Антитела против человеческого il33r и их применение

Изобретения относятся к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая антитело, связывающееся с IL33R(варианты), фармацевтическую композицию для связывания с IL33R, содержащая вышеуказанное антитело, применение вышеуказанного антитела для изготовления фармацевтической композиции, применение вышеуказанного антитела для лечения ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы, нуклеиновую кислоту, кодирующую указанное антитело(варианты), экспрессионный вектор, содержащий вышеуказанную нуклеиновую кислоту. Изобретения расширяют арсенал антител, связывающихся с IL33R. 11 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 табл., 12 пр.

 

Данное изобретение относится к антителам против человеческого IL33R (IL33R-антитело), способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и их применению.

Уровень техники

IL33 человека представляет собой интерлейкин-1-подобный цитокин семейства IL-1, который передает сигнал через IL-1-рецептор-связанный IL33-рецептор (синонимы названия рецептора: IL1RL1, T1/ST2) и индуцирует цитокины, связанные с Т-хелперами типа 2. Синонимами IL33 (рег. № в Swiss-Prot O95760) являются член 11 семейства интерлейкина-1 (IL-1F11) и ядерный фактор из эндотелиальных венул (NF-HEV). NF-HEV описан в Baekkevold, E.S., et al., Am. J. Pathol. 163 (2003) 69-79. IL33 описан в Schmitz, J., et al., Immunity 23 (2005) 479-490.

Человеческий рецептор IL33, IL33R (синоним для ILRL1; рег. № в SwissProt Q01638, другими названиями являются ST2, T1/ST2, Fit-1 и DER4), индуцируется при стимуляции роста фибробластов, а также может индуцироваться при антигенной стимуляции в Th2-клетках. В соответствии с изобретением IL33R и ST2 обозначают человеческий IL33R. Tominaga, S., et al., (FEBS Lett. 258 (1989) 301-304; Biochim. Biophys. Acta. 1171 (1992) 215-218) и Yanagisawa, K., (FEBS Lett. 318 (1993) 83-87) идентифицировали человеческий ST2 (секретируемая форма), ST2L (трансмембранная рецепторная форма) и ST2V (вариант Glu-78). Человеческий ST2 экспрессируется только в стимулированных к росту клетках Balb/c-3Т3 и является членом семейства генов первичного ответа, индуцируемого факторами роста. ST2 кодирует белок, похожий последовательностью на внеклеточную часть человеческого рецептора интерлейкина 1 типа 1 и типа 2. Исследования на мышах с нокаутом IL33R позволили предположить, что IL33R участвует в ранних событиях ТН2-ответа (Kropf, P., et al., Infect. Immunity 70 (2002) 5512-5520; Hoshino, K., et al., J. Exp. Med. 190 (1999) 1541-1548; Senn, et al., Eur. J. Immunol. 30 (2000) 1929-1938; Townsend, M.J., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 1069-1076). ST2 считается маркером, активатором и регулятором ТН2-иммунитета (Kumar, R.K., et al., Clin. Exp. Allergy 32 (2002) 1394-1396).

Анти-IL33R-антитела и их роль в иммунных функциях были описаны в ряде публикаций. Противочеловеческое ST2-антитело Mab523 и поликлональное антитело AF523 коммерчески доступны от R&D Systems (http://www.rndsystems.com). Противочеловеческое ST2-антитело HB12 коммерчески доступно от antibodies-online GmbH, Германия, и от MBL Int. Corp. (www.mblintl.com). Анти-IL33R-антитела приводят к снижению иммунного ответа ТН2-типа. Антитело ингибирует эозинофильную инфильтрацию, продукцию IL-5 и продукцию IgE. Оценка роли ST2 на животных моделях астмы привела к повышенной экспрессии мышиного IL33R на CD4⁺-T-клетках, что указывает на роль IL33R в аллергических или астматических ответах (Lohning, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 6930-6935 и Xu, D., et al., J. Exp. Med. 187 (1998) 787-794; Coyle, A.J., et al., J. Exp. Med. 190 (1999) 895-902). Meisel, С., et al., J. Immunol. 166 (2001) 3143-3150 исследовали регуляцию и функцию Т1/ST2-экспрессии на CD4⁺-T-клетках и индукцию продукции цитокинов 2 типа при перекрестном сшивании T1/ST2. Lohning, M., et al. создали противомышиное ST2-антитело у крыс. Предварительное введение 20 мкг (приблизительно 0,8 мг/кг) такого антитела за 1 час до провокации аллергеном сократило число эозинофилов в дыхательных путях мышей на 70%. Kumar, S., et al., (Biochem. Biophys. Res. Comm. 235 (1997) 474-478 и J. Biol. Chem. 270 (1995) 27905-27913) описывают экспрессию белка ST2, выявляемого при иммунопреципитации с использованием кроличьего поликлонального антитела, созданного против очищенного растворимого ST2-рецептора, экспрессируемого у дрозофил. Исследования с мышами BALB/c показали, что введение анти-IL33-антитела индуцировало более высокий ответ TH1-типа. Система ELISA для количественной оценки человеческого ST2-белка в сыворотках крови пациентов была описана Kuroiwa, K., et al., Hybridoma 19 (2000) 151-159. Анти-IL33R-антитела также уменьшают эффекты, связанные с инфекциями RSV (Walzl, et al., J. Exp. Med. 193 (2001) 785-792). Анти-IL33R-антитела также были исследованы на животной модели артрита (Leung, В.Р., et al., J. Immunol. 173 (2004) 145-150; Walzl, et al., J. Exp. Med. 193 (2001) 785-792). Smithgall, M.D., et al., Int. Immunol. 20 (2008) 1019-1030 исследовали уровни интерферона-γ в NK-клетках в присутствии анти-huST2-антитела. IL33R и/или антитела против IL33R упомянуты в WO 2005/079844, US 7087396, WO 2001/021641, WO 2002/038794, WO 2003/094856. Oboki, K., et al., Allergology Int. 59 (2010) 143-160 рассматривают роль IL-33 и IL-33-рецепторов в защите хозяина и развитии заболеваний и влияние анти-ST2-антитела, растворимого ST2 и анти-IL-33-антитела на воспаление дыхательных путей мыши.

Сущность изобретения

Изобретение включает антитело, связывающееся с IL33R, характеризующееся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №1, CDR2-область из SEQ ID №2 и CDR1-область из SEQ ID №3, и что вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №4, CDR2-область из SEQ ID №5 и CDR1-область из SEQ ID №6. Предпочтительно антитело характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №7. Предпочтительно антитело характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №7, а вариабельный домен легкой цепи содержит SEQ ID №8. Предпочтительно антитело связывается с IL33R и характеризуется тем, что указанные выше аминокислотные последовательности и фрагменты аминокислотных последовательностей имеют человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело содержит мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A. Предпочтительная константная область тяжелой цепи, включающая мутации L234A и L235A, показана в SEQ ID №9. Предпочтительно антитело связывается с IL33R и характеризуется тем, что указанные выше аминокислотные последовательности и фрагменты аминокислотных последовательностей имеют человеческий изотип IgG₄, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело содержит мутации L235E (глутаминовая кислота вместо лейцина в аминокислотной позиции 235) и S228P (пролин вместо серина в аминокислотной позиции 228).

Антитело ra170 (MKA ra170) представляет собой предпочтительное воплощение изобретения. Другое воплощение изобретения представляет собой химерный, гуманизированный или лишенный T-клеточного эпитопа вариант антитела ra170.

Предпочтительные варианты гуманизированного антитела ra170 характеризуются тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №24, CDR2-область из SEQ ID №23 и CDR1-область из SEQ ID №22, и что вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №33, CDR2-область из SEQ ID №32 и CDR1-область из SEQ ID №31, или характеризуются тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №28, CDR2-область из SEQ ID №27 и CDR1-область из SEQ ID №26, и что вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №33, CDR2-область из SEQ ID №32 и CDR1-область из SEQ ID №31. Предпочтительно гуманизированное антитело характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №21 или 25. Предпочтительно гуманизированное антитело характеризуется тем, что вариабельный домен легкой цепи содержит SEQ ID №30.

Антитело специфически связывается с IL33R с аффинностью 10^-10 М или ниже.

Данное изобретение относится также к антителу, которое связывается с IL33R и характеризуется связыванием с тем же эпитопом IL33R, с которым связывается моноклональное антитело ra170. Антитело связывается с IL33R с аффинностью по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A и L235A или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Предпочтительно антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело. Предпочтительно антитело в соответствии с изобретением ингибирует связывание IL33 с IL33R со значением IC₅₀ 0,32 нМ для человеческого IL33/IL33R и 0,13 нМ для IL33/IL33R макаки.

Антитела в соответствии с изобретением предпочтительно демонстрируют величины IC₅₀ 5 нМ или ниже в анализе эозинофилов, анализе тучных клеток, Th2-анализе, анализе базофилов (IL-5). Такие антитела особенно полезны при лечении ревматоидного артрита, астмы или язвенного колита.

Другое воплощение данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело в соответствии с изобретением. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит антитело, которое характеризуется связыванием с тем же эпитопом IL33R, с которым связывается моноклональное антитело ra170. Предпочтительно антитело фармацевтической композиции связывается с IL33R с аффинностью по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A, или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Другим воплощением данного изобретения является применение антитела в соответствии с изобретением для изготовления фармацевтической композиции. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит антитело, которое характеризуется связыванием с тем же эпитопом IL33R, с которым связывается моноклональное антитело ra170. Предпочтительно антитело фармацевтической композиции связывается с IL33R с аффинностью по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A, или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Другим воплощением данного изобретения является применение антитела в соответствии с изобретением для лечения язвенного колита или астмы. фармацевтической композиции. Другим воплощением изобретения является способ изготовления фармацевтической композиции, содержащей антитело в соответствии с изобретением. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит антитело, которое характеризуется связыванием с тем же эпитопом IL33R, с которым связывается моноклональное антитело ra170. Предпочтительно антитело фармацевтической композиции связывается с IL33R с аффинностью по меньшей мере от 10^-8 М^-1 до 10^-12 М^-1, предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A, или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область тяжелой цепи из SEQ ID №1 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область тяжелой цепи из SEQ ID №2 и CDR1-область из SEQ ID №3. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область легкой цепи из SEQ ID №4 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область легкой цепи из SEQ ID №5 и CDR1-область из SEQ ID №6. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в соответствии с изобретением, которое характеризуется тем, что содержит вариабельный домен тяжелой цепи из SEQ ID №7 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID №8, и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁ человека или мутации L235E и S228P в константном домене тяжелой цепи IgG₄ человека.

Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область тяжелой цепи из SEQ ID №24 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область тяжелой цепи из SEQ ID №23 и CDR1-область из SEQ ID №22. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область легкой цепи из SEQ ID №33 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область легкой цепи из SEQ ID №2 и CDR1-область из SEQ ID №31. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в соответствии с изобретением, которое характеризуется тем, что содержит вариабельный домен тяжелой цепи из SEQ ID №21 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID №30, и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁ человека или мутации L235E и S228P в константном домене тяжелой цепи IgG₄ человека.

Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область тяжелой цепи из SEQ ID №28 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение CDR2-область тяжелой цепи из SEQ ID №27 и CDR1-область из SEQ ID №26. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что содержит CDR3-область легкой цепи из SEQ ID №33 и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁. Предпочтительно антитело содержит в дополнение легкой цепи CDR2-область из SEQ ID №2 и CDR1-область из SEQ ID №31. Другим воплощением данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в соответствии с изобретением, которое характеризуется тем, что содержит вариабельный домен тяжелой цепи из SEQ ID №25 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID №30, и предпочтительно мутации L234A и L235A в константном домене тяжелой цепи IgG₁ человека или мутации L235E и S228P в константном домене тяжелой цепи IgG₄ человека.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно характеризуется тем, что константные цепи имеют человеческое происхождение. Такие константные цепи хорошо известны в данной области и описываются, например, Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), и Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Например, используемая человеческая константная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID №9 (IgG₁ человека с мутациями L234A и L235A) или SEQ ID №29 (IgG₄ человека с мутациями L235E и S228P). Например, используемая человеческая константная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи из SEQ ID №12 или 34. Кроме того, предпочтительно антитело имеет мышиное происхождение и включает последовательность рамки вариабельной области мышиного антитела в соответствии с Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); и Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218).

Антитело в соответствии с изобретением особенно характеризуется ингибированием связывания IL33 с IL33R и, следовательно, ингибированием передачи сигнала через сигнальный комплекс IL-33R/IL-1RacP.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁. Предпочтительные константные области тяжелой цепи γ1 показаны в SEQ ID №10 или 29 и SEQ ID №11 без мутаций L234A и L235A. Предпочтительная константная область легкой κ-цепи показана в SEQ ID №12 или 34.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно характеризуется тем, что не связывается с человеческим фактором комплемента C1q и, следовательно, не имеет CDC-эффекторной функции.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно имеет человеческий изотип IgG₁, модифицированный в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240, предпочтительно в аминокислотной позиции 220-240, между C_H1 и C_H2 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3. Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно характеризуется тем, что имеет человеческий изотип IgG₁, включающий по меньшей мере одну мутацию из L234 (лейцин в аминокислотной позиции 234), L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и/или Р329 (нумерация в соответствии с индексом ЕС). Предпочтительно антитело имеет человеческий изотип IgG₁, включающий мутации L234A (аланин вместо лейцина в аминокислотной позиции 234) и L235A, или человеческий изотип IgG₄, включающий мутации L235E и S228P.

Данное изобретение также относится к экспрессионным векторам, содержащим нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, способным экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, а также к клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы для рекомбинантной продукции такого антитела. Кроме того, изобретение включает прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, содержащую вектор в соответствии с изобретением. Кроме того, изобретение включает способ получения рекомбинантного человеческого или гуманизированного антитела в соответствии с изобретением, который характеризуется экспрессией нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделением указанного антитела из указанной клетки или супернатанта клеточной культуры. Кроме того, изобретение включает антитело, получаемое с помощью такого рекомбинантного способа.

Антитела в соответствии с изобретением демонстрируют преимущества для пациентов, нуждающихся в терапии, нацеленной на IL33R. Антитела в соответствии с изобретением имеют новые и изобретательные свойства, которые особенно полезны для пациента, страдающего от таких иммунологических заболеваний, особенно страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы. Антитела в соответствии с изобретением не вызывают чувствительность к стафилококковой и энтеральной бактериальным инфекциям у пациента, получающего лечение. Кроме того, изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы, включающему введение пациенту, у которого диагностировано такое заболевание (и, следовательно, нуждающемуся в такой терапии), эффективного количества антитела, связывающегося с IL33R, в соответствии с изобретением. Антитело предпочтительно вводят в виде фармацевтической композиции. Еще одно воплощение данного изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы, характеризующемуся введением пациенту антитела в соответствии с изобретением. Кроме того, изобретение относится к применению антитела в соответствии с изобретением для лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы, и для изготовления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением. Кроме того, изобретение относится к способу изготовления фармацевтической композиции в соответствии с изобретением.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело в соответствии с изобретением, возможно вместе с буфером и/или адъювантом, используемым для состава антитела для фармацевтических целей. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело в соответствии с изобретением в фармацевтически приемлемом носителе. В одном воплощении фармацевтическая композиция может быть включена в изделие или набор.

Подробное описание изобретения

Термин «антитело» включает в себя различные формы структур антител, в том числе, но не ограничиваясь ими, целые антитела и фрагменты антител. Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно представляет собой гуманизированное антитело, химерное антитело или другое антитело, полученное путем генной инженерии, до тех пор, пока сохраняются его характерные свойства в соответствии с изобретением. «Фрагменты антитела» включают часть антитела полной длины, предпочтительно его вариабельный домен, или по меньшей мере антигенсвязывающую часть. Примеры фрагментов антител включают двойные антитела, одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител. Например, scFv-антитела описаны в Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Кроме того, фрагменты антитела включают одноцепочечные полипептиды, имеющие характеристики домена V_H, a именно возможность объединяться с доменом V_L, или характеристики домена V_L, связывающего IL33R, а именно возможность объединяться с доменом V_H для формирования функционального антигенсвязывающего сайта и обеспечения таким образом свойств антитела в соответствии с изобретением. Используемые в данном документе термины «моноклональное антитело» или «композиция с моноклональным антителом» относятся к изготовлению молекул антитела единого аминокислотного состава. Термин «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых были изменены каркасные участки или «участки, определяющие комплементарность» (CDR) так, чтобы они содержали CDR иммуноглобулина другого вида, отличного от родительского иммуноглобулина. В предпочтительном воплощении мышиный CDR прививают в каркасную область человеческого антитела для получения «гуманизированного антитела». См., например, Riechmann, L, et al., Nature 332 (1988) 323-327; и Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270.

Термин «связывание с IL33R», используемый в данном документе, означает связывание антитела с иммобилизованным человеческим IL33R в анализе связывания ELISA. Связывание обнаруживается, если антитело вызывает сигнал, больший чем среднее значение +3 стандартных отклонения или более относительно контроля без антитела при концентрации антитела выше 12 нг/мл.

Термин «аффинность» относится к силе суммарных общих нековалентных взаимодействий между отдельным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, то термин «аффинность связывания», используемый в данном документе, относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антитела и антигена). Аффинность молекулы Х в отношении ее партнера Y может в основном выражаться константой диссоциации (K_d). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области, включая те, которые приведены в данном описании. Конкретные иллюстративные и примерные воплощения измерения аффинности связывания описаны далее.

Термин «эпитоп» обозначает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводные боковые цепи, и обычно эпитопы имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационный и неконформационный эпитопы отличаются тем, что связывание с первым, но не с последним теряется в присутствии денатурирующих растворителей. Предпочтительно антитело в соответствии с изобретением специфически связывается с нативным, но не денатурированным IL33R. IL33R-антитело в соответствии с изобретением связывается с тем же эпитопом на IL33R, с которым связывается антитело МКА ra170. Эпитопсвязывающие свойства антитела IL33R в соответствии с изобретением можно определить с помощью методик, известных в данной области. IL33R-антитело проверяется в анализе конкурентного связывания in vitro для определения способности анализируемого антитела препятствовать связыванию антитела МКА ra170 с IL33R. Если есть вымещение анализируемого антитела антителом МКА ra170 по меньшей мере на 15%, то эпитопы находятся в непосредственной близости.

Термин «вариабельный домен» (вариабельный домен легкой цепи (V_L), вариабельный домен тяжелой цепи (V_H)), используемый в данном документе, означает пару из легкой и тяжелой цепей, которая непосредственно участвует в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельной легкой и тяжелой цепей имеют одинаковые общие структуры, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (framework region, FR), последовательности которых в значительной степени консервативны, соединенные тремя «гипервариабельными участками» (или участками, определяющими комплементарность, CDR). Каркасные участки принимают конформацию β-листа, и CDR могут образовывать петли, связывающие структуру β-листа. CDR в каждой цепи удерживаются в их трехмерной структуре с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий участок. CDR3-участки тяжелой и легкой цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности связывания/аффинности антител в соответствии с изобретением и, следовательно, обеспечивают дальнейший предмет изобретения.

Термин «антигенсвязывающая часть антитела», используемый в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Антигенсвязывающая часть антитела содержит аминокислотные остатки из «участков, определяющих комплементарность», или «CDR». «Каркасными участками», или «FR», являются те участки вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельных участков, определенных здесь. Таким образом, вариабельные домены легких и тяжелых цепей антитела содержат от N-конца к C-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В частности, CDR3 тяжелой цепи является участком, который вносит наибольший вклад в связывание антигена и определяет свойства антитела. Области CDR и FR определены в соответствии со стандартной системой определения Кабата, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или этими остатками из «гипервариабельной петли».

Термин «аминокислота», используемый в данной заявке, обозначает группу природных карбокси-α-аминокислот, включающую аланин (трехбуквенный код: Ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (Ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серин (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Термины «нуклеиновая кислота» или «нуклеиновокислотная молекула», используемые в данном документе, включают молекулы ДНК и молекулы РНК. Нуклеиновокислотная молекула может быть одноцепочечной или двуцепочечной, но предпочтительной является двуцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой нуклеиновой кислотой. Например, ДНК предпоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется как пребелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы облегчить трансляцию. Как правило, «функционально связаны» означает, что последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторного лидера, смежными и в одной рамке считывания. Тем не менее, энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования на подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов не существует, то в соответствии с обычной практикой используются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры. Используемые в данном документе выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичную клетку-объект и культуры, полученные из нее, независимо от количества переносов. Также понятно, что все потомство может не быть точно идентичным по содержанию ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Подразумевается вариантное потомство, которое имеет такие же функции или биологическую активность, как и у исходной трансформированной клетки.

«Fc-часть» антитела непосредственно не вовлечена в связывание антитела с антигеном, но демонстрирует различные эффекторные функции. «Fc-часть антитела» является термином, хорошо известным специалистам, и определяется на основе расщепления антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины делятся на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ и IgG₄, IgA₁ и IgA₂. В соответствии с константными областями тяжелой цепи различные классы иммуноглобулинов называются α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Fc-часть антитела непосредственно участвует в ADCC (антителозависимой клеточной цитотоксичности) и CDC (комплементзависимой цитотоксичности) на основе активации комплемента, C1q-связывании и Fc-рецепторном связывании. Активация комплемента (CDC) начинается при связывании фактора комплемента C1q с Fc-частью большинства подклассов IgG-антител. В то время как влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с C1q вызвано определенными сайтами связывания в Fc-части. Такие сайты связывания Fc-части известны в данной области и описаны, например, Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0307434. Такими сайтами связывания являются, например, L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация в соответствии с EU индексом Кабата, Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Антитела подклассов IgG₁, IgG₂ и IgG₃ обычно демонстрируют активацию комплемента и C1q-связывание, в то время как IgG₄ не активируют систему комплемента и не связывают C1q.

Антитело в соответствии с изобретением содержит Fc-часть человеческого происхождения, которая является Fc-частью человеческого антитела подкласса IgG₁ или IgG₄. Для Fc-части антитела в соответствии с изобретением предпочтительно не может быть обнаружено C1q-связывание, как определено ниже.

Таким образом, изобретение включает антитело в соответствии с изобретением, при этом указанное антитело связывает IL33R, содержит Fc-часть человеческого происхождения и не связывает человеческий фактор комплемента C1q и, следовательно, не имеет CDC-эффекторной функции.

Предпочтительно антитело в соответствии с изобретением находится в связи с Fcγ-рецепторным связыванием человеческих подклассов IgG₁ или IgG₂ с мутацией L234, L235 и/или D265 и/или содержит мутацию PVA236. Предпочтительными являются мутации L234A, L235A, L235E и/или PVA236 (PVA236 означает, что аминокислотная последовательность ELLG (данная в однобуквенном аминокислотном коде) из аминокислотных позиций 233-236 из IgG₁ или IgG₄ из EFLG заменяется на PVA). Таким образом, данное изобретение относится к антителу в соответствии с изобретением, при этом указанное антитело представляет собой человеческое антитело подкласса IgG₁, содержащее по меньшей мере одну мутацию из L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и/или Р329. В одном воплощении антитело представляет собой человеческое антитело. В другом воплощении антитело представляет собой гуманизированное антитело. В одном воплощении данное изобретение относится к антителу в соответствии с изобретением, содержащему Fc-часть человеческого происхождения, при этом указанное антитело представляет собой человеческое антитело подкласса IgG₁, содержащее по меньшей мере одну мутацию из L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331, и связывается с IL33R со значением K_D менее 10^-8 М в анализе BIAcore. В другом воплощении диапазон K_D составляет от 10^-11 до 10^-9 М.

C1q-связывание может быть измерено в соответствии с Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184. Отсутствие C1q-связывания в соответствии с изобретением характеризуется тем, что если в таком анализе планшет ELISA покрыт различными концентрациями антитела, то добавляется человеческий C1q. Связывание C1q обнаруживается с помощью антитела, направленного против человеческого C1q с последующим обнаружением меченного пероксидазой конъюгата с помощью пероксидазного субстрата ABTS® (2,2′-азино-ди-[3-этилбензтиазолинсульфонат]). Отсутствие C1q-связывания в соответствии с изобретением не будет обнаружено, если оптическая плотность (OD) при 405 нм составляет для анализируемого антитела менее 0,05 при концентрации антитела 10 м кг/мл.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно характеризуется тем, что константные цепи имеют человеческое происхождение. Такие константные цепи хорошо известны в данной области и описаны, например, Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); и Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Например, используемая человеческая константная область тяжелой цепи включает SEQ ID №10, 11 или 29. Например, используемая человеческая константная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи из SEQ ID №12 или 34.

Еще одно воплощение данного изобретения относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей тяжелую и легкую цепи антитела в соответствии с изобретением.

Изобретение относится к способу лечения пациента, нуждающегося в терапии, который характеризуется введением пациенту терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с изобретением. Изобретение относится к применению антитела в соответствии с изобретением в терапии. Изобретение относится к применению антитела в соответствии с изобретением для получения лекарственного средства для профилактики и лечения особенно воспалительных заболеваний. Изобретение относится к применению антитела в соответствии с изобретением для лечения воспалительных заболеваний, предпочтительно для лечения ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита и астмы.

Кроме того антитела в соответствии с изобретением включают такие антитела с «модификациями консервативных последовательностей» (вариантные антитела), у которых модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей не влияют или не изменяют вышеуказанные характеристики антитела в соответствии с изобретением. Модификации могут быть введены стандартными методиками, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают те, при которых аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток со сходной боковой цепью. В данной области были выявлены семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный заменимый аминокислотный остаток в человеческом анти-IL33R-антителе предпочтительно может быть заменен другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. «Вариантное» анти-IL33R-антитело относится, таким образом, к молекуле, аминокислотная последовательность которой отличается от аминокислотной последовательности «родительского» анти-IL33R-антитела менее чем на десять, предпочтительно от двух до пяти, добавлений, удалений и/или замен в одной или более чем одной вариабельной области родительского антитела. Аминокислотные замены могут быть выполнены путем мутагенеза на основе молекулярного моделирования, как описано в Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 и Queen, С., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033.

Другое воплощение изобретения относится к способу получения антитела против IL33R, которое не связывается с Fcγ-рецептором и/или C1q, характеризующемуся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь человеческого антитела IgG₁-типа, связывающегося с IL33R, модифицирована таким образом, что указанное модифицированное антитело не связывается с C1q и/или Fc-рецептором, при этом указанная модифицированная нуклеиновая кислота и нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь указанного антитела, встраиваются в экспрессионный вектор, причем указанный вектор вводят в эукариотическую клетку-хозяина, закодированный белок экспрессируют и извлекают из клетки-хозяина или супернатанта.

Идентичность или гомология по отношению к последовательности определяется в данном документе как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которая идентична родительской последовательности после выравнивания последовательностей и введения пробелов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Никакие N-концевые, C-концевые или внутренние удлинения, делеции или вставки в последовательность антитела не должны быть истолкованы как влияющие на идентичность или гомологию последовательностей. Вариант сохраняет способность к связыванию человеческого IL33R и предпочтительно имеет свойства, превосходящие таковые у родительского антитела. Например, вариант может иметь уменьшенные побочные эффекты во время лечения.

«Родительское» антитело содержит CDR-области антитела ra170 и предпочтительно используется для изготовления варианта. Предпочтительно родительское антитело имеет человеческую каркасную область и, если она присутствует, константную область человеческого антитела или константные домены человеческого антитела. Например, родительское антитело может быть гуманизированным или человеческим антителом.

Антитела в соответствии с изобретением предпочтительно получают рекомбинантными способами. Такие способы широко известны в данной области и включают экспрессию белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и, как правило, его очистку до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, вставляют в экспрессионные векторы с помощью стандартных способов. Экспрессия осуществляется в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, таких как клетки СНО, клетки NS0, клетки SP2/0, клетки HEK293, клетки COS, дрожжи или клетки Е.coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или после лизиса клеток). Рекомбинантная продукция антител хорошо известна в данной области и описана, например, в обзорных статьях Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880. Антитела могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически чистой форме. Очистку проводят с целью устранения других клеточных компонентов или других примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методик, включая колоночную хроматографию и другие методики, хорошо известные в данной области. См. Ausubel, F., et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Экспрессия в клетках NS0 описана, например, в Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Временная экспрессия описана, например, в Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Клонирование вариабельных доменов описано в Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L, et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Предпочтительная система временной экспрессии (HEK293), описана в Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83, и Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199. Моноклональные антитела соответствующим образом выделяют из культуральной среды традиционными способами очистки иммуноглобулинов, например, с помощью белок А-сефарозы, гидроксилапатита, гель-электрофореза, диализа или аффинной хроматографии. ДНК и РНК, кодирующие моноклональные антитела, легко выделить и секвенировать с помощью стандартных процедур. Клетки гибридомы могут служить в качестве источника таких ДНК и РНК. После выделения ДНК может быть вставлена в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки HEK293, клетки СНО или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для получения синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.

Варианты аминокислотной последовательности человеческого IL33R-антитела получают путем введения соответствующих нуклеотидных замен в ДНК, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Тем не менее, такие модификации могут быть выполнены лишь в очень ограниченном диапазоне, например как описано выше. Например, модификации не изменяют вышеупомянутые характеристики антитела, такие как изотип IgG и эпитоп связывания, но могут улучшить выход рекомбинантной продукции, стабильность белка или облегчить очистку. Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации анти-IL33R-антитела, также может быть замещен, как правило, серином, для улучшения стабильности молекулы к окислению и предотвращения аберрантного сшивания. С другой стороны, в антитело может быть добавлена цистеиновая связь(и) для повышения его стабильности (особенно тогда, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент). Другой тип аминокислотного варианта антитела изменяет исходный характер гликозилирования антитела. Под «изменением» понимается удаление одной или более чем одной углеводной группировки, находящейся в антителе, и/или добавление одного или более чем одного сайта гликозилирования, не присутствующего в антителе. Гликозилирование антител, как правило, является N-связанным. Понятие «N-связанный» относится к присоединению углеводной группировки к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х обозначает любую аминокислоту кроме пролина, являются последовательностями распознавания для ферментативного присоединения углеводной группировки к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности так, чтобы она содержала одну или более чем одну из вышеуказанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования).

Нуклеиновокислотные молекулы, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей анти-IL33R-антитела, получают различными способами, известными в данной области. Эти способы включают, но не ограничиваясь ими, выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотной последовательности) или изготовление путем олигонуклеотид-опосредованного (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученного варианта или невариантной версии гуманизированного анти-IL33R-антитела.

Другой тип ковалентной модификации антитела включает связывание антитела с одним из множества небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, способом, описанным в патентах US 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192; 4179337.

Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей в соответствии с изобретением комбинируют с последовательностью промотора, инициации трансляции, константной области, 3′-нетранслируемой области, полиаденилирования и терминации транскрипции, чтобы сформировать конструкции экспрессионных векторов. Эксперссионные конструкции тяжелых и легких цепей могут быть объединены в один вектор, совместно трансфицированы, поочередно трансфицированы или отдельно трансфицированы в клетки-хозяева, которые затем сливаются, формируя одну клетку-хозяина, экспрессирующую обе цепи.

В другом аспекте данное изобретение относится к композиции, например, фармацевтической композиции, содержащей одно из или комбинацию моноклональных антител в соответствии с изобретением или их антигенсвязывающих частей, собранных в состав вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию/рассасывание агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель пригоден для инъекций или инфузий. Композицию в соответствии с данным изобретением можно вводить различными способами, известными в данной области. Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от желаемых результатов. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. Помимо воды, носитель может быть, например, изотоническим буферизованным солевым раствором. Вне зависимости от выбранного пути введения соединения данного изобретения, которые могут быть использованы в соответствующей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции в соответствии с изобретением готовят в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм обычными способами, известными специалистам в данной области. Фактические уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях в соответствии с изобретением можно варьировать так, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения желаемого терапевтического ответа у конкретного пациента, композиции и способа введения, и при этом не токсично для пациента (эффективное количество). Выбранный уровень дозировки будет зависеть от различных фармакокинетических факторов, включающих активность конкретных композиций данного изобретения, или сложного эфира, соли или амида, от пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного применяемого соединения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, используемых в сочетании с конкретными используемыми композициями, от возраста, пола, массы тела, состояния, общего состояния здоровья и истории болезни пациента, подлежащего лечению, и тому подобных факторов, хорошо известных в медицине.

Изобретение включает применение антител в соответствии с изобретением для лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы.

Другим воплощением данного изобретения является применение анти-IL33R-антитела, предпочтительно антитела в соответствии с изобретением, для лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, при этом указанный пациент умеренно реагирует или не реагирует на лечение TNF-антагонистом, анти-CD20-антителом, CTLA4Ig или анти-IL-6-антителом. Другим воплощением данного изобретения является применение анти-IL33R-антитела, предпочтительно антитела в соответствии с изобретением, для производства лекарственного средства для лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы.

Кроме того, изобретение относится к способу изготовления фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество антитела в соответствии с изобретением вместе с фармацевтически приемлемым носителем, и применение антитела в соответствии с изобретением для такого способа. Кроме того, изобретение относится к применению антитела в соответствии с изобретением в количестве, эффективном для изготовления фармацевтического агента, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, для лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы. Изобретение также относится к применению антитела в соответствии с изобретением в количестве, эффективном для изготовления фармацевтического агента, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, для лечения пациента, страдающего от ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы.

Описание последовательностей

SEQ ID №1 CDR3 тяжелой цепи, МКА ra170

SEQ ID №2 CDR2 тяжелой цепи, МКА ra170

SEQ ID №3 CDR1 тяжелой цепи, МКА ra170

SEQ ID №4 CDR3 легкой цепи, МКА ra170

SEQ ID №5 CDR2 легкой цепи, МКА ra170

SEQ ID №6 CDR1 легкой цепи, МКА ra170

SEQ ID №7 вариабельный домен тяжелой цепи, МКА ra170

SEQ ID №8 вариабельный домен легкой цепи, МКА ra170

SEQ ID №9 константная область человеческой тяжелой цепи γ1 с мутациями L234A и L235A (европейский аллотип)

SEQ ID №10 константная область человеческой тяжелой цепи γ1 (европейский аллотип)

SEQ ID №11 константная область человеческой тяжелой цепи γ1 (американский аллотип)

SEQ ID №12 константная область человеческой легкой κ-цепи

SEQ ID №13 замещенный фрагмент ST2-последовательности 1 для mut1

SEQ ID №14 замещенный фрагмент ST2-последовательности 2 для mut1

SEQ ID №15 замещенный фрагмент ST2-последовательности 3 для mut1

SEQ ID №16 замещенный фрагмент ST2-последовательности 4 для mut1

SEQ ID №17 IL-1R-фрагмент 1 mut1, замещающий фрагмент ST2 SEQ13

SEQ ID №18 IL-1R-фрагмент 2 mut2, замещающий фрагмент ST2 SEQ14

SEQ ID №19 IL-1R-фрагмент 3 mut3, замещающий фрагмент ST2 SEQ15

SEQ ID №20 IL-1R-фрагмент 4 mut4, замещающий фрагмент ST2 SEQ16

SEQ ID №21 вариабельный домен тяжелой цепи, гуманизированное ra170 11.12 (VH11)

SEQ ID №22 CDR1 тяжелой цепи, МКА ra170 11.12

SEQ ID №23 CDR2 тяжелой цепи, МКА ra170 11.12

SEQ ID №24 CDR3 тяжелой цепи, МКА ra170 11.12

SEQ ID №25 вариабельный домен тяжелой цепи, гуманизированное ra170 10.12 (VH10)

SEQ ID №26 CDR1 тяжелой цепи, МКА ra170 10.12

SEQ ID №27 CDR2 тяжелой цепи, МКА ra170 10.12

SEQ ID №28 CDR3 тяжелой цепи, МКА ra170 10.12

SEQ ID №29 главная цепь SPLE человеческого IgG₄ (константная область человеческой тяжелой цепи γ4 с мутациями L235E и S228P)

SEQ ID №30 вариабельный домен легкой цепи, гуманизированное ra170 (11.12 и 10.12)

SEQ ID №31 CDR1 легкой цепи, МКА ra170 10.12 и 11.12

SEQ ID №32 CDR2 легкой цепи, МКА ra170 10.12 и 11.12

SEQ ID №33 CDR3 легкой цепи, МКА ra170 10.12 и 11.12

SEQ ID №34 человеческая главная каппа-цепь

Примеры

Пример 1

Иммунизация

Для иммунизации использовали новозеландских белых кроликов дикого типа (NZW) (Oryctolagus cuniculus) от Charles River Laboratories International, Inc. Их размещали и содержали в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию и Ассоциации оценки и аккредитации ухода за лабораторными животными (Германия, Европа).

Очищенную NS0-производную секретируемую растворимую форму человеческого IL-33R, слитого с Fc-областью человеческого IgG, растворяли в NaCl-гистидиновом буфере с рН 6,1 в концентрации 1 мг/мл и смешивали (1:1) с полным адъювантом Фрейнда (CFA, complete Freund′s adjuvant) до получения стабильной эмульсии. Три кролика получали внутрикожную (i.d.) инъекцию 2 мл эмульсии с последующей второй внутримышечной (i.m.) и третьей подкожной (s.c.) инъекцией, каждая по 1 мл, с интервалом в одну неделю. Четвертую внутримышечную инъекцию 1 мл проводили через две недели с последующими двумя другими подкожными инъекциями 1 мл с интервалом в четыре недели. 10 мл образцов периферической цельной крови от каждого животного собирали через 4-6 дней после третьей, четвертой, пятой и шестой инъекции и использовали для сортировки отдельных клеток в FACS. Одновременно собирали дополнительные 0,5 мл сыворотки от каждого животного и использовали их для характеризации IL33R-специфического антительного ответа.

Антительный ответ

Антительный ответ на иммунизацию определяли посредством серийных разведении сывороток с использованием IL33R-специфического ELISA, при котором 96-луночные микротитровальные планшеты MaxiSorp покрывали 0,3 мкг/мл белка rhIL33R в карбонатном буфере в течение 1 ч при 37°С. Затем лунки блокировали PBS с добавлением 1% Crotein С (Roche Diagnostics GmbH, DE) в течение ночи при 4°С. Для детекции использовали козий противокроличий IgG, связанный с пероксидазой хрена (Jackson Laboratory), с разведением 1:16000. Субстрат ВМ Blue POD Substrat, преципитирующий тетраметилбензидин (ТМВ), готовый к употреблению раствор от Roche Diagnostics GmbH, DE, использовали для визуализации. Реакцию останавливали с помощью 1N HCl и измеряли в Tecan Infinite при 450/690 нм.

Описание выбора антитела

Стерильные клеточные культуральные 6-луночные планшеты покрывали 2 мкг/мл белка IL33R в карбонатном буфере (0,1 М бикарбонат натрия, 34 мМ гидрокарбонат натрия, рН 9,55) в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали стерильным PBS три раза перед применением. Кроличью цельную кровь, содержащую EDTA, разбавляли в два раза с помощью 1× PBS и затем центрифугировали в градиенте плотности на лимфоциты млекопитающих (Cedarlane Laboratories), чтобы выделить кроличьи РВМС. РВМС дважды промывали перед окрашиванием антителами.

Среда EL-4 B5

RPMI 1640 с добавлением 10% FCS (Hyclone, Логан, Юта, США), 2 мМ глутамина, 1% раствора пенициллина/стрептомицина, 2 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 0,05 мМ бета-меркаптоэтанола.

Извлечение макрофагов/моноцитов

Стерильные 6-луночные планшеты (cell culture grade, соответствующего качества для культивирования клеток) использовали для извлечения макрофагов и моноцитов путем неспецифической адгезии. В каждую лунку вносили максимум 4 мл среды и до 6×10⁶ мононуклеарных клеток периферической крови от иммунизированных кроликов и давали им связаться в течение 1 ч при 37°С в инкубаторе. 50% клеток в супернатанте использовали для этапа панорамирования, а остальные 50% клеток держали на льду до иммунофлуоресцентного окрашивания.

Обогащение В-клеток белком IL33R

В 6-луночные планшеты для культивирования тканей, покрытые белком IL33R, высевали до 6×10⁶ клеток в 4 мл среды и оставляли для связывания на 1 ч при 37°С в инкубаторе. После этапа обогащения белком IL33R неприкрепившиеся клетки удаляли, осторожно промывая лунки 1-2 раза 1× PBS. Остальные прикрепившиеся клетки снимали трипсином в течение 10 мин при 37°С в инкубаторе, а затем дважды промывали средой. Клетки держали на льду до иммунофлуоресцентного окрашивания.

Иммунофлуоресцентное окрашивание и проточная цитометрия

Противокроличьи IgG FITC, используемые для сортировки отдельных клеток, были получены от AbD Serotec (STAR121F, Дюссельдорф, Германия). Для поверхностного окрашивания клетки после этапа истощения и панорамирования инкубировали с оптимально разведенным противокроличьим IgG FITC-антителом в PBS в течение 30 мин, при покачивании в холодном помещении при 4°С в темноте. После центрифугирования супернатант удаляли путем аспирации. РВМС подвергали 2 циклам центрифугирования и промывки ледяным PBS. Наконец, РВМС ресуспендировали в ледяном PBS и сразу подвергали анализу FACS. Пропидия иодид в концентрации 5 мкг/мл (BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, США) добавляли перед FACS-анализом для различения живых и мертвых клеток. Becton Dickinson FACSAria™, оснащенный компьютером и программным обеспечением FACSDiva™ (BD Biosciences, США), использовали для сбора и анализа данных.

B-клеточная культура

B-клеточные культуры получали способом, аналогичным тому, который описан Zubler, et al., Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363, Zubler, et al., J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183. Вкратце, отдельно сортированные клетки культивировали в 96-луночных планшетах с 210 мкл/лунка среды с клетками Pansorbin® Cells (1:20000) (Calbiochem (Merck), (Дармштадт, Германия), 5% супернатантом кроличьих тимоцитов (20080910, производство Irmgard Thorey) и гамма-облученными мышиными клетках тимомы EL-4-B5 (2×10⁴/лунка) в течение 7 дней при 37°С в атмосфере с 5% CO₂ в инкубаторе. B-клеточные культуральные супернатанты удаляли для скрининга, и клетки немедленно собирали для получения гена вариабельной области или замораживали при -80°С в 100 мкл буфера RLT (Qiagen, Хильден, Германия).

Выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК)

Клетки, из которых должна быть изолирована РНК, сначала осаждали центрифугированием. Клеточный осадок лизировали добавлением 100 мкл RLT-буфера с 10 мкл/мл бета-меркаптоэтанола. Клетки ресуспендировали несколькими перемешиваниями с помощью пипетки и переносили в многолуночный планшет. Планшет быстро центрифугировали при 200д и замораживали при -20°С. Выделение РНК проводили с помощью набора NucleoSpin® 96 RNA (Macherey & Nagel) в соответствии с инструкциями производителя.

Обратно-транскрипционная полимеразная цепная реакция

Обратную транскрипцию проводили с помощью Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью AccuPrime Pfx SuperMix (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи амплифицировали в отдельных реакциях. Использовали ПЦР-праймеры, которые на 25 п.о. перекрывались с векторами, экспрессирующими целевые антитела. ПЦР-продукты очищали с помощью набора NucleoSpin® 96 Extract II (Macherey & Nagel).

Секвенирование и SLIC-клонирование

Продукты ПЦР секвенировали для определения ДНК-последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. ПЦР-продукты клонировали в экспрессионные вектора путем так называемой методики SLIC-клонирования, которая описана Haun, R.S., et al. в BioTechniques 13 (1992) pp.515-518 и Li, M.Z., et al. в Nature Methods 4 (2007) pp.251-256. Плазмиды для экспрессии антитела линеаризовали путем расщепления рестрикционным ферментом. Линеаризованную плазмиду очищали путем препаративного электрофореза в агарозном геле и экстрагировали из геля (набор Qiaquick Gel Extraction Kit/Qiagen). Очищенные плазмиды вводили в ПЦР-протокол, используя праймеры, перекрывающиеся (перекрытие 25 п.о.) с ПЦР-продуктом, который необходимо клонировать. И вектор, и вставку обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 (Roche Applied Sciences) в отсутствие дНТФ для создания свисающих краев, затем вектор и вставку инкубировали с белком RecA (New England Biolabs) и АТФ для стимуляции рекомбинации. Продуктами трансформировали Е.coli. Плазмидные ДНК для легкой цепи и тяжелой цепи изолировали, и все пары объединяли для временных трансфекций.

Временная трансфекция для экспрессии антитела в клетках HEK293

Клетки HEK293 (Invitrogen) выращивали в F17-средах (Gibco) в 1×10⁶ клеток/мл. 2×10⁶ HEK293-клеток трансфицировали 1 мкг плазмид НС+LC, суспендированных в 293-free (Novagen) и OptiMEM® (Gibco). Через 7 дней инкубации супернатанты собирали и анализировали.

Антитела в соответствии с изобретением демонстрируют высокое качество на основании ингибирования IL33-индуцированной активации NFkB в человеческих клетках UT-7. Предпочтительно антитела в соответствии с изобретением демонстрируют значение IC₅₀, равное 0,05 нМ или ниже, и более предпочтительно 0,03 нМ или ниже. Кроме того, антитела в соответствии с изобретением демонстрируют ценные свойства при сочетании анализа эозинофилов, анализа тучных клеток, анализа базофилов (KU812) и анализа ТН₂. Было обнаружено, что антитела, которые демонстрируют ингибирование IL33-индуцированной активации NFkB в человеческих UT-7 клетках со значением IC₅₀, равным 0,05 нМ или ниже, и более предпочтительно 0,03 нМ или ниже, будут иметь особенно полезные свойства для лечения ревматоидного артрита, язвенного колита и астмы. Более предпочтительными являются антитела, демонстрирующие значения IC₅₀ 5 нМ или ниже в анализе эозинофилов, анализе тучных клеток, анализе ТН₂, анализе базофилов (IL-5).

Пример 2

Ингибирование связывания IL33 с ST2 (ELISA)

Испытание проводили в 384-луночных микротитровальных планшетах MaxiSorp™ (Sigma-Aldrich, Nunc., Германия, кат. №464718) при комнатной температуре. После каждого этапа инкубации планшеты промывали 3 раза PBST (фосфатно-солевым буфером Tween®-20). В начале планшеты покрывали 1 мкг/мл козьего противочеловеческого IgG Fc-фрагмента (Jackson Imm. Res., США, кат. №109-006-170) в течение по меньшей мере 2 часов (ч). Затем лунки блокировали с помощью PBS с 0,1% Tween®-20 и 2% BSA (Roche Diagnostics GmbH, Германия) в течение 1 ч. Захват 60 нг/мл рекомбинантной человеческой ST2/IL-1R4 Fc-химеры (R&D Systems, Великобритания, кат. №523-ST) или рекомбинантной собачьей ST2 Fc-химеры осуществлялся в течение 1 ч. Разведения очищенных антител или супернатантов из гибридом/В-клеток в PBS с 0,5% BSA и 0,05% Tween®-20 инкубировали с рецепторным белком в течение 1 ч. Биотинилированный человеческий IL33 (PeproTech, США, кат. №500-Р261) добавляли еще на один час для создания комплекса. IL33 биотинилировали сульфо-NHS-LC-биотином (Thermo Scientific Pierce, США, кат. №21327) в соответствии с протоколом производителя и очищали с использованием колонки Zeba™ Desalt Spin Column (Thermo Scientific Pierce, США, кат. №89889). Связывание биотинилированного IL33 с комплексом обнаруживали с помощью разведенной 1:4000 стрептавидин-HRP (Roche Diagnostics GmbH, Германия, кат. №11089153001). Через 1 ч планшеты промывали 6 раз PBST и обрабатывали свежеприготовленным раствором ВМ blue POD (BM blue: 3,3′-5,5′-тетраметилбензидин, Roche Diagnostics GmbH, Германия, кат. №11484281001) в течение 12 минут при комнатной температуре. Абсорбцию измеряли при 370 нм. Отрицательный контроль определяли без добавления белка ST2/IL-1R4, а положительный контроль определяли со всеми компонентами, но без антитела.

Антитело ra170 демонстрирует значение IC₅₀, равное 0,32 нМ, при ингибировании связывания человеческого ST2, и 0,13 нМ при ингибировании связывания ST2 макаки.

Пример 3

Определение аффинности анти-hST2-антител к человеческому ST2 ECD (His-Avitag мономер)

Инструмент: BIACORE® T100

Чип: СМ4 (GE Healthcare BR-1005-34)

Соединение: аминное связывание

Буфер: 10 мМ фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,05% Tween-20 (PBST), pH 7,4, 37°С

Для измерения аффинности 10 мкг/мл козьего противочеловеческого Fcg-антитела (Jackson Imm. Res., США, кат. №115-005-098) связывали с поверхностью чипа для захвата антител, связывающихся с ST2. Мономер человеческого ST2 ECD с 6His Avitag™ (Avidity, LLC, США) добавляли в различных концентрациях в растворе. Ассоциацию измеряли путем введения ST2 ECD на время контакта 120 секунд (кинетика в течение одного цикла) при 37°С; диссоциацию измеряли путем промывания поверхности чипа буфером в течение 1800 сек при 37°С. Для расчета кажущейся K_D и других кинетических параметров использовали модель Ленгмюра 1:1. Результаты (среднее из двух измерений) показаны в таблице 1.

Таблица 1
Средние данные об аффинности, измеренные путем SPR (BIACORE Т100) в 10 мМ PBST при 37°С, pH 7,4
Антитело	каж. KD (M)	ka (1/Мс)	kd (1/с)	t1/2 (мин)
ra170 IgG4 SPLE	2,7×10-12	4,6×106	1,3×10-5	881
ra170 10, 12	1,1×10-09	4,9×106	5,1×10-3	2
ra170 11, 12	1,4×10-10	3,1×106	4,3×10-4	27

Пример 4

Ингибирование IL33-индуцированной активации NFkB в человеческих клетках UT-7

а) Реагенты:

Клеточная линия UT-7 (DSMZ № АСС 137)

Культуральная среда: RPMI1640 (Gibco №10509-24) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Gibco №25030), 1,0 мМ пирувата натрия (Gibco №11360-039), 0,1 мМ NEAA (Gibco №11140-035), 10% FCS (Gibco №10509-24), 10 единиц/мл rhGM-CSF (Roche №11115138)

Рекомбинантный человеческий IL-33 (PeproTech №200-33)

Пара антител PathScan® Phospho-NFkB p65 (Ser536) Sandwich ELISA Antibody Pair (Cell Signaling №7834)

буфера для лизиса PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (Cell Signaling №7018)

rhTNFalpha (Roche Applied Sci №11371843)

б) Процедура:

Клетки UT-7 выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 1,0 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ NEAA, 10% FCS и 10 единиц/мл GM-CSF в смеси 7% CO₂/95% воздуха при 37°С. Клетки пересевали, когда они достигали плотности примерно 1×10⁶ клеток/мл и разводили до плотности 2×10⁵ клеток/мл. Клетки использовали для анализа NFkB через 2 дня после пассажа. Для определения эффективной концентрации IL33 клетки UT-7 высевали в 96-луночный полипропиленовый планшет для культивирования клеток (8,0×10⁵ клеток/лунка в общем объеме 220 мкл ростовой среды) и стимулировали различными концентрациями рекомбинантного человеческого IL-33 (0,1-10 нг/мл) в течение 15 мин при 37°С. Затем планшеты центрифугировали, промывали ледяным PBS и снова центрифугировали. PBS удаляли, и в каждую лунку вносили 60 мкл лизирующего буфера PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer. Клетки инкубировали слизирующим буфером в течение 15 мин на льду. Лизаты осветляли путем центрифугирования и собирали супернатанты. Лизаты хранили при -80°С до определения NFkB-активации с помощью PathScan® Phospho-NF-kB p65 ELISA. ELISA проводили в соответствии с инструкциями изготовителя. Данные показали, что стимуляция активации NFkB была оптимальной при 1 нг/мл IL33. Для тестирования антитела клетки UT7 высевали в 96-луночный полипропиленовый планшет для культивирования клеток (8,0×10⁵ клеток/лунка) и инкубировали с различными концентрациями антитела (конечная концентрация 0,15 нг/мл - 300 нг/мл) в общем объеме ростовой среды 220 мкл. Клетки инкубировали с антителами в течение 1 ч на льду. Затем клетки стимулировали rhIL-33 (конечная концентрация 1 нг/мл) в течение 15 мин при 37°С. В качестве контроля определяли максимальную NFkB-активацию клеток UT7 путем инкубации клеток UT7 с TNF-альфа (30 нг/мл) в течение 15 мин при 37°С. Приготовление лизата и анализ NFkB проводили, как описано выше. Результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2
Ингибирование IL-33-индуцированной активации NFkB в человеческих клетках UT-7
Антитело	NFkB IC50 [нМ]
ra170 (кроличий IgG1)	0,025
ra170 10, 12	0,28
ra170 11, 12	0,04
Mab5231	1,90
AF523 (PAB, козлиный IgG1)1	0,56
HB12 (мышиный IgG1)1	1,43
2A52	66,22
FB92	0,95
1: доступен от R&D Systems (http://www.rndsystems.com)
2: доступен от MBL International Corporation, номера для заказа: D065-3, D066-3, D067-3 и ABIN 130564

Пример 5

Определение сайта связывания для клона ra170

Для определения сайтов связывания антитела человеческий IL-33-рецептор ST2 клонировали и экспрессировали. ST2 состоит из 3 областей D1, D2, D3. Вследствие этого получали вариант D1D2 и анализировали остаточное связывание ra170. Ra170 связывается с ST2 и усеченным вариантом D1D2.

Связывание с ST2-вариантом измеряли в анализе поверхностного плазменного резонанса (SPR) с помощью инструмента BIAcore® T100 (GE Healthcare) при 25°С. Система BIAcore® хорошо известна для изучения взаимодействий молекул. SPR-технология основана на измерении показателя преломления вблизи поверхности покрытого золотом биосенсорного чипа. Изменения показателя преломления отражают изменения массы на поверхности, вызванные взаимодействием иммобилизованного лиганда с анализируемым веществом, введенным в растворе. Если молекулы связывают иммобилизованные лиганды на поверхности, масса увеличивается, в случае диссоциации масса уменьшается, отражая диссоциацию комплекса. SPR позволяет осуществлять в реальном времени непрерывный мониторинг связываний лиганда/анализируемого вещества и, следовательно, определять константы скорости ассоциации (k_a), константы скорости диссоциации (k_d) и константы равновесия (K_D). Введение концентраций с отдельными значениями дает четкое заявление о способностях связывания анализируемого вещества, а также позволяет грубо предположить значения связывания.

Аминное связывание примерно 8000 единиц резонанса (RU) из системы захвата (захват ST2-His-специфический Penta-His, Qiagen, кат. №34660) выполняли на чипе СМ5 при рН 5,0 с использованием набора для аминного связывания, поставляемого GE Healthcare.

Для анализа His-меченый ST2-вариант захватывали путем введения 300 нМ раствора в течение 1 мин со скоростью потока 30 мкл/мин. Затем антитело, подлежащее анализу, вводили в концентрации 100 нМ в течение 2 мин со скоростью потока 30 мкл/мин. Фазу диссоциации контролировали в течение периода до 1 мин и переключали с раствора образца на рабочий буфер. Поверхность регенерировали путем 30-секундного промывания раствором глицина с рН 2,0 со скоростью потока 30 мкл/мин.

Групповые разности показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности, связанной с пустой пробой. Инъекции с пустой пробой также вычитали (= двойной контроль).

ST2-вариант связывается с антителами в соответствии с изобретением сравнимо с ST2 дикого типа, и поэтому делается вывод, что сайт связывания расположен на домене D1D2.

Пример 6

Определение связывания анти-IL-33R-антитела с различными вариантами ST2

Связывание антитела в соответствии с изобретением с различными вариантами ST2 измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием инструмент BIAcore® А100 (GE Healthcare) при 37°С. Система BIAcore® хорошо известна для изучения взаимодействий молекул. SPR-технология основана на измерении показателя преломления вблизи поверхности покрытого золотом биосенсорного чипа. Изменения показателя преломления отражают изменения массы на поверхности, вызванные взаимодействием иммобилизованного лиганда с анализируемым веществом, введенным в растворе. Если молекулы связывают иммобилизованные лиганды на поверхности, масса увеличивается, в случае диссоциации масса уменьшается, отражая диссоциацию комплекса. SPR позволяет осуществлять в реальном времени непрерывный мониторинг связываний лиганда/анализируемого вещества и, следовательно, определять константы скорости ассоциации (k_a), константы скорости диссоциации (k_d) и константы равновесия (K_D).

Аминное связывание примерно 800 единиц резонанса (RU) системы захвата (захват mFcγ-специфического противомышиного Fcγ, Jackson Imm. Res., кат. № JIR115-005-071 и rbFcg-специфического противокроличьего Fcg, Jackson Imm. Res., кат. № JIR111-005-046) выполняли на чипе СМ5 при рН 5,0 с использованием набора для аминного связывания, поставляемого GE Healthcare.

Для анализа различные антитела захватывали путем введения 10 нМ раствора кроличьих антител и примерно 30 нМ раствора мышиных антител в течение 2 мин со скоростью потока 10 мкл/мин. Затем Mis-меченые варианты ST2, подлежащие анализу, вводили в серии разведении с максимальной концентрацией 150 нМ в течение 2,5 мин со скоростью потока 30 мкл/мин. Фазу диссоциации контролировали в течение периода до 10 мин и переключали с раствора образца на рабочий буфер. Поверхность с противомышиными антителами захвата регенерировали путем 60-секундного промывания раствором глицина с рН 1,5, а затем 60-секундного промывания раствором глицина с рН 2,0 в соответствии с протоколом к инструменту. Поверхность с противокроличьими антителами захвата регенерировали путем двух этапов 60-секундного промывания раствором глицина с pH 1,7.

Групповые разности показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности, связанной с пустой пробой. Инъекции с пустой пробой также вычитали (= двойной контроль).

Если ST2-вариант связывается с исследуемым антителом сравнимо с ST2 дикого типа, то вариация не влияет на связывание антитела с ST2, и делается вывод, что сайт связывания расположен вне мутированной ST2-области.

Если ST2-вариант не связывается с исследуемым антителом сравнимо с ST2 дикого типа, то вариация влияет на связывание антитела с ST2, и делается вывод, что сайт связывания расположен внутри мутированной ST2-области.

Связывающие свойства антител показаны в Таблице 3. Связывание Ra170 зависит от Mut2 и Mut3, что говорит о том, что его сайт связывания перекрывается с мутированными участками последовательности. Связывание Mab523 зависит от Mut2 и Mut3, а также от Mut4, что говорит о его более широкой области связывания.

Таблица 3
Связывание анти-IL-33R-антитела с различными вариантами ST2
Антитело	Связывание
Mut1	Mut2	Mut3	Mut4
Ra170	+	-	-	+
МАВ523	+	-	-	-

Таблица 4
ST2-мутанты
Мутант	Замещенный фрагмент ST2-последовательности	Фрагмент последовательности IL-1R, заменяющий фрагмент последовательности ST2
Mut1	SEQ ID №13	SEQ ID №17
Mut2	SEQ ID №14	SEQ ID №18
Mut3	SEQ ID №15	SEQ ID №19
Mut4	SEQ ID №16	SEQ ID №20

Пример 7

Анализ NK

IL33 усиливает как TH1-, так и T_H2-ответ, активизируя различные лейкоциты, а также NK-клетки (Smithgall, M.D., et al., Int. Immunol. 20 (2008) 1019-1030). В следующем далее анализе секрецию IFN-γ NK-клетками индуцировали путем совместного культивирования с IL12 и IL33, и ее ингибирование выступало как показатель в ходе характеризации анти-IL33R-антител.

После выделения белых клеток крови (лимфоцитов) из крови здоровых доноров NK-клетки очищали из РВМС с использованием набора negative NK cell isolation kit (Miltenyi, №130-092-657). В среднем чистота составляла более 96%.

Реагенты

- Человеческий IL-12 (Sigma, № I2276, конечная концентрация [f.c.] = 1 нг/мл)

- Человеческий IL-33 (Peprotech, №200-33, f.c. = 10 нг/мл)

- набор IFN-γСВА Flex set (BD, №558269)

- NK-клеточная среда: RPMI 1640 (PAN, № P04-17500) с добавлением 10% FCS (Invitrogen или РАА), 1% пирувата натрия (Gibco Invitrogen, №11360) и L-глутамина (Gibco Invitrogen, №25030-024), а также 0,1% бета-меркаптоэтанола (Gibco Invitrogen, №31350-010).

1×10⁵ NK-клеток/лунка высевали в 96-луночный плоскодонный планшет, возможно предварительно обработанный антителами-образцами или изотипическим контрольным антителом в различных концентрациях, и инкубировали в течение одного часа при 37°С. Затем NK-клетки стимулировали 10 нг/мл IL-33 и 1 нг/мл IL-12, и инкубировали в течение 20 часов. После этого супернатанты собирали, центрифугировали и анализировали на продукцию IFN-γ. Для количественной оценки IFN-γ использовали СВА flex set platform (BD™, с использованием FACS Canto II). Значение IC₅₀ было определено как 0,27 нМ для ra170, 1,3 нМ для ra170 10.12, 1,8 нМ для ra170 11.12, 2,3 нМ для РАВ AF523, а при Mab 523 ингибирование отсутствовало.

Пример 8

Анализ жизнеспособности эозинофилов

Для описания влияния IL-33 на увеличение выживаемости эозинофилов проводили анализ, основанный на Chow, J.Y., et al., Cellular & Molecular Immunology 7 (2010) 26-34, с использованием свежевыделенных эозинофилов. Так как жизнеспособность человеческих эозинофилов зависит от добавления IL-33, предварительная инкубация с противочеловеческими МКА к IL-33R [ST2] в различных концентрациях ингибирует этот эффект. Гранулоциты выделяли из цельной крови путем центрифугирования в градиенте Ficoll-Paque™ PLUS (GE Healthcare, №17-1440-03). После лизиса эритроцитов осадок осевших эритроцитов/гранулоцитов отбирали для очистки эозинофилов с помощью набора negative eosinophil cell isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, №130-092-010).

Реагенты:

- Человеческий IL-33 (20 нг/мл)

- Cell Titer Glo®, Luminescent Cell Viability Assay (Promega, №7571)

- эозинофильная клеточная среда: RPMI 1640 с добавлением FCS, 1% пирувата натрия, L-глутамина и 0,1% бета-меркаптоэтанола.

1×10⁵ эозинофилов/лунка переносили в 96-луночный плоскодонный планшет, затем добавляли среду, содержащую антитело-образец [конечная концентрация 5 мкг/мл] и инкубировали в течение одного часа при 37°С. Затем добавляли IL33 до конечной концентрации 20 нг/мл и инкубировали эозинофилы при 37°С в увлажненном инкубаторе. Через 40 часов определяли жизнеспособность эозинофилов. Для ra170 значение IC₅₀ составляло 1,3 нМ.

Пример 9

Первичный анализ тучных клеток

Тучные клетки играют центральную роль в развитии и поддержании аллергических реакций путем усиления как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа. Тучные клетки локализуются в тканях, а не в циркулирующей крови. Таким образом, чтобы получить тучные клеток человека из крови, CD34⁺-гемопоэтические клетки-предшественники подвергали дифференцировке в тучные клетки в присутствии человеческого фактора стволовых клеток (SCF), IL-3 и IL-6 в течение 5-6 недель. Следующий протокол основан на публикации Saito, H., et al., Nature Protocols 1 (2006), 2178-2183.

После выделения лейкоцитов (см. пример 10), CD34⁺-гемопоэтические клетки-предшественники выделяли из РВМС с помощью набора CD34 MicroBead (Miltenyi Biotec, №130-046-702). Средний выход составлял 1-2×10⁵ клеток на каждого донора; обычно получали 50% CD34⁺CD117⁺-клеток.

Реагенты и протокол дифференциации:

- Methocult® (Stem Cell Tech., № H4236)

- добавка инсулин-трансферрин-селен (Invitrogen, №51300-044)

- BSA, бычий сывороточный альбумин

- Человеческий SCF

- Человеческий IL-3 и IL-6

- среда Basic Mast Cell (bMC): IMDM (среда Исков, модифицированная Дульбекко) с добавлением 0,1% бета-меркаптоэтанола и 1% пенициллина/стрептомицина.

После очистки 1,5×10⁵ очищенных CD34⁺-клеток ресуспендировали в bMC-среде с добавлением IL-3, IL-6 и SCF, BSA, Methocult® и добавкой инсулин-трансферрин-селен, и высевали в 10-12 лунок 24-луночного планшета и культивировали в течение 5-6 недель.

Функциональный анализ тучных клеток

После фазы размножения и дифференцировки тучные клетки использовали в функциональном анализе антагонистического воздействия анти-IL33R-антител.

Реагенты и среда

- 20 нг/мл человеческого IL-33

- Человеческий IL-5

- Человеческий IL-13

- среда Basic Mast Cell.

10⁵ тучных клеток/лунка засеивали в 96-луночный плоскодонный планшет. Вначале тучные клетки предварительно обрабатывали антителами-образцами или контрольным изотипическим антителом в течение одного часа при 37°С. Для определения IC₅₀ использовали антитела в различных концентрациях, обычно начиная с f.c. 5 мкг/мл, и разводили поэтапно 1:3. Затем добавляли 20 нг/мл IL-33 и инкубировали клетки в течение примерно 40-48 часов при 37°С перед количественной оценкой (ингибирования) уровней T_H2-цитокинов. После инкубации в течение указанного времени суспензии клеток переносили в планшет с V-образным дном и осаждали (400 g, 10 мин при комнатной температуре). Затем супернатант использовали для определения уровней цитокинов (IL-5 и IL-13). Для ra170 значения IC₅₀ составляли до 0,4 нМ (IL-13) и 0,2 (IL-5).

Пример 10

Анализ человеческих Th2

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из крови здоровых доноров в градиенте плотности Ficoll Hypaque. После промывания клеток PBS, рН 7,2 с 2 мМ EDTA, клетки промывали один раз PBS, рН 7,2, с 0,5% BSA и 2 мМ EDTA. Наивные CD4⁺-T-клетки выделяли из РВМС с использованием набора CD4+ Т cell isolation kit II (Miltenyi Biotec) и магнитной сепарации. Обогащенные Т-клетки промывали 3 раза с помощью полной RPMI 1640 (с добавлением 10% FCS, 2-меркаптоэтанола, L-глутамина, пирувата натрия, заменимых аминокислот и пенициллина/стрептомицина), ресуспендировали и высевали с плотностью 0,5×10⁶ клеток/мл в 6-луночные плоскодонные планшеты, с соотношением 1:1 Dynabeads T-Activator CD3/CD28 (Invitrogen), 10 нг/мл IL-2, 10 нг/мл IL-4, 5 мкг/мл анти-IL-12 (R&D System) и 5 мкг/мл анти-IFNγ (R&D System), и инкубировали в течение 4 дней при температуре 37°С. Клетки разделяли, затем содержали в тех же условиях культивирования в течение еще 4 дней. Клетки промывали полной RPMI два раза, а затем оставляли с плотностью 1×10⁶ клеток/мл в полной RPMI с 2 нг/мл IL-2 на 3 дня. За день до анализа 96-луночные плоскодонные планшеты с высоким связыванием (Costar) покрывали 5 мкг/мл растворимого анти-CD3e (BD Bioscience). В день анализа клетки дважды промывали полной средой RPMI и оставляли еще на 4 часа без IL-2. Планшеты трижды промывали PBS. 1×10⁵ клеток/лунка высевали в полной среде RPMI, дополненной 1 мкг/мл анти-CD28 (BD Bioscience). Затем клетки обрабатывали серийно разведенным анти-ST2-антителом или контрольным изотипическим антителом (0-10 мкг/мл) в течение 30 мин, затем повторно стимулировали 10 нг/мл IL33 (Peprotech) в общем объеме 200 мкл, затем культивировали при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение 64 часов. Супернатанты собирали для ELISA на IL-5/IL-13 (R&D Systems). Для ra170 значение IC₅₀ было определено как 2,77±2,58 нм (среднее ± SD, n=6) для IL-5, и 1,10±1,05 (среднее ± SD, n=5) для IL-13.

Пример 11

Анализ NK-клеток макаки

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из макаки на градиенте плотности Ficoll Hypaque. После промывания клеток PBS, рН 7,2 с 2 мМ EDTA, клетки промывали один раз PBS, рН 7,2, с 0,5% BSA и 2 мМ EDTA. NK-клетки выделяли из РВМС, с последующей селекцией с помощью Microbeads с нечеловеческим CD56 приматов (Miltenyi Biotec) и магнитной сепарацией с помощью сепаратора AutoMACS™. Обогащенные NK-клетки промывали 3 раза с помощью полной RPMI 1640 (с добавлением 10% FCS, 2-меркаптоэтанола, L-глутамина, пирувата натрия, заменимых аминокислот и пенициллина/стрептомицина), ресуспендировали и высевали с плотностью 2,5×10⁴ клеток/мл в 96-луночные планшеты с круглым дном в полной RPMI. Клетки последовательно обрабатывали серийно разведенным анти-ST2-антителом или контрольным изотипическим антителом (0-10 мкг/мл) в течение 30 мин, затем повторно стимулировали 20 нг/мл человеческого IL33 плюс 10 нг/мл рекомбинантного IL12 макаки в общем объеме 200 мкл, затем культивировали при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение 24 часов. Супернатанты собирали для ELISA на IFNγ макаки (R&D Systems). Для ra170 значение IC₅₀ было определено как 0,109±0,073 нМ (среднее ± SD, n=3).

Пример 12

Анализ базофильной клеточной линии (KU812)

Человеческую базофильную клеточную линию KU812 (АТСС CRL 2099) культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и пенициллина/стрептомицина. Клетки разделяли два раза в неделю с плотностью клеток не более 0,5 млн клеток/мл. Контроль качества стандартно проводили путем FACS-анализа экспрессии на клеточной поверхности c-kit и FceRI. В день анализа клетки KU812 (0,2 млн клеток/лунка) засевали в 96-луночные круглодонные культуральные планшеты со свежей полной средой. Клетки обрабатывали серийными разведениями антител или контрольным изотипическим антителом в течение 1 часа при 37°С. После обработки клетки стимулировали 10 нг/мл IL-33 (Peprotech) в течение ночи при 37°С в инкубаторе. Клетки центрифугировали и супернатанты собирали для анализа цитокинов. Цитокины (IL-5, IL-13 и GM-CSF) анализировали после процедуры получения MSD. Для ra170 значения IC₅₀ из трех независимых экспериментов были определены как 3,49±3,43 нМ (среднее ± SD, IL-13), 1,48±0,75 нМ (среднее ± SD, IL-5) и 1,31±1,22 нМ (среднее ± SD, GM-CSF). Для ra170 IC₉₀ значения были определены как 7,51±0,99 нМ (среднее ± SD, IL-13), 4,60±1,65 нм (среднее ± SD, IL-5) и 9,10±4,74 нм (среднее ± SD, GM-CSF).

1. Антитело, связывающееся с человеческим IL33R, которое характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №1, CDR2-область из SEQ ID №2 и CDR1-область из SEQ ID №3, и тем, что вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №4, CDR2-область из SEQ ID №5 и CDR1-область из SEQ ID №6.

2. Антитело по п.1, которое характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №7.

3. Антитело по п.2, которое характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №7, а вариабельный домен легкой цепи содержит SEQ ID №8.

4. Антитело по п.3, которое характеризуется тем, что оно является химерным, гуманизированным или лишенным Т-клеточного эпитопа вариантом антитела.

5. Антитело по п.1, которое характеризуется тем, что оно является человеческим изотипом IgG₁ или IgG₄, модифицированным в шарнирной области в аминокислотной позиции 216-240 и/или во второй междоменной области в аминокислотной позиции 327-331 между C_H2 и C_H3.

6. Антитело, связывающееся с человеческим IL33R, которое характеризуется тем, что оно является гуманизированным вариантом, в котором вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №24, CDR2-область из SEQ ID №23 и CDR1-область из SEQ ID №22 и в котором вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №33, CDR2-область из SEQ ID №32 и CDR1-область из SEQ ID №31.

7. Антитело по п.6, которое характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №21.

8. Антитело по п.7, которое характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №21, а вариабельный домен легкой цепи содержит SEQ ID №30.

9. Антитело, связывающееся с человеческим IL33R, которое характеризуется тем, что оно является гуманизированным вариантом, в котором вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №28, CDR2-область из SEQ ID №27 и CDR1-область из SEQ ID №26 и в котором вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №33, CDR2-область из SEQ ID №32 и CDR1-область из SEQ ID №31.

10. Антитело по п.9, которое характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №25.

11. Антитело по п.10, которое характеризуется тем, что вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID №25, а вариабельный домен легкой цепи содержит SEQ ID №30.

12. Антитело по любому из пп.1-11, которое характеризуется содержанием мутаций аланина вместо лейцина в аминокислотной позиции 234 и аланина вместо лейцина в аминокислотной позиции 235, где нумерация дана в соответствии с EU индексом Кабата.

13. Антитело по любому из пп.1-11, которое характеризуется содержанием мутаций глутаминовой кислоты вместо лейцина в аминокислотной позиции 235 и пролина вместо серина в аминокислотной позиции 228, где нумерация дана в соответствии с EU индексом Кабата.

14. Фармацевтическая композиция для связывания с IL33R, содержащая антитело по пп.1-13 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

15. Применение антитела по пп.1-13 для изготовления фармацевтической композиции.

16. Применение антитела по пп.1-13 для лечения ревматоидного артрита, неспецифического язвенного колита или астмы.

17. Нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, которое связывается с IL33R и содержит CDR3-область тяжелой цепи из SEQ ID №1, CDR2-область тяжелой цепи области из SEQ ID №2, CDR1-область тяжелой цепи из SEQ ID №3, CDR3-область легкой цепи из SEQ ID №4, CDR2-область легкой цепи из SEQ ID №5 и CDR1-область легкой цепи из SEQ ID №6.

18. Нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, которое связывается с IL33R и содержит CDR3-область из SEQ ID №24, CDR2-область из SEQ ID №23 и CDR1-область из SEQ ID №22, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №33, CDR2-область из SEQ ID №32 и CDR1-область из SEQ ID №31.

19. Нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающегося с IL33R, которое характеризуется тем, что указанное антитело содержит CDR3-область из SEQ ID №28, CDR2-область из SEQ ID №27 и CDR1-область из SEQ ID №26, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-область из SEQ ID №33, CDR2-область из SEQ ID №32 и CDR1-область из SEQ ID №31.

20. Экспрессионный вектор, который характеризуется содержанием нуклеиновой кислоты по пп.17,18 или 19, для экспрессии антитела, связывающегося с IL33R, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине.

21. Способ получения рекомбинантного антитела, связывающегося с IL33R, который характеризуется экспрессией нуклеиновой кислоты по пп.17, 18 или 19 в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделением указанного антитела из указанной клетки или супернатанта клеточной культуры.