Способ получения координационных соединений олигогалактуроновой кислоты с биогенными металлами (ii), как систем доставки биогенных металлов (ii) и систем выведения тяжелых металлов (ii)

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и описывает способ получения координационных соединений олигогалактуроновой кислоты с биогенными металлами (II). Способ включает получение из пектинсодержащего препарата олигогалактуроновой кислоты со степенью полимеризации не менее 10, подвергаемой взаимодействию с солью металла (II): меди, кобальта, железа, цинка, марганца, магния в водной среде при нейтральной pH, экспозицию реакционной смеси при комнатной температуре, нейтрализацию образовавшейся кислоты, водную промывку, центрифугирование и высушивание осадка. Согласно изобретению к 1 л 5,0·10^-3 M водного раствора очищенной олигогалактуроновой кислоты при перемешивании добавляют сначала 2 M водный раствор гидрата аммиака до pH 8, затем 1 л 4,5·10^-2 M водного раствора ацетата металла (II); образующийся гелеобразный осадок обрабатывают 96% этанолом при объемном соотношении 1:2, выдерживают 2 ч. Изобретение обеспечивает доставку биогенных металлов (II), а также выведение катионов тяжелых металлов (II) из организма. 8 табл., 4 ил., 6 пр.

 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа получения лекарственных средств на основе олиго-галактуроновой кислоты (олигоГК), играющей роль носителя ионов биогенных металлов (II) (БМе (II)) и выводящей ионы тяжелых металлов (II) (ТМе (II)).

Описан способ получения медицинского (очищенного) пектина из пектиновых образцов, выделенных из выжимок сахарной свеклы, цитрусовых плодов и яблок (Кайшева Н.Ш. Способ получения медицинского очищенного пектина. Пат. РФ 2116075, МКИ А61К 31/725, опубл. 27.07.1998, 16 с.), основанный на растворении пектинов в 0,5% растворе цитрата аммония (1:25), процеживании полученного раствора, его диализе через целлофановую мембрану (24 ч), концентрировании и обработке диализата 96% этанолом (1:3), деметоксилировании целевого продукта раствором гидрата аммиака (рН 10,5, 1:10, 2 ч) и деминерализации хлороводородной кислотой (рН 2,0, 1 ч). Данный способ получения пектинов близок к предлагаемому способу. Несмотря на достижение указанным способом высокой степени чистоты (отсутствие примесных катионов металлов, флавоноидов), подтверждаемой выраженной комплексообразующей способностью (1078-1525 мг Pb²⁺/г) и характером УФ-спектров, целевой продукт (очищенный пектин) предназначен только для детоксикации катионов ТМе (II), эталоном которых служат ионы свинца (II). Продукты взаимодействия - координационные соединения или пектинаты ТМе (II) - значительно устойчивее, чем пектинаты БМе (II), поэтому конкуренция между катионами ТМе (II) и БМе (II) в условиях in vivo за связывание с пектинами происходит в пользу ТМе (II). С другой стороны, относительно слабая связь катионов БМе (II) с олигоГК и прочная связь катионов БМе (II) с биологическими субстратами не способствуют выведению катионов этих металлов (II) из биологических систем с помощью олигоГК. Указанные свойства позволили предположить использование олигоГК не только как детоксикантов, связывающих и ускоряющих выведение из биологических систем и жидкостей катионов ТМ (II), но и как систем доставки БМе (II) в биологические среды. Катионами подобных БМе (II), входящих в состав ферментов, гормонов, витаминов, являются катионы меди (II), кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния (Ершов Ю.А., Попков В.А., Берлянд А.С. и др. Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов. - М., ВШ, 2002, 560 с.). Дефицит катионов этих БМе (II) приводит к нарушению нормальной жизнедеятельности человека: развитию анемии, диабета, атеросклероза, нефролитиаза и т.д. Для лечения пациентов с указанными нозологиями крайне редко используются неорганические соли БМе (II); в подавляющем большинстве случаев лекарственными средствами являются координационные соединения БМе (II) с биолигандами (углеводами, витаминами, органическими кислотами и др.), обладающие высокой биологической доступностью и фармакологической активностью (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна, 2000, 14 изд., 2 т.). Применение физических смесей пектинов и неорганических солей БМе (II) оказывает более выраженный фармакологический эффект, чем отдельных компонентов, но значительно меньшую активность по сравнению с пектинатами БМе (II) (Ашубаева З.Ж., Молдошев A.M., Джумалиев А.Д. и др. Применение пектинов в медицине. - Фрунзе: Илим, 1990, 65 с.).

В этой связи целесообразна разработка пектинатов Me (II) как систем доставки БМе (II) и систем выведения ТМе (II) из организма Наиболее близким способом получения подобных пектинатов, принятым за прототип, является способ получения координационных соединений БМе с олигоГК или полигалактуроновыми кислотами (полиГК) общей формулы: [Me^z+(C₆H₇O₆)_2-3]_n(H₂O)_2-3, где n (степень полимеризации)=10-145, Me^z+ - 2-8 ионов БМе, выбранных из группы: железо (II), калий, кобальт (II), марганец (II), цинк, хром (III), молибден (V), ванадий (IV), магний, никель (II), при условии, что один из катионов является катионом калия или магния, z⁺ - заряд иона Me (Лакатош Б., Майзель Ю., Варью М. Способ получения комплекса иона металла с олиго- или полигалактуроновыми кислотами. Пат. СССР 886750, МКИ С07Н 23/00, опубл. 30.11.1981). Способ заключается в том, что сначала из пектинового яблочного порошка получают полиГК путем суспендирования порошка водой (1:20, 10 ч), разбавления суспензии водой (1:4), доведения рН до ~12 с помощью 0,1 М раствора щелочи, катализа разложения хлоридом натрия или алюминия (1000 г смеси: 1 г соли), выдерживания смеси (20°C, 2 ч), создания рН ~0,5 концентрированной хлороводородной кислотой, осаждения спиртом, гомогенизации полиГК с водой и установления рН ~4,5 раствором щелочи, очистки и сушки продуктов (60°C). Операции гидролиза и осаждения проводят 4-кратно. Технологический выход полиГК составляет 40%, n ~140, содержание свободных карбоксильных групп 25,2%, содержание метоксильных групп 0,1%. Далее получают декагалактуроновую кислоту (декаГК) путем смешивания полиГК с 0,1 М раствором гидроксида натрия (1:32÷36), выдерживания при рН ~4,5 (10 ч), доведения рН до ~3 с помощью 0,05 М раствора серной кислоты, кипячения (1 ч), охлаждения, осаждения спиртом, сушки (60°C). Технологический выход декаГК 80%. Для получения целевого продукта олигоГК или полиГК (n=10-145) подвергают взаимодействию в водном растворе или системе растворителей из воды и полярного органического растворителя с солями (сульфатами, хлоридами) или комплексами 2-8 ионов Me с более низкими константами устойчивости, чем у целевого продукта. Для получения фармацевтических композиций предпочтительными являются соединения с n=2-20.

Недостатками способа являются:

- неэффективность использования полиГК в качестве транспортных систем доставки и выведения катионов БМе в связи с их низкой биологической доступностью в биологические субстраты (особенно в костную ткань, депонирующую катионы ТМе);

- создание кислой среды (рН 4,5-6,5) при получении металлических производных за счет подавления диссоциации ГК способствует снижению степени комплексообразования ГК;

- соосаждение избытка ионов БМе с целевыми продуктами и невозможность их удаления промывкой водой; так, с 1 молем диГК (1/5 декаГК) осаждается 1,4 моль меди (II), по 3 моль кобальта (II), железа (II), цинка, 3,4 моль марганца (II), 4 моль никеля (II), 6,8 моль магния;

- относительно низкий технологический выход целевых продуктов (49,1-76,0%);

- многостадийность и трудоемкость технологии получения целевого продукта (гомогенизация яблочного порошка, щелочной гидролиз пектина, нейтрализация сильными кислотами, выделение, щелочной гидролиз и термолиз полиГК, выделение декаГК, получение, отделение и очистка металлических производных);

- большая продолжительность способа - 8 суток (получение полиГК - 4 суток, декаГК - 0,5 суток, металлических производных декаГК - 3,5 суток).

Цель изобретения - увеличение степени полноты протекания реакции взаимодействия олигоГК с катионами БМе (II) (образования олигоГК-БМе (II)) и исключение избытка солей металлов (II); повышение технологического выхода целевых продуктов; упрощение и сокращение продолжительности способа; использование целевых продуктов как носителей катионов БМе (II) и систем выведения катионов ТМе (II) из организма.

Поставленная цель достигается тем, что способ получения олигоГК-БМе (II) осуществляют сначала путем получения из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075) медицинского (очищенного) пектина, представляющего собой олигоГК (с молярной массой 3200 г/моль, n=18, рН 3,50), после чего к 1 л 5,0·10^-3 М водного раствора олигоГК при интенсивном перемешивании добавляют 2 М водный раствор гидрата аммиака до установления рН реакционной смеси ~ 8, затем приливают 1 л 4,5·10^-2 М водного раствора ацетата одного из Me (II): меди (II), кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния. Образующийся гелеобразный осадок обрабатывают 96% этанолом (1:2), выдерживают смесь при комнатной температуре (2 ч), образовавшуюся уксусную кислоту нейтрализуют 2 М раствором гидрата аммиака, декантируют надосадочную жидкость, промывают осадок трижды водой по 100 мл, центрифугируют и сушат при температуре 60°С до постоянной массы. Общая продолжительность способа, включая получение олигоГК (30 ч) и олигоГК-БМе (II) (3 ч), составляет 33 ч.

Используемые в предлагаемом способе количества реагентов (моль): 5,0·10^-3 олигоГК и 4,5·10^-2 катионов Me (II), или соотношение олигоГК:катионы Me (II) 1:9, обеспечивающее максимальный технологический выход целевых продуктов, является оптимальным, что показано на примере олигоГК-меди (II) (таблица 1). Увеличение количества ионов меди (II) не ведет к увеличению выхода олигоГК-меди (II). Подобное соотношение является оптимальным и для получения других металлических производных олигоГК: кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния.

Изучение влияния осадителя - этанола различной концентрации - на полноту осаждения олигоГК-БМе (II) на примере олигоГК-меди (II) (таблица 2) свидетельствует о максимальном выходе целевого продукта при использовании 96% этанола.

Изучение влияния объемного соотношения первоначально образовавшегося гелеобразного осадка олигоГК-БМе (II) (на примере олигоГК-меди (II)) и 96% этанола на полноту осаждения (таблица 3) свидетельствует об оптимальном соотношении 1:2.

Оптимальной продолжительностью экспозиции реакционной смеси после осаждения олигоГК-БМе (II) (на примере олигоГК-меди (II)) 96% этанолом при соотношении 1:2 является 2 ч (таблица 4).

Состав полученных олигоГК-БМе (II) установлен на деривато-графе марки «Q-1500» фирмы MOM (Венгрия) с применением различных вариантов термического анализа: термогравиметрическим (ТГА), дифференциальным термогравиметрическим (ДТГА), дифференциальным термическим (ДТА). В качестве примера на рисунке 1 приведены термические кривые олигоГК-меди (II), в соответствии с которыми отмечены характерные эндотермические эффекты. Первый эффект отмечен в области температур 80-115°C на кривой ДТГА и 100-120°C на кривой ДТА; ему соответствует на кривой ТГА потеря адсорбционной воды 7,4%. Второй эндотермический эффект отмечен при температуре 150-165°C на кривой ДТГА и при 155-160°C на кривой ДТА; этому эффекту на кривой ТГА соответствует потеря внутри-координационной воды 2,8%. Кроме того, обнаружены эндотермические эффекты при температурах 200-220°C (декарбоксилирование), 240°C и выше (деструкция).

Используя метод потенциометрического титрования 0,3% водной суспензии олигоГК-БМе (II) 0,1 М раствором гидроксида натрия на рН-метре марки «рН-340» (индикаторный электрод - стеклянный, электрод сравнения - хлорсеребряный), на примере олигоГК-меди (II) установлена точка эквивалентности при рН 4,87, соответствующая объему титранта 4,0 мл при ΔрН/ΔV=1,62 (рисунок 2). Выявленная в кислой среде точка эквивалентности для олигоГК-меди (II), аналогичная и для других олигоГК-БМе (II), доказывает проявление ими кислотных свойств за счет содержащихся во внутренней сфере молекул воды, образующих гидроксокомплекс.

Учитывая потерю адсорбционной воды (7,4%), «внутрисферной» воды (2,8%) и установленное гравиметрическим методом после озоления соотношение 1 моль ионов меди (II):1 моль диГК, состав олигоГК-меди (II) выражается формулой: [Cu(C₆H₇O₆)₂(H₂O)₂]₉. Для других олигоГК-БМе (II) получены идентичные результаты.

Изучение ИК-спектров поглощения полученных заявляемым способом олигоГК-БМе (II) в виде таблеток с бромидом калия на ИК-фурье-спектрометре «Magna-750» фирмы «Nicolet» (разрешение 2 см^-1) показало сходство в наличии полос поглощения в области 1630-1600 и 1430-1400 см^-1, характерных для карбоксилат ионов и молекул воды. Положение этих полос и разница частот для несимметричных и симметричных колебаний Δν (as-s) карбоксилат ионов (таблица 5), являющихся функциями массы, радиуса, электростатического поля и поляризующего действия катионов (Филиппов М.П. Инфракрасные спектры пектина и его производных. Изв. АН МССР, 1976, №4, с. 80-87), свидетельствуют об образовании катионами БМе (II) несимметричных структур с карбоксильными группами олигоГК, выполняющими роль монодентатных лигандов. Наличие молекул воды, координированной с ионами БМе (II), помимо указанной полосы, подтверждается и другой полосой поглощения - в области 880-650 см^-1. В этой связи, структура элементарного звена олигоГК-БМе (II) включает ячейку из катиона БМе (II), карбоксильных групп олигоГК и молекул воды (рисунок 3).

На основании вышеизложенного можно сделать заключение, что реакция образования олигоГК-БМе (II) выражается уравнением:

Для расчета константы равновесия (К_равн.), определяющей направление и полноту протекания данной реакции, определены значения:

а) константы диссоциации (К_дис.), или кислотности, олигоГК (0,1% раствор) методом алкалиметрического титрования (0,1 М раствор гидроксида натрия) при ионной силе 0,091, создаваемой 1 М раствором хлорида натрия, с потенциометрической фиксацией точки эквивалентности. На кривой титрования (рисунок 4) наблюдается один скачок титрования, что, по-видимому, связано с отличием ступенчатых констант олигоГК менее чем в 10³-10⁴ раз. По молярной массе эквивалента титранта рассчитано значение рК (3,50), антилогарифм которого представил собой К_{дис.олигоГК}=3,2·10^-4.

б) константы растворимости (K_s), или произведения растворимости, рассматриваемой как функция комплексообразования, методом растворимости с последующим определением равновесных концентраций в растворе олигоГК методом спектрофотометрии в УФ области (Кайшева Н.Ш., Компанцев В.А., Щербак С.Н. и др. Изучение взаимодействия пектинов с металлами. Фармация, 1992, т.41, №2, с. 45-49) и ионов БМе (II) методом комплексонометрического титрования (Шварценбах Г., Флашка Г. Комплексонометрическое титрование. Пер. с нем. - М.: Химия, 1970, 360 с.). В зависимости от рН реакционной среды, в которой образуется олигоГК-меди (II), выбранный в качестве примера олигоГК-БМе (II), значения K_s и соответствующие константы устойчивости (13) составили при рН 2: K_s=1,64·10^-8, β=6,10·10⁷; при рН 5: K_s=4,98·10^-8, β=2,01·10⁷; при рН 8: K_s=3,43 10^-10, β=2,92·10⁹. Для других олигоГК-БМе (II) полученные значения K_s и β имеют такой же порядок.

Учитывая стехиометрические коэффициенты перед слабыми электролитами в уравнении (1) и исключая воду как реагент, не претерпевший изменения в ходе реакции, выражение К_равн. имеет вид:

Рассчитанные для олигоГК-меди (II) значения К_равн. составили

при рН 2: К_равн.=3,2·10^-4/1,64·10^-8=1,95·10⁴;

при рН 5: К_равн.=3,2·10^-4/4,98·10^-8=6,43·10³;

при рН 8: К_равн.=3,2·10^-4/3,43·10^-10=9,33·10⁵.

Полученные данные свидетельствуют о том, что реакция образования олигоГК-меди (II) как и других олигоГК-БМе (II) протекает практически полно как при рН 8, так и при рН 2 (К_равн.>10⁴), причем степень полноты протекания реакции при рН 8 в 48 раз больше, чем при рН 2. При рН 5, используемой в способе - прототипе, реакция комплексообразования протекает практически неполно (К_равн.<10⁴); степень полноты в 145 раз меньше, чем при рН 8. В этой связи, оптимальной средой, обусловливающей наиболее высокую полноту протекания реакции, является рН 8.

Оставшийся после выделения олигоГК-меди (II) центрифугат (маточный раствор) проанализирован на наличие катионов меди (II) по очень чувствительной реакции взаимодействия с 3 М водным раствором гидрата аммиака (Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия (аналитика). В 2 кн. Кн. 1. Общие теоретические основы. Качественный анализ. - М., ВШ, 2001, 615 с.) и наличие олигоГК методом спектрофо-тометрии в УФ области (Кайшева Н.Ш. и др. … Фармация, 1992). Полученные отрицательные результаты (отсутствие интенсивно синего окрашивания раствора и отсутствие характерного максимума поглощения при 286 нм соответственно) свидетельствовали об отсутствии в фильтрате ионов меди (II) и олигоГК, что дополнительно доказывает практическую полноту протекания реакции. В промывных водах, полученных после очистки декаГК-меди (II)-калия (способ-прототип), указанная реакция на ионы меди (II) оказалась положительной.

Аналогичные олигоГК-меди (II) результаты изучения состава и полноты протекания реакций получены для других олигоГК-БМе (II): кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния.

Выбор солей БМе (II) в виде ацетатов в заявляемом способе обусловлен необходимостью образования в результате реакций слабой уксусной кислоты с К_дис.=1,74·10^-5 (Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. - М.: Химия, 1989, 6 изд., 448 с.), практически не влияющей на рН среды и устойчивость целевых продуктов, в отличие от серной или соляной кислот, выделяющихся при использовании сульфатов или хлоридов (способ-прототип).

Выбор свекловичного пектина для получения олигоГК обусловлен его наибольшей среди других пектинов (яблочного, цитрусового, подсолнечного, хлопкового) комплексообразующей способностью (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075).

В молекулах олигоГК карбоксильные группы независимо от степени замещения катиона водорода доступны для ионного обмена (Кайшева Н.Ш., Кайшев А.Ш. Катионообменные свойства полиуронатов s-металлов. Химико-фармацевтический журнал, 2014, т. 48, №4, с. 43-46). Предполагая возможность обмена в олигоГК-БМе (II) ионов БМе (II) (меди (II), кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния) на ионы ТМе (II) (использованы ионы свинца (II) и кадмия), определены степени десорбции (высвобождения) катионов БМе (II) и сорбции (связывания) катионов ТМе (II). С этой целью олигоГК-БМе (II) массой около 0,1 г (точные навески) вносили в 20 мл 1,25·10^-2 М раствора ацетата свинца (II) (5,18·10^-2 г ионов свинца (II)) или в 20 мл 5,0·10^-2 М раствора ацетата кадмия (11,24·10^-2 г ионов кадмия). Смеси выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании, после чего твердую и жидкую фазы отделяли центрифугированием. Далее катионы ТМе (II) (свинца (II), кадмия), оставшиеся в растворе после ионного обмена, и катионы БМе (II) (меди (II), кобальта (II), железа (II), цинка, марганца (II), магния), перешедшие из олигоГК-БМе (II) в раствор, отделяли друг от друга и определяли количественное содержание:

1. Для отделения катионов свинца (II) от катионов БМе (II) к анализируемому раствору добавляли 1 М водный раствор серной кислоты до полного выделения белого осадка сульфата свинца (II), смесь центрифугировали; в растворе оставались катионы БМе (II) (Харитонов Ю.Я. … 2001).

Количественное содержание катионов свинца (II) определяли методом гравиметрии по массе гравиметрической формы - сульфата свинца (II) - с учетом гравиметрического (аналитического) фактора 0,6832 (Лурье Ю.Ю. … 1989).

Количественное содержание катионов железа (II) определяли методом фотометрии по реакции с сульфосалициловой кислотой в аммиачной среде (=631,5) (Шарло Г. Методы аналитической химии. Количественный анализ неорганических соединений. - М.: Химия, 1965, 976 с.).

Количественное содержание катионов других БМе (II) (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА (Шварценбах Г. … 1970): катионов меди (II) (рН 8 с помощью аммиачного буферного раствора, индикатор - мурексид); катионов кобальта (II) (рН 8 с помощью 1 М раствора гидрата аммиака, индикатор - мурексид); катионов цинка (рН 10 с помощью универсальной буферной смеси, индикатор - эриохром черный Т); катионов марганца (II) (в присутствии 20% раствора триэта-ноламина гидрохлорида, аскорбиновой кислоты, рН 10 с помощью универсальной буферной смеси, индикатор - эриохром черный Т); катионов магния (рН 10 с помощью универсальной буферной смеси, индикатор - эриохром черный Т).

2. Для отделения катионов кадмия от катионов магния, железа (II), марганца (II) к анализируемым растворам добавляли 25% раствор гидрата аммиака до создания рН 12, смеси центрифугировали: в бесцветных растворах оставались ионы кадмия в виде аммиаката, в осадках - гидроксиды магния (белого цвета), железа (II) (черного цвета), марганца (II) (белого цвета). Осадки отделяли, промывали водой, обрабатывали 3 М раствором хлорида аммония (для растворения гидроксида магния) или 2 М раствором хлороводородной кислоты (для растворения гидроксидов железа (II) и марганца (II)) (Харитонов Ю.Я. … 2001).

Количественное содержание катионов Me (II) (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА: катионов кадмия (рН 10 с помощью аммиачного буферного раствора, индикатор - пирокатехиновый фиолетовый), катионов марганца (II) и магния (как указано выше) (Шварценбах Г. … 1970). Содержание катионов железа (II) определяли методом фотометрии по реакции с сульфосалициловой кислотой в аммиачной среде (Шарло Г. … 1965).

3. Для отделения катионов кадмия от катионов цинка к анализируемому раствору при нагревании (60°C) прибавляли 2 М водный раствор гидроксида натрия до создания рН 13, смесь центрифугировали: в осадке находился гидроксид кадмия (белого цвета), в бесцветном растворе - ионы цинка. Осадок отделяли, промывали водой, обрабатывали 2 М водным раствором хлороводородной кислоты (Харитонов Ю.Я. … 2001).

Количественное содержание катионов кадмия и цинка (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА, как указано выше (Шварценбах Г. … 1970).

4. Для отделения катионов кадмия от катионов кобальта (II) к анализируемому раствору прибавляли 1 М раствор хлороводородной кислоты до создания рН 0,5, затем при нагревании (60°C) добавляли 1 М раствор сероводородной кислоты: в растворе (розового цвета) оставались ионы кобальта (II), в осадке (желтого цвета) - сульфид кадмия. Осадок отделяли, промывали водой, при 60°C обрабатывали 3 М раствором азотной кислоты до растворения (Харитонов Ю.Я. … 2001).

Количественное содержание катионов кадмия и кобальта (II) (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА, как указано выше (Шварценбах Г. … 1970).

5. Для отделения катионов кадмия от катионов меди (II) к анализируемому раствору при рН 5, создаваемом 1 М раствором серной кислоты, при нагревании (60°C) прибавляли кристаллический тиосульфат натрия: в осадке (черного цвета) находился сульфид меди (II), в бесцветном растворе - ионы кадмия. Осадок отделяли, промывали водой, обрабатывали 2 М раствором азотной кислоты до растворения (Харитонов Ю.Я. … 2001).

Количественное содержание катионов кадмия и меди (II) (в отдельных растворах) определяли методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА, как указано выше (Шварценбах Г. … 1970).

По соотношению количеств (моль) ионов БМе (II), выделившихся в результате катионного обмена и содержавшихся в олигоГК-БМе (II), судили о степени их десорбции (высвобождения) из олигоГК-БМе (II). Степень сорбции (связывания) олигоГК катионов ТМе (II) определяли как отношение количеств (моль) связанных ионов ТМе (II) и ионов БМе (II), содержавшихся в исходном олигоГК-БМе (II). Полученные данные (таблица 6) свидетельствуют о высокой степени десорбции катионов БМе (II) как в растворе свинца (II): 58,7-93,1% (в среднем 81,0%), так и в растворе кадмия: 55,8-92,0% (в среднем 79,5%). Примерно на таком же уровне находятся показатели сорбции олигоГК катионов свинца (II): 56,8-92,6% (в среднем 79,7%) и кадмия: 51,5-91,0% (в среднем 77,2%).

Исследование биологических свойств олигоГК-БМе (II) на примере олигоГК-железа (II) проведено в опытах на белых беспородных крысах-самцах массой по 180-220 г; каждая опытная группа состояла из 6 особей. Животные в течение эксперимента находились на стандартном режиме питания. Для приготовления растворов в качестве растворителя использовали изотонический раствор (0,9%) хлорида натрия. Результаты биологических исследований обрабатывали методом множественной статистики с использованием параметрического критерия Стьюдента; определяли среднюю арифметическую величину, ее стандартную ошибку и вероятность различий результатов сравниваемых групп животных (Ойвин И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований. Патол. физиология и эксперим. терапия, 1960, т. 4, №4, с. 76-85).

Острую токсичность олигоГК-железа (II) определяли методом Кербера (Сидоров К.К. Методы определения острой токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия). - М.: Медицина, 1970, 117 с.) путем одноразового перорального введения препарата в дозах 5000 мг/кг, 1000 мг/кг, 500 мг/кг, 250 мг/кг, 100 мг/кг. Введение более высоких доз было невозможным из-за низкой растворимости исследуемого вещества. За состоянием животных наблюдали в течение 14 дней; гибели крыс не отмечалось. При вскрытии животных через 14 дней изменений со стороны печени, почек, селезенки не обнаружено. Данные по изучению острой токсичности олигоГК-железа (II) приведены в таблице 7. Поскольку даже максимально введенная доза олигоГК-железа (II) (5000 мг/кг) не вызвала токсичности, то рассчитать LD₅₀ не представилось возможным; по-видимому, LD₅₀>5000 мг/кг. В связи с этим, согласно классификации токсических веществ (Сидоров К.К. … 1970), олигоГК-железа (II) отнесен к группе практически нетоксичных веществ.

При интоксикации соединениями ТМе, типичным представителем которых являются катионы свинца (II), нарушаются различные звенья биологического окисления: блокируются SH-группы дегидрогеназ, участвующих в окислении субстратов, снижается поступление водорода в дыхательную цепь, нарушаются процессы окислительного фосфорилирования, интенсифицируется окисление жирных кислот фосфолипидов, ведущее к образованию пероксидов (свободных радикалов). Образующиеся продукты пероксидного окисления липидов снижают устойчивость клеток, в т.ч. эритроцитов, приводя их к разрушению и развитию гемической анемии (Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. Механизмы токсического действия неорганических соединений. - М.: Медицина, 1989, 272 с.). Поэтому в качестве модели для проведения биологических испытаний олигоГК-БМе (II) как лекарственных средств, перспективных в терапии гемической анемии, выбрана модель интоксикации животных ацетатом свинца (II).

Испытания проводили с олигоГК-железа (II) на фоне свинцовой интоксикации путем изучения показателей крови крыс: количество эритроцитов, содержание гемоглобина и содержание катионов свинца (II). Для исследования использовали 5 групп животных:

№1 - интактные животные;

№2 - животные, перорально получавшие ацетат свинца (II) в однократной дозе 75 мг/кг в день (1,5 мл 1% раствора) ежедневно в течение 7 дней (контроль) (Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. Механизмы. 1989);

№3 - животные, перорально получавшие ацетат свинца (II) в однократной дозе 75 мг/кг в день (1,5 мл 1% раствора) и через 1 ч олигоГК-железа (II) в однократной дозе 150 мг/кг в день (3 мл 1% суспензии) ежедневно в течение 7 дней;

№4 - животные, перорально получавшие ацетат свинца (II) в однократной дозе 75 мг/кг в день (1,5 мл 1% раствора) и через 1 ч олигоГК в однократной дозе 150 мг/кг в день (3 мл 1% суспензии) ежедневно в течение 7 дней;

№5 - животные, перорально получавшие ацетат свинца (II) в однократной дозе 75 мг/кг в день (1,5 мл 1% раствора) и через 1 ч лекарственный препарат сравнения, содержащий железа (II) сульфат, «Ферроплекс» (Машковский М.Д. … 2000) в однократной дозе 30 мг/кг в день (0,6 мл 1% суспензии) ежедневно в течение 7 дней.

Забор крови у животных проводили по завершении опытов (на 8 сутки) путем декапитации под легким эфирным наркозом. Количество эритроцитов в крови животных определяли с помощью прибора «Целлоскопа ИКМ-II» путем автоматической цифровой регистрации электрических импульсов, возникающих при прохождении каждого эритроцита через микроотверстие капсулы прибора при протяжке через капсулу фиксированного объема суспензии эритроцитов, полученной из образцов крови. Содержание гемоглобина в крови определяли гемиглобинцианидным методом (методика Сали) (Камышников B.C., Волотовская О.А., Ходюкова А.Б. и др. Методы клинических лабораторных исследований. - Минск: Бел. наука, 2001, 695 с.). Содержание катионов свинца (II) в крови определяли методом комплексоно-метрического титрования 0,01 М раствором ЭДТА (рН 10, индикатор - эриохром черный Т) после гидролиза субстрата смесью концентрированных азотной и серной кислот (1:1) и растворения минерального остатка в растворах ацетата аммония (Шварценбах Г. … 1970).

Полученные данные (таблица 8) свидетельствуют о снижении как количества эритроцитов, так и содержания гемоглобина в крови животных, интоксицированных ацетатом свинца (II). Влияние трех исследованных препаратов на фоне свинцовой интоксикации достоверно способствовало увеличению указанных показателей, но в раз ной степени. Наиболее эффективно подобное воздействие проявил олигоГК-железа (II), на 82,51% приблизивший количество эритроцитов к норме и практически нормализовавший содержание гемоглобина (P₁>0,05). Активность препарата сравнения «Ферроплекса» оказалась ниже, чем у олигоГК-железа (II): на 20,54% при влиянии на количество эритроцитов и на 22,76% - на содержание гемоглобина. Практически на уровне «Ферроплекса» находилась олигоГК по воздействию на оба гемических показателя (Р₄>0,05). Примечательна аналогичная тенденция изменения указанных гемических показателей между собой под влиянием всех трех исследованных препаратов.

В отличие от «Ферроплекса», и олигоГК-железа (II) и олигоГК достоверно снижали концентрацию катионов свинца (II) в крови интоксицированных животных: соответственно в 2 раза и 1,5 раза; эффект олигоГК-железа (II) на 28,6% превосходил подобное действие олигоГК.

Таким образом, при введении олигоГК-железа (II) степень уменьшения количества эритроцитов и содержания гемоглобина в крови животных на фоне свинцовой интоксикации значительно ниже, чем при применении как «Ферроплекса», так и олигоГК. С другой стороны, олигоГК-железа (II) и в меньшей степени олигоГК способствуют связыванию и ускорению выведения катионов свинца (II) в отличие от «Ферроплекса». Иначе говоря, если «Ферроплекс» способствует только снижению интенсивности гемоглобинопении и эритро-цитопении, хотя и в меньшей степени, чем олигоГК-железа (II), то последний, кроме того, выполняет роль эффективного антидота катионов свинца (II).

Предлагаемый способ получения олигоГК-БМе (II) как систем доставки БМе (II) и систем выведения ТМе (II) поясняется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение олигоГК-меди (II)

1. Вначале получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075). 2 г сухого свекловичного пектина помещают в коническую колбу вместимостью 1 л, приливают 50 мл 0,5% раствора цитрата аммония и перемешивают содержимое колбы на магнитной мешалке в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствору дают отстояться (5 мин), после чего его процеживают через тройной слой марли. К полученному раствору приливают 25 мл 0,1 М раствора хлорида калия, перемешивают и диализуют раствор в диализной трубке длиной 15 см и рабочей площадью 9 см², конец которой закрыт целлофановой мембраной толщиной 0,4 нм. Трубку помещают в стакан, в котором находится 100 мл 0,1 М раствора хлорида калия. Стакан и трубку с раствором выдерживают в термостате (38°C, 24 ч). Полученный диализат концентрируют под вакуумом до 1/3 от первоначального объема, обрабатывают 96% этанолом в соотношении 1:3. Выпавший осадок фильтруют под вакуумом, промывают дважды на фильтре 90% этанолом (по 30 мл), переносят в колбу вместимостью 100 мл, приливают 10 мл воды (примерно 5% раствор), добавляют 5 мл 5% раствора гидрата аммиака до достижения рН смеси 10,5 (потенциометрически). Колбу со смесью плотно закрывают крышкой и выдерживают 2 ч при комнатной температуре (происходит деметоксилирование олигоГК и раствор приобретает форму желе). Полученное желе постепенно подкисляют разбавленным (8,3%) раствором хлороводородной кислоты до рН ~ 2 и оставляют смесь на 1 ч при температуре 18°C. Выпавший осадок фильтруют через бумажный фильтр, промывают на фильтре 90% этанолом (дважды по 30 мл), сушат при температуре 60°C. Полученная олигоГК имеет среднюю молярную массу 3200 г/моль, n=18, К_дис. (0,1% водный раствор)=3,2·10^-4.

2. Далее из олигоГК получают олигоГК-меди (II). К 1 л 5,0·10^-3 М водного раствора олигоГК, имеющему рН 3,50, при перемешивании на магнитной мешалке добавляют 2 М водный раствор гидрата аммиака до установления рН 8 (потенциометрически), затем приливают 1 л 4,5·10^-2 М водного раствора ацетата меди (II). Сразу образующийся гелеобразный осадок обрабатывают 96% этанолом в объемном соотношении 1:2, выдерживают смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. Высвободившуюся уксусную кислоту нейтрализуют 2 М водным раствором гидрата аммиака. Декантируют надосадочную жидкость, осадок центрифугируют, трижды промывают водой по 100 мл, снова декантируют надосадочную жидкость и центрифугируют осадок. Осадок олигоГК-меди (II) сушат при температуре 60°C в сушильном шкафу до постоянной массы.

Технологический выход олигоГК-меди (II) составил 17,38 г, или 85,9% к теоретически возможному выходу олигоГК-меди (II) (20,23 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-меди (II), определенная методом вискозиметрии (Нелина В.В., Донченко Л.В., Карпович Н.С. и др. Пектин. Методы контроля в пектиновом производстве. - Киев, Пектин, 1992, 114 с.), составила 4046 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-меди (II) (%): С 32,0, Н 4,0, О 49,8, Си 14,2, позволил вывести эмпирическую формулу: Cu₉C₁₀₈H₁₆₂O₁₂₆ или [Cu(C₆H₇O₆)₂(H₂O)₂]₉. Общая продолжительность способа получения олигоГК-меди (II) составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-меди (II) - 3 ч.

Пример 2. Получение олигоГК-кобальта (II)

Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.

Далее получают олигоГК-кобальта (II) из олигоГК (1 л 5,0·10^-2 М водный раствор) и ацетата кобальта (II) (1 л 4,5·10^-2 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.

Технологический выход олигоГК-кобальта (II) составил 16,94 г, или 84,6% к теоретически возможному выходу олигоГК-кобальта (II) (20,02 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-кобальта (II), определенная методом вискозиметрии, составила 4004 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-кобальта (II) (%): С 32,4, Н 4,0, О 50,3, Со 13,3, позволил вывести эмпирическую формулу: Co₉C₁₀₈H₁₆₂O₁₂₆ или [Со(C₆H₇O₆)₂(H₂O)₂]₉. Общая продолжительность способа получения олигоГК-кобальта (II) составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-кобальта (II) - 3 ч.

Пример 3. Получение олигоГК-железа (II)

Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.

Далее получают олигоГК-железа (II) из олигоГК (1 л 5,0·10^-3 М водный раствор) и ацетата железа (II) (1 л 4,5·10^-2 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.

Технологический выход олигоГК-железа (II) составил 15,27 г, или 76,8% к теоретически возможному выходу олигоГК-железа (II) (19,88 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-железа (II), определенная методом вискозиметрии, составила 3977 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-железа (II) (в %): С 32,6, Н 4,1, О 50,7, Fe 12,6, позволил вывести эмпирическую формулу: Fe₉C₁₀₈H₁₆₂O₁₂₆ или [Fe(C₆H₇O₆)₂(H₂O)₂]₉. Общая продолжительность способа получения олигоГК-железа (II) составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-железа (II) - 3 ч.

Пример 4. Получение олигоГК-цинка

Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.

Далее получают олигоГК-цинка из олигоГК (1 л 5,0·10^-3 М водный раствор) и ацетата цинка (1 л 4,5·10^-2 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.

Технологический выход олигоГК-цинка составил 15,68 г, или 77,2% к теоретически возможному выходу олигоГК-цинка (20,31 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-цинка, определенная методом вискозиметрии, составила 4063 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-цинка (%): С 31,9, Н 4,0, О 49,6, Zn 14,5, позволил вывести эмпирическую формулу: Zn₉C₁₀₈H₁₆₂O₁₂₆ или [Zn(С₆Н₇О₆)₂(H₂O)₂]₉. Общая продолжительность способа получения олигоГК-цинка составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-цинка - 3 ч.

Пример 5. Получение олигоГК-марганца (II)

Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.

Далее получают олигоГК-марганца (II) из олигоГК (1 л 5,0·10^-3 М водный раствор) и ацетата марганца (II) (1 л 4,5·10^-2 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.

Технологический выход олигоГК-марганца (II) составил 16,11 г, или 81,2% к теоретически возможному выходу олигоГК-марганца (II) (19,84 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-марганца (II), определенная методом вискозиметрии, составила 3968 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-марганца (II) (%): С 32,7, Н 4,1, О 50,8, Мn 12,4, позволил вывести эмпирическую формулу: Mn₉C₁₀₈H₁₆₂O₁₂₆ или [Mn(C₆H₇O₆)₂(H₂O)₂]₉. Общая продолжительность способа получения олигоГК-марганца (II) составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-марганца (II) - 3 ч.

Пример 6. Получение олигоГК-магния

Сначала получают олигоГК из свекловичного пектина по известному способу (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075), изложенному в примере 1.

Далее получают олигоГК-магния из олигоГК (1 л 5,0·10^-3 М водный раствор) и ацетата магния (1 л 4,5·10^-2 М водный раствор) при рН 8, устанавливаемом с помощью 2 М водного раствора гидрата аммиака, способом, описанным в примере 1.

Технологический выход олигоГК-магния составил 14,28 г, или 77,4% к теоретически возможному выходу олигоГК-магния (18,46 г). Средняя молярная масса полученного олигоГК-магния, определенная методом вискозиметрии, составила 3693 г/моль. Найденный на элементном анализаторе и спектрографе СТЭ-1 методом эмиссионного спектрографического анализа элементный состав олигоГК-магния (%): С 35,1, Н 4,4, О 54,6, Mg 5,9, позволил вывести эмпирическую формулу: Mg₉C₁₀₈H₁₆₂O₁₂₆ или [Mg(C₆H₇O₆)₂(H₂O)₂]₉. Общая продолжительность способа получения олигоГК-магния составляет 33 ч, в т.ч. получение олигоГК - 30 ч, получение олигоГК-магния - 3 ч.

Таким образом, предлагаемый способ получения олигоГК-БМе (II) обеспечивает следующий положительный эффект:

1. Использование в качестве источника получения олигоГК и олигоГК-БМе (II) свекловичного пектина, имеющего в 1,4 раз более высокую комплексообразующую способность (1525 мг Pb²⁺/г), чем яблочный пектин (1078 мг Pb²⁺/г) (Кайшева Н.Ш. … Пат. РФ 2116075).

2. Повышение биологической доступности галактуронидов за счет использования олигоГК, способной концентрироваться не только в биологических жидкостях, но и тканях, особенно в костной ткани, являющейся местом депонирования катионов ТМе (Кайшева Н.Ш. Научные основы применения полиуронидов в фармации. - Пятигорск: ПятГФА, 2003, 194 с.).

3. Использование олигоГК не только как системы доставки катионов БМе (II) в биологические ткани и жидкости, но и как системы выведения катионов ТМе (II). Об этом свидетельствуют результаты определения степени десорбции катионов БМе (II) из олигоГК-БМе (II) в растворы свинца (II) (в среднем 81,0%) и кадмия (в среднем 79,5%) и степени сорбции олигоГК ионов свинца (II) (в среднем 79,7%) и кадмия (в среднем 77,2%). На модели развития гемической анемии, вызванной интоксикацией животных ацетатом свинца (II), достоверно доказана способность олигоГК-железа (II) увеличивать количество эритроцитов в 1,6 раз, содержание гемоглобина в крови в 1,8 раз и уменьшать содержание катионов свинца (II) в крови в 2 раза.

4. Повышение в 145 раз по сравнению со способом-прототипом полноты протекания реакции взаимодействия олигоГК с катионами БМе (II) и устойчивости целевых продуктов за счет создания слабощелочной реакции среды (рН 8) и использования солей Me (II) в виде ацетатов. Об этом свидетельствуют значения К_равн. реакции комплексообразования и В олигоГК-БМе (II) на примере олигоГК-меди (II) при различных рН: при рН 5 (способ-прототип) К_равн.=6,43·10³, β=2,01·10⁷; при рН 8 (заявляемый способ) К_равн.=9,33·10⁵, β=2,92·10⁹.

5. Устранение избытка соосаждаемых с целевыми продуктами трудно или не удаляемых ионов Me (II) путем использования стехиометрического соотношения реагентов: 1 моль олигоГК: 9 моль катионов Me (II). Результаты качественного анализа маточного раствора и промывных вод при получении олигоГК-БМе (II) на наличие катионов Me (II) в отличие от способа-прототипа отрицательные.

6. Увеличение технологического выхода олигоГК-БМе (II) относительно теоретически возможного выхода по сравнению со способом-прототипом (за счет создания слабощелочной среды и использования в качестве осадителя 96% этанола): на 28,1% для олигоГК цинка, 14,8% для олигоГК-меди (II), 13,3% для олигоГК-кобальта (II), 12,5% для олигоГК-железа (II), 6,8% для олигоГК-магния, 5,2% для олигоГК-марганца (II).

7. Упрощение способа получения олигоГК-БМе (II) за счет исключения стадий гомогенизации пектинсодержащего порошка, щелочного гидролиза и термолиза полиГК, очистки целевых продуктов от избытка ионов Me (II).

8. Сокращение как общей продолжительности способа получения олигоГК-БМе (II) в 5,3 раз (по способу-прототипу 8 суток, по заявляемому способу 1,5 сутки), так и длительности получения олигоГК-БМе (II) из олигоГК в 28 раз (по способу-прототипу 3,5 суток, по заявляемому способу 3 ч).

Способ получения координационных соединений олигогалактуроновой кислоты с биогенными металлами (II) как систем доставки биогенных металлов (II), а так же систем выведения катионов тяжелых металлов (II) из организма, включающий получение из пектинсодержащего препарата олигогалактуроновой кислоты со степенью полимеризации не менее 10, подвергаемой взаимодействию с солью металла (II): меди, кобальта, железа, цинка, марганца, магния в водной среде при нейтральной pH, экспозицию реакционной смеси при комнатной температуре, нейтрализацию образовавшейся кислоты, декантацию надосадочной жидкости, водную промывку, центрифугирование и высушивание при температуре 60°C осадка, отличающийся тем, что к 1 л 5,0·10^-3 M водного раствора очищенной олигогалактуроновой кислоты при перемешивании добавляют сначала 2 M водный раствор гидрата аммиака до pH 8, затем 1 л 4,5·10^-2 M водного раствора ацетата металла (II); образующийся гелеобразный осадок обрабатывают 96% этанолом при объемном соотношении 1:2, выдерживают 2 ч.