблицу 7). Фактически, скорость растворения J1, лиофилизированного с эксципиентами, была на самом деле быстрее, чем может быть измерено с помощью этого способа.

Таблица 7 Добавление эксципиентов к J1 (4 мг) на стадии замораживания-высушивания, способ A
Лиафилизированное вещество	Отношение J1:добавка (J1, мг:добавка, мг)	Количество экспериментов
D-маннит	4:2	1
D-маннит	4:10	2
Трегалоза	4:2	1
Трегалоза	4:10	2
Сахароза	4:10	1
β-циклодекстрин	4:9	1
β-циклодекстрин	4:18	2
Полисорбат 80	4:0,05	1
Полисорбат 80	4:0,265	2

Для повышения точности и обеспечения возможности оценки растворения за более короткие промежутки времени был разработан способ B. По этому способу водные растворы мелфалан фторфенамида и эксципиентов (см. таблица 2) помещали в 2 мл пластиковые пробирки и лиофилизировали. Затем раствор глюкозы с внутренним стандартом, 3-метоксибензойной кислотой, добавляли без перемешивания. Через различные промежутки времени (15 сек - 6 мин) содержимое пробирок фильтровали через 0,45 мкм GHP фильтры, установленные в пробирки, фильтрат переносили в стеклянные пробирки и степень растворения мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) определяли с помощью ВЭЖХ с внутренним стандартом. Отсутствие перемешивания снижает скорость растворения, одновременно и являясь ближе к клиническим условиям, и облегчая измерение кинетик.

Следуя данному способу кинетики растворения лиофилизированного J1 можно регистрировать вплоть до полного растворения через 3-4 мин (см. фиг.3, без эксципиентов и фиг.4, с эксципиентами, см. также таблица 8).

Таблица 8 Добавление эксципиентов к J1 (4 мг) на стадии замораживания-высушивания, способ В
Лиафилизированное вещество	Отношение J1:добавка (J1, мг:добавка, мг)	Количество экспериментов
J1:Маннит	4:20	1
J1:Трегалоза	4:20	1
J1:β-циклодекстрин	4:9	1
J1:Полисорбат	4:5	1
J1: Trizma HCl	4:8	1

Скорости растворения J1 с и без добавок, определенные по способу A и способу B, резюмированы в таблице 9.

Таблица 9 Результаты измерения времен растворения J1 с и без добавок, по способам A и B
Лиофилизированное вещество	Отношение J1:добавка (J1, мг:добавка, мг)	Время (мин) по способу А	Время (мин) по способу В
J1 без добавок		<2	3-4
J1:Трегалоза	4:2	<2
J1:Трегалоза	4:10	<2
J1:Трегалоза	4:20		0,5-1
J1:Сахароза	4:10	<2
J1:Маннит	4:2	<2
J1:Маннит	4:10	<2
J1:Маннит	4:20		0,5-0,75
J1:β-циклодекстрин	4:9	<2	0,75-1
J1:β-циклодекстрин	4:18	<2
J1:Полисорбат	4:0,05	<2
J1:Полисорбат	4:0,265	<2	0,25-0,5
J1:Полисорбат	4:5
J1: Trizma HCl	4:8		>12

Чистота и растворение J1

Образец мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) растворяли в 50% водном ацетонитриле и сразу же анализировали с помощью ЖХМС (жидкостная хроматография-масс-спектрометрия), при этом получая только один пик (>99%). Чистота J1 непосредственно после растворения в 70% этаноле, содержащем 1 мМ HCl или 5 мМ HCl, равнялась приблизительно 97%, с незначительными количествами побочного продукта, равным приблизительно 3%. Количество такого побочного продукта увеличивалось, если раствор оставляли при комнатной температуре.

Результаты демонстрируют, что скорость растворения лиофилизированного J1 в растворе глюкозы при помешивании была выше, чем можно было измерить (по способу A), что не позволяет оценить эффект от добавки эксципиента. Используя более близкий к клиническим условиям способ B без перемешивания, растворение лиофилизированного мелфалан фторфенамида в растворе глюкозы можно регистрировать до полного растворения в течение 3-4 минут. Добавление любого эксципиента из β-циклодекстрина, Полисорбата 80, маннита и трегалозы к раствору мелфалан фторфенамида перед лиофилизацией уменьшило время растворения до менее, чем 1 минуты. Самое быстрое растворение было получено при добавлении Полисорбата 80, приводящего к полному растворению уже к первой контрольной временной точке в 15 секунд.

Пример 3

Тестирование эффекта от концентрации эксципиента Полисорбата 80 на скорость растворения мелфалан фторфенамида

Следующие эксперименты проводили для определения количества эксципиента Полисорбата 80, которое следует добавить на стадии лиофилизации к мелфалан фторфенамиду для максимизации скорости растворения в 5% растворе глюкозы. Использовали 0, 10, 50 и 100% масс. Полисорбата 80 относительно мелфалан фторфенамида. Эксперименты проводили в двух повторениях.

Мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1) использовали во всех экспериментах. Используемый Полисорбат 80 был куплен у Fluka, 59924-100 g.

Лиофилизацию проводили на установке Leybold Lyovac GT2. ЖХМС проводили на HP1 100-system, используя ацетонитрил-0,1% трифторуксусную кислоту в воде в качестве элюента. Использовали ACE-колонку C8, 50×3 мм и градиент 10-97% ацетонитрила за 3 мин. Фильтровальные пробирки были получены у Whatman, Mini-UniPrep, 0,45 мкм.

Подготовку 2 мг/мл стокового раствора мелфалан фторфенамида перед лиофилизацией проводили следующим способом:

11,0 мг мелфалан фторфенамида суспендировали в 10 мМ растворе HCl в абсолютном EtOH (0,5 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут перед добавлением 0,2 мл воды. Смесь перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре (прозрачный раствор) перед его добавлением к водному раствору (4,8 мл) с температурой 0°C. 0,25 мл раствора переносили в пластиковую пробирку, содержащую 10%, 50% или 100% масс. Полисорбата 80. Пробирку встряхивали, охлаждали и проводили лиофилизацию.

5% раствор глюкозы с внутренним стандартом, 3-метоксибензойной кислотой, изготавливали, растворяя 3-метоксибензойную кислоту (1,2 мг) в воде (15 мл). Смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего добавляли 750 мг глюкозы при помешивании. 0,5 мл 5% раствора глюкозы добавляли в каждую пластиковую пробирку после лиофилизации, смеси фильтровали и в разные контрольные временные точки переносили в стеклянные пробирки, и растворимость J1 определяли с помощью ВЭЖХ.

Определение скорости растворения

J1 (11 мг) суспендировали в EtOH (0,5 мл) и перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего добавляли воду (5 мл). Раствор разливали по 4 различным колбам, содержащим 0%, 10%, 50% или 100% масс. (относительно J1) Полисорбата 80. Растворы переносили в 2 мл пластиковые пробирки и лиофилизировали в течение ночи.

5% раствор глюкозы с внутренним стандартом, 3-метоксибензойной кислотой, добавляли в каждую пробирку без перемешивания и смеси фильтровали через 0,45 мкм GHP фильтр, устанавливаемый в пробирку, в различные моменты времени (2-300 секунд). Фильтрат сразу же переносили в стеклянную пробирку для предотвращения попадания не растворенного вещества. Количество растворенного J1, относительно внутреннего стандарта, определяли при помощи ВЭЖХ.

Результаты

Скорость растворения J1 (1 мг/мл в 5% растворе глюкозы) с и без Полисорбата 80 резюмирована в таблице 10 и показана на фиг.5.

Таблица 10
Лиофилизированное вещество (1 мг/мл)	Время достижения стационарного состояния растворения (секунды)
J1 без добавки	300-600
J1 с 10% Полисорбатом 80	30-60
J1 с 50% Полисорбатом 80	30-60
J1 с 100% Полисорбатом 80	30-60

Из таблицы 10 видно, что все образцы, содержащие лиофилизированный J1 и эксципиент Полисорбат 80, растворялись значительно быстрее, чем J1, лиофилизированный в отсутствие эксципиента. Особое внимание уделяли образцу, содержащему 10% Полисорбата 80, и следующим временным точкам в этом эксперименте:

сразу после фильтрации, 2 секунды, 15 секунд, 30 секунд и 5 минут. В первой временной точке, когда образец фильтровали сразу же, приблизительно 40% вещества растворялось и через 2 секунды растворялось приблизительно 70%. Полное растворение достигалось через 30-60 секунд.

Время растворения лиофилизированного J1 при концентрации 1 мг/мл, содержащего различные количества Полисорбата 80, в 5% растворе глюкозы было меньше 1 минуты для всех образцов. Наименьшее количество Полисорбата 80 для быстрого растворения находилось между 10 и 50% по массе.

Пример 4

Тестирование эффекта от концентрации эксципиентов Полисорбата 80, ПЭГ 400 и β-циклодекстрина на скорость растворения мелфалан фторфенамида

Эксперименты из этого примера проводили для изучения эффекта различных концентраций эксципиентов Полисорбата 80, ПЭГ 400 и β-циклодекстрина, добавляемых во время лиофилизации к мелфалан фторфенамиду для максимизации скорости растворения в 5% растворе глюкозы, с дальнейшей целью разработать лиофилизированное вещество, стабильное при хранении и из которого просто изготовить необходимые дозировки.

Мелфалан фторфенамида гидрохлорид (J1) использовали во всех экспериментах. Используемый Полисорбат 80 был куплен у Fluka (59924-100 g), β-циклодекстрин у Aldrich (856088) и ПЭГ 400 у Clariant (100316).

Лиофилизацию проводили на установке Leybold Lyovac GT2. ЖХМС проводили на HP1 100-system, используя ацетонитрил-0,1% трифторуксусную кислоту в воде в качестве элюента. Использовали ACE-колонку C8, 50×3 мм и градиент 10-97% ацетонитрила за 3 мин. Фильтровальные пробирки были получены у Whatman, Mini-UniPrep, 0,45 мкм.

Подготовка 2 мг/мл стокового раствора мелфалан фторфенамида для лиофилизации

11,1 мг мелфалан фторфенамида суспендировали в 10 мМ растворе HCl в абсолютном EtOH (0,5 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут перед добавлением 0,2 мл воды. Смесь перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре (прозрачный раствор) перед добавлением по каплям к водному раствору (4,8 мл) с температурой 0°C. 0,25 мл или 0,5 мл раствора переносили в пластиковую пробирку, содержащую эксципиенты. Пробирку встряхивали, охлаждали и проводили лиофилизацию.

Эксперимент с растворением

5% раствор глюкозы с внутренним стандартом изготавливали, растворяя 3-метоксибензойную кислоту (1,2 мг) в воде (15 мл). Смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего добавляли 750 мг глюкозы при помешивании. 0,2 мл 5% раствора глюкозы добавляли в каждую пластиковую пробирку после лиофилизации, смеси встряхивали 10-15 секунд и фильтровали через 5 минут. Фильтрат переносили в стеклянные пробирки и растворимость мелфалан фторфенамида определяли с помощью ВЭЖХ и калибровочной кривой.

Определение растворимости

2 мг/мл стоковый раствор мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) использовали как и в предыдущих экспериментах.

Для растворения 2,5 мг/мл J1 в 5% растворе глюкозы 0,25 мл стокового раствора помещали в 2 мл пластиковые пробирки, содержащие смесь эксципиентов, определенную согласно дизайну эксперимента, и смеси сразу охлаждали и лиофилизировали.

Высокое/низкое количество каждого эксципиента (в % масс. относительно мелфалан фторфенамида) являлось следующим: Полисорбат 80 (8-80%), ПЭГ 400 (80-400%) и β-циклодекстрин (10-50%). Наибольшее количество каждого эксципиента определяли из базы данных о неактивных ингредиентах, зарегистрированных для использования в лекарственных средствах FDA (Inactive Ingredient database registered IV-administered drugs). β-циклодекстрин имеется в списке FDA's GRAS (общепризнанных безопасными), но не дается никаких рекомендаций касательно внутривенных инъекций, насколько нам известно, в виду чего высокое количество было установлено достаточно заниженным. Массовая доля каждого эксципиента по отношению к мелфалан фторфенамида гидрохлориду (J1) (весу) показана в таблице 11.

Как показано в других экспериментах в настоящем изобретении, скорость растворения J1 заметно возрастает при добавлении Полисорбата 80 во время лиофилизации. Три эксперимента провели в попытке достичь растворимости 5 мг/мл. Стоковый раствор J1 добавляли в 3 различные пластиковые пробирки (эксперимент 12, 13 и 14), содержащие Полисорбат 80 (10%, 50% и 100% масс. относительно мелфалан фторфенамида). Смеси немедленно охлаждали и лиофилизировали.

5% раствор глюкозы с внутренним стандартом (3-метоксибензойная кислота) добавляли в каждую пробирку, пробирки встряхивали и оставляли в течение 5 минут. Смеси фильтровали через 0,45 мкм GHP фильтр для пробирок и фильтрат немедленно переносили в стеклянную пробирку для предотвращения попадания не растворенного вещества. Количество растворенного J1 определяли используя ВЭЖХ и калибровочную кривую.

Результаты

Растворимость J1 в мг/мл при высоком/низком количестве эксципиентов Полисорбата 80, ПЭГ 400 и β-циклодекстрина резюмирован в таблице 12.

Результаты, приведенные в таблице 12, демонстрируют, что растворимость J1 возросла во всех экспериментах, содержащих эксципиенты, по сравнению с не лиофилизированным J1 (номера 15 и 16). Большие различия в растворимости не лиофилизированных образцов J1 возможно вызваны различным размером частиц в экспериментах, так как в эксперименте 15 использовали суспензию тонкодисперсного белого порошка, тогда как в эксперименте 16 использовали крупные комки, проявившие меньшую скорость растворения и, таким образом, показавшие меньшую растворимость J1 за 5 минут. Точность анализа показана в экспериментах 9-11 (1.9, 1.8 и 1.7) с одинаковыми концентрациями эксципиентов. 3 образца с Полисорбатом 80 в качестве эксципиента (10, 50 и 100%) показали растворимость, равную 1,0, 1,2 и 1,4 мг/мл, соответственно.

Эксперименты со смесью эксципиентов Полисорбата 80, ПЭГ 400 и β-циклодекстрина выявили несколько комбинаций с растворимостью, равной или близкой к 2,0 мг/мл. Наибольшая найденная растворимость, равная 2,0 (эксперименты 3, 5 и 7), достигалась только при высокой концентрации ПЭГ 400, образовывавшего жидкости или полутвердые вещества после лиофилизации.

Образцы с меньшим количеством ПЭГ 400 (эксперименты 2, 4, 6 и 8) образовывали белый рассыпчатый порошок после лиофилизации, и наибольшая найденная растворимость равнялась 1,9 мг/мл в эксперименте 8. Это побудило проверить можно ли получить более высокую растворимость уменьшив количество ПЭГ 400 и увеличив количество β-циклодекстрина. Дополнительный образец (строка 17 в таблице 12) лиофилизировали содержащим 50% Полисорбата 80, 80% ПЭГ 400 и 100% β-циклодекстрина. Растворимость J1 с такой смесью эксципиентов равнялась 1,2 мг/мл.

Результат показал, что максимальная растворимость J1 с комбинацией эксципиентов близка к 2 мг/мл.

В эксперименте 13 показано, что раствор J1 только с 50% Полисорбатом обладает растворимостью, равной приблизительно 1,2 мг/мл, достаточной для получения 1,0 мг/мл составов, что позволяет исключить ПЭГ 400 и β-циклодекстрин.

Эксперименты для визуального подтверждения

Для подтверждения растворимости в более клинически значимых условиях проводили крупномасштабные эксперименты в прозрачных стеклянных пробирках, вместо пластиковых пробирок. Пробирка 1 содержала раствор 4,8 мг мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) и 2,4 мг Полисорбата 80. В качестве контроля пробирка 2 содержала 4,8 мг мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) без Полисорбата 80. Содержимое пробирок подвергали лиофилизации в течение ночи.

В каждую пробирку, содержащую лиофилизированный мелфалан J1 в виде белого рассыпчатого вещества, добавляли 4,70 мл 5% раствора глюкозы, получая концентрацию J1, равную 1,02 мг/мл. Смеси встряхивали в течение 10-15 секунд и в тестовой пробирке, содержащей J1 и 50% Полисорбат 80, наблюдался прозрачный раствор через 15 секунд, см. фиг.6, левая пробирка. В контрольной пробирке с лиофилизированным J1 без Полисорбата наблюдались маленькие частицы и не достигалось полное растворение через 30 минут, см. фиг.6, правая пробирка. ЖХМС анализ показал, что чистота мелфалан фторфенамида через 30 минут была >95% в обеих пробирках.

Результаты, предоставленные в настоящем изобретении, показывают, что растворимость J1 в 5% растворе глюкозы можно повысить, используя смесь эксципиентов Полисорбата 80, ПЭГ 400 и β-циклодекстрина, до 1,9 мг/мл. Такая смесь эксципиентов с J1 образует белое рассыпчатое твердое вещество при лиофилизации.

Лиофилизация J1 с 50% масс. Полисорбатом 80 образует белое рассыпчатое твердое вещество, которое быстро растворяется в 5% растворе глюкозы. Насыщающая концентрация, равная 1,2 мг/мл, является достаточной для использования в клинических условиях в дозированных препаратах с концентрацией 1,0 мг/мл.

Пример 5

Тестирование стабильности

Цель первой части данного исследования заключалась в исследовании скорости растворения мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) (лиофилизированного вместе с Полисорбатом 80) в 5% растворе глюкозы.

Скорость растворения J1 (лиофилизированного) в 5% растворе глюкозы, содержащем Полисорбат 80, измерялась в другом эксперименте.

И в заключение измеряли скорость растворения не лиофилизированного J1 в 5% растворе глюкозы, содержащем Полисорбат 80.

Во второй части исследовали деградацию J1 в двух разных препаратах при повышенной температуре. Первый препарат представлял собой лиофилизированное твердое вещество, содержащее Полисорбат 80, и второй представлял собой 25 мг/мл раствор J1 в N,N-диметилацетамид (DMA). Деградацию в течение 1 месяца при +40°C регистрировали, используя два препарата.

(i) Определение скорости растворения

5% раствор глюкозы добавляли в каждую пластиковую пробирку, содержащую J1. Пробирки встряхивали и фильтровали в различные контрольные временные точки. Фильтрат переносили в стеклянную пробирку и количество растворенного J1 определяли с помощью ВЭЖХ.

(ii) Дизайн эксперимента для ускоренного исследования стабильности

10 пробирок с лиофилизированным J1 и Полисорбатом 80, и 10 пробирок с раствором J1 в DMA хранили при 40°C в течение 1 месяца. Две пробирки с лиофилизированным веществом (обозначенные как лиофилизированные 1 и 2 в таблице ниже) и одна пробирка с раствором DMA (обозначенная как DMA в таблице 1 ниже) забрали из комнаты с 40°C, хранили их при -20°C и анализировали для количественного анализа и анализа чистоты J1. Образцы отбирали на 0, 1, 3, 10 и 30 сутки. Каждая пробирка с лиофилизированным веществом содержала 0,25 мг J1. 25 мг/мл раствор в DMA получили от Oncopeptides.

(iii) Анализ и результаты

Лиофилизированные образцы растворяли в 500 мкл DMA в фильтровальных пробирках Whatman 0,45 мкм. Образцы встряхивали перед сдвиганием двух частей пробирки вместе, таким образом фильтруя образец. 25 мг/мл раствора образцов разбавляли DMA, отбирая аликвоту в 20 мкл раствора в пробирку для ВЭЖХ и разбавляя 980 мкл DMA. 4 мкл инъецировали в хроматографическую систему.

Стабильность оценивали как относительную чистоту, так как были небольшие различия в количестве лиофилизированного J1 в пробирках. Используя относительную чистоту каждый образец стандартизовали относительно самого себя и, таким образом минимизировали эффект от различия количества J1 на результаты оценки стабильности.

Скорость растворения J1 в 5% растворе глюкозы в присутствии PS резюмирована в таблице 13:

Таблица 13 Результаты экспериментов с растворением
	Время (мин) достижения стационарного состояния растворения	Содержимое пластиковой пробирки	Раствор
Эксперимент с растворением 1	1	лиофилизированный J1 + Полисорбат 80	5% глюкоза
Эксперимент с растворением 2	1	лиофилизированный J1	5% глюкоза + Полисорбат 80
Эксперимент с растворением 3	1-2	не лиофилизированный J1	5% глюкоза + Полисорбат 80

Результаты тестирования стабильности

Из результатов, показанных в таблице 14, видно, что лиофилизированное вещество практически не изменяется за время тестирования. Наблюдаются только небольшие изменения чистоты. Кроме того, время растворения лиофилизированного J1 при 1 мг/мл в 5% растворе глюкозы было меньше 1 мин в присутствии Полисорбата 80. Время растворения не лиофилизированного J1 при 1 мг/мл в 5% растворе глюкозы, содержащем Полисорбат 80, составляло 1-2 мин.

J1 в растворе DMA значительно разлагается при хранении при +40°C в течение одного месяца. Относительное количество уменьшается приблизительно от 96,8% до 86,9%. J1, который хранили в лиофилизированном виде, подвергся незначительному разложению с 98,7% до 98,3% за тот же период времени.

Другие варианты осуществления

Следует понимать, что хотя изобретение раскрыто в сочетании с подробным описанием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем изобретения, которое определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации включены в объем прилагаемой формулы изобретения.

1. Лиофилизированный фармацевтический препарат, содержащий:
(i) мелфалан фторфенамид гидрохлорид (J1); и
(ii) сахарозу.

2. Лиофилизированный фармацевтический препарат по п. 1, где количество эксципиента составляет приблизительно 10-100% по массе относительно указанного мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1).

3. Лиофилизированный фармацевтический препарат по п. 2, где количество эксципиента составляет 10-50% по массе относительно указанного мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1).

4. Фармацевтическая композиция, содержащая лиофилизированный фармацевтический препарат по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащий физиологически приемлемый раствор.

5. Композиция по п. 4, где указанный физиологически приемлемый раствор представляет собой раствор глюкозы.

6. Композиция по п. 5, где количество глюкозы составляет 4,5-5,5% по массе относительно лиофилизированного препарата.

7. Лиофилизированный фармацевтический препарат по любому из пп. 1-3, не содержащий или практически не содержащий органических растворителей.

8. Лиофилизированный фармацевтический препарат по любому из пп. 1-3 и 7 для применения в качестве лекарственного средства.

9. Лиофилизированный фармацевтический препарат по любому из пп. 1-3 и 7 для применения в лечении и/или профилактике злокачественной опухоли.

10. Лиофилизированный фармацевтический препарат по п. 9, где указанная злокачественная опухоль представляет собой любую из таких, как рак яичников, рак легких, рак мочевого пузыря, мезотелиома, множественная миелома, рак молочной железы или гематологическая злокачественная опухоль.

11. Способ получения лиофилизированного фармацевтического препарата по любому из пп. 1-3 и 7, в котором:
a) мелфалан фторфенамид гидрохлорид (J1) растворяют в органическом растворителе для получения раствора мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1);
b) воду добавляют к раствору мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) для получения водного раствора мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) с концентрацией, равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;
c) сахарозу добавляют к раствору мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1); и
d) водный раствор мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1), содержащий сахарозу, подвергают лиофилизации.

12. Способ получения лиофилизированного фармацевтического препарата по любому из пп. 1-3 и 7, в котором:
a) мелфалан фторфенамид гидрохлорид (J1) растворяют в органическом растворителе;
b) воду добавляют к раствору, полученному на стадии а), для получения раствора указанного мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) с концентрацией, равной приблизительно 0,2-3,0 мг/мл;
c) сахарозу добавляют к раствору, полученному на стадии b); и
d) раствор, полученный на стадии с), подвергают лиофилизации.

13. Способ по п. 11 или 12, где органический растворитель выбирают из этанола, содержащей этанол кислоты, глицерина, пропиленгликоля, бензилового спирта, диметилацетамида (DMA), N-метил-2-пирролидона, изопропанола, н-бутанола, трет-бутанола, метил трет-бутил простого эфира, диметилсульфоксида, тетрагидрофурана, 2-метил тетрагидрофурана, ацетона, диметилформамида, ацетонитрила, диоксана, уксусной кислоты, молочной кислоты, пропионовой кислоты, изопропанола, н-пропанола, втор-бутанола, метанола и смеси этанола и воды.

14. Способ по п. 13, где органический растворитель представляет собой этанол.

15. Применение сахарозы в лиофилизированном препарате мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) для уменьшения времени растворения лиофилизированного препарата мелфалан фторфенамида гидрохлорида (J1) при растворении в водном растворителе.