Улучшенная вакцинация против гриппа

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для индукции перекрестной защиты от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма гриппа. Для индукции перекрестной защиты от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма гриппа по сравнению со штаммами гриппа, антигены из которых присутствуют в противогриппозной вакцине, вводят противогриппозную вакцину, содержащую НА и NA. Где вакцина является виросомальной противогриппозной вакциной, которая не содержит вспомогательное средство и которую вводят внутримышечно по меньшей мере трижды в течение одного года. Группа изобретений относится также к способу индукции перекрестной защиты от штамма гриппа H5N1 и к способу вакцинации против гриппа. Использование данной группы изобретений позволяет обеспечивать перекрестную защиту за счет введения виросомальных сезонных вакцин, которые не содержат вспомогательного средства, путем обычного внутримышечного введения. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 пр., 9 ил.

 

Настоящее изобретение относится к области здравоохранения. Более конкретно оно касается улучшенных схем вакцинации для создания широкой защиты против гриппа.

Предпосылки изобретения

Вирусы гриппа представляют собой основные патогены человека и животных, вызывающие респираторное заболевание - грипп, тяжесть которого может варьироваться от субклинической инфекции до первичной вирусной пневмонии, которая может привести к смерти. Каждый год во всем мире этим вирусом заражаются вплоть до 1 миллиарда человек.

Многие люди проходят вакцинацию против гриппа с использованием так называемой вакцины против сезонного гриппа, которую вводят раз в год. Композиция вакцины против сезонного гриппа обычно меняется каждый год.

Вирусы гриппа классифицируют на основании различий в антигенной структуре их белков гемагглютинина (HA) и и нейраминидазы (NA), с их различными комбинациями, представляющими единственные в своем роде подтипы вирусов, которые дополнительно классифицируют в специфические штаммы вируса гриппа. Хотя все известные подтипы гриппа А можно обнаружить у птиц, распространяемые в настоящее время подтипы гриппа A человека представляют собой H1N1 и H3N2. Филогенетический анализ показал, что гемагглютинины подразделяются на две основные группы, а именно, на Н1, Н2, Н5 и Н9 подтипы в филогенетической группе 1 и Н3, Н4 и Н7 подтипы в филогенетической группе 2 (см. Фиг. 1А). Вакцина против сезонного гриппа в настоящее время обычно содержит белки HA и NA гриппа из штаммов филогенетической группы 1 (например, H1N1) и группы 2 (например, H3N2) гриппа A и из гриппа B.

Известно, что антитела, которые нейтрализуют вирус гриппа, в первую очередь направлены против HA. HA представляет собой трехзвенный гликопротеин, закрепленный на вирусной оболочке и содержащий крупный головной домен и стержневой домен меньшего размера.

Причиной, по которой сезонная противогриппозная вакцина должна обновляться каждый год, является значительная изменчивость вируса. В молекуле НА эта изменчивость особенно проявляется в головном домене, где антигенный дрейф приводит к большому числу различных вариантов. Поскольку он также представляет собой область, которая является иммунодоминантной, большинство нейтрализующих антител направлено против этого домена.

Сочетанием иммунодоминантности и значительной изменчивости головного домена также объясняется то, что инфекция с определенным штаммом не вызывает иммунитет к другим штаммам: антитела, выработанные в результате первой инфекции, распознают ограниченное число штаммов, близкородственных к вирусу первичной инфекции.

Современная практика иммунизации основана на ранней идентификации распространяемых в данный момент вирусов гриппа, чтобы обеспечить своевременное получение эффективной вакцины против сезонного гриппа. Такая практика ограничивает период времени для производства и стандартизации вакцины до максимум девяти месяцев, что приводит к ежегодно возникающей трудной задаче с точки зрения логистики и производства. Другим недостатком является то, что выбранная вакцина может не охватить все распространяемые в данный момент штаммы, что приводит к вакцине, не являющейся оптимальной для защиты против штаммов сезонного гриппа. Помимо неизбежных трудностей в прогнозировании штаммов, которые будут преобладать во время следующего сезона, в неспособности современных вакцин предупредить заболеваемость и смертность также играют роль противовирусная устойчивость и ускользание от иммунного ответа. В дополнение к этому значительную и реальную угрозу здоровью во всем мире представляет возможность пандемии, вызванной высоковирулентным штаммом, полученным от животных-носителей, и подвергшимся реассортации для увеличения передачи от человека к человеку. Даже ежегодное стандартное использование вакцин не обеспечивает защиту против потенциальных таких вновь возникающих вызывающих пандемию штаммов, как штаммы H5N1.

Увеличение широты защиты противогриппозными вакцинами наблюдалось в некоторых исследованиях, но требовало сильных вспомогательных средств или введения через слизистые оболочки (интраназальное), или в некоторых случаях введения как вспомогательных средств, так и введения через слизистые оболочки, или целых вирусов очень специфических высокоиммуногенных штаммов гриппа (Tumpey et al., 2001, J.Virology, 75: 5141-5150; Ichinohe et al., 2007, J.Inf.Disease 196: 1313-1320; van Maurik et al., 2010, Vaccine 28: 1778-1785; WO 2008/037033; Tamura et al, 1989, Vaccine 7: 314-320; Zhiwei Sui et al, 2010, Archives of Virol 155: 535-544). В большинстве из этих случаев сообщалось, что перекрестная защита была по-прежнему недостаточно широкой. Недостатком введения через слизистые оболочки является то, что иммунологическая память плохо индуцируется. Недостатками большинства или всех вспомогательных средств, использованных в данных сообщениях, является то, что они не рекомендуются для применения у людей из-за своей реактогенности.

Таким образом, в данной области техники по-прежнему существует потребность в улучшенной вакцинации против гриппа. Настоящее изобретение имеет целью предложить улучшенную вакцинацию против гриппа, в частности, для улучшения широты защиты, предоставляемой противогриппозными вакцинами.

Краткое описание изобретения

Вопреки установившемуся мнению об индукции с помощью вакцин иммунитета, специфического к определенному штамму, данными исследователями было неожиданно обнаружено, что вакцинация противогриппозной вакциной, содержащей белки HA и NA, индуцирует широкую защиту от гетерологичных и даже гетеросубтипических штаммов гриппа по сравнению со штаммами, из которых для вакцины получали белки гриппа, если вакцины вводить трижды, даже без добавления вспомогательного вещества, и введение проводить путем инъекции.

Так в одном аспекте изобретение предлагает способ вакцинации против гриппа, причем способ включает многократное введение субъекту вакцины, содержащей белки геммаглютинин (HA) и нейраминидазу (NA) гриппа из по меньшей мере первого штамма гриппа, где белки HA и NA первого штамма гриппа вводят субъекту по меньшей мере трижды в течение периода продолжительностью менее одного года.

Изобретение также предлагает вакцину, содержащую белки HA и NA из по меньшей мере первого штамма гриппа, для применения при вакцинации против гриппа путем введения субъекту белков HA и NA первого штамма гриппа по меньшей мере трижды в течение периода продолжительностью менее одного года.

Изобретение также предлагает способ получения лекарственного средства для вакцинации против гриппа путем введения субъекту вакцины, содержащей белки HA и NA из по меньшей мере первого штамма гриппа, по меньшей мере трижды в течение периода продолжительностью менее одного года.

Вакцина, применяемая в соответствии с данным изобретением, представляет собой вакцину против сезонного гриппа, содержащую HA и NA из по меньшей мере трех штаммов вируса гриппа, и является виросомальной противогриппозной вакциной, расщепленной противогриппозной вакциной или субъединичной противогриппозной вакциной, которая не содержит вспомогательное средство, и которую вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

Таким образом, изобретение предлагает способ вакцинации против гриппа, причем способ включает введение вакцины против сезонного гриппа, содержащей белки геммаглютинин (HA) и нейраминидазу (NA) гриппа из по меньшей мере трех штаммов гриппа, где вакцина является виросомальной противогриппозной вакциной, расщепленной противогриппозной вакциной или субъединичной противогриппозной вакциной, которая не содержит вспомогательное средство, и которую вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно по меньшей мере трижды в течение одного года.

В другом аспекте изобретение предлагает способ, который вызывает образование перекрестной защиты от различных штаммов гриппа, включающих по меньшей мере один гетерологичный штамм по сравнению с первым штаммом гриппа, и включает введение субъекту противогриппозной вакцины, содержащей HA и NA из первого штамма гриппа, по меньшей мере трижды в течение одного года, причем он не включает введение HA и NA из по меньшей мере одного гетерологичного штамма.

Изобретение также предлагает вакцину, применение которой вызывает образование перекрестной защиты от различных штаммов гриппа, включающих по меньшей мере один гетерологичный штамм по сравнению с первым штаммом гриппа, путем введения субъекту противогриппозной вакцины, содержащей HA и NA из первого штамма гриппа, по меньшей мере трижды в течение одного года, причем он не включает введение HA и NA из по меньшей мере одного гетерологичного штамма.

Изобретение также предлагает способ получения лекарственного средства, которое вызывает образование перекрестной защиты от различных штаммов гриппа, включающих по меньшей мере один гетерологичный штамм по сравнению с первым штаммом гриппа, путем введения субъекту противогриппозной вакцины, содержащей HA и NA из первого штамма гриппа, по меньшей мере трижды в течение одного года, причем он не включает введение HA и NA из по меньшей мере одного гетерологичного штамма.

В другом аспекте изобретение предлагает способ, который вызывает образование перекрестной защиты от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма по сравнению со штаммами гриппа, антигены из которых присутствуют в противогриппозной вакцине, содержащей HA и NA, причем способ включает введение субъекту противогриппозной вакцины по меньшей мере трижды в течение одного года.

Изобретение также предлагает противогриппозную вакцину, содержащую HA и NA, применение которой вызывает образование перекрестной защиты от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма по сравнению со штаммами гриппа, антигены из которых присутствуют в противогриппозной вакцине, путем введения субъекту противогриппозной вакцины по меньшей мере трижды в течение одного года.

Изобретение также предлагает способ получения лекарственного средства, который вызывает образование перекрестной защиты от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма по сравнению со штаммами гриппа, антигены из которых присутствуют в противогриппозной вакцине, содержащей HA и NA, путем введения субъекту вакцины по меньшей мере трижды в течение одного года.

В другом аспекте изобретение предлагает способ, который вызывает образование перекрестной защиты от штамма гриппа H5N1, включающий введение субъекту противогриппозной вакцины, содержащей HA и NA из штаммов гриппа H1N1, H3N2 и B по меньшей мере трижды в течение одного года, где субъекту не вводят HA и NA из штамма гриппа H5N1.

Изобретение дополнительно предлагает противогриппозную вакцину, содержащую HA и NA из штаммов гриппа H1N1, H3N2 и B, применение которой вызывает перекрестную защиту от штамма гриппа H5N1 путем введения субъекту противогриппозной вакцины по меньшей мере трижды в течение одного года, где субъекту не вводят HA и NA из штамма гриппа H5N1.

Изобретение также предлагает способ получения лекарственного средства, которое вызывает образование перекрестной защиты от штамма гриппа H5N1, путем введения субъекту противогриппозной вакцины, содержащей HA и NA из штаммов гриппа H1N1, H3N2 и B по меньшей мере трижды в течение одного года, где субъекту не вводят HA и NA из штамма гриппа H5N1.

В дополнительном аспекте изобретение предлагает способ, который вызывает образование перекрестной защиты от пандемического или потенциально пандемического штамма гриппа, например, штамма H2N2, H5N1, H7N7 или H9N2, включающий введение субъекту противогриппозной вакцины, содержащей HA и NA из штаммов гриппа H1N1, H3N2 и B по меньшей мере трижды в течение одного года, где субъекту не вводят HA и NA из пандемического штамма гриппа.

Изобретение также предлагает противогриппозную вакцину, содержащую HA и NA из штаммов гриппа H1N1, H3N2 и B, применение которой вызывает перекрестную защиту от пандемического или потенциально пандемического штамма гриппа путем введения субъекту противогриппозной вакцины по меньшей мере трижды в течение одного года, где субъекту не вводят HA и NA из пандемического штамма гриппа.

Изобретение также предлагает способ получения лекарственного средства, которое вызывает образование перекрестной защиты от пандемического или потенциально пандемического штамма гриппа путем введения субъекту противогриппозной вакцины, содержащей HA и NA из штаммов гриппа H1N1, H3N2 и B по меньшей мере трижды в течение одного года, где субъекту не вводят HA и NA из пандемического штамма гриппа.

В другом аспекте изобретение также предлагает способ обеспечения защиты субъекта от первого штамма гриппа и от по меньшей мере второго штамма гриппа в одном и том же подтипе, гетерологичном первому штамму гриппа, и против по меньшей мере третьего штамма гриппа, гетеросубтипического по отношению к первому штамму гриппа, причем способ включает введение субъекту трижды в течение одного года HA и NA первого штамма гриппа, где субъекту не вводят HA и NA второго или третьего штамма гриппа.

Изобретение также предлагает HA и NA первого штамма гриппа для применения в обеспечении защиты субъекта от первого штамма гриппа и от по меньшей мере второго штамма гриппа в одном и том же подтипе, гетерологичном первому штамму гриппа, и против по меньшей мере третьего штамма гриппа, гетеросубтипического по отношению к первому штамму гриппа, путем введения субъекту трижды в течение одного года HA и NA первого штамма гриппа, где субъекту не вводят HA и NA второго или третьего штамма гриппа.

Изобретение также предлагает способ получения лекарственного средства для обеспечения защиты субъекта от первого штамма гриппа и от по меньшей мере второго штамма гриппа в одном и том же подтипе, гетерологичном первому штамму гриппа, и против по меньшей мере третьего штамма гриппа, гетеросубтипического по отношению к первому штамму гриппа, путем введения субъекту трижды в течение одного года HA и NA первого штамма гриппа, где субъекту не вводят HA и NA второго или третьего штамма гриппа.

В другом аспекте изобретение также предлагает вакцину, содержащую, по меньшей мере, белки HA и NA первого штамма гриппа, которая вызывает образование защиты от первого штамма гриппа и перекрестную защиту от по меньшей мере одного гетерологичного штамма гриппа в одном и том же подтипе, а также от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма гриппа, антигены HA и NA которого не представлены в вакцине, путем введения субъекту вакцины по меньшей мере трижды в течение одного года.

Изобретение также предлагает способ вакцинации против гриппа, причем способ включает внутримышечное, подкожное или внутрикожное введение субъекту виросомальной вакцины против сезонного гриппа, содержащей белки геммаглютинин (HA) и нейраминидазу (NA) гриппа из по меньшей мере трех штаммов гриппа, по меньшей мере трижды в течение одного года.

Изобретение, таким образом, предлагает способы, которые вызывают образование гетерологичной и предпочтительно гетеросубтипической перекрестной защиты от различных штаммов гриппа по сравнению с первым штаммом гриппа, включающие введение субъекту по меньшей мере трижды в течение одного года противогриппозной вакцины, содержащей HA и NA первого штамма гриппа.

Изобретение также предлагает сезонную вакцину, содержащую белки HA и NA по меньшей мере трех штаммов гриппа, применение которой вызывает образование защиты от трех штаммов гриппа и перекрестную защиту от по меньшей мере одного гетерологичного штамма гриппа в одном и том же подтипе по сравнению с по меньшей мере одним из штаммов гриппа, а также от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма гриппа, антигены HA и NA которого не представлены в вакцине, и где вакцина является виросомальной противогриппозной вакциной, расщепленной противогриппозной вакциной или субъединичной противогриппозной вакциной, и где вакцина не содержит вспомогательное средство, и ее вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно по меньшей мере трижды в течение одного года.

Изобретение также предлагает способ вакцинации вакциной против сезонного гриппа, содержащей белки HA и NA по меньшей мере трех штаммов гриппа, который вызывает образование защиты от трех штаммов гриппа и перекрестную защиту от по меньшей мере одного гетерологичного штамма гриппа в одном и том же подтипе по сравнению с по меньшей мере одним из штаммов гриппа, а также сезонной вакциной против по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма гриппа, антигены HA и NA которого не представлены в вакцине, где вакцина является виросомальной противогриппозной вакциной, расщепленной противогриппозной вакциной или субъединичной противогриппозной вакциной, и где вакцина не содержит вспомогательное средство, и ее вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно по меньшей мере трижды в течение одного года.

Противогриппозная вакцина, применяемая в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, не содержит HA и NA из всех штаммов, защиту от которых она предоставляет. Обычно она также предоставляет защиту от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма гриппа по сравнению со всеми штаммами, HA и NA из которых представлены в вакцине, после введения вакцины трижды (т.е. первичное и два бустерных) в течение одного года.

Противогриппозная вакцина в данном изобретении представляет собой обычную и/или вакцину против сезонного гриппа. Она может быть расщепленной противогриппозной вакциной, субъединичной противогриппозной вакциной или виросомальной противогриппозной вакциной и содержать белки HA и NA. В определенных вариантах осуществления она является виросомальной противогриппозной вакциной.

В определенных вариантах осуществления противогриппозная вакцина содержит HA и NA из трех штаммов гриппа (трехвалентная). В других вариантах осуществления противогриппозная вакцина содержит HA и NA из четырех штаммов гриппа (четырехвалентная). В дополнительных вариантах осуществления противогриппозная вакцина содержит HA и NA из по меньшей мере пяти штаммов гриппа (пятивалентная и более). В определенных вариантах осуществления HA и NA в вакцине включают в себя HA и NA из штамма гриппа А. В определенных вариантах осуществления HA и NA в вакцине включают в себя HA и NA из штамма гриппа H1N1. В определенных вариантах осуществления HA и NA в вакцине получены из штамма гриппа Н1, штамма гриппа Н3 и штамма гриппа В. В определенных вариантах осуществления HA и NA в вакцине получены из штамма Н1N1, штамма Н3N2 и штамма В.

В определенных вариантах осуществления вакцина содержит HA и NA из первого штамма гриппа Н1 и вызывает образование защиты от указанного первого штамма и от по меньшей мере второго штамма гриппа Н1, гетерологичного указанному первому штамму.

В определенных вариантах осуществления вакцина вызывает образование защиты от по меньшей мере одного штамма, который является гетеросубтипическим по отношению ко всем штаммам гриппа, представленным в вакцине.

В определенных вариантах осуществления вакцина содержит HA и NA из первого штамма гриппа Н1 и вызывает образование защиты от указанного первого штамма и от по меньшей мере второго штамма гриппа, который является штаммом гриппа Н5, где вакцина не содержит HA и NA из штамма гриппа Н5.

В определенных вариантах осуществления вакцину вводят субъекту по меньшей мере трижды в течение 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 месяцев или менее. В определенных вариантах осуществления введение вакцины проводят с интервалом между введениями продолжительностью по меньшей мере одну неделю, две недели, три недели или четыре недели. В определенных вариантах осуществления введение вакцины проводят с интервалом между введениями продолжительностью от примерно трех до восьми недель. В определенных вариантах осуществления вакцину субъекту вводят с интервалом между двумя введениями продолжительностью не более шести месяцев, пяти месяцев, четырех месяцев или трех месяцев. В определенных вариантах осуществления вторую дозу вакцины субъекту вводят через период от 1 недели до 8 недель после первой дозы, а третью дозу вакцины субъекту вводят через период от 3 недель до 26 недель после второй дозы. В определенных вариантах осуществления вакцину вводят с интервалом примерно четыре недели между первым и вторым введениями, и с интервалом примерно четыре недели между вторым и третьим введением.

В определенных вариантах осуществления субъект представляет собой субъекта-человека. В определенных вариантах осуществления возраст субъекта-человека составляет от 6 месяцев до 80 лет, например, от 4 до 80 лет. В определенных вариантах осуществления субъект представляет собой субъект, иммунная система которого уже подвергалась воздействию вируса гриппа.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. A. Филогенетическое дерево гриппа A. B. Филогенетическое дерево вакцины против гриппа H1N1 и выбранных штаммов. Штамм вакцины, использованный в примере 1, обведен сплошной линией, а контрольный штамм, использованный в примере 1, обведен прерывистой линией. C. Филогенетическое дерево вакцины против гриппа H3N2 и выбранных штаммов. Штамм вакцины, использованный в примере 3А, обведен сплошной линией, а контрольный штамм, использованный в примере 3А, обведен прерывистой линией. D. Филогенетическое дерево вакцины против гриппа В и выбранных штаммов. Штамм вакцины, использованный в примере 4А, обведен сплошной линией, а контрольный штамм, использованный в примере 4А, обведен прерывистой линией.

Фиг. 2. Результаты эксперимента, в котором мышей инфицировали гетерологичным вирусом гриппа H1N1 после 3-кратной вакцинации (сплошная линия), или контрольной вакцинации бета-пропиолактоном (прерывистая линия): A. выживаемость, B. средний относительный вес тела, C. клинические оценки. Подробности смотри в примере 1.

Фиг. 3. Результаты эксперимента, в котором мышей инфицировали гетеросубтипическим вирусом гриппа H5N1 после 3-кратной вакцинации (сплошная линия), или контрольной вакцинации забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) (прерывистая линия): A. выживаемость, B. средний относительный вес тела, C. клинические оценки. Подробности смотри в примере 2.

Фиг. 4. Результаты эксперимента, в котором мышей инфицировали гетерологичным вирусом гриппа (H3N2) после 3-кратной вакцинации (сплошная линия), или контрольной вакцинации PBS (прерывистая линия): A. выживаемость, B. средний относительный вес тела, C. клинические оценки. Подробности смотри в примере 3А.

Фиг. 5. Результаты эксперимента, в котором мышей инфицировали гетерологичным вирусом гриппа B/Florida/04/06 после 1-кратной (прерывистая линия) или 3-кратной вакцинации (точечная линия) или контрольной вакцинации PBS (сплошная линия). A. Выживаемость, B. средний относительный вес тела, C. клинические оценки. Подробности смотри в примере 3В.

Фиг. 6. Результаты эксперимента, в котором мышей инфицировали гетеросубтипическим вирусом гриппа H5N1 A/HK/156/97 после 1-кратной (прерывистая линия) или 3-кратной вакцинации (точечная линия) или контрольной вакцинации PBS (сплошная линия). A. Выживаемость, B. средний относительный вес тела, C. клинические оценки. Подробности смотри в примере 3С.

Фиг. 7. Результаты эксперимента, в котором мышей инфицировали гетерологичным вирусом гриппа В от другой филогенетической ветви после 3-кратной вакцинации (сплошная линия), или контрольной вакцинации PBS (прерывистая линия): A. выживаемость, B. средний относительный вес тела, C. клинические оценки. Подробности смотри в примере 4А.

Фиг. 8. Результаты эксперимента, в котором мышей инфицировали гетерологичным вирусом гриппа B/Florida/04/06 после 1-кратной (прерывистая линия) или 3-кратной вакцинации (точечная линия) или контрольной вакцинации PBS (сплошная линия). A. Выживаемость, B. средний относительный вес тела, C. клинические оценки. Подробности смотри в примере 4В.

Фиг. 9. Результаты эксперимента, в котором мышей инфицировали гетеросубтипическим вирусом гриппа H5N1 A/HK/156/97 после 1-кратной (прерывистая линия) или 3-кратной вакцинации (точечная линия) или контрольной вакцинации PBS (сплошная линия). A. Выживаемость, B. средний относительный вес тела, C. клинические оценки. Подробности смотри в примере 4С.

Подробное описание изобретения

В данном документе на штамм гриппа ссылаются как на "гетерологичный" штамм гриппа по сравнению с первым штаммом сравнения, когда сыворотка, извлеченная из штамма, более не дает достаточной перекрестной нейтрализации штамма сравнения (т.е. в четыре раза ниже титра HI относительно гомологичной сыворотки; например, Smith et al, 2004, Science 305: 371-376). Таким образом, например, при обновлении штаммов вакцины новый штамм по определению является гетерологичным к предыдущему штамму.

"Гетеросубтипический" штамм гриппа в данном документе означает штамм гриппа, который по сравнению с первым штаммом сравнения относится к другому подтипу (например, H1N1 является гетеросубтипическим по отношению к H5N1 и к H3N2).

Штамм "сезонного" гриппа представляет собой штамм гриппа, распространяющийся среди человеческой популяции в определенный момент. Такие штаммы распространяются во время сезона гриппа и могут повторятся каждый год обычно в слегка измененной форме из-за мутаций в антигенных областях (из-за антигенного дрейфа). Вакцина против сезонного гриппа содержит антигены из выбранных штаммов сезонного гриппа, преобладающих в данном сезоне. Типичными примерами штаммов сезонного гриппа в настоящий момент являются штаммы H1N1, штаммы H3N2, штаммы B.

"Пандемический" штамм гриппа представляет собой вновь распространяющийся штамм, к которому у популяции существует слабый иммунитет или он отсутствует. Неограничивающими примерами являются щтаммы H2N2, H5N1, H7N7 и H9N2. Однако, например, пандемический грипп 2009 был вызван штаммом H1N1 во время распространения штаммов H1N1.

Согласно данному изобретению термин "защита" (также в смысле "перекрестной защиты") от штаммов гриппа не обязательно означает защиту от заражения как такового этими штаммами, но по крайней мере включает уменьшение частоты, тяжести и/или продолжительности симптомов и/или осложнений, которые могут произойти в результате заражения такими штаммами гриппа, по сравнению с аналогичной контрольной группой, в которой вакцинацию не проводили. Термин "перекрестная защита" означает защиту от по меньшей мере одного штамма, отличающегося (по меньшей мере гетерологичного и предпочтительно гетеросубтипического) от штаммов, антигены HA и NA которых представлены в вакцине.

В определенных вариантах осуществления HA и NA получены из штамма гриппа А. В определенных вариантах их осуществления HA и NA получены из штамма гриппа А из филогенетической группы 1, например, из подтипа гриппа H1, H2, H5, H9 и т.п. (подтипы в филогенетических группах см. на Фиг. 1). В других вариантах осуществления HA и NA получены из штамма гриппа А из филогенетической группы 2, например, из подтипа гриппа H3, H4, H7 и т.п.

В других вариантах осуществления HA и NA получены из штамма гриппа В. Для гриппа В в настоящее время различают две линии, представляемые вирусами-прототипами B/Victoria/2/87 (линия Victoria) и B/Yamagata/16/88 (линия Yamagata). B/Yamagata была основной линией, распространяющейся до 1980-х, когда появились вирусы линии B/Victoria. С тех пор в мировом масштабе совместно распространяются дрейфующие варианты обеих линий гриппа B, причем в последних сезонах гриппа одновременно циркулируют обе линии. В определенных вариантах осуществления вакцина данного изобретения содержит HA и NA из штамма гриппа B, который может, например, относится к линии, подобной Yamagata, или к линии, подобной Victoria, или вакцина может содержать HA и NA из штамма гриппа B обоих линий.

Иммуногенные белки HA и NA или их иммунологически активные фрагменты можно включать в составы и получать в виде, например, составов с расщепленным вирусом, очищенных субъединичных составов, выделенных вирусных белков, очищенных или полученных из вирусов, и вирусоподобных частиц (ВПЧ). Белки HA и NA гриппа можно также получать из других источников, отличающихся от целого вируса гриппа, например, их можно получать рекомбинантной экспрессией в подходящих экспрессионных системах, известных специалисту. Вакцины могут содержать или не содержать дополнительные антигены гриппа помимо HA и NA.

В зависимости от определенного сезона и от природы антигена, включенного в вакцину, антигены гриппа можно получать из одного или нескольких из следующих подтипов гемагглютинина: гриппа A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16; или гриппа B; и одного или нескольких из следующих подтипов нейраминидазы: грипп A N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 или N9; или гриппа B. Для большинства подтипов HA, H1-H7 и H9- H12 рассматривались все комбинации с подтипом 9 NA. Важные иллюстративные комбинации для гриппа А содержат, но не ограничиваясь ими: H1N1, H2N2, H3N2, H3N1, H5N1, H5N2, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 и H10N7. Обычно вакцина против сезонного гриппа содержит HA и NA трех штаммов гриппа, которые в настоящее время обычно включают H1N1, H3N2 и по меньшей мере один штамм B. Четырехвалентные сезонные вакцины обычно содержат антигены из дополнительных штаммов В (обычно такие вакцины содержат антигены как из линии Yamagata, так и из линии Victoria штамма В).

Вирус гриппа также может быть реассортантным штаммом и может быть полученным с помощью методов обратной генетики. Так вирус гриппа A может включать один или несколько сегментов РНК из вируса A/PR/8/34 (обычно 6 сегментов из A/PR/8/34, с HA и N сегментами из штамма вакцины, т.е. реассортант 6:2). Он может также включать один или несколько сегментов РНК из вируса A/WSN/33 или из любого другого штамма вируса, полезного для получения реассортантных вирусов для приготовления вакцины.

HA представляет собой иммуноген в настоящих инактивированных противогриппозных вакцинах, а дозы вакцины стандартизируют по отношению к уровням HA, обычно измеряемым с помощью простой радиальной иммунодиффузии (SRID) (J. M. Wood et al., 1977, J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247). Существующие вакцины обычно содержат примерно 15 мкг HA на штамм, хотя можно использовать более низкие дозы, например, для детей или в условиях пандемии, или при использовании вспомогательного вещества. Использовались дробные дозы, такие, как 1/2 (т.е. 7,5 мкг HA на штамм), 1/4 и 1/8, а также более высокие дозы (например, 3-кратные или 9-кратные дозы). Эти вакцины могут содержать от 0,1 до 150 мкг HA на штамм гриппа, предпочтительно от 0,1 до 50 мкг, например, 0,1-20 мкг и т.п. Конкретные дозы содержат, например, примерно 15, примерно 10, примерно 7,5, примерно 5, примерно 1,5 и т.д. мкг на штамм. Низкие дозы могут соответствующим образом использоваться в сочетании с внутрикожным введением.

Количество NA в дозе может изменяться, например, в интервале примерно 0,1-50 мкг, например, в интервале 0,5-20 мкг. Обычно сезонная вакцина может содержать примерно 0,5-5 мкг NA на 15 мкг присутствующего HA, например, примерно 2-4 мкг NA на 15 мкг присутствующего HA.

Используемые в данном изобретении HA и/или NA могут быть природными HA или NA в том виде, в котором они находятся в вирусе, или могут быть модифицированы.

Схема вакцинации согласно данному изобретению в принципе пригодна для всех субъектов. Это включает субъектов всех возрастов, включая субъектов, иммунная система которых уже подвергалась или не подвергалась воздействию вируса гриппа на момент введения первой дозы. Субъект согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой млекопитающее, которое может быть заражено гриппом, или по другим причинам может получить пользу от индукции иммунного ответа против гриппа, причем таким субъектом, например, может быть грызун, например мышь, или хорек, или домашнее или сельскохозяйственное животное, такое, как свинья, собака, лошадь, или примат, кроме человека, или человек. Предпочтительно субъект представляет собой субъекта-человека.

В определенных вариантах осуществления субъекты представляют собой субъектов-людей с возрастом в интервале от примерно 6 месяцев до 80 лет, например, в интервале от примерно 4 до 80 лет, например, в интервале от примерно 18 до 60 или от 18 до 65 лет (взрослая популяция). В других вариантах осуществления субъект представляет собой пожилого субъекта-человека (50 лет или старше, 60 лет или старше, 65 лет или старше). В других вариантах осуществления субъект представляет собой молодого субъекта-человека (например, ≤5 лет, например, с возрастом в интервале от 6 месяцев до 4 лет, т.е. субъект детского возраста или ребенок). В других вариантах осуществления субъекты представляют собой госпитализированных пациентов, работников здравоохранения, служащих вооруженных сил и военнослужащих, беременных женщин (в этом варианте осуществления введение вакцины предоставляет перекрестную защиту матери, но также может потенциально вызвать образование перекрестной защиты у ребенка после рождения), хронических больных (например, пациентов с астмой, диабетом, неврологическими и нервно-мышечными расстройствами (церебральным параличом, припадками, мышечной дистрофией, и т.п.)), пациентов с иммунодефицитом, субъектов, принимавших антивирусное соединение (например, соединение оселтамивир или занамивир) за 7 дней до получения вакцины и т.п. Вакцина может быть применена согласно изобретению в общем в популяции. В определенных вариантах осуществления иммунная система субъекта, которому вводят вакцину, подвергалась воздействию антигена вируса гриппа на момент введения первой дозы. В общем случае в популяции субъекты-люди до исполнения им 10 лет, например, возрастом по меньшей мере 4 года, уже сталкивались с антигеном вируса гриппа либо в природе, либо через вакцинацию. В других вариантах осуществления иммунная система субъекта, которому вводят вакцину, не подвергалась воздействию антигена вируса гриппа на момент введения первой дозы.

В определенных вариантах осуществления субъект представляет собой субъекта-человека детского возраста, которому обычно меньше чем 3 года, или меньше чем 2 года, или меньше чем один год. Их иммунная система могла не подвергаться воздействию вируса гриппа и обычно таким субъектам уже дважды вводилась стандартная вакцина против сезонного или пандемического гриппа, т.е. по схеме первичная-бустерная с целью получения достаточного иммунного ответа у этих субъектов. Способы данного изобретения включают введение вакцины по меньшей мере трижды с целью расширения иммунного ответа для формирования защиты от штаммов гриппа, гетерологичных и даже гетеросубтипических по отношению к штаммам, из которых получены HA и NA, присутствующие в вакцине. О таком расширении иммунного ответа с помощью внутримышечного, внутрикожного или подкожного введения и в отсутствие вспомогательного вещества ранее не сообщалось, и оно противоречит сложившемуся мнению об иммунитете, специфическом к определенному штамму, образование которого вызывается сезонной вакцинацией. Поэтому обнаружение данными изобретателями расширенного иммунного ответа после тройного введения по схеме первичное-бустерное-бустерное, о котором сообщается в данном документе, было крайне неожиданным.

В определенных вариантах осуществления субъект представляет собой субъекта-человека в возрасте от по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере одного года, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 18, 50, 60, 65 лет. В определенных вариантах осуществления субъект представляет собой субъекта-человека в возрасте не старше 50, 60, 65, 70, 80 лет. Любой субъект, которому полагается регулярная и/или пандемическая вакцинация, также может вакцинироваться в соответствии с данным изобретением.

Для субъектов более старых или с ослабленным иммунитетом может быть желательно включать вспомогательное средство в композицию вакцины по меньшей мере одного из введений, например, первого введения, например, всех введений. Независимо или в дополнение может быть желательно включать более высокую дозу антигенов в вакцину, которую вводят более старым пациентам, например, с содержанием антигена в два-четыре раза выше по сравнению с обычной дозой вакцины. Обычная доза противогриппозной вакцины в общем случае содержит примерно 15 мкг HA на штамм.

Вакцина (также называемая "иммуногенная композиция") для применения в соответствии с данным изобретением предпочтительно представляет собой фармацевтическую композицию. Она обычно включает компоненты в дополнение к антигенам гриппа, например, она в типичном случае включает один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей. Оптимальное отношение каждого компонента в составе можно определять с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. В настоящем контексте выражение "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель или разбавитель в применяемых дозировках или концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или неблагоприятных эффектов у субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители или разбавители хорошо известны в данной области техники (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 2000; 20th edition, ISBN: 0683306472); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). Предпочтительно вакцины составляют и вводят в виде стерильного раствора. Стерильные растворы получают с помощью стерильной фильтрации или с помощью других способов, известных как таковые в данной области техники. Затем растворы можно лиофилизировать или наполнять ими фармацевтические контейнеры для лекарственной формы. pH раствора обычно находится в диапазоне от pH 3,0 до рН 9,5, например, от pH 5,0 до рН 7,5. Как правило, белки HA и NA или их иммуногенные части находятся в растворе с подходящим фармацевтически приемлемым буфером, при этом раствор может также содержать соль. В определенных вариантах осуществления присутствует ПАВ. В определенных вариантах осуществления вакцину можно составлять в виде состава для инъекции. Данные составы, содержащие эффективные количества антигенов, являются либо стерильными жидкими растворами, жидкими суспензиями, либо лиофилизированными вариантами и по выбору содержат стабилизаторы и наполнители. Композиции в основном будут в водной форме.

Композиция может содержать физиологические соли, например, для регулирования тоничности. Предпочтительным является NaCl, например, в интервале 1-20 мг/мл, но также могут присутствовать и другие соли, такие, как хлорида калия, дигидрофосфат калия, дигидрофосфат динатрия, хлорид магния, хлорида кальция и т.п. В некоторых вариантах осуществления может присутствовать лецитин. В общем случае осмоляльность составляет 200-400 мОсм/кг. Композиция может включать один или несколько буферов, обычно фосфатный буфер, Tris буфер, боратный буфер, сукцинатный буфер, гистидиновый буфер или цитратный буфер. Буферы обычно находятся в интервале 5-20 мМ.

Композиция предпочтительно является апирогенной. Композиция может включать один или несколько консервантов, таких, как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Предпочтительно вакцина не содержит ртутных материалов, таких, как тиомерсал, более предпочтительно, она не содержит консервантов.

Композиция может по выбору содержать детергент, например, ПАВ на основе сложного эфира полиоксиэтилен сорбитана (известного, как 'Tweens', например, Tween-20 или Tween-80), октоксинол (такой, как октоксинол-9 (Triton X-100)), цетилтриметиламмония бромид ('CTAB'), дезоксихолат натрия. Детергент может присутствовать только в следовых количествах.

Противогриппозные вакцины обычно вводят в дозе, объемом примерно от 0,1 до 1,0 мл, обычно примерно 0,5 мл. Для детей вводимая доза часто составляет половину (т.е. примерно 0,25 мл) взрослой дозы.

Противогриппозные вакцины обычно хранят при температуре от примерно 2°C до 8°C.

В настоящее время существуют различные формы вакцины против вируса гриппа, например, см. главы 17 и 18 публикации Plotkin & Orenstein (Vaccines, 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0). Вакцины, применяемые в соответствии с данным изобретением, основаны на инактивированном вирусе. Пригодные для использования инактивированные вакцины могут быть основаны на "расщепленных" вирионах или на очищенных поверхностных антигенах (включая гемагглютинин). Антигены гриппа могут также быть представлены в виде виросомов (свободных от нуклеиновых кислот вирусободобных липосомальных частиц). Также можно использовать антигены, очищенные от рекомбинантного хозяина (например, клеточная линия насекомого с использованием бакуловирусного вектора, или клеточная линия млекопитающего, или клетки дрожжей).

Типичная противогриппозная вакцина, которая может использоваться согласно данному изобретению, представляет собой противогриппозную вакцину, которая зарегистрирована для сезонной вакцинации, например, вакцины, поступающие в продажу под торговыми названиями Inflexal® V (Crucell); Fluzone® или Vaxigrip® (Sanofi Pasteur); Fluvirin®, Agrippal®, Begrivac® или Optaflu® (Novartis); Fluarix® (GSK); Imuvac® или Influvac® (Abbott); Fluvax® (CSL); Preflucel® (Baxter) и т.п.

Вакцина согласно данному изобретению может быть любой вакциной, содержащей белки HA и NA, в форме вакцины на основе расщепленного вириона, субъединичной вакцины или виросомальной вакцины. Специалисту в данной области известны и привычны несколько приемов получения противогриппозной вакцины.

Вакцины можно составлять в субвирионном виде, например, в форме расщепленного вируса, при этом растворяют или нарушают вирусную липидную оболочку, или в форме одного или нескольких очищенных вирусных белков. Способы расщепления вирусов, таких, как вирусы гриппа, хорошо известны в данной области техники, например, см. WO 02/28422, WO 02/067983, WO 02/074336, WO 01/21151 и т.п. Расщепления вирусов проводят с помощью нарушения или фрагментации целого вируса, как инфекционного (дикого типа или ослабленного), так и неинфекционного (например, инактивированного), разрушающей концентрацией расщепляющего агента. Расщепляющие агенты обычно включают агенты, способные разрушать и растворять липидные мембраны, обычно имеющие гидрофобный конец, присоединенный к гидрофильной голове, например, неионные или ионные (например, катионные) ПАВ, такие, как Triton, Tween, CTAB и т.п. Разрушение приводит к полной или частичной солюбилизации вирусных белков, изменяя целостность вируса.

Способы очистки отдельных белков из вирусов хорошо известны и включают, например, стадии фильтрации, хроматографии, центрифугирования и половолоконное элюирование. В одном варианте осуществления белки очищают ионообменной хроматографией.

Способы инактивации или "убивания" вирусов гриппа для устранения их способности инфицировать клетки млекопитающих известны в данной области техники и включают обработку формалином, бета-пропиолактоном, УФ-светом и т.п.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления используемая в изобретении вакцина представляет собой виросомную противогриппозную вакцину скорее, чем обыкновенную (т.е. расщепленную, субединичную или противогриппозную цельную) вакцину. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления противогриппозная вакцина, применяемая в способах данного изобретения, является виросомальной вакциной, которая представляет собой вакцину, в которой большинство, т.е. по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 70% крупных липидно-белковых комплексных структур присутствуют в виде виросомов. Такие виросомы включают белки HA и NA. В виросомальных вакцинах виросомы специально получают в производственном процессе, например, путем солюбилизации гриппозных частиц с использованием детергента, удаления нерастворимых материалов и последующего определенного удаления детергента для восстановления виросомов. В определенных вариантах осуществления виросомы содержат экзогенные липиды. Виросомы представляют собой восстановленные липидные мембраны, содержащие антигены из вируса. Виросомы, например, могут быть получены с помощью двух основных подходов, один из которых основан на добавлении экзогенных липидов во время повторной сборки виросома (Almeida et al., 1975. Lancet 2:899-901; Trudel M. and F. Nadon, 1981. Can J Microbiol. 27:958-62; Ando et al., 1997. J Microencapsul. 14:79-90; Markgraf et al., 2001. Cloning 3:11-21; Gluck, R. and I. C. Metcalfe, 2002. Vaccine 20:B10-16; Mischler, R. and I. C. Metcalfe, 2002. Вакцина 20:B17-23) и другие основаны на образовании виросомов в отсутствие добавления экзогенных липидов (Stegmann, T. et al. 1987. EMBO J. 6:2651-9; Huckriede et al., 2003. Vaccine 21:925-31). Особенно полезная вакцина для применения в настоящем изобретении, таким образом, представляет собой такую, как Inflexal®V (см., например, WO 92/19267; Glück, R, 1992, Vaccine 10: 915-920; Mischler, R. and I. C. Metcalfe, 2002. Vaccine 20:B17-23). Эти виросомы также называются иммуностимулирующими восстановленными виросомами гриппа (IRIV). Они в основном состоят из сферических однослойных везикул с диаметром в интервале от примерно 100 до 300 нм, например, примерно 150 нм, а основные составляющие представляют собой встречающиеся в природе фосфолипиды (PL) и фосфатидилхолин (PC), последний образует примерно 70% структуры виросома, в то время как оставшиеся 30% компонентов мембраны состоят из PL оболочки, остающейся от вируса гриппа, используемого для получения гликопротеинов HA и NA. Они могут быть получены в крупном масштабе из солюбилизированного в октаэтиленгликоле (OEG) вируса гриппа, который после ультрацентрифугирования смешивают с лецитином. Процесс получения Inflexal® V подробно описан в тексте и на фиг. 1 в публикации Mischler, R. and I. C. Metcalfe, 2002. Vaccine 20:B17-23, включенной в данный документ путем ссылки. Каждая доза (0,5 мл) вакцины Inflexal® V обычно содержит в качестве активного компонента 15 мкг гемагглютинина каждого из штаммов гриппа, сезонно рекомендованных ВОЗ, и дополнительно каждая доза содержит: 117 мкг лецитина (фосфолипида), 3,8 мг гидрофосфат динатрия дигидрата, 0,7 мг дигидрофосфата калия, 2,4 мг хлорида натрия и 0,5 мл воды для инъекций. Виросомальную противогриппозную вакцину Inflexal® V можно приобрести у компании Crucell, она предоставляет отличную иммуногенность без необходимости использовать вспомогательное средство и низкую реактогенность.

HA и NA для вакцин можно получать из вирусов гриппа, которые традиционно производят в оплодотворенных куриных яйцах. Этот широко известный способ используется уже десятилетиями и все равно является стандартной процедурой для абсолютного большинства противогриппозных вакцин, поступающих в продажу.

Альтернативно HA и NA можно получать из вирусов гриппа, произведенных в подходящих клеточных линиях, таких, как клеточные линии млекопитающих, птиц или насекомых, предпочтительно в клеточных линиях млекопитающих, таких, как MDCK, Vero, PER.C6, BHK и т.п., используя средства и способы как таковые известные и доступные специалисту (например, описанные в публикации EP 1951296). Использование клеток млекопитающих обозначает, что вакцины могут не содержать такие материалы, как куриную ДНК, белки яйца (такие, как овальбумин и овомукоид) и т.п., таким образом снижая аллергенность. WO 97/37000, WO 97/37001, EP 1108787 и EP 2290053 являются примерами, где описано получение клеток и клеточных линий животных, способных расти в суспензии и в среде, не содержащей сыворотки, и пригодных для производства и репликации вируса гриппа. Дополнительные подробности приведены в WO 03/023021 и WO 03/023025. Клетки можно выращивать различными путями, например, в суспензии, в прикрепленной культуре, на микроносителях. Производство может предпочтительно проводиться в не содержащей сыворотки суспензионной культуре.

Белки субъединичной вакцины могут также быть получены традиционной рекомбинантной экспрессией ДНК в подходящих системах, таких, как эукариотические клетки, предпочтительно клетки млекопитающих.

Вирионы можно собирать из содержащих вирус жидкостей различными способами. Например, процесс очистки может включать зональное центрифугирование с использованием раствора сахарозы с линейным градиентом, содержащим детергент для разрушения вирионов. Антигены можно затем после необязательного разведения очищать путем диафильтрации.

Очищенные вакцины с поверхностным антигеном содержат поверхностные антигены гриппа гемагглютинин и обычно также нейрамнидазу. Процессы получения этих белков в очищенной форме хорошо известны в данной области техники.

Иммунный ответ, полученный способами данного изобретения будет в общем случае включать ответ антитела, предпочтительно защитный ответ антитела. Способы оценки ответов антител, нейтрализующую способность и защиту после противогриппозной вакцинации хорошо известны в данной области техники. Исследования на людях показало, что титр антитела против HA коррелирует с защитой (титр гемагглютинации-ингибирования (HAI) образца сыворотки, равный примерно 30-40, дает примерно 50% защиты от заражения гомологичным вирусом) [например, Potter & Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69-75], хотя недавние исследования ставят это под вопрос или даже демонстрируют отсутствие корреляции между HAI и эффективностью.

Введение вакцины в соответствии с данным изобретением можно проводить, используя стандартные пути парентерального введения, предпочтительно инъекционное, например, подкожное, внутрикожное, внутримышечное. В одном варианте осуществления вакцину вводят путем внутримышечной инъекции, например, в дельтовидную мышцу руки или латеральную широкую мышцу бедра. Специалисту известны различные возможности введения вакцины в соответствии с настоящим изобретением для того, чтобы вызвать иммунный ответ на антиген(ы) в вакцине.

В схеме иммунизации первичная-бустерная можно использовать многократные дозы. В типичном варианте осуществления по меньшей мере три дозы вакцины согласно данному изобретению все вводятся путем внутримышечной инъекции. В схемах изобретения композиция вакцины содержит белки HA и NA из по меньшей мере первого штамма гриппа, и белки HA и NA первого штамма гриппа вводят по меньшей мере трижды в течение периода продолжительностью менее одного года. Схема введения, таким образом, включает первичное введение и по меньшей мере два бустерных введения. В схеме вакцинации первичная-бустерная предпочтительно одну и ту же вакцину используют трижды, но также возможно проводить изменения в отношении определенных компонентов.

Ранее было описано введение двух доз противогриппозной вакцины субъектам, иммунная система которых не подвергалась воздействию вируса, но ранее введение трех доз одной и той же вакцины одному и тому же субъекту не было типичным, и улучшенная ширина защиты, описанная впервые в данном документе, после трехкратного введения противогриппозной вакцины была в высшей степени неожиданной. Многократные дозы обычно вводят согласно изобретению с интервалом по меньшей мере в одну неделю (например, примерно 2 недели, примерно 3 недели, примерно 4 недели, примерно 6 недель, примерно 8 недель, примерно 10 недель, примерно 12 недель, примерно 16 недель и т.д.). Общее время между первым и третьим введением согласно данному изобретению составляет один год или меньше. Предпочтительно общее время между первым и третьим введением составляет 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 месяца или меньше. Месяц равен 4 неделям, и эти термины используются взаимозаменяемо в данном документе. В определенных вариантах осуществления вторую дозу вводят с интервалом от 1 до 12 недель, предпочтительно с интервалом от 2 до 8 недель, предпочтительно с интервалом от 3 до 6 недель после первой дозы. В определенных вариантах осуществления третью дозу вводят с интервалом от 4 недель до 10 месяцев, предпочтительно с интервалом от 4 недель до 6 месяцев после второй дозы. В определенных вариантах осуществления вторую дозу вводят примерно через 4 недели после первой дозы, а третью дозу вводят с интервалом в примерно 4 недели и до 3 месяцев, например, примерно 4 недели, после второй дозы. Такая схема иммунизации согласно данному изобретению обладает преимуществом, обеспечивающим относительно быстрое формирование защиты, а также перекрестной защиты от гетерологичных и даже гетеросубтипических штаммов гриппа, по отношению ко всем штаммам, из которых были получены вводимые с вакциной антигены HA и NA.

В данной области техники известно, что вспомогательные средства повышают иммунный ответ на применяемую антигенную детерминанту, а фармацевтические композиции, содержащие антигены гриппа и пригодные вспомогательные средства хорошо известны в данной области техники, например, противогриппозная вакцина FluAd® (Novartis) содержит вспомогательное средство (MF59, эмульсионное типа масло-в-воде вспомогательное средство, содержащее сквален). Выражения “вспомогательное средство” и "иммуностимулятор" используют в данном документе взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте вспомогательное средство используют для усиления иммунного ответа на антигены гриппа. Противогриппозные вакцины, используемые в соответствии с данным изобретением, не содержат вспомогательные средства. Неожиданно было обнаружено, что вспомогательные средства не требуются для обеспечения широкого иммунного ответа, если сезонную вакцину вводят субъекту трижды, даже путем парентеральной инъекции, поскольку определенное число предшествующих документов предполагали, что необходимы либо введение через слизистые оболочки, либо сильнодействующие вспомогательные средства, либо и то и другое для расширения иммунного ответа относительно противогриппозных вакцин. Некоторые преимущества, получаемые от исключения вспомогательных средств из вакцин, представляют собой повышение безопасности, снижение реактогенности, упрощение продукта, поскольку требуется испытание и производство меньшего числа компонентов, а также потенциальное применение вакцин в молодых субъектах.

Введение фармацевтических композиций согласно данным изобретениям в основном направлено на то, чтобы вызвать образование иммунного ответа. Иммунный ответ может включать клеточный и/или гуморальный ответ. Наблюдаемая перекрестная защита может включать индуцирование антител, но не обязательно против консервативного эпитопа HA.

Введение вакцины согласно способам данного изобретения вызывает перекрестную защиту от гетерологичных штаммов гриппа и даже гетеросубтипических штаммов гриппа. Оно может предоставить стерильную защиту от таких штаммов, т.е. может не защищать от инфекции как таковой, но по меньшей мере направлено на снижение частоты, тяжести и/или продолжительности по меньшей мере одного и предпочтительно нескольких или всех симптомов гриппозного заражения такими штаммами, а именно, миальгии, головной боли, слабости/усталости, кашля, боли в носоглотке, снижения веса, озноба, жара, боли в мышцах, покашливания, общего плохого состояния и т.п. Кроме того ожидается, что частота, тяжесть и/или продолжительность осложнений, которые могут возникнуть в результате гриппозного инфицирования такими штаммами (включая, например, первичную вирусную пневмонию или вторичную бактериальную пневмонию), которые даже могут потребовать госпитализацию, а в особо тяжелых случаях могут приводить к смертельному исходу, будут снижены после введения вакцины согласно способам данного изобретения. Способы данного изобретения могут, таким образом, снизить или даже предотвратить некоторые нежелательные воздействия гриппа на экономику, например, отсутствие на работе по болезни, визиты к врачу, госпитализацию, необходимость в (дополнительных) лекарствах и т.д. Способы данного изобретения, таким образом, могут иметь большой эффект в здравоохранении. Кроме того, способы данного изобретения позволяют проводить вакцинацию против нежелательных последствий инфицирования пандемическики штаммами гриппа путем повторного применения стандартных сезонных вакцин, что может быть огромным преимуществом с точки зрения времени, позволяя обеспечить раннее наличие вакцин во время пандемии.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами. Данные примеры не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Они служат лишь для пояснения настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Перекрестная защита от гетерологичного штамма гриппа после трех вакцинаций вакциной против сезонного гриппа у мышей.

Мышей иммунизировали трехвалентной виросомальной вакциной против гриппа Inflexal® V (Crucell) сезона 2009/2010. Эта вакцина содержит HA (30 мкг/мл) и NA (количество не указано, обычно предполагается, что оно находится в пределах от примерно 0,8 до 4 мкг NA на 15 мкг HA) каждого из следующих трех штаммов гриппа: (H1N1 A/Brisbane/59/07, H3N2 A/Uruguay/716/2007, B/Brisbane/60/2008) в виде виросомов. Доза вакцины для человека составляет 15 мкг НА на штамм, т.е. 0,5 мл. Мышей вакцинировали трижды, используя 20% от дозы для человека с интервалами в 3 недели (50 мл внутримышечная инъекция в обе четырехглавые мышцы задних конечностей на каждую иммунизацию), с использованием обычного шприца для инъекций с иглой. Через четыре недели после последней иммунизации мышей инфицировали с использованием 25× LD50 (LD50 = доза вируса, приводящая к 50% смертности среди зараженных мышей) адаптированного к мышам штамма гриппа H1N1 WSN33, который генетически удален от (и поэтому является гетерологичным к) штамма(у) H1 в вакцине (см. Фиг. 1B). Мышей, получивших 3-кратную вакцину, сравнивали с мышами, которые получили инъекции разбавителя (PBS, 2×50 мл внутримышечно на каждую инъекцию) согласно такой же схеме дозирования. После инфицирования каждый день наблюдали за весом тела и клиническими симптомами. Клинические оценки присваивались следующим образом: 0 = клинические симптомы отсутствуют; 1 = грубая шерсть; 2 = грубая шерсть, слабая реакция, пассивны при обращении с ними; 3 = грубая шерсть, свернуты в клубок, затрудненное дыхание, пассивны при обращении с ними; 4 = грубая шерсть, свернуты в клубок, затрудненное дыхание, отсутствие реакции. Мышам, получившим клиническую оценку 4, проводили эвтаназию и присваивали оценку "смерть".

На Фиг. 2А показана кривая выживания Каплана-Мейера для мышей после инфицирования, которая неожиданно показывает значительное увеличение выживаемости (8 из 10 мышей, иммунизированных вакциной трехкратно) по сравнению с контрольными мышами (2 из 10, p<0,023 с использованием точного критерия Фишера). Как и ожидалось, 1 инъекция вакцины не дала защиты в этой модели (не показано).

На Фиг. 2В показан средний относительный вес тела мышей после инфицирования, который показывает, что обе группы мышей потеряли более 20% веса, после чего иммунизированные мыши в основном восстановились, а неиммунизированные мыши в основном поддались инфекции. Последний зафиксированный вес тела мышей перед смертью или эвтаназией использовали для анализа.

На Фиг. 2С показаны клинические оценки мышей после инфицирования, которые показывают, что иммунизированные мыши, пережившие инфекцию, не страдают от продолжительной клинической болезни. Последнюю зафиксированную клиническую оценку перед смертью или эвтаназией использовали для анализа.

Композицию сезонной вакцины модифицируют почти каждый год, если предполагается, что они более не предоставляют защиты от генетически дрейфующих распространяющихся штаммов. Таким образом, совершенно неожиданным оказалось то, что дополнительные бустеры вакциной против сезонного гриппа 2009/2010 (т.е. трехкратное введение одной и той же вакцины) дает защиту от генетически удаленного штамма гриппа, относящемуся к 1933 году. Сделано заключение о том, что трехкратное введение вакцины приводит к существенной перекрестной защите от гетерологичного штамма гриппа.

Пример 2. Перекрестная защита от гетеросубтипического штамма гриппа после трех вакцинаций вакциной против сезонного гриппа у мышей.

В примере 1 продемонстрировали перекрестную защиту от гетерологичного штамма H1N1. В данном примере исследовали будет ли такая перекрестная защита распространяться на гетеросубтипические штаммы.

Мышей иммунизировали согласно такой же схеме дозирования и такой же вакциной, как и в примере 1. Через четыре недели после последней иммунизации мышей инфицировали 25× LD50 адаптированным к мышам гриппом H5N1 НК/156/97, который является гетеросубтипическим по отношению к штаммам, антигены которых присутствуют в вакцине. После инфицирования за болезнью наблюдали согласно тем же критериям, как описано в примере 1.

На Фиг. 3А показана кривая выживания Каплана-Мейера для мышей после инфицирования, которая неожиданно показывает значительное увеличение выживаемости (7 из 8 мышей, иммунизированных вакциной трехкратно) по сравнению с контрольными мышами (0 из 8, p<0,001 с использованием точного критерия Фишера).

На Фиг. 3В показан средний относительный вес тела мышей после инфицирования, который показывает, что обе группы мышей потеряли более 20% веса, после чего иммунизированные мыши в основном восстановились, а неиммунизированные мыши быстро поддались инфекции. Последний зафиксированный вес тела мышей перед смертью или эвтаназией использовали для анализа.

На Фиг. 3С показаны клинические оценки мышей после инфицирования, которые показывают, что иммунизированные мыши, пережившие инфекцию, не страдают от продолжительной клинической болезни. Последнюю зафиксированную клиническую оценку перед смертью или эвтаназией использовали для анализа.

Сезонные вакцины составляют из штаммов, которые ежегодно выбирают в соответствии с распространяющимися штаммами гриппа, и в общем случае не предполагается, что они предоставят защиту от дополнительных субтипов гриппа (см. Фиг. 1А для краткого обзора). Специфические вакцины разрабатывают для нескольких субтипов гриппа, предположительно представляющих собой угрозу пандемии, как, например, H5N1. Так, совершенно неожиданным оказалось то, что дополнительные бустеры вакциной против сезонного гриппа 2009/2010 дает защиту от гетеросубтипического гриппа H5N1.

Сделано заключение о том, что трехкратное введение вакцины приводит к существенной перекрестной защите не только от гетерологичного штамма гриппа, но также и от гетеросубтипического штамма гриппа.

Пример 3. Широта защиты, вызываемая многократными введениями Inflexal^® V 2009/2010 у мышей.

Действие вакцины против сезонного гриппа (H1N1 A/Brisbane/59/07, H3N2 A/Uruguay/716/2007, B/Brisbane/60/2008: Inflexal^® V, сезон 2009/2010), вводимой однократно или трехкратно (временной интервал между введениями: 3 недели) исследовали на мышах, которых впоследствии (через 4 недели после иммунизации) инфицировали: i) гетерологичными штаммами H1, H3 и B, ii) гетеросубтипическим штаммом H5, и iii) гетеросубтипическим штаммом H7 (способами, как в примерах 1-3) в независимых экспериментах.

Предполагается, что 3 введения сезонной вакцины будут в значительной степени защищать животных от гетерологичных и гетеросубтипических штаммов гриппа, которые не представлены (т.е. антигены этих штаммов не содержатся) в вакцине.

Пример 3А. Перекрестная защита от гетерологичного штамма гриппа Н3 после трех вакцинаций вакциной против сезонного гриппа у мышей.

В примере 1 продемонстрировали перекрестную защиту от гетерологичного штамма H1N1. В данном примере исследовали будет ли такая перекрестная защита распространяться на гетерологичный грипп Н3.

Мышей иммунизировали согласно такой же схеме дозирования и такой же вакциной, как и в примере 1. Через четыре недели после последней иммунизации мышей инфицировали 25× LD50 адаптированным к мышам гриппом H3N2 НК/1/68, который является сильно гетерологичным по отношению к штамму H3N2, присутствующему в вакцине (см. Фиг. 1С). После инфицирования за болезнью наблюдали согласно тем же критериям, как описано в примере 1.

На Фиг. 4А показана кривая выживания Каплана-Мейера для мышей после инфицирования, которая показывает значительное увеличение выживаемости (6 из 10 мышей, иммунизированных вакциной трехкратно) по сравнению с контрольными мышами (0 из 10, p<0,05 с использованием точного критерия Фишера).

На Фиг. 4В показан средний относительный вес тела мышей после инфицирования, который показывает, что обе группы мышей потеряли более 20% веса, после чего иммунизированные мыши в основном восстановились, а неиммунизированные мыши быстро поддались инфекции. Последний зафиксированный вес тела мышей перед смертью или эвтаназией использовали для анализа.

На Фиг. 4С показаны клинические оценки мышей после инфицирования, которые показывают, что иммунизированные мыши, пережившие инфекцию, не страдают от продолжительной серьезной клинической болезни. Последнюю зафиксированную клиническую оценку перед смертью или эвтаназией использовали для анализа.

Сезонные вакцины составляют из штаммов, которые ежегодно выбирают в соответствии с распространяющимися штаммами гриппа, и в общем случае предоставят защиту только от штаммов, которые представлены в вакцине, и близкородственных штаммов. Штамм, используемый для инфицирования в настоящем примере, представляет собой оригинальный пандемический штамм H3N2, относящийся к 1968 году, и, таким образом, являющийся генетически отдаленным от текущих штаммов H3N2. Композицию вакцины обновляют на основании значительно меньших степеней генетической вариации, которые предположительно приведут к снижению защиты. Таким образом, до настоящего изобретения совершенно не предполагалось, что вакцина против сезонного гриппа при трехкратном введении дает существенную защиту от генетически удаленного гриппа H3N2. Эти результаты подтверждают, что трехкратное введение вакцины против сезонного гриппа приводит к существенной перекрестной защите от гетерологичного штамма гриппа, в данном случае - от штамма Н3.

Пример 3В. Перекрестная защита от гетерологичного штамма гриппа В после одной или трех вакцинаций вакциной против сезонного гриппа у мышей.

В примере 1 продемонстрировали перекрестную защиту от гетерологичного штамма H1N1. В данном примере исследовали будет ли такая перекрестная защита распространяться на гетерологичный грипп В в случае композиции сезонной вакцины 2009/2010. Мышей вакцинировали трижды сезонной вакциной с интервалами в 3 недели, и через 4 недели после последней иммунизации инфицировали, используя 25×LD50 гриппа B/Florida/04/06. В контрольной группе, получившей одну инъекцию сезонной вакцины, иммунизацию также проводили за 4 недели до инфицирования. После инфицирования за болезнью наблюдали согласно тем же критериям, как описано в примере 1.

На Фиг. 5A показана кривая выживания Каплана-Мейера для мышей после инфицирования, которая показывает, что 1-кратное и 3-кратное введение вакцины дает существенную защиту от инфицирования по сравнению с контрольным PBS (выживаемость 80%, p=0,01; 100%, p=0,001 соответственно (2-сторонний точный критерий Фишера).

На Фиг. 5В показан средний относительный вес тела мышей после инфицирования, который показывает, что как 1-кратное, так и 3-кратное введение вакцины значительно снижают потерю веса тела после инфицирования (p=0,032 и p<0,001 соответственно, ANOVA с критерием множественных сравнений Даннетта). В частности, в группе, получавшей 3-кратную вакцинацию, потеря веса после инфицирования практически не наблюдалась.

На Фиг. 5С показаны клинические оценки мышей после инфицирования, которые показывают, что как 1-кратное, так и 3-кратное введение вакцины сильно уменьшают клинические симптомы по сравнению с контрольным PBS (особенно заметно на день 3 после инфицирования в обоих случаях). Заболевание в обработанных группах было очень легким, причем средняя клиническая оценка не превысила 1.

Несколько компаний сейчас перешли на включение 2 штаммов гриппа B в четырехвалентные составы вакцины против сезонного гриппа, представляющих 2 основных прототипа филогенетических ветвей гриппа B (Victoria/02/1987) и Yamagata/16/1988 (Фиг. 1D)), что обосновано тем, что перекрестная защита не ожидается между этими 2 филогенетическими ветвями. Таким образом, до настоящего изобретения совершенно не предполагалось, что мыши, иммунизированные трижды вакциной против сезонного гриппа, в которой представлена только одна филогенетическая ветвь гриппа В, будут полностью защищены от гетерологичного инфицирования гриппом В. Эти результаты подтверждают, что трехкратное введение вакцины против сезонного гриппа приводит к существенной перекрестной защите от гетерологичного штамма гриппа, в данном случае - от штамма В. Кроме того композиция вакцины 2009 года уже дает существенную защиту от гетерологичного гриппа В, в то время как защита дополнительно усиливается путем 3-кратной сезонной вакцинации.

Пример 3С. Перекрестная защита от гетеросубтипического штамма гриппа H5N1 после одной или трех вакцинаций вакциной против сезонного гриппа у мышей.

В примере 2 продемонстрировали перекрестную защиту от гетеросубтипического штамма H5N1. В настоящем примере исследовали будет ли защита от гетеросубтипического гриппа H5N1 зависеть от числа иммунизаций вакциной (Inflexal® V, композиция сезона 2009/10). Мышей вакцинировали трижды сезонной вакциной с интервалами в 3 недели, и через 4 недели после последней иммунизации инфицировали, используя 25×LD50 гриппа А/НК/156/97. В контрольной группе, получившей одну инъекцию сезонной вакцины, иммунизацию также проводили за 4 недели до инфицирования. После инфицирования за болезнью наблюдали согласно тем же критериям, как описано в примере 1.

На Фиг. 6A показана кривая выживания Каплана-Мейера для мышей после инфицирования, которая показывает, что 1-кратное и 3-кратное введение вакцины дает существенную защиту от инфицирования; выживаемость 60%, p=0,022; 70%, p=0,006 соответственно (2-сторонний точный критерий Фишера).

На Фиг. 6В показан средний относительный вес тела мышей после инфицирования, который показывает, что 3-кратное введение вакцины значительно снижает потерю веса тела (p=0,023), ANOVA с критерием множественных сравнений Даннетта). На основании веса тела сделано заключение, что защита путем 3-кратного вакцинирования является более устойчивым, в то время как доля защиты в процентах сравнима между 1-кратным и 3-кратным вакцинированием.

На Фиг. 6С показаны клинические оценки мышей после инфицирования, которые показывают, что как группа с 1-кратной иммунизацией вакциной, так и группа с 3-кратной иммунизацией вакциной были в значительной степени больны после инфицирования, однако, обе группы в конце концов поправились, в то время как контрольная группа поддалась инфекции.

Эти результаты подтверждают результаты в примере 2. Кроме того, они указывают на то, что защита путем 3-кратной сезонной вакцинации от гетеросубтипического инфицирования H5N1 является более устойчивой, чем защита путем 1-кратной сезонной вакцинации.

Пример 4. Широта защиты, вызываемая многократными введениями Inflexal^® V 2010/2011 у мышей.

Действие вакцины против сезонного гриппа (H1N1 A/California/07/09, H3N2 A/Victoria/210/2009, B/Brisbane/60/2008: Inflexal^® V, сезон 2010/2011), вводимой однократно или трехкратно (временной интервал между введениями: 3 недели) исследовали на мышах, которых впоследствии (через 4 недели после иммунизации) инфицировали: i) гомологичными штаммами H1, H3 и B, ii) гетерологичными штаммами H1, H3 и B.

Предполагается, что 3 введения сезонной вакцины будут в значительной степени защищать животных от гетерологичных и гетеросубтипических штаммов гриппа, которые не представлены в вакцине.

Пример 4А. Перекрестная защита от гетерологичного штамма гриппа В после трех вакцинаций вакциной против сезонного гриппа у мышей.

В данном примере исследовали будет ли 3-кратная иммунизация вакциной против сезонного гриппа (Inflexal® V, композиция сезона 2010/2011) вызывать защиту от гриппа В (Flo/4/2006), относящегося к другой филогенетической ветви гриппа В по сравнению со штаммом, представленным в вакцине (см. Фиг. 1D).

Мышей иммунизировали согласно такой же схеме дозирования и такой же вакциной, как и в примере 1. Через четыре недели после последней иммунизации мышей инфицировали 25× LD50 адаптированным к мышам гриппом В Flordia/4/2006, который является сильно гетерологичным по отношению к штамму гриппа В, присутствующему в вакцине ((Brisbane/60/2008) см. Фиг. 1D). После инфицирования за болезнью наблюдали согласно тем же критериям, как описано в примере 1.

На Фиг. 7А показана кривая выживания Каплана-Мейера для мышей после инфицирования, которая неожиданно показывает значительное увеличение выживаемости (10 из 10 мышей, иммунизированных вакциной трехкратно) по сравнению с контрольными мышами (0 из 10, p<0,001 с использованием точного критерия Фишера).

На Фиг. 7В показан средний относительный вес тела мышей после инфицирования, который показывает, что контрольная группа мышей потеряла более 25% от первоначального веса тела перед тем, как она поддалась инфекции, в то время как группа с 3-кратным вакцинированием потеряла менее чем 10% их веса тела (значительное отличие на день 3 и далее). Последний зафиксированный вес тела мышей перед смертью или эвтаназией использовали для анализа.

На Фиг. 7С показаны клинические оценки мышей после инфицирования, которые показывают, что 3-кратно иммунизированные мыши, пережившие инфекцию, не страдают от серьезной клинической болезни, в то время как контрольная группа быстро перешла в состояние серьезной клинической болезни (как определяется по клинической оценке >2; значительное отличие на день 3). Последнюю зафиксированную клиническую оценку перед смертью или эвтаназией использовали для анализа.

Сезонные вакцины составляют из штаммов, которые ежегодно выбирают в соответствии с распространяющимися штаммами гриппа, и в общем случае предоставят защиту только от штаммов, которые представлены в вакцине, и близкородственных штаммов. Несколько компаний сейчас перешли на включение 2 штаммов гриппа B в четырехвалентные составы вакцины против сезонного гриппа, представляющих 2 основных прототипа филогенетических ветвей гриппа B (Victoria/02/1987) и Yamagata/16/1988 (Фиг. 1D)), что обосновано тем, что перекрестная защита не ожидается между этими 2 филогенетическими ветвями. Таким образом, до настоящего изобретения совершенно не предполагалось, что мыши, иммунизированные трижды вакциной против сезонного гриппа, в которой представлена только одна филогенетическая ветвь гриппа В, будут полностью защищены от гетерологичного инфицирования гриппом В. Эти результаты подтверждают, что трехкратное введение вакцины против сезонного гриппа приводит к существенной перекрестной защите от гетерологичного штамма гриппа, в данном случае - от штамма В. Кроме того, результаты демонстрируют, что гетерологичная перекрестная защита путем 3-кратной вакцинации не ограничивается одной композицией противогриппозной вакцины, поскольку это наблюдалось для обеих композиций Inflexal 2009/2010 и 2010/11.

Пример 4В. Перекрестная защита от гетерологичного штамма гриппа В после одной или трех вакцинаций вакциной против сезонного гриппа у мышей.

Пример 4А демонстрирует перекрестную защиту от гетерологичного гриппа В для композиции сезонной вакцины 2010 года. В настоящем примере мы исследовали будет ли защита от гетерологичного гриппа В зависеть от числа иммунизаций вакциной. Мышей иммунизировали трижды сезонной вакциной (Inflexal® V, сезон 2010/11) с интервалами в 3 недели, и через 4 недели после последней иммунизации инфицировали, используя 25×LD50 гриппа B/Florida/04/06. В контрольной группе, получившей одну инъекцию сезонной вакцины, иммунизацию также проводили за 4 недели до инфицирования. После инфицирования за болезнью наблюдали согласно тем же критериям, как описано в примере 1.

На Фиг. 8A показана кривая выживания Каплана-Мейера для мышей после инфицирования, которая показывает, что 3-кратное введение вакцины дает полную защиту от инфицирования (100%, p=0,001, 2-сторонний точный критерий Фишера). 1-кратное введение вакцины не дает существенной защиты от инифицирования гетерологичным гриппом В.

На Фиг. 8В показан средний относительный вес тела мышей после инфицирования, который показывает, что только 3-кратное введение вакцины значительно снижает потерю веса тела после инфицирования (p=0,018), ANOVA с критерием множественных сравнений Даннетта).

На Фиг. 8С показаны клинические оценки мышей после инфицирования, которые показывают, что 3-кратное введение вакцины сильно уменьшает клинические симптомы по сравнению с контрольным PBS (особенно заметно на день 3 после инфицирования), в то время как 1-кратное введение вакцины вызывает только незначительную задержку в возникновении симптомов. Заболевание в группе с 3-кратным введением вакцины было очень легким, причем средняя клиническая оценка не превысила 1,5.

Сходные результаты были получены, когда другую сезонную вакцину (Influvac®, субъединичная вакцина от Abbot Healthcare, композиция сезона 2010/11 (т.е. те же штаммы, что и в Inflexal® V для того же сезона) вводили трижды. Несмотря на то что существенная защита уже была получена после одного введения, полная защита наблюдалась только после 3-х введений.

Эти данные явно показывают преимущество 3-кратной иммунизации над 1-кратной иммунизацией с точки зрения защиты от гетерологичного гриппа В.

Пример 4С. Перекрестная защита от гетеросубтипического штамма гриппа H5N1 после одной или трех вакцинаций вакциной против сезонного гриппа у мышей.

Примеры 2 и 3С демонстрируют перекрестную защиту от гетеросубтипического штамма H5N1 для композиции сезонной вакцины 2009 года. В настоящем примере исследовали будет ли защита от гетеросубтипического гриппа H5N1 получена от 1 или 3 иммунизаций композицией сезонной вакцины. Мышей иммунизировали трижды сезонной вакциной (Inflexal® V, композиция 2010/11) с интервалами в 3 недели, и через 4 недели после последней иммунизации инфицировали, используя 25×LD50 гриппа А/НК/156/97. В контрольной группе, получившей одну инъекцию сезонной вакцины, иммунизацию также проводили за 4 недели до инфицирования. После инфицирования за болезнью наблюдали согласно тем же критериям, как описано в примере 1.

На Фиг. 9A показана кривая выживания Каплана-Мейера для мышей после инфицирования, которая показывает, что 3-кратное введение вакцины дает существенную защиту от инфицирования (80%, p=0,001, 2-сторонний точный критерий Фишера).

На Фиг. 9В показан средний относительный вес тела мышей после инфицирования, который показывает, что 3-кратное введение вакцины значительно снижает потерю веса тела (p=0,023), ANOVA с критерием множественных сравнений Даннетта), в то время как 1-кратное введение вакцины значительно не снижает потерю веса.

На Фиг. 9С показаны клинические оценки мышей после инфицирования, которые показывают, что как группа с 1-кратной иммунизацией вакциной, так и группа с 3-кратной иммунизацией вакциной были в значительной степени больны после инфицирования, однако, только мыши, получившие 3-кратное введение вакцины, в конце концов поправились (значительное отличие от PBS на день 7 и далее).

Эти результаты показывают, что 3-кратное введение сезонной вакцины композиции 2010 года также дает существенную защиту от гетеросубтипического инфицирования H5N1, расширяя результаты примеров 2 и 3С. Несмотря на то что 1-кратное введение сезонной вакцины 2009 года уже дает частичную защиту от инфицирования H1N1, этого не произошло в случае вакцины 2010 года. В обоих случаях защита определенно более устойчива после 3-кратной иммунизации по сравнению с 1-кратной иммунизацией.

Пример 5. Широта защиты, вызываемой многократными введениями противогриппозной вакцины, у хорьков.

Хорьки считаются проверенной моделью для испытания эффективности противогриппозных вакцин. Действие вакцины против сезонного гриппа (H1N1, H3N2, B: Inflexal® V, сезон 2011/2012 или 2012/2013), вводимой однократно, дважды или трижды (временной интервал между введениями: 3 недели) исследовали на хорьках, которых затем (через 4 недели) по отдельности инфицировали гетеросубтипическим штаммом Н5 (H5N1 Ind/05/05). Репликацию вируса оценивали по культивированию ежедневных мазков из горла, а выживаемость наблюдали вплоть 5 дней после инфицирования.

Ожидается, что 3 введения сезонной вакцины будут существенно защищать животных от гетеросубтипического гриппа H5N1.

Пример 6. Широта защиты, вызываемой дополнительным бустерным введением альтернативных вакцин.

Действие альтернативных противогриппозных вакцин (например, альтернативной зарегистрированной вакцины, инактивированнного целого вируса гриппа и/или рекомбинантных HA+NA), вводимых однократно, дважды или трижды (временной интервал между введениями: 3 недели) исследовали на мышах, которых впоследствии (через 4 недели после иммунизации) инфицировали: i) гомологичными штаммами H1, H3 и B, ii) гетерологичными штаммами H1, H3 и B, iii) гетеросубтипическими штаммами гриппа.

Предполагается, что дополнительное бустерное введение также таких вакцин будет давать перекрестную защиту от гетерологичных и гетеросубтипических штаммов гриппа, которые не представлены в вакцине.

Пример 7. Дополнительные бустерные введения противогриппозной вакцины V объектам-людям.

Было проведено клиническое испытание на объектах-людях для исследования безопасности и иммуногенности вакцины против сезонного гриппа (H1N1 A/Brisbane/59/07, H3N2 A/Uruguay/716/2007, B/Brisbane/60/2008: Inflexal® V, сезон 2011/2012), вводимой трижды (временной интервал между введениями: 4 недели). Сыворотку и одноядерные клетки переферической крови собирали до начала каждой иммунизации, 4 недели после последней иммунизации и через 5 месяцев после первичной иммунизации. Сыворотку и одноядерные клетки переферической крови собирали через 12 месяцев после первичной иммунизации.

За иммуногенностью наблюдали с помощью гомологичной, гетерологичной и гетеросубтипической нейтрализации, связывания и HAI анализов собранной сыворотки. Данные по иммуногенности после одной иммунизации показали, что вакцина отвечает критериям EMA по всем трем штаммам. Перекрестную защиту сывороткой исследовали на мышах, которые получали внутрибрюшинную инъекцию сыворотки и впоследствии (через 1 день после инъекции) инфицировали: i) гомологичными штаммами H1, H3 и B, ii) гетерологичными штаммами H1, H3 и B, iii) гетеросубтипическими штаммами гриппа.

1. Способ индукции перекрестной защиты от по меньшей мере одного гетеросубтипического штамма гриппа по сравнению со штаммами гриппа, антигены из которых присутствуют в противогриппозной вакцине, включающий введение противогриппозной вакцины, содержащей НА и NA, где вакцина является виросомальной противогриппозной вакциной, которая не содержит вспомогательное средство и которую вводят внутримышечно по меньшей мере трижды в течение одного года.

2. Способ по п. 1, где вакцину вводят с интервалом между введениями, равным по меньшей мере одной неделе, предпочтительно с интервалом примерно от трех до восьми недель.

3. Способ по п. 1, где вторую дозу вакцины субъекту вводят через период от 1 недели до 8 недель после первой дозы, а третью дозу вакцины субъекту вводят через период от 3 недель до 26 недель после второй дозы.

4. Способ по п. 1, где вторую дозу вакцины субъекту вводят через примерно один месяц после первой дозы, а третью дозу вакцины субъекту вводят через примерно один месяц после второй дозы.

5. Способ по п. 1, где вакцина содержит НА и NA из трех или четырех штаммов гриппа.

6. Способ по п. 1, где вакцина содержит НА и NA из трех или четырех штаммов гриппа и где вакцина содержит НА и NA из штамма H1, штамма Н3 и штамма В.

7. Способ по п. 1, где вакцина содержит НА и NA из штамма гриппа H1N1.

8. Способ по п. 1, где субъект представляет собой субъекта-человека в возрасте от 6 месяцев до 80 лет.

9. Способ по п. 1, где субъект представляет собой субъекта-человека в возрасте от 3 месяцев до 4 лет.

10. Способ индукции перекрестной защиты от штамма гриппа H5N1, включающий введение субъекту противогриппозной вакцины, содержащей НА и NA из штаммов гриппа H1N1, H3N2 и В, где субъекту не вводят НА и NA из штамма гриппа H5N1 и где вакцина является виросомальной противогриппозной вакциной, которая не содержит вспомогательное средство и которую вводят внутримышечно по меньшей мере трижды в течение одного года.

11. Способ вакцинации против гриппа, включающий внутримышечное введение субъекту виросомальной противогриппозной вакцины, которая не содержит вспомогательное средство и содержит белки геммаглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) гриппа из по меньшей мере трех штаммов гриппа, по меньшей мере трижды в течение одного года.

12. Способ по любому из пп. 1 или 11, где вакцина содержит НА и NA по меньшей мере из штамма гриппа H1N1, штамма H3N2 и штамма В.

13. Способ по любому из пп. 1, 10 или 11, где иммунная система субъекта не подвергалась воздействию антигена вируса гриппа на момент введения первой дозы вакцины.