[1,3]оксазины

Изобретение относится к соединению, имеющему формулу I, или его фармацевтически приемлемым солям. Соединения формулы I обладают свойствами ингибиторов ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2. В формуле I:

R¹ представляет собой 6-членный гетероарил, включающий 2 гетероатома, выбранных из N, замещенный заместителем C_2-6-алкинил-C_1-6-алкокси; R² представляет собой атом галогена; R³ представляет собой C_1-6-алкил; R⁴ выбран из атома галогена; R⁵ выбран из атома галогена; R⁶ выбран из атома водорода, и R⁷ выбран из атома водорода. Изобретение также относится к меченному тритием соединению формулы Ia, ¹¹С-меченому соединению формулы Ia', структурные формулы которых указаны в формуле изобретения, к способу диагностической визуализации фермента BACE1, к применению соединения при получении композиции для диагностической визуализации BACE1, к фармацевтической композиции, к применению соединения при получении лекарственного средства, к способу применения при ингибировании активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2. Технический результат: получены новые соединения формулы I, обладающие свойствами ингибиторов ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2. 10 н. и 23 з.п. ф-лы, 7 табл., 9 пр.

 

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к [1,3]оксазинам, обладающим свойствами ингибиторов ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2, к их получению, содержащим их фармацевтическим композициям и к их применению в качестве терапевтически активных веществ. В изобретении дополнительно предложены радиоактивно меченые соединения, имеющие общую формулу I, в качестве радиоактивных индикаторов ВАСЕ1, полезных для мечения и диагностической визуализации функциональной способности ВАСЕ1.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Болезнь Альцгеймера (AD; от англ. "Alzheimer's disease") представляет собой нейродегенеративное расстройство центральной нервной системы и является ведущей причиной прогрессирующей деменции у пожилого населения. Ее клиническими симптомами являются ухудшение памяти, познавательной способности, временной и пространственной ориентации, суждения и мышления, а также тяжелые эмоциональные нарушения. В настоящее время нет доступных способов лечения, которые могут предупреждать это заболевание или его прогрессирование, либо вызывать стабильную реверсию его клинических симптомов. AD стала значительной проблемой здравоохранения во всех обществах с высокой средней продолжительностью жизни, а также значительным экономическим бременем для их систем здравоохранения.

AD характеризуется двумя следующими основными патологиями в центральной нервной системе (ЦНС): возникновением амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков (Hardy et al., The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics, Science. 2002 Jul 19; 297(5580):353-6, Selkoe, Cell biology of the amyloid beta-protein precursor and the mechanism of Alzheimer's disease, Annu Rev Cell Biol. 1994; 10:373-403). Обе патологии также обычно наблюдают у пациентов с синдромом Дауна (трисомией 21), у которых также развиваются AD-подобные симптомы в раннем возрасте. Нейрофибриллярные клубки представляют собой внутриклеточные агрегаты ассоциированного с микротрубочками белка tau (МАРТ; от англ. "microtubule-associated protein tau"). Амилоидные бляшки возникают во внеклеточном пространстве, их основными компонентами являются Аβ-пептиды. Последние представляют собой группу протеолитических фрагментов, образованных от белка-предшественника β-амилоида (АРР; от англ. "β-amyloid precursor protein") в результате серии стадий протеолитического расщепления. Идентифицировано несколько форм АРР, из которых наиболее распространенными являются белки длиной 695, 751 и 770 аминокислот. Все они имеют происхождение от одного гена посредством дифференциального сплайсинга. Аβ-пептиды образованы из одного и того же домена АРР, но отличаются их N- и С-концами, где основные виды молекул имеют длину 40 и 42 аминокислоты. Существует несколько научных доказательств, которые позволяют с большой вероятностью предположить, что Аβ-пептиды являются существенными молекулами в патогенезе AD: 1) амилоидные бляшки, образованные из Аβ-пептидов, составляют неизменную часть патологии AD; 2) Аβ-пептиды токсичны для нейронов; 3) при семейной болезни Альцгеймера (FAD; от англ. "Familial Alzheimer's Disease") мутации в генах этого заболевания АРР, PSN1, PSN2 приводят к повышенным уровням Аβ-пептидов и раннему амилоидозу головного мозга; 4) у трансгенных мышей, которые экспрессируют такие гены FAD, развивается патология, которая имеет много сходств с заболеванием у человека. Аβ-пептиды продуцируются из АРР посредством последовательного действия двух протеолитических ферментов, называемых β- и γ-секретазой. β-Секретаза сначала отщепляет примерно 28 аминокислот во внеклеточном домене АРР снаружи от трансмембранного домена (ТМ; от англ. "transmembrane domain") с образованием С-концевого фрагмента АРР, содержащего ТМ и цитоплазматический домен (CTFβ). CTFβ является субстратом для γ-секретазы, которая расщепляет в нескольких соседних положениях внутри ТМ с образованием Аβ пептидов и цитоплазматического фрагмента. γ-Секретаза представляет собой комплекс, состоящий по меньшей мере 4 различных белков, и ее каталитической субъединицей весьма вероятно является белок пресенилин (PSEN1, PSEN2). β-Секретаза (ВАСЕ1, Asp2; ВАСЕ обозначает β-сайт АРР-расщепляющего фермента) представляет собой аспартилпротеазу, которая заякорена в мембране посредством трансмембранного домена (Vassar et al., Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE, Science. 1999 Oct 22; 286(5440):735). Она экспрессируется во многих тканях организма человека, но ее уровень особенно высок в ЦНС. Генетическое разрушение гена ВАСЕ1 у мышей четко показало, что его активность существенна для процессинга АРР, который приводит к образованию Аβ-пептидов, в отсутствие ВАСЕ1 Аβ-пептиды не продуцируются (Luo et al., Mice deficient in ВАСЕ1, the Alzheimer's beta-secretase, have normal phenotype and abolished beta-amyloid generation, Nat Neurosci. 2001 Mar; 4(3):231-2, Roberds et al., BACE knockout mice are healthy despite lacking the primary beta-secretase activity in brain: implications for Alzheimer's disease therapeutics, Hum Mol Genet. 2001 Jun 1; 10(12): 1317-24). Мыши, у которых генно-инженерным путем получена экспрессия гена АРР человека, и у которых образуются обширные амилоидные бляшки и патологии, подобные болезни Альцгеймера, при старении, этого не происходит, когда активность β-секретазы снижена в результате генетического разрушения одного из аллелей ВАСЕ1 (McConlogue et al., Partial reduction of ВАСЕ1 has dramatic effects on Alzheimer plaque and synaptic pathology in АРР Transgenic Mice. J Biol Chem. 2007 Sep 7; 282(36):26326). Следовательно, предполагают, что ингибиторы активности ВАСЕ1 могут быть полезными агентами для терапевтического вмешательства в болезнь Альцгеймера (AD).

Диабет типа 2 (T2D; от англ. "type 2 diabetes") вызван устойчивостью к инсулину и неадекватной секрецией инсулина из β-клеток поджелудочной железы, приводящей к слабому контролю глюкозы в крови и гипергликемии (М Prentki & CJ Nolan, "Islet beta-cell failure in type 2 diabetes" J. Clin. Investig. 2006, 116(7), 1802-1812). Пациенты, страдающие T2D, обладают повышенным риском микрососудистого и макрососудистого заболевания и ряда родственных осложнений, включающих диабетическую нефропатию, ретинопатию и сердечно-сосудистое заболевание. В 2000 г. по оценкам 171 млн. человек страдал этим состоянием, причем ожидают, что эта цифра удвоится к 2030 г.(S Wild, G Roglic, A Green, R.Sicree & Н King, "Global prevalence of diabetes", Diabetes Care 2004, 27(5), 1047-1053), что делает это заболевание значительной проблемой здравоохранения. Рост распространенности T2D связан с все возрастающим сидячим образом жизни и употреблением в пищу высококалорийных продуктов питания населением во всем мире (Р Zimmet, KGMM Alberti & J Shaw, "Global and societal implications of the diabetes epidemic" Nature 2001, 414, 782-787).

Недостаточность β-клеток и вследствие этого резкое снижение секреции инсулина и гипергликемия отмечает начало T2D. Большинство современных терапий не предотвращает потерю массы β-клеток, характеризующую выраженный T2D. Однако недавние разработки аналогов GLP-1, гастрина и других агентов показывают, что сохранения и пролиферации β-клеток можно достичь, что приведет к улучшенной толерантности к глюкозе и замедлению прогрессирования до выраженного T2D (LL Baggio & DJ Drucker, "Therapeutic approaches to preserve islet mass in type 2 diabetes", Annu. Rev. Med. 2006, 57, 265-281).

Tmem27 идентифицирован как белок, стимулирующий пролиферацию бета-клеток (Р Akpinar, S Kuwajima, J Krutzfeldt, M Stoffel, "Tmem27: A cleaved and shed plasma membrane protein that stimulates pancreatic Р cell proliferation", Cell Metab. 2005, 2, 385-397) и секрецию инсулина (К Fukui, Q Yang, Y Cao, N Takahashi et al., "The HNF-1 target Collectrin controls insulin exocytosis by SNARE complex formation", Cell Metab. 2005, 2, 373-384). Tmem27 представляет собой мембранный гликопротеин, имеющий молекулярную массу 42 кДа, который конститутивно выделяется с поверхности β-клеток в результате расщепления полноразмерного клеточного Tmem27. Гиперэкспрессия Tmem27 у трансгенных мышей увеличивает массу р-клеток и улучшает толерантность к глюкозе в модели диабета, вызванного алиментарным ожирением DIO (от англ. "diet-induced obesity"). Кроме того, нокаут Tmem27 посредством малых интерферирующих РНК (миРНК) в анализе пролиферации β-клеток грызунов (например, с использованием клеток INS1e) снижает скорость пролиферации, что указывает на роль Tmem27 в контроле массы β-клеток.

В таком же анализе пролиферации ингибиторы ВАСЕ2 также увеличивают пролиферацию. Однако ингибирование ВАСЕ2 в сочетании с нокаутом Tmem27 siRNA приводит в результате к низким скоростям пролиферации. Поэтому сделан вывод, что ВАСЕ2 является протеазой, ответственной за расщепление Tmem27. Кроме того, in vitro ВАСЕ2 расщепляет пептид, основанный на последовательности Tmem27. Близкородственная протеаза ВАСЕ1 не расщепляет этот пептид, и селективное ингибирование только ВАСЕ1 не усиливает пролиферацию β-клеток.

Близким гомологом ВАСЕ2 является мембраносвязанная аспартилпротеаза, и она совместно локализована с Tmem27 в β-клетках поджелудочной железы человека (G Finzi, F Franzi, С Placidi, F Acquati et al., "ВАСЕ2 is stored in secretory granules of mouse and rat pancreatic beta cells", Ultrastruct Pathol. 2008, 32(6), 246-251). Также известно, что она способна к расщеплению АРР (I Hussain, D Powell, D Howlett, G Chapman et al., "ASP1 (ВАСЕ2) cleaves the amyloid precursor protein at the p-secretase site" Mol Cell Neurosci. 2000, 16, 609-619), IL-1R2 (P Kuhn, E Marjaux, A Imhof, В De Strooper et al., "Regulated intramembrane proteolysis of the interleukin-1 receptor II by alpha-, beta-, and gamma-secretase" J. Biol. Chem. 2007, 282(16), 11982-11995) и АСЕ2. Способность к расщеплению АСЕ2 указывает на возможную роль ВАСЕ2 в контроле гипертензии.

Ингибирование ВАСЕ2, следовательно, предложено в качестве терапии T2D с потенциалом сохранения и восстановления массы β-клеток и стимуляции секреции инсулина у преддиабетических и диабетических пациентов. Следовательно, цель настоящего изобретения состоит в разработке селективных ингибиторов ВАСЕ2. Такие соединения полезны в качестве терапевтически активных веществ, в частности, при лечении и/или предупреждении заболеваний, которые связаны с ингибированием ВАСЕ2.

Кроме того, образование или образование и отложение β-амилоидных пептидов в неврологической ткани или вокруг нее (например, в головном мозге) ингибируется настоящими соединениями, то есть ингибированием продуцирования Аβ из АРР или фрагмента АРР.

Объектами настоящего изобретения являются новые соединения, имеющие формулу I, их получение, лекарственные средства на основе соединения в соответствии с изобретением и их получение, а также применение соединений, имеющих формулу I, при лечении или предупреждении заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и диабет типа 2.

Обнаружено, что радиоактивно меченые соединения, имеющие формулу I, можно применять в качестве радиоактивного индикатора ПЭТ (позитронно-эмиссионной томографии) для мечения и радиоактивной молекулярной визуализации функциональной способности ВАСЕ1, в частности, [¹¹С]-меченые соединения, имеющие формулу I. Молекулярная визуализация основана на селективном и специфичном взаимодействии молекулярного зонда (например, радиоактивного индикатора) с биологической мишенью (например, с рецептором, ферментом, ионным каналом или другим клеточным компонентом, способным к связыванию или удерживанию молекулярного зонда), которое визуализируют посредством ПЭТ, ядерно-магнитного резонанса, ближнего инфракрасного или других методов. ПЭТ, ядерный медицинский метод визуализации, идеально подходит для получения трехмерных изображений, обеспечивающих важную информацию о распределении биологической мишени в данном органе, либо о метаболической активности такого органа или клетки, либо о способности лекарственного средства к проникновению в такой орган, к связыванию с биологической мишенью и/или к модификации биологических процессов. Поскольку ПЭТ является неинвазивным методом визуализации, его можно применять для исследования патофизиологии заболевания и действия лекарственного средства на данную биологическую мишень или на клеточные процессы у людей и у животных. Доступность радиоактивного индикатора ПЭТ, специфичного к данной молекулярной мишени, может облегчить разработку лекарственного средства и понимание механизма действия лекарственного средства. Кроме того, радиоактивный индикатор ПЭТ может облегчить диагностику заболевания путем демонстрации патофизиологических изменений, происходящих вследствие заболевания.

Головной мозг человека является сложным органом, состоящим из миллионов взаимодействующих друг с другом нейронов. Понимание аномалий, относящихся к заболеваниям, является ключом к будущей разработке эффективной диагностики и новых терапевтических средств. Изучение биохимических аномалий у человека быстро становится существенным и неотделимым компонентом процесса открытия и разработки лекарственных средств. Традиционно открытие и разработка новых лекарственных средств проводится с сильным акцентом на методы in vitro, чтобы выбрать перспективные ведущие кандидаты, которые затем тестируют на живых животных перед введением человеку. Поскольку системы in vitro лишь частично отражают комплексность живых систем, а модели заболевания человека in vivo на животных часто являются только приближением к патологии человека, все больше растет осознание того, что надежное понимание взаимодействия лекарства с рецептором у живого человека на ранней стадии этого процесса является основной направляющей силой при дальнейшем усовершенствовании эффективного и своевременного открытия и разработки новых терапевтических средств. За последние годы возросло применение медицинской визуализации человека для оценки патологий, болезненных процессов и действия лекарств. Эти методы визуализации включают ПЭТ, магнитно-резонансную томографию (МРТ), компьютерную томографию (КГ), ультразвуковое исследование, электроэнцефалографию (ЭЭГ), однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ) и другие методы (British Medical Bulletin, 2003, 65, 169-177). Следовательно, применение неинвазивных методов визуализации, например ПЭТ, является неоценимым инструментом разработки лекарственных средств в будущем. Неинвазивные методы ядерной визуализации можно применять для получения базовой и диагностической информации о физиологии и биохимии разнообразных живых существ. Эти методы основаны на применении сложной аппаратуры визуализации, способной обнаруживать излучение, испускаемое от радиоактивных индикаторов, введенных таким живым существам. Полученную информацию можно реконструировать с получением плоскостных и томографических изображений, выявляющих распределение радиоактивного индикатора в зависимости от времени. В результате применения радиоактивных индикаторов можно получить изображения, содержащие информацию о структуре, функции и, что наиболее важно, физиологии и биохимии субъекта. Большая часть такой информации не может быть получена другими средствами. Радиоактивные индикаторы, применяемые в этих исследованиях, разработаны таким образом, что они обладают определенным поведением in vivo, дающим возможность определения конкретной информации, касающейся физиологии или биохимии субъекта. В настоящее время радиоизотопные индикаторы доступны для получения полезной информации, касающейся функции сердца, коронарного кровотока, легочной сцинтиографии, функции печени, кровотока головного мозга, регионарной глюкозы в головном мозге и метаболизма кислорода (WO 2007/041025). Кроме того, визуализация ПЭТ обеспечивает неинвазивный и количественный анализ нормальной и аномальной нейрохимии у человека на ранней стадии разработки лекарственного средства с целью усовершенствования эффективного и действенного открытия терапевтических средств. Индикаторные дозы меченых соединений обеспечивают следующую раннюю оценку новых лекарственных средств: исследования биораспределения; исследования занятости рецепторов, чтобы оптимизировать режим дозирования лекарственного средства и характеризовать нисходящие ответы на действие лекарственного средства. Понимание механизмов заболевания у человека при применении неинвазивных методов тесно связано с будущими разработками в диагностике и лечении заболеваний и новых терапевтических средств.

Радионуклиды, обычно применяемые при ПЭТ, включают следующие радионуклиды: ¹¹С, ¹³N, ¹⁵O и ¹⁸F. В принципе, можно метить все аналоги лекарственных средств ПЭТ-нуклидом, но обнаружено, что только немногие из них применимы в качестве агентов визуализации in vivo у людей. Период полураспада радиоактивности ¹¹С, ¹³N, ¹⁵О и ¹⁸F составляет 20, 10, 2 и 110 мин соответственно. Эти короткие периоды полураспада предоставляют ряд преимуществ их применения в качестве радиоактивных индикаторов для зондирования биологических процессов in vivo с применением ПЭТ. Они дают возможность проводить повторные исследования у одного и того же субъекта в течение одних и тех же суток. Возрастает применение ПЭТ в качестве инструмента для определения взаимоотношений лекарство-доза-фермент/занятость рецепторов у хорошо определенных соединений. Применение радиоактивных индикаторов ПЭТ, специфически связывающихся с целевым рецептором или ферментом, может обеспечить информацию о способности лекарственного средства к проникновению в головной мозг и к связыванию с сайтом-мишенью: о степени занятости сайта-мишени, полученной при данной дозе лекарственного средства, о динамике занятости и об относительной кинетике интересующего лекарственного средства в плазме и тканях.

Исследования занятости проводят с помощью радиоактивных индикаторов ПЭТ, которые обычно не идентичны исследуемому лекарственному средству-кандидату (British Medical Bulletin, 2003, 65, 169-177).

Следующими объектами настоящего изобретения являются радиоактивно меченые ингибиторы, имеющие общую формулу I, в качестве радиоактивного индикатора ВАСЕ1, полезного при мечении и диагностической визуализации функциональной способности ВАСЕ1.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложено соединение, имеющее формулу I,

в котором заместители и переменные являются такими, как описано ниже и в формуле изобретения, либо его фармацевтически приемлемая соль или радиоактивно меченая форма.

Настоящие соединения обладают активностью ингибирования Asp2 (β-секретазы, ВАСЕ1 или мемапсина-2) и, следовательно, их можно применять при терапевтическом и/или профилактическом лечении заболеваний и расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида и/или олигомеров β-амилоида и/или β-амилоидных бляшек и дополнительных отложений, в частности, болезни Альцгеймера. И/или настоящие соединения обладают активностью ингибирования ВАСЕ2 и, следовательно, их можно применять при терапевтическом и/или профилактическом лечении заболеваний и расстройств, таких как диабет типа 2, и других метаболических расстройств. Далее в настоящем изобретении предложены радиоактивно меченые ингибиторы, имеющие формулу I, в качестве радиоактивного индикатора ВАСЕ1, полезного при мечении и диагностической визуализации функциональной способности ВАСЕ1.

Далее в настоящем изобретении предложены радиоактивно меченые соединения, имеющие общую формулу I, в качестве радиоактивного индикатора ВАСЕ1, полезного при мечении и диагностической визуализации функциональной способности ВАСЕ1.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Объектом настоящего изобретения являются соединения, имеющие формулу I, и их фармацевтически приемлемые соли, получение указанных выше соединений, содержащие их лекарственные средства и их получением, а также применение указанных выше соединений при терапевтическом и/или профилактическом лечении заболеваний и расстройств, связанном с ингибированием активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2, например, болезни Альцгеймера и диабета типа 2. Кроме того, настоящие соединения ингибируют образование или образование и отложение β-амилоидных бляшек в неврологической ткани (например, в головном мозге) или вокруг нее посредством ингибирования продуцирования Аβ из АРР или фрагмента АРР.

Далее в настоящем изобретении предложены радиоактивно меченые соединения, имеющие общую формулу I, в качестве радиоактивных индикаторов ВАСЕ1, полезных при мечении и диагностической визуализации функциональной способности ВАСЕ1.

Приведенные ниже определения общих терминов, используемых в настоящем описании, применяют независимо от того, встречаются ли обсуждаемые термины отдельно или в сочетании с другими группами.

Если не указано иное, приведенные ниже термины, используемые в данной заявке, включая описание и формулу изобретения, имеют приведенные ниже определения. Необходимо отметить, что, как используют в описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают множественные объекты ссылки, если контекстом явным образом не продиктовано иное.

Термин "C_1-6-алкил", отдельно или в комбинации с другими группами, означает углеводородный радикал, который может быть нормальным или разветвленным, с одиночным или множественным разветвлением, где алкильная группа, как правило, включает от 1 до 6 атомов углерода, например, метил (Me), этил (Et), пропил, изопропил (i-пропил), н-бутил, i-бутил (изобутил), 2-бутил (втор-бутил), t-бутил (трет-бутил) и тому подобное. Конкретные группы представляют собой группы, включающие от 1 до 4 атомов углерода. Наиболее конкретная группа представляет собой метил.

Термин "С_2-6-алкенил" означает одновалентную, нормальную или разветвленную, насыщенную углеводородную группу, состоящую из атомов углерода в количестве от 2 до 6, в частности, от 2 до 4 атомов углерода, и содержит одну, две или три двойные связи. Примеры алкенила включают этенил, пропенил и изобутенил.

Термин "галоген-С_2-6-алкенил", отдельно или в комбинации с другими группами, относится к С_2-6-алкенилу, как определено в данной работе, замещенному одним или множественными атомами галогена, как определено в данной работе, в частности, одним атомом галогена, в частности, F, например, фтор-этенил.

Термин "С_1-6-алкокси-С_2-6-алкенил", отдельно или в комбинации с другими группами, относится к С_2-6-алкенилу, как определено в данной работе, замещенному одной или множественными группами С_1-6-алкокси, как определено в данной работе, в частности, одной группой С_1-6-алкокси, например, метокси-этенил.

Термин "С_2-6-алкинил" означает одновалентную, нормальную или разветвленную, насыщенную углеводородную группу, состоящую из атомов углерода в количестве от 2 до 6, в частности, от 2 до 4 атомов углерода, и содержащую одну, две или три тройные связи. Примеры алкинила включают этинил, пропинил, проп-2-инил, н-бутинил и изобутинил.

Термин "галоген-С_2-6-алкинил", отдельно или в комбинации с другими группами, относится к С_2-6-алкинилу, как определено в данной работе, замещенному одним или множественными атомами галогена, как определено в данной работе, в частности, одним атомом галогена, в частности, F, например, фтор-этинил.

Термин "С_1-6-алкокси-С_2-6-алкинил", отдельно или в комбинации с другими группами, относится к С_2-6-алкинилу, как определено в данной работе, замещенному одной или множественными группами C_1-6-алкокси, как определено в данной работе, в частности, одной группой C_1-6-алкокси, например, метокси-этинил.

Термин "атом галогена", отдельно или в комбинации с другими группами, означает атом хлора (Cl), йода (I), фтора (F) и брома (Br). Конкретный "атом галогена" представляет собой F.

Термин "гетероарил", отдельно или в комбинации с другими группами, относится к ароматической карбоциклической группе, имеющей одно 4-8-членное кольцо или множественные конденсированные кольца, включающие от 6 до 14, более предпочтительно от 6 до 10, кольцевых атомов и включающие 1, 2 или 3 гетероатома, индивидуально выбранные из N, О и S, в частности, 2 N, причем, в этой группе по меньшей мере одно гетероциклическое кольцо является ароматическим. Примеры "гетероарила" включают бензофурил, бензоимидазолил, бензооксазинил, бензотиазинил, бензотиазолил, бензотиенил, бензотриазолил, фурил, имидазолил, индазолил, индолил, изохинолинил, изотиазолил, изоксазолил, оксазолил, пиразинил, пиразолил (пиразил), пиразоло[1,5-а]пиридинил, пиридазинил, пиридинил, пиримидинил, пирролил, хинолинил, тетразолил, тиазолил, тиенил, триазолил и тому подобное. Конкретная группа представляет собой пиразинил. Конкретным является пиразин-2-ил.

Термин "C_1-6-алкокси", отдельно или в комбинации с другими группами, обозначает -O-низший алкильный радикал, который может быть нормальным или разветвленным, с одиночным или множественным разветвлением, в котором алкильная группа, как правило, включает от 1 до 6 атомов углерода, например, метокси (ОМе, МеО), этокси (OEt), пропокси, изопропокси (i-пропокси), н-бутокси, i-бутокси (изо-бутокси), 2-бутокси (втор-бутокси), t-бутокси (трет-бутокси), изопентилокси (i-пентилокси) и тому подобное. Конкретными группами являются группы, включающие от 1 до 4 атомов углерода. Наиболее конкретной группой является метокси.

Термин "С_2-6-алкенил -C_1-6-алкокси", отдельно или в комбинации с другими группами, относится к группе C_1-6-алкокси, как определено в данной работе, замещенной одним С_2-6-алкенилом, как определено в данной работе. Примерами являются этенил-этокси, этенил-метокси и тому подобное.

Термин "С_2-6-алкинил-С_1-6-алкокси", отдельно или в комбинации с другими группами, относится к группе C_1-6-алкокси, как определено в данной работе, замещенной одним С_2-6-алкинилом, как определено в данной работе. Примерами являются этинил-этокси, этинил-метокси и тому подобное.

Термин "С_2-6-алкинил-С_1-6-алкокси-пиразинил", отдельно или в комбинации с другими группами, относится к пиразинильному кольцу, замещенному одной группой С_2-6-алкинил-С_1-6-алкокси-, как определено в данной работе. Конкретным примером является 5-бут-2-инилокси-пиразинил.

Термин "арил" означает одновалентную ароматическую карбоциклическую моно- или бициклическую кольцевую систему, содержащую от 6 до 10 кольцевых атомов углерода. Примеры арильных группировок включают фенил и нафтил. Конкретным является фенил.

Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, которые пригодны для применения в контакте с тканями людей и животных. Примерами подходящих солей с неорганическими и органическими кислотами являются, но не ограничены ими, соли со следующими кислотами: уксусной кислотой, лимонной кислотой, муравьиной кислотой, фумаровой кислотой, соляной кислотой, молочной кислотой, малеиновой кислотой, яблочной кислотой, метансульфоновой кислотой, азотной кислотой, фосфорной кислотой, пара-толуолсульфоновой кислотой, янтарной кислотой, серной кислотой, сернистой кислотой, винной кислотой, трифторуксусной кислотой и тому подобное. Конкретными являются следующие кислоты: муравьиная кислота, трифторуксусная кислота и соляная кислота. Наиболее конкретной является соляная кислота.

Термины "фармацевтически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество" относятся к носителям и вспомогательным веществам, таким как разбавители или наполнители, совместимые с другими ингредиентами препарата.

Термин "фармацевтическая композиция" включает препарат, содержащий указанные ингредиенты в предопределенных количествах или долях, а также любой препарат, который является результатом, прямо или косвенно, объединения указанных ингредиентов в указанных количествах. В частности, этот термин включает препарат, содержащий один или более активных ингредиентов, и необязательный носитель, включающий инертные ингредиенты, а также любой препарат, который является результатом, прямо или косвенно, объединения, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов, либо диссоциации одного или более ингредиентов, либо других типов реакций или взаимодействий одного или более ингредиентов.

Термин "половинная максимальная ингибиторная концентрация" (IC₅₀) означает концентрацию конкретного соединения, необходимую для получения 50% ингибирования биологического процесса in vitro. Значения IC₅₀ можно логарифмически преобразовать в значения pIC₅₀ (-log IC₅₀), в которых более высокие значения указывают на экспоненциально более высокую эффективность. Значение IC₅₀ не является абсолютной величиной, а зависит от экспериментальных условий, например, от используемых концентраций. Значение IC₅₀ можно преобразовать в абсолютную константу ингибирования (Ki), используя уравнение Ченга-Прусоффа (Biochem. Pharmacol. (1973) 22:3099). Термин "константа ингибирования" (Ki) означает абсолютное сродство связывания конкретного ингибитора с рецептором. Ее измеряют, используя анализы конкурентного связывания, и она равна концентрации, при которой конкретный ингибитор занимал бы 50% рецепторов, если отсутствует конкурирующий лиганд (например, радиолиганд). Значения Ki можно логарифмически преобразовать в значения pKi (-log Ki), в которых более высокие значения указывают на экспоненциально более высокую эффективность.

"Терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, которое при введении субъекту для лечения болезненного состояния, является достаточным, чтобы осуществить такое лечение болезненного состояния. "Терапевтически эффективное количество" варьирует в зависимости от соединения, болезненного состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, подлежащего лечению, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, пути и формы введения, мнения лечащего врача или ветеринара и от других факторов.

Термин "как определено в данной работе" и "как раскрыто в данной работе" при отнесении к переменной включает посредством ссылки, как широкое определение этой переменной, так и конкретные, более конкретные и наиболее конкретные определения, если они есть.

Термины "обработка", "приведение в контакт" и "взаимодействие" при отнесении к химической реакции означают добавление или смешивание двух или более реагентов в соответствующих условиях с получением указанного и/или желаемого продукта. Понятно, что реакция, которая дает указанный и/или желаемый продукт, может необязательно являться прямым результатом объединения двух реагентов, которые были первоначально добавлены, то есть может существовать одно или более промежуточных соединений, которые образуются в смеси, что, в конце концов, приводит к образованию указанного и/или желаемого продукта.

В любом случае, когда в химической структуре присутствует хиральный атом углерода, подразумевают, что все стереоизомеры, связанные с этим хиральным атомом углерода, включены в данную структуру.

В изобретении предложено соединение, имеющее формулу I,

в котором:

R¹ представляет собой арил или гетероарил, каждый замещенный 1-4 заместителями, индивидуально выбранными из галоген-С_2-6-алкенила, галоген-С_2-6-алкинила, С_1-6-алкокси-С_2-6-алкенила, С_1-6-алкокси-С_2-6-алкинила, С_2-6-алкенил-С_1-6-алкокси и С_2-6-алкинил-С_1-6-алкокси;

R² представляет собой атом галогена;

R³ представляет собой C_1-6-алкил;

R⁴ выбран из группы, состоящей из

i) атома водорода,

ii) C_1-6-алкила и

iii) атома галогена;

R⁵ выбран из группы, состоящей из

i) атома водорода,

ii) C_1-6-алкила и

iii) атома галогена;

R⁶ выбран из группы, состоящей из

i) атома водорода и

ii) C_1-6-алкила;

R⁷ выбран из группы, состоящей из

i) атома водорода и

ii) C_1-6-алкила;

и, когда R¹ представляет собой гетероарил, замещенный С_2-6-алкинил-С_1-6-алкокси, тогда R⁴ и R⁵ оба представляют собой атом водорода или оба представляют собой атом галогена;

или его фармацевтически приемлемые соли.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R¹ представляет собой гетероарил, замещенный 1-2 заместителями, индивидуально выбранными из галоген-С_2-6-алкенила, галоген-С_2-6-алкинила, C_1-6-алкокси-С_2-6-алкенила, С_1-6-алкокси-С_2-6-алкинила, С_2-6-алкенил-С_1-6-алкокси и С_2-6-алкинил-С_1-6-алкокси.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R¹ представляет собой гетероарил, замещенный галоген-С_2-6-алкенилом, галоген-С_2-6-алкинилом, C_1-6-алкокси-С_2-6-алкенилом, С_1-6-алкокси-С_2-6-алкинилом, С_2-6-алкенил-С_1-6-алкокси или С_2-6-алкинил-C_1-6-алкокси.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R¹ представляет собой пиразинил, замещенный галоген-С_2-6-алкенилом, галоген-С_2-6-алкинилом, С_1-6-алкокси-С_2-6-алкенилом, С_1-6-алкокси-С_2-6-алкинилом, С_2-6-алкенил-С_1-6-алкокси или С_2-6-алкинил-С_1-6-алкокси.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R¹ представляет собой С_2-6-алкинил-С_1-6-алкокси-пиразинил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R¹ представляет собой 5-бут-2-инилокси-пиразинил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R¹ представляет собой 5-бут-2-инилокси-пиразин-2-ил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R² представляет собой F.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R³ представляет собой C_1-6-алкил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R³ представляет собой метил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁴ и R⁵ оба представляют собой атом водорода.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁴ и R⁵ оба представляют собой атом галогена.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁴ и R⁵ оба представляют собой F.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁴ представляет собой атом водорода.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁴ представляет собой атом галогена.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁴ представляет собой F.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁴ представляет собой C_1-6-алкил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁴ представляет собой метил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁵ представляет собой атом водорода.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁵ представляет собой атом галогена.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁵ представляет собой F.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁵ представляет собой C_1-6-алкил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁵ представляет собой метил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁶ и R⁷ оба представляют собой атом водорода.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁶ представляет собой атом водорода.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁶ представляет собой C_1-6-алкил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁶ представляет собой метил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁷ представляет собой атом водорода.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁷ представляет собой C_1-6-алкил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, в котором R⁷ представляет собой метил.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, представляющее собой 5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, представляющее собой меченое тритием соединение, имеющее формулу Ia, в котором R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ имеют значения, раскрытые в данной работе,

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, представляющее собой [³Н]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид.

В определенной форме осуществления изобретения предложено меченое тритием соединение, имеющее формулу Ia, как раскрыто в данной работе, представляющее собой [³H]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, представляющее собой ¹¹C-меченое соединение, имеющее формулу Ia', в котором R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ имеют значения, раскрытые в данной работе,

В определенной форме осуществления изобретения предложено ¹¹С-меченое соединение, имеющее формулу Ia', представляющее собой [¹¹С]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид.

В определенной форме осуществления изобретения предложено ¹¹С-меченое соединение, имеющее формулу I, представляющее собой [¹¹С]-5-6ут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве радиоактивного индикатора ВАСЕ1.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое при исследовании связывания ВАСЕ1.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве радиоактивного индикатора ПЭТ.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, для применения при диагностической визуализации ВАСЕ1 в головном мозге млекопитающего.

В определенной форме осуществления изобретения предложен способ диагностической визуализации фермента ВАСЕ1, включающий введение млекопитающему эффективного количества соединения, как определено в данной работе.

В определенной форме осуществления изобретения предложено применение соединения, как определено в данной работе, при получении композиции для диагностической визуализации ВАСЕ1 в головном мозге млекопитающего.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу Ia, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве радиоактивного индикатора ВАСЕ1.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу Ia, как раскрыто в данной работе, применяемое при исследовании связывания ВАСЕ1.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу Ia, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве радиоактивного индикатора ПЭТ.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу Ia, как раскрыто в данной работе, применяемое при диагностической визуализации ВАСЕ1 в головном мозге млекопитающего.

В определенной форме осуществления изобретения предложен способ диагностической визуализации фермента ВАСЕ1, включающий введение млекопитающему эффективного количества соединения, имеющего формулу Ia, как определено в данной работе.

В определенной форме осуществления изобретения предложено применение соединения, имеющего формулу Ia, как определено в данной работе, при получении композиции для диагностической визуализации ВАСЕ1 в головном мозге млекопитающего.

В изобретении также предложены фармацевтические композиции, способы применения и способы получения раскрытых выше соединений.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве терапевтически активного вещества.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве ингибитора активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве ингибитора активности ВАСЕ1.

В определенной форме осуществления изобретения Предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве ингибитора активности ВАСЕ2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве ингибитора активности ВАСЕ1 и ВАСЕ2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве терапевтически активного вещества для терапевтического и/или профилактического лечения заболеваний и расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида и/или олигомеров β-амилоида и/или β-амилоидных бляшек и дополнительных отложений, в частности, болезни Альцгеймера.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве терапевтически активного вещества для терапевтического и/или профилактического лечения болезни Альцгеймера.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое в качестве терапевтически активного вещества для терапевтического и/или профилактического лечения диабета, в частности, диабета типа 2.

В определенной форме осуществления изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, и фармацевтически приемлемый носитель и/или фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В определенной форме осуществления изобретения предложено применение соединения, имеющего формулу I, как раскрыто в данной работе, при получении лекарственного средства, применяемого при ингибировании активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено применение соединения, имеющего формулу I, как раскрыто в данной работе, при получении лекарственного средства, применяемого при ингибировании активности ВАСЕ1.

В определенной форме осуществления изобретения предложено применение соединения, имеющего формулу I, как раскрыто в данной работе, при получении лекарственного средства, применяемого при ингибировании активности ВАСЕ2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено применение соединения, имеющего формулу I, как раскрыто в данной работе, при получении лекарственного средства, применяемого при ингибировании активности ВАСЕ1 и ВАСЕ2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено применение соединения, имеющего формулу I, как раскрыто в данной работе, при получении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболеваний и расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида и/или олигомеров β-амилоида и/или β-амилоидных бляшек и дополнительных отложений, в частности, болезни Альцгеймера.

В определенной форме осуществления изобретения предложено применение соединения, имеющего формулу I, как раскрыто в данной работе, при получении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения болезни Альцгеймера.

В определенной форме осуществления изобретения предложено применение соединения, имеющего формулу I, как раскрыто в данной работе, при получении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения диабета, в частности, диабета типа 2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое при ингибировании активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое при ингибировании активности ВАСЕ1.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое при ингибировании активности ВАСЕ2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое при ингибировании активности ВАСЕ1 и ВАСЕ2.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое при терапевтическом и/или профилактическом лечении заболеваний и расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида и/или олигомеров β-амилоида и/или β-амилоидных бляшек и дополнительных отложений, в частности, болезни Альцгеймера.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое при терапевтическом и/или профилактическом лечении болезни Альцгеймера.

В определенной форме осуществления изобретения предложено соединение, имеющее формулу I, как раскрыто в данной работе, применяемое при терапевтическом и/или профилактическом лечении диабета, в частности, диабета типа 2.

В определенной форме осуществления изобретения предложен способ применения при ингибировании активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2, в частности, при терапевтическом и/или профилактическом лечении заболеваний и расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида и/или олигомеров β-амилоида и/или β-амилоидных бляшек и дополнительных отложений, болезни Альцгеймера, диабета или диабета типа 2, причем, данный способ включает введение соединения, имеющего формулу I, как раскрыто в данной работе, человеку или животному.

Кроме того, изобретение включает все оптические изомеры, то есть диастереоизомеры, диастереомерные смеси, рацемические смеси, все их соответствующие энантиомеры и/или таутомеры, а также их сольваты.

Специалистам в данной области техники понятно, что соединения, имеющие формулу I, могут существовать в таутомерных формах, например, в следующих таутомерных формах:

Все таутомерные формы включены в объем настоящего изобретения.

Соединения, имеющие формулу I, могут содержать один или более асимметрических центров, и, следовательно, могут существовать в виде рацематов, рацемических смесей, отдельных энантиомеров, диастереомерных смесей и индивидуальных диастереомеров. Дополнительные асимметрические центры могут присутствовать в зависимости от природы различных заместителей на молекуле. Каждый такой асимметрический центр независимо образует два оптических изомера, и подразумевают, что все возможные оптические изомеры и диастереомеры в виде смесей и в виде чистых или частично очищенных соединений включены в данное изобретение. Подразумевают, что настоящее изобретение включает все такие изомерные формы этих соединений. Независимые синтезы этих диастереомеров или их хроматографические разделения могут быть достигнуты, как известно в данной области техники, путем соответствующей модификации методологии, раскрытой в настоящей работе. Их абсолютная стереохимия может быть определена с помощью рентгенокристаллографии кристаллических продуктов или кристаллических промежуточных соединений, которые являются дериватизированными при необходимости реагентом, содержащим асимметрический центр, имеющий известную абсолютную конфигурацию. При желании рацемические смеси соединений могут быть разделены таким образом, чтобы выделить индивидуальные энантиомеры. Это разделение можно осуществить способами, хорошо известными в данной области техники, такими как сочетание рацемической смеси соединений с энантиомерно чистым соединением с образованием диастереомерной смеси с последующим разделением индивидуальных диастереомеров стандартными способами, такими как фракционная кристаллизация или хроматография. Конкретным примером изомеров соединения, имеющего формулу I, является соединение, имеющее формулу Ib, или соединение, имеющее формулу Ic, в котором остатки имеют значение, раскрытое в любой из форм осуществления. Конкретным является соединение, имеющее формулу Ic.

В тех формах осуществления, в которых предложены оптически чистые энантиомеры, оптически чистый энантиомер означает, что соединение содержит более 90% желаемого изомера по массе, в частности, более 95% желаемого изомера по массе, или более конкретно более 99% желаемого изомера по массе, причем, данный процент по массе основан на суммарной массе изомера (изомеров) соединения. Хирально чистые или хирально обогащенные соединения могут быть получены путем стереоселективного синтеза или путем разделения энантиомеров. Разделение энантиомеров может быть выполнено на конечном продукте или альтернативно на подходящем промежуточном соединении.

Соединения, имеющие формулу I, могут быть получены в соответствии с приведенными ниже схемами. Исходное вещество имеется в продаже или может быть получено в соответствии с известными способами. Любые определенные выше остатки и переменные продолжают иметь определенное выше значение, если не указано иное.

Сульфинилимины, имеющие общую формулу А2, могут быть получены по аналогии с документом Т.Р. Tang & J.A. Ellman, J. Org. Chem. 1999, 64, 12, путем конденсации арилкетона А1 и сульфинамида, например, алкилсульфинамида, наиболее конкретно (R)-(+)-трет-бутилсульфинамида, в присутствии кислоты Льюиса, такой как, например, алкоксид титана(IV), более конкретно этоксид титана(IV), в растворителе, таком как эфир, например, диэтиловый эфир, или более конкретно тетрагидрофуран.

Преобразование сульфинилимина А2 в сульфинамидоэфир A3 протекает стереоселективно посредством хиральной направляющей группы, как описано в статье Tang & Ellman. Сульфинилимин А2 можно подвергать взаимодействию с енолятом титана, полученным, например, из алкилацетата или алкил-2-галоген-пропаноата, в частности, этилацетата или 2-фтор-пропаноата, диизопропиламидом лития и хлортриизопропоксититаном при низкой температуре, в частности, при -78°С, в растворителе, таком как эфир, например, диэтиловый эфир или более конкретно тетрагидрофуран. Альтернативно сульфинамидоэфир A3 может быть получен из сульфинилимина А2 путем реакции Реформатского с производным бромуксусного эфира, в частности, этил-2-бром-2-фторацетата или 2-бром-2,2-дифторацетата и цинковой пыли, необязательно в присутствии хлорида меди(I), в растворителе, таком как эфир, например, диэтиловый эфир или более конкретно тетрагидрофуран, при температурах, составляющих от 0 до 70°С, в частности, при 23°С.

Спирт, имеющий формулу А4, может быть получен путем восстановления этилового эфира, имеющего формулу A3, гидридом щелочного металла, в частности, боргидридом лития или алюмогидридом лития, в растворителе, таком как эфир, например, диэтиловый эфир или более конкретно тетрагидрофуран.

Гидролиз хиральной направляющей группы сульфинамидоспирта, имеющего формулу А4, с получением аминоспирта, имеющего формулу А5, может быть выполнен с минеральной кислотой, например, с серной кислотой или, в частности, соляной кислотой, в растворителе, таком как эфир, например, диэтиловый эфир, тетрагидрофуран или более конкретно 1,4-диоксан.

Аминооксазин, имеющий формулу А6, может быть получен путем взаимодействия аминоспирта, имеющего формулу А5, с цианогенбромидом в растворителе, таком как спирт, в частности, этанол.

Нитропроизводное, имеющее формулу А7, может быть получено путем нитрования оксазина А6, в котором Q представляет собой атом водорода, следуя стандартному методу, включающему чистую серную кислоту и дымящуюся азотную кислоту без использования растворителя.

Восстановление нитрогруппы в соединениях, имеющих формулу А7, с получением анилинов, имеющих формулу А8, может быть выполнено путем гидрогенизации, используя катализатор, такой как палладий на углероде, в протонных растворителях, таких как спирты, в частности, этанол или метанол.

Альтернативно восстановление производных, имеющих формулу А6, в котором Q представляет собой нитрогруппу, с получением анилинов, имеющих формулу А8, может быть выполнено путем гидрогенизации, используя катализатор, такой как палладий на углероде, в протонных растворителях, таких как спирты, в частности, этанол или метанол.

Целевые амиды, имеющие формулу I.1, могут быть получены путем селективного сочетания анилинов, имеющих формулу А8, и карбоновой кислоты, имеющей формулу R¹-COOH, с гидратом 4-(4,6-диметокси[1.3.5]триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (DMTMM; от англ. "4-(4,6-dimethoxy[1.3.5]triazin-2-ил)-4-methylmorpholinium chloride") в качестве конденсирующего агента, в растворителе, таком как метанол.

Сульфинамидоэфиры, имеющие формулу A3, могут быть преобразованы в спирты, имеющие формулу В1, путем взаимодействия этилового эфира с избытком реагента Гриньяра или литийорганического реагента, например, галогенидом метил- или этилмагния, метиллитием и т.д., в растворителе, таком как эфир, например, диэтиловый эфир или более конкретно тетрагидрофуран, при температурах, составляющих от -78 до 70°С, в частности, от 0 до 23°С.

Гидролиз хиральной направляющей группы в спиртах, имеющих формулу В1, с получением аминоспиртов, имеющих формулу В2, может быть выполнен с минеральной кислотой, например, с серной кислотой или, в частности, соляной кислотой, в растворителе, таком как эфир, например, диэтиловый эфир, тетрагидрофуран или более конкретно 1,4-диоксан, при температурах, составляющих от 0 до 23°С.

Аминооксазины, имеющие формулу ВЗ, могут быть получены путем взаимодействия аминоспиртов, имеющих формулу В2, с цианогенбромидом в растворителе, таком как спирт, в частности, этанол.

Нитропроизводное, имеющее формулу В4, могут быть получены путем нитрования оксазина ВЗ, в котором Q представляет собой атом водорода, следуя стандартному методу, включающему чистую серную кислоту и дымящуюся азотную кислоту без использования растворителя.

Восстановление нитрогруппы в соединениях, имеющих формулу В4, с получением анилинов, имеющих формулу В5, может быть выполнено путем гидрогенизации, используя катализатор, такой как палладий на углероде, в протонных растворителях, таких как спирты, в частности, этанол или метанол.

Альтернативно восстановление нитрогруппы производных, имеющих формулу В3, в которых Q представляет собой нитрогруппу, с получением анилинов, имеющих формулу В5, может быть выполнено путем гидрогенизации, используя катализатор, такой как палладий на углероде, в протонных растворителях, таких как спирты, в частности, этанол или метанол.

Другой характерный метод получения анилинов, имеющих формулу А8/В5, посредством N-защищенных промежуточных соединений проиллюстрирован на схеме А.1.

Защита аминогруппы в соединениях, имеющих формулу А6.1, в которых Q представляет собой атом брома, с получением арилбромидов, имеющих формулу С1, может быть выполнена с триарилметилхлоридами, такими как трифенилметилхлорид (Tr-Cl), пара-метоксифенилдифенилметилхлорид (MMTr-Cl; от англ. "p-methoxyphenyldiphenylmethyl chloride"), ди(пара-метоксифенил)фенилметилхлорид (DMTr-Cl; от англ. "di(p-methoxyphenyl)phenylmethyl chloride") или три(пара-метоксифенил)метилхлорид (TMTr-Cl; от англ. "tri(p-methoxyphenyl)methyl chloride"), в частности, DMTr-Cl, в основных условиях, например, в присутствии амина, такого как триэтиламин или диизопропилэтиламин, в хлорированном растворителе, таком как дихлорметан или хлороформ, при температурах, составляющих от 0°С до температуры окружающей среды.

Арилбромиды, имеющие формулу С1, можно подвергать взаимодействию с эквивалентами аммиака, такими как бензофенонимин, в присутствии подходящего катализатора, представляющего собой переходный металл, такого как бис(дибензилиденацетон)палладий(0) ((dba)₂Pd) или трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) ((dba)₃Pd₂)), и подходящего лиганда, такого как рац-2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-динафтил (rac-BINAP; от англ. "rac-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl"), 2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропилдифенил (X-PHOS) или 2-ди-трет-бутилфосфино-2',4',6'-триизопропилдифенил (f-Bu X-PHOS), в присутствии основания, такого как трет-бутоксид натрия, фосфат калия или карбонат цезия, в подходящем растворителе, таком как толуол или 1,4-диоксан, в инертном атмосфере, такой как азот или аргон, при температурах, составляющих от 80 до 110°С, с получением соединений, имеющих формулу С2.

Удаление защиты обеих аминогрупп в соединениях, имеющих формулу С2, может быть достигнуто с помощью однореакторного метода, сначала путем их взаимодействия с сильной органической кислотой, такой как трифторуксусная кислота, в хлорированных растворителях, таких как дихлорметан или хлороформ, в безводных условиях, при температурах, составляющих от 0°С до температуры окружающей среды, с отщеплением Р¹-группы. Затем в результате добавления воды с расщеплением бензофенонимина и взаимодействия при температуре окружающей среды получают диамины, имеющие формулу А8/В5.

Схема С: Альтернативный синтез промежуточных анилинов, имеющих формулу А8/В5

Анилины, имеющие формулу А8/В5, могут быть преобразованы в йодопроизводные, имеющие формулу D1, с помощью систем доноров йодония, с использованием йодидов в качестве источника йода, таких как, например, йодид аммония, вместе с сильным окисляющим агентом, таким как, например, пероксид водорода, в полярном растворителе, таком как, например, уксусная кислота, и, как описано авторами N. Narender et al. в статье Tetrahedron Letters 48 (2007) 6124-6128.

Промежуточные тритированные амины, имеющие формулу D2, могут быть получены методами, известными специалистам в данной области техники. В результате обработки йодопроизводных, имеющих формулу D1, газом тритием в инертных растворителях, таких как, например, этилацетат, в присутствии палладия в качестве катализатора получают меченые тритием соединения, имеющие формулу D2.

Целевые амиды, имеющие формулу Ia, могут быть получены путем селективного сочетания тритированных анилинов, имеющих формулу D2, и карбоновой кислоты имеющей формулу R¹-COOH, с гидратом 4-(4,6-диметокси[1.3.5]триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (DMTMM; от англ. "4-(4,6-dimethoxy[1.3.5]triazin-2-ил)-4-methylmorpholinium chloride") в качестве конденсирующего агента в растворителе, таком как метанол.

Целевые амиды, имеющие формулу Ia', могут быть получены из промежуточных соединений А8/В5, как изображено на схеме Е. Промежуточные соединения А8/В5 могут быть преобразованы в амиды, имеющие формулу D1, путем взаимодействия с 5-хлорпиразин-2-карбоновой кислотой путем селективного сочетания в присутствии гидратом 4-(4,6-диметокси[1.3.5]триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (DMTMM) в качестве конденсирующего агента в растворителе, таком как метанол.

Защита аминогруппы в соединениях, имеющих формулу D1, с получением карбаматов, имеющих формулу D2, может быть выполнена с реагентом, таким как Boc₂O, в растворителе, таком как дихлорметан.

Промежуточные соединения, имеющие формулу D2, могут быть преобразованы в пропаргиловые эфиры, имеющие формулу D3, путем взаимодействия с пропаргиловым спиртом в присутствии основания, такого как KOtBu, в растворителе, таком как ДМФ.

Защитную группу на соединениях, имеющих формулу D3, можно удалить с получением промежуточных соединений D4 путем обработки подходящей кислотой, такой как, например, ТФУ, в растворителе, таком как ДХМ.

Концевой ацетилен, имеющий структуру D4, может быть станнилирован с получением соединения, имеющего формулу D5. Соответствующими условиями для такого преобразования являются, например, использование три-н-бутилметоксида олова и нагревание реакционной смеси.

[¹¹С]-Меченые соединения, имеющие формулу Ia', могут быть получены путем катализируемого палладием (например, [Pd(tBu₃)₂]) сочетания трибутилстаннилацетиленов, имеющих формулу D5, и [¹¹С]метилиодида в растворителе, таком как ДМФ.

Схема Е: Синтез [¹¹С]метилацетиленов. имеющих Формулу Ia'

Соответствующие фармацевтически приемлемые соли с кислотами могут быть получены стандартными способами, известными специалистам в данной области техники, например, путем растворения соединения, имеющего формулу I, в подходящем растворителе, таком как, например, диоксан или ТГФ, и добавления соответствующего количества соответствующей кислоты. Продукты могут быть обычно выделены путем фильтрования или путем хроматографии. Преобразование соединения, имеющего формулу I, в фармацевтически приемлемую соль с основанием может быть выполнено путем обработки такого соединения таким основанием. Одним из возможных способов образования такой соли является, например, добавление 1/n эквивалентов основной соли, такой как, например, М(ОН)_n, в которой М=катион металла или аммония и n=число анионов гидроксида, к раствору соединения в подходящем растворителе (например, в этаноле, в смеси этанол-вода, в смеси тетрагидрофуран-вода) и удаление растворителя путем выпаривания или лиофилизации.

Если их получение не описано в примерах, соединения, имеющие формулу I, а также все промежуточные продукты могут быть получены аналогичными способами или способами, раскрытыми в данной работе. Исходные вещества имеются в продаже, известны в данной области техники или могут быть получены способами, известными в данной области техники, или по аналогии с ними.

Понятно, что соединения, имеющие общую формулу I, по данному изобретению могут быть дериватизированы по функциональным группам с получением производных, способных к обратному преобразованию в исходное соединение in vivo.

Фармакологические тесты

Соединения, имеющие формулу I, и их фармацевтически приемлемые соли обладают ценными фармакологическими свойствами. Обнаружено, что соединения по настоящему изобретению связаны с ингибированием активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2. Эти соединения были исследованы в соответствии с тестом, приведенным в данной работе ниже.

Клеточный анализ снижения Аβ:

a) Клетки НЕК293 человека, стабильно трансфицированные вектором, экспрессирующим кДНК гена АРР wt (дикого типа) (АРР695), использовали для оценки эффективности соединений в клеточном анализе. Клетки высевали в 96-луночные микротитрационные планшеты в среде для клеточных культур (Iscove, с добавлением 10% (об/об) фетальной бычьей сыворотки (ФБС), глутамина, пенициллина/стрептомицина) примерно до 80% конфлюентности, и соединения добавляли в 10х концентрации в 1/10 объема среды без ФБС, содержащей 8% диметилсульфоксида (ДМСО) (конечную концентрацию ДМСО поддерживали при 0,8% об/об). После 18-20 ч инкубации при 37°С и 5% CO₂ в увлажненном термостате супернатант культуры собирали для определения концентраций Аβ40. 96-луночные планшеты для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA; от англ. "enzyme linked immunosorbent analysis") (например, Nunc MaxiSorb) покрывали моноклональным антителом, специфично распознающим С-конец Аβ40 (Brockhaus et al., NeuroReport 9, 1481-1486; 1998). После блокирования сайтов неспецифического связывания, например, 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), и отмывки супернатанты культуры добавляли в соответствующих разведениях вместе с идентифицирующим антителом Аβ, сшитым с пероксидазой хрена (например, антителом 4G8, Senetek, Maryand Heights, МО), и инкубировали в течение 5-7 ч. Затем лунки микротитрационного планшета интенсивно промывали физиологическим раствором, забуференным Трисом, содержащим 0,05% Твин 20, и анализ проявляли тетраметилбензидином/H₂O₂ в лимонно-кислотном буфере. После остановки реакции одним объемом 1 н. H₂SO₄ реакцию измеряли в считывающем устройстве для планшетов ELISA при длине волны 450 нм. Концентрации Аβ в супернатантах культуры вычисляли на основании стандартной кривой, полученной с известными количествами чистого пептида Аβ.

b) Альтернативно можно использовать анализ А-бета 40 AlphaLISA Assay. Клетки НЕК293 АРР Клетки высевали в 96-луночные микротитрационные планшеты в среде для клеточных культур (Iscove, с добавлением 10% (об/об) фетальной бычьей сыворотки (ФБС), глутамина, пенициллина/стрептомицина) примерно до 80% конфлюентности, и соединения добавляли в 3х концентрации в 1/3 объема культуральной среды (конечную концентрацию ДМСО поддерживали при 1% об/об).

После 18-20 ч инкубации при 37°С и 5% CO₂ в увлажненном термостате супернатант культуры собирали для определения концентраций Аβ40, используя набор Perkin-Elmer Human Amyloid beta 1-40 (высокой специфичности) (№по каталогу AL275C).

В планшете White Optiplate-384 фирмы Perkin-Elmer (№по каталогу 6007290) 2 мкл супернатантов культур объединяли с 2 мкл 10-кратной смеси акцепторных гранул AlphaLISA анти-hAβ с биотинилированным антителом анти-Аβ 1-40 (50 мкг/мл/5 нМ). После 1-часовой инкубации при комнатной температуре добавляли 16 мкл 1,25-кратного препарата донорных гранул стрептавидина (СА) (25 мкг/мл) и инкубировали в течение 30 минут в темноте. Затем регистрировали испускание света при 615 нм, используя считывающее устройство EnVision-Alpha. Уровни Аβ40 в супернатантах культуры вычисляли в виде процента от максимального сигнала (клетки, обработанные 1% ДМСО без ингибитора). Значения IC₅₀ вычисляли, используя программу Excel XLfit.

Анализ ингибирования ВАСЕ путем измерения расщепления клеточного ТМЕМ27:

В данном анализе используют принцип ингибирования расщепления ТМЕМ27 человека эндогенным клеточным ВАСЕ2 в крысиной клеточной линии lns1e и шеддинга с клеточной поверхности в культуральной среде с последующим обнаружением в анализе ELISA. Ингибирование ВАСЕ2 дозозависимо предотвращает это расщепление и шеддинг.

Стабильная клеточная линия "INS-TMEM27" представляет собой клеточную линию, имеющую происхождение от INS1e, с индуцибельной доксициклин-зависимой экспрессией (используя систему TetOn) полноразмерного hTMEM27. На протяжении всего эксперимента клетки культивируют в среде RPMI1640 с добавлением пенициллина/стрептомицина Glutamax (Invitrogen), 10% фетальной бычьей сыовротки, 100 мМ пирувата, 5 мМ бета-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл G418 и 100 мкг/мл гигромицина и выращивают в прикрепленной культуре при 37°С в стандартном СО₂-инкубаторе для клеточных культур.

Клетки INS-TMEM27 высевают в 96-луночные планшеты. После 2 суток в культуре добавляют ингибитор ВАСЕ2 в диапазоне концентраций, который требуется для анализа, и еще через два часа добавляют доксициклин до конечной концентрации, составляющей 500 нг/мл. Клетки инкубируют еще в течение 46 часов, и супернатант собирают для обнаружения шеддинга ТМЕМ27.

Анализ ELISA (с использованием пары антител мыши против ТМЕМ27 человека, направленных против внеклеточного домена ТМЕМ27) используют для обнаружения ТМЕМ27 в культуральной среде. ЕС₅₀ для ингибирования ВАСЕ2 вычисляют, используя результат ELISA для каждой концентрации ингибитора с помощью программы соответствия стандартной кривой, такой как XLFit для программы электронных таблиц Excel.

Например, значение IC₅₀, составляющее 1,1 нМ, было получено для 5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амида (клеточный анализ ВАСЕ1 на Аβ40).

Авторадиографические исследования с [³H]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амидом (пример 2) в головном мозге крыс

1) Авторадиография in vitro

Распределение сайтов связывания [³H]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амида, а также связывающую специфичность ВАСЕ1 исследовали с помощью авторадиографии in vitro, используя самцов крыс линии Спраг-Доули. Животных умерщвляли, их головной мозг быстро извлекали и замораживали в измельченном в порошок сухом льду. Сагиттальные срезы, имеющие толщину 10 мкм, резали в криостатном микротоме и помещали с оттаиванием на клейкие предметные стекла. Срезы головного мозга сначала инкубировали в течение 10 мин в буфере Рингера (NaCl 120 мМ, KCl 5 мМ, CaCl₂ 2 мМ, MgCl₂ 1 мМ, Трис-HCl 50 мМ рН 7,4) при комнатной температуре (KT), а затем в течение 60 мин в буфере Рингера, содержащем либо 1 нМ, либо 10 нМ [³H]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амида. Для оценки неспецифического связывания (NSB; от англ. Non-specific Bound) радиоактивного индикатора дополнительную серию срезов инкубировали с буфером Рингера, содержащим радиоактивный индикатор и референсный ингибитор ВАСЕ1 ((S)-3-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-7-(2-фторпиридин-3-ил)-5'Н-спиро[хромено[2,3-с]пиридин-5,5'-оксазол]-2'-амин, CAS Nr 1215869-02-5; пример 294 в документе WO 2010030954) при 10 мкМ. По окончании инкубации срезы ополаскивали 3×5 мин в охлажденном во льду буфере Рингера, а затем быстро погружали один раз в дистиллированную воду при 4°С. Срезы головного мозга, закрепленные на покровных стеклах, высушивали в потоке холодного воздуха в течение 3 ч и проводили их экспозицию с [³Н] для микроскопического масштаба на рентгенографической пластине фирмы Fuji в течение 5 суток. Затем рентгенографическую пластину сканировали в считывающем устройстве высокого разрешения Fuji BAS. Общее количество радиоактивного индикатора, связанного с интересующими областями головного мозга (ТВ; от англ. Total Brain) измеряли, используя программу анализа изображений MCID, и выражали в виде фемтомоль (фмоль) связанного радиоактивного индикатора/мг белка. Количество [³Н]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амида, специфично связанного с ВАСЕ1 (SB; от англ. Specific Bound), вычисляли согласно формуле: SB=ТВ-NSB. Полученные результаты показали широкое распределение сайтов связывания Примера 2 в головном мозге крыс, что согласуется с известным распределением мРНК ВАСЕ1 (Brian D. Bennett, Safura Babu-Khan, Richard Loeloff, Jean-Claude Louis, Eileen Curran, Martin Citron, and Robert Vassar, The Journal of Biological Chemistry. 275, 20647-51, 2000). Самые высокие плотности сайтов связывания Примера 2 наблюдали в зоне зубчатой извилины и зоне САЗ гиппокампа, мозжечке, бледном шаре и черной субстанции. Совместная инкубация 1 нМ Примера 2 с 10 мкМ специфичного ингибитора ВАСЕ1 А снижала связывание радиоактивного индикатора более чем на 80%, и, таким образом, продемонстрировано, что Пример 2 специфично связывается с ВАСЕ1 in vitro. Кроме того, тритированный радиоактивный индикатор-кандидат использовали для исследования и сравнения связывания с ВАСЕ1 в срезах ткани головного мозга обезьян и людей с помощью авторадиографии in vitro. Можно продемонстрировать, что Пример 2 связывается с ВАСЕ1 в аналогичной степени, что позволяет предположить переносимость Примера 2 в качестве ВАСЕ1-специфичного радиоактивного индикатора в различные виды.

2) Авторадиография ex vivo

Характеристики [³H]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амида для визуализации ВАСЕ1 in vivo анализировали с помощью авторадиографического метода ех vivo, используя молодых самцов крыс линии Спраг-Доули. Животным внутривенно инъецировали 1 мкКи/кг [³Н]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амида, что соответствует 37,7 наномоль (нмоль)/кг, и умерщвляли животных в различные моменты времени после инъекции. Чтобы проверить специфичность связывания радиоактивного индикатора in vivo, крысам предварительно вводили 10 мг/кг референсного ингибитора ВАСЕ1 ((S)-3-(3,6-дигидро-2Н-пиран-4-ил)-7-(2-фторпиридин-3-ил)-5'Н-спиро[хромено[2,3-с]пиридин-5,5'-оксазол]-2'-амина, САЗ №1215869-02-5; пример 294 в документе WO 2010030954) (р.о.) за 3 ч до инъекции радиоактивного индикатора. Животных умерщвляли в различные моменты времени после инъекции (5, 15, 30, 60, 120 мин p.i.), их головной мозг быстро извлекали и замораживали в измельченном в порошок сухом льду. Сагиттальные срезы, имеющие толщину 10 мкм, резали в криостатном микротоме и помещали с оттаиванием на клейкие предметные стекла. Срезы головного мозга, закрепленные на покровных стеклах, высушивали в потоке холодного воздуха в течение 3 ч и проводили их экспозицию с [³Н] для микроскопического масштаба на рентгенографической пластине фирмы Fuji в течение 5 суток. Затем рентгенографическую пластину сканировали в считывающем устройстве высокого разрешения Fuji BAS. Общее количество радиоактивного индикатора, связанного с интересующими областями головного мозга (ТВ) измеряли, используя программу анализа изображений MCID, и выражали в виде фемтомоль (фмоль) связанного радиоактивного индикатора/мг белка. Количество [³H]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амида, специфично связанного с ВАСЕ1 (SB), вычисляли согласно формуле: SB=ТВ - NSB. Было обнаружено, что [³Н]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид проникает в головной мозг крысы, что показывает благоприятные соотношения головного мозга и плазмы. Наблюдаемая картина распределения связывания in vivo точно соответствует распределению in vitro, причем, самое высокое накопление наблюдают в зоне зубчатой извилины и в зоне САЗ гиппокампа, мозжечке, бледном шаре и черной субстанции. Кроме того, было обнаружено, что накопление Примера 2 in vivo является, в основном, специфичным к ВАСЕ1, поскольку связывание явным образом снижалось в результате предварительной обработки лигандом ВАСЕ1 А. Анализ связывания радиоактивного индикатора в различные моменты времени после инъекции продемонстрировал благоприятную кинетику вымывания связывания Примера 2 в течение характерного периода снятия данных ПЭТ, составляющего 120 мин.

Визуализация ПЭТ in vivo с [¹¹С]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил1-амидом у бабуина

Эксперименты ПЭТ проводили у самцов бабуинов (Papio anubis). Животных не кормили в течение 12 часов перед исследованием ПЭТ. Сначала бабуинов седатировали внутримышечно кетамина гидрохлоридом в ограниченных дозах, составляющих 5-7 мг/кг, до достижения уровня неглубокой анестезии, а затем поддерживали при непрерывной внутривенной инфузии пропофола в дозе, составляющей 0,3-0,4 мг/кг/ч (DIPRIVAN® Injectable Emulsion). Объем кровообращения поддерживали путем инфузии изотонического физиологического раствора. Для взятия образцов крови устанавливали катетер бедренной артерии. На протяжении всего исследования непрерывно следили за физиологическими показателями основных жизненно важных функций, включающими частоту сердечных сокращений, электрокардиограмму (ЭКГ), кровяное давление и сатурацию кислородом. Животных помещали в сканирующее устройство ПЭТ головного мозга ЕСАТ HRRT® (томограф высокого разрешения, CPS Innovations, Inc., Knoxville, TN). На голову животного надевали маску из термопластического полимера, которую прикрепляли к держателю головы с целью воспроизводимой фиксации. С целью коррекции экранирования сразу проводили 6-минутную трансмиссионную сканограмму с точечным источником 1 мкКи Cs-137. [¹¹С]-5-Бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид (приблизительно 10 мкКи или 1 мкг) вводили внутривенно в виде 1-минутной болюсной инъекции. Сканирование ПЭТ и взятие образцов артериальной крови начинали после начала введения радиоактивного индикатора, и изображения ПЭТ снимали в моменты времени с 0 по 120 минуту после введения радиоактивного индикатора. Эмиссионные сканограммы ПЭТ реконструировали, используя итерационный алгоритм максимизации ожидания упорядоченного подмножества (OSEM; от англ. "ordered-subset expectation-maximization") с коррекцией экранирования, рассеяния и время затухания. Стандартную матрицу исследуемого объема (VOI; от англ. Volume of Interest) переносили на базовый уровень ПЭТ каждого индивидуального животного. Кривые активность-время (ТАС; от англ. "Time-activity curves") областей были получены путем применения матриц VOI на последовательные рамки ПЭТ. Радиоактивность VOI в момент времени Т вычисляли в виде взвешенного среднего и выражали в мкКи/мл. Значения ТАС также выражали с помощью стандартизованных значений накопления (SUV; от англ. "standardized uptake value"), используя следующую формулу, предоставляющую возможность проведения приблизительных сравнений ТАС между сканограммами и между сканограммами различных радиоактивных индикаторов:

SUV (%)=радиоактивность (наноКи/мл)/106/(доза (мКи)/масса тела (кг)×103)×100, где числа использованы для получения единицы эквивалентной радиоактивности между радиоактивностью воксела и дозой радиоактивности (106) и между массой тела и объемом воксела (103).

Результаты исследований визуализации ПЭТ показали, что радиоактивный индикатор быстро поглощается во множественных областях головного мозга, причем, ТАС продемонстрировали пиковое поглощение через 10-20 мин после введения и медленное снижение в течение остального периода исследования. Повсеместное распределение радиоактивного индикатора отражает известное распределение ВАСЕ1 (В. D. Bennett et al., J. Biol Chem. 2000, 275 (27), 20647-20651) с несколько более высоким накоплением в зубчатой извилине гиппокампа, бледном шаре и черной субстанции.

Фармацевтические композиции

Соединения, имеющие формулу I, и их фармацевтически приемлемые соли можно применять в качестве терапевтически активных веществ, например, в форме фармацевтических препаратов. Фармацевтические препараты можно вводить перорально, например, в форме таблеток, таблеток с покрытием, драже, твердых и мягких желатиновых капсул, растворов, эмульсий или суспензий. Введение можно, однако, также осуществлять ректально, например, в форме суппозиториев, или парентерально, например, в форме инъекционных растворов.

Соединения, имеющие формулу I, и их фармацевтически приемлемые соли можно обрабатывать фармацевтически инертными, неорганическими или органическими носителями, предназначенными для получения фармацевтических препаратов. Лактозу, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновые кислоты или их соли и тому подобное можно использовать, например, в качестве таких носителей для таблеток, таблеток с покрытием, драже и твердых желатиновых капсул. Подходящими носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и тому подобное. Тем не менее, в зависимости от природы активного вещества в случае мягких желатиновых капсул носители обычно не требуются. Подходящими носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, глицерин, растительное масло и тому подобное. Подходящими носителями для суппозиториев являются, например, натуральные или отвержденные масла, воски, жиры, полужидкие или жидкие полиолы и тому подобное.

Фармацевтические препараты могут, кроме того, содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, увлажняющие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, корригенты, соли для варьирования осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты. Эти препараты могут также содержать другие терапевтически ценные вещества.

Лекарственные средства, содержащие соединение, имеющее формулу I, или его фармацевтически приемлемую соль и терапевтически инертный носитель, также являются объектом настоящего изобретения, а также способ их получения, включающий приведение одного или более соединений, имеющих формулу I, и/или их фармацевтически приемлемых солей и, если желательно, одного или более других терапевтически ценных веществ в форму галенова препарата для введения вместе с одним или большим числом терапевтически инертных носителей.

Дозировка может варьировать в широких пределах и, конечно, ее следует регулировать по индивидуальным потребностям в каждом конкретном случае. В случае перорального введения доза для взрослых может варьировать от приблизительно 0,01 мг до приблизительно 1000 мг в сутки соединения, имеющего общую формулу I, или соответствующего количества его фармацевтически приемлемой соли. Суточную дозу можно вводить в виде однократной дозы или в разделенных дозах и, кроме того, верхний предел может быть также превышен, если обнаружены показания к этому.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение без его ограничения, но служат исключительно как репрезентативные. Фармацевтические препараты обычно содержат примерно 1-500 мг, в частности, 1-100 мг соединения, имеющего формулу I. Примерами композиций в соответствии с изобретением являются следующие композиции:

Пример А

Таблетки, имеющие приведенную ниже композицию, готовят обычным способом:

Метод получения

1. Смешивают ингредиенты 1, 2, 3 и 4 и гранулируют с дистиллированной водой.

2. Высушивают гранулы при 50°С.

3. Пропускают гранулы через подходящее оборудование для измельчения.

4. Добавляют ингредиент 5 и смешивают в течение трех минут; прессуют на подходящем прессе.

Пример В-1

Готовят капсулы, имеющие приведенную ниже композицию:

Метод получения

1. Смешивают ингредиенты 1, 2 и 3 в подходящем смесителе в течение 30 минут.

2. Добавляют ингредиенты 4 и 5 и смешивают в течение 3 минут.

3. Заполняют в подходящую капсулу.

Соединение, имеющее формулу I, лактозу и кукурузный крахмал сначала смешивают в смесителе, а затем в измельчающем аппарате. Смесь возвращают в смеситель; добавляют к ней тальк и тщательно смешивают. Смесь заполняют с помощью аппарата в подходящие капсулы, например, в твердые желатиновые капсулы.

Пример В-2

Готовят мягкие желатиновые капсулы, имеющие приведенную ниже композицию:

Метод получения

Соединение, имеющее формулу I, растворяют в теплом расплаве других ингредиентов, и смесь заполняют в мягкие желатиновые капсулы подходящего размера. Заполненные мягкие желатиновые капсулы обрабатывают в соответствии с обычными методами.

Пример С

Готовят суппозитории, имеющие приведенную ниже композицию:

Метод получения

Суппозиторную массу плавят в стеклянном или стальном сосуде, тщательно смешивают и охлаждают до 45°С. После этого к ней добавляют тонкоизмельченное соединение, имеющее формулу I, и перемешивают до тех пор, пока оно полностью не диспергируется. Смесь заливают в формы для суппозиториев подходящего размера, оставляют до охлаждения; затем суппозитории извлекают из форм и упаковывают индивидуально в вощеную бумагу или металлическую фольгу.

Пример D

Готовят инъекционные растворы, имеющие приведенную ниже композицию:

Метод получения

Соединение, имеющее формулу I, растворяют в смеси полиэтиленгликоля 400 и воды для инъекций (части). Доводят рН до 5,0 уксусной кислотой. Объем доводят до 1,0 мл добавлением остального количества воды. Раствор фильтруют, заполняют во флаконы, используя подходящий допустимый избыток, и стерилизуют.

Пример Е

Готовят пакеты-саше, имеющие приведенную ниже композицию:

Метод получения

Соединение, имеющее формулу I, смешивают с лактозой, микрокристаллической целлюлозой и натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы и гранулируют со смесью поливинилпирролидона в воде. Гранулят смешивают со стеаратом магния, добавляют добавки корригентов и заполняют в пакеты-саше.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Приведенные ниже примеры предложены для иллюстрации изобретения. Их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения, но исключительно в качестве репрезентативных примеров.

Синтез промежуточных сульфинилиминов А2

Общий метод:

Раствор (R)-(+)-трет-бутилсульфинамид (89,8 ммоль) в тетрагидрофуране (400 мл) последовательно обрабатывали кетоном (98,7 ммоль) и этоксидом титана(IV) (178,4 ммоль). Раствор перемешивали при температуре образования флегмы в течение от 3 до 18 часов. Для обработки смесь охлаждали до 22°С и обрабатывали рассолом (400 мл). Суспензию перемешивали в течение 10 минут и фильтровали через дикалит. Слои разделяли, водный слой экстрагировали этилацетатом, объединенные органические слои промывали водой, высушивали и выпаривали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, используя смесь гептана и этилацетата в качестве элюента, с получением чистых сульфинилиминов А2.

Промежуточное соединение А2.1 (Q=NO₂; R²=F; R³=Me): Начиная с 1-(2-фтор-5-нитро-фенил)-этанона (89,7 ммоль), продукт, представляющий собой (R)-2-метил-пропан-2-сульфиновой кислоты [1-(2-фтор-5-нитро-фенил)-(Е)-этилиден]-амид (21,56 г), был получен в виде бледно-желтого твердого вещества. Масс-спектр (МС) с индукционно-связанной плазмой (ИСП): m/z=287,0 [М+Н]⁺.

Синтез промежуточных сульфинамидодифторэфиров A3

Общий метод (посредством реакции Реформатского):

В сухом аппарате суспензию свежеактивированного цинкового порошка (1,28 г, 19,6 ммоль) в сухом диэтиловом эфире (45 мл) нагревали в инертной атмосфере до образования флегмы. Раствор сульфинилимина А2 (9,81 ммоль) и этил-2-бром-2,2-дифторацетата (3,98 г, 2,52 мл, 19,6 ммоль) в сухом диэтиловом эфире (25 мл) добавляли по каплям в течение периода, составляющего 15 минут, в то время как внутренняя температура поднималась, и образование флегмы увеличивалось. Суспензию поддерживали при температуре образования флегмы еще в течение 5 часов. Для обработки ее охлаждали до 23°С, фильтровали через целлит и промывали этилацетатом. Фильтрат наливали в насыщенный раствор хлорида аммония (300 мл) и экстрагировали этилацетатом (2×300 мл). Объединенные органические слои высушивали над сульфатом натрия и выпаривали с получением 4,59 г сырого продукта в виде коричневого масла, которое очищали флэш-хроматографией (силикагель, 70 г) смесью 8:1 гептана и этилацетата с получением сульфинамидодифторэфиров A3.

Промежуточное соединение А3.1 (Q=NO₂; R²=F; R³=Me; R⁴=F; R⁵=F): Начиная с (R)-2-метил-пропан-2-сульфиновой кислоты [1-(2-фтор-5-нитро-фенил)-(Е)-этилиден]-амида (промежуточное соединение А2.1) (5,73 г, 20 ммоль), продукт, представляющий собой (R)-2,2-дифтор-3-(2-фтор-5-нитро-фенил)-3-((Р)-2-метил-пропан-2-сульфиниламино)-масляной кислоты этиловый эфир (3,1 г), был получен в виде оранжевого масла. МС (ИСП): m/z=411,2 [М+Н]⁺.

Синтез промежуточных сульфинамидоспиртов А4

Раствор сульфинамидодифторэфиров A3 (4,4 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (24 мл) охлаждали до 0°С и обрабатывали боргидридом лития (9,0 ммоль). Перемешивание продолжали при 0°С в течение 15 минут. Затем реакционной смеси давали подогреться до комнатной температуры и перемешивали дополнительно в течение от 2 до 18 часов. Для обработки реакционную смесь гасили добавлением воды, объем реакционной смеси уменьшали при пониженном давлении и разбавляли этилацетатом. Органическую фазу промывали рассолом, высушивали над сульфатом натрия и выпаривали с получением остатка, который очищали хроматографией на силикагеле, используя смесь н-гептана и этилацетата в качестве элюента, с получением промежуточных спиртов А4.

Промежуточное соединение А4.1 (Q=NO₂; R²=F; R³=Me; R⁴=F; R⁵=F; R⁶=H; R⁷=Н): Начиная с (R)-2,2-дифтор-3-(2-фтор-5-нитро-фенил)-3-((R)-2-метил-пропан-2-сульфиниламино)-масляной кислоты этилового эфира (промежуточное соединение А3.1) (3,78 г, 9,2 ммоль), продукт, представляющий собой (R)-2-метил-пропан-2-сульфиновой кислоты [(R)-2,2-дифтор-1-(2-фтор-5-нитро-фенил)-3-гидрокси-1-метил-пропил]-амид (2,9 г), был получен в виде светло-желтого твердого вещества. МС (ИСП): m/z=369,0 [M+H]⁺.

Синтез промежуточных аминоспиртов А5

Общий метод:

Раствор сульфинамидоспиртов А4 (10,3 ммоль) в метаноле или тетрагидрофуране (от 30 до 60 мл) обрабатывали раствором соляной кислоты (4 М в 1,4-диоксане, 10-13 мл). Перемешивание продолжали при 23°С в течение от 2 до 18 часов. Затем смесь распределяли между этилацетатом и водным раствором карбоната натрия (2 М). Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали с получением остатка, который очищали хроматографией на силикагеле, используя смесь н-гептана и этилацетата в качестве элюента, с получением чистых аминоспиртов А5.

Промежуточное соединение А5.1 (Q=NO₂; R²=F; R³=Me; R⁴=F; R⁵=F; R⁶⁼H; R⁷=H): Начиная с (R)-2-метил-пропан-2-сульфиновой кислоты [(R)-2,2-дифтор-1-(2-фтор-5-нитро-фенил)-3-гидрокси-1-метил-пропил]-амида (промежуточное соединение А4.1) (3,79 г, 10,3 ммоль), продукт, представляющий собой (R)-3-амино-2,2-дифтор-3-(2-фтор-5-нитро-фенил)-бутан-1-ол (2,5 г), был получен в виде светло-желтого твердого вещества. МС (ИСП): m/z=265,1 [М+Н⁺].

Синтез промежуточных аминооксазинов А6

Общий метод:

Раствор аминоспиртов А5 (8,4 ммоль) в этаноле (40 мл) обрабатывали в атмосфере аргона при 23°С цианогенбромидом (1,33 г, 12,6 ммоль). Светло-желтый реакционный раствор перемешивали в герметично закрытой пробирке в течение 24 часов при 85°С. К охлажденной до 23°С реакционной смеси добавляли некоторое количество льда, затем экстрагировали дихлорметаном, водой и насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (рН=8). Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали с получением сырого продукта, который либо использовали на следующей стадии без дополнительной очистки, либо очищали хроматографией на силикагеле, используя смесь н-гептана и этилацетата в качестве элюента, с получением чистого аминооксазина А6.

Промежуточное соединение А6.1 (Q=NO₂; R²=F; R³=Me; R⁴=F; R⁵=F; R⁶⁼H; R⁷=H): Начиная с (R)-3-амино-2,2-дифтор-3-(2-фтор-5-нитро-фенил)-бутан-1-ола (промежуточное соединение А5.1) (1,5 г, 5,7 ммоль), продукт, представляющий собой (R)-5,5-дифтор-4-(2-фтор-5-нитро-фенил)-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламин (1,3 г), был получен в виде светло-желтого твердого вещества. МС (ИСП): m/z=290,2 [М+Н]⁺.

Синтез промежуточных диаминов А8 (из нитросоединений А6)

Общий метод:

Раствор нитросоединения А6 (4,47 ммоль) в этаноле (35 мл) обрабатывали при 23°С в инертной атмосфере палладием на углероде (10% Pd/C, 238 мг, 5 моль%), и смесь перемешивали в атмосфере водорода (баллон) при 23°С в течение 1 часа. Катализатор отфильтровывали и дважды промывали этанолом. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением промежуточного диамина А8 в виде сырого продукта, который использовали без дополнительной очистки.

Промежуточное соединение А8.1 (R²=F; R³=Me; R⁴=F; R⁵=F; R⁶=H; R⁷=H): Начиная с (R)-5,5-дифтор-4-(2-фтор-5-нитро-фенил)-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламина (промежуточное соединение А6.1) (1,29 г, 4,47 ммоль), продукт, представляющий собой (R)-4-(5-амино-2-фтор-фенил)-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламин (1,14 г), был получен в виде бесцветной пены. МС (ИСП): m/z=260,1 [М+Н]⁺.

Синтез промежуточных йодопроизводных D1

Общий метод:

Раствор диамина А8 (500 мг, 1,9 ммоль) и йодида аммония (308 мг, 2,1 ммоль) в уксусной кислоте (9,6 мл) обрабатывали при комнатной температуре водным раствором пероксида водорода (35%, 0,19 мл, 2,1 ммоль). После перемешивания в течение ночи оставалось 50% исходного вещества. Добавляли еще один эквивалент йодида аммония и пероксида водорода, и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение ночи. Для обработки реакционную смесь фильтровали, фильтрат обрабатывали тиосульфатом натрия, затем экстрагировали этилацетатом (3 х). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, затем высушивали над сульфатом натрия и выпаривали при пониженном давлении. С целью удаления остаточной уксусной кислоты сырой продукт растворяли в дихлорметане и снова экстрагировали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия. Сырой продукт очищали хроматографией на флэш-колонке Isolate NH₂, используя градиент гептан/этилацетат в качестве элюента, с получением чистого йодо-производного D1.

Промежуточное соединение D1 (R²=F; R³=Me; R⁴=F; R⁵=F; R⁶=H; R⁷=H): Начиная с(R)-4-(5-амино-2-фтор-фенил)-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламина (промежуточное соединение А8.1) (500 мг, 1,9 ммоль), продукт, представляющий собой (R)-4-(5-амино-2-фтор-4-йодо-фенил)-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламин (415 мг), был получен в виде желтого твердого вещества. МС (ИСП): m/z=386,0 [М+Н]⁺.

Синтез промежуточных меченых тритием аминов D2

Общий метод:

В 2 мл флаконе для тритирования смесь йодо-диамина D1 (0,026 ммоль), палладия (10% на углероде) (27,6 мг, 0,026 ммоль) и триэтиламина (7,26 мкл, 0,52 ммоль) суспендировали в этилацетате (1,0 мл). Флакон присоединяли к трубопроводу трития (RC-TRITEC) и дегазировали замораживанием, откачкой и оттаиванием. Вводили газ тритий, и реакционную смесь энергично перемешивали в течение 4 часов в атмосфере трития при 710 мбар. Смесь охлаждали жидким азотом, и избыток газа трития в реакционном сосуде повторно абсорбировали на урановой ловушке для отходов трития. Растворитель удаляли лиофилизацией, и неустойчивый тритий удаляли лиофилизацией со смесью 9:1 этанола и воды (3×1 мл). Остаточное черное твердое вещество суспендировали в этаноле (1 мл), фильтровали через 0,25 мкм шприцевой фильтр и промывали этанолом. D2 собирали и хранили в виде 20 мл концентрированного раствора в этаноле.

Промежуточное соединение D2 (R²=F; R³=Me; R⁴=F; R⁵=F; R⁶=H; R⁷=H): Начиная с (R)-4-(5-амино-2-фтор-4-йодо-фенил)-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламина (промежуточное соединение D1) (10 мг, 0,026 ммоль), был получен продукт, представляющий собой [³Н]-(R)-4-(5-амино-2-фтор-фенил)-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламин (23,2 ГБк, 627 мКи). Анализ радиоактивной ВЭЖХ показал радиохимическую чистоту, составляющую 74%. Промежуточное соединение использовали без дополнительной очистки.

Пример 1

5-Бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид

Раствор гидрата 4-(4,6-диметокси[1.3.5]триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (DMTMM) (74 мг, 0,25 ммоль) в метаноле (5 мл) охлаждали до 0°С и обрабатывали 5-(бут-2-инилокси)пиразин-2-карбоновой кислоты (CAS[1221447-98-8]) (40,8 мг, 0,21 ммоль). Суспензию перемешивали при 0°С в течение 30 минут, затем добавляли по каплям раствор (R)-4-(5-амино-2-фтор-фенил)-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламина (промежуточное соединение А8.1) (50 мг, 0,19 ммоль) в метаноле (1 мл). Полученный в результате желтый раствор перемешивали при 0°С в течение 4 часов. Для обработки реакционную смесь выпаривали при пониженном давлении, и остаток обрабатывали насыщенным раствором карбоната натрия (10 мл). В результате экстракции этилацетатом, объединения органических слоев, высушивания над сульфатом натрия и выпаривания при пониженном давлении получили сырой продукт. После хроматографии на фазе силикагель-NH₂, используя этилацетат в качестве элюента, продукт был получен в виде желтоватого масла, в результате растирания которого в изопропиловом эфире получили 5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид (52 мг, выход 63%) в виде белого твердого вещества. МС (ИСП): m/z=434,2 [М+Н]⁺.

Пример 2

[³H]-5-Бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид

Этанольный раствор (R)-4-(5-амино-2-фтор-фенил)-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламина, меченого тритием (промежуточное соединение D2)(5 мл; с = 1,15 ГБк/мл (31,4 мк Ки/мл), 5,81 ГБк(157 мКи), примерно 1,7 мг, 0,0065 ммоль) концентрировали в потоке аргона. Остаток растворяли в метаноле (75 мкл) с получением светло-коричневого раствора, который охлаждали до 0°С (раствор 1). Суспензию 5-(бут-2-инилокси)пиразин-2-карбоновой кислоты CAS[1221447-98-8] (2,4 мг, 0,012 ммоль) в метаноле (94 мкл) охлаждали до 0°С. После добавления гидрата 4-(4,6-диметокси[1.3.5]триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (DMTMM) (3,7 мг, 0,013 ммоль) смесь перемешивали при 0°С в течение 2 часов. Затем к раствору 1 добавляли 75 мкл суспензии, и реакционную смесь перемешивали в течение 15 часов, при этом температура поднималась до 18°С. В течение дополнительных 3 часов перемешивание продолжали при комнатной температуре. Для обработки растворитель удаляли в потоке азота, и остаток распределяли между этилацетатом (1 мл) и водным раствором карбоната натрия (2 н.). Органический слой промывали водой (1 мл), и водную фазу снова экстрагировали этилацетатом (2×1 мл). Объединенные органические слои высушивали над сульфатом натрия и выпаривали при пониженном давлении. После очистки препаративной ВЭЖХ (XBridge C18, 5 мкм, 10×250 мм), используя смесь буфера рН 9, ацетонитрила и воды в качестве элюента, получили 3,79 ГБк (103 мКи, выход 66%) тритированного 5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амида. Анализ радиоактивной ВЭЖХ показал радиохимическую чистоту, составляющую более 99%. С помощью МС-спектроскопии было определено, что удельная активность составляет 980 ГБк/ммоль (26,5 Ки/ммоль).

Пример 3

5-Хлорпиразин-2-карбоновая кислота

Метил-5-хлорпиразин-2-карбоксилат (CAS [33332-25-1], 1 г, 5,79 ммоль) растворяли в смеси ТГФ (50 мл) и воды (50 мл). Добавляли моногидрат гидроксида лития (243 мг, 5,79 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при КГ в течение ночи. Доводили рН до 1 1 М HCl, и продукт экстрагировали тремя порциями EtOAc. Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали в вакууме. Сырое вещество очищали флэш-хроматографией (SiO₂, 50 г, от 0 до 20% МеОН в ДХМ) с получением соединения, указанного в заголовке, в виде белого твердого вещества (741 мг, 81%). МС (ИСП): m/z=159,0 [М+Н]⁺.

(R)-N-(3-(2-Амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-1,3-оксазин-4-ил)-4-фторфенил)-5-хлорпиразин-2-карбоксамид

5-Хлорпиразин-2-карбоновую кислоту (367 мг, 2,31 ммоль) объединяли с МеОН (25 мл) с получением бесцветного раствора. Добавляли гидрат 4-(4,6-диметокси[1.3.5]триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (DMTMM, 705 мг, 2,55 ммоль) при 0°С, и раствор перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Добавляли по каплям раствор (R)-4-(5-амино-2-фтор-фенил)-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-иламина (промежуточное соединение А 8.1, 600 мг, 2,31 ммоль) в МеОН (10 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при 0°С. Добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃, и продукт экстрагировали тремя порциями AcOEt. Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали в вакууме. Сырое вещество очищали флэш-хроматографией (SiO₂, 50 г, от 50 до 100% EtOAc в гептане). Белое твердое вещество (540 мг, 58%). МС (ИСП):m/z=400,1 [M+H]⁺.

((R)-4-{5-[(5-Хлор-пиразин-2-карбонил)-амино]-2-фтор-фенил}-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-ил)-карбаминовой кислоты трет-бутиловый эфир

(R)-N-(3-(2-Амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-1,3-оксазин-4-ил)-4-фторфенил)-5-хлорпиразин-2-карбоксамид (540 мг, 1,35 ммоль) объединяли с ДХМ (15 мл) с получением бесцветного раствора. Добавляли Boc₂O (310 мг, 1,42 ммоль) при 0°С, и смесь перемешивали в течение 1 ч при этой температуре. После подогревания до КТ перемешивание продолжали в течение 5 ч. Добавляли дополнительное количество Boc₂O (310 мг, 1,42 ммоль), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Затем добавляли третью порцию Boc₂O (310 мг, 1,42 ммоль), и перемешивание продолжали еще в течение одних суток. После разбавления смеси насыщенным водным раствором NaHCO₃ продукт экстрагировали ДХМ (3 порциями). Органические слои высушивали над Na2S04 и концентрировали в вакууме. Сырое вещество очищали флэш-хроматографией (SiO₂, 50 г, от 0 до 100% EtOAc в гептане). Белое твердое вещество (405 мг, 60%). МС (ИСП): m/z=500,2 [М+Н]⁺.

((R)-5,5-Дифтор-4-{2-сртор-5-[(5-проп-2-инилокси-пиразин-2-карбонил)-амино]-фенил}-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-ил)-карбаминовой кислоты трет-бутиловый эфир

((R)-4-{5-[(5-Хлор-пиразин-2-карбонил)-амино]-2-фтор-фенил}-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-ил)-карбаминовой кислоты трет-бутиловый эфир (400 мг, 800 мкмоль) объединяли с ДМФ (1,2 мл) с получением бесцветного раствора. Добавляли KOtBu (180 мг, 1,6 ммоль) и пропаргиловый спирт (449 мг, 477 мкл, 8,00 ммоль), и реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при KT. Осторожно добавляли воду, и продукт экстрагировали EtOAc. Органические слои высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали в вакууме. Сырое вещество очищали флэш-хроматографией (SiO₂, 20 г, от 0 до 50% EtOAc в гептане). Светло-желтое твердое вещество (350 мг, 84%). МС (ИСП): m/z=520,2 [М+Н]⁺.

(R)-N-(3-(2-Амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-1,3-оксазин-4-ил)-4-фторфнил)-5-(проп-2-инилокси)пиразин-2-карбоксамид

((R)-5,5-Дифтор-4-{2-фтор-5-[(5-проп-2-инилокси-пиразин-2-карбонил)-амино]-фенил}-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-2-ил)-карбаминовой кислоты трет-бутил эфир (350 мг, 674 мкмоль) объединяли с ДХМ (5,2 мл) с получением светло-желтого раствора. Раствор охлаждали до 0°С и добавляли ТФУ (768 мг, 519 мкл, 6,74 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин при 0°С ледяную баню удаляли, и реакционной смеси давали подогреться и перемешивали при КГ в течение 6 ч. Доводили рН реакционной смеси до 8 добавлением по каплям насыщенного водного раствора NaHCO₃, и продукт экстрагировали ДХМ. Органические слои высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали в вакууме. Была получена бесцветная пена, которую очищали флэш-хроматографией (SiO₂, 10 г, от 0 до 80% EtOAc в гептане). Бесцветная пена (230 мг, 81%). МС (ИСП): m/z=420,1 [М+Н]⁺.

(R)-N-(3-(2-Амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-1,3-оксазин-4-ил)-4-фторфенил)-5-(3-(трибутилстаннил)проп-2-инилокси)пиразин-2-карбоксамид

(R)-N-(3-(2-Амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-1,3-оксазин-4-ил)-4-фторфенил)-5-(проп-2-инилокси)пиразин-2-карбоксамид (170 мг, 405 мкмоль) объединяли с метоксидом три-н-бутилолова (651 мг, 586 мкл, 2,03 ммоль) и нагревали до 60°С в течение 6 часов. Реакционной смеси давали возможность охладиться до КГ и очищали флэш-хроматографией (SiO₂, 20 г, от 0 до 50% EtOAc в гептане) с получением соединения, указанного в заголовке (195 мг, 68%) в виде бесцветного масла. МС (ИСП): m/z=710,2 [М+Н]⁺.

[¹¹С]-5-Бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид

[Pd[(tBu₃)₂] (2,05 мг, 2,89 мкмоль) растворяли в ДМФ (200 мкл) во флаконе, герметично закрытом крышкой с диафрагмой. [¹¹С] Метил и од ид (полученный согласно Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrom, К., J. Label. Compels. Radiopharm. 37, 73-75, 1995) переносили во флакон в потоке гелия (30 мл/мин) с помощью канюли. Как только радиоактивность вышла на плато, раствор оставляли при комнатной температуре на 4 минуты, после чего добавляли раствор 2,03 мг (R)-N-(3-(2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-1,3-оксазин-4-ил)-4-фторфенил)-5-(3-(трибутилстаннил)проп-2-инилокси)пиразин-2-карбоксамида в ДМФ (100 мкл), и реакцию продолжали еще в течение 4 минут при комнатной температуре. Реакционную смесь разводили в 10 мл триэтиламинного буфера (рН 7,2) и пропускали через колонку Water C18 SepPak Plus. Колонку SepPak промывали 10 мл буфера, представляющего собой смесь 10:90 ацетонитрил : триэтиламин (рН 7,2). Сырой продукт элюировали с колонки SepPak 1 мл чистого ацетонитрила, смешивали с 0,5 мл триэтиламинного буфера (рН 7,2) и переносили на полупрепаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) для очистки, используя колонку Waters XBridge C18 10 мкм (150×10 мм), смесью 40% ацетонитрил: 60% триэтиламинный буфер (рН 7,2).

Фракцию, содержащую продукт, определенную с помощью встроенного радиометрического детектора, собирали в резервуаре воды. В резервуаре создавали повышенное давление, чтобы нанести продукт на колонку С18 Sep-Pak. Затем колонку С18 Sep-Pak промывали 10 мл 0,9% хлорида натрия для инъекций. Конечный продукт элюировали с колонки С18 Sep-Pak 1 мл этанола, а затем 10 мл 0,9% хлорида натрия для инъекций, через стерилизующий фильтр 0,22 мкм в стерильный апирогенный флакон, в который было предварительно внесено 4 мл хлорида натрия для инъекций. В данном конкретном эксперименте было получено 24 мКи конечного продукта через 33 минут после улавливания приблизительно 600 мКи [¹¹С]метилиодида. Вычисленная удельная активность по окончании синтеза составляла более 5900 мКи на микромоль при радиохимической чистоте, составляющей 100%. Условия ВЭЖХ: Аналитическая: Waters Xbridge 4,6×100 мм, 3,5 мкм, 40/60 MeCN/буфер ТЭА рН 7,2, 2 мл/мин, УФ 254 нм. Полупрепаративная: Waters Xbridge 10×150 мм, 10 мкм, 40/60 MeCN/буфер ТЭА рН 7,2, 10 мл/мин, УФ 254 нм.

1. Соединение, имеющее формулу I,

в котором R¹ представляет собой 6-членный гетероарил, включающий 2 гетероатома, выбранных из N, замещенный заместителем C_2-6-алкинил-C_1-6-алкокси;
R² представляет собой атом галогена;
R³ представляет собой C_1-6-алкил;
R⁴ выбран из атома галогена;
R⁵ выбран из атома галогена;
R⁶ выбран из атома водорода, и
R⁷ выбран из атома водорода,
или его фармацевтически приемлемые соли.

2. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, в котором R¹ представляет собой 6-членный гетероарил, включающий 2 гетероатома, выбранных из N, замещенный C_2-6-алкинил-C_1-6-алкокси.

3. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, в котором R¹ представляет собой пиразинил, замещенный C_2-6-алкинил-C_1-6-алкокси.

4. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, в котором R¹ представляет собой C_2-6-алкинил-C_1-6-алкокси-пиразинил.

5. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, в котором R² представляет собой F.

6. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, в котором R³ представляет собой метил.

7. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, в котором R⁴ и R⁵ оба представляют собой атом галогена.

8. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, в котором R⁴ и R⁵ оба представляют собой F.

9. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, в котором R⁶ и R⁷ оба представляют собой атом водорода.

10. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, в котором R¹ представляет собой 5-бут-2-инилокси-пиразинил.

11. Соединение, имеющее формулу I, по п. 1, представляющее собой 5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид.

12. Меченное тритием соединение, имеющее формулу Ia, в которой R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ имеют значения, как в п. 1:

13. Меченное тритием соединение, имеющее формулу Ia, по п. 12, представляющее собой [³Н]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид.

14. ¹¹С-меченое соединение, имеющее формулу Ia′, в которой R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ имеют значения, как в п. 1:

15. ¹¹С-меченое соединение, имеющее формулу Ia′ по п. 14, представляющее собой [¹¹С]-5-бут-2-инилокси-пиразин-2-карбоновой кислоты [3-((R)-2-амино-5,5-дифтор-4-метил-5,6-дигидро-4Н-[1,3]оксазин-4-ил)-4-фтор-фенил]-амид.

16. Соединение, имеющее формулу Ia, по любому из пп. 12-15, применяемое в качестве радиоактивного индикатора ВАСЕ1.

17. Соединение, имеющее формулу Ia, по любому из пп. 12-15, применяемое при исследовании связывания ВАСЕ1.

18. Соединение, имеющее формулу Ia, по любому из пп. 14-15, применяемое в качестве радиоактивного индикатора ПЭТ.

19. Соединение, имеющее формулу I, по любому из пп. 12-15, применяемое при диагностической визуализации ВАСЕ1 в головном мозге млекопитающего.

20. Способ диагностической визуализации фермента ВАСЕ1, включающий введение млекопитающему эффективного количества соединения, как определено в любом из пп. 12-15.

21. Применение соединения, как определено в любом из пп. 12-15, при получении композиции для диагностической визуализации ВАСЕ1 в головном мозге млекопитающего.

22. Соединение, имеющее формулу I, по любому из пп. 1-15, применяемое в качестве терапевтически активного вещества, обладающего свойствами ингибиторов ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2.

23. Соединение, имеющее формулу I, по любому из пп. 1-15, применяемое в качестве ингибитора активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2.

24. Соединение, имеющее формулу I, по пп. 1-15, применяемое в качестве терапевтически активного вещества для терапевтического и/или профилактического лечения заболеваний и расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида и/или олигомеров β-амилоида и/или β-амилоидных бляшек и дополнительных отложений, в частности, болезни Альцгеймера.

25. Соединение, имеющее формулу I, по пп. 1-15, применяемое в качестве терапевтически активного вещества для терапевтического и/или профилактического лечения диабета, в частности, диабета типа 2.

26. Фармацевтическая композиция, обладающая свойствами ингибиторов ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2, содержащая соединение, имеющее формулу I, по любому из пп. 1-15 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель и/или фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

27. Применение соединения, имеющего формулу I, по любому из пп. 1-15 при получении лекарственного средства, применяемого при ингибировании активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2.

28. Применение соединения, имеющего формулу I, по любому из пп. 1-15 при получении лекарственного средства, применяемого для терапевтического и/или профилактического лечения заболеваний и расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида и/или олигомеров β-амилоида и/или β-амилоидных бляшек и дополнительных отложений, в частности, болезни Альцгеймера.

29. Применение соединения, имеющего формулу I, по любому из пп. 1-15 при получении лекарственного средства, применяемого для терапевтического и/или профилактического лечения диабета, в частности диабета типа 2.

30. Соединение, имеющее формулу I, по любому из пп. 1-15, применяемое при ингибировании активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2.

31. Соединение, имеющее формулу I, по пп. 1-15, применяемое при терапевтическом и/или профилактическом лечении заболеваний и расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида и/или олигомеров β-амилоида и/или β-амилоидных бляшек и дополнительных отложений, в частности болезни Альцгеймера.

32. Соединение, имеющее формулу I, по пп. 1-15, применяемое при терапевтическом и/или профилактическом лечении диабета, в частности диабета типа 2.

33. Способ применения при ингибировании активности ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2, в частности, для терапевтического и/или профилактического лечения заболеваний и расстройств, характеризующихся повышенными уровнями β-амилоида и/или олигомеров β-амилоида и/или β-амилоидных бляшек и дополнительных отложений, болезни Альцгеймера, диабета или диабета типа 2, включающий введение соединения, имеющего формулу I, по любому из пп. 1-15 человеку или животному.