Состав с отсроченным высвобождением для уменьшения частоты мочеиспускания и способ его применения

Группа изобретений относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использована для уменьшения частоты мочеиспускания. Для этого вводят эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей ацетаминофен в дневной дозировке от 1 мг до 2000 мг, либо ацетаминофен в дневной дозировке от 50 мг до 2000 мг и один или несколько антимускариновых агентов, либо ацетаминофен и один или несколько антидиуретиков, причем фармацевтическая композиция может иметь различное время высвобождения. Это обеспечивает эффективное подавление сокращений гладкой мускулатуры мочевого пузыря. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 2 ил., 9 табл., 8 пр.

 

Настоящая заявка претендует на приоритет заявки на патент США с порядковым номером 13/487 343, поданной 4 июня 2012, заявки на патент США с порядковым номером 13/423 949, поданной 19 марта 2012, и заявки на патент США с порядковым номером 13/343 349, поданной 4 января 2012.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящая заявка относится, главным образом, к способам и композициям для подавления сокращения мышц и, в частности, к способам и композициям для подавления сокращений гладкой мускулатуры мочевого пузыря.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сократительная мышца (детрузор) представляет собой слой стенки мочевого пузыря, состоящий из гладких мышечных волокон, организованных в спиральные, продольные и круговые пучки. Растяжение мочевого пузыря дает парасимпатической нервной системе сигнал на сокращение детрузора. Это стимулирует мочевой пузырь вытолкнуть мочу через мочеиспускательный канал.

Для выхода мочи из мочевого пузыря как внутренний сфинктер, управляемый вегетативной нервной системой, так и внешний сфинктер, управляемый сознанием человека, должны находиться в открытом состоянии. Проблемы с этими мышцами могут приводить к недержанию мочи. Если количество мочи достигает 100% абсолютной емкости мочевого пузыря, внешний сфинктер перестает управляться сознанием человека и моча немедленно выбрасывается из мочевого пузыря.

В мочевом пузыре взрослого человека обычно удерживается примерно 300-350 мл мочи (рабочий объем), но полностью заполненный мочевой пузырь взрослого человека может вмещать примерно до 1000 мл (абсолютный объем), причем этот объем неодинаков у разных людей. По мере накопления мочи, морщины, образующиеся при сжатии стенки мочевого пузыря (складки), разглаживаются, и стенка мочевого пузыря утончается и растягивается, позволяя мочевому пузырю удерживать большее количество мочи без значительного повышения внутреннего давления.

Большинство индивидуумов обычно начинает ощущать позывы к мочеиспусканию, когда объем мочи в мочевом пузыре достигает примерно 200 мл. На этом этапе субъект при желании может легко воздерживаться от мочеиспускания. Если мочевой пузырь продолжает наполняться, желание осуществить мочеиспускание становится сильнее и его становится труднее игнорировать. В конце концов мочевой пузырь наполнится до такой степени, что потребность в мочеиспускании становится непреодолимой, и субъект не сможет больше игнорировать его. У некоторых индивидуумов, эта настоятельная потребность осуществить мочеиспускание возникает, когда мочевой пузырь заполнен менее чем на 100% от своего рабочего объема. Такие усиленные позывы к мочеиспусканию могут мешать нормальной деятельности человека, включая способность непрерывно спать в течение продолжительных периодов времени, достаточных для отдыха. В некоторых случаях упомянутые усиленные позывы к мочеиспусканию могут быть связаны с медицинскими состояниями, такими как доброкачественная гиперплазия простаты или рак простаты у мужчин, или беременность у женщин. Однако усиленные позывы к мочеиспусканию возникают также у индивидуумов, как мужского, так и женского пола, у которых отсутствуют другие медицинские состояния.

Соответственно, существует потребность в композициях и способах лечения мужчин и женщин, страдающих позывами к мочеиспусканию, когда мочевой пузырь заполнен мочой менее чем на 100% своего рабочего объема. Указанные композиции и способы необходимы для подавления мышечных сокращений, чтобы позывы к мочеиспусканию возникали, когда объем мочи в мочевом пузыре превышал примерно 100% его рабочего объема.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из аспектов настоящей заявки относится к способу уменьшения частоты мочеиспускания. В одном из вариантов осуществления, этот способ включает введение субъекту, которому это необходимо, эффективного количества фармацевтической композиции, включающей первый обезболивающий агент, выбранный из группы, состоящей из аспирина, ибупрофена, напроксена натрия и ацетаминофена, где эта фармацевтическая композиция представляет собой состав с отсроченным высвобождением, и где указанный первый обезболивающий агент вводят перорально в дневной дозировке от 5 мг до 2000 мг.

В другом варианте осуществления, способ по настоящему изобретению включает введение субъекту, которому это необходимо, эффективного количества фармацевтической композиции, включающей несколько действующих ингредиентов, где в число этих действующих ингредиентов входят: (1) один или несколько обезболивающих агентов и/или (2) один или несколько антимускариновых агентов, и где упомянутые один или несколько обезболивающих агентов вводят перорально в общей дневной дозировке от 5 мг до 2000 мг. В некоторых вариантах осуществления упомянутые один или несколько обезболивающих агентов выбраны из группы, состоящей из аспирина, ибупрофена, напроксена натрия и ацетаминофена. Примеры антимускариновых агентов включают, не ограничиваясь этим, оксибутинин, солифенацин, дарифенацин, фесотеродин, толтеродин, троспиум и атропин.

Еще один аспект настоящей заявки относится к фармацевтической композиции, включающей: один или несколько обезболивающих агентов, выбранных из группы, состоящей из аспирина, ибупрофена, напроксена и ацетаминофена; одного или нескольких антидиуретиков; а также фармацевтически приемлемого носителя, где указанная композиция обеспечивает отсроченное высвобождение как минимум одного из указанных одного или нескольких обезболивающих агентов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Фиг. 1A и Фиг. 1B представляют собой диаграммы, показывающие, что обезболивающие средства регулируют экспрессию костимулирующих молекул макрофагами Raw 264 в отсутствии (Фиг. 1A) или в присутствии (Фиг. 1B) LPS. Клетки культивировали в течение 24 часов в присутствии только анальгетика или анальгетика совместно с LPS, вырабатываемым Salmonella typhyiurium (0,05 мкг/мл). Результаты выражены в средних процентных долях CD40+CD80+клетки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Помещенное ниже подробное описание изобретения приведено для того, чтобы дать возможность каждому специалисту в данной области техники воспроизвести и применить настоящее изобретение. С целью объяснения дана конкретная номенклатура препаратов, чтобы обеспечить полное понимание настоящего изобретения. Однако специалисту в данной области техники должно быть ясно, что эти конкретные подробности не являются необходимыми для практической реализации изобретения. Описание конкретных вариантов осуществления приведено только в качестве типовых примеров. Предполагается, что настоящее изобретение не ограничено показанными вариантами осуществления, но должно соответствовать наиболее широкой возможной области, согласующейся с принципами и элементами, раскрытыми в настоящей заявке.

В настоящей заявке термин «эффективное количество» означает количество, необходимое для достижения намеченного результата.

В настоящем описании термины «обезболивающий», «обезболивающий агент» или «анальгетик» относятся к агентам, соединениям или препаратам, применяемым для облегчения боли, и включает противовоспалительные соединения. Примеры обезболивающих и/или противовоспалительных агентов, соединений или препаратов включают, не ограничиваясь этим, следующие вещества: нестероидные противовоспалительные средства (NSAIDs), салицилаты, аспирин, салициловую кислоту, метилсалицилат, дифлунизал, салсалат, олсалазин, сульфасалазин, производные пара-аминофенола, ацетанилид, ацетаминофен, фенацетин, фенаматы, мефенамовую кислоту, меклофенамат, меклофенамат натрия, производные гетероарилуксусной кислоты, толметин, кеторолак, диклофенак, производные пропионовой кислоты, ибупрофен, напроксен натрия, напроксен, фенопрофен, кетопрофен, флурбипрофен, оксапрозин; еноловые кислоты, производные оксикама, пироксикам, мелоксикам, теноксикам, ампироксикам, дроксикам, пивоксикам, производные пиразолона, фенилбутазон, оксифенбутазон, антипирин, аминопирин, дипирон, коксибы, целекоксиб, рофекоксиб, набуметон, апазон, индометацин, сулиндак, этодолак, изобутилфенил пропионовую кислоту, люмиракоксиб, эторикоксиб, парекоксиб, вальдекоксиб, тиракоксиб, этодолак, дарбуфелон, декскетопрофен, ацеклофенак, ликофелон, бромфенак, пранопрофен, локсопрофен, пироксикам, нимесулид, цизолирин, 3-формиламино-7-метилсульфониламино-6-фенокси-4H-1-бензопиран-4-он, мелоксикам, лорноксикам, d-индобуфен, мофезолак, амтолметин, пранопрофен, толфенамовую кислоту, флурбипрофен, супрофен, оксапрозин, залтопрофен, алминопрофен, тиапрофеновую кислоту, их фармакологически приемлемые соли, гидраты и сольваты.

В настоящей заявке термины «коксиб» и «ингибитор COX» относятся к композиции соединений, которые способны ингибировать активность или экспрессию ферментов COX2, или способны подавлять или уменьшать тяжесть сильной воспалительной реакции, включая боль и опухание.

Мочевой пузырь имеет две важных функции: хранение мочи и опорожнение. Хранение мочи происходит при низком давлении, т.е. детрузор во время фазы заполнения расслаблен. Опорожнение мочевого пузыря требует координированного сокращения детрузора и расслабления сфинктеров мочевыводящих путей. Нарушение функции хранения может приводить к симптомам нижних мочевыводящих путей, например, неотложным позывам к мочеиспусканию, учащенному мочеиспусканию и острому недержанию, т.е. компонентам синдрома гиперактивности мочевого пузыря. Синдром гиперактивного мочевого пузыря, который может возникать из-за неуправляемых сокращений гладкой мускулатуры мочевого пузыря (детрузора) во время фазы хранения мочи, является часто встречающейся и плохо освещенной проблемой, распространенность которой оценили только в последнее время.

Один из аспектов настоящей заявки относится к способу уменьшения частоты мочеиспускания путем введения человеку, которому это необходимо, фармацевтической композиции, представляющей собой состав с отсроченным высвобождением. Эта фармацевтическая композиция включает один или несколько обезболивающих агентов и, необязательно, один или несколько антимускариновых агентов.

В настоящей заявке термин «отсроченное высвобождение» относится к лекарственным средствам, для которых нехарактерно немедленное разрушение и высвобождение действующего ингредиента (ингредиентов) в организм. В некоторых вариантах осуществления, термин «отсроченное высвобождение» используется в отношении лекарственных составов, имеющих профиль высвобождения, характеризующийся заранее определенной задержкой высвобождения лекарственного средства после введения. В некоторых вариантах осуществления составы с отсроченным высвобождением включают кишечнорастворимое покрытие, которое представляет собой барьер, нанесенный на пероральный лекарственный препарат, который препятствует высвобождению лекарственного средства, до того, как препарат достигнет тонкого кишечника. Составы с отсроченным высвобождением, например, с кишечнорастворимым покрытием, препятствуют растворению в желудке препаратов, оказывающих раздражающее действие на желудок, например, аспирина. Такие покрытия применяются также для защиты действующих веществ, нестабильных в присутствии кислот, от действия кислоты в желудке, вместо этого доставляя их в среду с основными значениями pH (значения pH в кишечнике составляют 5,5 и более), где активные вещества не разрушаются и оказывают желаемое действие.

Термин «пульсирующее высвобождение» описывает один из вариантов отсроченного высвобождения и используется в настоящей заявке в отношении лекарственных составов, которые обеспечивают быстрое импульсное высвобождение лекарственного средства в течение короткого периода времени сразу же после заранее установленного периода задержки, что обеспечивает «пульсирующий» профиль действующего вещества в плазме после введения лекарственного средства. Составам можно придавать такие свойства, чтобы они обеспечивали высвобождение в форме одного импульса или ряда импульсов через установленные промежутки времени после введения.

Большинство кишечнорастворимых покрытий действуют за счет того, что они образуют поверхность, которая является стабильной при сильно кислых значениях pH, имеющихся в желудке, но быстро разрушается при менее кислых (относительно более основных) значениях pH. Поэтому препараты с кишечнорастворимым покрытием не будут растворяться в кислом желудочном соке (pH~3), но растворение произойдет в щелочной (pH 7-9) среде тонкого кишечника. Примеры материалов для кишечнорастворимого покрытия включают, не ограничиваясь этим, сополимеры метилакрилат-метакриловая кислота, ацетат сукцинат целлюлозы, фталат гидроксипропил метил целлюлозы, ацетат сукцинат гидроксипропил метил целлюлозы (ацетат сукцинат гипромеллозы), поливинил ацетат фталат (PVAP), сополимеры метил метакрилат-метакриловая кислота, альгинат натрия и стеариновую кислоту.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят перорально в форме нескольких лекарственных составов, предназначенных для обеспечения отсроченного высвобождения. Пероральные дозированные формы с отсроченным высвобождением включают, например, таблетки, капсулы, каплеты (капсуловидные таблетки) и могут также включать большое число гранул, шариков, порошков или пеллет, которые могут быть или не быть заключены в капсулы. Таблетки и капсулы представляют собой наиболее традиционные пероральные дозированные формы, и в них применяются твердые фармацевтические носители.

В составах с отсроченным высвобождением на гранулы, таблетки или капсулы может быть нанесено барьерное покрытие, которое способствует задержке растворения и сопутствующего высвобождения лекарственного средства в кишечник. Как правило, барьерное покрытие содержит один или несколько полимеров, которые заключают в корпус, окружают или формируют слой или защитную пленку вокруг терапевтической композиции или активного ядра.

В некоторых вариантах осуществления, действующие агенты поступают в организм в составе, который обеспечивает отсроченное высвобождение в заранее определенный момент времени после введения. Задержка высвобождения может составлять до примерно 10 минут, примерно 20 минут, примерно 30 минут, примерно 1 часа, примерно 2 часов, примерно 3 часов, примерно 4 часов, примерно 5 часов, примерно 6 часов или более.

Композиция с отсроченным высвобождением может включать 100% общей дозы данного действующего агента, вводимого в одной единице дозированной лекарственной формы. В качестве альтернативы, композиция с отсроченным высвобождением может быть включена в качестве компонента в состав с комбинированным профилем высвобождения и может обеспечивать примерно 30-95% общей дозировки действующего агента (агентов), которые предполагается доставить с помощью данной фармацевтической композиции. Например, компонент с немедленным высвобождением может обеспечивать примерно 5-70% или примерно 50% от общей дозы действующего агента (агентов), которые предполагается доставить с помощью данного фармацевтического состава. В альтернативных вариантах осуществления, компонент с отсроченным высвобождением обеспечивает примерно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% от общей дозы действующего агента (агентов), которые предполагается доставить с помощью данного состава.

Состав с отсроченным высвобождением обычно включает барьерное покрытие, которое задерживает высвобождение действующего ингредиента (ингредиентов). Барьерное покрытие может состоять из целого ряда различных материалов, в зависимости от цели, с которой оно применяется. Кроме того, состав может включать несколько барьерных покрытий, которые способствуют достижению необходимого профиля высвобождения. Покрытия могут представлять собой покрытия из сахара, пленочные покрытия (например, на основе гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, метилгидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, акриловых сополимеров, полиэтиленгликолей и/или поливинилпирролидона) или покрытия на основе сополимера метакриловой кислоты, ацетатфталата целлюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетатсукцината гидроксипропилметилцеллюлозы, поливинилацетата фталата, шеллака и/или этилцеллюлозы. Кроме того, состав может дополнительно включать материал, вызывающий задержку во времени, например, глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

В некоторых вариантах осуществления, состав с отсроченным высвобождением включает кишечнорастворимое покрытие, которое состоит из одного или нескольких полимеров, способствующих высвобождению действующих агентов в ближних или удаленных участках желудочно-кишечного тракта. В настоящей заявке, термин «кишечнорастворимое полимерное покрытие» означает покрытие, включающее один или несколько полимеров, и имеющее pH-зависимый или pH-независимый профиль высвобождения. Как правило, такое покрытие устойчиво к растворению в кислой среде желудка, но растворяется или разрушается в последующих участках желудочно-кишечного тракта, например, тонком кишечнике или ободочной кишке. Кишечнорастворимое полимерное покрытие, как правило, препятствует высвобождению действующих агентов, пока не пройдет определенное время, после выхода лекарственного препарата из желудка, т.е. обеспечивает задержку высвобождения примерно в 3-4 часа после введения.

pH-зависимые кишечнорастворимые покрытия, включающие один или несколько pH-зависимых или pH-чувствительных полимеров, которые поддерживают их структурную целостность при низких значениях pH, например, в желудке, но растворяются в среде с высоким значением pH в последующих областях желудочно-кишечного тракта, например, в тонком кишечнике, где высвобождается лекарственное содержимое. Для целей настоящего изобретения, термин «pH-зависимый» определяется, как имеющий характеристики (например, растворимость), которые меняются в зависимости от значения pH окружающей среды. Типовые примеры pH-зависимых полимеров включают, не ограничиваясь этим, сополимеры метакриловой кислоты, сополимеры метакриловая кислота-метилметакрилат (например, EUDRAGIT^® L100 (тип A), EUDRAGIT^® S100 (тип B), Rohm GmbH, Germany); сополимеры метакриловая кислота-этилакрилат (например, EUDRAGIT^® L100-55 (тип C) и дисперсия сополимера EUDRAGIT^® L30D-55, Rohm GmbH, Germany); сополимеры метакриловая кислота-метилметакрилат и метилметакрилат (EUDRAGIT^® FS); терполимеры метакриловой кислоты, метакрилата и этилакрилата; ацетатфталаты целлюлозы (CAP); фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMCP) (например, HP-55, HP-50, HP-55S, Shinetsu Chemical, Japan); поливинилацетатфталаты (PVAP) (например, COATERIC^®, OPADRY^® кишечный белый OY-P-7171); ацетатсукцинаты целлюлозы (CAS); ацетатсукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMCAS), например, HPMCAS LF Grade, MF Grade, HF Grade, в т.ч. AQOAT^® LF и AQOAT^® MF (Shin-etsu Chemical, Japan); шеллак (например, Marcoat^TM 125 и Marcoat^TM 125N); карбоксиметилэтилцеллюлозу (CMEC, Freund Corporation, Japan), ацетатфталаты целлюлозы (CAP) (например, AQUATERIC^®); ацетаттримеллитаты целлюлозы (CAT); а также смеси двух или нескольких перечисленных полимеров в массовых соотношениях от примерно 2:1 до примерно 5:1, например, смесь EUDRAGIT^® L100-55 и EUDRAGIT^® S100 в массовом отношении от примерно 3:1 до примерно 2:1, или смесь EUDRAGIT^® L30D-55 и EUDRAGIT^® FS в массовом отношении от примерно 3:1 до примерно 5:1.

pH-зависимые полимеры, как правило, демонстрируют характеристическое значение pH, которое является оптимальным для растворения. В некоторых вариантах осуществления pH-зависимые полимеры демонстрируют оптимальное значение pH примерно от 5,0 до 5,5, примерно от 5,5 до 6, примерно от 6,0 до 6,5 или примерно от 6,5 до 7,0. В других вариантах осуществления, pH-зависимый полимер демонстрирует оптимальное значение pH≥5,0, ≥5,5, ≥6,0, ≥6,5 или ≥7,0.

В других вариантах осуществления кишечнорастворимое покрытие может включать один или несколько pH-независимых полимеров. Эти полимеры могут обеспечить высвобождение лекарственного вещества через определенный период времени, независимо от значения pH. Для целей настоящего изобретения, «pH-независимый» определяется как имеющий характеристики (например, растворимость), на которые практически не влияет значение pH. Профили высвобождения pH-независимых полимеров часто именуют «управляемыми временем» или «зависимыми от времени».

pH-независимый полимер может быть нерастворимым или растворимым в воде. Типовые примеры нерастворимых в воде полимеров включают, не ограничиваясь этим, нейтральные эфиры метакриловой кислоты с небольшими фрагментами триметиламмонийэтилметакрилат хлорида (например, EUDRAGIT^® RS и EUDRAGIT^® RL); нейтральные дисперсии сложных эфиров без каких-либо функциональных групп (например, EUDRAGIT^® NE30D и EUDRAGIT^® NE30); полимеры целлюлоз, например, этилцеллюлозы, гидроксиэтил целлюлозы, ацетата целлюлозы или их смеси, а также другие продукты, образующие pH-независимое покрытие. Типовые примеры растворимых в воде pH-независимых полимеров включают OPADRY^® amb.

В некоторых вариантах осуществления, pH-независимые полимеры содержат один или несколько полисахаридов, которые устойчивы к разрушению как в желудке, так и в тонком кишечнике. Такие полимеры могут разрушаться только в ободочной кишке, которая содержит большое количество микрофлоры, вырабатывающей ферменты, которые способны разрушать такое полисахаридное покрытие, высвобождая лекарственное содержимое регулируемым и зависимым от времени образом.

В некоторых вариантах осуществления методика получения покрытий включает смешивание одного или нескольких pH-зависимых и одного или нескольких pH-независимых полимеров. Смешивание pH-зависимых и pH-независимых полимеров может уменьшить скорость высвобождения действующих ингредиентов, когда достигается оптимальное значение pH для растворения растворимого полимера.

В некоторых вариантах осуществления, «управляемый временем» или «зависимый от времени» профиль высвобождения можно получить с применением нерастворимого в воде корпуса капсулы, содержащей один или несколько действующих агентов, где этот корпус капсулы закрыт с одного из концов нерастворимой, но проницаемой и способной к набуханию пробкой из гидрогеля. При контакте с жидкой средой желудочно-кишечного тракта или растворяющей средой пробка набухает, самопроизвольно выталкивается из капсулы и высвобождает лекарственное средство по прошествии заранее установленного времени задержки, которое можно регулировать, например, положением и размером пробки. Капсульный корпус может быть дополнительно покрыт внешним pH-зависимым кишечнорастворимым покрытием, предохраняющим капсулу от контакта с внешней средой, пока она не достигнет тонкого кишечника. Подходящие материалы пробки включают, например, полиметакрилаты, разрушаемые прессованные полимеры (например, HPMC, поливиниловый спирт), застывшие расплавы полимеров (например, глицерилмоноолеата) и полимеры, способные разрушаться под действием ферментов (например, полисахариды, такие как амилоза, арабиногалактан, хитозан, хондроитина сульфат, циклодекстрин, декстран, гуаровая камедь, пектин и ксилан).

В других вариантах осуществления можно разработать капсулы или двухслойные таблетки, которые включают ядро, содержащее лекарственное вещество, покрытое разбухающим слоем, и внешнее нерастворимое, но полупроницаемое полимерное покрытие или мембрану. Время задержки до разрушения можно регулировать за счет изменения проницания и механических свойств полимерного покрытия и характеристик набухания набухающего слоя. Как правило, набухающий слой включает один или несколько компонентов, способных к набуханию, например, набухающих гидрофильных полимеров, которые набухают и удерживают воду в своей структуре.

Типовые примеры материалов, способных набухать в воде, включают, не ограничиваясь этим, полиэтиленоксид (например, имеющий среднюю молекулярную массу от 1 000 000 до 7 000 000, например, POLYOX^®), метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу; полиалкиленоксиды со среднемассовой молекулярной массой от 100000 до 6 000000, включая, но не ограничиваясь этим, поли(метиленоксид), поли(бутиленоксид); поли(гидроксиалкилметакрилат) со средней молекулярной массой от 25000 до 5 000000; поли(виниловый спирт) с низким содержанием ацетальных остатков, который сшит глиоксалем, формальдегидом или глутаровым альдегидом и имеет степень полимеризации от 200 до 30000; смеси метилцеллюлозы, поперечно-сшитого агара и карбоксиметилцеллюлозы; сополимеры, образующие гидрогели, полученные путем формирования дисперсии тонкоизмельченного сополимера малеинового ангидрида со стиролом, этиленом, пропиленом, бутиленом или изобутиленом, поперечно-сшитого с использованием 0,001-0,5 молей насыщенного сшивающего реагента на моль малеинового ангидрида в упомянутом сополимере; CARBOPOL^®, т.е. кислые карбоксиполимеры с молекулярной массой от 450000 до 4 000000; полиакриламиды CYANAMER^®; поперечно-сшитые, набухающие в воде полимеры инден-малеиновый ангидрид; GOODRITE^®, т.е. полиакриловые кислоты с молекулярной массой от 80000 до 200000; привитые сополимеры крахмала; AQUA-KEEPS^®, т.е. полимеры акрилатов и полисахаридов, состоящие из конденсированных фрагментов глюкозы, например, диэфирные поперечно-сшитые полиглюканы; карбомеры, имеющие вязкость от 3000 до 60000 мПа в форме 0,5%-1% масса/объем водных растворов; простые эфиры целлюлозы, например, гидроксипропилцеллюлозу, имеющую вязкость примерно 1000-7000 мПа в форме 1% масса/масса водного раствора (25°C); гидроксипропил метилцеллюлозу, имеющую вязкость примерно 1000 или более, предпочтительно 2500 или более, максимум до 25 000 мПа в форме 2% масса/объем водного раствора; поливинилпирролидон, имеющий вязкость примерно 300-700 мПа в виде 10% масса/объем водного раствора при 20°C; а также их комбинации.

Кишечнорастворимый слой может дополнительно включать средство против прилипания, например, тальк или глицерилмоностеарат. Кроме того, кишечнорастворимый слой может включать один или несколько пластификаторов, в т.ч., но не ограничиваясь этим, триэтилцитрат, ацетилтриэтилцитрат, ацетилтрибутилцитрат, полиэтиленгликольацетилированные моноглицериды, глицерин, триацетин, пропиленгликоль, эфиры фталевой кислоты (например, диэтилфталат, дибутилфталат), диоксид титана, оксид железа (III), касторовое масло, сорбитол и дибутилсебацинат.

В другом варианте осуществления, в составах с замедленным высвобождением применяются проницаемые для воды, но нерастворимые пленочные покрытия, которые окружают действующий ингредиент и в которых применяется осмотический агент. Вода из пищеварительного тракта медленно проникает через пленку в ядро, ядро набухает, пока не разрывается пленка, что приводит к высвобождению действующих ингредиентов. Свойства пленочного покрытия можно регулировать для обеспечения различной скорости проникания воды или времени высвобождения.

В качестве альтернативы, время высвобождения лекарственного средства можно регулировать за счет времени задержки до разрушения лекарственной формы, зависящего от баланса между устойчивостью и толщиной нерастворимой в воде полимерной мембраны (например, из этилцеллюлозы, EC), на дне которой содержатся заранее определенные микропоры, и количеством набухающего эксципиента, например, гидроксипропилцеллюлозы с низкой степенью замещения (L-HPC) и гликолята натрия. После перорального приема, жидкость из желудочно-кишечного тракта проникает через микропоры, вызывая набухание соответствующих эксципиентов, что порождает внутреннее давление, высвобождающее компоненты капсулы, включая первый корпус капсулы, содержащий набухающие материалы, второй корпус капсулы, содержащий лекарственное вещество, и внешнее покрытие, соединенное с первым корпусом капсулы.

В других вариантах осуществления лекарственные средства могут высвобождаться при действии осмотических механизмов. В качестве примера, капсула может содержать одну осмотическую ячейку или 2, 3, 4, 5 или 6 пушпульных осмотических ячеек, заключенных в капсулу из твердого желатина, где каждая из двухслойных пушпульных ячеек содержит слой, развивающий осмотическое давление, и слой лекарственного вещества, причем оба слоя окружены полупроницаемой мембраной. В этой мембране просверлены одно или несколько отверстий, ведущих в слой лекарственного вещества. Мембрана может быть дополнительно покрыта pH-зависимым кишечнорастворимым покрытием, которое препятствует высвобождению до выхода лекарственной формы из желудка. Желатиновая капсула растворяется сразу же после приема внутрь. Как только осмотическая ячейка (ячейки) попадает в тонкий кишечник, кишечнорастворимое покрытие разрушается, что позволяет жидкости проходить через полупроницаемую мембрану и вызывать набухание осмотического отсека, который оказывает давление на лекарство и заставляет лекарственное средство выходить через отверстие (отверстия) со скоростью, точно управляемой скоростью прохождения воды через полупроницаемую мембрану. Высвобождение лекарственного средства может осуществляться с постоянной скоростью в течение периода времени до 24 часов или более.

Слой, развивающий осмотическое давление, включает один или несколько осмотических агентов, создающих движущую силу для перемещения воды через полупроницаемую мембрану в ядро средства доставки. Один из классов осмотических агентов включает набухающие в воде гидрофильные полимеры, именуемые также «осмополимерами» и «гидрогелями», в число которых входят, не ограничиваясь перечисленным, гидрофильные виниловые и акриловые полимеры, полисахариды, например, альгинат кальция, полиэтиленоксид (PEO), полиэтиленгликоль (PEG), полипропиленгликоль (PPG), поли(2-гидроксиэтил метакрилат), поли(акриловая) кислота, поли(метакриловая) кислота, поливинилпирролидон (PVP), поперечно-сшитый PVP, поливиниловый спирт (PVA), сополимеры PVA/PVP, сополимеры PVA/PVP с гидрофильными мономерами, например, метилметакрилатом и винилацетатом, гидрофильные полиуретаны, включающие крупные блоки PEO, натрий кросскармелоза, каррагинан, гидроксиэтилцеллюлоза (HEC), гидроксипропилцеллюлоза (HPC), гидроксипропил метил целлюлоза (HPMC), карбоксиметилцеллюлоза (CMC) и карбоксиэтил целлюлоза (CEC), альгинат натрия, поликарбофил, желатин, ксантановая камедь и натрий крахмал гликолят.

Другой класс осмотических агентов включает осмогены, которые способны впитывать воду, создавая градиент осмотического давления через полупроницаемую мембрану. Типовые примеры осмогенов включают, не ограничиваясь этим, неорганические соли, например, сульфат магния, хлорид магния, хлорид кальция, хлорид натрия, хлорид лития, сульфат калия, фосфат калия, карбонат натрия, сульфит натрия, сульфат лития, хлорид калия и сульфат натрия; сахара, например, декстрозу, фруктозу, глюкозу, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, раффинозу, сорбит, сахарозу, трегалозу и ксилит; органические кислоты, например, аскорбиновую кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту, лимонную кислоту, малеиновую кислоту, себациновую кислоту, сорбиновую кислоту, адипиновую кислоту, этилендиаминтетрауксусную кислоту, глутаминовую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, янтарную кислоту и винную кислоту; мочевину; а также их смеси.

Материалы, подходящие для формирования полупроницаемой мембраны, включают различные разновидности акриловых полимеров, виниловых полимеров, эфирных полимеров, полиамидов, поли(сложных эфиров) и производных целлюлозы, которые проницаемы для воды и нерастворимы в воде при физиологически разумных значениях pH, или, которые можно сделать нерастворимыми в воде с помощью химических превращений, например, сшивания.

В другом варианте осуществления, в составе с отсроченным высвобождением применяется непроницаемое для воды покрытие таблетки, за счет которого вода проникает через регулируемое отверстие в покрытии, до тех пор, пока ядро не разрушится. Когда таблетка разрушается, содержащееся в ней лекарственное вещество высвобождается немедленно или в течение продолжительного периода времени. Эту и другие методики можно модифицировать, чтобы получить заранее определенный период задержки до начала высвобождения лекарственного вещества.

Могут применяться различные методики нанесения покрытия на гранулы, шарики, порошки или пеллеты, таблетки, капсулы или их комбинации, содержащие действующие агенты, с целью получения ряда различных профилей высвобождения. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция имеет форму таблетки или капсулы, содержащей единственный слой покрытия. В других вариантах осуществления, фармацевтическая композиция имеет форму таблетки или капсулы, содержащей несколько слоев покрытия.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает несколько действующих ингредиентов, выбранных из группы, состоящей из анальгетиков, антимускариновых агентов, антидиуретиков и спазмолитиков. Примеры спазмолитиков включают, не ограничиваясь перечисленными, карисопродол, бензодиазепины, баклофен, циклобензаприн, метаксалон, метокарбамол, клонидин, аналоги клонидина и дантролен. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция включает один или несколько анальгетиков. В других вариантах осуществления, фармацевтическая композиция включает (1) один или несколько анальгетиков и (2) один или несколько других действующих ингредиентов, выбранных из группы, состоящей из антимускариновых агентов, антидиуретиков и спазмолитиков. В другом варианте осуществления, фармацевтическая композиция включает (1) один или два анальгетика и (2) один или два антимускариновых агента. В другом варианте осуществления, фармацевтическая композиция включает (1) один или два анальгетика и (2) один или два антидиуретика. В следующем варианте осуществления, фармацевтическая композиция включает (1) один или два анальгетика и (2) один или два спазмолитика. В еще одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает (1) один или два аналгетика, (2) один или два антимускариновых агента и (3) один или два антидиуретика.

В одном из вариантов осуществления предусмотрено немедленное высвобождение нескольких действующих ингредиентов. В другом варианте осуществления предусмотрено отсроченное высвобождение нескольких действующих ингредиентов. В следующем варианте осуществления предусмотрено как немедленное, так и отсроченное высвобождение нескольких действующих ингредиентов (например, первая часть каждого действующего ингредиента предназначена для немедленного высвобождения, и вторая часть каждого действующего ингредиента предназначена для отсроченного высвобождения). В еще одном варианте осуществления предусмотрено немедленное высвобождение некоторых из действующих ингредиентов и отсроченное высвобождение некоторых других действующих ингредиентов (например, предусмотрено немедленное высвобождение действующих ингредиентов A, B, C и отсроченное высвобождение действующих ингредиентов C и D).

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает немедленно высвобождающийся компонент и компонент, который высвобождается в отсроченном режиме. Немедленно высвобождающийся компонент может включать один или несколько действующих ингредиентов, выбранных из группы, состоящей из анальгетиков, антимускариновых агентов, антидиуретиков и спазмолитиков. Компонент, который высвобождается в отсроченном режиме, может включать один или несколько действующих ингредиентов, выбранных из группы, состоящей из анальгетиков, антимускариновых агентов, антидиуретиков и спазмолитиков. В некоторых вариантах осуществления немедленно высвобождающийся компонент и компонент, высвобождающийся в отсроченном режиме, включают одни и те же действующие ингредиенты. В других вариантах осуществления немедленно высвобождающийся компонент и компонент, высвобождающийся в отсроченном режиме, включают разные действующие ингредиенты. В еще одном варианте осуществления немедленно высвобождающийся компонент и компонент, высвобождающийся в отсроченном режиме, включают один или несколько общих действующих ингредиентов.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает два действующих ингредиента (например, два обезболивающих агента или смесь одного обезболивающего агента и одного антимускаринового агента или антидиуретика, или спазмолитика), причем предусмотрено их немедленное высвобождение примерно в одно и то же время. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция включает два действующих ингредиента, причем предусмотрено их отсроченное высвобождение примерно в одно и то же время. В следующем варианте осуществления фармацевтическая композиция включает два действующих ингредиента, для каждого из которых предусмотрено отсроченное высвобождение, причем профили отсроченного высвобождения для обоих ингредиентов различаются. Например, первый компонент с отсроченным высвобождением высвобождает первый действующий ингредиент в первый момент времени, и второй компонент с отсроченным высвобождением высвобождает второй действующий ингредиент во второй момент времени. В еще одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает два действующих ингредиента, для одного из которых предусмотрено немедленное высвобождение, а для другого отсроченное высвобождение.

В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает два действующих ингредиента (например, два обезболивающих агента или смесь одного обезболивающего агента и одного антимускаринового агента или антидиуретика, или спазмолитика), для которых предусмотрено немедленное высвобождение и (2) два действующих ингредиента (например, два обезболивающих агента или смесь одного обезболивающего агента и одного антимускаринового агента или антидиуретика, или спазмолитика), для которых предусмотрено отсроченное высвобождение. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает три действующих ингредиента, для которых предусмотрено немедленное высвобождение и (2) три действующих ингредиента, для которых предусмотрено отсроченное высвобождение. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает четыре действующих ингредиента, для которых предусмотрено немедленное высвобождение и (2) четыре действующих ингредиента, для которых предусмотрено отсроченное высвобождение. В этих вариантах осуществления, действующий ингредиент (ингредиенты) компонента, для которого предусмотрено немедленное высвобождение могут быть такими же, как и действующий ингредиент (ингредиенты) компонента, для которого предусмотрено отсроченное высвобождение, или отличаться от них.

Термин «немедленное высвобождение» используется в настоящей заявке в отношении лекарственных составов, которые не содержат компонента, регулирующего скорость растворения. После введения состава с немедленным высвобождением практически не наблюдается задержки высвобождения действующих агентов. Покрытие, способствующее немедленному высвобождению, может включать подходящие материалы, растворяющиеся сразу же после введения в организм, чтобы высвободить заключенное в них действующее вещество. Типовые материалы покрытий, обеспечивающих немедленное высвобождение, включают желатин, сополимеры поливиниловый спирт-полиэтиленгликоль (PVA-PEG) (например, KOLLICOAT^®), а также целый ряд других материалов, известных специалисту в данной области техники.

Композиция с немедленным высвобождением может включать 100% общей дозы данного действующего агента, вводимого в единице лекарственной формы. В качестве альтернативы, компонент с немедленным высвобождением может быть включен качестве составной части в состав с комбинированным высвобождением, и может обеспечивать от примерно 1% до примерно 50% общей дозы данного действующего агента (агентов), которую предполагается ввести с помощью данного фармацевтического состава. Например, компонент с немедленным высвобождением, может обеспечивать, как минимум, от примерно 5% или 10% до примерно 30% или примерно 45%, или примерно 50% от общей дозы данного действующего агента (агентов), которые предполагается ввести с данным составом. Остальная часть действующего агента (агентов) может доставляться компонентом с отсроченным высвобождением. В альтернативных вариантах осуществления, компонент с немедленным высвобождением обеспечивает примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% от общей дозы действующего агента (агентов), которые предполагается доставить с данным составом. Компонент с отсроченным высвобождением обеспечивает примерно 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 или 50% общей дозы действующего агента (агентов), которую предполагается доставить с данным составом.

В некоторых вариантах осуществления состав с немедленным высвобождением или состав с отсроченным высвобождением включает активное ядро, в которое входят одна или несколько инертных частиц, имеющих, например, форму шариков, пеллет, пилюль, гранулированных частиц, микрокапсул, микросфер, микрогранул, нанокапсул или наносфер, поверхности которых покрыты лекарственным средством в форме, например, пленкообразующей композиции, содержащей лекарство, например, по методике покрытия в кипящем слое или по другим методикам, известным специалистам в данной области техники. Упомянутые инертные частицы могут иметь различные размеры, если эти размеры достаточны для того, чтобы сохранялась их плохая растворимость. В качестве альтернативы, активное ядро можно получить путем гранулирования и измельчения и/или путем экструзии и сферонизации полимерной композиции, содержащей лекарственное вещество.

Содержание лекарственного вещества в ядре будет зависеть от требуемой дозы, и обычно это содержание меняется в пределах от 5 до 90 масс.%. Как правило, полимерное покрытие на активном ядре будет иметь массу от примерно 1 до 50% от массы покрытых частиц в зависимости от времени задержки и необходимого типа профиля высвобождения и/или полимеров и растворителей, выбранных для получения покрытия. Специалист в данной области техники сможет выбрать подходящее количество лекарственного вещества для нанесения или включения в частицы ядра, для получения желаемой дозы. В одном из вариантов осуществления, неактивное ядро может представлять собой сферу из сахара или буферный кристалл, или инкапсулированный буферный кристалл, например, карбоната кальция, бикарбоната натрия, фумаровой кислоты, винной кислоты и т.п., который изменяет микроокружение лекарственного средства для облегчения его высвобождения.

В некоторых вариантах осуществления, состав с отсроченным высвобождением получают путем покрытия водорастворимой/диспергируемой частицы, содержащей лекарственное вещество, например, шарика, смесью не растворимого в воде полимера и кишечнорастворимого полимера, где нерастворимый в воде и кишечнорастворимый полимер могут присутствовать в массовом соотношении от 4:1 до 1:1, и общая масса покрытия составляет от 10 до 60 масс.% от общей массы шариков с покрытием. Слоистые частицы, содержащие лекарство, могут необязательно включать внутреннюю мембрану, регулирующую скорость растворения и изготовленную из этилцеллюлозы. Композиция внешнего слоя, а также индивидуальные массы внутреннего и внешнего слоев полимерной мембраны оптимизируют с целью достижения желаемого суточного ритма профилей высвобождения для данного действующего вещества, которые предсказывают, исходя из корреляций in vitro/in vivo.

В других вариантах осуществления составы включают смесь частиц, содержащих лекарственное вещество и обеспечивающих немедленное высвобождение, без полимерной мембраны, регулирующей скорость растворения, и гранул с отсроченным высвобождением, демонстрирующих, например, время задержки 2-4 часа после перорального введения, что обеспечивает профиль высвобождения с двумя импульсами. В другой группе вариантов осуществления, состав включает смесь гранул с отсроченным высвобождением двух типов: первый из которых демонстрирует время задержки 1-3 часа, а второй 4-6 часов.

В некоторых вариантах осуществления активное ядро покрыто одним или несколькими слоями полимеров, регулирующих скорость растворения, для получения желаемых профилей высвобождения с временем задержки или без него. Внутренний слой мембраны может в значительной степени регулировать скорость высвобождения лекарственного вещества после впитывания воды или жидкой среды организма в ядро, тогда как внешний слой мембраны способен обеспечить желаемое время задержки (период отсутствия высвобождения или незначительного высвобождения лекарственного вещества после впитывания воды или жидкой среды организма в ядро). Внутренний слой мембраны может включать нерастворимый в воде полимер или смесь нерастворимого и растворимого в воде полимеров.

Полимеры, подходящие для внешней мембраны, которые успешно регулируют время задержки в пределах до 6 часов, могут включать кишечнорастворимый полимер, который описан выше, и нерастворимый в воде полимер в количестве от 10 до 50 масс.%. Соотношение между нерастворимым в воде полимером и кишечнорастворимым полимером может меняться в пределах от 4:1 до 1:2, и предпочтительно эти полимеры присутствуют в соотношении примерно 1:1. Как правило, в качестве нерастворимого в воде полимера применяют этилцеллюлозу.

Типовые примеры нерастворимых в воде полимеров включают этилцеллюлозу, поливинилацетат (Kollicoat SR#0D производства BASF), нейтральные сополимеры на основе этилакрилата и метилметакрилата, сополимеры эфиров акриловой и метакриловой кислоты с четвертичными аммониевыми группами, такие как EUDRAGIT^® NE, RS и RS30D, RL или RL30D и т.п. Типовые примеры водорастворимых полимеров включают HPMC низкой молекулярной массы, HPC, метилцеллюлозу, полиэтиленгликоль (PEG с молекулярной массой >3000) в количестве от 1 масс. % до 10 масс. % в зависимости от растворимости действующего вещества в воде и примененного растворителя или состава покрытия на основе латексной суспензии. Отношение нерастворимого в воде полимера к водорастворимому полимеру, как правило, может находиться в пределах от 95:5 до 60:40, предпочтительно, от 80:20 до 65:35.

Предпочтительно, составам придают такие профили высвобождения, которые ограничивают нарушение спокойного сна, где состав высвобождает лекарственное вещество в то время, когда пациент обычно вынужден был просыпаться из-за позыва к мочеиспусканию. Например, если рассмотреть пациента, который отходил ко сну в 11 часов вечера и обычно просыпался в 12:30 ночи, 3:00 утра и 6:00 утра для посещения туалета. Состав с отсроченным высвобождением мог бы доставлять лекарственное средство в 12:15 ночи, тем самым откладывая позыв к мочеиспусканию хотя бы на 2-3 часа.

Фармацевтическую композицию можно вводить ежедневно или по мере необходимости. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическую композицию вводят субъекту перед отходом ко сну. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическую композицию вводят непосредственно перед временем отхода ко сну. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическую композицию вводят примерно за два часа до времени отхода ко сну, предпочтительно, примерно за один час до отхода ко сну. В другом варианте осуществления, фармацевтическую композицию вводят примерно за два часа до времени отхода ко сну. В следующем варианте осуществления, фармацевтическую композицию вводят как минимум за два часа до времени отхода ко сну. В другом варианте осуществления, фармацевтическую композицию вводят примерно за один час до времени отхода ко сну. В следующем варианте осуществления, фармацевтическую композицию вводят как минимум за один час до времени отхода ко сну. В еще одном варианте осуществления, фармацевтическую композицию вводят менее чем за один час до времени отхода ко сну. В еще одном варианте осуществления, фармацевтическую композицию вводят непосредственно перед отходом ко сну. Предпочтительно, фармацевтическую композицию вводят перорально.

Подходящая доза («терапевтически эффективное количество») действующего агента (агентов) в компоненте с немедленным высвобождением или компоненте с отсроченным высвобождением будет зависеть, например, от тяжести и течения заболевания, от пути введения, биодоступности конкретного агента (агентов), возраста и массы пациента, истории его болезни и реакции на данный действующий агент (агенты), усмотрения врача и т.д.

Как правило, терапевтически эффективное количество действующего агента (агентов) в компоненте с немедленным высвобождением или в компоненте с отсроченным высвобождением находится в диапазоне от примерно 100 мкг/кг массы тела/в день до примерно 100 мг/кг массы тела/в день в виде одного или нескольких введений. В некоторых вариантах осуществления, диапазон количества каждого из действующих агентов, вводимого в течение дня, составляет от примерно 100 мкг/кг массы тела/в день до примерно 50 мг/кг массы тела/в день, от 100 мкг/кг массы тела/в день до примерно 10 мг/кг массы тела/в день, от 100 мкг/кг массы тела/в день до примерно 1 мг/кг массы тела/в день, от 100 мкг/кг массы тела/в день до примерно 10 мг/кг массы тела/в день, от 500 мкг/кг массы тела/в день до примерно 100 мг/кг массы тела/в день, от 500 мкг/кг массы тела/в день до примерно 50 мг/кг массы тела/в день, от 500 мкг/кг массы тела/в день до примерно 5 мг/кг массы тела/в день, от 1 мг/кг массы тела/в день до примерно 100 мг/кг массы тела/в день, от 1 мг/кг массы тела/в день до примерно 50 мг/кг массы тела/в день, от 1 мг/кг массы тела/в день до примерно 10 мг/кг массы тела/в день, от 5 мг/кг массы тела/в день до примерно 100 мг/кг массы тела/в день, от 5 мг/кг массы тела/в день до примерно 50 мг/кг массы тела/в день, от 10 мг/кг массы тела/в день до примерно 100 мг/кг массы тела/в день, и от 10 мг/кг массы тела/в день до примерно 50 мг/кг массы тела/в день.

Действующий агент (агенты), описанные в настоящей заявке, могут быть включены в компонент с немедленным высвобождением или в компонент с отсроченным высвобождением или комбинацию этих компонентов для ежедневного перорального введения в виде одной дозы или нескольких доз в диапазоне от 1 мг до 2000 мг, от 5 мг до 2000 мг, от 10 мг до 2000 мг, от 50 мг до 2000 мг, от 100 мг до 2000 мг, от 200 мг до 2000 мг, от 500 мг до 2000 мг, от 5 мг до 1800 мг, от 10 мг до 1600 мг, от 50 мг до 1600 мг, от 100 мг до 1500 мг, от 150 мг до 1200 мг, от 200 мг до 1000 мг, от 300 мг до 800 мг, от 325 мг до 500 мг, от 1 мг до 1000 мг, от 1 мг до 500 мг, от 1 мг до 200 мг, от 5 мг до 1000 мг, от 5 мг до 500 мг, от 5 мг до 200 мг, от 10 мг до 1000 мг, от 10 мг до 500 мг, от 10 мг до 200 мг, от 50 мг до 1000 мг, от 50 мг до 500 мг, от 50 мг до 200 мг, от 100 мг до 250 мг, от 100 мг до 500 мг, от 250 мг до 1000 мг, от 250 мг до 500 мг, от 500 мг до 1000 мг, от 500 мг до 2000 мг. Как ожидается, дозировка будет зависеть от состояния, габаритов, возраста и состояния пациента.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция включает один обезболивающий агент. В одном из вариантов осуществления этот единственный обезболивающий агент представляет собой аспирин. В другом варианте осуществления, единственный обезболивающий агент представляет собой ибупрофен. В следующем варианте осуществления, единственный обезболивающий агент представляет собой напроксен натрия. В другом варианте осуществления единственный обезболивающий агент представляет собой индометацин. В следующем варианте осуществления, единственный аналгетический агент представляет собой набуметон. В еще одном варианте осуществления, единственный обезболивающий агент представляет собой ацетаминофен.

В некоторых вариантах осуществления, единственный обезболивающий агент вводят в дневной дозировке от 1 мг до 2000 мг, от 5 мг до 2000 мг, от 20 мг до 2000 мг, от 5 мг до 1000 мг, от 20 мг до 1000 мг, от 50 мг до 500 мг, от 100 мг до 500 мг, от 250 мг до 500 мг, от 250 мг до 1000 мг, от 500 мг до 1000 мг. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает ацетилсалициловую кислоту, ибупрофен, напроксен натрия, индометацин, набуметон или ацетаминофен в качестве единственного обезболивающего агента, и этот обезболивающий агент вводят перорально в дневной дозировке в диапазоне от 5 мг до 2000 мг, от 20 мг до 2000 мг, от 5 мг до 1000 мг, от 20 мг до 1000 мг, от 50 мг до 500 мг, от 100 мг до 500 мг, от 250 мг до 500 мг, от 250 мг до 1000 мг или от 500 мг до 1000 мг. В некоторых вариантах осуществления второй обезболивающий агент вводят в дневной дозировке от 1 мг до 2000 мг, от 5 мг до 2000 мг, от 20 мг до 2000 мг, от 5 мг до 1000 мг, от 20 мг до 1000 мг, от 50 мг до 500 мг, от 100 мг до 500 мг, от 250 мг до 500 мг, от 250 мг до 1000 мг или от 500 мг до 1000 мг.

В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает пару обезболивающих агентов. Примеры таких парных обезболивающих агентов включают, не ограничиваясь этим, ацетилсалициловую кислоту и ибупрофен, ацетилсалициловую кислоту и напроксен натрия, ацетилсалициловую кислоту и набуметон, ацетилсалициловую кислоту и ацетаминофен, ацетилсалициловую кислоту и индометацин, ибупрофен и напроксен натрия, ибупрофен и набуметон, ибупрофен и ацетаминофен, ибупрофен и индометацин, напроксен натрия и набуметон, напроксен натрия и ацетаминофен, напроксен натрия и индометацин, набуметон и ацетаминофен, набуметон и индометацин, а также ацетаминофен и индометацин. Эти парные обезболивающие агенты смешаны в массовом соотношении в диапазоне от 0,1:1 до 10:1, от 0,2:1 до 5:1, или от 0,3:1 до 3:1, причем суммарная дозировка находится в диапазоне от 5 мг до 2000 мг, от 20 мг до 2000 мг, от 100 мг до 2000 мг, от 200 мг до 2000 мг, от 500 мг до 2000 мг, от 5 мг до 1500 мг, от 20 мг до 1500 мг, от 100 мг до 1500 мг, от 200 мг до 1500 мг, от 500 мг до 1500 мг, от 5 мг до 1000 мг, от 20 мг до 1000 мг, от 100 мг до 1000 мг, от 250 мг до 500 мг, от 250 мг до 1000 мг, от 250 мг до 1500 мг, от 500 мг до 1000 мг, от 500 мг до 1500 мг, от 1000 мг до 1500 мг и от 1000 мг до 2000 мг. В одном из вариантов осуществления парные анальгетические агенты смешаны в массовом соотношении 1:1.

В некоторых других вариантах осуществления, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно включает один или несколько антимускариновых агентов. Примеры антимускариновых агентов включают, не ограничиваясь перечисленными, оксибутинин, солифенацин, дарифенацин, фесотеродин, толтеродин, троспиум и аторопин. Дневная доза антимускаринового агента находится в диапазоне от 0,01 мг до 100 мг, от 0,1 мг до 100 мг, от 1 мг до 100 мг, от 10 мг до 100 мг, от 0,01 мг до 25 мг, от 0,1 мг до 25 мг, от 1 мг до 25 мг, от 10 мг до 25 мг, от 0,01 мг до 10 мг, от 0,1 мг до 10 мг, от 1 мг до 10 мг, от 10 мг до 100 мг и от 10 мг до 25 мг.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу уменьшения частоты мочеиспускания путем введения пациенту, которому это необходимо, фармацевтической композиции, представляющей собой состав с немедленным высвобождением. В некоторых вариантах осуществления эта фармацевтическая композиция включает один или несколько обезболивающих агентов и один или несколько антимускариновых агентов. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает один или несколько обезболивающих агентов и один или несколько антидиуретиков. В следующей группе вариантов осуществления фармацевтическая композиция включает один или несколько обезболивающих агентов, один или несколько антимускариновых агентов и один или несколько антидиуретиков.

В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция по настоящей заявке дополнительно включает один или несколько спазмолитиков. Примеры спазмолитиков включают, не ограничиваясь этим, карисопродол, бензодиазепины, баклофен, циклобензаприн, метаксалон, метокарбамол, клонидин, аналоги клонидина и дантролен. В некоторых вариантах осуществления спазмолитики применяются в дневной дозировке от 1 мг до 1000 мг, от 1 мг до 100 мг, от 10 мг до 1000 мг, от 10 мг до 100 мг, от 20 мг до 1000 мг, от 20 мг до 800 мг, от 20 мг до 500 мг, от 20 мг до 200 мг, от 50 мг до 1000 мг, от 50 мг до 800 мг, от 50 мг до 200 мг, от 100 мг до 800 мг, от 100 мг до 500 мг, от 200 мг до 800 мг и от 200 мг до 500 мг. Спазмолитики можно включать, индивидуально или вместе с другими действующими ингредиентами, в фармацевтическую композицию с немедленным высвобождением, отсроченным-продолжительным высвобождением или в композиции комбинированного типа.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает два или несколько обезболивающих агентов. В других вариантах осуществления, фармацевтическая композиция включает один или несколько обезболивающих агентов и один или несколько антимускариновых агентов и/или антидиуретиков. Фармацевтическая композиция может принимать форму таблетки, капсулы, драже, порошка, гранулята, жидкости, геля или эмульсии. Указанные жидкость, гель или эмульсия могут приниматься субъектом «как есть» или же они могут быть заключены в капсулу.

В некоторых вариантах осуществления, обезболивающий агент выбран из группы, состоящей из салицилатов, аспирина, салициловой кислоты, метилсалицилата, дифлунизала, салсалата, олсалазина, сульфасалазина, производных пара-аминофенола, ацетанилида, ацетаминофена, фенацетина, фенаматов, мефенамовой кислоты, меклофенамата, меклофенамата натрия, производных гетероарилуксусной кислоты, толметина, кеторолака, диклофенака, производных пропионовой кислоты, ибупрофена, напроксена натрия, напроксена, фенопрофена, кетопрофена, флурбипрофена, оксапрозина; еноловых кислот, производных оксикама, пироксикама, мелоксикама, теноксикама, ампироксикама, дроксикама, пивоксикама, производных пиразолона, фенилбутазона, оксифенбутазона, антипирина, аминопирина, дипирона, коксибов, целекоксиба, рофекоксиба, набуметона, апазона, нимесулида, индометацина, сулиндака, этодолака и изобутилфенил пропионовой кислоты. Антимускариновый агент выбран из группы, состоящей из оксибутинина, солфенацина, дарифенацина и атропина.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает один обезболивающий агент и один антимускариновый агент. В одном из вариантов осуществления единственный обезболивающий агент представляет собой аспирин. В другом варианте осуществления единственный обезболивающий агент представляет собой ибупрофен. В следующем варианте осуществления единственный обезболивающий агент представляет собой напроксен натрия. В другом варианте осуществления единственный обезболивающий агент представляет собой индометацин. В следующем варианте осуществления единственный обезболивающий агент представляет собой набуметон. В еще одном варианте осуществления единственный обезболивающий агент представляет собой ацетаминофен. Обезболивающий агент и антимускариновый агент могут вводиться в дозах, которые находятся в указанных выше диапазонах.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения ноктурии (ночных позывов к мочеиспусканию) путем введения субъекту, которому это необходимо (1) одного или нескольких обезболивающих агентов и (2) одного или нескольких антидиуретиков. В некоторых вариантах осуществления антидиуретик (антидиуретики) способствуют: (1) увеличению секреции вазопрессина; (2) повышению степени активации рецептора вазопрессина; (3) уменьшению секреции предсердного натрийуретического пептида (ANP) или натрийуретического пептида C-типа (CNP); или (4) уменьшению активации рецепторов ANP и/или CNP.

Типовые примеры антидиуретиков включают, не ограничиваясь этим, антидиуретический гормон (ADH), ангиотензин II, альдостерон, вазопрессин, аналоги вазопрессина (например, десмопрессин, аргипрессин, липрессин, фелипрессин, орнипрессин, терлипрессин); агонисты рецептора вазопрессина, антагонисты рецепторов предсердного натрийуретического пептида (ANP) и натрийуретического пептида C-типа (CNP) (т.е. NPR1, NPR2, NPR3) (например, HS-142-1, изатин, [Asu7,23']b-ANP-(7-28)], анатин, циклический пептид из Streptomyces coerulescens и моноклональное антитело 3G12); антагонисты рецептора соматостатина 2 типа (например, соматостатин) и их фармацевтически приемлемые производные, аналоги, соли, гидраты и сольваты.

В некоторых вариантах осуществления упомянутые один или несколько обезболивающих агентов и один или несколько антидиуретиков включены в состав, обеспечивающий отсроченное высвобождение.

Следующий аспект настоящей заявки относится к способу лечения ноктурии путем введения человеку, которому это необходимо, первой фармацевтической композиции, включающей диуретик, и затем второй фармацевтической композиции, включающей один или несколько обезболивающих агентов. Первая фармацевтическая композиция имеет такой состав и дозировку действующего ингредиента, чтобы оказывать диуретическое действие в течение 6 часов после введения, и ее вводят как минимум за 8 часов до времени отхода ко сну. Вторую фармацевтическую композицию вводят за 2 часа до времени отхода ко сну.

Примеры диуретиков включают, не ограничиваясь этим, подкисляющие соли, например, CaCl₂ и NH₄Cl; антагонисты рецептора 2 аргинин вазопрессина, например, амфотерицин B и цитрат лития; акваретики, например, Goldenrod и Junipe; антагонисты Na-H обменника, например, дофамин; ингибиторы карбоангидразы, например, ацетазоламид и дорзоламид; петлевые диуретики, например, буметанид, этакриновую кислоту, фуросемид и торсемид; осмотические диуретики, например, глюкозу и маннит; калий-сберегающие диуретики, например, амилорид, спиронолактон, триамтерен, канреноат калия; тиазиды, например, бендрофлуметиазид и гидрохлортиазид; а также ксантаны, например, кофеин, теофиллин и теобромин.

В некоторых вариантах осуществления упомянутая вторая фармацевтическая композиция дополнительно включает один или несколько антимускариновых агентов. Примеры антимускариновых агентов включают, не ограничиваясь этим, оксибутинин, солифенацин, дарифенацин, фесотеродин, толтеродин, троспиум и атропин. Вторая фармацевтическая композиция может представлять собой состав с немедленным высвобождением или состав с отсроченным высвобождением. В одном из вариантов осуществления первая фармацевтическая композиция может являться составом с немедленным высвобождением, а вторая фармацевтическая композиция составом с отсроченным высвобождением.

В некоторых других вариантах осуществления вторая фармацевтическая композиция дополнительно включает один или несколько антидиуретиков.

Другой аспект настоящей заявки относится к фармацевтической композиции, включающей несколько действующих ингредиентов и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления в число нескольких действующих ингредиентов входят два или несколько анальгетиков. В других вариантах осуществления в число нескольких действующих ингредиентов входит один или несколько аналгетиков и один или несколько антимускариновых агентов. В других вариантах осуществления в число нескольких действующих ингредиентов входит один или несколько анальгетиков и один или несколько антидиуретиков. В ряде других вариантов осуществления в число нескольких действующих ингредиентов входит один или несколько анальгетиков, один или несколько антидиуретиков и один или несколько антимускариновых агентов. В других вариантах осуществления предусмотрено отсроченное высвобождение как минимум одного из указанных нескольких действующих ингредиентов.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает два анальгетика, выбранных из группы, состоящей из ацетилсалициловой кислоты, ибупрофена, напроксена натрия, набуметона, ацетаминофена и индометацина. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает один или несколько аналгетиков выбранных из группы, состоящей из ацетилсалициловой кислоты, ибупрофена, напроксена натрия, набуметона, ацетаминофена и индометацина; а также антимускариновый агент, выбранный из группы, состоящей из оксибутинина, солифенацина, дарифенацина и атропина.

В настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает все без исключения растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и средства, замедляющие абсорбцию, подсластители и т.п. Фармацевтически приемлемые носители можно получать из целого ряда материалов, включая, но не ограничиваясь этим, вкусоароматические агенты, подсластители и различные материалы, такие как буферы и абсорбенты, которые могут оказаться необходимыми для получения конкретной терапевтической композиции. Применение таких сред и агентов в комбинации с фармацевтически-активными веществами хорошо известно в технике. За исключением тех случаев, когда какая-либо традиционная среда или агент несовместимы с действующим ингредиентом, их применение в терапевтических композициях предусмотрено настоящим изобретением.

Еще один аспект настоящей заявки относится к способу уменьшения частоты мочеиспускания путем введения субъекту, которому это необходимо, двух или нескольких обезболивающих агентов попеременно, для предотвращения развития невосприимчивости к лекарственным препаратам. В одном из вариантов осуществления этот способ включает введение первого обезболивающего агента в течение первого периода времени и затем введение второго обезболивающего агента в течение второго периода времени. В другом варианте осуществления этот способ дополнительно включает введение третьего обезболивающего агента в течение третьего периода времени. Упомянутые первый, второй и третий обезболивающие агенты отличаются друг от друга и их можно выбрать из группы, состоящей из салицилатов, аспирина, салициловой кислоты, метилсалицилата, дифлунизала, салсалата, олсалазина, сульфасалазина, производных пара-аминофенола, ацетанилида, ацетаминофена, фенацетина, фенаматов, мефенамовой кислоты, меклофенамата, меклофенамата натрия, производных гетероарилуксусной кислоты, толметина, кеторолака, диклофенака, производных пропионовой кислоты, ибупрофена, напроксена натрия, напроксена, фенопрофена, кетопрофена, флурбипрофена, оксапрозина; еноловых кислот, производных оксикама, пироксикама, мелоксикама, теноксикама, ампироксикама, дроксикама, пивоксикама, производных пиразолона, фенилбутазона, оксифенбутазона, антипирина, аминопирина, дипирона, коксибов, целекоксиба, рофекоксиба, набуметона, апазона, нимесулида, индометацина, сулиндака, этодолака и изобутилфенил пропионовой кислоты.

В одном из вариантов осуществления первый обезболивающий агент представляет собой ацетаминофен, второй обезболивающий агент представляет собой ибупрофен, и третий обезболивающий агент представляет собой напроксен натрия. Продолжительность каждого периода может меняться в зависимости от реакции субъекта на каждый из обезболивающих агентов. В некоторых вариантах осуществления каждый период имеет продолжительность от 3 дней до трех недель. В другом варианте осуществления один или несколько агентов из числа первого, второго или третьего анальгетика включены в состав с отсроченным высвобождением.

Ниже по тексту настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует считать ограничивающими. Содержание всех упомянутых в тексте литературных источников, патентов и опубликованных патентных заявок включены в настоящую заявку посредством ссылок.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: подавление позывов к мочеиспусканию

В эксперименте принимали участие двадцать добровольцев, как мужского, так и женского пола, каждый из которых сталкивался с преждевременным позывом или желанием мочеиспускания, что мешало им спать в течение периода времени, достаточного чтобы чувствовать себя отдохнувшими в должной степени. Каждый из субъектов принимал 400-800 мг ибупрофена в виде одной дозы перед отходом ко сну. По крайней мере 14 субъектов сообщили, что их сон улучшился, поскольку им не приходилось столь же часто просыпаться из-за позывов к мочеиспусканию.

Несколько субъектов сообщили, что после нескольких недель еженощного применения ибупрофена, перестало проявляться преимущество более редких позывов к мочеиспусканию. Однако все эти субъекты затем сообщили о возвращении благоприятного эффекта после нескольких дней воздержания от приема препарата.

Пример 2: влияние обезболивающих агентов, ботулинического нейротоксина и антимускариновых агентов на реакции макрофагов на воспалительные и невоспалительные стимулы

План эксперимента

Данное исследование предназначено для определения дозы и in vitro эффективности обезболивающих и антимускариновых агентов при регулировании реакции макрофагов на воспалительные и невоспалительные стимулы, опосредованной COX2 и простагландинами (PGE, PGH и т.д.). В исследовании установлены исходные (дозы и кинетические) реакции клеток мочевого пузыря на воспалительные и невоспалительные эффекторы. Вкратце, культивированные клетки подвергали действию обезболивающих агентов и/или антимускариновых агентов в отсутствии или присутствии различных эффекторов.

Эффекторы включали: липополисахарид (LPS), представляющий собой воспалительный агент и индуктор COX2, в качестве воспалительного стимула; карбахол или ацетилхолин, представляющий собой стимулятор сокращения гладкой мускулатуры, в качестве не воспалительного стимула; ботулинический нейротоксин A, представляющий собой известный ингибитор высвобождения ацетилхолина, в качестве положительного контрольного препарата; и арахидоновую кислоту (AA), гамма-линоленовую кислоту (DGLA) или эйкозапентаеновую кислоту (EPA) в качестве предшественников простагландинов, которые образуются после поэтапного окисления AA, DGLA или EPA в клетках под действием циклооксигеназ (COX1 и COX2) и терминальных простагландинсинтаз.

Обезболивающие агенты включали: салицилаты, такие как аспирин, производные изобутилфенилпропионовой кислоты (ибупрофен), например Advil, Motrin, Nuprin и Medipren, напроксен натрия, например, Aleve, Anaprox, Antalgin, Feminax Ultra, Flanax, Inza, Midol Extended Relief, Nalgesin, Naposin, Naprelan, Naprogesic, Naprosyn, суспензию Naprosyn, EC-Naprosyn, Narocin, Proxen, Synflex и Xenobid, производные уксусной кислоты, например, индометацин (Indocin), производные 1-нафталинуксусной кислоты, например, набуметон или релафен, производные N-ацетил-пара-аминофенола (APAP), например, ацетаминофен или парацетамол (Tylenol, тайленол), а также Celecoxib.

Антимускариновые агенты включают: оксибутинин, солифенацин, дарифенацин и атропин.

Макрофаги подвергали кратковременному (1-2 ч) или долговременному (24-48 ч) стимулированию с помощью:

(1) каждого из обезболивающих агентов индивидуально в различных дозах;

(2) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(3) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(4) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(5) ботулинического нейротоксина A индивидуально в различных дозах;

(6) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии LPS;

(7) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(8) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(9) каждого из антимускариновых агентов индивидуально в различных дозах;

(10) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(11) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(12) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA.

Затем исследовали клетки с целью определения высвобождения PGH₂, PGE, PGE₂, простацидина, тромбоксана, IL-1β, IL-6, TNF-α, активности COX2, выработки cAMP и cGMP, выработки IL-1β, IL-6, мРНК TNF-α и COX2, а также поверхностной экспрессии CD80, CD86 и молекул MHC класса II.

Материалы и методики

Макрофаги

В этом исследовании использовались мышиные макрофаги RAW264.7 или J774 (которые получали у ATCC). Клетки содержали в культуральной среде, включавшей RPMI 1640 с добавкой 10%-й эмбриональной сыворотки телят (FBS), 15 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 100 мкл/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивировали при 37°C в 5%-й атмосфере CO₂ и разделяли (перенося в другой сосуд) один раз в неделю.

Обработка макрофагов анальгетиками in vitro

Макрофаги RAW264.7 высевали в 96-луночные планшеты при плотности клеток 1,5×10⁵ клеток на лунку в 100 мкл культуральной среды. Клетки обрабатывали (1) анальгетиками в различных концентрациях (ацетаминофеном, аспирином, ибупрофеном или напроксеном), (2) липополисахаридом (LPS), который является эффектором воспалительного стимулирования для макрофагов, в различных концентрациях, (3) карбахолом или ацетилхолином, которые являются эффекторами не воспалительного стимулирования для макрофагов, в различных концентрациях, (4) анальгетиком и LPS и (5) анальгетиком и карбахолом или ацетилхолином. Вкратце, анальгетики растворяли в культуральной среде, не содержащей FBS, (т.е. RPMI 1640 с добавкой 15 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) и разбавляли до желаемых концентраций путем последовательного разбавления той же средой. Для клеток, которые предполагалось обработать анальгетиком в отсутствии LPS, в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора анальгетика и 50 мкл культуральной среды без FBS. Для клеток, которые предполагалось обработать анальгетиком в присутствии LPS, в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора анальгетика и 50 мкл LPS (из Salmonella typhimurium) в культуральной среде без FBS. Для каждых условий обработки проводили два параллельных эксперимента.

Через 24 или 48 часов культивирования, отбирали 150 мкл культурального супернатанта, центрифугировали в течение 2 мин при 8000 об/мин при 4°C для удаления клеток и продуктов их разрушения, и хранили при -70°C для исследования цитокинового ответа с помощью ELISA. Клетки собирали и промывали центрифугированием (5 мин при 1500 об/мин при 4°C) в 500 мкл фосфатного буфера (PBS). Половину клеток подвергали мгновенному замораживанию в жидком азоте и хранили при -70°C. Остальные клетки окрашивали флуоресцентными моноклональными антителами и анализировали проточной цитометрией.

Анализ экспрессии костимулирующих молекул проточной цитометрией

Для исследования по методике проточной цитометрии макрофаги разбавляли 100 мкл буфера FACS (фосфатный солевой буфер (PBS) с 2% альбумином бычьей сыворотки (BSA) и 0,01% NaN₃) и окрашивали в течение 30 мин при 4°C добавлением анти-CD40, конъюгированных с FITC, анти-CD80, конъюгированных с PE, анти-CD86 антител, конъюгированных с PE, анти MHC класса II (I-A^d)PE (BD Bioscience). Затем клетки промывали центрифугированием (5 мин при 1500 об/мин при 4°C) в 300 мкл буфера FACS. После второго промывания, клетки повторно суспендировали в 200 мкл буфера FACS и определяли процентную долю клеток, экспрессирующих данный маркер (положительных по одному маркеру) или комбинацию маркеров (положительных по двум маркерам), с применением проточного цитометра Accuri C6 (BD Biosciences).

Исследование цитокиновых ответов с помощью ELISA

Культуральные супернатанты исследовали с помощью цитокин-специфичного иммуноферментного анализа (ELISA) для определения ответов IL-1β, IL-6 и TNF-α в культурах макрофагов, обработанных только анальгетиками, только LPS или комбинацией LPS и анальгетика. Анализы осуществляли на иммунологических планшетах Nunc MaxiSorp Immunoplates (Nunc), покрытых в течение ночи 100 мкл mAbs против мышиных IL-6, TNF-α (BD Biosciences) или mAb против IL-1β (RD Systems) в 0,1М натрий-бикарбонатном буфере (pH 9,5). После двух промываний PBS (200 мкл на лунку), в каждую лунку добавляли 200 мкл PBS 3% BSA (блокирование) и инкубировали планшеты в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшеты вновь два раза промывали добавлением 200 мкл на лунку, добавляли 100 мкл цитокиновых стандартов и последовательных разбавлений культуральных супернатантов в двух параллельных экспериментах, и инкубировали планшеты в течение ночи при 4°C. В заключении планшеты дважды промывали и инкубировали со 100 мкл вторичных биотинилированных mAbs против мышиного IL-6, TNF-α (BD Biosciences) или mAb против IL-1β (R&D Systems) и затем меченого пероксидазой козьего mAb против биотина (Vector Laboratories). Проводили колориметрическую реакцию путем добавления субстрата, а именно 2,2′-азино-бис(3)-этилбензилтиазолон-6-сульфоновой кислоты (ABTS) и H₂O₂ (Sigma), и измеряли поглощение на 415 нм с помощью универсального прибора для считывания планшетов Victor^® V multilabel plate reader (PerkinElmer).

Определение активности COX2 и выработки cAMP и cGMP

Активность COX2 в культивированных макрофагах определяли с помощью анализа активности COX2. Выработку cAMP и cGMP определяли с помощью анализа cAMP и анализа cGMP. Методики проведения этих анализов являются стандартными в известном уровне техники.

Результаты

В таблице 1 суммированы эксперименты, проведенные с макрофагами линии Raw 264, и их основные результаты, относящиеся к действию анальгетиков на экспрессию на поверхности клеток костимулирующих молекул CD40 и CD80. Экспрессия этих молекул стимулируется под действием COX2 и воспалительных сигналов и, следовательно, ее измерение может служить для определения функциональных последствий ингибирования COX2.

Как показано в таблице 2, ацетаминофен, аспирин, ибупрофен и напроксен ингибируют исходный уровень экспрессии макрофагами костимулирующих молекул CD40 и CD80 при всех исследованных дозах (т.е. 5×10⁵ нм, 5×10⁴ нм, 5×10³ нм, 5×10² нм, 50 нм и 5 нм), за исключением самой высокой дозы (т.е. 510⁶ нм), которая по-видимому усиливает, а не подавляет, экспрессию этих костимулирующих молекул. Как показано на Фиг. 1A и 1B, упомянутое ингибирующее действие на экспрессию CD40 и CD80 наблюдалось при такой низкой дозировке анальгетика, как 0,05 нМ (т.е. 0,00005 мкМ). Эти данные подтверждают мнение о том, что регулируемое высвобождение небольших доз анальгетика может быть предпочтительнее, чем быстрая доставка больших доз. Кроме того, данный эксперимент показал, что ацетаминофен, аспирин, ибупрофен и напроксен оказывают аналогичное ингибирующее действие на экспрессию CD40 и CD80, индуцированную LPS.

Таблица 1 Общие сведения о проводимых исследованиях
	Контроль	LPS Salmonella typhimurium	Ацетаминофен	Аспирин	Ибупрофен	Напроксен
ТЕСТЫ
1	X
2	X	Реакция на дозировки (0, 5, 50, 1000 нг/мл)
3	X		Реакция на дозировки (0, 5, 50, 500, 5×103, 5×104, 5×105, 5×106) нМ
4	X	X (5 нг/мл) X (50 нг/мл) X (1000 нг/мл)	Реакция на дозировки (0, 5, 50, 500, 5×103, 5×104, 5×105, 5×106) нМ
АНАЛИЗЫ
a	Определение статуса активации/стимулирования: анализ по методике проточной цитометрии CD40, CD80, CD86 и MHC класс II
b	Определение медиаторов воспалительной реакции: IL-1β, IL-6 и TNα- с помощью методики ELISA

Таблица 2 Сводка основных результатов
Эффекторы	% положит.	Отр. контроль	LPS 5 нг/мл	Дозировка анальгетика (нМ)
				5106	5105	5104	5103	500	50	5
	CD40+CD80+	20,6	77,8
Ацетаминофен	CD40+CD80+			63	18	12	9,8	8,3	9,5	7,5
Аспирин	CD40+CD80+			44	11	10,3	8,3	8	10,5	7,5
Ибупрофен	CD40+CD80+			ND*	6,4	7,7	7,9	6,0	4,9	5,8
Напроксен	CD40+CD80+			37	9,6	7,7	6,9	7,2	6,8	5,2
				Анальгетик плюс LPS
Ацетаминофен	CD40+CD80+			95,1	82,7	72,4	68,8	66,8	66,2	62,1
Аспирин	CD40+CD80+			84,5	80	78,7	74,7	75,8	70,1	65,7

Ибупрофен	CD40+CD80+			ND	67	77,9	72,9	71,1	63,7	60,3
Напроксен	CD40+CD80+			66,0	74,1	77,1	71,0	68,8	72	73
*ND: измерение не проводилось (токсичность)

В таблице 3 суммированы результаты нескольких исследований, в которых проводилось измерение уровней анальгетика в сыворотках после перорального введения терапевтических доз взрослым людям. Как видно из таблицы 3, максимальные уровни анальгетиков в сыворотке после перорального приема терапевтических доз находятся в диапазоне от 10⁴ до 10⁵ нМ. Таким образом, дозировки анальгетиков, протестированные in vitro в таблице 2, охватывают диапазон концентраций, которые могут достигаться in vivo в организме человека.

Таблица 3 Уровни анальгетиков в сыворотке крови человека после перорального введения терапевтических доз
Обезболивающий препарат	Молекулярная масса	Максимальные уровни в сыворотке после перорального приема терапевтических доз	Ссылка
		мг/л	нМ
Ацетаминофен (Tylenol)	151,16	11-18	7,2×104-1,19×105
Аспирин (Ацетилсалициловая кислота)	181,66	30-100	1,65×105-5,5×105
Ибупрофен (Advil, Motrin)	206,29	24-32	1,16×105-1,55×105
Напроксен (Aleve)	230,26	до 60	До 2,6×105

Пример 3: влияние обезболивающих агентов, ботулинического нейротоксина и антимускариновых агентов на реакцию клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря на воспалительные и не воспалительные стимулы

План эксперимента

Данное исследование проводили для выяснения того, как оптимальные дозы анальгетиков, определенные в примере 2, влияют на клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря в клеточной и тканевой культуре, и определения, способны ли различные классы анальгетиков проявлять синергию для более эффективного ингибирования COX2 и PGE2 ответов.

Эффекторы, обезболивающие агенты и антимускариновые агенты описаны в примере 2.

Исходные культуры клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря мышей подвергали кратковременному (1-2 ч) или долговременному (24-48 ч) стимулированию с помощью:

(1) каждого из обезболивающих агентов индивидуально в различных дозах;

(2) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(3) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(4) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(5) ботулинического нейротоксина A индивидуально в различных дозах;

(6) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии LPS;

(7) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(8) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(9) каждого из антимускариновых агентов индивидуально в различных дозах;

(10) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(11) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(12) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA.

Затем исследовали клетки с целью определения высвобождения PGH₂, PGE, PGE₂, простацидина, тромбоксана, IL-1β, IL-6, TNF-α, активности COX2, выработки cAMP и cGMP, выработки IL-1β, IL-6, мРНК TNF-α и COX2, а также поверхностной экспрессии CD80, CD86 и молекул MHC класса II.

Материалы и методики

Изоляция и очистка клеток мочевого пузыря мышей

Клетки мочевого пузыря отбирали у умерщвленных мышей C57BL/6 (в возрасте 8-12 недель) и изолировали клетки с помощью ферментного расщепления с последующей очисткой на градиенте плотности Percoll. Вкратце, мочевые пузыри 10 мышей измельчали ножницами до мелкодисперсной суспензии в 10 мл расщепляющего буфера (RPMI 1640, 2% эмбриональная сыворотка телят (FBS), 0,5 мг/мл коллагеназа, 30 мкг/мл DNase). Суспензию мочевых пузырей подвергали ферментному расщеплению в течение 30 минут при 37°C. После этого, неразрушенные фрагменты дополнительно диспергировали через cell-trainer. Клеточную суспензию осаждали центрифугированием и добавляли к ступенчатому 20%, 40% и 75% градиенту плотности Percoll для выделения мононуклеарных клеток. Для каждого эксперимента использовали 50-60 мочевых пузырей.

После промывания в RPMI 1640, клетки мочевого пузыря ресуспендировали в RPMI 1640 с добавкой 10% эмбриональной сыворотки телят, 15 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, и высевали в черные микрокультуральные 96-луночные планшеты с прозрачным дном при плотности клеток 3×10⁴ клеток на лунку в 100 мкл среды. Клетки культивировали при 37°C в 5% атмосфере CO₂.

Обработка клеток анальгетиками in vitro

Клетки мочевого пузыря обрабатывали растворами анальгетиков (50 мкл/лунку) либо индивидуально, либо в комбинации с карбахолом (10-молярным, 50-мкл/лунку), который является примером невоспалительного стимула, либо липополисахаридом (LPS) из Salmonella typhimurium (1 мкг/мл, 50 мкл/лунку), который является примером воспалительного стимула. Если к клеткам не добавляли других эффекторов, в лунки вводили 50 мкл RPMI 1640 без эмбриональной сыворотки телят, чтобы довести конечный объем до 200 мкл.

После 24 часов культивирования, отбирали 150 мкл культурального супернатанта, центрифугировали в течение 2 мин при 8000 об/мин при 4°C для удаления клеток и продуктов их разрушения, и хранили при -70°C для исследования простагландинового E2 (PGE₂) ответа с использованием анализа ELISA. Клетки фиксировали, пермеабилизировали и блокировали для определения циклооксигеназы-2 (COX2) с использованием флуорогенного субстрата. В отдельных экспериментах, клетки стимулировали в течение 12 часов in vitro для анализа COX2 ответа.

Исследование COX2-ответов

COX2-ответы исследовали с помощью клеточного анализа ELISA используя иммуноанализ для определения общего человеческого/мышиного COX2 (R&D Systems), следуя инструкциям производителя. Вкратце, после фиксации и пермеабилизации клеток, в лунки 96-луночного микрокультурального планшета для клеточных культур с прозрачным дном, добавляли мышиное антитело против общего COX2 и кроличье антитело против общего GAPDH. После инкубирования и промывания в лунки добавляли HRP-конъюгированный анти-мышиный IgG и AP-конъюгированный анти-кроличий IgG. После еще одного инкубирования и нескольких промываний, добавляли флуорогенные субстраты HRP и AP. В заключении, с помощью универсального прибора для считывания планшетов Victor® V (Perkin Elmer) регистрировали флуоресцентное излучение при 600 нм (флуоресценция COX2) и 450 нм (флуоресценция GAPDH). Результаты выражали в процентных уровнях относительно общего COX2, которые определяли в относительных единицах флуоресценции (RFUs) и нормализовали относительно белка «домашнего хозяйства» GAPDH.

Исследование PGE2-ответов

Ответы простагландина E2 исследовали с помощью последовательного конкурентного анализа ELISA (RD Systems). Более конкретно, в лунки 96-луночного микропланшета из полистирола, покрытые козьим антимышиным поликлональным антителом, добавляли культуральные супернатанты и стандартные образцы PGE2. После инкубирования в течение одного часа на шейкере для микропланшетов, добавляли HRP-конъюгированный PGE2 и инкубировали планшеты в течение еще двух часов при комнатной температуре. Затем планшеты промывали раствором субстрата HRP, который добавляли в каждую ячейку. Давали пройти реакции образования цветного вещества в течение 30 мин и затем останавливали реакцию добавлением серной кислоты, после чего осуществляли считывание планшетов на 450 нм, с коррекцией длины волны на 570 нм. Результаты выражали в виде среднего содержания PGE2 в пг/мл.

Другие анализы

Высвобождение PGH₂, PGE, простацидина, тромбоксана, IL-1, IL-6 и TNF-, выработку cAMP и cGMP, выработку IL-1, IL-6, мРНК TNF- и COX2, а также поверхностную экспрессию CD80, CD86 и молекул MHC класса II определяли, как описано в примере 2.

Результаты

Анальгетики ингибируют COX2-ответ клеток мочевого пузыря мышей на воспалительные стимулы

Тестировали действие нескольких анальгетиков (ацетаминофена, аспирина, ибупрофена и напроксена) в концентрациях 5 мкМ или 50 мкМ на клетки мочевого пузыря мышей с целью определения могут ли эти анальгетики вызвать COX2-ответ. Исследование 24-часовых культур показало, что ни один из протестированных анальгетиков не вызвал COX2-ответов в клетках мочевого пузыря мышей in vitro.

Кроме того, тестировалось влияние этих аналгетиков на COX2 ответ клеток мочевого пузыря мышей при стимулировании карбахолом или LPS in vitro. Как показано в таблице 1, протестированные дозы карбахола не оказали значительного влияния на уровни COX2 в клетках мочевого пузыря мышей. С другой стороны, LPS значительно повышал общие уровни COX2. Интересно, что все анальгетики, т.е. ацетаминофен, аспирин, ибупрофен и напроксен, проявили способность подавлять влияние LPS на уровни COX2. Подавляющее действие аналгетиков наблюдалось при тестировании двух доз препаратов, т.е. как 5 мкМ, так и 50 мкМ (Таблица 4).

Таблица 4 Экспрессия COX2 клетками мочевого пузыря мышей после in vitro стимулирования и обработки анальгетиками
Стимулирующий агент	Анальгетик	Общие уровни COX2 (нормализованные RFUs)
Отсутствует	Отсутствует	158±18
Карбахол (мМ)	Отсутствует	149±21
LPS (1 мкг/мл)	Отсутствует	420±26
LPS (1 мкг/мл)	Ацетаминофен (5 мкМ)	275±12
LPS (1 мкг/мл)	Аспирин (5 мкМ)	240±17
LPS (1 мкг/мл)	Ибупрофен (5 мкМ)	253±32
LPS (1 мкг/мл)	Напроксен (5 мкМ)	284±11
LPS (1 мкг/мл)	Ацетаминофен (50 мкМ)	243±15

LPS (1 мкг/мл)	Аспирин (50 мкМ)	258±21
LPS (1 мкг/мл)	Ибупрофен (50 мкМ)	266±19
LPS (1 мкг/мл)	Напроксен (50 мкМ)	279±23

Анальгетики ингибируют PEG2-ответы клеток мочевого пузыря мышей на действие воспалительных стимулов

Измеряли секрецию PGE2 в культуральных супернатантах клеток мочевого пузыря мышей, для определения биологической достоверности изменения уровней COX2 в клетках мочевого пузыря мышей под действием аналгетиков. Как показано в таблице 5, PGE2 не был обнаружен в культуральных супернатантах не стимулированных клеток мочевого пузыря или клеток мочевого пузыря, культивированных в присутствии карбахола. В соответствии с описанными выше COX2-ответами, стимулирование клеток мочевого пузыря мышей LPS индуцировало секрецию высоких уровней PGE2. Добавление анальгетиков, а именно ацетаминофена, аспирина, ибупрофена и напроксена, подавляло влияние LPS на секрецию PGE2, причем разница в ответах клеток, обработанных 5 или 50 мкМ дозами анальгетиков, отсутствовала.

Таблица 5 Секреция PGE2 клетками мочевого пузыря мышей после стимулирования in vitro и обработки анальгетиками
Стимулирующий агент	Анальгетик	Уровни PGE2 (пг/мл)
Отсутствует	Отсутствует	<20,5
Карбахол (мМ)	Отсутствует	<20,5
LPS (1 мкг/мл)	Отсутствует	925±55
LPS (1 мкг/мл)	Ацетаминофен (5 мкМ)	619±32

LPS (1 мкг/мл)	Аспирин (5 мкМ)	588±21
LPS (1 мкг/мл)	Ибупрофен (5 мкМ)	593±46
LPS (1 мкг/мл)	Напроксен (5 мкМ)	597±19
LPS (1 мкг/мл)	Ацетаминофен (50 мкМ)	600±45
LPS (1 мкг/мл)	Аспирин (50 мкМ)	571±53
LPS (1 мкг/мл)	Ибупрофен (50 мкМ)	568±32
LPS (1 мкг/мл)	Напроксен (50 мкМ)	588±37

В совокупности приведенные данные показывают, что анальгетики сами по себе в концентрациях 5 мкМ или 50 мкМ не вызывают COX2 и PGE2 ответов клеток мочевого пузыря мышей. В то же время, анальгетики в концентрациях 5 мкМ или 50 мкМ в значительной степени подавляют COX2- и PGE2-ответы клеток мочевого пузыря мышей, стимулированных in vitro действием LPS (1 мкг/мл). Не наблюдалось значительного влияния аналгетиков на COX2- и PGE2-ответы клеток мочевого пузыря мышей, стимулированных карбахолом (1 мМ).

Пример 4: влияние обезболивающих агентов, ботулинического нейротоксина и антимускариновых агентов на сокращение клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря

План эксперимента

Культивированные клетки гладкой мускулатуры мышиных или крысиных мочевых пузырей или ткань гладкой мускулатуры мышиных или крысиных мочевых пузырей подвергали действию воспалительных стимулирующих агентов и невоспалительных стимулирующих агентов в присутствии обезболивающих агентов и/или антимускариновых агентов в различных концентрациях. Измеряли индуцированное этими стимулирующими агентами сокращение мышц для оценки ингибирующего действия обезболивающего агента и/или антимускаринового агента.

Эффекторы, обезболивающие агенты и антимускариновые агенты описаны в примере 2.

Исходные культуры клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря мышей подвергали кратковременному (1-2 часа) или долговременному (24-48 часов) стимулированию с помощью:

(1) каждого из обезболивающих агентов индивидуально в различных дозах;

(2) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(3) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(4) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(5) ботулинического нейротоксина A индивидуально в различных дозах;

(6) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии LPS;

(7) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(8) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(9) каждого из антимускариновых агентов индивидуально в различных дозах;

(10) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(11) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(12) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA.

Материалы и методики

Исходные клетки мочевого пузыря мышей изолировали, как описано в примере 3. В некоторых экспериментах использовали культуры тканей мочевого пузыря. Сокращение клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря регистрировали с помощью многоканального самописца Grass polygraph (Quincy Mass, USA).

Пример 5: Влияние перорального приема обезболивающих агентов и антимускариновых агентов на COX2- и PGE2-ответы клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря

План эксперимента:

Нормальным мышам и мышам с синдромом гиперактивного мочевого пузыря перорально вводили дозы аспирина, напроксена натрия, ибупрофена, индоцина, набуметона, тайленола, целекоксиба, оксибутирина, солифенацина, дарифенацина, атропина и их комбинаций. Контрольные группы включали нормальных мышей, не получавших препаратов, и OAB мышей, не получавших препаратов, без синдрома гиперактивного мочевого пузыря. Через тридцать (30) минут после введения последних доз препаратов, извлекали мочевые пузыри и стимулировали их ex vivo карбахолом или ацетилхолином. В некоторых экспериментах мочевые пузыри обрабатывали ботулиническим нейротоксином A перед стимулированием карбахолом. Животных содержали в метаболических клетках и определяли частоту (и объем) мочеиспускания. Объемы жидкости, выходящей из мочевого пузыря, определяли путем отслеживания количества выпитой воды и массы подстилки в клетке. Используя анализ ELISA, определяли уровни PGH₂, PGE, PGE₂, простацидина, тромбоксана, IL-1β, IL-6, TNF-α, cAMP и cGMP в сыворотке. Экспрессию CD80, CD86, MHC класса II в клетках цельной крови определяли проточной цитометрией.

В конце эксперимента животных подвергали эвтаназии и регистрировали сокращения мочевого пузыря ex vivo с помощью многоканального самописца Grass polygraph. Части мочевых пузырей фиксировали в формалине и определяли COX2-ответ с помощью иммуногистохимии.

Пример 6: действие обезболивающих агентов, ботулинического нейротоксина и антимускариновых агентов на реакцию клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека на воспалительные и невоспалительные стимулы

План эксперимента

Цель данного эксперимента заключается в определении того, как оптимальные дозы анальгетиков, установленные в примерах 1-5, влияют на клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека в клеточных или тканевых культурах, и решении вопроса, способны ли различные классы анальгетиков проявлять синергию для более эффективного подавления COX2- и PGE2-ответов.

Эффекторы, обезболивающие агенты и антимускариновые агенты описаны в примере 2.

Клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека подвергали кратковременному (1-2 часа) или долговременному (24-48 часов) стимулированию с помощью:

(1) каждого из обезболивающих агентов индивидуально в различных дозах;

(2) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(3) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(4) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(5) ботулинического нейротоксина A индивидуально в различных дозах;

(6) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии LPS;

(7) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(8) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(9) каждого из антимускариновых агентов индивидуально в различных дозах;

(10) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(11) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(12) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA.

Затем клетки исследовали с целью определения высвобождения PGH₂, PGE, простацидина, тромбоксана, IL-1β, IL-6, TNF-α, активности COX2, выработки cAMP и cGMP, выработки IL-1β, IL-6, мРНК TNF-α и COX2, а также поверхностной экспрессии CD80, CD86 и молекул MHC класса II.

Пример 7: действие обезболивающих агентов, ботулинического нейротоксина и антимускариновых агентов на сокращение клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека

План эксперимента

Культивированные клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека подвергали действию воспалительных и невоспалительных стимулов в присутствии обезболивающего агента и/или антимускаринового агента в различных концентрациях. Измеряли индуцированное этими стимулами сокращение мышц для оценки ингибирующего действия обезболивающего агента и/или антимускаринового агента.

Эффекторы, обезболивающие агенты и антимускариновые агенты описаны в примере 2.

Клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека подвергали кратковременному (1-2 часа) или долговременному (24-48 часов) стимулированию с помощью:

(1) каждого из обезболивающих агентов индивидуально в различных дозах;

(2) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(3) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(4) каждого из обезболивающих агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(5) ботулинического нейротоксина A индивидуально в различных дозах;

(6) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии LPS;

(7) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(8) ботулинического нейротоксина A в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA;

(9) каждого из антимускариновых агентов индивидуально в различных дозах;

(10) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии LPS;

(11) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии карбахола или ацетилхолина;

(12) каждого из антимускариновых агентов в различных дозах в присутствии AA, DGLA или EPA.

Сокращения клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря регистрировали с помощью многоканального самописца Grass polygraph (Quincy Mass, USA).

Пример 8: влияние обезболивающих агентов на реакцию нормальных клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека на воспалительные и невоспалительные сигналы

План эксперимента

Культуры нормальных клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека

Нормальные клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека изолировали путем ферментного расщепления кусочков нормального мочевого пузыря макроскопических размеров. Клетки размножали in vitro, культивируя их при 37°C в 5%-й атмосфере CO₂ в среде RPMI 1640 с добавками 10%-й эмбриональной сыворотки телят, 15 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 100 U/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина, и раз в неделю осуществляли пересев культуры, обрабатывая клетки трипсином для их отделения, и затем перенося их в новую колбу для клеточных культур. На первой неделе культивирования в культуральную среду вводили добавку 0,5 нг/мл эпидермального фактора роста, 2 нг/мл фактора роста фибробластов и 5 мкг/мл инсулина.

Обработка нормальных клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря анальгетиками in vitro

Клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря, трипсинизированные и высеянные в микрокультуральные планшеты при плотности клеток 3×10⁴ клеток на лунку в 100 мкл, обрабатывали растворами анальгетиков (50 мкл/лунку) либо индивидуально, либо в комбинации с карбахолом (10-молярным, 50-мкл/лунку), который является примером невоспалительного стимула, либо с липополисахаридом (LPS) из Salmonella typhimurium (1 мкг/мл, 50 мкл/лунку), который является примером воспалительного стимула. Если к клеткам не добавляли других эффекторов, в лунки вводили 50 мкл RPMI 1640 без эмбриональной сыворотки телят, чтобы довести конечный объем до 200 мкл.

После 24 часов культивирования отбирали 150 мкл культурального супернатанта, центрифугировали в течение 2 мин при 8000 об/мин при 4°C для удаления клеток и продуктов их разрушения, и хранили при -70°C для исследования простагландинового E2(PGE₂)-ответа с использованием анализа ELISA. Клетки фиксировали, пермеабилизировали и блокировали для определения COX2 с использованием флуорогенного субстрата. В отдельных экспериментах, клетки стимулировали в течение 12 часов in vitro для анализа COX2-, PGE2- и цитокинового ответов.

Исследование COX2-, PGE2- и цитокинового ответов

COX2- и PGE2-ответы исследовали по методике, описанной в примере 3. Цитокиновые ответы исследовали по методике, описанной в примере 2.

Результаты

Анальгетики ингибируют COX2-ответы нормальных клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека на воспалительные и невоспалительные стимулы.

Исследование клеток и культуральных супернатантов через 24 часа культивирования показало, что ни один из протестированных анальгетиков сам по себе не вызывает COX2-ответов в нормальных клетках гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека. Однако, как показано в таблице 6, карбахол вызывал небольшой, но статистически значимый COX2-ответ в нормальных клетках гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека. С другой стороны, обработка LPS приводила к более высоким уровням COX2-ответа в нормальных клетках гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека. Все анальгетики, т.е. ацетаминофен, аспирин, ибупрофен и напроксен, показали способность подавлять влияние карбахола и LPS на уровни COX2. Подавляющее действие анальгетиков на LPS-индуцированный ответ наблюдалось при тестировании обезболивающих препаратов в любой из доз, т.е. как 5 мкМ, так и 50 мкМ.

Таблица 6 Экспрессия COX2 нормальными клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека после in vitro стимулирования воспалительными и невоспалительными стимулирующими агентами и обработки анальгетиками
Стимулирующий агент	Анальгетик	Общий уровень COX2# (Нормализованные значения RFU) субъект 1	Общий уровень COX2 (Нормализованные значения RFU) субъект 2
Нет	Нет	230	199
Карбахол 10-3 М	Ацетаминофен (50 мкМ)	437	462
Карбахол 10-3 М	Аспирин (50 мкМ)	298	310
Карбахол 10-3 М	Ибупрофен (50 мкМ)	312	297
Карбахол 10-3 М	Напроксен (50 мкМ)	309	330
Карбахол 10-3 М	Ацетаминофен (50 мкМ)	296	354
LPS (10 мкг/мл)	Нет	672	633
LPS (10 мкг/мл)	Ацетаминофен (5 мкМ)	428	457
LPS (10 мкг/мл)	Аспирин (5 мкМ)	472	491
LPS (10 мкг/мл)	Ибупрофен (5 мкМ)	417	456
LPS (10 мкг/мл)	Напроксен (5 мкМ)	458	501
LPS (10 мкг/мл)	Ацетаминофен (50 мкМ)	399	509
LPS (10 мкг/мл)	Аспирин (50 мкМ)	413	484
LPS (10 мкг/мл)	Ибупрофен (50 мкМ)	427	466
LPS (10 мкг/мл)	Напроксен (50 мкМ)	409	458
#Данные являются средними значениями для двух параллельных экспериментов

Анальгетики ингибируют PGE2-ответы нормальных клеток гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека на воспалительные и невоспалительные стимулы.

Аналогично описанной выше индукции COX2-ответов, как карбахол, так и LPS вызывали выработку PGE2 нормальными клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека. Также, аналогично указанному выше было обнаружено, что ацетаминофен, аспирин, ибупрофен и напроксен подавляют LPS-индуцированные PGE2-ответы в любой из доз 5 мкМ или 50 мкМ (таблица 7).

Таблица 7 Секреция PGE2 нормальными клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека после in vitro стимулирования воспалительными и не воспалительными стимулами и обработки анальгетиками
Стимулирующий агент	Анальгетик	Уровни PGE2# (пг/мл) субъект 1	Уровни PGE2 (пг/мл) субъект 2
Нет	Нет	<20,5	<20,5
Карбахол 10-3 М	Ацетаминофен (50 мкМ)	129	104
Карбахол 10-3 М	Аспирин (50 мкМ)	76	62
Карбахол 10-3 М	Ибупрофен (50 мкМ)	89	59
Карбахол 10-3 М	Напроксен (50 мкМ)	84	73
Карбахол 10-3 М	Ацетаминофен (50 мкМ)	77	66
LPS (10 мкг/мл)	Нет	1125	998
LPS (10 мкг/мл)	Ацетаминофен (5 мкМ)	817	542
LPS (10 мкг/мл)	Аспирин (5 мкМ)	838	598
LPS (10 мкг/мл)	Ибупрофен (5 мкМ)	824	527
LPS (10 мкг/мл)	Напроксен (5 мкМ)	859	506
LPS (10 мкг/мл)	Ацетаминофен (50 мкМ)	803	540
LPS (10 мкг/мл)	Аспирин (50 мкМ)	812	534
LPS (10 мкг/мл)	Ибупрофен (50 мкМ)	821	501
LPS (10 мкг/мл)	Напроксен (50 мкМ)	819	523
#Данные являются средними значениями для двух параллельных экспериментов.

Анальгетики ингибируют цитокиновые ответы нормальных клеток мочевого пузыря человека на воспалительные стимулы

Исследование клеток и культуральных супернатантов после 24 часов культивирования показало, что ни один из исследованных анальгетиков сам по себе не вызвал секрецию IL-6 или TNFα в нормальных клетках гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека. Как показано в таблицах 8 и 9, исследованная доза карбахола вызвала невысокие, но статистически значимые TNFα- и IL-6-ответы в нормальных клетках гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека. С другой стороны обработка LPS приводила к выработке больших количеств этих провоспалительных цитокинов. Ацетаминофен, аспирин, ибупрофен и напроксен подавляли действие карбахола и LPS на TNFα- и IL-6-ответы. Подавляющее действие анальгетиков на LPS-индуцированные ответы наблюдалось при тестировании обезболивающих препаратов в любой из доз, т.е. как 5 мкМ, так и 50 мкМ.

Таблица 8 Секреция TNFα нормальными клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека после in vitro стимулирования воспалительными и невоспалительными стимулами и обработки анальгетиками
Стимулирующий агент	Анальгетик	TNFα (пг/мл)# субъект 1	TNFα (пг/мл) субъект 2
Нет	Нет	<5	<5
Карбахол 10-3 М	Нет	350	286
Карбахол 10-3 М	Ацетаминофен (50 мкМ)	138	164
Карбахол 10-3 М	Аспирин (50 мкМ)	110	142
Карбахол 10-3 М	Ибупрофен (50 мкМ)	146	121
Карбахол 10-3 М	Напроксен (50 мкМ)	129	137
LPS (10 мкг/мл)	Нет	5725	4107
LPS (10 мкг/мл)	Ацетаминофен (5 мкМ)	2338	2267
LPS (10 мкг/мл)	Аспирин (5 мкМ)	2479	2187
LPS (10 мкг/мл)	Ибупрофен (5 мкМ)	2733	2288
LPS (10 мкг/мл)	Напроксен (5 мкМ)	2591	2215

LPS (10 мкг/мл)	Ацетаминофен (50 мкМ)	2184	2056
LPS (10 мкг/мл)	Аспирин (50 мкМ)	2266	2089
LPS (10 мкг/мл)	Ибупрофен (50 мкМ)	2603	1997
LPS (10 мкг/мл)	Напроксен (50 мкМ)	2427	2192
#Данные являются средними значениями для двух параллельных экспериментов.

Таблица 9 Секреция IL-6 нормальными клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека после in vitro стимулирования воспалительными и не воспалительными стимулами и обработки анальгетиками
Стимулирующий агент	Анальгетик	IL-6 (пг/мл)# субъект 1	IL-6 (пг/мл) субъект 2
Нет	Нет	<5	<5
Карбахол 10-3 М	Нет	232	278
Карбахол 10-3 М	Ацетаминофен (50 мкМ)	119	135
Карбахол 10-3 М	Аспирин (50 мкМ)	95	146
Карбахол 10-3 М	Ибупрофен (50 мкМ)	107	118
Карбахол 10-3 М	Напроксен (50 мкМ)	114	127
LPS (10 мкг/мл)	Нет	4838	4383
LPS (10 мкг/мл)	Ацетаминофен (5 мкМ)	2012	2308
LPS (10 мкг/мл)	Аспирин (5 мкМ)	2199	2089
LPS (10 мкг/мл)	Ибупрофен (5 мкМ)	2063	2173
LPS (10 мкг/мл)	Напроксен (5 мкМ)	2077	2229
LPS (10 мкг/мл)	Ацетаминофен (50 мкМ)	2018	1983
LPS (10 мкг/мл)	Аспирин (50 мкМ)	1987	2010
LPS (10 мкг/мл)	Ибупрофен (50 мкМ)	2021	1991
LPS (10 мкг/мл)	Напроксен (50 мкМ)	2102	2028
#Данные являются средними значениями для двух параллельных экспериментов

Исходные нормальные клетки гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека изолировали, культивировали и исследовали их реакцию на анальгетики в присутствии невоспалительных (карбахол) и воспалительных (LPS) стимулирующих агентов. Цель этого исследования заключалась в определении того, воспроизводятся ли результаты, полученные ранее для клеток мочевого пузыря мышей, на нормальных клетках гладкой мускулатуры мочевого пузыря человека.

Описанные выше эксперименты будут повторены с обезболивающими агентами и/или антимускариновыми агентами в составах с отсроченным высвобождением или составах с продолжительным высвобождением, или составах с отсроченным и продолжительным высвобождением.

Приведенное выше описание предназначено для того, чтобы разъяснить рядовому специалисту в данной области техники, как воплотить настоящее изобретение на практике, и не содержит подробного изложения всех очевидных модификаций и вариантов изобретения, которые станут ясны специалисту при ознакомлении с настоящим описанием. При этом имеется в виду, что все эти очевидные модификации и варианты включены в объем настоящего изобретения, который определяется приведенной ниже формулой изобретения. Предполагается, что формула изобретения охватывает все заявленные компоненты и стадии в любой последовательности, которая эффективна для достижения предполагаемых целей, если контекст явно не указывает на противоположное.

1. Способ уменьшения частоты мочеиспускания, включающий:
введение субъекту, которому это необходимо, эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ацетаминофен, где указанный ацетаминофен вводят в дневной дозировке от 1 мг до 2000 мг.

2. Способ по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой композицию с отсроченным высвобождением.

3. Способ по п. 2, где указанный состав с отсроченным высвобождением содержит материал, выбранный из группы, состоящей из гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, метилгидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, акрилатных сополимеров, полиэтиленгликолей, поливинилпирролидона, сополимеров метакриловой кислоты, ацетатфталата целлюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетатсукцината гидроксипропилметилцеллюлозы, поливинилацетата фталата, шеллака и этилцеллюлозы.

4. Способ по п. 2, где указанный состав с отсроченным высвобождением дополнительно содержит глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

5. Способ по п. 2, где указанный состав с отсроченным высвобождением содержит не растворимый в воде корпус капсулы, который с одной стороны закрыт не растворимой, но проницаемой и способной набухать пробкой из гидрогеля, где указанная пробка содержит материал, выбранный из группы, состоящей из полиметакрилатов, разрушаемых прессованных полимеров, затвердевших расплавов полимеров и полимеров, способных к управляемому разрушению под действием ферментов.

6. Способ по п. 2, где указанный состав с отсроченным высвобождением содержит кишечнорастворимое покрытие.

7. Способ по п. 1, где указанный ацетаминофен вводят в дневной дозировке от 50 мг до 500 мг.

8. Способ по п. 1, где указанный ацетаминофен вводят в дневной дозировке от 500 мг до 2000 мг.

9. Способ по п. 1, где указанный ацетаминофен вводят в дневной дозировке от 100 мг до 1500 мг.

10. Способ по п. 1, где указанный ацетаминофен вводят в дневной дозировке от 250 мг до 1000 мг.

11. Способ по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой состав с немедленным высвобождением.

12. Способ по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит:
обезболивающий агент, выбранный из группы, состоящей из аспирина, ибупрофена, напроксена, напроксена натрия, индометацина и набуметона,
где указанный обезболивающий агент вводят в дневной дозировке от 1 мг до 2000 мг.

13. Способ по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит один или несколько антимускариновых агентов, выбранных из группы, состоящей из оксибутинина, солифенацина, дарифенацина и атропина.

14. Способ по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит один или несколько антидиуретиков.

15. Способ по п. 1, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит один или несколько спазмолитиков.

16. Способ по п. 1, дополнительно содержащий:
введение указанному субъекту диуретика;
где указанный диуретик вводят как минимум за 8 часов до времени отхода ко сну и где указанную фармацевтическую композицию вводят в течение 2 часов до указанного времени отхода ко сну.

17. Способ уменьшения частоты мочеиспускания, включающий:
введение субъекту, которому это необходимо, эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей несколько действующих ингредиентов,
где указанные несколько действующих ингредиентов содержат ацетаминофен и один или несколько антимускариновых агентов, выбранных из группы, состоящей из оксибутинина, солифенацина, дарифенацина и атропина, и где указанный ацетаминофен вводят в дневной дозировке от 50 мг до 2000 мг.

18. Способ по п. 17, где указанная фармацевтическая композиция составлена для немедленного высвобождения указанных нескольких действующих ингредиентов.

19. Способ по п. 17, где указанная фармацевтическая композиция составлена для отсроченного высвобождения указанных нескольких действующих ингредиентов.

20. Способ по п. 17, где указанные несколько действующих ингредиентов дополнительно содержат обезболивающий агент, выбранный из группы, состоящей из аспирина, ибупрофена, напроксена, напроксена натрия, индометацина и набуметона.

21. Способ по п. 17, где указанные несколько действующих ингредиентов, дополнительно содержат один или несколько антидиуретиков.

22. Способ по п. 17, где указанные несколько действующих ингредиентов дополнительно содержат один или несколько спазмолитиков.

23. Фармацевтическая композиция для уменьшения частоты мочеиспускания, содержащая:
ацетаминофен;
один или несколько антидиуретиков и
фармацевтически приемлемый носитель,
где указанная композиция составлена для отсроченного высвобождения ацетаминофена.

24. Фармацевтическая композиция по п. 23, дополнительно содержащая один или несколько антимускариновых агентов.

25. Фармацевтическая композиция по п. 24, дополнительно содержащая один или несколько спазмолитиков.